RU2664476C1 - Рекомбинантный штамм yarrowia lipolytica - продуцент инкапсулированной фитазы obesumbacterium proteus - Google Patents
Рекомбинантный штамм yarrowia lipolytica - продуцент инкапсулированной фитазы obesumbacterium proteus Download PDFInfo
- Publication number
- RU2664476C1 RU2664476C1 RU2017125240A RU2017125240A RU2664476C1 RU 2664476 C1 RU2664476 C1 RU 2664476C1 RU 2017125240 A RU2017125240 A RU 2017125240A RU 2017125240 A RU2017125240 A RU 2017125240A RU 2664476 C1 RU2664476 C1 RU 2664476C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- phytase
- encapsulated
- lipolytica
- activity
- puv3
- Prior art date
Links
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 title claims description 53
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 title claims description 32
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 title claims description 24
- 241001622831 Obesumbacterium proteus Species 0.000 title claims description 10
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 241000201640 Yarrowia lipolytica PO1f Species 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 29
- 244000144972 livestock Species 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 26
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 26
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 235000002949 phytic acid Nutrition 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- -1 CPhy) Proteins 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 235000019735 Meat-and-bone meal Nutrition 0.000 description 3
- 101710129178 Outer plastidial membrane protein porin Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 102100037820 Voltage-dependent anion-selective channel protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 3
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 2
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 2
- WPEXVRDUEAJUGY-UHFFFAOYSA-B hexacalcium;(2,3,4,5,6-pentaphosphonatooxycyclohexyl) phosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])(=O)OC1C(OP([O-])([O-])=O)C(OP([O-])([O-])=O)C(OP([O-])([O-])=O)C(OP([O-])([O-])=O)C1OP([O-])([O-])=O WPEXVRDUEAJUGY-UHFFFAOYSA-B 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 102000006844 purple acid phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108010073968 purple acid phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 2
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000588919 Citrobacter freundii Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000038461 Growth Hormone-Releasing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 241000256602 Isoptera Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Phytic acid Natural products OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 1
- 239000006004 Quartz sand Substances 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- FENRSEGZMITUEF-ATTCVCFYSA-E [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].OP(=O)([O-])O[C@@H]1[C@@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H]1OP(=O)([O-])[O-] Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].OP(=O)([O-])O[C@@H]1[C@@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H]1OP(=O)([O-])[O-] FENRSEGZMITUEF-ATTCVCFYSA-E 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019728 animal nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 101150080488 apa gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 1
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002432 hydroperoxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003295 industrial effluent Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 108010004512 paprin Proteins 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 1
- 229940085991 phosphate ion Drugs 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229940068041 phytic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000467 phytic acid Substances 0.000 description 1
- 102000007739 porin activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229940116540 protein supplement Drugs 0.000 description 1
- 235000005974 protein supplement Nutrition 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000011076 safety test Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- WGWPRVFKDLAUQJ-MITYVQBRSA-N sermorelin Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WGWPRVFKDLAUQJ-MITYVQBRSA-N 0.000 description 1
- 229960002758 sermorelin Drugs 0.000 description 1
- 229940083982 sodium phytate Drugs 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
- C12Y301/03008—3-Phytase (3.1.3.8)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм- продуцент фитазы, инкапсулированной в цитоплазме, получаемый путем введения плазмиды pUV3-Op, характеризующейся нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, в коллекционный штаммPO1f. Изобретение обладает повышенной термостабильностью при кратковременном прогреве при 70°С и может быть использовано для получения кормовых премиксов при указанной температуре для использования в животноводстве. 3 ил., 1 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и кормопроизводства, в частности, к созданию рекомбинантного штамма Yarrowia lipolytica - продуцента инкапсулированной фитазы Obesumbacterium proteus, и может быть использовано для получения кормовых премиксов для использования в животноводстве, обладающих высокой усвояемостью органического фосфора, находящегося в зерновом сырье.
Фитазы - группа фосфогидролаз, расщепляющих сложноэфирные связи фосфорной кислоты в молекуле фитата. По типу активного центра фермента выделяют четыре класса фитаз: кислые гистидиновые фосфатазы (histidine acid phosphatase, HAP), цистеиновые фитазы (cystein phytase, CPhy), пурпурные кислые фосфатазы (purple acid phosphatase, PAP) и β-пропеллерные фитазы (beta-propeller phytase, BPP). Для практического использования в кормовом производстве к фитазам предъявляют следующие требования: устойчивость к кратковременному (5-10 мин.) действию высоких температур (70°С - 80°С), используемых в ходе гранулирования комбикормов; высокая удельная активность в физиологических условиях желудочно-кишечного тракта (температурный оптимум около 42°С, рН 3-5); способностью выдерживать действие среды желудка животных (стабильность при низких значениях pH 1,5-2,5 и устойчивость к протеолитическим ферментам).
В зависимости от оптимальной для ферментативной активности кислотности среды фитазы разделяют на два класса: кислые и щелочные фитазы. Кислые фитазы демонстрируют наибольшую активность при pH 2,5-5,5. В аминокислотных последовательностях кислых гистидиновых фитаз имеется консервативный мотив, содержащий остаток гистидина, который участвует в нуклеофильной атаке на отщепляемую фосфатную группу. В группе кислых фитаз выделяются бактериальные и грибные ферменты. Бактериальные кислые фитазы демонстрируют более высокую удельную активность по сравнению с грибными. По литературным данным из всех изученных к настоящему времени природных фитаз самую высокую удельную активность демонстрируют фитазы Е. coli и Citrobacter freundii (продукты гена АррА). Большинство известных бактериальных кислых фитаз способны последовательно отщеплять от молекулы фитиновой кислоты до пяти фосфатных остатков, оставляя в качестве конечного продукта мио-инозитолмонофосфат. Недостатком природных бактериальных фитаз является их низкая термостабильность. Глубина гидролиза фитатов для щелочных фитаз обычно ниже, чем для кислых фитаз, но зато щелочные фитазы обладают промышленно-ценной особенностью: они более термостабильны, некоторые выдерживают нагрев до 80-95°C.
Примером щелочной бактериальной фитазы, обладающей высокой термостабильностью, является популярный на рынке препарат Nov9x. AB Vista (Германия), продающийся также под торговой маркой Quantum Blue. Готовая форма Quantum Blue представляет собой Nov9x, слитую с тиоредоксином (Trx-Nov9x6). Коммерческий препарат имеет активность 2358 FTU/мл, которая не меняется в диапазоне рН от 4,5 до 6,0. При рН 1,5 сохраняется 20% активности. При кратковременном прогреве при 70°С а течение 1 мин активность полностью сохраняется. При прогреве при 60°С в течении 2 ч сохраняется 75% первоначальной активности. После инкубации при 70°С в течение 30 мин сохраняется 29% активности.
Препарат инкапсулированной Файзим™ (Даниско Анимал Ньютришн, Финляндия) используется в технологии Thermostability Protection Technology (TPT), допуская прогрев при температуре 95°C. Капсулы TPT обеспечивают высвобождение Файзим™ в верхней части пищеварительного тракта животных.
На данный момент в России разрешены для использования три типа фитазы Файзим:
Файзим XP 5000 G - активность 5000 FTU/гр, термостабильность до 76°С;
Файзим XP 5000 TPT- активность 5000 FTU/гр, термостабильность до 96°С;
Файзим XP 10000 TPT - активность 10000 FTU/гр, термостабильность до 96°С.
Они устойчивы в диапазоне рН от 2,5 до 5,5, pH-оптимум - 5,5.
Цена препарата в зависимости от объемов поставки и условий оплаты:
Файзим XP 5000 G - 10 EUR/кг;
Файзим XP 5000 TPT- 12 EUR/кг;
Файзим XP 10000 TPT - 22 EUR/кг
Еще одним представленным на рынке препаратом фитазы является Ронозим ХайФос (DSM Нутришнл продактс), выпускаемый в трех различных формах:
- высокотермостабильная форма Ронозим ХайФос (GT) имеет улучшенные характеристики для применения, такие как отсутствие пыли, хорошая сыпучесть и смешиваемость, максимальная среди фитаз термостабильность - до 95°C. Активность - 10000 FTU/г;
- концентрированная форма Ронозим ХайФос (М) оптимальна для мягких режимов производства комбикорма; она также имеет хорошую сыпучесть и гомогенность распределения, безопасна в использовании для персонала (отсутствие пыли). Активность - 50000 FTU/г;
- жидкая форма Ронозим ХайФос (L) - стабильный продукт, применяется для жидких концентрированных продуктов. Активность - 20000 FTU/г.
Дрожжи Yarrowia lipolytica являются перспективным объектом биотехнологии, что обусловлено сочетанием в этом организме нескольких уникальных биохимических особенностей [Barth G., Gaillardin C., FEMS Microbiology Reviews, 1997, V.19. P.219]. За счет наличия пероксисом Y. lipolytica способна расти на органических субстратах самого различного биогенного и абиогенного происхождения, включая парафины нефти, коммунальные и промышленные стоки. Благодаря склонности к утилизации гидрофобных соединений микроорганизм способен осуществлять исчерпывающую биологическую очистку кормовых ингредиентов от микотоксинов, гидропероксидов и ксенобиотиков. Обладая мощным аэробным метаболизмом, Y. lipolytica устойчива ко многим агрессивным органическим соединениям: спиртам, кислотам, альдегидам и кетонам. В отличие от других видов дрожжей, Y. lipolytica обладает высокой алкало - и галотолерантностью, с высокой эффективностью секретирует белки во внешнюю среду. В течение 10 лет Y. lipolytica использовалась в СССР в качестве промышленного объекта в производстве кормового белка для животноводства, утилизируя в качестве субстратов парафины нефти (паприн, гаприн, белково-витаминный концентрат - БВК), в результате чего были накоплены данные, подтверждающие полную безопасность и высокую кормовую ценность ее биомассы [Выслоух В.А. и соавт. Патент СССР № 1479509, 1989; Ибрагимов Ф.Б. и соавт. Патент РФ № 2041946, 1995]. В 2000 г надзорный орган США - Food and Drug Administration - включил Y. lipolytica в список заведомо безопасных видов (GRAS), без ограничений пригодных для производства кормовых и пищевых ингредиентов. По данным [Guerzoni M.E. et al. International. Journal. of Food Microbiology. 2001. V. 69. P. 79-89; Suzzi G. et al. International. Journal. of Food Microbiology. 2001. V. 69. P. 69-77], живые клетки Y. lipolytica присутствуют в традиционных продуктах из регионов Италии.
В работе Зыльковой М.В. и соавт [Проблемы биологии продуктивных животных, 2012, №2, 2012, стр. 5-12] описаны результаты испытаний биологической безопасности биодобавки на основе жизнеспособной биомассы рекомбинантного штамма Y. lipolytica, продуцирующей соматолиберин. Добавку в течение 20 суток вносили в корм белых мышей-отъемышей и определяли скорость привесов. В результате работы было показано, что добавка не только не обладает токсичностью, но и характеризуется анаболическим эффектом, не присущим биомассе, не содержащей соматолиберина.
В работе Эповой Е.Ю. и соавт [Epova et al, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2016, Volume 21, Issue 3, pp 408-413] описана генетическая система, позволяющая получать рекомбинантные штаммы-продуценты Y. lipolytica, адаптированные к эксплуатации в условиях культивирования на малоценных промышленных ингредиентах, в частности, интегративный вектор pUVLT2, содержащий промотор митохондриального порина VDAC Y. lipolytica. С помощью транскрипционного репортера было показано, что использование этого вектора позволяет добиваться высокоэффективной экспрессии трансгенов в рекомбинантных штаммах Y. lipolytica, культивируемых на средах на основе малоценного сырья. При этом уровень экспрессии трансгена оказывался не ниже, а в некоторых случаях даже превышал уровень экспрессии под контролем наиболее эффективного из описанных в литературе промоторов - синтетического промотора hp4D. Более того, высокая вариабельность профилей экспрессии, независимо полученных при трансформации клонов, позволяет с помощью фенотипической селекции отбирать трансформанты, обладающие наибольшей эффективностью экспрессии на конкретной среде на основе малоценных ингредиентов, имеющей промышленное значение.
Описанный в рамках изобретения рекомбинантный штамм Y. lipolytica, продуцирующий инкапсулированную фитазу O. proteus, сконструирован на основании использования вектора pUVLT2 с промотором VDAC. Он предназначен для применения в рамках технологии, совмещающей решение двух независимых задач биотехнологии: продукция кормового белка путем биоконверсии отходов и получение источника ценного фермента фитазы кормового назначения. Целесообразность использования Y. lipolytica в качестве источника белка аргументирована выше. Целесообразность использования Y. lipolytica для производства микроинкапсулированных ферментов, в частности, фитазы, обусловлена следующими обстоятельствами. Во всех странах мира признано и применяется использование ферментов в производстве комбикормов для свиней, птицы и других животных. Ферменты позволяют резко повысить эффективность использования кормовых ингредиентов, вовлечь в оборот ряд видов малоценного и непригодного сырья, снизить уровень нагрузки животноводческого производства на окружающую среду. Однако, номенклатура ферментов, доступных для применения в кормовом производстве, серьезно ограничивается его технологическими особенностями. Дело в том, что гранулированные комбикорма получают методом распылительной сушки при температуре ≈70°С. Получение премиксов (комбикормов с предварительно внесенным ферментом) заставляет подвергать сушке в тех же условиях и сам ферментный препарат. Таким образом, для кормового производства приходится отбирать только те ферменты, которые обладают термостабильностью при 70°С и выше. Эта особенность, присущая только небольшой доле промышленно выпускаемых ферментов, не играет роли при их функционировании в ЖКТ сельскохозяйственных животных, где устойчиво поддерживается температура ≈37°С. Однако, за счет возникающего технологического требования термостабильности приходится использовать в кормах ферменты со свойствами, далекими от оптимальных при работе в ЖКТ животных. Например, препараты термостабильных фитаз грибного происхождения, наиболее массово продаваемые в мире: Файзим (Даниско Анимал Ньютришн, Финляндия), Quantum Blue (AB Vista, Германия) и Ронозим ХайФос (DSM Нутришнл продактс) имеют рН-оптимум 2,0 и ниже, что практически не позволяет им работать в двенадцатиперстной и тонкой кишке, имеющим рН ≈8. Поскольку при использовании фитазы на 25-40% уменьшается содержание фосфора в помете, пропорционально снижается содержание фосфора в почве и сточных водах, подвергающихся загрязнению животноводческими отходами, природоохранный аспект сыграл решающее значение для выработки рекомендаций на применение фитазы в странах Европейского Союза (например, в Голландии), где внесение этого фермента в корма регламентируется производственными стандартами: не менее 200 фитиновых ед. на кг корма. Однако, выполнение этого требования применительно к Файзим, Quantum Blue, и Ронозим ХайФос носит сугубо формальный характер, так как по своим энзиматическим характеристикам они не могут гидролизовать фитат, высвободившийся из зерна в просвете тонкого кишечника при рН тонкого кишечника.
Использование нейтрофильной фитазы из Obesumbacterium proteus (ОРР) может дать существенно бόльший эффект, но оно возможно только за счет увеличения термостабильности этих ферментов при кратковременном прогреве во время гранулирования кормов. Этот фермент [FEMS Microbiol Lett. 2004; V. 236, № 2. P. 283-90] характеризуется высокой удельной активностью, равной 310 Ед/мг. Фермент ОРР остается активным в диапазоне значений рН от 1,5 до 6,5, оптимум рН - при 4,9. Максимальная активность фермента достигается при 45°С. При культивировании в колбах рекомбинантного штамма Pichia pastoris - продуцента ОРР - фитазная активность в культуральной жидкости составляет 500 Ед/мл [RU 2388823].
Основным результатом, лежащим в основе настоящего изобретения, является доказанная возможность повышения термостабильности ОРР при кратковременном прогреве от 50 до 70°С при инкапсуляции фермента непосредственно в клетках рекомбинантного продуцента: Y. lipolytica. Выход фитазы в расчете на мл культуральной среды при этом будет несколько уступать выходу секретируемого в среду фермента. Однако, комбинирование ферментной и белковой добавки в одном и том же исходном материале, имеющим достаточно низкую себестоимость, делает рациональным внесение ее в корм в количестве 5%, а не ≈0,01%, как в случае очищенных секреторных ферментов. Поскольку производство инкапсулированного фермента является безотходным, и биомасса продуцента и остаток белка из среды не попадают в стоки и отходы, а используются для кормления животных, производство добавки остается рентабельным даже при сравнительно невысоком выходе фермента. Дополнительным преимуществом инкапсулированного в Y. lipolytica кормового фермента является защита от повреждения кислотой и пепсином в желудке животного: солюбилизация содержимого клеток Y. lipolytica и высвобождение содержимого происходит только в двенадцатиперстной кишке.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - карта конструкции pUV3-Op на основе промотора VDAC Y. lipolytica.
Фиг. 2 - аминокислотная последовательность фитазы, кодируемой конструкцией pUV3-Op.
Фиг. 3 - оценка активности фитазы в гомогенатах биомассы трансформантов Y. lipolytica PO1f, несущих интегрированную конструкцию pUV3-Op. На фотографии видны зоны просветления агаризованной среды, содержащей фитат, образовавшиеся в результате внесения в лунки гомогенатов клонов. Для дальнейшего использования отобран клон №13.
Получение рекомбинантного штамма Y. lipolytica, несущего генетическую конструкцию pUV3-Op
Получение плазмидной конструкции pUV3-Op
Клонирование гена фитазы OPP проводили с помощью ПЦР на матрице геномной ДНК O. proteus ВКПМ-5477 с праймерами OPP-for1 (BamHI) (GGGGATCCgaaaccgaaccttccggatat) и OPP-rev1 (NotI) (GGGCGGCCgcttattggcactccaccagt) (Фиг. 1). По данным электрофореза в агарозном геле, размер продукта ПЦР соответствовал ожидаемому - 1240 п.н.
Особенностью подобранных праймеров являлось то, что при их использовании происходит отсечение фрагмента кодирующей области длиной 33 кодона, соответствующих секреторному лидеру, благодаря чему продукт утрачивает способность секретироваться во внешнюю среду и накапливается в цитоплазме. Праймер OPP-for1 обеспечивал введение сайта рестриктазы BamHI, наличие которого приводило также к введению на N-конец модифицированного гена ОРР искусственного кодона GGA (Gly), который, следуя непосредственно за инициаторным кодоном ATG (присутствует в векторе pUV3LT непосредственно выше сайта рестриктазы BamHI) согласно правилу Варшавского увеличивает цитоплазматическую стабильность продукта в дрожжах (Фиг. 2).
Продукт ПЦР очищали с помощью набора DNA Gene Jet (ThermoFisher Scientific), обрабатывали рестриктазами BamHI и NotI и лигировали с ДНК вектора pUV-LT3 [Epova et al, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2016, V. 21, № 3, pp 408-413], обработанного рестриктазами BamHI и NotI (при этом произошло отщепление последовательности репортерного гена LacZ от остальной части вектора).
Лигазную смесь использовали для трансформации штамма E. coli TG1 по стандартному протоколу с применением ионов Ca2+. Трансформированные клетки E. coli высевали на среду LB c канамицином (30 мкг/мл) и X-gal, отбирали колонии, не имеющие синего оттенка (для контрселекции клонов, содержащих ген LacZ в составе исходного вектора pUV-LT3). 10 отобранных клонов выращивали на жидкой среде LB c добавлением канамицина (30 мкг/мл), выделяли плазмидную ДНК, которую картировали с помощью рестриктаз BamHI и NotI. Было отобрано 4 независимых клона, содержащих вставку искомого размера 1240 п.н. (вставка в клонах, содержащих исходный вектор, имела размер ~3000 п.н.). Плазмидную ДНК одного из клонов подвергали секвенированию с праймерами OPP-for1 и OPP-rev1 на капиллярном генетическом анализаторе AbiPrizm 3500 с помощью набора BigDye® Terminator v3.1, убедившись в полном соответствии полученной последовательности ранее известной [FEMS Microbiol Lett. 2004; V. 236 № 2 P. 283-90]. Полученная конструкция получила название pUV3-Oр (Фиг. 1).
Трансформация штамма Y. lipolytica PO1f плазмидной конструкцией pUV3-Op
Введение ДНК конструкции pUV3-Oр в клетки Y. lipolytica PO1f (MatA, leu2-270, ura3-302, xpr2-322, axp-2) (депонирован в коллекции CIRM-Levures (Франция) под номером CLIB-724 и в ATCC под номером MYA-2613) проводилось методом трансформации с использованием солей Li+, как описано ранее [Davidow et al, Curr. Genet. 1985, № 10. P 39.]. Отбор трансформантов проводили на минимальной синтетической среде, свободной от урацила c добавлением лейцина при 28°С.
Оценка продуктивности трансформантов штамма Y. lipolytica PO1f(pUV3-Op)
Выросшие колонии (20 клонов) упорядочивали пересевом на чашку с минимальной средой YNB, обогащенной 2% глюкозой и лейцином. После этого каждый клон высевали на стерильную жидкую среду, представляющую собой 5%-ю водную суспензию мясокостной муки с естественным рН (5,3), объемом 3 мл, разлитую в плоскодонные пенициллиновые флаконы, закрытые ватно-марлевыми пробками. Клоны культивировали в течение 34 часов при 28°С на микробиологическом шейкере-культиваторе при максимально интенсивной аэрации.
Выросшую биомассу вместе с нерастворимой фракцией среды собирали кратковременным центрифугированием на настольной центрифуге в полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл. Растворимую фракцию культуральной жидкости удаляли и суспендировали осадок в 500 мкл физиологического раствора, повторно осаждали на настольной центрифуге и суспендировали в 1 мл стерильной деионизованной воды. Суспензию охлаждали до 4°С, переносили в охлажденную до 0°С фарфоровую ступку объемом 100 мл, добавляли 50-70 мг стерильного кварцевого песка и гомогенизировали фарфоровым пестиком в течение 3 мин. Фитазную активность трансформантов оценивали в чашечном тесте по диаметру зон просветления суспензии фитата кальция. Для этого 50 мкл суспензии биомассы клонов Y. lipolytica вносили в лунки агаризованной среды, полученной путем суспендирования фитата кальция (2 мас.%) в 250 мМ Na-ацетатном буфере рН 5,5, содержащего 1% агарозу (Фиг. 3).
Хорошо видно, что отрицательные контрольные клоны PO1f (pUV3) (обозначены К1 и К2 на Фиг. 3) не имеют зон просветления. Для дальнейшей работы использовали клон №13.
Исследование термостабильности ОРР, инкапсулированной в биомассе рекомбинантного штамма Y. lipolytica, несущего генетическую конструкцию pUV3-Op
Получение препарата инкапсулированной фитазы ОРР
Штаммы Po1f (pUV3-Oр) №13 и Y-3852 (стандарт) выращивали при 28°С в течение 1 суток в чашках Петри с агаризованной средой YPD (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, глюкоза - 2, агар - 2).
Инокулят (жидкую посевную культуру) выращивали в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих по 30 мл жидкой питательной среды YPD (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, глюкоза - 2). Засев колб осуществляли посевной культурой, выращенной на твердой агаризованной среде YPD. Колбы инкубировали на микробиологическом шейкере-инкубаторе (250 об/мин) при 28°С в течение 24 ч.
В колбу с 25 мл ферментационной среды (мас. %: мясокостная мука - 5) засевали 5 мл инокулята. Культивирование осуществляли на качалке со скоростью 250 об/мин при температуре 28°С. Ферментацию проводили в течение 34 часов.
Моделирование условий кратковременного прогрева фитазы ОРР (имитация распылительной сушки)
Полученную культуральную жидкость штаммов Po1f (pUV3-Oр) №13 и Y-3852 (стандарт) распределяли по 1 мл в стерильные полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл, не допуская осаждения суспензии под действием силы тяжести и замораживали в жидком азоте, после чего подвергали их лиофильному высушиванию на установке SpeedVac Savant SPD1010 в течение 6 часов до постоянной массы (при дальнейшем высушивании масса сухого остатка уменьшалась менее, чем на 2% за 1 час).
По пять пробирок, содержащих биомассу штаммов Po1f (pUV3-Oр) №13 и Y-3852 (стандарт), устанавливали в твердотельный термостат «Термит» при температуре 70°С на 30 сек, после чего пробирки охлаждали на льду. Затем по пять пробирок прогревали в аналогичных условиях при 60°С и 50°С.
Во все прогретые пробирки, а также в пять непрогретых пробирок с биомассой каждого штамма, вносили по 1 мл деионизованной воды, охлажденной на льду, суспендировали и гомогенизировали в фарфоровой ступке, как описано выше. Далее перед определением ферментативной активности проводили очистку фермента от примесей фосфата, имевшихся в гомогенатах.
Для этого гомогенаты центрифугировали на настольной центрифуге в течение 10 мин при 14,5 тыс. g, отбирали по 500 мкл супернатанта, переносили в чистые полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл и добавляли по 1 мл насыщенного сульфата аммония, приготовленного на 250 мМ Na-ацетате, pH 5,5. Пробирки тщательно перемешивали на ручном вортексе и инкубировали при +4°С в течение 6 часов. Осадки отделяли центрифугированием на настольной центрифуге в течение 5 мин при 14,5 тыс. g, супернатанты удаляли с помощью водоструйного насоса, а осадки растворяли в 100 мкл 250 мМ Na-ацетате, pH 5,5 в течение 15 мин при +4°С.
Фитазную активность определяли по накоплению в реакционной смеси свободного фосфат-иона, детектируемого методом Фиске-Субарроу [J. Biol. Chem., 1925, V. 66, pp. 375-400]. За единицу фитазной активности принимали количество фермента, способного высвободить 1 моль неорганического фосфата из фитата натрия в минуту при 37°С и рН 5,5. Для определения отбирали аликвоты фермента 5 мкл, проводили измерение оптической плотности при λ=415 нм, после чего нормировали остаточную активность на мл исходной культуральной жидкости штамма.
Результаты измерений (ед/мл культуральной жидкости) представлены в таблице.
Таблица 1. Активность фитазы ОРР при различных температурных режимах
Штамм | ||
Po1f (pUV3-Oр) №13 | ВКПМ Y-3852 | |
До прогрева | ||
1 | 362 | 523 |
2 | 359 | 517 |
3 | 357 | 526 |
4 | 364 | 522 |
5 | 361 | 520 |
Ср. знач. | 360,6 | 521,6 |
СКО | 2,1 | 2,5 |
Прогрев при 50°С | ||
1 | 335 | 332 |
2 | 342 | 251 |
3 | 349 | 256 |
4 | 343 | 234 |
5 | 338 | 288 |
Ср. знач. | 341,4 | 272,2 |
СКО | 3,9 | 30,24 |
Инактивация | 5,3% | 47,8% |
Прогрев при 60°С | ||
1 | 303 | 86 |
2 | 295 | 98 |
3 | 312 | 135 |
4 | 291 | 77 |
5 | 293 | 86 |
Ср. знач. | 298,8 | 96,4 |
СКО | 7,0 | 16,08 |
Инактивация | 17,1% | 81,5% |
Прогрев при 70°С | ||
1 | 258 | 11 |
2 | 269 | 2 |
3 | 248 | 14 |
4 | 263 | 9 |
5 | 271 | 4 |
Ср. знач. | 261,8 | 1 |
СКО | 7,0 | 4 |
Инактивация | 27,4% | 99,8% |
Таким образом, приведенные выше результаты показывают, что:
1. Сконструированный в процессе осуществления изобретения штамм Po1f (pUV3-Oр) обладает способностью к синтезу фитазы при культивировании на среде, представляющей собой суспензию мясокостной муки кормового назначения.
2. Уровень продукции фитазы ОРР штаммом Po1f (pUV3-Oр) составляет около 340 ед FTU/мл культуральной жидкости или 69,2±2,1 от уровня продукции коллекционного штамма ВКПМ Y-3852.
3. После кратковременного прогрева при 70°С остаточная активность фитазы ОРР, инкапсулированной в биомассе, составляет 72,6±7,0% от исходного уровня, тогда как остаточная активность секретированной фитазы ОРР составляет только 0,2±4,0% от исходного уровня. Этот показатель позволяет сделать вывод о термостабилизации микроинкапсулированной фитазы по сравнению со свободной. Уровень термостабильности микроинкапсулированной фитазы, накопленной в биомассе рекомбинантного штамма Po1f (pUV3-Oр), обеспечивает ее пригодность для изготовления кормовых премиксов с применением распылительной сушки.
4. После кратковременного прогрева при 60°С остаточная активность фитазы ОРР, инкапсулированной в биомассе, составляет 83,9±7,0% от исходного уровня. Этот показатель позволяет сделать вывод о предпочтительности использования сниженной температуры сушки премиксов при использовании микроинкапсулированной фитазы, накопленной в биомассе рекомбинантного штамма Po1f (pUV3-Oр), для изготовления кормовых премиксов.
Claims (1)
- Рекомбинантный штамм Yarrowia lipolytica, обладающий способностью к синтезу фитазы Obesumbacterium proteus, инкапсулированной в цитоплазме и обладающей за счет этого повышенной термостабильностью при кратковременном прогреве при 70°С, получаемый путем введения плазмиды pUV3-Op, характеризующейся нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 1, в коллекционный штамм Yarrowia lipolytica PO1f.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017125240A RU2664476C1 (ru) | 2017-07-14 | 2017-07-14 | Рекомбинантный штамм yarrowia lipolytica - продуцент инкапсулированной фитазы obesumbacterium proteus |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017125240A RU2664476C1 (ru) | 2017-07-14 | 2017-07-14 | Рекомбинантный штамм yarrowia lipolytica - продуцент инкапсулированной фитазы obesumbacterium proteus |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2664476C1 true RU2664476C1 (ru) | 2018-08-17 |
Family
ID=63177352
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017125240A RU2664476C1 (ru) | 2017-07-14 | 2017-07-14 | Рекомбинантный штамм yarrowia lipolytica - продуцент инкапсулированной фитазы obesumbacterium proteus |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2664476C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2814490C1 (ru) * | 2023-09-25 | 2024-02-29 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук (ИОГЕН РАН) | Рекомбинантный штамм Yarrowia lipolytica - продуцент инкапсулированной фитазы Paenibacillus sp. |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2388823C1 (ru) * | 2008-08-21 | 2010-05-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) | Интегративный плазмидный вектор для экспрессии генов в дрожжах |
RU2409670C1 (ru) * | 2009-07-10 | 2011-01-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) | Рекомбинантная плазмида для экспрессии в дрожжах pichia pastoris гена фитазы (варианты), штамм дрожжей pichia pastoris - продуцент фитазы (варианты) |
RU2504579C2 (ru) * | 2012-04-12 | 2014-01-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica - ПРОДУЦЕНТ ФИТАЗЫ |
EP3101126A1 (en) * | 2010-03-26 | 2016-12-07 | Novozymes A/S | Thermostable phytase variants |
-
2017
- 2017-07-14 RU RU2017125240A patent/RU2664476C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2388823C1 (ru) * | 2008-08-21 | 2010-05-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) | Интегративный плазмидный вектор для экспрессии генов в дрожжах |
RU2409670C1 (ru) * | 2009-07-10 | 2011-01-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) | Рекомбинантная плазмида для экспрессии в дрожжах pichia pastoris гена фитазы (варианты), штамм дрожжей pichia pastoris - продуцент фитазы (варианты) |
EP3101126A1 (en) * | 2010-03-26 | 2016-12-07 | Novozymes A/S | Thermostable phytase variants |
RU2504579C2 (ru) * | 2012-04-12 | 2014-01-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica - ПРОДУЦЕНТ ФИТАЗЫ |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ZININ N.V. et al., Gene cloning, expression and characterization of novel phytase from Obesumbacterium proteus, FEMS Microbiology Letters Vol. 236, Issue 2, pp. 283-290, 2004. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2814490C1 (ru) * | 2023-09-25 | 2024-02-29 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук (ИОГЕН РАН) | Рекомбинантный штамм Yarrowia lipolytica - продуцент инкапсулированной фитазы Paenibacillus sp. |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN100406561C (zh) | 微生物表达的用于动物饲料的耐热植酸酶 | |
CN100475051C (zh) | 含有肌醇六磷酸酶的动物食物和方法 | |
CN101035893B (zh) | 弗氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶及同源物 | |
ES2738181T3 (es) | Promotores de levadura de Pichia pastoris | |
PT948606E (pt) | Fitasse de peniophora | |
CN107164344B (zh) | 一类耐热型植酸酶突变体及其编码基因和应用 | |
WO2006038128A2 (en) | Citrobacter freundii phytase and homologues | |
KR20210147021A (ko) | 동물 사료 조성물에서의 산화환원 효소 | |
KR20210149775A (ko) | 동물 사료 조성물에서의 산화환원 효소 | |
CA2391739A1 (en) | Site-directed mutagenesis of escherichia coli phytase | |
EP2743347A2 (en) | Novel phytase, method for obtaining same and use thereof | |
JP6086614B2 (ja) | 生理活性分子の融合 | |
TW201504259A (zh) | 植酸酶 | |
US8420369B2 (en) | Polypeptide having phytase activity and increased temperature resistance of the enzyme activity, and nucleotide sequence coding said polypeptide | |
CN102392002A (zh) | 一种改进的大肠杆菌植酸酶htp6m及其基因和应用 | |
CN110582573B (zh) | 植酸酶在黑曲霉中表达 | |
Isakova et al. | A new recombinant strain of Yarrowia lipolytica producing encapsulated phytase from Obesumbacterium proteus | |
RU2664476C1 (ru) | Рекомбинантный штамм yarrowia lipolytica - продуцент инкапсулированной фитазы obesumbacterium proteus | |
ES2725705T3 (es) | Nueva fitasa, método para obtener la misma y uso de la misma | |
RU2814490C1 (ru) | Рекомбинантный штамм Yarrowia lipolytica - продуцент инкапсулированной фитазы Paenibacillus sp. | |
AU2002360098B2 (en) | Phytases and method for producing these phytases | |
Mootapally et al. | Mining of ruminant microbial phytase (RPHY1) from metagenomic data of mehsani buffalo breed: identification, gene cloning, and characterization | |
CN101260391A (zh) | 耐热型植酸酶基因及其应用 | |
US20220046956A1 (en) | Polypeptides Having Phytase Activity | |
TWI735801B (zh) | 具有高催化功效之新穎熱穩定植酸酶 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190715 |