TW200306350A - Novel phytases and method for producing these phytases - Google Patents

Description

(i) (i) 200306350 玖、發明說明 (發明說_敘明：《簡之技術領域、先前技術、喊、實施方式及賦簡單說明) 本發明係關於新穎之植酸酶，特別是來源為真菌者，及 :備此等植酸酶之個別方法，本發明更特別者係關於源自 青黴菌屬真菌（特別是青黴菌屬CBS 109899)之新穎植酸 酶，及編碼此等植酸酶之聚核苷酸，本發明亦關於含有此 等聚核芸酸之載體，及能在其組織中表現此等植酸酶的經 轉型宿主生物體。 、月崔a之，本發明植酸酶特別適合欲作為動物營養用之 =料組合物，此適合性與植酸酶特性有關，特別是指其在 製備該等組合物時的溫度及pH條件下之活性，及在動物 屬化系统中所遇到的條件下之活性。 磷是所有生物體維生所必需的元素。明確言之，對動物 句牧業者而言，為確保動物攝取足夠量的磷而有最隹的生 長及發育，磷是最重要的。大部分的農場動物係餵食以植 物A、 、、、王的飼料組合物，這些植物中含有大量的璘酸，這些 鱗龄 、 以儲存化合物的形式·植酸_儲存在植物組織中，平均 而言，植酸佔植物中50至70%之磷。植酸是自然循環流動 、 大部分的農場動物會分解植酸而釋放出所各之磷酸，

特 钉 Q ’是反籍動物，然而，單胃動物（諸如豬及家禽）則不能 弋身植酸，因此，餵食這些動物之飼料中所含有的植酸會 者排杻物排出體外，而畜牧業者則必須在其所攝取的飼 料中補充無機磷酸，以便讓動物攝取足夠量的磷，此種方 式因此造成畜牧業額外的花費，並因為無法消化的植酸排 攻至環境後而造成污染，此污染在密集性畜牧區域更為增 200306350

(2) 加0 已知植酸亦為飼料中重要營養元素的螯合劑，諸如，例 如，鎂、鈣、鋅或鐵。此一特性會降低飼料的營養品質， 是以，植酸具有抗營養劑的特性。 為了克服單胃動物無法同化植酸的種種有關缺點，便在 這些禽畜動物的飼料中加入酵素，植酸酶，植酸酶會水解 植酸而釋放出肌醇及無機磷酸。已經從許多生物體中分離 出植酸酶及編碼此等植酸酶的基因。植酸酶主要是從真菌 分離（哈孫恩（Howson)及大衛司（Davis)，1983，酵素微生物技 術5, 377-382;威斯（Wyss)等人，1999，應用環境微生物，65 (2)， 359-366)。這些產生植酸酶的真菌係指包括麴黴菌屬 (Aspergillus)的真菌（特別是A. ficcum (優樂（Ullah)及吉柏孫 (Gibson)，I987，製備生物化學17 (1)，63_91 ;優樂及迪司辛吉 (Dischinger)，1993，生物化學生物物理研究公報，192(2)， 747_753)、A· terreus (米契爾（Mitchell)等人，1997，微生物學， 143 (Pt 1)，245-252)、A· niger (得福洛可夫（Dvorakova)等人， 1997，植物微生物（布拉格），42 (4)，349-352)、A. fumigatus (帕 撒曼替司（Pasamontes)等人，1997，應用環境微生物，63 (5)， 1696-1700)、青黴屬（特別是p caseicolum)、木黴屬（Myceliophthora) (特別是Μ· thermophila (米契爾等人，1997，微生物學，143 (Pt 1)，245-252)、Talaromyces屬（特別是 Τ· thermophilus)、脈胞黴 菌屬（Neurosp〇ra)(特別是N以以以及N sit〇phila)、嗜熱真菌屬 (Thermomyces)(特別是 τ· lanuginosus (貝克（Berka)等人，1998， 應用環境微生物64 (11)，4423_4427)、紅麴菌屬（Monascus)(特 200306350 (3) 別是M. anka)。細菌中亦發現植酸酶，實例中包括芽孢样 菌屬（Bacillus)(特別是B. subtilis (包瓦（Powar)及吉格納赛恩 (Jagannathan)，1982，細菌學雜誌 151 (3)，102-1108 ;許米茲 (Shimizu)，1992，生物科學生物技術生物化學56 (8)，1266-1269 ;卡路夫（Keruvo)等人，1998，應用環境微生物64 (6)， 2079_2085)、假單孢菌屬（Pseudomonas)(卡司格洛夫（Cosgrove)， 1970，澳洲生物科學雜誌23，1207-1220)、埃希氏桿菌屬 (Escherichia)(特別是 E。coli (格洛溫（Golovan)等人，2000，加 拿大微生物雜誌 46, 59-71)、腸產氣桿菌屬（Enterobacter)(葉 恩（Yoon)等人，1996，酵素及微生物技術，18, 449-454)，或鏈 絲菌屬（Streptomyces)。酵母菌植酸酶亦已分離出來（得福洛 可夫，1998，植物微生物43 (4)，323-338)，諸如酵母菌 Schwaniiomyces occidentalis及 Saccharomyces cerevisiae。最後， 植物中業已發現植酸酶，特別是黃豆（優樂及吉柏孫，1988, 古代生物化學生物物理，260 (2)，514-20)、玉米（莫吉尼斯特 (Maugenest)等人，1997，生物化學雜誌，322 (Pt 2)，5 11_7);莫 吉尼斯特等人，1999，植物分子生物，39 (3)，503-14)，或阿 拉伯芥（莫樂尼（Mullaney)及優樂3 1998，生物化學生物物理 研究公報 251 (1)，252-5)。 利用植酸酶與植酸的麥克利斯常數（Michaelis constant， Km)、酵素活性的最佳pH及最佳溫度、特定pHs及溫度下酵 素活性的穩定性等特性定性植酸酶，亦可利用植酸酶的結 構數據，諸如，分子量（MW)、等電點（pi)或肽序列。為便 其用於動物營養中，植酸酶必須具有與此營養飼料物處理 200306350

(4) 過程相容的特性，明確言之，在製備這些飼料過程之溫度 及pH條件下，及消化這些飼料的動物消化遒之溫度及pH 條件下，植酸酶的活性必須能夠維持，且倘可能，仍具有 最佳狀態的活性。由於這些限制性因此需要研發具有抵抗 高溫條件之植酸酶，諸如製備飼料組合物過程所用的溫度 條件者，及抵抗酸性pH條件之植酸酶，諸如能存於禽畜 動物消化道者。 為了滿足這些要求’所以在符合此要求下的溫度及pH 環境下之生物中尋找植酸酶，特別是微生物。此策略不作 可以分離出抵抗南溫的植酸酶，諸如，例如世界專利安 WO 97/35016或歐洲專利案〇 684 313所揭示者，亦可分離出 低Km之植酸酶，諸如，例如歐洲專利案〇 96〇 中所揭 示者。另一種策略係以人工方式利用位置引導突變作用修 飾已知植酸酶的序列，以產生具有較佳特性之植酸酶，此 策略特別揭示於世界專利案w〇 99/4838〇、歐洲專利案〇 897 985及歐洲專利案〇 897 〇1〇中。 發明内容 本發明係關於編碼SEQ ID NO: 3所示植酸酶之經分離聚 、4 fe:此植g母及其所編碼聚核嘗酸源自於青黴菌屬之 真菌’明確言之，係青黴菌屬CBS 1〇9899。 根據本發明所用”聚核苷酸”一詞係指由天然或人工鹼 基序列所組成之核酸分子，可為DNA或RNA形式，較佳者 為DNA形式，特別是雙股者。當該聚核甞酸為天然者，咸 欲明白本發明不但涵蓋其天然環境下之聚核苷酸，且包括 200306350

(5) 伙自然發現之生物體基因體中所分離及純化之相同聚核 s•酸。可以利用萃取作用及純化作用直接獲取此聚核苷 酸，或是以拷貝的方式間接獲得。然而，本發明包括以人 工方式併入至自然存於該生物體以外生物體基因體中之 水核知酸’或以人工方式再併入其來源生物體中之聚核苷 酸此生物體基因體中具有一或多套者。當此聚核：y：酸為 探針時，其通常為單股。 因此本發明包括編碼SEQ ID NO: 3所示植酸酶肽序列之 聚核巷酸，熟知技藝者咸欲了解，雖然鑒於基因密碼的簡 併現象，不同核甞酸序列會編碼相同的胺基酸序列，因此 此足義包括所有編碼SEq id NO. 3所示相同胺基敗序列之 植酸酶，及因此編碼相同植酸酶之聚核苷酸。

本發明亦包括與前述聚核苷酸同源相似之聚核甞酸，該 同源相似聚核甞酸所編碼之植酸酶與序列SEQ ID NO: 3所 示之植酸酶同源相似。根據本發明所用”同源相似”係指編 碼植酸酶之聚核甞酸序列與編碼SEq ID NO: 3所示植酸酶 之相對核苷酸序列有所變更，同源相似核甞酸的特徵是與 編碼SEQ ID NO: 3所示植酸酶之聚核苷酸序列具有一足程 度的相同性，比較這兩個序列後可得對應聚核瞀酸間（相 同程度，通常係以這些序列間相同的核嘗酸之百为比表 示，以特定序列長度來測定相同程度，測定決定相同程度 之同源相似序列長度之短序列長度。因此，本發明包括對 應於編碼SEQ ID NO: 3所示植酸酶而有一或多個序列修飾 作用之聚核嘗酸，而所編碼之植酸酶特性等同於SEQ •10- 200306350 (6) NO: 3所示植酸酶之特性。

根據本發明，所謂”等同植酸酶”或”具有等同特性植酸 酶”基本上係指具有植酸酶活性之蛋白質，與其實際特性 無關，諸如Km、活性最佳pH或活性最佳溫度。可以任何 測定植酸酶活性的方法來測定植酸酶活性的程度。所謂，，植 酸酶”係指具有水解植酸酶而釋放出肌醇及無機磷酸的催 化活性之酵素。然而，因為大部分植酸酶不會完全的水解 植酸酶（含有六個磷酸），因此根據本發明植酸酶的催化活 性會釋放出無機磷酸及肌纖維醇磷酸酯，根據植酸酶的水 解能力’所釋放的酯類可能為肌纖維醇單·、二-、三-、四-或五磷酸酯。舉例而言，可根據許米茲方法（1992，生物科 學生物技術生物化學56 (8)，U66-1269)來測定植酸酶活 性，明確言之，係以實例2中所述的方法測定之。然而，

任何可以定出植酸酶活性的方法，不論是測定因酵素反應 所導致受質的減少量或是測定產物的累積量，均可用以測 足植酸酶’明確言之，例如，利用其他受質或其他藥劑之 相似的方法亦可用來測定植酸酶活性。 同源相似聚核嘗酸中的序列修飾作用為天然或利用一 般突變作用技術所獲得之核苷酸加成、刪除或取代作用。 咸已知此種編碼具有等同功能蛋白質之同源相似聚核苷 酸天然存於不同生物種的甘 土 〇搜的基因體中，甚至是不同種族、變 異體或品系之基因體中。阴^丨 ^ ^ 因此，對热識技藝者而言，利用 熟知的分子雜化作用（山本$ 士 μ 不魯克（Sambrook)等人，I989，分子 生物選殖：實驗室手冊 每—u 、 ’弟一版，語南（Nolan)公司出版 -11- 200306350 ⑺ 紐約：冷泉灣實驗室印行）以根據本發明之編碼SEQ ID NO: 3所示植酸酶之聚核甞酸來分離此種同源相似聚核甞酸是 輕而易舉的。 分子雜化作用是種配對反應，其發生在某種程度相同程 度聚核棼酸之核甞酸序列之互補股間，因此，利用編碼 SEQ ID NO: 3所示植酸酶之聚核甞酸可鑑定其來源生物以 外之生物體基因（例如，其他的真菌，特別是其他青黴菌， 例如繩狀青黴（P. funicolosum) IMI 134756)中與這些聚核站 酸具有同源相似之聚核嘗酸’及編碼具有與SEQ ID NO: 3 所示植酸酶等同特性植酸酶之聚核苷酸。聚核答酸間的相 同度越高，則在該等聚核甞酸間越可能及容易進行雜化反 應，而該聚核牮酸編碼具有等同蛋白質的特性之可能性越 高。雜化聚核嘗酸的方法廣泛地揭示於文獻（山布魯克等 人，1989,分子選殖：實驗室手冊，第二版，諾南公司出版， 紐約：冷泉灣實驗室印行）中，且是熟知技藝者所熟知的 方法。例如，其基礎是篩選生物或從此生物體組織而來的 基因體或cDNA庫，係以包括已知聚核棼酸的探針，或其 片段進行篩選，以鑑別這些基因庫中可以與探針進行雜化 的同源相似聚核替酸。根據本發明，探針包括編碼SEQ ID NO: 3所示植酸酶之聚核苷酸，或其片段。為了鐘別可以 與探針進行雜化的聚核苷酸，需要，例如，以放射活性元 素進行標記，諸如32p。熟知技藝者亦可使用市售的非放 射活性進行標記。 因此，本發明亦包括能夠選擇性與編碼SEQ m N〇: 3所 -12- 200306350

⑻ 示植酸酶之爾酸或其片段之一者進行雜化之刪 酸。咸已知倘這些聚核甞酸編碼等同SEQ m n〇: 3所示序 列之植酸酶，則這些核甞酸只是本發明的一部分。根l本 發明，所謂"能夠選擇性進行雜化之聚核苷酸"係指利用一 種一般性的分子雜化方法（山布魯克等人，1989，分子選 殖：實驗室手冊，第二版，#南公司出版，細約：冷泉彎 實驗室印行），可以與經標記作為探針之編3 所示植酸酶之聚核嘗酸或其片段之—者進行雜化作用，主 雜化程度大於該探針與其他相關非同源相似性聚核接酸 之非專-性雜化作用，特別是其他的cDNAs 1聚核甞酸 源自cDNA庫。雜化作用程度係測定探針所產生的訊號， 而訊號程度是能夠進行選擇性雜化之聚核苷酸間相互反 應後所產生的，通常探針訊號強度是探針與其他會產生"背 景雜訊"聚核驻酸間相互作用的訊號的1〇倍，^佳為 倍。選擇性雜化作用通常係為正常條件，較佳者為嚴苛或 非常嚴苛的雜化作用及清洗條件（例如以含有至少5 χ ssc 及1%8〇3，於約501_60。(；之緩衝液中進行雜化，依序以 0.1% SDS及遞減SSC濃度（自2 x SSC至〇·4 χ ss〇，並増加溫 度（自20 C至50 C )清洗之）。熟識技藝者能夠調整雜化的條 件’也就是雜化步驟及清洗步驟所用的溫度及緩衝液的鹽 類濃度。明確言之，這些條件應根據與所用探針長度調 整’並根據以此探針篩選基因庫中所存聚核甞酸相同程度 調整。為便使雜化之同源相似序列所產生的訊號達到最大 值’同時讓背景雜訊減至最小，有必要調整雜化作用條件。 -13 - 200306350

(9) 能夠與本發明聚核甞酸選擇性雜化之聚核甞酸可從，例 如，真菌之基因體庫或cDNA庫中分離出來，特別是青黴 菌屬，例如，蠅狀青黴菌IMI 134756株。以編碼SEQ ID NO: 3所示植酸酶之聚核苷酸、此等聚核苷酸之片段，或與其 互補之聚核苷酸為探針’利用標準雜化技術可以進行此種 聚核苷酸的分離（山姆布魯克等人，1989，分子選殖：實驗 室手冊，第二版，諾南公司出版，紐約：冷泉灣實驗室印 行）。當利用此等技術分離出聚核甞酸時，必須定出其序 列，並鑑定出這些聚核甞酸所編碼蛋白質的特性，特別為 確認此蛋白質是與SEQ ID NO: 3所示植酸酶等同之植酸酶。 因此，前述之雜化技術可以分離出與編碼SEQ ID NO: 3 所示植酸酶之聚核甞酸具有同源相似之聚核苷酸。熟識標 準分子生物技術之生物技術領域者可輕易的分辨出此種 聚核棼酸及其所編碼之植酸酶。因此，本發明包括與編碼 SEQ ID NO: 3所示植酸酶之聚核甞酸具有同源相似之聚核 甞酸，較佳地，該同源相似聚核甞酸至少與編碼SEQ ID NO· 3所示植酸酶之聚核省：酸有45%，較佳者至少50%，至少 70%，至少80%，更佳者至少90%及更佳者至少95%之相同 程度。測定及鑑定序列間的相同程度是熟識技藝者所熟知 的。例如，可以利用程式PILEUP、BLAST (特別是阿爾兹 契爾（Altschul)等人，1993，分子進化雜誌36:290_300 ;阿爾兹 契爾等人，1990，分子生物雜誌215:403-10)或BestFit (咸斯 康辛序列分析套裝軟體，Unix第八版，基因電腦小組，大 學研究組，575科學道，麥迪森，WI 53711，利用應用數學 -14- 200306350

(10) 所揭示之史密斯（Smith)及瓦特曼（Waterman)對數，1981，No· 2, 482-489) ° 亦可利用慣用突變技術以人工方式獲得此種同源相似 聚核甞酸。 編碼SEQ ID NO: 3所示植酸酶之較佳聚核甞酸選自SEQ ID NO: 1 及 SEQ ID NO: 2。 舉例而言，同源相似聚核苷酸實例為SEQ ID NO: 4所示 之聚核芬酸。 根據本發明一個特別具體實例，編碼前述植酸酶之聚核 甞酸源自青黴菌屬之真菌，根據一個特別之具體實例，其 源自青黴菌CBS 109899或源自蠅狀青黴IMI 134756。 根據本發明一個特別具體實例，根據本發明聚核苷酸所 編碼之植酸酶具有下列特性：

(a) 最佳溫度=5〇°C (b) 最佳 pH = 4-5 (c) Km = 550 //m 本發明亦關於上述聚核甞酸之片段，所謂”片段”特別是 指至少具有20個核甞酸的片段，特別是至少50個核甞酸， 及較佳為至少100個核甞酸。此種片段通常命名為寡核苷 酸，其可作為雜化探針，以鑑別同源相似聚核甞酸，或作 為引子，以利用阿撒伯爾（Ausubel)等人，（1987)分子生物最 新步騾，約翰威利&孫，第6.3-6.4章節中所述之PCR (聚合 酶鏈結反應）技術鑑定及增幅此種同源相似聚核甞酸。 所謂”片段”亦指編碼SEQ ID NO: 3所示植酸酶，或編碼與 200306350 (11) SEQ ID NO: 3所示植酸酶同

源相似或等同之植酸酶片段之 根據本發明核苷酸片段。 本發明亦關於包括至少一種上述聚核替酸之聚核誓酸。 所有上述的聚核替酸不是編碼SEQ ID N〇: 3所不植酸 酶，就是編瑪同源相似植酸酶，或是編碼這些植酸酶的活 性片段。因λ，本發明包栝所有這些聚核#酸所編碼之植 酸酶，因此，此定義包括SEQ ID Ν0: 3所示之植酸酶，與 此植酸酶同源相似之植酸酶，及此等植酸酶之活性片段。 & π社M且體實例，植酸酶為包括至Φ 根據本發明一個粒佳的具缸貫 ^ SEQ ID NO: 3所示肽序列之蛋白夤。 因此，本發明亦包括與SEQ ID N〇: 3所示植酸酶同源相 似之植酸酶。根據本發明，"同源相似植酸酶”係指該植酸 酶序列對應於SEQ ID NO: 3所示植酸酶序列有修飾改變。 一如同源相似聚核苷酸，同源相似植酸酶為其蛋白質肽序 列與植酸酶具有某一程度的相同性’相同的程度通常係以 相同胺基酸的百分比表示之。因此，本發明包括與對應於 SEQ ID NO: 3所示植酸酶之序列有一或多個序列修饰作用 之植酸酶，及具有與SEQ ID N〇: 3所示植酸酶之等同特性 之植酸酶這些修飾可以是天然胺基酸或以一般突變技術 所得胺基酸之加成、刪除或取代’較佳者’同源相似植酸 酶至少與SEQ ID NO: 3所示植酸酶具有35%，較佳者至少 50%，至少70%，至少80%，更佳者至少90%及較佳者至少 95%之相同程度。熟識技藝者熟知鑑定及測定序列間相同

程度的方法，例如，可以利用可以利用程式PILEUP、BLAST -16- 200306350

(12) (特別是阿爾茲契爾等人，1993，分子進化雜誌36 : 290-300 ; 阿爾茲契爾等人，1990，分子生物雜誌215:403_10)或BestFit (威斯康辛序列分析套裝軟體，Unix第八版，基因電腦小 組，大學研究組，575科學道，麥迪森，WI 53711，利用應 用數學，1981，第二卷，482-489所揭示之史密斯（Smith)及瓦 特曼（Waterman)對數）。 舉與SEQ ID NO: 3所示植酸酶序列同源相似植酸酶之實 例而言，編碼該植酸酶之聚核甞酸如SEQ ID NO: 4所示。 根據本發明一個特別具體實例，根據本發明植酸酶源自 青黴菌屬之真菌。 根據本發明一個特別具體實例，該植酸酶具有下列特 性：

(a) 最佳溫度=5(TC (b) 最佳 pH = 4-5 (c) Km = 550 μιη 本發明亦包括SEQ ID NO: 3所示植酸酶之片段及該同源 相似植酸酶之片段，所謂”片段’’是指本質上具有生物活性 之片段，換言之，利用實例2或相似的方法測定後，具有 等同完整植酸酶之植酸酶活性的片段。 本發明亦關於將基因元素功能性連結至另一個元素之 嵌合基因，其包括至少一個在宿主内具有功能之啟動子、 編碼根據本發明植酸酶之聚核苷酸，及在相同宿主中具有 功能的終止子。一般基因中所含有的各式元素主要是調節 轉錄作用、轉譯作用及蛋白質成熟作用的元素、編碼訊息 -17- 200306350 (13) 肽或引導肽序列，或包括聚腺甞酸信號訊息的終止元素， 其次是編碼蛋白質的聚核苷酸。所用”功能性連結至另一 個元素”係指嵌合基因上的元素連結至嵌合基因上另一個 元素上，而使得這些元素受到另一個元素的影響。例如， 當啟動子會影響編碼序列的表現時，即表示啟動子係功能 性連結至該編碼序列上。根據技藝中所熟知之技術，特別 是山姆布魯克等人所揭示方法（1989，分子選殖：實驗室手 冊，Nolan C出版，紐約：冷泉灣實驗室印行），可完成根據 本發明嵌合基因的構築及其各式元素的組合。選擇組成嵌 合基因之調節元素基本上必須根據其在宿主體内具有功 能而定，熟知技藝者能夠選用特定在宿主生物中具有功能 之調節元素，”功能”一辭係指在特定宿主體中能夠發揮功 能者。 根據本發明嵌合基因之啟動子包括組織性者或謗導性 者，例如，細菌中所用的啟動子可選自下列細菌之啟動 子。在大腸桿菌（Escherichia coli)中表現時，可以選用lac、 trp、Ιρρ、phoA、recA、araBAD、proU、cst-1、tetA、cadA、 nar、tac、trc、lpp_lac、Psyn、cspA、PL、PL-9G-50、PR-PL、 T7、APL-PT7、T3-lac、T5-lac、T4基因 32、nprM-lac、VHb及 蛋白質A啟動子（麥力迪斯（Makrides)，1996,微生物總論 60:512-538 ;生物技術現今觀點，1996，7 ;威克（Weickert)等 人，1996，生物技術現今觀點7:494-499)或其他Ptrp啟動子 (世界專利案99/64607)。在革蘭氏陽性菌（諸如棒狀样菌或 鏈絲菌）中表現時，則可以使用PtipA (哈爾米斯（Holmes)等人， -18· 200306350 (14)

1993，EMBO雜誌 12:3183-3191)或 PS1 及 PS2 (法國專利案 FR 91/09870)啟動子或歐洲專利案0629699A2中所示者。在酵母 菌或真菌中表現時，可利用K. lactis Plac4啟動子（凡得恩柏 (Van den Berg)等人，1990，生物 /技術 8: 135-139)或 K. lactis Ppgk 啟動子（法國專利案91/05294)、木黴菌tefl或cbhl啟動子（世 界專利案94/04673)、青黴菌his、csl或apf啟動子（世界專利 案00/68401)及麴黴菌gla啟動子（格威恩（Gwynne)等人，1987, 生物/技術5:713-719)。 嵌合基因亦包括編碼訊息肽或引導肽之次細胞編址序 列，此種序列位於編碼植酸酶的聚核嘗酸上游或下游，可 以將該植酸酶專一性地引導至宿主生物的細胞部位中，或 將其引導分泌細胞外。例如，嵌合基因可包括編碼引導植 酸酶至細胞質特定部位訊息肽或引導肽之序列，諸如粒線 體、原質體、内質網或液泡。較佳地，編址序列編碼可將 植酸酶引導至非原質體或細胞外基質之訊息肽。 根據一個具體實例，引導肽可為葉綠體、液泡或粒線體 編址訊息，而後在葉綠體、液泡或粒線體中將其切除，此 種肽廣泛揭示於文獻中：尼合斯（Neuhaus)及羅吉斯（Rodgers)， 1998，植物分子生物38: 127_144 ;美國專利案5188642中所揭 示之EPSPS引導肽；核酮糖-雙羧化酶（ribulose- biscarboxylase/ 氧化酶小次單位引導肽（歐洲專利案189707)。 根據另一個具體實例，引導肽係由引導至細菌胞質周緣 區之訊息肽所組成，諸如pac (許麥契（Schumacher)等人，1986, 核酸研究14:5713-5727) ; ompA (博得恩（Bowden)及喬治亞 -19· 200306350

(15) (Georgiou)，1990，生物化學雜龍 265: 16761-16766)及 phoA (張 (Chang)等人，1986，基因44: 121-124)，或細菌性表面之錨定 肽，諸如基因PS1及PS2 (法國專利案91/09870)。 引導肽可為單肽或雙肽，雙引導肽可視情況以中間序列 區隔之，舉葉綠體引導肽為例，雙引導肽包括（根據轉錄 作用的方向）編碼植物基因（其編碼的酵素位於質粒體中） 引導肽的序列、植物基因（其編碼的酵素位於質粒體中）成 熟N-端部分之部份序列，及而後是編碼植物基因（編碼的 酵素位於質粒體）第二個引導肽的序列，此種雙葉綠體引 導肽，例如’揭示於專利案歐洲專利案〇 508 909中。 根據一個具體實例，引導肽可由各式的元素所組成，以 便增加感興趣蛋白質分泌至培養基中的含量。所指係由融 合至感興趣蛋白質上之載體蛋白及蛋白分解切割位置組 合而成（美國專利案6130063)。 根據本發明，嵌合基因亦包括其他調節序列，其可位於 啟動子及編碼序列之間，諸如轉錄活化子（促進子）。 本發明亦關於包括根據本發明嵌合基因之選殖、表現及 /或轉型載體。根據本發明載體係用以轉型宿主生物，並 在此生物中表現植酸酶。該载體可以是質體、黏粒質體 (cosmid)、嗜菌體或病毒，較佳地，根據本發明轉型載體 為-個質體。通常’此載體的主要特性是在宿主細胞中應 具有利用複製源來維持本身的能力及自行複製的能力，並 表現出植酸酶。為了能穩定轉型宿主生物，載體亦可以併 入至生物基因體中，是以，載體的組成侷限於在宿主中合 -20- 200306350

(16) 成植酸酶所需的元素。選用此種載體，及將根據本發明嵌 合基因插入至載體上的技術完整的揭示於山姆布魯克等 人所著者（1989，分子選殖：實驗室手冊，諾南公司c出版， 紐約··冷泉灣實驗室印行），且是熟識技藝者的一般性知 識。較佳地，本發明所用的載體除了根據本發明嵌合基因 外，亦包含編碼篩選標識之嵌合基因，此篩選標識可有效 篩選經轉型的宿主生物，換言之，也就是併入載體之宿主 生物。在這些所用的篩選標識中，可為含有對抗抗生素或 殺真菌基因的標識，諸如，例如潮黴素磷移轉酶基因（格 利茲（Gritz)等人，1983，基因 25: 179-188 ;龐特（Punt)等人， 1987;基因56: 117-24)，編碼提供夫利徽素（phleomycin)抗 性之鏈黴辛素（streptothricin)乙醯移轉酶，提供農藥免耐得 (benomyl)抗性之突變貝它-微管蛋白（高爾德（Gold)等人， 1994，基因142: 225-30)，或畢拉草（bialaphos)乙醯移轉酶（阿 凡樂斯（Avalos)等人，1外9，現今遺傳學，16:369-72)。其他的 標識可為互補自營性的基因，諸如pyrA、pyrB、pyrG、pyr4(布 斯頓（Buxton)及雷福特（Radford)，1983，分子基因遺傳學 190:403-405)、arg4、argB (柏斯（Berse)等人，1983，基因 25:109-117)及打？(：基因（古森（0〇〇5611)等人，1989，分子基因 遗傳學，219:282-88)、molybdopterin合成酶基因（阿柏雅 (Appleyard)等人，1998，生物化學雜龍273:14869_76 ;優爾其 斯（Unkles)等人，1999，生物化學雜誌274: 19286-93)或乙醯胺 酶基因（柏力（Beri)及特納（Turner)，1987，現今遺傳學， 11:639-41)。另一類的篩選標識是抗殺蟲劑的基因，諸如畢 200306350 (17) 拉草抗性的bar基因（懷特（White)等人，NAR 18: 1062，1990)、 嘉磷赛（glyphosate)抗性的EPSPS基因（美國專利案5，188,642) 、異哼唑（isoxazole)抗性之HPPD基因（世界專利案96/38567) ，或嘉磷赛氧化還原酶基因（美國專利案5463175)。所指亦 可為編碼能輕易鑑別之酵素基因，諸如GUS酵素，或編碼 轉型細胞中色素或調節產生色素之酵素，此種篩選標識基 因特別揭示於世界專利案91/02071、95/06128、96/38567及 97/04103 中。 本發明亦關於包含至少一種根據本發明嵌合基因之經 轉型宿主生物體，不論其是否併入至基因體中，或是帶在 染色體外之基因元素上，例如質體。’’宿主生物體’’係指引 入根據本發明之嵌合基因的任何低等或高等單細胞或多 細胞生物體，可產生根據本發明植酸酶。較佳地，宿主生 物體為微生物，特別是真菌類（例如青黴菌屬、麴菌屬、 毛革菌屬（Chrysosporium)或木黴菌屬）、細菌類（例如埃希氏 屬，特別是大腸桿菌）、棒狀桿菌屬、芽孢桿菌屬或鏈絲 菌屬、酵母菌（特別是 Saccharomyces、Kluyveromyces或 Pichia 屬）、桿病毒或植物細胞。宿主生物體亦可為植物或為植 物的一部分。 本專利說明書”轉型宿主生物體”係指在其基因體或在 染色體基因元素外（例如質體），引入至少一種根據本發明 後合基因之宿主生物體，因而其組織或其組織培養基中會 產生植酸酶。熟識技藝者可利用任一種已知之轉型方法獲 得根據本發明宿主生物體。 200306350

(18) 其中一種方法是將欲轉型之宿主生物體細胞或組織與 聚乙二醇（PEG)及根據本發明載體接觸反應（張及古恩 (Cohen)，1979，分子基因遺傳學168 (1)，111-115 ;墨西尼爾 (Mercenier)及崔西（Chassy)，1988，生物化學 70 (4)，503-517)。 電穿孔法是另一種方法，其將欲轉型之細胞或組織及根據 本發明載體置於電場中（安卓森（Andreas〇n)及伊凡斯（Evans)， 1988，生物技術6 (7)，650-660 ;西吉卡威（Shigekawa)及杜威 (Dower)，1989，澳洲生物技術雜諸3 (1)，56_62)。另一種方法 是直接利用微注射法將載體注入至細胞或組織中（高登 (Gordon)及路得（Ruddle)，1985，基因 33 (2)，121-136)。較佳 地，使用’’基因槍”方法，其係以吸附本發明載體之顆粒衝 擊細胞或組織（布魯斯（Bruce)等人，1989，美國國家學院文 獻 86 (24)，9692-9696 ;克萊恩（Klein)等人，1992，生物技術 10 (3)，286-291 ;美國專利案 4,945,050)。 文獻中揭示數種經轉型大腸桿菌及其他革蘭氏陰性細 菌的方法（阿撒柏爾等人，1985，分子生物現今步騾，約翰 威利及孫司，紐約；伊諾（Inoue)等人，1990，基因96: 23-28 ; 蔣（Chung)等人，I989，美國國家學院文獻86: 2172-2175)。亦 可使用共輛法（卡米洛（Cameron)等人，1989，細菌學雜詰^ 171: 547-557)。以革蘭氏陽性菌而言，可使用電穿孔法及原生 質轉型法，特別是鏈絲菌屬之細菌（柏納米（Bonamy)等人， 1"0, FEMS微生物學公報66: 263_270;哈瓦德（Hopwood)等人 1985,鏈絲菌之基因操作方法：實驗室手冊·約翰伊尼斯基 金會，諾威治（Norwich))。 -23 - 200306350

(19) 文獻中亦揭示數種經轉型真菌的方法（泰柏特（Talbot)， 2001，絲狀真菌之分子及細胞生物，牛津大學印行，紐 約），歐洲專利案0260762中揭示以PEG進行麴黴菌的原生質 轉型作用，世界專利案00/36120中揭示採用該方法轉型蠅 狀青黴菌，利用限制酵素媒介引入法之轉型作用或稱 REMI (山許茲（Sanchez)等人，I"8，分子基因遗傳學258: 89-94)亦是已知的，其為利用農桿菌署（Agrobacterium)細菌 進行之原生質轉型作用（迪格路特（de Groot)等人，1998，自 然生物技術16: 839-842)，文獻中亦揭示轉型酵母菌之技 術，特別是阿撒柏爾等人（1995，分子生物現今步騾，約翰 威利及孫司，紐約）及凡德恩柏等人（1990，生物/技術8 : 135-139)。 在特別的情形下，當欲轉型的宿主生物體為植物來源 時，該植物細胞或組織較佳利用農桿菌屬細菌進行轉型作 用，較佳是以根瘤農样菌（A· tumefaciens)(克諾夫（Knopf)， 1979，次細胞生物化學6, 143-173 ;蕭（Shaw)等人，1983，基因 23 (3):315-330)或生根農样菌（A· rhizogenes)(貝凡恩（Bevan)及 契爾頓（Chilton)，1982，遺傳總論年刊16:357-384 ;替福 (Tepfer)及卡西-迪爾柏特（Casse_Delbart)，1987，微生物學科 學4(1)，24-28)感染該植物細胞或組織。較佳地，以根瘤農 桿菌轉型植物細胞或組織係根據伊許達（Ishida)等人（1996, 自然生物技術14 (6)，745-750)所述之方法進行。熟識技藝者 會根據欲轉型宿主生物體的特性選用適當之方法。 本發明亦關於一種製備具有植酸酶活性萃取物之方 -24- (20) 200306350 法 根據本發明 —個具體實例，此方法包括

(a) 於可以讓 本發明聚 (b) 濃縮步雖 (c) 破壞步綠 (d) 離心步懸

步驟（d)中 生物體表現植酸酶的條件下， #爷酸之生物體 (a) 所培養的生物體 (b) 中所分離之生物體細胞 (e)所得之破壞細胞萃取物 步驟有： 培養具有根據 回收具有植酸酶活性之澄清液 利用技藝φ & & ώ 中所热知之技術可完成步驟（〇,諸如機械式研 磨（利用凰士 y 公刀差、超音波作用、磨碎）、酵素溶解或渗透壓 休克法等’該等技術可個別使用或組合使用。 另外加入—個純化步驟（f)後，本方法亦成為製備根據本 發明植酸酶之方法。此用以製備根據本發明植酸酶方法之 步驟（f)包括自步騾⑷中回收上清液中純化植酸酶。可利用 任何渡縮或分離蛋白質的技術來純化植酸酶，特別是技藝 中所熟知之微過濾法、超過濾法、電泳法、層析法等技術。 為了獲得純化之植酸酶，熟知技藝者可利用前述測定植酸 酶活性的方法來鑑別含有該植酸酶之純化分液。根據本方 法’所產生的植酸酶較佳具有50%、60%、70%、80%、90%、 95°/°、99%之純度，或較佳為1〇〇%。 根據本發明方法另一個具體實例’特別當根據本發明植 酸酶分泌至培養基時，該方法包括步驟有： ⑷於可以讓生物體表現植酸酶的條件下，培養具有根據 本發明聚核甞酸之生物體， (b)去除生物體回收組織培養基。 •25- 200306350

(21) ’’在其基因知·上天然具有根據本發明聚核嘗酸之生物" 係指任何自然狀態下的生物中，其基因體上具有編碼SEQ ID NO: 3所示植酸酶之聚核：y：酸，或同源相似之聚核甞酸。 根據前述方法一個具體實例，該生物為微生物，根據一 個具體實例，該微生物為真菌類，特別是青黴菌屬，特別 是青黴菌CBS 109899。 根據這些方法，利用技藝中所熟知之技術將生物培養於 適以製備植酸酶之培養基中，當生物明確言之是微生物 時，特別是真菌類，可培養在振盪的錐形瓶、實驗室用的 發酵器，或工業用的發酵器（批次發酵作用，補料批次發 酵作用或固態培養基發酵作用），所用的培養基應該含有 碳及氮及無機鹽來源。以青黴菌CBS 1〇9899為生物之方法 之特別具體實例中’不論有或無植酸鹽類（舉例而言，植 酸鹽類為Na+鹽、Ca++鹽或Ca++或Mg++鹽的組合）存在，於控 制pH (較佳為pH 3或4)條件下，或是隨意之酸鹼度下，均 會表現植酸酶。 根據本方法，利用任何分離包含於液體分液中固體部分 之方法進行去除經轉型宿主生物體，以回收組織培養基。 明確言之，完成此步驟的方法為過濾法及離心法。 另外加入一個純化步驟（c)後，本方法亦成為製備根據本 發明植酸酶之方法。此用以製備根據本發明植酸酶方法之 步驟（C)包括自步騾（b)中回收上清液中純化植酸酶。利用 可利用任何濃縮或分離蛋白質的技術來純化植酸酶，特別 是技藝中所熟知之微過濾法、超過濾法、電泳法、層析法 -26 - (22) 200306350

等技術為了獲得純化之植酸酶，熟知技藝者可利用前述 d足植酸酶；舌性的方法來鑑別含有該植酸酶之純化分 '夜根據本方去，所產生的植酸酶較佳具有5〇%、60%、 70% - 80% - 90〇/ /°、95%、99%之純度，或較佳為1〇〇%。 根據本發日Η 』另一個具體實例，利用根據本發明經轉型宿 主生物缸製備具有植酸酶活性萃取物之方法包括的步騾 有： (a) 培養根據本發明之經轉型宿主生物體 (b) /辰縮步驟（a)所培養之經轉型主生物體 (C)破壞步驟（b)中所分離之生物體細胞 (d)離〜步驟（e)所得之破壞細胞萃取物 0)自步驟（d)中回收具有植酸酶活性之澄清液。 利用技藝中所熟知之技術可完成步騾（c)，諸如機械式研 磨（利用壓力差、超音波作用、磨碎）、酵素溶解或滲透壓 休克法等’該等技術可個別使用或組合使用。 另外加入一個純化步騾（f)後，本方法亦成為製備根據本 發明植酸酶之方法。此用以製備根據本發明植酸酶方法之 步驟⑺包括自步騾（e)中回收上清液中純化植酸酶。利用可 利用任何濃縮或分離蛋白質的技術來純化植酸酶，特別是 、技藝中所熟知之微過濾法、超過濾法、電泳法、層析法等 技術。為了獲得純化之植酸酶，熟知技藝者可利用前述測 足植酸酶活性的方法來鑑別含有該植酸酶之純化分液。根 據本方法，所產生的植酸酶較佳具有50%、60%、70%、80。/〇、 90%、95❶/〇、99%之純度，或較佳為100%。 •27- 200306350

f孢桿菌屬或鏈絲菌屬）、酵母菌類（特 KlUyveromyces或Piehia屬）、桿病毒或植 別是 Saccharomyces、 物細胞。 根據本發明另一個具體實例，特別是當根據本發明植酸 酶分泌至培養基時，此方法包括的步驟有： (a) 培養根據本發明之經轉型宿主生物體 (b) 去除經轉型宿主生物回收培養基 根據這些方法，利用技藝中所熟知之技術將生物培養於 適以製備植酸酶之培養基中，當生物明確言之是微生物 時，特別是真菌類，可培養在振盪的錐形瓶，實驗室用的 發酵器，或工業用的發酵器（批次發酵作用，補料批次發 酵作用或固態培養基發酵作用）。所用的培養基應該含有 碳及氮及無機鹽的來源。 根據本方法，利用任何分離包含於液體分液中固體部分 之方法進行去除經轉型宿主生物體，以回收培養基°明確 言之，完成此步騾的方法為過濾法及離心法。 · 純化步驟中加入另一個步騾（c)後，則本方法亦成為一種 製備根據本發明植酸酶之方法。此種製備本發明植酸酶方 法之步騾（c)係純化步騾（b)所獲上清液中植酸酶，可利用 任何濃縮或分離蛋白質的技術來純化植酸酶，特別是技藝 中所熟知之微過濾法、超過濾法、電泳法、層析法等技術。 -28 - 200306350

(24) 為了獲得純化之植酸酶，熟知技藝者可利用前述測定植酸 酶活性的方法來繼別含有該植酸酶之純化分液。根據本方 法，所產生的植酸酶較佳具有50%、60%、70%、80%、90%、 95%、99%之純度，或較佳為ι〇〇〇/0。 本發明亦關於包括至少一種根據本發明植酸酶之酵素 性組合物。 ’’酵素性組合物”係指一種包括至少一種根據本發明植 酸酶之組合物，其中植酸酶根據其是否與不同的佐劑（促 進植ϊ母穩足性及其轉換率）組合而有不同的比例。可用 於根據本發明酵素性組合物中的佐劑實例有山梨醇、甘露 醇表甲故、播機鹽，或植物油。根據本發明酵素性組合 物可為液態形式，其所含的組合物及植酸酶則為液賤溶 液’或為固態形式，而其所含之組合物或植酸酶則為冷柬 乾燥之粉末。 根據本發明一個特別具體實例，除了根據本發明植酸酶 外，酵素性組合物包括至少一種額外的酵素，此額外的酵 素可具有植酸酶活性或具有植酸酶活性外 Γ的洽性。當此額 外的酵素具有植酸酶活性時，該植酸酶活性 …、 伐佳有別於並 互補於根據本發明植酸酶之植酸酶活性。卷 見古4去A & 两此頸外的酵素 具有植鉍酶活性以外的活性時，例如，戈 、 為木聚糖分解 _、纖維酶、/S -葡聚糖酶、海帶聚糖酶、 _ 阿魏酸酯酶、 炎私头枝酶（pullulanase)、蛋白酶、酸胺酶、采 辟馱酶或甘露 聚糖酶活性。 較佳地’係將該酵素性組合物加至禽畜動物_^ -29 - (25) 200306350 胃動物)之匈料中，較佳者為豬 本發明亦關於包括至少一種根 組合物。 據本發明植酸酶之飼科 ”飼料組合物”一詞基本上 別是單胃動& ^ 係‘禽畜動物所用的飼科，特 J疋皁Θ動物，較佳者為豬或家畲 ,^ ? 性組合物之根據本發明飼料組。添加根據本發明酵素 料’因此’根據本發明飼料組合物，禽百動物的理想飼 其中至少添加至少—種根據本發^禽¥動物用的铜料， 與酵素性組合物混合後可獲得匈料^物。將詞科 明一個特別具趙實例，讀飼料组合 種根據本發明之經轉型宿 至！/ 特別具體實例，該飼料組合物至二體。根據本發明另-個 明聚核甞酸之生物體，特別是至少匕括主種具，根據本發 特別是青黴菌CBS 109899之真菌。 目黴菌屬之真菌， 較佳地，根據本發明飼料组合物係欲 中，根據本發明一個特別的具體 円動物養料 諸養料中。根據本發明另-個具飼料組合物用於 於家禽養料中。 Ha㈣组合物用 本發明主題亦為一種製備前述飼料組合物之方法。 根據本發明一個特別的具體實例，該方法包括培養根據 本發明之宿主生物體或具有根據本發明聚核苷酸之生物 體，特別是真菌類，更明確言之為青黴菌屬的真菌，特別 是青黴菌CBS 109899，利用技藝中所熟知之任何濃縮方法 濃縮該生物體，特別是過漉法或離心法’而後將所滚縮的 -30 - 200306350

(26) 生物體混入至飼料組合物中。 根據本發明另一個特別的具體實例，其係利用一種製備 該萃取物或該植酸酶（如前所述）之方法製備具有根據本 發明植酸酶活性之萃取物或植酸酶，而後將萃取物或植酸 酶混入至飼料組合物中。 本發明亦關於一種用以促進無機磷酸同化作用之方 法，該無機磷酸包含在單胃動物所攝取之植物為主飼料中 之植酸内，其中該動物攝取養料中混入根據本發明之植酸 酶或酵素性組合物。較佳地’在該方法中，該單胃動物銀 以根據本發明之飼料組合物。 本發明亦關於一種降低添加在單胃動物養料的磷含量 之方法，其中該動物餵以根據本發明之飼料組合物。 本發明亦關於一種用以降低排放源自單胃動物養料的 磷含量之方法，其中該動物餵以根據本發明之飼料組合 物。 本發明亦關於青黴菌屬之絲狀真菌，其存放編號CBS 109899 〇 下列實例係欲以說明本發明，然而，非用以限制本發明。 實例I :定性及培養青黴菌CBS 109899 1·1·特徵 30 C下，CBS 109899的菌絲在PDA瓊脂培養基（24克/升馬 龄箸葡萄糖培養液，16克/升瓊脂-瓊脂）上生長’隨著時 間’會呈現黃色。在菌柱的周邊會發現氣生菌絲，並無青 徽菌的特徵構造。將真菌於2fC下培養在MN-Uri液態培養 -31- 200306350 (27) 基（P.J.龐特（Punt)及 C.A.1VLJ.J·凡德何德爾（van den Hondel)， (1992)酵素學方法 216，447_457)下，經過2天振盪後，以過 濾法收集菌絲，並於液態氮中研磨。將1克之研磨物置於5 毫升溶解缓衝液（1% SDS、2% Triton X-100、100 mM Naa、 ImM EDTA、10mM Tris，pH 8·0)，以技藝者所熟知的酚-氯 仿方法萃取出基因體DNA。純化後，加入2倍體積的乙醇 沉澱出基因體DAN，利用高傳真聚合酶及引子ΡΝ3 (SEQ ID NO: 5)及PN4 (SEQ ID NO: 6)進行PCR增幅作用，可獲得經定 序之 1175 bp片段（SEQ ID NO: 7)。 PN3: 5，-CCGTTGGTAACCAGCGGAGGGATC-3， PN4: 5f-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3f 將此内部轉錄空間序列與資料庫中所示之ITS序列比較 後，發現與Penicillium aculeatum之ITS序列有96%的相同度， 而與蠅狀青黴菌（Penicillium funiculosum) IMI 134756之 ITS序 列有96%相同度，因此將CBS 109899命名為青黴菌。 1.2.培養條件 決定培養CBS 109899之合成培養基，其係由溶於去礦物 質水之10克/升葡萄糖、0.1 M NH4N〇3、1.5克/升KH2P〇4、 0.5 克 /升 KC1、0.5 克 /升 MgS04、10 毫克 /升 MnCl2、10 毫克 /升ZnS〇4及10毫克/升FeS〇4所組成。為了表現植酸酶，將 取自生長於PDA培養基的1平方公分菌落之菌絲樣品，接 種於30毫升的MSP3培養基（10克/升葡萄糖、NaN〇3、20克/ 升植酸鈣、〇·5克/升KC1、0.5克/升MgS04、2.2毫克/升ZnS〇4、 1·1 毫克 /升 H3B〇3、0·5 毫克 /升 MnCl2、0.5 亳克 /升 FeS〇4、017 -32- 200306350 (28) 毫克 /升 CaCl2、0.16 毫克 /升 CuS04、0,15 毫克 /升 Na2Mo04及 5 亳克/升Na2EDTA)中，30°C下振盪培養7天，以5000 rpm速度 離心培養液10分鐘，並以實例2所述者分析上清液。 實例2 :測定植酸酶活性

測定植酸酶活性是根據許米茲的方法（1992，生物科學 生物技術生物化學56 (8)，1266-1269)。此分法的原理是測定 植酸酶與其受質（其為植酸鈉溶於250 mM含有1 mM CaCl2 (pH 5.5)之醋酸緩衝液中，濃度為10克/升）之酵素反應間所 釋放出無機磷酸的含量。將磷酸與呈色劑（10.8%硫酸鐵（1 體積）與溶於0.012 M H2S04之鉬酸銨（4體積）即席混合）反應 以測定所釋放之無機磷酸含量。在高酸性培養基中，此反 應會形成有顏色的磷酸鉬酸複合物（在Fe2+存在下），以分 光光譜儀測定所產生有色溶液中700毫微米的吸收度，以 定量出所形成複合物的含量。

同時進行三個反應，以便測定37°C下在10、20及30分鐘 時酵素的動力學，添加2.5毫升20%三氯醋酸終止酵素反 應，在稀釋或未經稀釋之粗萃取物中加入20%三氯醋 酸，而後加入植酸來測定樣品干擾，以内含1 mM CaCl2， pH 5.5之250 mM醋酸緩衝液為酵素反應的空白組，反應終 止後，加入相同體積的呈色劑[1體積FeS04.7H20+4體積七 鉬酸銨溶液]測定出所釋放之磷酸含量。以分光光譜儀測 定在700毫微米藍色的強度，該強度與所使用0與1 mM範圍 間的KH2P04磷酸濃度有線性關係。利用酵素動力學反應間 所出現磷酸速度來測定酵素的活性。 -33- 200306350

(29) 實例3 :分離具有植酸酶活性之真菌萃取物 30°C下，將CBS 109899培養在錐形瓶及3至200升之發酵槽 中6至8天，該生產培養基係由10克/升葡萄糖、40克/升殿 粉、25克/升米糠、20克/升Ca2 +植酸、15克/升氯化銨、〇.5 克/升硫酸按及〇·9克/升消泡劑所組成，將PH調至5·5，但在 發酵期間未控制。4%接種量用以啟動發酵，此接種量相 當於在30°C之培養基（1〇克/升葡萄糖、1〇克/升蛋白醌、5 克/升Na-CMC、〇·5克/升硫酸鎂、0.5克/升氯化鈣、001克/ 升FeS04.7H20及〇.〇1克/升MnS04.4H20)培養3至4天。該接種 量直接以孢子或以培養真菌之一小塊培養基（PDA培養 基，30。(：下1〇天）接種之。其亦可用相同條件下之3-或4-天 培養基接種之。 發酵終了，過濾整個培養基，並經截止點為10 kDa之有 機或無機膜之超過遽濃縮濾、液，測定超過滤濃縮液樣品之 活性，活性與最初發酵體積有關。 表1 :發酵終了所獲之活性與發酵體積之函數關係 發酵槽體積 振盪 通氣 活性 rpm vvm 單位/毫升 錐形瓶 220 45-63 3升 450 1 45 30升 400 1 55-66 實例4 ··經分離根據本發明植酸酶之特徵 利用實例2中所述方法測定粗真菌萃取物之最佳pH及最 佳溫度、對pH及溫度之穩定性，及麥克利斯常數。 4·1·麥克利斯（Michaelis)常數 -34- 200306350

(30) 改變受質濃度及培養溫度來測定麥克利斯-曼頓 (Michaelis-Menten)常數（Kmapp)及最大反應速率（Vmapp)。真菌 萃取物中所含植酸酶特徵為Kmapp為550 //M，而每分鐘及每 毫克樣品所釋放磷酸之Vmapp為1.425 //莫耳。 4.2.植酸酶活性與pH之函數關係 改變pH及/或反應緩衝液的特性（PH 2 : KC1_HC1緩衝液； pH 3 :甘胺酸-HC1緩衝液；pH 4、5、5.5及6 :醋酸鈉缓衝 液、pH 7 : Tris-HCl緩衝液）來測定最佳的pH。圖1所示結果 顯示是根據所得最大酵素活性計算出之相對活性，在37 °C下測得含有植酸酶真菌萃取物之最佳pH介於pH 4及pH 5 之間。 4·3·植酸酶活性與溫度之函數關係 改變酵素反應之培養溫度來測定最佳的溫度。圖2所示 之所得數據顯示是根據所得最大酵素活性計算出之相對 活性，在pH 5.5下測得含有植酸酶真菌萃取物之最佳溫度 在50°C範圍。 4·4.植酸酶穩定性與pH之函數關係 評估植酸酶活性對酸性pH之抗性。將萃取物於4rc下暴 露於pH 2及pH 6.5後〇至180分鐘後，經稀釋，溶液的酸鹼度 在pH 5.5時仍為穩定，而後利用實例2中所述之方法測定活 性，結果顯示低至pH 3·5時，萃取物的植酸酶活性仍相當 的穩定，然而在更低的酸性ρΗ時則會快速的變性，特別 是在pH 2時。 4·5·植酸酶穩定性與溫度之函數關係 -35- 200306350

(31) 評估溫度等於或大於60°C時植酸酶活性之熱穩定性。稀 釋之萃取物溶液（最終濃度為1國際單位/毫升）置於測試溫 度下一段特定的時間（不超過30分鐘），而後回到室溫，根 據實例1A中所述之方法分析每個熱處理之溶液。在實驗 的條件下，60°C下5分鐘，植酸酶活性降低至约80%，而在 8(TC下1分鐘則降低至〇。 實例5 :純化根據本發明之植酸酶 利用截止點為10 kDa膜進行超過濾法，濃縮實例3中所獲 之真菌酵素萃取物。以20 mM甘胺酸緩衝液，pH 3清洗數 次後，可調整萃取物的離子強度及pH。 陽離子交換層析法係將所獲之濃縮物加至SP10管柱 (PerSeptive BiosSystems)中，其酸驗度為穩定之pH 3。以階段 梯度〇至溶於甘胺酸緩衝液之1M NaCl，流速為3毫升/分鐘 沖提所附之蛋白質，植酸酶活性之高峰約出現在30%之1M NaCl時。利用HR200管柱（法瑪西亞（Pharmacia))膠體滲透作 用（50 mM醋酸鈉緩衝液，pH 5.5，流速為0,7毫升/分鐘）將植 酸酶與其他活性高♦之成分分離，以銀染色法之非變性聚 丙烯醯胺膠體電泳法測定所收集分液之純度，在膠體上出 現一條蛋白質條紋，估計分子量為130 kDa。然而，經純化 之植酸酶進行SDS-PAGE電泳法後，可發現兩條聚肽條紋， 一條主要條紋的相對移動距離在70 kDa處，而另一條次要 者則在90 kDa移動距離處。 實例6 :經純化植酸酶之微定序 6.1.測定N-端序列 -36- 200306350

(32) 將SDS-PAGE電泳法所獲70及90 kDa聚肽條紋處之聚肽於 4°C 下轉潰至 PVDF膜（ProBlott，Applied Biosystems) 15 小時，用 醯胺黑10B (西格瑪（Sigma))染色偵測聚肽，並加以定序（巴 斯德研究院，蛋白質微定序實驗室，巴黎）。兩條條紋聚 肽具有相同的N-端序列（SEQ ID NO: 8)。 此結果結論是SDS-PAGE上所鑑定出之兩聚肽條紋可能 是相同的聚肽，其移動速率的差異可能導因於純化步驟時 聚肽部分分解。 6.2.測定植酸酶内部片段之胺基酸序列 以SDS-PAGE電泳法分離70及90 kDa之2條聚肽，並以醯胺 黑染色偵測之。自膠體上將70 kDa聚肽條紋切下來，在37 °C下，以内離胺酸C·酵素（Endolysine-C)原位消化該聚肽18 小時，以C18 DEAE管柱之HPLC分離肽片段，利用微定序法 定序所得之4條内部片段之序列（SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11 及 SEQ ID NO: 12)。

SEQ ID NO: 8 ： IPTDPQVPQ/VYF

SEQ ID NO: 9 ： TSGGDAVNEWTALYLQK

SEQ ID NO: 10 ： AGGAPFLAQXNPIYXQPXYV

SEQ ID NO: 11 ： LYDPASK

SEQ ID NO: 12 ： APGLVR 實例7 :製備有關青黴菌CBS 109899植酸酶之分子探針 微定序之後，從肽的序列推論出寡核甞酸，利用PCR增 幅編碼青黴菌CBS 109899植酸酶基因之DNA片段。 7·1. PCR引子設計 -37- 200306350

(33) 從内部序列SEQ ID NO: 9之N_端胺基酸序列推論出引 子，N-端的序列推論出4群正向簡併引子，而内部序列SEQ ID NO: 9序列則推論出1群逆向簡併引子。每群正向引子可 個別與逆向引子使用。 7.2·增幅有關植酸酶之基因體DNA片段 首先，將青黴菌CBS 109899培養在液態MN-Uri培養基中 (28它，180 rpm，2天），以過濾法收集菌絲，並於液態氮中 研磨。以5毫升的溶解緩衝液（1% SDS、2% Triton X-100、100 mM Naa、1 mM EDTA及 10 mM Tris，pH 8.0)及 5毫升酚來萃 取1克研磨物質中之基因體DNA，經過酚/氯仿及氯仿萃取 作用之水相純化後，添加2體積之乙醇沉澱出基因體DNA。 以100毫微克基因體DNA及1單位之Taq聚合酶（Q-BIOgene) 及型號為PTC-200之MJ研究用熱循環器進行PCR反應。每個 PCR反應產物以0.8%瓊脂膠片進行分析。獲得對應引子OT ACS 17 P4.4 (SEQ ID NO: 13)及 OT ACS 25 P6.1 (SEQ ID NO: 14) 之850 bp之核甞酸片段，直接次選殖至載體pCR4-TOPO(因 威特基因公司（Invitrogen))上並定序之（SEQ ID NO: 15)。 分析序列顯示增幅時所用之兩個引子存於增幅片段的 兩邊，且根據其所推論之胺基酸與植酸酶微定序所得者相 符。除此之外，内部肽片段SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 11 之胺基酸序列出現在DNA片段所推論之胺基酸序列中，這 些發現得到結論是DNA片段對應於微定序之植酸酶，並 將其命名為OT ACS 29.1。而後以此DNA片段作為選殖編碼 純化植酸酶基因之同源相似分子探針。 -38- 200306350

(34)

OT ACS 17 Ρ4·4 (SEQ IS NO: 13) 5，-ACNGAYCCNCARGTCCC

OT ACS 25 P6.1 (SEQ ID NO: 14) 5，-GCNGTCCAYTCRTTNAC 實例8 :選殖及定性青黴菌CBS 109899植酸酶之基因 8.1.測定有關植酸酶cDNA之序列 增幅獲得完整的cDNA序列，次選殖，並根據5’及3’ RACE-PCR技術定序其5,及3,端。 首先，將青黴菌CBS 109899培養在可以謗發植酸酶條件 下之培養基，其成分濃度為40克/升澱粉麵粉、25克/米糠、 20克/升植酸鈣、10克/升葡萄糖、15克/升NH4C1及0.5克/升 MgS04.7H20，pH 5.5，並添加0.06克/升糖澱粉酶AMG 300升 (諾瓦赛姆公司（Novozymes))及0.18克/升阿爾法澱粉酶耐高 溫藏粉酶（Termamyl) 120升（諾瓦赛姆公司）。持續培養直至 培養基中植酸酶活性達10單位/毫升。培養基經濾紙（瓦特 曼（Whatman))過濾回收菌絲，而後在液態氮中研磨，利用 酚萃取作用（溶於含有10 mM EDTA之50 mM醋酸鈉緩衝 液，pH 5·3)萃取所有的RNA，而後以GeneRacer套組（因威特 基因）進行mRNAs之反轉錄作用，所合成之cdNA具有特定 之5’及T端核甞酸序列，為便而後的PCR增幅作用。為了專 一性增幅感興趣cDNAs端，自對應肽序列SEQ ID NO: 10區 域之分子探針推論出2條引子（一條向5’端，名為OT ACS 37 PI (SEQ ID NO: 20)，另一條向 3,端，名為 OT ACS 37 P3 (SEQ ID NO: 21)。 以1微克cDNA及1單位之Taq聚合酶（Q-BIOgene)及型號為 PTC-200之MJ研究用熱循環器進行PCR反應。所增幅之產物 -39- 200306350

(35) 以0.8%瓊脂膠片進行分析。將對應5’端之0.3 kb區域之片段 及對應3’端之1.7 kb者直接次選殖至載體pCR4-TOPO (因威 特基因）上，而後定序之，將完整之cDNA序列重新構築（SEQ ID NO: 2)。 OT ACS 37 PI (SEQ ID NO: 20) 5,-GGCGCTCCGTTCCTTGCGCAAAC-3, OT ACS 37 P3 (SEQ ID NO: 21) 5,-GTAGGTCGGCTGGGAATAGATCG-3, 8.2.次選殖含有基因之EcoRV基因體DNA片段 利用基因體步移技術選殖基因體DNA之片段。首先，將 接合核酸子接合至EcoRV限制酶切割片段上。為達此一目 的，利用T4 DNA接合酶於含有10 mM MgCl2、10 mM二硫蘇 糖醇、1 mM ATP及0.25微克/亳升牛血清白蛋白之50 mM Tris_HCl緩衝液（pH 7.5)，將經EcoRV切割之青黴菌CBS 109899基因體DNA之產物於16 °C下15小時接合至 GenomeWalker Adaptor (克隆特（CLONTECH)實驗室公司），在 7〇°C下熱處理終止反應，並將反應混合物溶解於200微升 之超純水中。 為了利用PCR增幅EcoRV限制酶切割片段51及Y端之區 域，自分子探針推論出兩條正向引子，一條方向向5’端， 命名為OT ACS 32 P5 (SEQ ID NO: 16)，另一條方向向3·端， 命名為OT ACS 32 P3 (SEQ ID NO: 17)。命名為接合核酸子引 子（Adaptor Primer)(克隆特實驗室公司）之反向引子則用以 進行對應接合核酸子5’端之PCR反應。 以1微升之接合產物及1單位之AdvantaSe Genomic聚合酶 混合物（克隆特實驗室）及型號為PTC-20〇i MJ研究用熱循 -40- 200306350

(36) 環器進行PCR反應。每個PCR反應產物以0.8%瓊脂膠片進行 分析。

次選殖對應5’端之1.8 kb及對應3’端之1.3 kb之兩條片 段，並定序分析之。因為EcoRV片段之5’及1端核苷酸序列 是可用的，因此設計出對該端具有專一性之引子，命名為 OT ACS 38 PI (SEQ ID NO: 18)及 OT ACS 38 P2 (SEQ ID NO: 19)。利用高傳真聚合酶增幅完整之片段，以100毫微克青 黴菌CBS 109899基因體DNA及1單位之PLATINUM Pfx DNA聚 合酶（賴夫技術（Life Technologies)公司）及型號為PTC-200之 MJ研究用熱循環器進行PCR反應。增幅產物以0.8%瓊脂膠 片進行分析，將3.8 kb片段直接次選殖至載體pCR4_TOPO (Invitrogen)上，並定序之（SEQ ID NO: 1)，並命名為 OT ACS 38.1。 8·3·分析CDNA及基因之序列 自cDNA推論出胺基酸序列並分析之（SEQ ID NO: 3)。在此 胺基酸序列中發現以微定序法所獲植酸酶之内部肽序 列，證實所定序之cDNA對應感興趣之植酸酶。除此之外， 推論之胺基酸序列包含磷酸之键結專一性位置（RHGXRXP) 及親核攻擊位置（HD)，此特徵將植酸酶歸類屬於組胺酸磷 酸酶群。將cDNA與OT ACS 38.1基因體之DNA片段排列比較 後更精確指出感興趣基因之限制性及其所含基因内子所 在。 實例9 :同源相似序列研究 9·1·構築蠅狀青黴菌IMI 134756株之黏粒質體庫 -41 - 200306350

(37) 將蠅狀青黴菌IMI 134756培養在液態MN-Uri培養基中（28 °C，180 rpm，2天）。以過濾法收集菌絲，並於液態氮中研 磨。以5毫升的溶解緩衝液（1% SDS、2% Triton X-100、100 mM NaCl、1 mM EDTA及 10 mM Tris，pH 8·0)及 5亳升酚來萃取 1 克研磨物質中之基因體DNA，經過酚/氯仿及氯仿萃取作 用之水相純化後，添加2體積之乙醇沉澱出基因體DNA。 將經Sail限制酶部分切割之20微克產物加至瓊脂糖膠 (低溫熔解）上，以便在0.5 X TBE緩衝液中進行脈衝式電泳 分析（18小時，5伏特/公分），經溴化乙錠染色後，用yS -瓊 脂糖酶（GIBCO-BRL)將膠片上30至40 kb長度之片段分解出 來，並以乙醇沉澱之。將此部分之基因體DNA接合至事先 經Xhol切割並經牛小腸磷酸酶去磷酸化之載體pMOCosX [歐佩克（〇rbach)(1994)，基因150, pp 159-162]上，將接合產物 與 λ 嗜菌體元素（Packaging Protocol-STRATAGENE ; Gigapack Gold-11)反應後，可以轉染大腸桿菌Q358株（曼尼亞迪斯 (Maniatis)等人，1982)。將其圖覆在添加50微克/毫升安皮西 林之Luria及Bertani (LB)瓊脂培養基上，將菌落懸浮於50 96 槽孔微量盤，隔夜培養於150微升添加50微克/毫升安皮西 林之LB中。在添加甘油（最終濃度為50%)之前，將培養物 移轉複製於Hybond N+膜（安莫新（AMERSHAM))上，並保存 於-80°C下。 9.2.用探針OT ACS 29.1篩選黏粒質體庫 利用探針OT ACS 29.1進行蠅狀青黴菌IMI 134756株基因 體DNA之南方墨潰分析法。將事先經數個限制内核酸酶消 •42· 200306350 (38) 化並經電泳法分離之基因體DNA轉潰至膜上，並於65°C下 在雜化緩衝液（7% SDS ; 0.5M磷酸鈉，pH 7.0)中進行前雜化 作用10分鐘，利用DNA標記套組（安莫新）將探針以α -32P dCTP標記，經標記之探針加至雜化緩衝液中，並且該混合 物在使用前於l〇〇°C下加熱5分鐘。在65°C下進行雜化作用 6小時，雜化作用後，膜在65°C之清洗緩衝液（1% SDS; 0.1M 磷酸鈉，pH 7.0)中清洗3次15分鐘，而後進行底片感光。此 分析結果只有一個訊號，因此蠅狀青黴菌IMI 134756只含 有一套感興趣基因。利用探針OT ACS 29.1於相同的嚴苛條 件下篩選黏粒質體庫，而在膜編號15、19及48上顯示出數 個訊號，因而鑑定出對應膜編號15之黏粒質體15F10含有 可與探針OT ACS 29.1雜化之DNA序列。進行此黏粒質體 DNA之限制酶切割分析，以定出相對基因的位置。該基因 命名為phyF。選殖及定序黏粒質體15F10之1.3 kb Ncol片段 顯示與OT ACS 29.1序列具有極高的同源相似性，完整的 phyF位於2.7 kb EcoRV-EcoRI片段上，經選殖並定序（SEQ ID NO: 4)。 序列分析顯示具有790 bp啟動子區域，及位於ATG 791處 之編碼phyF之起始序列。PhyF具有153 6bp (位置791-2527)， 包括兩個推論之基因内子，長度為35 bp及61 bp。 實例10 :包含於OT ACS 38.1 (SEQ ID NO: 1)中基因之重組表 現作用 10.1. 數套基因引入至蠅狀青黴菌IMI 134756 將數套選殖基因（OT ACS 38.1)引入至只產生少量植酸酶 -43 - 200306350

(39) 之蠅狀青黴菌IMI 134756基因體中，並觀察經轉型選殖體 是否能增加生產力，以確認該選殖基因之有效性。 為此，根據國際專利案00/68401所揭示之技術，以含有 片段OT ACS 38.1之質體及pAN7-l質體共同轉型蠅狀青黴菌 IMI 134756(龐特等人，1987 ;基因，56: 117-24)，並以潮黴素 篩選之。轉型作用之後，利用分子探針0Τ ACS 29·1，以南 方墨潰分析法確認數套感興趣基因之引入。根據實例9中 所揭示之條件進行南方墨潰分析法，候選轉型菌株之基因 體DNA係以EcoRI限制内核酸酶切割。 陽性候選菌株於可以謗導植酸酶條件下之50毫升之培 養基中培養，該培養基係由20克/[lacuna]植酸鈣、10克/升 葡萄糖、8克/升NH4N〇3、5克/升KC1及5克/升MgS04.7H20所 組成，並添加1毫升/升之微量元素溶液（2.2% ZnS04.7H20、 1.1% H3B〇3、0.5% MnCl2.4H20、0.5% FeS04.7H20、0.17% CoC12.6H20、0.16% CiiS04.5H20、0.15% Na2Mo04.2H20及 5.0% Na2 EDTA，pH 6.5)。測定培養基中植酸酶之活性《 2株候選菌株分析後所得之結果示於表2中，未經轉型之 蠅狀青黴菌IMI 134756為控制組。 表2 :監控2株經OT ACS 38.1片段轉型之蠅狀音黴菌IMI 134756候選菌株及野生型蠅狀青黴菌I]V[I 134756培養液中 植酸酶之活性（單位/毫升） 天數 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 Dll D12 D14 IMI 134756 0 0 0 1.1 0.8 0.9 1·3 1.2 0.9 1.5 1.4 候選菌株1 0 0 0 2 1.3 1.2 2.2 1.7 2.5 3.6 4.1 候選菌株2 0 0 0 2.2 1.8 1.4 1.4 1.3 2 2.6 3 -44- 200306350 (40) 培養基中所監控之植酸酶活性結果顯示，該兩個測試候 選菌株之基因體中已經引入數套的OT ACS 38.1，植酸酶的 生產力提高了 2-至2.5倍。此結果證實包含於OT ACS 38.1片 段中之感興趣基因編碼一種植酸酶，且青黴菌之基因體中 含有數套該基因後會增加植酸酶之生產力。 10.2.異源性啟動子控制下的基因表現 利用含有國際專利案00/68401中所揭示之CS131基因啟 動子及終止子之表現g來表現編碼感興趣植酸酶之基因 體DNA片段OT ACS 38.1之區域。為此，在Swal位置引入在 啟動子端之後，以Swal/Spel限制内核酸酶切割表現匣，利 用下列的引子增幅基因體DNA片段OT ACS 38.1中所含編碼 植酸酶之區域。

PhyGoamp4 5’TAGATATCACGATGCTCAAGCTATATGTAGCTGC 3,（SEQ ID NO: 22)及

PhyGoamp5 5，ATACTAGTTTAGGACGTAGCATTCTTCGGAATAG 3,（SEQ ID NO: 23)。 PCR反應是以濃度為10微微莫耳之引子及1單位 PLATINUM Pfx DNA聚合酶（賴夫技術公司）於此聚合酶（賴 夫技術公司）有關之緩衝液50微升中，在型號為PTC-200之 MJ研究用熱循環器中進行。以EcoRV及Spel限制内核酸酶 切割PCR產物，並接合至載體pBCMT上，因此將所獲之質 體命名為pCP。 為此，根據國際專利案00/68401所揭示之技術，以含 有片段OT ACS 3 8.1之質體及ρΑΝ7·1質體共同轉型蠅狀青黴 菌ΙΜΙ 134756 (龐特等人，1987 ;基因，56: 117-24)，並以潮黴 •45- (41) (41)200306350

素碎選之。利用分子探針〇T ACS 29」，以南方墨潰分析法 確認基因體中引入pCp匣之候選菌株，8個候選轉型菌株之 基因體DNA係以EcoRl限制内核酸酶切割。分析後，篩選出 4個共同轉型菌株，並於培養於csl31啟動子謗導條件下。 分析該基因的表現作用，並測定植酸酶之活性。 4個所篩選候選菌株培養於125毫升之錐形瓶中，其内含 有50毫升添加1%玉米漿之最少營養培養基。於28它下，以 180印111振|速度培養48小時及72小時後，收集菌絲，以探 針OT ACS 29.1，取每個樣品20微克總RNA進行北方墨潰分 析（山姆布魯克等人，1989，分子選殖：實驗室手冊）。清洗 膜後’利用STORM磷光影像分析儀（分子動力公司 (Molecular Dynamics))察視訊號。 結果顯示經PCP轉型之候選菌株只有一個訊號，而在未 轉型控制組中則缺少該訊號，此證明該基因可在esl31啟 動子控制下表現。 同時，測定每個培養液中植酸酶活性，結果示於表3中。 表3 :測定4株經PCP轉型並培養在csl31啟動子謗導條件下 之候選菌株，於48小時及72小時之植酸酶活性（單位/毫 升），蠅狀青黴菌IMI 134756為控制組。 48小時 72小時 控制組 0 0 候選菌株1 1 1.2 候選菌株2 0.8 1.7 候選菌株3 0.7 1.2 候選菌株4 1.7 2.9 -46 - 200306350

(42) 結果分析顯示植酸酶只存在於對應經pCP轉型候選菌株 之上清液中，此結果與該基因的表現作用相符，並證實基 因體DNA片段含有編碼植酸酶之基因。 實例11 :培養青黴菌CBS 109899之最佳化條件 11.1.振盪對植酸酶產生的影響 於實例3的條件下進行發酵作用，振盪的速度範圍從400 至 450 rpm (表 4)。 表4 :發酵作用終了所獲活性與振盪速度之函數關係 發酵槽 振盪 活性 體積 rpm (單位/毫升） 30升 400 66 30升 425 48 30升 450 36 這些結果顯示增加振盪速度對原生青黴菌CBS 109899之 植酸酶產生有負面效應。 11.2. 氮源對植酸酶產生的影響 於實例3的條件下進行發酵作用，唯一改變的參數是氮 源（米糠），其以不同的氮源，黃豆麩取代之（表5)。 表5 :發酵作用終了所獲活性與氮源之函數關係 氮源 活性（％) 米糠 100% 黃豆麵 128% 這些結果顯示氮源對原生青黴菌CBS 109899之植酸酶產 生有影響，明確言之，以黃豆麩為氮源者可促進植酸酶之 -47- 200306350

(43) 產生。 11.3· 植酸來源對植酸酶產生的影響 於實例3的條件下進行發酵作用，唯一改變的參數是 Ca++植酸，其以Ca++及Mg++雙鹽取代之（表6)。 表6 :發酵作用終了所獲活性與植酸來源之函數關係 植酸鹽 活性（％) Ca++ 100% Ca++及 Mg++鹽 120% 這些結果顯示植酸來源對原生青黴菌CBS 109899之植酸 酶產生有影響，明確言之，鈣及鎂雙鹽之植酸來源者較鈣 鹽者能促進植酸酶之產生。 11.4.植酸含量對植酸酶產生的影響 於實例3的條件下進行發酵作用’唯一改變的參數是發 酵培養基中所存的植酸含量（表7)。 表7 :發酵作用終了所獲活性與植酸含量之函數關係

Ca++植酸克/升 活性（％) 20 100% 15 70% 10 60% 0 1%

這些結果顯示發酵培養基中所存植酸含量明顯增加原 生青黴菌109899之植酸酶產生。 實例12 :青黴菌CBS 109899所產生植酸酶之動物技術功效 12· 1.補充植酸酶之飼料對公雞磷消化性的效應 -48- 200306350

(44) 此實驗以20隻公難進行，將動物分成兩組，每組10隻’ 一組為試驗組，另一組為控制組，而後個別飼養在籠子 中。動物餵食缺乏可消化磷之玉米及大豆為主之飼料’但 試驗動物餵食飼料中則每公斤飼料中補充702國際單位 (國際單位=37°C下，每分鐘能催化1〇克/升植酸鈉溶液（PH 5·5)釋放出1 #莫耳麟酸之植酸酶含量）之植酸酶。 實驗開始後2及3天收集動物的糞便，以分析磷的排放 量。磷消化性為對應動物消化磷與其所攝取量比較後之百 分比，此百分比是從糞便中所發現的磷排放量推論出來的 (表 8) 〇 表8 :磷攝取量、排放量及消化性 磷 攝取量 排放量 消化性 (克/公斤） (克/公斤） (%) 基礎飼料 0.804±0.003 0.319 + 0.019 60.3 + 2.5 補充702國際單 位/公斤植酸酶 0.801±0.011 0.255土 0.028 68.1±4.4 _>飼料 表6清楚顯示缺乏消化性磷之基礎飼料中補充根據本發 明植酸酶後’可明顯地減少磷的排放量（p<〇 〇5)。此效應 反應出動物餵食補充性飼料後可增加磷的消化性，其顯示 根據本發明植酸酶於釋放攝取飼料中無法消化磷之功效。 12·2·補充植酸酶之飼料對雞的生長效應 以210隻羅絲308種系之難進行此實驗。將動物分成6組， 每組35隻，4組銀食不同劑量之植酸酶，一組餵食不含植 •49- (45) 200306350

酸酶 < 陰性控制組，而一組則餵食含有無機磷飼料、h * » , 竹之陽性 二1、、且。以每個蘢子飼養5隻動物之比例飼養動物， 13天（攸第9天大餵食至22天大卜基礎飼料 養 一 η怎米及土 Α所組成’並缺乏消化性磷（Ρ))中添加4種不同濃户、只 Ϊ& :在·八μ & ^^植酸 •母a斤飼料添加243、433、738及1234國際單位， 4組試驗動物，而陽性控制組中則添加鱗酸單句食 〇·1%無機磷。 —艾鈣之 。這些 應於所 所攝取 只驗開始及結束時測量動物的體重，以計算生長 測量值定出體重增長及消耗指數（CI)。消耗指數對 消耗之飼料含量與所增長體重之比。以特定量甸料 指數的降低表示動物所獲體重增加，換言之，動物 之飼料有較佳的同化作用。結果示於表9。 表9 :植酸酶對難的生長效應 • 50 - 200306350 (46) 衅萆麵闼 ^243画眾邾命/>>/}- 433週眾挪命/>>斗 738画學驷命/>>斗 1234涵學驷命/>>4-添薛髂產^ 遂珈鷂142161+76 3691+88 4351+82 4521+97 4971+81 4611+72 S ηι 2·28±0.91 L74I+0.52 1.571+0.34 1·61±0.44 L51±0.26 L51I4-P23 离雜米¾邻潜^遂冷隹炒；一:皋逾韋奇珠鶴杆碜涩鉢黪罄243 ' 433 ' 738涔1234画承挪命/>>;1-薄”岭遂^竣#斤^^鷂14-今埜^1.7-'2*0-'2.1知2.3-带-^渺#一^蛛^^^綠^施^|1時簿 盡^齡族#~逾单汁。芪藎^钭呤施穿族衆鈦婵--fvwfs33%。

-51- 200306350

(47) 12。3.補充植酸酶之飼料對雞骨骼礦物化的效應 以210隻羅絲308種系之雞進行此實驗。將動物分成6組， 每組35隻，4組餵食不同劑量之植酸酶，一組餵食不含植 酸酶之陰性控制組，而一組則餵食含有無機磷飼料之陽性 控制組。以每個籠子飼養5隻動物之比例飼養動物，餵養 13天（從第9天大餵食至22天大）。基礎飼料（其由玉米及黃 豆所組成，並缺乏消化性磷（P))中添加4種不同濃度之植酸 酶：每公斤飼料添加243、433、738及1234國際單位，餵食 4組試驗動物，而陽性控制組中則添加磷酸單鈣或雙鈣之 0.1 %無機麟。 第14天時，取出每隻動物之脛骨，測量脛骨重量並焚 化，分析其灰份、#5及磷的成分，結果示於表10中。 表10 :植酸酶對雞骨骼礦物化之效應 實驗處理 陰性 控制組 243國際 單位/公斤 433國際 單位/公斤 738國際 單位/公斤 1234國際 單位/公斤 陽性 控制組 脛骨磷 (毫克） 89.1 138.2 157.8 180.1 215.9 184.1 SD ±22.5 ±21.4 ±28.1 ±41.2 ±37.6 ±14.8 脛骨鈣 (毫克） 43 66.7 76.8 87.8 103.6 89.7 SD 土9.6 ±9.3 ±13.6 ±18.6 土 19.3 ±8.0 脛骨灰份 (毫克） 309 473 527 594 683 602 SD ±71 土54 ±71 ±102 土 106 ±42 這些結果清楚顯示所有補充根據本發明植酸酶之試驗 濃度對雞骨骼礦物化均有正面的效果，明確言之，根據本 -52- 200306350

(48) 發明植酸酶可促進骨骼鈣及磷之礦物化作用，且亦可增加 其灰份量，除此之外，每種所測之參數均發現會隨著植酸 酶劑量的增加而增加的效應。 12.4. 補充植酸酶之飼料對豬磷及鈣消化性的效應 此實驗以7隻平均重量約為70公斤重之豬進行。動物手 術進行迴直腸吻合術，以便定量收集其迴腸中成分。根據 實驗所需個別飼養這些動物。 動物餵食以玉米及黃豆為主之三種飼料，每公斤飼料補 充300及600國際單位之植酸酶，每一動物連續餵食一種飼 料6天，在第7天收集迴腸中成分，而後改變飼料。分析迴 腸成分中的鈣及磷含量，而後測量此兩種元素之消化性， 結果示於表11中。 表11 :植酸酶對緒磷及#5消化性的效應 控制組 300國際單位/公斤 600國際單位/公斤 Ca消化性(％) 42·73±7·40 45.26±2.49 47·09±8·14 P消化性(％) 39.46土 11.86 43·06±9·11 47·52± 15.23 飼料中補充根據本發明植酸酶明顯增加鈣及磷之消化 性。每公斤飼料中補充300及600國際單位者之鈣的消化性 分別增加5.6及9.3%，而每公斤飼料中補充300及600國際單 位者之磷的消化性則分別增加8.4及17%。 12.5. 補充植酸酶之飼料對仔豬嶙消化性的效應 此實驗以12隻平均重量約為11公斤重之仔豬進行。動物 分成兩組，每組6隻，一組動物為實驗動物，另一組為控 制組動物，分別飼養於蘢子中。這些動物餵食缺乏消化磷 -53- 200306350

(49) (P)之玉米及黃豆飼料，及每公斤飼料補充481國際單位植 酸酶之飼料2 6天。 從實驗第21天起收集動物糞便5天，以分析其磷及鈣成 分。磷消化性對應動物所消化之磷及鈣與所攝取含量之百 分比。此百分比從糞便中所發現之排放量推論出來（表12)。 表12 :植酸酶對仔豬磷消化性的效應 攝取量(克） 排放量(克） 消化性(％) 磷 控制組 1.007 士 0.127 0.800±0·078 20· 11 ±5.79 481國際單位/公斤 1.145±0.124 0.573 土 0.111 50.28±6.52 #5 控制組 1.873 ±0.237 1·228±0·180 34·2±7·73 481國際單位/公斤 2·131±0·234 1.102±0.102 48.62土8.44 這些結果顯示飼料中補充根據本發明植酸酶會增加磷 消化性250%，而增加鈣消化性42%。 12.6.補充植酸酶之飼料對仔豬的生長效應 此實驗以12隻平均重量約為11公斤重之仔豬進行。動物 分成兩組，每組6隻，一組動物為實驗動物，另一組為控 制組動物，分別飼養於蘢子中。這些動物銀食缺乏消化磷 (P)之玉米及黃豆飼料，及每公斤飼料補充481國際單位植 酸酶之飼料26天。 實驗開始及結束時測量動物的體重，以估算生長。這些 測量值可算出增長體重及消耗指數（CI)。結果示於表13。 •54· 200306350

(50) 表13 ··植酸酶對仔豬的生長效應

6·75±0·88 14.86±1·41 8·11±1·66 .63±0·88 控制組 實驗處理 6·81 土 〇·69 13·34± 1.58 6·53± 1.72 2.31土 1.85 最初體重（公斤） 最後體重（公斤） 增長的體重（公斤）

CL 這些結果顯示缺乏消化磷之基礎飼料中添 明植酸酶481國際單位/公斤會增加體重24% ’此補^ 顯減少消耗性指數D ^ 12.7.補充植酸酶之飼料對仔豬骨骼礦物化的效應 實驗以12隻平均重量約為u公斤重之仔豬進行。動物 二二’每Μ隻，—组動物為實驗動物… 制組動物’分別飼養於籠子中。這些動物餵 磷（P)之玉米及黃豆翻抖，男在八Ah < 了巧化 只二飼科及母公斤飼料補充481國 植酸酶之飼料26天。 圏際早位 實驗第27天時出每隻動物之脛骨，測量 :化.，分析其灰份、躬及磷的成分，、结果示於表^量並 Μ ·植酸酶對仔豬骨骼礦物化的效應 ________ 〜 實驗處理 ^ --—* ---_______ 腰骨鈣 % L66±010 壙物（％ ) 356 士0 30 4初 土 〇·42 果顯示缺乏可消化磷之基礎飼料 單位/公斤姐祕士 竹甲補无481國際 化，明確+ > ^ 3刀仔豬骨骼礦物 曰义，根據本發明植酸酶可促進骨骼 J久憐 < 礦 —10.45^0.69 ^.^±0.55 -55- 200306350

(51) 物化作用，且亦可增加其礦物質量。 圖式簡單說明 圖1 :青黴菌CBS 109899之植酸酶活性與pH的函數圖。相 對100%活性數值係對應特定pH下之最佳植酸酶活性。 圖2 :青黴菌CBS 109899之植酸酶活性與溫度的函數圖。 相對100%活性數值係對應特定溫度下之最佳植酸酶活 性。

-56- 200306350 序列清單 <110> Adisseo <120>新穎植酸酶及製備此等植酸酶之方法 <130> PM01046 <140> 091135682 <141> 2002/12/10 <150> 0115954 <151〉 2001-12-10 <160> 23 <170〉專利版2.1

<210> 1 <211〉 3753 <212> DNA <213〉青黴菌 CBS 109899 <220> <221>基因内子 <222> (1491)..(1550) <220> <221>基因内子 <222> (1703)..(1764) <400> 1 ggctttgctg gtgcggggtg dgtccgctgg ttggctcgct tccgscgcC^ cgaCttcagc 60 gtcggcttg^ gccatigatag ccgccagggt ggct^cgact cggtc^tgga ^ct^tgcgag 120 agtctcaccd cgtcgcqgtg ggatcaciA^ tgg^ttgtag agactetcag ggttttcggc 180 gag^dacg^9 g^ti-cag3ac «tttgccgda acgg^agcgg gd^gttc-aaa 240 tgtg^tgcct ccgddccdtt cgccatgtca $agctgccaa ccccctcttc cctaaccata 300 cca^tggstg actgccctac cctsatccst tttcgactct gacgttgaga tctgtcccag 360

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<210> 2 <211> 1761 <212> DNA <213> 青黴菌 CBS 109899 <220> <221> CDS <222〉（89)..(1711) <400> 2 ^ccggactct caaggtttca tccaacaccc attgtccttc ggtccatatt ctatacagea 60 1X2 gaatcag孩ac tgtatttcga ttaccacg atg etc aa^ eta tat gta get gee

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<210> 7 <211〉 1175 <212> DNA <213〉青黴菌 CBS 109899 <400> 7 ccgttggcaa ccageggagg gatcatcaec gagtgcgggc ectcgcggcc caacctccca 60 ccctt^tccc tatacacctg ctgcttt<jgc gggcccaccg gggccacccg gtcgccgggg 120 gacgcacgtc cccgggcccg cgcccgccga agcgcgctgt gaaccctaat gaagangggc 180 tgcctgagta etAtgaaaat tgtcaaaact ttcaacaatg gatctcttgg ttccggcatc 240 gatgaagaac gcagc^aaat gcgataagta atgtgaattg cagaattccg tgaatcatcg 300 ^atcctcgaa cgcacattgc gccccctggc attccggg9Q gcatgccugt ccgagcgtca 360 tttct9ccct caagcac^gc tggtgtgttg ^gtgtg^tcc cccc^^gac ctgccc^aaa 420 ggcagcggcg acgtcc^tct ggtcctcgag cgtatggggc tctgtcactc cfctcgggaag 4$ΰ gacctgc^g ggttggtcac cacciicattc taccacggtt gacctcggat c^ggtaggag 54 0 ctacccgctg aactt^agca catcaataag cg^a^^aaaa gaaaccaacc gggatt^cct 600 c&gtaacggc gagtgaagcg ^csagagctc aastttgaad tctggcecct ttggggtcc<5 660 agf：tgcaatt tgcagaggar gcctcggig-tg cggtcCCOgt ctasgtgccc LggAacgggc 720 cgtcatagag ggtgagaanc ccgtctggga tgggcggccg cgccdjtgtg aagctccctc 7$0 gacgagtcga ^Ctgtttggg a^tgcagctc tasgcgggtg gtaiAatCtcd tctaaagcta 840 aatactggcc ggagacegat a^egcacaag aa^cactttg 900 aa«Ldgdg^9t raaacagcdc gtgdaattgt t9aaag$94吞 gc^ttgtcca ccagactcgc 960 tcagccggca c^tgtgccgg tgtacccctc tccgggcggg ccagcatcgg 1020 tttcrggcggc tggtgaaagg ccccgggaat gcaacaccct tcggggtgcc ttatagcccg 1080 gggigrccatd cagccagcct ggaccgaggc ccgcgcttcg gcgaggatgc tggcgt-aatg 1140 grggccaacg gcccgtcttg aa^cacggac caagg 11*75 <210> 8 <211> 11 <212〉蛋白質 <213〉青黴菌 CBS 109899 <220> <221>未確定 <222> (9) <223〉kaa = Glu或 Val <400> 8 lie Pro Thr Asp Pro Gin Vai Pro Xaa Tyr Phe 1 5 ：0 <210> 9 <211> 17 <212>蛋白質 <213〉音黴菌 CBS 109899 <400> 9

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<210> 10 _ <211〉 20 ~ <212〉蛋白質 <213〉音黴菌 CBS 109899 <400> 10

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Ala Pro Giy Leu Val Arg l 5 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉人工序列說明寡核：y：酸OTACS17P4.4 17 <400> 13 acngayccnc argtccc > > Λ > 0 12 3 ΙΑ ΙΑ IX IX 2 2 2 2 V < V < 列 najl 1417DN人 <220> <223>人工序列說明寡核甞酸OTACS25P61 <400> 14 gcngtccayt orttnac

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<400> 19 cctgcgggtt cgtaactttg tctgtaactt gac 33 <210> 20 <211〉 23 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉人工序列說明寡核苷酸OTACS37P1 <400> 20 ggcgctccgt tccttgcgca aac 23 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉人工序列說明寡核甞酸OTACS37P3 <400> 21 gtaggtcggc tgggaataga teg 23 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>人工序列說明寡核嘗酸phyGoamp4 <400> 22 tagatatcac gatgctcaag ctatatgtag ctgc 34 <210> 23 <211〉 34 <212〉DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列說明寡核^:酸phyGoamp5 <400> 23 atactagttt aggaegtage attettegga atag 34 -10-

Claims (1)

1. 200306350 拾、申請專痴範園 1. 一種編碼植酸酶之經分離聚核甞酸，其選自下列所組 成之群： (a) 編碼SEQ ID NO: 3所示植酸酶之經分離聚核：y：酸 (b) 可與根據（a)之聚核甞酸雜交之經分離聚核甞酸 (c) 與根據（a)之聚核苷酸同源之經分離聚核苷酸 (d) 根據（a)、（b)或（c)之聚核铭酸之片段。 2·根據申請專利範圍第1項之聚核甞酸，其係選自如SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2所示之序列。 3·根據申請專利範圍第1項之聚核甞酸，其如SEQ ID NO: 4 所示之序列。 4。根據申請專利範圍第1至3項中任一項之聚核苷酸，其源 自青黴菌屬之真菌。 5· —種經分離聚核：y：酸，其包括根據申請專利範圍第1至 3項中任一項之聚核甞酸。 6· —種植酸酶，其係由根據申請專利範圍第1至3項中任一 項之聚核甞酸所編碼。 7.根據申請專利範圍第6項之植酸酶，其係選自下列所組 成之群： (a) SEQ ID NO: 3所示之植酸酶 (b) 與根據（a)之植酸酶同源之植酸酶 (c) 根據⑷或（b)之植酸酶之片段。 8·根據申請專利範圍第6項之植酸酶，其源自青黴菌屬之 真菌。 200306350 mmmm 9. 根據申請專利範圍第8項之植酸酶，其源自青黴菌CBS 109899 。 10. —種嵌合基因，其功能性連結至另一個嵌合基因，其 包括至少： (a) —種在宿主生物體中具有功能之啟動子 (b) 根據申請專利範圍第1至3項中任一項之聚核苷酸 (c) 在宿主生物體中具有功能之終止子因子。 11. 根據申請專利範圍第10項之嵌合基因，其亦包括在該宿 主生物體中具有功能之訊息肽或引導肽。 12. —種表現或轉型載體，其包括根據申請專利範圍第10 項之嵌合基因。 13·根據申請專利範圍第12項之載體，其為質體、嗜菌體或 病毒。 14· 一種經轉型之宿主生物體，其包括根據申請專利範圍 第10項之嵌合基因。 15·根據申請專利範圍第14項之宿主生物體，其為微生物。 16·根據申請專利範圍第15項之宿主生物體，其中該微生物 選自細菌、真菌、酵母菌或病毒。 17·根據申請專利範圍第16項之宿主生物體，其中該微生物 為選自棒狀桿菌屬（Corynebacterium)、芽孢桿菌屬（Bacillus) 、鏈絲菌屬（Streptomyces)及埃希氏菌屬（Escherichia)之細 菌，特別是大腸桿菌。 18·根據申請專利範圍第16項之宿主生物體，其中該微生物 為選自青黴菌屬（Penicillium)、麴菌屬（Aspergillus)、毛革 200306350

   菌屬（Chrysosporium)及木菌屬（Trichoderma)之真菌。 19. 根據申請專利範圍第16項之宿主生物體，其中該微生物為 選自酵母屬（Saccharomyces)、克魯維酵母屬（Kluyveromyces) 及畢赤酵母屬（Pichia)之酵母菌。 20. 根據申請專利範圍第14項之宿主生物體，其為植物細 胞、植物或植物的一部分。 21· —種製備具有植酸酶活性萃取物之方法，其包括步驟 有： (a) 於可以讓生物體表現該植酸酶的條件下，培養具有 根據申請專利範圍第1至3項中任一項之聚核苷酸 之生物體 (b) 濃縮步騾（a)所培養的生物體 (c) 破瓌步驟（b)中所分離之生物體細胞 (d) 離心步驟（e)所得之破壞細胞萃取物 (e) 自梦驟（d)中回收具有植酸酶活性之上清液。 22· —種製備具有植酸酶活性萃取物之方法，其包括步騾 有： (a)於以讓生物體表現該植酸酶的條件下，培養具有 根據申請專利範圍第1至3項中任一項之聚核甞酸 之生物體 其 ， 法 方 之 酶 酸〇 植 基之 養項 培6 織第 組圍 收範 回矛 Jgr ， 體請 物申 生據 該根 徐備 去製 」Ey.f 種£一 23. 步 有 所 之 中 法 方 項 2 2 或 11 2 第 ： 園驟 範步 的 外 額 入 加 據外 相另 括， 包驟 專 青 、一r 中 200306350

   (f)自根據申請專利範圍第21項之方法步驟（e)所回收 之上清液中純化該植酸酶 (c)自根據申請專利範圍第22項之方法步騾（b)所回收 之組織培養基中純化該植酸酶。 24. 根據申請專利範圍第21、22或23項中任一項之製備方 · 法，其中該生物體是微生物。 ^ 25. 根據申請專利範圍第24項之製備方法，其中該微生物是 真菌。 鲁 26. 根據申請專利範圍第25項之製備方法，其中該真菌是青 黴菌屬之真菌。 27·根據申請專利範圍第26項之製備方法，其中該青黴菌屬 之真菌為青黴菌CBS 109899。 28· —種製備具有植酸酶活性萃取物之方法，其包括步驟 有 ⑷ 培 養 根據申請 專 .利範圍第14至20項中任一項之轉 型 宿 主生物體 ⑻ 濃 縮 步驟（a)所 培 養 的 轉 型 生 物 體 (C) 破 壞 步騾（b)中 所 分 離 之 生 物 體 細 胞 ⑷ 離 心 步騾（C)所 得 之 破 壞 細 胞 萃 取 物 ⑷ 白 步 驟（d)中回 收 具 有 植 酸 酶 活 性 之上清液。 29· —種製備具有植酸酶活性萃取物之方法，其包括步騾 有： (a) 培養根據申請專利範圍第14至20項中任一項之轉 型宿主生物體 200306350 (b) 去除該轉型生物體，回收組織培養基。 30. —種製備根據申請專利範圍第6項之植酸酶之方法，其 包括根據申請專利範圍第28或29項之方法中之所有步 騾，另外加入額外的步騾： (f)自根據申請專利範圍第28項之方法步騾（e)所回收 ， 之上清液中純化植酸酶 . (c) 自根據申請專利範圍第29項之方法步驟（b)所回收 之組織培養基中純化植酸酶。 籲 31. —種酵素性組合物，其包括至少一種根據申請專利範 圍第6項之植酸酶。 32· —種飼料組合物，其包括至少一種根據申請專利範圍 第14至20項中任一項之轉型宿主生物體。 33· —種飼料組合物，其包括至少一種具有根據申請專利 範圍第1至3項中任一項之聚核甞酸之生物體。 34·根據申請專利範圍第33項之飼料組合物，其中該生物體 為真菌。 H 35.根據申請專利範圍第34項之飼料組合物，其中該真菌為 青黴菌屬之真菌。 36·根據申請專利範圍第35項之飼料組合物，其中該真菌為 青黴菌 CBS 109899。 37· —種飼料組合物，其包括至少一種根據申請專利範圍 第6項之植酸酶。 38.根據申請專利範圍第32項之飼料組合物之用途，其係用 於單胃動物之養料 200306350

   39. 根據申請專利範圍第38項之飼料組合物之用途，其係用 於豬之養料。 40. 根據申請專利範圍第38項之飼料組合物之用途，其係用 於家禽之養料。 41. 一種製備根據申請專利範圍第32項之飼料組合物之方 法，其包括步騾有： (a) 培養根據申請專利範圍第14至20項中任一項之宿 主生物體 (b) 濃縮步騾（a)所培養之宿主生物體 (c) 將分離自步騾（b)之宿主生物體混入至該飼料組合 物中。 42. —種製備根據申請專利範圍第33項之飼料組合物之方 法，其包括步騾有： (a) 於可以讓生物體表現該植酸酶的條件下，培養具有 根據申請專利範圍第1至3項中任一項之聚核荅酸 之生物體 (b) 濃縮步驟（a)所培養之生物體 (c) 將分離自步騾（b)之生物體混入至該飼料組合物中。 43· —種製備根據申請專利範圍第37項之飼料組合物之方 法，其包括步驟有： (a)於可以讓生物體表現植酸酶的條件下，培養具有根 據申請專利範圍第1至3項中任一項之聚核甞酸之 生物體 (b)濃縮步騾（a)所培養的生物體 200306350

   (C) 破壞步騾（b)中所分離之生物體細胞 (d) 離心步騾（c)所得之破壞細胞萃取物 (e) 自步驟（d)中回收具有植酸酶活性之上清液 (f) 將步騾（e)所回收之上清液混入至該飼料組合物中。 44. 一種製備根據申請專利範圍第37項之飼料組合物之方 法，其包括步騾有： (a) 於可以讓生物體表現植酸酶的條件下，培養具有根 據申請專利範園第1至3項中任一項之聚核甞酸之 生物體 (b) 去除生物體，回收組織培養基 (c) 將步騾（b)所回收之組織培養基混入至該飼料組合 物中。 45. —種製備根據申請專利範圍第37項之飼料組合物之方 法，其包括步騾有： (a) 培養根據申請專利範圍第14至20項中任一項之轉 型宿主生物體 (b) 濃縮步騾（a)所培養的轉型生物體 (c) 破壞步騾（b)中所分離之生物體細胞 (d) 離心步騾（c)所得之破壞細胞萃取物 (e) 自步騾（d)中回收具有植酸酶活性之上清液 (f) 將步騾（e)所回收之上清液混入至該飼料組合物中。 46. —種製備根據申請專利範園第37項之飼料組合物之方 法，其包括步騾有： (a) 培養根據申請專利範圍第14至20項中任一項之轉 200306350

   型宿主生物體 (b)去除轉型宿主生物體，回收組織培養基 ⑷將分離自步驟（b)所回收之#且織培養基混入至該飼 料組合物中。 47·根據申請專利範圍第43或45項 万凌八T步騾（f)經下 列步騾取代： (f) 自步驟（e)所回收之上清液中純化植酸酉每 (g) 將步騾（f)所純化之植酸酶混入至該飼料組合物中。 级根據申請專利範圍第44或46項之方法，其中步驟1⑷取代 為步驟： (C)自步驟（b)所回收之組織培養基中純化植酸酶 (d)將步驟（C)所純化之植酸酶混入至該飼料組合物中。 49. 一種增加單胃動物攝取植物性為主飼料中植酸所含之 無機磷酸的同化作用之方法，其中係將根據申請專利 範圍第6項之植酸酶或根據申請專利範園第^項之酵素 性組合物混入至該動物攝取之養料中。 5〇·根據申請專利範圍第48項之方法，其中該單胃動物餵食 根據申請專利範園第32項之飼科組合物。 51· —種降低單胃動物養料中磷添加量之方法，其中該動 物餵食根據申請專利範圍第32項之飼料組合物。 52. —種降低源自單胃動物養料之磷的排放量之方法’其 中該動物餵食根據申請專利範園第32項之飼料組合物。 53· —種屬於音黴菌屬之絲狀真菌，其寄存編號為CBS 109899 。 -8 -