TW201504259A - 植酸酶 - Google Patents

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Arne I Solbak
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Abstract

本發明提供具有植酸酶活性之多肽及編碼該等植酸酶之多核苷酸序列。該基因以至少7g/l至40g/L之量表現該植酸酶。該等植酸酶具有較高比活性，在低pH保留活性，在高溫保留活性，具有增加的磷當量、增加的磷生物可用度及增加的磷水解。該等植酸酶可用於眾多工業中，包含食品、飼料、乙醇生產、醫藥及清潔。

Description

植酸酶 序列表
本申請案係經由USPTO EFS-WEB伺服器如MPEP § 502.05中所授權及陳述以電子方式提出申請，且此電子檔包含以電子方式提交之序列表；此序列表之全部內容皆以引用方式併入本申請案之說明書中。在以電子方式申請的ASCII(.txt)文字檔案上序列表鑒定如下：
本發明提供具有植酸酶活性之多肽及編碼該植酸酶之多核苷酸序列。具體而言，該等序列提供具有高比活性、高熱穩定性、高耐熱性之植酸酶增加的表現量及植酸酶之多種工業用途。
圖1：在植酸(pH 5.5)下使用經純化蛋白質測定比活性(U/mg)。畢赤酵母屬(Pichia)表現之植酸酶：SEQ ID NO：8(由SEQ ID NO：7編碼)、SEQ ID NO：3(由SEQ ID NO：2編碼)及SEQ ID NO：6(由SEQ ID NO：5編碼)以及假單胞菌屬(Pseudomonas)表現之植酸酶：SEQ ID NO：3(由SEQ ID NO：1編碼)及SEQ ID NO：6(由SEQ ID NO：4編碼)。
圖2：植酸酶SEQ ID NO：3(由SEQ ID NO：1編碼)在100mM檸檬酸鹽(pH 5.5)+10%山梨醇-10% NaCl中之DSC層析圖。
圖3：植酸酶在含及不含10%山梨醇-10% NaCl之100mM檸檬酸 鹽(pH 5.5)中之DSC Tm值(℃)。SEQ ID NO：3(由SEQ ID NO：1編碼)及SEQ ID NO：6(由SEQ ID NO：4編碼)係由假單胞菌屬表現。SEQ ID NO：3(由SEQ ID NO：2編碼)、SEQ ID NO：6(由SEQ ID NO：5編碼)及SEQ ID NO：8(由SEQ ID NO：7編碼)係由畢赤酵母屬表現。
圖4：在4mM植酸鹽下使用布裏頓-羅賓遜「通用」緩衝液(Britton-Robinson「universal」buffer)之植酸酶之pH曲線。SEQ ID NO：3(由SEQ ID NO：1編碼)及SEQ ID NO：6(由SEQ ID NO：4編碼)係由假單胞菌屬表現。SEQ ID NO：3(由SEQ ID NO：2編碼)及SEQ ID NO：6(由SEQ ID NO：5編碼)係由畢赤酵母屬表現。
圖5：SGF+胃蛋白酶處理之植酸酶之SDS-PAGE。SEQ ID NO：3(由SEQ ID NO：1編碼)及SEQ ID NO：6(由SEQ ID NO：4編碼)係由假單胞菌屬表現。SEQ ID NO：3(由SEQ ID NO：2編碼)、SEQ ID NO：6(由SEQ ID NO：5編碼)及SEQ ID NO：8(由SEQ ID NO：7編碼)係由畢赤酵母屬表現。
圖6：在SGF處理後熱穩定植酸酶之活性。觀察到熱穩定植酸酶之活性極少或無損失。用pH 11緩衝液預驟冷T0樣品，然後添加植酸酶。
圖7：植酸酶發酵(30L)之假單胞菌屬(P.f.)表現量。
圖8：顯示當與業內已知之大腸桿菌(E.coli)植酸酶、經修飾大腸桿菌植酸酶及真菌植酸酶相比時，本發明(SEQ ID NO：3)之胃穩定性。
圖9：顯示當與業內已知之大腸桿菌植酸酶、經修飾大腸桿菌植酸酶及真菌植酸酶相比時，植酸酶SEQ ID NO.：3在多種植酸濃度下之植酸酶活性。
圖10：當與業內已知之大腸桿菌植酸酶、經修飾大腸桿菌植酸酶及真菌植酸酶相比時，植酸酶SEQ ID NO.：3之DSC層析。
圖11：顯示時間釋放植酸酶活性。
圖12：顯示抗營養植酸酶(IP6及IP5)之水解。
圖13：顯示藉由HPLC之43天肉雞之食糜內容物的肌醇磷酸酯分析。
圖14：顯示與業內已知之植酸酶相比，植酸酶SEQ ID NO.：3之基於飼料轉換比率之P當量。
圖15：顯示與業內已知之植酸酶相比，植酸酶SEQ ID NO.：3之基於脛骨灰分之P當量。
圖16：顯示與業內已知之植酸酶相比，植酸酶SEQ ID NO.：3之基於重量增加之P當量。
植酸酶係催化植酸(肌型肌醇六磷酸鹽)水解成磷與肌醇之磷酸單酯水解酶。根據國際生物化學與分子生物學聯盟命名委員會(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology，IUBMB)及Bairoch A.,「The ENZYME database in 2000,」Nucleic Acids Res 28：304-305(2000)之推薦，植酸酶歸類為酶學委員會(Enzyme Commission，EC)編號EC 3.1.3.8，且亦稱為：1-植酸酶；肌型肌醇六磷酸鹽3-磷酸水解酶；植酸鹽1-磷酸酶；植酸鹽3-磷酸酶；或植酸鹽6-磷酸酶。植酸酶亦歸類為EC 3.1.3.26，其亦稱為：4-植酸酶；6-植酸酶(基於1L-編號系統而非1D-編號命名)；或植酸鹽6-磷酸酶。植酸酶亦歸類為EC 3.1.3.72，其亦稱為5-植酸酶。植酸酶亦稱為組胺酸磷酸酶(HAP)；β-螺旋槳植酸酶；紫色酸性磷酸酶(PAP)；及蛋白質酪胺酸磷酸酶(PTP)。植酸酶之替代名稱將為彼等熟習此項技術者已知。
植酸酶係可具有作為動物飼料顆粒之補充物作用之酶的實例。植酸酶將植酸降解成肌型肌醇核心及一或多個游離磷酸鹽分子。植酸 係由共價附接6個磷酸基之肌型肌醇核心組成。植酸係用於產生動物飼料顆粒之植物材料(例如大豆種子)之成份，該等動物係例如非反芻動物，例如家禽、肉雞、鳥、小雞、蛋雞、火雞、鴨、鵝及禽；反芻動物，例如乳牛、家牛、馬及綿羊；豬、種豬、仔豬、生長豬及母豬；伴侶動物，包含(但不限於)：貓、狗、齧齒類動物及兔；魚類，包含(但不限於)鮭、鱒、吳郭魚、鯰及鯉；及甲殼類，包含(但不限於)河蝦及對蝦。因該等動物不能消化植酸，故植酸具有眾多有害作用。其螯合諸如鈣及鎂等二價陽離子，且其磷酸鹽係呈所飼餵動物生物不可用之形式，從而使得需要使用該等營養素補充動物膳食，儘管其在原料中較為豐富。此外，因該等營養素通過動物未經消化，故其可被進一步在食物鏈下游之能夠降解植酸之分解者利用，從而產生例如地表水中與動物排出物接觸之藻華。
非反芻動物(例如小雞、豬及魚)無法自快速生長所需要之食物獲取足量磷，此乃因其通常不產生自食物中所發現之植酸釋放磷所需要之植酸酶。自基於植物之食物及種子僅利用少量磷，此乃因大部分磷係以植酸之磷酸基(植酸鹽)形式存在。因此，業內需要向動物提供磷以加快其生長。
一種解決方案係向動物飼料中添加無機磷補充物；然而，使用無機磷補充物會引起自動物排泄且進入環境中之磷酸鹽量增加，此會導致水源污染。
另一解決方案係向動物提供植酸酶補充物或向動物飼料中添加植酸酶。市售植酸酶產品之實例包含(但不限於)：PHYZYME(Dupont,Danisco,Genencor)；QUANTUM及FINASE(AB Vista,AB Enzymes)；NATUPHOS(BASF)；RONOZYME(DSM)；生物飼料植酸酶(Novo Nordisk)；奧吉美植酸酶(Allzyme phytase，Alltech)；OPTIPHOS(Enzyvia,Phytex,Cornell)；Rovabio(Adisseo)； PHYTOUT(US Waters)。該等植酸酶產品中之每一者至少在生產量、生產時間、高溫下之穩定性、低pH下之穩定性、比活性及劑量要求方面具有限制。因此，業內需要一種使使用者能夠減少劑量量且降低生產及提供動物飼料之植酸酶之成本的植酸酶，例如，可在較短時間內以較高產量產生之植酸酶，在高溫下保留更強活性之植酸酶，在低pH下保留更強活性之植酸酶或具有較高比活性之植酸酶。
植酸酶係由核酸序列編碼之蛋白質。將核酸序列或DNA選殖至能夠表現或產生植酸酶之宿主生物體中。業內存在眾多已知可用於產生蛋白質之蛋白質表現系統。蛋白質表現系統之實例包含諸如以下等生物體：細菌、酵母、黴菌、哺乳動物、植物或昆蟲。多種因素會影響表現系統之選擇，例如所表現蛋白質之類型及所產生蛋白質產物之量。Demain,(2009)「Production of Recombinant Proteins by Microbes and higher Organisms,」Biotechnology Advances，第27卷，第297-306頁揭示眾多蛋白質表現系統之多個優點及缺點。
植酸酶在商業上係自眾多宿主生物體細胞外產生，包含(但不限於)：黑麴菌(Aspergillus niger)、米麴菌(Aspergillus oryzae)、繩狀青黴(Penicillium funiculosum)、植酸酶菜籽(Phytase canola)(西洋油菜(Brassica napus))、嗜甲醇畢赤酵母(Pichia pastoris)及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，參見Pariza,「Determining the safety of enzymes used in animal feed,」Regulatory Toxicology and Pharmacology 56(2010)332-342。
植酸酶之工業規模生產需要在短時間內以低成本產生大量酶之表現系統。因此，業內需要提供滿足或超出植酸酶之工業規模製造之生產要求之基因。
本發明之實施例係提供編碼在革蘭氏陰性細菌表現系統(gram-negative bacteria expression system)中大量產生之植酸酶之基因。另一 實施例係提供編碼經由細胞內表現大量產生之植酸酶之基因。另一實施例係在革蘭氏陰性細菌表現系統中經由細胞內表現產生植酸酶，其中宿主生物體為假單胞菌屬。另一實施例係在螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)中產生植酸酶。表現系統可為業內已知之任何螢光假單胞菌表現系統，例如自Dow Global Technologies公司購得之螢光假單胞菌表現系統，菌株DC454(美國專利公開申請案第20050130160號及美國專利公開申請案第20050186666號)。將編碼植酸酶或多肽之核酸序列插入pMYC載體(Dow Global Technologies公司，美國專利公開申請案第20050130160號)或pDOW1169載體(Dow Global Technologies公司，美國專利公開申請案第20080058262號)中，且然後藉由電穿孔引入螢光假單胞菌宿主中。彼等熟習此項技術者將瞭解可用作本發明實施例之替代載體。
在另一實施例中，可將編碼植酸酶之DNA引入質體上或穩定轉化至例如任何數目之諸如以下等革蘭氏陰性細菌系統之基因組中：大腸桿菌；假單胞菌屬，例如螢光假單胞菌、戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；羅爾斯頓氏菌屬(Ralstonia species)或柄桿菌屬(Caulobacter species)。類似地，可將植酸酶引入任何數目之諸如以下等革蘭氏陽性細菌表現系統(gram positive bacterial expression system)中：芽孢桿菌屬(Bacillus species)，例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)或短芽孢桿菌(Bacillus brevis)；乳球菌屬(Lactococcus species)，例如乳酸鏈球菌(Lactococcus lactis)；乳桿菌屬(Lactobacillus species)；或鏈黴菌屬(Streptomyces species)，例如變鉛青鏈黴菌(Streptomyces lividans)。可使用其他革蘭氏陰性、革蘭氏陽性或不相關真細菌或古細菌表現系統來表現植酸酶。
在另一實施例中，可將編碼植酸酶之DNA引入質體中以引導其 表現。包括編碼植酸酶之DNA之質體可包含例如家族pQE、pET及pASK之大腸桿菌表現載體；家族pCN51 LT8、RSF1010、pWZ112T及pMYC之假單胞菌屬表現載體；家族pBAX、pHT01及pHIS1525之芽孢桿菌屬表現載體；家族pIJ6021及pIJ2460之鏈黴菌屬表現載體；及家族pNZ9530及pNZ8148之乳球菌屬表現載體。該等實例係出於展示目的，且並不代表可表現多核苷酸序列SEQ ID NO：1之載體之完整集合。
在另一實施例中，編碼植酸酶之經分離、重組或合成核酸序列係以下列量經由細胞內表現來產生：至少7.0g/L、8.0g/L、9.0g/L、10.0g/L、11.0g/L、12.0g/L、13.0g/L、14.0g/L、15.0g/L、16.0g/L、17.0g/L、18.0g/L、19.0g/L、20.0g/L、21.0g/L、22.0g/L、23.0g/L、24.0g/L、25.0g/L、26.0g/L、27.0g/L、28.0g/L、29.0g/L、30.0g/L、31.0g/L、32.0g/L、33.0g/L、34.0g/L、35.0g/L、36.0g/L、37.0g/L、38.0g/L、39.0g/L或至少40.0g/L或40.0g/L以上。
在另一實施例中，植酸酶之發酵生產時間小於150小時、145小時、140小時、135小時、130小時、125小時、120小時、115小時、110小時、105小時、100小時、95小時、90小時、85小時、80小時、75小時、70小時、65小時、60小時、55小時、50小時、49小時、48小時、47小時、46小時、45小時、44小時、43小時、42小時、41小時、40小時、39小時、38小時、37小時、36小時、35小時、34小時、33小時、32小時、31小時、30小時、29小時、28小時、27小時、26小時、25小時、24小時、23小時、22小時、21小時、20小時或小於20小時。
在另一實施例中，發酵係以等於或大於下列之體積來實施：10L、100L、200L、500L、1000L、2000L、5000L、10,000L、25,000L、50,000L、55,000L、60,000L、65,000L、70,000L、 75,000L、80,000L、85,000L、90,000L、95,000L、100,000L、110,000L、120,000L、130,000L、140,000L、150,000L、160,000L、170,000L、180,000L、190,000L、200,000g/L或200,000L以上。
在一實施例中，細胞內表現系統為革蘭氏陰性細菌。在另一實施例中，革蘭氏陰性細菌係假單胞菌屬。在另一實施例中，假單胞菌屬為螢光假單胞菌。
在一實施例中，具有植酸酶活性之多肽係以約35.0g/L產生。在另一實施例中，具有植酸酶活性之多肽係以大於7.0g/L產生。在另一實施例中，植酸酶將在小於144小時內表現。在另一實施例中，植酸酶將在小於84小時、74小時、64小時、54小時、44小時、34小時或24小時內產生。
在一實施例中，編碼藉由細胞內表現產生之植酸酶之核酸係源自大腸桿菌、芽孢桿菌屬、哈佛尼亞菌屬(Hafnia sp.)、隔孢伏革菌(Perni ophora lycii)、布丘氏菌屬(Buttiauxella sp.)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter sp.)或黑麴菌或係源自該等細菌之核酸之經修飾形式。在另一實施例中，植酸酶係以下PCT公開案中所揭示之任何植酸酶：第WO 1999/008539號、第WO 2000/071728號、第WO 2001/090333號、第WO 2002/095003號、第WO 2006/028684號、第WO 2008/036916號或第WO 2010/135588號。
在另一實施例中，核酸係經分離、合成或重組核酸。在另一實施例中，經分離、重組或合成核酸序列編碼具有植酸酶活性之多肽。在另一實施例中，核酸序列係選自由以下組成之群：核酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：7。
在一實施例中，編碼具有植酸酶活性之多肽之核酸係SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7之變體，其中該變體與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及/或SEQ ID NO：7或其片段至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或完全(100%)一致，其中該變體編碼具有植酸酶活性之多肽。
在另一實施例中，經分離、合成或重組核酸序列編碼選自由以下組成之群之多肽：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：8。在另一實施例中，SEQ ID NO：1之核酸或SEQ ID NO：1之變體編碼多肽SEQ ID NO：3。在另一實施例中，SEQ ID NO：2之核酸或SEQ ID NO：2之變體編碼多肽SEQ ID NO：3。在另一實施例中，SEQ ID NO：4之核酸或SEQ ID NO：4之變體編碼多肽SEQ ID NO：6。在另一實施例中，SEQ ID NO：5之核酸或SEQ ID NO：5之變體編碼多肽SEQ ID NO：6。在另一實施例中，SEQ ID NO：7之核酸或SEQ ID NO：7之變體編碼多肽SEQ ID NO：8。
在一實施例中，核酸序列與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7之全長序列或其變體互補。
在一實施例中，植酸酶係具有植酸酶活性之經分離、重組或合成多肽，其中該多肽係選自由以下組成之群：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：8之胺基酸序列。
在另一實施例中，植酸酶係SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8之變體，其中該變體與SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8或其酶活性片段至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、 76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或完全(100%)一致，其中該變體具有植酸酶活性。在另一實施例中，植酸酶係由包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及/或SEQ ID NO：7之核酸序列編碼之胺基酸序列。
在一實施例中，植酸酶係缺少信號序列、前蛋白序列、啟動子序列或其任何組合之胺基酸序列。
在一實施例中，植酸酶係進一步包括選自由以下組成之群之異源序列之胺基酸序列：信號序列、標籤、表位、交配因子、調控序列、啟動子序列、N端延伸、C端延伸及其任何組合。
在一實施例中，植酸酶具有介於約1000U/mg至約1,600U/mg範圍內之任一值之比活性。在另一實施例中，植酸酶具有以下比活性：1000U/mg、1100U/mg、1200U/mg、1300U/mg、1400U/mg、1500U/mg或1600U/mg。
在一實施例中，植酸酶在介於約pH 1.0至約pH 9.0範圍內任一pH之下有活性。在一實施例中，植酸酶在以下pH下有活性：1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或鹼性更強之條件。
在一個實施例中，植酸酶在介於約50℃至約100℃範圍內之任一溫度有活性。在另一實施例中，植酸酶在以下溫度有活性：介於大於37℃至約95℃範圍內、或介於約55℃至約85℃之間、或介於約70℃至約75℃之間、或介於約70℃至約95℃之間、介於約90℃至約95℃之間、介於約95℃至約105℃之間、或介於約95℃至約110℃之間。
在一個實施例中，本發明之植酸酶包含於組合物中。在另一實 施例中，該組合物係調配物。在另一實施例中，組合物為包括植酸酶之食品、飼料、補充物、動物飼料添加劑或膳食助劑。在另一實施例中，組合物係包括植酸酶之醫藥組合物。
本文所使用之「選殖」係產生DNA片段、細胞或生物體之拷貝之過程，其中將DNA引入產生重組DNA拷貝之宿主生物體中。
本文所使用之「選殖載體」係用於將遺傳序列(例如去氧核糖核酸(DNA)片段或完整基因)插入宿主細胞中以使外源遺傳物質能夠複製之載體，例如細菌質體或噬菌體。
本文所使用之「雞尾酒(cocktail)」係包括本發明植酸酶與一或多種其他酶組合之組合物。一或多種其他酶可為任何酶，例如乳糖酶、脂酶、蛋白酶、過氧化氫酶、聚木糖酶、纖維素酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、澱粉酶、醯胺酶、環氧化物水解酶、酯酶、磷脂酶、轉胺酶、胺氧化酶、纖維二糖水解酶、解氨酶或其任何組合。
「密碼子」係指定欲添加至蛋白質中之胺基酸身份之三聚核苷酸序列。
本文所使用之「互補DNA或cDNA」係在逆轉錄酶及DNA聚合酶催化之反應中自信使RNA(mRNA)模板合成之DNA。
本文所使用之「培養」包含使用視需要修改之習用營養培養基以在含有編碼植酸酶之多核苷酸之宿主細胞中活化啟動子、選擇轉化體或擴增基因。培養條件(諸如溫度、pH及諸如此類)係經選擇用於表現之宿主細胞所用者，且將為熟習此項技術者所明瞭。
本文所使用之「宿主細胞」係包括編碼植酸酶之核酸序列或包括本發明之表現盒、載體、選殖媒介、表現載體或選殖載體之經轉化細胞。宿主細胞可係熟習此項技術者所熟悉之任何宿主細胞，包含原核細胞或真核細胞，例如細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞。適宜宿主之選擇係在熟習此項技術者之 能力範圍內。
宿主細胞可以習用方式用於產生由重組序列編碼之基因產物。端視重組產生程序中所採用之宿主，由宿主細胞產生之多肽可為糖基化或可為非糖基化的。本發明之多肽亦可或可不包含初始甲硫胺酸胺基酸殘基。
如本文所使用之「一致」係序列一致性(同源性)程度，其可使用業內已知之任一電腦程式及相關參數(例如BLAST 2.2.2.或FASTA 3.0t78版以及缺省參數)來測定。
蛋白質及/或核酸序列一致性(同源性)可使用業內已知之眾多序列比較演算法及程式中之任一者來評估。該等演算法及程式包含(但不限於)BLAST程式(Basic Local Alignment Search Tool，國家生物技術資訊中心(National Center for Biological Information)，例如BLAST、BLAST2、BLASTN及BLASTX)、TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA以及CLUSTALW(Pearson及Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)：2444-2448,1988；Altschul等人，J.Mol.Biol.215(3)：403-410,1990；Thompson等人，Nucleic Acids Res.22(2)：4673-4680,1994；Higgins等人，Methods Enzymol.266：383-402,1996；Altschul等人，J.Mol.Biol.215(3)：403-410,1990；Altschul等人，Nature Genetics 3：266-272,1993。亦使用BLAST、BLAST 2.0及BLAST 2.2.2演算法來實踐本發明。其闡述於例如Altschul(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402；Altschul(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。用於執行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心公開獲得。
術語「同源性」及「一致性」在兩個或更多個核酸或多肽序列之背景下係指，在比較窗口內或指定區域內如利用任一數量之序列比較演算法或藉由人工比對及目視檢查所量測針對最大對應比較及比對 時，兩個或更多個序列或子序列相同或具有相同胺基酸殘基或核苷酸之指定百分比。對於序列比較，一個序列可用作與測試序列進行比較之參考序列(本發明之實例性序列)。當使用序列比較演算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦中，必要時指定子序列坐標，且指定序列演算法程式參數。可使用缺省程式參數或可指定替代參數。然後序列比較演算法將基於程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分數。
如本文所使用之「核酸」係指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或該等核苷酸中任一者之核酸片段。核酸可為基因組或合成來源之基因組DNA、cDNA、合成DNA或RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA)，其可為單鏈或雙鏈且可表示肽核酸(PNA)或天然或合成來源之任一DNA樣或RNA樣材料之有義鏈或反義鏈，包含例如iRNA、核糖核蛋白(例如iRNP)。該術語涵蓋含有天然核苷酸之已知類似物之核酸，即寡核苷酸。該術語亦涵蓋具有合成骨架之核酸樣結構，參見例如Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144：189-197；Strauss-Soukup(1997)Biochemistry 36：8692-8698；Samstag(1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6：153-156。
用於實踐本發明之核酸無論RNA、iRNA、反義核酸、cDNA、基因組DNA、載體、病毒抑或其雜合體皆可自經遺傳改造、擴增及/或重組表現/產生之眾多來源分離。自該等核酸產生之重組多肽可經個別地分離或選殖且測試期望活性。在一實施例中，核酸可處於重組表現系統中，包含細菌、哺乳動物、酵母、昆蟲或植物細胞表現系統。
用於核酸操縱之技術(例如亞選殖、標記探針(例如，使用Klenow聚合酶之隨機引子標記、切口平移、擴增)、測序、雜交及諸如此類)詳細闡述於科學及專利文獻中，例如參見Sambrook編輯，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(第2版)，第1- 3卷，Cold Spring Harbor Laboratory,(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Ausubel編輯，John Wiley & Sons公司，New York(1997)；LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY：HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES，第I部分.Theory and Nucleic Acid Preparation,Tijssen編輯，Elsevier,N.Y.(1993)。
本發明提供可操作地連接至表現(例如轉錄或翻譯)控制序列(例如啟動子或增強子)以引導或調節RNA合成/表現之本發明核酸(例如DNA)序列。表現控制序列可為表現載體。
本發明提供包括本發明核酸(例如編碼本發明植酸酶之序列)之表現系統，例如表現盒、載體、選殖媒介及諸如此類，用於表現及過表現本發明多肽。
本發明核酸序列之最佳化表現亦指核酸之引導或隨機誘變以實現所編碼蛋白質之增加的表現。本發明核酸之誘變可直接或間接提供所表現蛋白質之增加的產量。藉助非限制性實例，可使用本文所闡述之誘變技術來實現核酸之5'非翻譯區、3'非翻譯區或編碼區之突變，其突變可使得RNA或蛋白質層面上之穩定性增加，由此增加蛋白質之產量。
在一些實施例中，對所關注蛋白質製造之突變係由多種因素來確定，包含分析開放閱讀框(ORF)或所關注基因之所預測mRNA結構之5引發端的二維及三維結構以及宿主之較佳密碼子，以選擇可增強所關注蛋白質之表現之突變。例如，在一些實施例中，突變既非僅基於宿主之較佳密碼子(即密碼子最佳化)亦非藉由密碼子最佳化程式來選擇。
「突變」係核苷酸序列或胺基酸序列與參考序列相比之變化。
「沉默突變」係密碼子之不產生不同胺基酸特異性之突變。
「核苷酸」係指以下四種構成DNA序列之鹼基中之一者：腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)及胞嘧啶(C)。
在一態樣中，本發明之表現盒包括本發明序列及能夠影響結構基因(即，蛋白質編碼序列，例如本發明之植酸酶)在與該等序列相容之宿主中之表現之核苷酸序列。表現盒包含至少一個與多肽編碼序列及視情況與其他序列(例如轉錄終止信號)可操作地連接之啟動子。亦可使用實現表現所需要或有助於實現表現之其他因素，例如增強子。
大量適宜載體為彼等熟習此項技術者已知，且市面上有售。實例性載體包含：細菌：pQE載體(Qiagen)、pBluescript質體、pNH載體、(λ-ZAP載體(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)；真核：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)。然而，可使用任何其他質體或其他載體，只要其在宿主中可複製且可有活力即可。倘若將重組微生物或細胞培養物闡述為攜載「表現載體」，則此包含染色體外環狀及線性DNA及已納入宿主染色體中之DNA。倘若載體係由宿主細胞來維持，則該載體可在細胞有絲分裂期間穩定地複製。
表現載體可包括啟動子、用於翻譯起始之核糖體結合位點及轉錄終止子。該載體亦可包含用於擴增表現之適宜序列。
本發明提供用於擴增編碼具有植酸酶活性之多肽之核酸或其子序列之擴增引子序列對。熟習此項技術者可設計用於該等序列之任一部分或全長之擴增引子序列對。擴增方法亦為業內所熟知，且包含例如聚合酶鏈式反應PCR；轉錄擴增；自我持續序列複製；Q β複製酶擴增；及其他RNA聚合酶介導之技術。
如本文所使用之「多肽」包括為寡肽、肽、多肽或蛋白質序列或另一選擇為該等序列中任一者之片段、部分或亞單位且為天然或合成分子之「胺基酸」或「胺基酸序列」。
在一態樣中，本發明之多肽及肽具有植酸酶活性。在替代態樣中，其亦可用作例如標記探針、抗原、耐受原、基序、植酸酶活性位點。
本發明之多肽及肽係經分離、合成或重組多肽。肽及蛋白質可在活體外或在活體內以重組方式來表現。本發明之肽及多肽可使用業內已知之任何方法來製備及分離。本發明之多肽及肽亦可使用業內熟知之化學方法全部或部分地合成。例如，植酸酶多肽可在標準重組表現系統(如本文所闡述)中產生，以化學方式合成或自以天然方式表現其之生物體純化。
在替代態樣中，本發明之「重組」多肽或蛋白質包含(係指)藉由重組DNA技術產生之多肽或蛋白質；例如，自經編碼期望多肽或蛋白質之外源DNA構築物轉化之細胞產生的多肽或蛋白質。
在替代態樣中，本發明之肽及多肽經糖基化。糖基化可在翻譯後以化學方式或藉由細胞生物合成機制來添加，其中後者涉及使用已知糖基化基序，該等基序可為序列原有的或可以肽形式添加或在核酸編碼序列中添加。糖基化可為O-連接或N-連接或其組合。
在替代態樣中，如上文所定義之本發明肽及多肽部分或完全地包括「模擬物」及「擬肽」形式。在一態樣中，術語「模擬物」及「擬肽」係指具有與本發明多肽實質上相同之結構及/或功能特徵之合成化學化合物。模擬物可完全由胺基酸之合成非天然類似物構成，或係部分天然肽胺基酸與胺基酸之部分非天然類似物之嵌合分子。模擬物亦可納入任一量之天然胺基酸保守取代，只要該等取代亦不實質上改變模擬物之結構及/或活性即可。鑒於利用為保守變體之本發明多肽，常規實驗將確定模擬物是否係在本發明之範疇內，即實質上並不改變其結構及/或功能。因此，在一態樣中，若模擬物組合物具有植酸酶活性，則其係在本發明之範疇內。
在替代態樣中，保守取代係藉由特徵類似之另一胺基酸取代多肽中之給定胺基酸之彼等。在替代態樣中，保守取代為以下置換：脂肪族胺基酸(例如Ala、Val、Leu及Ile)經另一脂肪族胺基酸置換；Ser經Thr置換或反之亦然；酸性殘基(例如Asp及Glu)經另一酸性殘基置換；具有醯胺基團之殘基(例如Asn及Gln)經具有醯胺基團之另一殘基置換；鹼性殘基(例如Lys及Arg)經另一鹼性殘基交換；及芳香族殘基(例如Phe、Tyr)經另一芳香族殘基置換；一疏水性胺基酸(例如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸)取代另一胺基酸或一極性胺基酸取代另一胺基酸，例如精胺酸取代離胺酸、麩胺酸取代天冬胺酸或麩醯胺酸取代天冬醯胺。在一態樣中，自例如本發明之植酸酶多肽可缺失一或多個胺基酸，以產生多肽結構之修飾而不顯著改變其生物活性，或另一選擇為有意地顯著改變其生物活性。例如，可移除及/或添加為植酸酶生物活性所必需或另一選擇為其不必需之胺基或羧基端胺基酸。可藉由任何數量之方法來分析本發明之經修飾多肽序列之植酸酶生物活性，包含使經修飾多肽序列與植酸酶受質接觸並測定經修飾多肽是否使分析中之特異性受質之量減少或使功能性植酸酶多肽與受質之酶反應之生物產物增加。
在一態樣中，本發明之肽及多肽具有與本發明之胺基酸序列「實質上一致」之序列，即區別在於一或多個保守或非保守胺基酸取代、缺失或插入之序列，尤其在該取代出現在並非分子之活性位點之位點處時，且前提係該多肽基本上保留其功能性質。
在一實施例中，植酸酶係選自由以下組成之群：具有胺基酸序列SEQ ID NO：3(由多核苷酸SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2編碼)之多肽；具有胺基酸序列SEQ ID NO：6(由多核苷酸SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5編碼)之多肽；及具有胺基酸序列SEQ ID NO：8(由多核苷酸SEQ ID NO：7編碼)之多肽。
在另一實施例中，植酸酶係SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8之多肽變體，其中該多肽變體具有與多肽SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8或其酶活性片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98.0%、98.1%、98.2%、98.3%、98.4%、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或完全(100%)一致性之胺基酸序列，其中該多肽變體具有植酸酶活性。
本發明提供不具或具有經修飾信號序列(亦稱為信號肽(SP)或前導肽)或異源信號序列之植酸酶。本發明多肽亦可不具或具有經修飾或異源前原結構域及/或催化結構域(CD)。納入本發明多肽中之經修飾或異源SP、前原結構域及/或CD可係融合蛋白之一部分，例如作為嵌合蛋白質中之異源結構域或藉由化學連接劑添加。例如，在載體(例如pPIC系列載體(Life Technologies,Carlsbad,CA))中，本發明之酶可包括異源SP及/或前原結構域。
此外，本發明之多肽可進一步包括異源序列、來自其他植酸酶或來自非植酸酶來源之任一序列或完全合成序列。因此，在一態樣中，本發明之核酸包括內源、經修飾或異源信號序列(SP)、前原結構域及/或催化結構域(CD)之編碼序列及異源序列(即，通常不與本發明之信號序列(SP)、前原結構域及/或催化結構域(CD)相關之序列)。該異源序列可位於SP、前原結構域及/或CD編碼序列之3’末端、5’末端及/或兩端。
本發明之固定化酶及固體載體係植酸酶或其片段，且編碼該等酶及片段之核酸可附加至固體載體。此通常在工業製程中使用植酸酶 方面經濟且有效。例如，可將用於特定化學反應中之植酸酶(或其活性片段)之共同體或雞尾酒附接至固體載體且浸泡於融溶釜中。可進行酶反應。然後，可自釜中取出固體載體以及附加至其之酶以供重複利用。在本發明之一實施例中，將本發明之經分離核酸附加至固體載體。在本發明之另一實施例中，固體載體係選自由以下組成之群：凝膠、樹脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微電極及/或其任何組合。
業內存在熟習此項技術者已知用於將酶或其片段或核酸固定至固體載體上之許多方法。該等方法之一些實例包含例如靜電液滴產生、電化學方式、經由吸附、經由共價結合、經由交聯、經由化學反應或過程、經由囊封、經由包埋、經由藻酸鈣或經由聚(甲基丙烯酸2-羥基乙基酯)。類似方法闡述於以下文獻之方法中：Enzymology,Immobilized Enzymes and Cells，C部分.1987.Academic Press.S.P.Colowick及N.O.Kaplan編輯.第136卷及Immobilization of Enzymes and Cells.1997.Humana Press.G.F.Bickerstaff編輯.Series：Methods in Biotechnology，J.M.Walker編輯。
如本文所使用之「變體」包含該等多肽之衍生物或類似物。具體而言，變體之胺基酸序列可因可以任一組合存在之一或多個取代、添加、缺失、融合及截短而與本發明多肽及與其實質上一致之序列不同。
產生本發明核酸(例如編碼植酸酶之彼等)之變體之方法為業內所熟知。該等方法可重複或以多種組合使用以產生具有與由模板核酸編碼之植酸酶相比經改變或不同之活性或經改變或不同穩定性的植酸酶。該等方法亦可重複或以多種組合使用，以例如產生基因/信使表現、信使翻譯或信使穩定性之變化形式。在另一態樣中，藉由例如離體修飾同源基因、然後將其再插入細胞中來改變細胞之遺傳組成。
本發明亦提供藉由誘變及其他方法改變本發明植酸酶之特徵之 方法，包含例如由Verenium公司(先前的Diversa公司，San Diego,CA)研發之專利性方式，例如基因再裝配(例如，參見美國專利第6,537,776號；基因位點飽和誘變(GSSM)(例如，參見美國專利第6,171,820號及第6,764,835號)、在定向進化中外切酶介導之基因裝配(例如，參見美國專利第6,361,974號及第6,352,842號)、定向進化中之末端選擇(例如，參見美國專利第6,358,709號及第6,238,884號)、基於重組之合成穿梭(例如，參見美國專利第5,965,408號及第6,440,668號及澳大利亞專利第AU724521號)、嗜熱酶之定向進化(例如，參見美國專利第5,830,696號及第6,335,179號)及修剪式多位點組合裝配(例如，參見WO 2009/018449)。
可使用分子生物學中已知之多種技術，例如隨機PCR誘變，例如參見Rice(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5467-5471；或組合多盒誘變，例如參見Crameri(1995)Biotechniques 18：194-196。另一選擇為，可在隨機或「隨機化」片段化後再裝配核酸(例如基因)，例如參見美國專利第6,291,242號；第6,287,862號；第6,287,861號；第5,955,358號；第5,830,721號；第5,824,514號；第5,811,238號；第5,605,793號。在替代態樣中，修飾、添加或缺失係藉由以下方式來引入：易錯PCR、穿梭、寡核苷酸定向誘變、裝配PCR、有性PCR誘變、活體內誘變、盒誘變、遞歸總體誘變、指數總體誘變、位點特異性誘變、基因再裝配、基因位點飽和誘變(GSSM)、合成連接再裝配(SLR)、重組、遞歸序列重組、一硫代磷酸酯修飾之DNA誘變、含尿嘧啶之模板誘變、缺口雙鏈體誘變、點錯配修復誘變、修復缺陷宿主菌株誘變、化學誘變、放射誘變、缺失誘變、限制性選擇誘變、限制性純化誘變、人工基因合成、總體誘變、嵌合核酸多聚體產生及/或該等與其他方法之組合。
如本文所使用之「轉基因植物及種子」包括本發明之核酸、多 肽、表現盒、選殖機制或載體或本發明之經轉染或轉化之細胞。本發明亦提供包括本發明核酸及/或多肽之植物產品，例如油、種子、葉、提取物及諸如此類。轉基因植物可為雙子葉(雙子葉植物)或單子葉(單子葉植物)。本發明亦提供製造及使用該等轉基因植物及種子之方法。表現本發明多肽之轉基因植物或植物細胞可根據業內已知之任一方法來構築。例如，參見美國專利第6,309,872號。
在一些實施例中，為達成植酸酶之細胞外表現，本發明之表現構築物利用分泌信號序列。儘管亦可使用與植物宿主物種同源(原有)之信號序列、異源信號序列(即源自其他植物物種或微生物來源者)，但該等信號序列為熟習此項技術者已知。可用於本發明之適宜信號序列揭示於Blobel等人，1979；Von Heijne,1986；Garcia等人，1987；Sijmons等人，1990；Ng等人，1994及Powers等人，1996)中。
本文所使用之「轉基因非人類動物」為本發明之核酸、多肽、表現盒或載體或經轉染或轉化之細胞。轉基因非人類動物可為例如包括本發明核酸之山羊、兔、綿羊、豬、牛、大鼠及小鼠。該等動物可用作例如研究植酸酶活性之活體內模型，或用作篩選活體內植酸酶活性之調節劑之模型。欲在轉基因非人類動物中表現之多肽之編碼序列可經設計為組成型或在組織特異性、發生特異性或可誘導轉錄之調節因子之控制下。轉基因非人類動物可使用業內已知之任何方法設計及產生。
在一個實施例中，使用本發明之植酸酶作為動物飼料之添加劑。添加植酸酶之一些益處包含(但不限於)：增加飼料中所含有之總磷、減少經由排泄釋放至環境中之磷，及增加其他礦物質及胺基酸之消化率。在另一實施例中，當與業內已知之植酸酶相比時，本發明之植酸酶具有高活體內活性。在另一實施例中，在低受質濃度(低Km)下植酸酶活性高。在另一實施例中，植酸酶在不使用包覆下具有固有 熱穩定性及造粒穩定性。在另一實施例中，植酸酶在腸中快速活化且更快速釋放。在另一實施例中，植酸酶具有降低的IP6及IP5抗營養活性。
在另一實施例中，可將包括本發明植酸酶之動物飼料或補充物給予任何動物。植酸酶通常包含於家禽(例如小雞、肉雞或蛋雞，火雞，鴨)、豬(swine)(例如豬(pigs)、仔豬或母豬)、牛(bovine)(例如家牛(cattle))之動物飼料及魚(例如鱒、鮭、吳郭魚(tilapia)、鯰及鱸魚)之水產養殖飼料中。
在另一實施例中，包括本發明植酸酶之動物飼料可以彼等熟習此項技術者已知之任何調配物形式提供至動物。動物飼料調配物之實例包含(但不限於)：遞送基質、顆粒、錠劑、凝膠、液體、噴霧、研磨穀粒或粉末。
在另一實施例中，使用本發明植酸酶來處理易於遭受骨質流失之個體，例如骨質疏鬆症、惡病質及經可損害營養素之適當攝取或利用之醫學治療(例如化學療法)。本發明之一態樣係提供包括植酸酶之醫藥或膳食調配物。業內亦常將本發明植酸酶用於經受體育訓練、強化體能訓練、醫院膳食、微量營養素貧乏之穀類及豆類膳食、學校午餐計劃或任何其他營養計劃之個體。
在一實施例中，將本發明之植酸酶用於生物燃料之工業生產及生物質轉換中。例如，將植酸酶用於發酵或醇生產製程中。在一實施例中，醇為可用於燃料應用或為可飲用乙醇之乙醇。在一實施例中，發酵製程可利用澱粉或非澱粉植物材料，例如木質纖維素材料，例如纖維素、半纖維素及/或木質素。
在另一實施例中，使用本發明植酸酶來處理可溶乾酒槽(DDS)；乾酒渣(DDG)；可溶濃縮酒槽(CDS)；可溶濕酒渣(DWG)及可溶乾酒渣(DDGS)。可將醇發酵製程之該等副產品用作動物飼料之成份。在 另一實施例中，使用植酸酶來減少結垢及增加乙醇產率。
在另一實施例中，使用本發明植酸酶將藻類、初榨植物油、廢植物油、污物轉換成燃料。
在另一實施例中，當與真菌、大腸桿菌或經修飾大腸桿菌植酸酶相比時，本發明植酸酶將具有增加的磷當量。
在另一實施例中，本發明植酸酶具有介於0.11%至0.23%範圍內之磷當量。
在另一實施例中，當與真菌、大腸桿菌或經修飾大腸桿菌植酸酶相比時，植酸酶包括增加的磷生物可用度。
在另一實施例中，當與真菌或大腸桿菌植酸酶相比時，本發明植酸酶具有高至少60%至65%之磷生物可用度。
在另一實施例中，當與經修飾大腸桿菌植酸酶相比時，本發明植酸酶具有高至少20%至30%之磷生物可用度。
在另一實施例中，當與真菌、大腸桿菌或經修飾大腸桿菌植酸酶相比時，本發明植酸酶能夠增加磷水解。
在另一實施例中，本發明植酸酶使來自包括植酸之飼料之高達90%之磷水解。
在另一實施例中，本發明植酸酶能夠使來自包括植酸之飼料之高達90%之磷水解。
在另一實施例中，本發明植酸酶在低pH下具有至少100%的活性達5分鐘以上。在另一實施例中，pH為1.2至約pH 5.5。
在另一實施例中，本發明植酸酶在0.2mM至5.1mM植酸之植酸濃度下具有經改良之活性。
在另一實施例中，本發明植酸酶具有大於約90℃之熔融溫度。
在另一實施例中，本發明植酸酶在2.5分鐘時具有至少90%的活性。
在另一實施例中，本發明植酸酶水解介於約91%至約98%範圍內之抗營養植酸酶IP2、IP3、IP4、IP5及IP6。
在一些實施例中，本文所揭示之植酸酶包括於2013年3月12日提出申請的美國臨時申請案第61,777,139號中所揭示之植酸酶，該申請案之揭示內容之全文以引用方式併入本文中。
實例 實例1：植酸酶比活性
測定(如下文所闡述)在假單胞菌屬及畢赤酵母屬中表現之植酸酶之比活性。植酸酶分子之比活性受在兩種所分析表現系統中之表現的影響(參見圖1)。藉由離心自發酵培養液移除畢赤酵母屬細胞，且用DNA酶處理上清液並用100mM TRIS(pH 8.0)交換緩衝液。使用微射流機溶解表現植酸酶之假單胞菌屬細胞且離心。用DNA酶處理上清液且與100mM Tris(pH 8.0)進行緩衝液交換。然後將樣品裝載至離子交換管柱(FPLC)上且收集流份。測試所溶析流份之活性且在SDS-PAGE上運行；彙集純流份。
經由分光光度計測定蛋白質濃度(280nm下之吸光度)。使用基於肽之軟體計算器VECTOR NTI(Life Technologies,Carlsbad,CA)測定特異性蛋白吸收係數(280nm)。基於肽序列之植酸酶分子之280nm係數經測定為OD280 1.0=0.875mg/mL(SEQ ID NO：6(由SEQ ID NO：4編碼)、SEQ ID NO：6(由SEQ ID NO：5編碼)、SEQ ID NO：3(由SEQ ID NO：1編碼)及SEQ ID NO：3(由SEQ ID NO：2編碼)及0.897mg/mL(SEQ ID NO：8，由SEQ ID NO：7編碼)。基於吸光度比率(260nm/280nm)，DNA經測定低於可量測值。
使用檢測來自植酸去磷酸化之游離磷酸之比色分析來測定植酸酶比活性。將經純化植酸酶之50μL等份試樣添加至預熱(37℃)的950μL受質混合物(4mM植酸十二鈉、100mM乙酸鈉(pH 5.5))中。每分鐘 抽取50μL等份試樣且在50μL顯色/終止(color/stop)溶液(鉬酸鹽-釩酸鹽)中驟冷。10分鐘後，當完全形成黃色時，使用SpectraMax Plus吸光度讀取器量測OD415。藉由下文所說明之計算來確定活性。
一個單位定義為酶每分鐘釋放之磷酸鹽的微莫耳數
實例2：高溫下之植酸酶活性(DSC Tm)
為測定植酸酶之熱穩定性，採用Perkin-Elmer Pyris 1差示掃描量熱計(DSC)來測定植酸酶變體之熔融溫度(T m )。在pH 5.5(與水性飼料提取物類似)下使用100mM檸檬酸鹽作為緩衝液實施T m 分析。在具或不具10%山梨醇-10% NaCl下運行DSC運行。DSC分析指示經10%山梨醇-10% NaCl改良之植酸酶熱穩定性。在液體形式中，可達成大於98℃之T m (圖2)。僅在緩衝液中，假單胞菌屬表現之植酸酶顯示T m 比畢赤酵母屬表現之植酸酶低約1℃-2℃，然而當添加10%山梨醇-10% NaCl時並未觀察到此溫度降低(圖3)。
實例3：pH曲線
當在畢赤酵母屬或假單胞菌屬中表現時，植酸酶之最佳pH(圖4)經測定為pH 3.5-pH 4.5。使用布裏頓-羅賓遜緩衝液測定植酸酶在不同pH點下對植酸受質之活性以移除因切換緩衝液以覆蓋所測試範圍pH 1.0-pH 5.5而產生之混淆變量。將不同pH下之活性正規化至最佳pH 4。
實例4：低pH(模擬胃液(SGF))條件下之植酸酶活性及pH曲線
藉由在pH 1.2之模擬胃液(SGF)中將植酸酶分子處理60分鐘之時程來評價胃穩定性。將胃蛋白酶以10個胃蛋白酶單位/μg植酸酶添加至SGF中。在10、30及60分鐘時，移除SGF-植酸酶混合物之等份試樣且在200mM碳酸鈉緩衝液(pH 11.0)中驟冷。然後藉由SDS-PAGE分析樣品以確定蛋白質消化之程度。SDS-PAGE(圖5)結果展示，SEQ ID NO：8(由SEQ ID NO：7編碼)分子之植酸酶條帶在10分鐘SGF+胃蛋白酶處理內降解。在畢赤酵母屬中表現(SEQ ID NO：3(由SEQ ID NO：2編碼)及SEQ ID NO：6(由SEQ ID NO：5編碼))及在假單胞菌屬中表現(SEQ ID NO：3(由SEQ ID NO：1編碼)及SEQ ID NO：6(由SEQ ID NO：4編碼))之其他植酸酶分子在60分鐘後顯示最少降解。
基於先前報告，大腸桿菌wt appA植酸酶展示2.4分鐘之SGF半衰期(Garrett等人，2004)。植酸酶SEQ ID NO：8(由SEQ ID NO：7編碼)實際上在10分鐘後不具活性，且其他植酸酶(SEQ ID NO：3(由SEQ ID NO：2編碼)、SEQ ID NO：6(由SEQ ID NO：5編碼)、SEQ ID NO：3(由SEQ ID NO：1編碼)及SEQ ID NO：6(由SEQ ID NO：4編碼))在60分鐘後維持完整蛋白質(圖5)及活性(圖6)。
實例5：植酸酶表現
畢赤酵母屬表現系統利用經RCT許可之嗜甲醇畢赤酵母GS115菌株及甲醇誘導型啟動子(AOX)。使植酸酶分泌至發酵培養液中。在30L發酵罐中測試在畢赤酵母屬中表現之植酸酶SEQ ID NO：3(由SEQ ID NO：2編碼)且在120hr後達成7.0g/L。植酸酶SEQ ID NO：6(由SEQ ID NO：5編碼)之發酵結果小於7.0g/L。
來自DOW之假單胞菌屬表現系統利用含有插入pDOW1169(可由IPTG誘導)中之植酸酶序列之菌株(DC454)。植酸酶在細胞內表現，且因此需要細胞溶解以供植酸酶回收(參見圖7)。以一式三份在假單胞 菌屬中表現之細胞內植酸酶(SEQ ID NO：3(由SEQ ID NO：1編碼)及SEQ ID NO：6(由SEQ ID NO：4編碼))之結果介於約5g/L至約35.0g/L範圍內。
實例6：植酸酶胃穩定性
在模擬胃液(SGF)條件下根據美國藥典.2000.Simulated gastric fluid,TS.國家處方集第24/19,2235號.National Publishing,Philadelphia,Pa.使用10U胃蛋白酶/mg蛋白質(pH 1.5)及經修飾AOAC(動力學)活性分析使用4mM植酸(pH 5.5)來測試植酸酶。圖8及此實例下列示之表中之結果顯示本發明植酸酶在模擬胃液條件下保留至少約96%的植酸酶活性達5分鐘以上。此外，結果顯示本發明植酸酶保留至少約96%的植酸酶活性達至少30分鐘。另一方面，大腸桿菌植酸酶(ECP)、經修飾大腸桿菌植酸酶(ModECP)及真菌植酸酶(FP)在SGF條件下在30分鐘後具有4%、26%及0%的活性。
實例7：低植酸鹽濃度下之植酸酶活性
在0.0mM至5.1mM(工業標準)之多種植酸濃度下測試大腸桿菌植酸酶(ECP)、經修飾大腸桿菌植酸酶(ModECP)、真菌植酸酶(FP)及本發明植酸酶(SEQ ID NO.：3)之活性，且結果顯示於圖9中。活性係 使用經修飾AOAC(動力學)分析、0.2-5.1mM植酸(pH 5.5)來量測。可溶性植酸鹽濃度端視多種因素而定，例如飼料中植酸鹽之濃度、飼料水合作用、食糜之pH、植酸鈣鎂-礦物質複合物。本發明之植酸酶在多種植酸濃度下之活性強於ECP、ModECP及FP。
實例8：植酸酶熔融溫度
使用差示掃描量熱(DSC)來量測若干植酸酶之熔融溫度，此允許蛋白質熔融溫度Tm之可控評估(圖10)。已使½蛋白質去摺疊之點係蛋白質之熔融溫度。結果顯示當與大腸桿菌植酸酶(ECP)、經修飾大腸桿菌植酸酶ModECP及真菌植酸酶(FP)相比時，本發明之植酸酶(SEQ ID NO.：3)具有優異的固有熱穩定性。
實例9：植酸酶活化
使用植酸酶活性分析、經修飾AOAC(動力學)分析使用4mM植酸(pH 5.5)測試植酸酶以測定其達到大於90%活性所花費之時間量。圖11中所顯示之結果顯示本發明之植酸酶(SEQ ID NO.：3)在2.5分鐘後具有超過90%的活性。另一方面，真菌植酸酶直至17.5分鐘才具有大於90%的活性。
實例10：植酸酶使抗營養植酸酶(IP6及IP5)水解
植酸酶活性較為複雜且產生可藉由HPLC量化之不同水解產物。分析工具之組合(例如ICP與HPLC)可提供對植酸酶反應在實際應用中之較佳理解。
ICP：感應耦合電漿
HPLC：高效液相層析
自43天時之肉雞收集食糜樣品
自農作物、砂囊、空腸及腸骨收集樣品
將樣品冷凍在-20℃下且然後凍乾以妥善保存材料
圖12之結果顯示，當與真菌植酸酶(FP)、大腸桿菌植酸酶(ECP) 及經修飾大腸桿菌植酸酶(ModECP)相比時，在250U/Kg、500U/Kg及2000U/Kg之劑量下本發明植酸酶(SEQ ID NO.：3)更有效地水解抗營養植酸鹽(IP6及IP5)。此外，圖13之結果顯示本發明之植酸酶比大腸桿菌植酸酶(ECP)、經修飾大腸桿菌植酸酶(ModECP)或真菌植酸酶(FP)更有效地水解食糜中之植酸鹽(IP2、IP3、IP4、IP5及IP6)及相關肌醇磷酸酯。
實例11：動物研究
運行動物研究來測定本發明之植酸酶(SEQ ID NO.：3)在不同劑量下之功效以研發出替代營養素值且與其他植酸酶進行比較。
‧膳食：
-玉米大豆粕膳食
-缺乏磷與次最佳無機磷
-遵循Agristats之營養素說明書之商業膳食。
-顆粒溫度85℃
‧酶劑量：
-250、500及2000FTU/kg。
-在相同濃度下比較之植酸酶
‧量度：
-性能、脛骨灰分及迴腸營養素消化率
‧磷滴定：
‧使用非植酸鹽磷研發磷劑量反應
‧最佳擬合標準曲線(即線性、二次)
‧反應變量(增加、飼料轉換率、脛骨灰分)
‧研發酶之P當量值
研究1：使用植酸酶(SEQ ID NO.：3)及其他植酸酶之劑量反應之地面圈磷滴定研究
備註1：針對Ca及npp(非植酸鹽磷)二者調節+ve及-ve對照膳食二者以滿足鳥之需要，此端視階段而定(開始期/生長期/結束期)。
備註2：用於T3之Agristat 2012值：開始期-0.45% npp，0.93% Ca；生長期-0.41% npp，0.84% Ca；結束期0.38% npp，0.77% Ca。
20隻鳥/圈及8個圈/處理；基於玉米-SBM之膳食，處理溫度為85℃磷(P)當量值(相對值)之結果
‧酶之磷當量值隨年齡增加
‧磷當量值隨性能變量而變化：
-飼料轉換率具有較高P值作為線性反應之反映
-增加具有較低P值作為其二次反應之反映
‧當與其他植酸酶相比時，本發明植酸酶(SEQ ID NO.：3)具有較高P當量值。
研究3：較大劑量反應籠飼試驗之滴定
備註1：針對Ca及npp(非植酸鹽磷)二者調節+ve及-ve對照膳食二者以滿足鳥之需要，此端視階段而定(開始期/生長期)。
備註2：用於T3之Agristat 2012值：開始期-0.45% npp，0.93% Ca；生長期-0.41% npp，0.84% Ca。
在85℃下造粒/粉粹。
12個圈/處理及8隻小雞/圈；量測性能及脛骨灰分。
圖14中之結果顯示當與其他植酸酶相比時，植酸酶SEQ ID NO.：3之基於飼料轉換比率之P當量值較佳。此外，圖15顯示當與業內已知之植酸酶相比時，植酸酶SEQ ID NO.：3之基於脛骨灰分之P當量值顯著較高。同樣，圖16顯示，植酸酶SEQ ID NO.：3以250U/kg、500U/kg及2000U/kg投藥時之基於重量增加之P當量值顯著高於業內已知 之植酸酶以500U/kg投藥時獲得之值。
動物試驗概述：
‧利用植酸酶SEQ ID NO.：3獲得之磷當量值隨年齡及研究而變化。當以500FTU/kg投藥時，植酸酶SEQ ID NO.：3產生：
-增加：介於0.11%至0.16% P當量範圍內
-FCR：介於0.18%至0.20% P當量範圍內
-骨灰：介於0.12%至0.13% P當量範圍內
‧當使用500FTU/kg時，SEQ ID NO.：3在該等實驗內具有最佳增加及脛骨灰分結果。
-當量磷相對值對
‧真菌植酸酶 +36%
‧大腸桿菌植酸酶 +38%
‧增強的大腸桿菌植酸酶 +78%
劑量反應研究指示磷在2,000FTU/kg下在玉米大豆膳食中高達0.23%之釋放，此表明植酸鹽磷幾乎完全水解。
關於增加或FCR之磷當量值高於脛骨灰分礦化，此指示本發明植酸酶(例如SEQ ID NO.：3)在超出磷釋放外之作用。
<110> 美商凡瑞寧恩公司
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<130> VEREN.070WO/D2500-2WO
<140> Filed herewith
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<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1239
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生之多核苷酸
<400> 1
<210> 2
<211> 1230
<212> NDA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生之多核苷酸
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生之多肽
<400> 3
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成產生之多肽
<400> 8

Claims (13)

  1. 一種植酸酶，其與真菌、大腸桿菌(E.coli)或經修飾大腸桿菌之植酸酶相比具有增加的磷當量。
  2. 如請求項1之植酸酶，其中該植酸酶具有介於0.11%至0.23%範圍內之磷當量。
  3. 一種植酸酶，其與真菌、大腸桿菌或經修飾大腸桿菌之植酸酶相比具有增加的磷生物可用度。
  4. 如請求項3之植酸酶，其中當與真菌或大腸桿菌之植酸酶相比時，該植酸酶具有高至少60%至65%之磷生物可用度。
  5. 如請求項3之植酸酶，其中當與經修飾大腸桿菌之植酸酶相比時，該植酸酶具有高至少20%至30%之磷生物可用度。
  6. 一種植酸酶，其與真菌、大腸桿菌或經修飾大腸桿菌之植酸酶相比能夠增加磷水解。
  7. 如請求項6之植酸酶，其中該植酸酶水解包括植酸之飼料中高達90%的磷。
  8. 一種植酸酶，其能夠水解包括植酸之飼料中高達90%的磷。
  9. 一種植酸酶，其在低pH具有至少100%的活性5分鐘以上。
  10. 一種植酸酶，其在0.2mM至5.1mM植酸之植酸濃度具有改良之活性。
  11. 一種植酸酶，其具有大於約90℃之熔融溫度。
  12. 一種植酸酶，其在2.5分鐘具有至少90%的活性。
  13. 一種植酸酶，其水解介於約91%至約98%範圍內之抗營養植酸酶IP2、IP3、IP4、IP5及IP6。
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