CN105408492A

CN105408492A - 肌醇六磷酸酶

Info

Publication number: CN105408492A
Application number: CN201480041673.XA
Authority: CN
Inventors: A·I·索尔巴克
Original assignee: BASF Enzymes LLC
Current assignee: BASF Enzymes LLC
Priority date: 2013-07-25
Filing date: 2014-03-10
Publication date: 2016-03-16
Also published as: EP3027762A1; BR112015032838A2; US20190100734A1; JP2016525354A; US10093909B2; CA2919437A1; JP2019037233A; EP3027762A4; US20160194618A1; WO2015012890A8; AR095173A1; WO2015012890A1; KR20160033711A; TW201504259A

Abstract

提供具有肌醇六磷酸酶活性的多肽和编码该肌醇六磷酸酶的多核苷酸序列。基因表达至少7g/l至40g/L的水平下的肌醇六磷酸酶。肌醇六磷酸酶具有较高的比活性、在低pH下保留活性、在高温下保留活性、增加的磷当量、增加的磷生物利用度和增加的磷水解。肌醇六磷酸酶可用于各种产业，包括食品、饲料、乙醇生产、药物和清洁。

Description

肌醇六磷酸酶

序列表

本申请正在经由USPTOEFS-WEB服务器电子提交，如在MPEP§502.05中所批准并阐明的，并且此电子提交包括电子提交的序列表；该序列表的全部内容在此通过引用并入本申请的说明书。序列表以如下电子提交的ASCII(.txt)文本文件确定：

文件名	创建日期	大小
			SEQUENCE_LISTING_VEREN070WO_D2500_2WO.TXT	2014年3月5日	19.5KB

技术领域

提供了具有肌醇六磷酸酶活性的多肽和编码肌醇六磷酸酶的多核苷酸序列。具体而言，该序列提供具有肌醇六磷酸酶的高比活性、高热稳定性、高耐热性和多种工业用途的肌醇六磷酸酶的增加水平的表达。

附图说明

图1：使用纯化蛋白对肌醇六磷酸(pH5.5)测定比活性(U/mg)。毕赤酵母属表达的肌醇六磷酸酶：SEQIDNO:8(由SEQIDNO:7编码)、SEQIDNO:3(由SEQIDNO:2编码)和SEQIDNO:6(由SEQIDNO:5编码)与假单胞菌属表达的肌醇六磷酸酶：SEQIDNO:3(由SEQIDNO:1编码)和SEQIDNO:6(由SEQIDNO:4编码)。

图2：肌醇六磷酸酶SEQIDNO:3(由SEQIDNO:1编码)在100mM柠檬酸盐pH5.5+10％山梨醇-10％NaCl中的DSC色谱图。

图3：肌醇六磷酸酶在具有和不具有10％山梨醇-10％NaCl的100mM柠檬酸盐pH5.5中的DSCT_m值(℃)。SEQIDNO:3(由SEQIDNO:1编码)和SEQIDNO:6(由SEQIDNO:4编码)是假单胞菌属表达的。SEQIDNO:3(由SEQIDNO:2编码)、SEQIDNO:6(由SEQIDNO:5编码)和SEQIDNO:8(由SEQIDNO:7编码)是毕赤酵母属表达的。

图4：对4mM肌醇六磷酸盐使用Britton-Robinson“通用”缓冲液的肌醇六磷酸酶的pH曲线。SEQIDNO:3(由SEQIDNO:1编码)和SEQIDNO:6(由SEQIDNO:4编码)是假单胞菌属表达的。SEQIDNO:3(由SEQIDNO:2编码)和SEQIDNO:6(由SEQIDNO:5编码)是毕赤酵母属表达的。

图5：SGF+胃蛋白酶处理的肌醇六磷酸酶的SDS-PAGE。SEQIDNO:3(由SEQIDNO:1编码)和SEQIDNO:6(由SEQIDNO:4编码)是假单胞菌属表达的。SEQIDNO:3(由SEQIDNO:2编码)、SEQIDNO:6(由SEQIDNO:5编码)和SEQIDNO:8(由SEQIDNO:7编码)是毕赤酵母属表达的。

图6：热稳定的肌醇六磷酸酶在SGF处理后的活性。观察到热稳定的肌醇六磷酸酶的活性极少损失或无损失。在添加肌醇六磷酸酶之前，使用pH11缓冲液预淬灭T0样品。

图7：肌醇六磷酸酶发酵(30L)的假单胞菌属(P.f.)表达水平。

图8：显示当与本领域中已知的大肠杆菌肌醇六磷酸酶、修饰的大肠杆菌肌醇六磷酸酶和真菌肌醇六磷酸酶比较时，本发明(SEQIDNO:3)的胃稳定性。

图9：显示当与本领域中已知的大肠杆菌肌醇六磷酸酶、修饰的大肠杆菌肌醇六磷酸酶和真菌肌醇六磷酸酶比较时，SEQIDNO.:3的肌醇六磷酸酶在多种浓度的肌醇六磷酸下的肌醇六磷酸酶活性。

图10：当与本领域中已知的大肠杆菌肌醇六磷酸酶、修饰的大肠杆菌肌醇六磷酸酶和真菌肌醇六磷酸酶比较时，SEQIDNO.:3的肌醇六磷酸酶的DSC色谱法。

图11：显示随时间释放的肌醇六磷酸酶活性。

图12：显示抗营养的肌醇六磷酸酶(IP6和IP5)的水解。

图13：通过HPLC显示43天肉鸡(broiler)的消化内含物(digestacontent)的肌醇磷酸酯分析。

图14：显示相对于本领域中已知的肌醇六磷酸酶，SEQIDNO.:3的肌醇六磷酸酶的基于饲料转化率的P当量(Pequivalency)。

图15：显示相对于本领域中已知的肌醇六磷酸酶，SEQIDNO.:3的肌醇六磷酸酶的基于胫骨灰分(tibiaash)的P当量。

图16：显示相对于本领域中已知的肌醇六磷酸酶，SEQIDNO.:3的肌醇六磷酸酶的基于体重增加的P当量。

描述

肌醇六磷酸酶是催化肌醇六磷酸(肌-肌醇-六磷酸盐(myo-inositol-hexakisphosphate))水解为磷和肌醇的磷酸单酯水解酶。根据国际生物化学与分子生物学联盟(IUBMB)命名委员会和BairochA.,“TheENZYMEdatabasein2000,”，NucleicAcidsRes28:304-305(2000)的推荐，肌醇六磷酸酶被归类为酶学委员会(EC)号EC3.1.3.8，并且也被称为：1-肌醇六磷酸酶；肌-肌醇-六磷酸盐3-磷酸水解酶；肌醇六磷酸盐1-磷酸酶；肌醇六磷酸盐3-磷酸酶；或肌醇六磷酸盐6-磷酸酶。肌醇六磷酸酶也被归类为EC3.1.3.26，其也可被称为：4-肌醇六磷酸酶；6-肌醇六磷酸酶(基于1L-编号系统而非1D-编号命名)；或肌醇六磷酸盐6-磷酸酶。肌醇六磷酸酶还被归类为EC3.1.3.72，其也可被称为5-肌醇六磷酸酶。肌醇六磷酸酶也被称为组氨酸磷酸酶(HAP)；β螺旋桨肌醇六磷酸酶(β-propellerphytase)；紫色酸性磷酸酶(PAP)；和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)。肌醇六磷酸酶的替代名称对本领域技术人员将是已知的。

肌醇六磷酸酶是可具有作为动物饲料颗粒(feedpellet)中的补充物的作用的酶的实例。肌醇六磷酸酶将肌醇六磷酸降解为肌-肌醇核心(myo-inositolcore)和一个或多个游离的磷酸盐分子。肌醇六磷酸由共价地附连六个磷酸基团的肌-肌醇核心组成。肌醇六磷酸是用于生成动物饲料颗粒的植物材料——比如大豆种子——的成分，所述动物比如非反刍动物，例如家禽、肉鸡、鸟、雏鸡、下蛋鸡(layer)、火鸡、鸭、鹅和家禽(fowl)；反刍动物，例如奶牛、家牛(cattle)、马和绵羊；家猪(pig)、猪(swine)、小猪(piglet)、生长猪(growingpig)和母猪(sow)；伴侣动物包括但不限于：猫、狗、啮齿类动物和兔；鱼类，包括但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；和甲壳类动物，包括但不限于河虾(shrimp)和对虾。因为这些动物不能够消化肌醇六磷酸，因此肌醇六磷酸具有许多有害作用。它螯合二价阳离子比如钙和镁，并且它的磷酸盐是饲养的动物生物上不可利用的形式，导致需要使用这些养分补充动物饮食，尽管它们在原料中是丰富的。此外，因为这些养分未消化地通过动物，所以它们可被进一步在食物链下游的能够降解肌醇六磷酸的分解物利用，导致例如与动物排出物接触的地表水中的藻华。

非反刍动物比如雏鸡、家猪和鱼不能从食物获得快速生长所必需的足够的磷，这是因为它们不天然地产生对从在食物中发现的肌醇六磷酸释放磷必需的肌醇六磷酸酶。因为大部分磷以肌醇六磷酸(肌醇六磷酸盐)的磷酸基团的形式存在，因此自基于植物的食物和种子仅少量的磷被利用。因此，为了增加其生长，存在向动物提供磷的需要。

一种方案是向动物饲料添加无机磷补充物；然而，使用无机磷补充物导致由动物排泄并进入环境的磷酸盐的量增加，其导致水源的污染。

另一种方案是向动物提供肌醇六磷酸酶补充物或向动物饲料添加肌醇六磷酸酶。商业上可获得的肌醇六磷酸酶产品的实例包括但不限于：PHYZYME(Dupont,Danisco,Genencor)；QUANTUM和FINASE(ABVista,ABEnzymes)；NATUPHOS(BASF)；RONOZYME(DSM)；Biofeedphytase(NovoNordisk)；Allzymephytase(Alltech)；OPTIPHOS(Enzyvia,Phytex,Cornell)；Rovabio(Adisseo)；PHYTOUT(USWaters)。这些肌醇六磷酸酶产品中的每个至少在生产水平、生产时间、高温下的稳定性、低pH下的稳定性、比活性、和剂量要求上具有限制。因此，存在将使得用户能够减小剂量水平并减少为动物饲料生产和提供肌醇六磷酸酶的成本的肌醇六磷酸酶的需要，例如，可在更少时间内以较高产量产生的肌醇六磷酸酶、在高温下保留更多活性的肌醇六磷酸酶、在低pH下保留更多活性的肌醇六磷酸酶、或具有较高比活性的肌醇六磷酸酶。

肌醇六磷酸酶是由核酸序列编码的蛋白质。将核酸序列或DNA克隆入能够表达或产生肌醇六磷酸酶的宿主生物。存在可用于产生蛋白质的本领域中已知的各种蛋白表达系统。蛋白表达系统的实例包括生物比如：细菌、酵母、霉菌、哺乳动物、植物或昆虫。多种因素影响表达系统的选择，比如正被表达的蛋白质的类型和产生的蛋白质产物的量。Demain,(2009)"ProductionofRecombinantProteinbyMicrobesandhigherOrganisms,"BiotechnologyAdvances，27卷，297-306页公开了多种蛋白表达系统的各种优点和缺点。

肌醇六磷酸酶商业上从各种宿主生物细胞外产生，其包括但不限于：黑曲霉、米曲霉、绳状青霉菌、肌醇六磷酸酶油菜(Phytasecanola)(欧洲油菜(Brassicanapus))、毕赤酵母(Pichiapastoris)和栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，参见Pariza,"Determiningthesafetyofenzymesusedinanimalfeed,"RegulatoryToxicologyandPharmacology56(2010)332-342。

工业规模生产肌醇六磷酸酶需要在短时间量内以低成本产生高水平的酶的表达系统。因此，存在提供满足或超过工业规模制造肌醇六磷酸酶的生产要求的基因的需要。

本发明的实施方式提供编码在革兰氏阴性菌表达系统中以高水平产生的肌醇六磷酸酶的基因。另一个实施方式提供编码经由细胞内表达以高水平产生的肌醇六磷酸酶的基因。另一个实施方式在革兰氏阴性菌表达系统中经由细胞内表达产生肌醇六磷酸酶，其中宿主生物是假单胞菌属。另一个实施方式在荧光假单胞菌中产生肌醇六磷酸酶。表达系统可以是本领域中已知的任何荧光假单胞菌表达系统，例如，商业上可获得自DowGlobalTechnologiesInc.的荧光假单胞菌表达系统——菌株DC454(美国专利公开申请号20050130160和美国专利公开申请号20050186666)。将编码肌醇六磷酸酶或多肽的核酸序列插入pMYC载体(DowGlobalTechnologiesInc.，美国专利公开申请号20050130160)中或pDOW1169载体(DowGlobalTechnologiesInc.，美国专利公开申请号20080058262)中，并且然后通过电穿孔引入荧光假单胞菌宿主。本领域技术人员将知道可被用作本发明的实施方式的可选载体。

在另一个实施方式中，编码肌醇六磷酸酶的DNA可被引入质粒上或稳定地转化入例如任何数目的革兰氏阴性菌系统的基因组，所述系统比如大肠杆菌，假单胞菌属比如荧光假单胞菌(fluorescen)、恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌，罗尔斯通菌属(Ralstonia)某些种或茎菌属某些种。类似地，肌醇六磷酸酶可被引入任何数目的革兰氏阳性菌表达系统，比如芽孢杆菌属某些种比如枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或短芽孢杆菌，乳球菌属(Lactococcus)某些种比如乳酸乳球菌，乳酸杆菌属某些种，或链霉菌属某些种比如变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)。其它革兰氏阴性、革兰氏阳性或不相关的真细菌或古细菌表达系统可用于表达肌醇六磷酸酶。

在另一个实施方式中，编码肌醇六磷酸酶的DNA可被引入质粒以指导其表达。例如，包含编码肌醇六磷酸酶的DNA的质粒可包括，例如，家族pQE、pET和pASK的大肠杆菌表达载体；家族pCN51LT8、RSF1010、pWZ112T和pMYC的假单胞菌属表达载体；家族pBAX、pHT01和pHIS1525的芽孢杆菌属表达载体；家族pIJ6021和pIJ2460的链霉菌属表达载体；和家族pNZ9530和pNZ8148的乳球菌属表达载体。这些实例用于说明目的，而不代表其中可表达SEQIDNO:1的多核苷酸序列的载体的完整集合。

在另一个实施方式中，编码肌醇六磷酸酶的分离、重组或合成核酸序列以下列水平经由细胞内表达产生：至少7.0g/L、8.0g/L、9.0g/L、10.0g/L、11.0g/L、12.0g/L、13.0g/L、14.0g/L、15.0g/L、16.0g/L、17.0g/L、18.0g/L、19.0g/L、20.0g/L、21.0g/L、22.0g/L、23.0g/L、24.0g/L、25.0、g/L、26.0g/L、27.0g/L、28.0g/L、29.0g/L、30.0g/L、31.0g/L、32.0g/L、33.0g/L、34.0g/L、35.0g/L、36.0g/L、37.0g/L、38.0g/L、39.0g/L或至少40.0g/L或超过40.0g/L。

在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶的发酵生产时间小于150小时、145小时、140小时、135小时、130小时、125小时、120小时、115小时、110小时、105小时、100小时、95小时、90小时、85小时、80小时、75小时、70小时、65小时、60小时、55小时、50小时、49小时、48小时、47小时、46小时、45小时、44小时、43小时、42小时、41小时、40小时、39小时、38小时、37小时、36小时、35小时、34小时、33小时、32小时、31小时、30小时、29小时、28小时、27小时、26小时、25小时、24小时、23小时、22小时、21小时、20小时或小于20小时。

在另一个实施方式中，以下列体积或下列以上的体积进行发酵：10L、100L、200L、500L、1000L、2000L、5000L、10,000L、25,000L、50,000L、55,000L、60,000L、65,000L、70,000L、75,000L、80,000L、85,000L、90,000L、95,000L、100,000L、110,000L、120,000L、130,000L、140,000L、150,000L、160,000L、170,000L、180,000L、190,000L、200,000g/L或超过200,000L。

在一个实施方式中，细胞内表达系统是革兰氏阴性菌。在另一个实施方式中，革兰氏阴性菌是假单胞菌属。在另一个实施方式中，假单胞菌属是荧光假单胞菌。

在一个实施方式中，以大约35.0g/L产生具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。在另一个实施方式中，以大于7.0g/L产生具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。在另一个实施方式中，将在小于144小时内表达肌醇六磷酸酶。在另一个实施方式中，将在小于84小时、74小时、64小时、54小时、44小时、34小时或24小时内产生肌醇六磷酸酶。

在一个实施方式中，编码通过细胞内表达产生的肌醇六磷酸酶的核酸衍生自大肠杆菌、芽孢杆菌属某种、哈夫尼菌属某种、Perniophoralycii、革兰氏阴性兼性厌氧菌属(Buttiauxella)某种、柠檬酸细菌属某种或黑曲霉(Aspergillusniger)，或是衍生自其的核酸的修饰版本。在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶是在PCT公开号WO1999/008539、WO2000/071728、WO2001/090333、WO2002/095003、WO2006/028684、WO2008/036916或WO2010/135588中公开的任何肌醇六磷酸酶。

在另一个实施方式中，核酸是分离的、合成的或重组的核酸。在另一个实施方式中，分离的、重组的或合成的核酸序列编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。在另一个实施方式中，核酸序列选自：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:7的核酸序列。

在一个实施方式中，编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的核酸是SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的变体，其中所述变体与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和/或SEQIDNO:7或其片段具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或完全(100％)同一性，其中变体编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。

在另一个实施方式中，分离的、合成的或重组的核酸序列编码选自：SEQIDNO:3、SEQIDNO:6和SEQIDNO:8的多肽。在另一个实施方式中，SEQIDNO:1的核酸或SEQIDNO:1的变体编码SEQIDNO:3的多肽。在另一个实施方式中，SEQIDNO:2的核酸或SEQIDNO:2的变体编码SEQIDNO:3的多肽。在另一个实施方式中，SEQIDNO:4的核酸或SEQIDNO:4的变体编码SEQIDNO:6的多肽。在另一个实施方式中，SEQIDNO:5的核酸或SEQIDNO:5的变体编码SEQIDNO:6的多肽。在另一个实施方式中，SEQIDNO:7的核酸或SEQIDNO:7的变体编码SEQIDNO:8的多肽。

在一个实施方式中，核酸序列与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7的全长序列或其变体互补。

在一个实施方式中，肌醇六磷酸酶是具有肌醇六磷酸酶活性的分离的、重组的或合成的多肽，其中多肽选自：SEQIDNO:3、SEQIDNO:6和SEQIDNO:8的氨基酸序列。

在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶是SEQIDNO:3、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的变体，其中该变体与SEQIDNO:3、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8或其酶促活性片段具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或完全(100％)同一性，其中变体具有肌醇六磷酸酶活性。在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶是由包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和/或SEQIDNO:7的核酸序列编码的氨基酸序列。

在一个实施方式中，肌醇六磷酸酶是缺少信号序列、前蛋白序列、启动子序列或其任意组合的氨基酸序列。

在一个实施方式中，肌醇六磷酸酶是进一步包括选自：信号序列、标签、表位、交配因子、调控序列、启动子序列、N-末端延伸、C-末端延伸和其任意组合的异源序列的氨基酸序列。

在一个实施方式中，肌醇六磷酸酶具有大约1000U/mg至大约1,600U/mg的范围中任何值的比活性。在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶具有1000U/mg、1100U/mg、1200U/mg、1300U/mg、1400U/mg、1500U/mg或1600U/mg的比活性。

在一个实施方式中，肌醇六磷酸酶在大约pH1.0至大约pH9.0范围的任何pH下有活性。在一个实施方式中，肌醇六磷酸酶在1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或更碱性条件的pH下有活性。

在一个实施方式中，肌醇六磷酸酶在大约50摄氏度至大约100摄氏度的范围中的任何温度下有活性。在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶在大于37℃至大约95℃、或大约55℃至大约85℃之间、或大约70℃至大约75℃之间、或大约70℃至大约95℃之间、或大约90℃至大约95℃之间、或大约95℃至大约105℃之间、或大约95℃至大约110℃之间的范围的温度下有活性。

在一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶包含在组合物中。在另一个实施方式中，组合物是制剂。在另一个实施方式中，组合物是食物、饲料、补充物、动物饲料添加剂、或包括肌醇六磷酸酶的饮食助剂(dietaryaid)。在另一个实施方式中，组合物是包括肌醇六磷酸酶的药物。

如本文使用的“克隆”是用于产生DNA片段、细胞或生物的拷贝的方法，其中DNA被引入产生重组DNA的拷贝的宿主生物。

如本文使用的“克隆载体”是运载体，比如细菌质粒或噬菌体，其用于将遗传序列——比如脱氧核糖核酸(DNA)片段或完整基因——插入宿主细胞，以使外源遗传物质能够被复制。

如本文使用的“混合物(cocktail)”是包括本发明的肌醇六磷酸酶与一种或多种额外的酶组合的组合物。一种或多种额外的酶可以是任何酶，例如，乳糖酶、脂肪酶、蛋白酶、过氧化氢酶、木聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、酰胺酶、环氧化物水解酶、酯酶、磷脂酶、转氨酶、胺氧化酶、纤维二糖水解酶、解氨酶(ammonialyase)或其任意组合。

“密码子”是规定待添加至蛋白质的氨基酸的身份的三聚核苷酸序列。

如本文使用的“互补DNA或cDNA”是在由逆转录酶和DNA聚合酶催化的反应中从信使RNA(mRNA)模板合成的DNA。

如本文使用的“培养”包括使用根据需要改良的常规营养培养基，用于在包含编码肌醇六磷酸酶的多核苷酸的宿主细胞中活化启动子、选择转化体或扩增基因。培养条件——比如温度、pH等——是与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对本领域技术人员将是显而易见的。

如本文使用的“宿主细胞”是包括编码肌醇六磷酸酶的核酸序列，或包括本发明的表达盒、载体、克隆媒介、表达载体或克隆载体的转化细胞。宿主细胞可以是本领域技术人员熟知的任何宿主细胞，包括原核细胞或真核细胞，比如细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。适当的宿主的选择在本领域技术人员的能力内。

可以以常规方式使用宿主细胞以产生由重组序列编码的基因产物。取决于重组生产过程中采用的宿主，由宿主细胞产生的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可以或可以不包括初始甲硫氨酸氨基酸残基。

如本文使用的“同一性”是序列同一性(同源性)的程度，其可使用本领域中已知的任何计算机程序和相关的参数比如BLAST2.2.2.或FASTA3.0t78版以及缺省参数来测定。

可以使用任何本领域中已知的多种序列比较算法和程序评估蛋白质和/或核酸序列同一性(同源性)。这样的算法和程序可以包括但不限于BLAST程序(美国国立生物技术信息中心的基本局部比对检索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool)，比如BLAST、BLAST2、BLASTN和BLASTX)、TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA和CLUSTALW(Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(8):2444-2448,1988；Altschul等，J.Mol.Biol.215(3):403-410,1990；Thompson等，NucleicAcidsRes.22(2):4673-4680,1994；Higgins等，MethodsEnzymol.266:383-402,1996；Altschul等，J.Mol.Biol.215(3):403-410,1990；Altschul等，NatureGenetics3:266-272,1993。BLAST、BLAST2.0和BLAST2.2.2算法也用于实践本发明。例如，它们描述在Altschul(1977)Nuc.AcidsRes.25:3389-3402；Altschul(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于执行BLAST分析的软件是通过美国国立生物技术信息中心可公开获得的。

术语“同源性”和“同一性”在两个或更多个核酸或多肽序列的背景中是指，如使用任何数目的序列比较算法或通过人工比对和目视检查测量的，在比较窗口或指定区域上针对最大对应比较和比对时，相同的或具有规定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或子序列。对于序列比较，一个序列可以充当参考序列(本发明的示例性序列)，其与测试序列相比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用缺省程序参数，或可以指定可选的参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

如本文使用的“核酸”是指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或者任何这些的核酸片段。核酸可以是基因组或合成源的基因组DNA、cDNA、合成DNA或RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA)，其可以是单链或双链的，并且可以表示有义链或反义链；可以是肽核酸(PNA)、或天然或合成源的任何DNA样或RNA样材料，例如，包括iRNA、核糖核蛋白(例如，iRNP)。该术语包括包含天然核苷酸的已知类似物的核酸，即，寡核苷酸。该术语还包括具有合成骨架的核酸样结构，参见例如，Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144:189-197；Strauss-Soukup(1997)Biochemistry36:8692-8698；Samstag(1996)AntisenseNucleicAcidDrugDev6:153-156。

用于实践本发明的核酸——不论RNA、iRNA、反义核酸、cDNA、基因组DNA、载体、病毒或其杂合体——可从多种来源分离、遗传工程改造、扩增和/或重组地表达/生成。由这些核酸生成的重组多肽可被单独地分离或克隆，并且测试期望的活性。在一个实施方式中，核酸可以在重组表达系统中，其包括细菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物细胞表达系统。

用于核酸操作的技术，比如，例如，亚克隆、标记探针(例如，使用Klenow聚合酶的随机引物标记、缺口平移、扩增)、测序、杂交等在科学和专利文献中充分地描述，参见，例如，Sambrook编辑的MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL(第二版)，1-3卷，ColdSpringHarborLaboratory,(1989)；Ausubel编辑的CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork(1997)；Tijssen编辑的LABORATORYTECHNIQUESINBIOCHEMISTRYANDMOLECULARBIOLOGY:HYBRIDIZATIONWITHNUCLEICACIDPROBES,第I部分,TheoryandNucleicAcidPreparation,Elsevier,N.Y.(1993)。

本发明提供可操作地连接至表达(例如，转录或翻译)控制序列(一种或多种)——例如启动子或增强子——以指导或调节RNA合成/表达的本发明的核酸(例如，DNA)序列。表达控制序列可以在表达载体中。

本发明提供包括本发明的核酸——例如编码本发明的肌醇六磷酸酶的序列——的表达系统，例如，表达盒、载体、克隆媒介等，用于表达和过表达本发明的多肽。

本发明的核酸序列的最优表达也指指导或随机诱变核酸以实现增加的编码蛋白表达。本发明的核酸的诱变可以直接地或间接地提供增加的表达蛋白产量。通过非限制性实例，可以利用本文描述的诱变技术实现核酸的5'非翻译区、3'非翻译区或编码区的突变，其突变可导致在RNA或蛋白水平下增加稳定性，从而导致增加的蛋白质产量。

在一些实施方式中，通过多种因素确定将在感兴趣的蛋白质中进行的突变，所述因素包括分析开放阅读框(ORF)或感兴趣的基因的预测的mRNA结构的5引发端(primeend)的二维和三维结构，以及宿主的优选密码子，以选择可以增强感兴趣的蛋白质的表达的突变。例如，在一些实施方式中，不唯一地基于宿主的优选密码子，即密码子最优化，也不基于密码子最优化程序选择突变。

“突变”是核苷酸序列或氨基酸与参考相比的变化。

“沉默突变”是不导致不同氨基酸的特化(specification)的密码子突变。

“核苷酸”是指构成DNA序列的四种碱基中的一种——腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)。

在一个方面，本发明的表达盒包括本发明的序列和能够影响结构基因(即，蛋白编码序列，比如本发明的肌醇六磷酸酶)在与这样的序列相容的宿主中的表达的核苷酸序列。表达盒至少包括与多肽编码序列，和任选地与其它序列例如转录终止信号，可操作地连接的启动子。还可以使用实现表达所必需或有帮助的额外因子，例如，增强子。

大量合适的载体是本领域技术人员已知的，并且是商业上可获得的。示例性载体包括：细菌：pQE载体(Qiagen)、pBluescript质粒、pNH载体、λ-ZAP载体(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)；真核：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)。然而，可以使用任何其它质粒或其它载体，只要它们在宿主中是可复制的且可存活的。当重组微生物或细胞培养物被描述为寄宿(hosting)“表达载体”时，这包括染色体外环状与线性DNA和已经并入宿主染色体(一个或多个)的DNA二者。当载体由宿主细胞维持时，载体可由细胞在有丝分裂期间稳定地复制。

表达载体可包括启动子、用于翻译起始的核糖体结合位点、和转录终止子。载体还可包括用于扩增表达的适当序列。

本发明提供用于扩增编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的核酸或其子序列的扩增引物序列对。本领域技术人员可以对这些序列的任何部分或全长设计扩增引物序列对。扩增方法在本领域中也是众所周知的，并且包括，例如，聚合酶链反应——PCR；转录扩增；自主序列复制；Qβ复制酶扩增；和其它RNA聚合酶介导的技术。

如本文使用的“多肽”包括是寡肽、肽、多肽或蛋白质序列，或者可选地是任何这些的片段、部分或亚单位的“氨基酸”或“氨基酸序列”，并且是天然发生的或合成的分子。

在一个方面，本发明的多肽和肽具有肌醇六磷酸酶活性。在可选的方面，它们还可用作例如标记探针、抗原、耐受原、模体、肌醇六磷酸酶活性位点。

本发明的多肽和肽可以是分离的、合成的或重组的。可在体外或体内重组地表达肽和蛋白质。可以使用本领域中已知的任何方法制造和分离本发明的肽和多肽。还可以使用本领域中众所周知的化学方法全部或部分地合成本发明的多肽和肽。例如，肌醇六磷酸酶多肽可以在标准的重组表达系统(如本文描述的)中产生、被化学地合成、或从它们在其中天然地表达的生物纯化。

在可选的方面，本发明的“重组”多肽或蛋白质包括(指)通过重组DNA技术产生的多肽或蛋白质；例如，从编码期望的多肽或蛋白质的外源DNA构建体转化的细胞产生的。

在可选的方面，本发明的肽和多肽是糖基化的。糖基化可在翻译后化学地添加或通过细胞生物合成机构添加，其中后者包括使用已知的糖基化模体，其可以是序列自有的，或作为肽被添加或添加在核酸编码序列中。糖基化可以是O-连接或N-连接或其组合。

在可选的方面，如上面限定的，本发明的肽和多肽部分地或完全地包括“模拟物(mimetic)”和“拟肽(peptidomimetic)”形式。在一个方面，术语“模拟物”和“拟肽”是指具有与本发明的多肽基本上相同的结构和/或功能特性的合成化学化合物。模拟物可以完全地由氨基酸的、合成的非天然类似物组成，或者是部分天然肽氨基酸和氨基酸的部分非天然类似物的嵌合分子。模拟物还可并入任何量的天然氨基酸保守置换，只要这样的置换也基本上不改变模拟物的结构和/或活性。就为保守变体的本发明的多肽而言，常规实验将确定模拟物是否在本发明的范围内，即其结构和/或功能基本上没有改变。因而，在一个方面，如果模拟物组合物具有肌醇六磷酸酶活性，则其在本发明的范围内。

在可选的方面，保守置换是由类似特性的另一种氨基酸置换多肽中的给定氨基酸的那些。在可选的方面，保守置换是下列替换：使用另一种脂族氨基酸替换脂族氨基酸比如Ala、Val、Leu和Ile；使用Thr替换Ser或反之亦然；使用另一种酸性残基替换酸性残基比如Asp和Glu；使用另一种带有酰胺基团的残基替换带有酰胺基团的残基，比如Asn和Gln；使用另一种碱性残基交换碱性残基比如Lys和Arg；和使用另一种芳族残基替换芳族残基比如Phe、Tyr。一种疏水性氨基酸——比如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸——置换另一种，或者一种极性氨基酸置换另一种，比如精氨酸置换赖氨酸、谷氨酸置换天冬氨酸、或谷氨酰胺置换天冬酰胺。在一个方面，例如，自本发明的肌醇六磷酸酶多肽可以缺失一个或多个氨基酸，以导致多肽结构的修饰而不显著地改变其生物活性，或者可选地故意显著地改变其生物活性。例如，可以移除和/或添加肌醇六磷酸酶生物活性所需要的或可选地不需要的氨基或羧基末端氨基酸。可以通过任何数目的方法检测本发明的修饰的多肽序列的肌醇六磷酸酶生物活性，所述方法包括使修饰的多肽序列与肌醇六磷酸酶底物接触，并且测定修饰的多肽在检测中是否减少特异性底物的量或是否增加功能性肌醇六磷酸酶多肽与底物的酶促反应的生物产物。

在一个方面，本发明的肽和多肽具有与本发明的氨基酸序列“基本上同一”的序列，即，差别一个或多个保守或非保守氨基酸置换、缺失或插入的序列，特别是当这样的置换发生在不是分子的活性位点的位点处时，并且条件是多肽大体上保留其功能性质。

在一个实施方式中，肌醇六磷酸酶选自：具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的多肽(由SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的多核苷酸编码)；具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的多肽(由SEQIDNO:4或SEQIDNO:5的多核苷酸编码)；和具有SEQIDNO:8的氨基酸序列的多肽(由SEQIDNO:7的多核苷酸编码)。

在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶是SEQIDNO:3、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的多肽变体，其中多肽变体具有与SEQIDNO:3、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的多肽或其酶促活性片段具有至少大约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或完全(100％)同一性的氨基酸序列，其中多肽变体具有肌醇六磷酸酶活性。

本发明提供不具有或具有修饰的信号序列(也称为信号肽(SP)或前导肽)或异源信号序列的肌醇六磷酸酶。本发明的多肽还可不具有或具有修饰的或异源的前原(prepro)结构域和/或催化结构域(CD)。并入本发明多肽中的修饰的或异源的SP、前原结构域和/或CD可以是融合蛋白的一部分，例如作为嵌合蛋白中的异源结构域，或通过化学连接剂添加。例如，本发明的酶可包括载体例如pPIC系列载体(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)中的异源SP和/或前原结构域。

额外地，本发明的多肽可进一步包括异源序列，其为来自其它肌醇六磷酸酶或来自非肌醇六磷酸酶来源中任一个的序列，或者完全合成的序列。因而，在一个方面，本发明的核酸包括用于内源的、修饰的或异源的信号序列(SP)、前原结构域和/或催化结构域(CD)的编码序列，和异源序列(即，不与本发明的信号序列(SP)、前原结构域和/或催化结构域(CD)天然地相关联的序列)。异源序列可以在3’末端、5’末端上和/或在SP、前原结构域和/或CD编码序列的两端上。

本发明的固定化酶和固体支撑体(support)是肌醇六磷酸酶或其片段，并且编码该酶和片段的核酸可被粘附至固体支撑体。这通常在工业过程中使用肌醇六磷酸酶方面是经济的和有效的。例如，在特定化学反应中使用的肌醇六磷酸酶(或其活性片段)的聚生体或混合物可被附加至固体支撑体并浸入工艺釜(processvat)。可以发生酶促反应。然后，可以从釜中取出固体支撑体连同粘附至其的酶供重复使用。在本发明的一个实施方式中，本发明的分离的核酸被粘附至固体支撑体。在本发明的另一个实施方式中，固体支撑体选自凝胶、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极和/或其任意组合。

存在将对本领域技术人员已知的用于将酶或其片段、或核酸固定至固体支撑体上的许多方法。这样的方法的一些实例包括，例如，静电液滴生成、电化学手段、经由吸附、经由共价结合、经由交联、经由化学反应或工艺、经由封装、经由包埋、经由藻酸钙、或经由聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)。类似方法描述在S.P.Colowick和N.O.Kaplan编辑的MethodsinEnzymology,ImmobilizedEnzymesandCells,PartC.1987.AcademicPress,136卷；和J.M.Walker编辑的Series:MethodsinBiotechnology,G.F.Bickerstaff编辑的ImmobilizationofEnzymesandCells.1997.HumanaPress中。

如本文使用的“变体”包括这些多肽的衍生物或类似物。具体而言，变体通过可以以任何组合存在的一个或多个置换、添加、缺失、融合和截短可以在氨基酸序列上与本发明的多肽和基本上与其具有同一性的序列不同。

生成本发明的核酸的变体例如编码肌醇六磷酸酶的那些的方法在本领域中是众所周知的。这些方法可以重复或以多种组合使用以生成与由模板核酸编码的肌醇六磷酸酶的活性和稳定性相比具有改变的或不同的活性或改变的或不同的稳定性的肌醇六磷酸酶。这些方法还可以重复或以多种组合使用，例如，以生成基因/信使表达、信使翻译或信使稳定性的变化。在另一个方面，例如，通过离体修饰同源基因，然后将其重新插入细胞而改变细胞的遗传组成。

本发明还提供通过诱变和其它方法改变本发明的肌醇六磷酸酶的特性的方法，所述方法包括例如由VereniumCorporation(先前的DiversaCorporation,SanDiego,CA)开发的专利方法，例如基因重组装(GeneReassembly)(参见，例如，美国专利号6,537,776)、基因位点饱和诱变(GeneSiteSaturationMutagenesis(GSSM))(参见，例如，美国专利号6,171,820和6,764,835)、在定向进化中的外切核酸酶介导的基因组装(Exonuclease-MediatedGeneAssemblyinDirectedEvolution)(参见，例如，美国专利号6,361,974和6,352,842)、在定向进化中的末端选择(EndSelectioninDirectedEvolution)(参见，例如，美国专利号6,358,709和6,238,884)、基于重组的合成重排(Recombination-BasedSynthesisShuffling)(参见，例如，美国专利号5,965,408和6,440,668，和澳大利亚专利号AU724521)、嗜热细菌酶的定向进化(DirectedEvolutionofThermophilicEnzymes)(参见，例如，美国专利号5,830,696和6,335,179)、和调整的多位点组合组装(TailoredMulti-sitecombinatorialassembly)(参见，例如，WO2009/018449)。

可以使用分子生物学中已知的多种技术，例如，随机PCR诱变，参见，例如，Rice(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5467-5471；或组合多盒(combinatorialmultiplecassette)诱变，参见，例如，Crameri(1995)Biotechniques18:194-196。可选地，核酸，例如，基因可在无规则的或“随机的”片段化后重装配，参见，例如，美国专利号6,291,242；6,287,862；6,287,861；5,955,358；5,830,721；5,824,514；5,811,238；5,605,793。在可选的方面，修饰、添加或缺失通过下列方法引入：易错PCR、重排(shuffling)、寡核苷酸定向诱变、组装PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒诱变、递归整体(recursiveensemble)诱变、指数整体(exponentialensemble)诱变、位点特异性诱变、基因重组装、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接重组装(syntheticligationreassembly)(SLR)、重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含尿嘧啶的模板诱变、缺口双链体(gappedduplex)诱变、点错配修复诱变、修复缺陷宿主菌株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制性选择诱变、限制性纯化诱变、人工基因合成、整体诱变、嵌合核酸多聚体产生和/或这些与其它方法的组合。

如本文使用的“转基因植物和种子”包括本发明的核酸、多肽、表达盒、克隆机构或载体，或者本发明的转染或转化的细胞。本发明还提供包括本发明的核酸和/或多肽的植物产品，例如，油、种子、叶、提取物等。转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。本发明还提供制造和使用这些转基因植物和种子的方法。可以根据本领域中已知的任何方法构建表达本发明的多肽的转基因植物或植物细胞。参见，例如，美国专利号6,309,872。

在一些实施方式中，为完成肌醇六磷酸酶的细胞外表达，本发明的表达构建体利用分泌信号序列。虽然信号序列是与植物宿主物种同源(自有)的，但是也可以使用异源信号序列，即起源自其它植物物种或微生物源的那些，这样的信号序列对本领域技术人员是已知的。可以在本发明的情况内使用的适当的信号序列公开在Blobel等，1979；VonHeijne,1986；Garcia等，1987；Sijmons等，1990；Ng等，1994；和Powers等，1996中。

如本文使用的“转基因非人动物”是本发明的核酸、多肽、表达盒或载体、或转染或转化的细胞。例如，转基因非人动物可以是包括本发明的核酸的山羊、兔、绵羊、家猪、奶牛、大鼠和小鼠。例如，这些动物可被用作研究肌醇六磷酸酶活性的体内模型，或被用作筛选体内肌醇六磷酸酶活性的调节剂的模型。待在转基因非人动物中表达的多肽的编码序列可被设计为是组成型的，或者在组织特异性、发育特异性或可诱导的转录调控因子的控制下。可以使用本领域中已知的任何方法设计和生成转基因非人动物。

在一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶被用作动物饲料的添加剂。添加肌醇六磷酸酶的一些益处包括但不限于：增加饲料中含有的总磷、减少经由排泄释放入环境的磷、和增加其它矿物质和氨基酸的消化率。在另一个实施方式中，当与本领域中已知的肌醇六磷酸酶比较时，本发明的肌醇六磷酸酶具有高的体内活性。在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶活性在低底物浓度(低Km)下是高的。在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶在不使用包被(coating)的情况下具有固有的热稳定性和造粒稳定性。在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶在肠中迅速活化并更快速地释放。在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶具有减小的IP6和IP5抗营养活性。

在另一个实施方式中，包括本发明的肌醇六磷酸酶的动物饲料或补充物可被给予至任何动物。肌醇六磷酸酶通常包括在家禽比如雏鸡、肉鸡或下蛋鸡；火鸡；鸭；猪比如家猪、小猪或母猪；牛比如家牛的动物饲料中；和鱼类比如鳟鱼、鲑鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲈鱼的水产养殖饲料中。

在另一个实施方式中，包括本发明的肌醇六磷酸酶的动物饲料可以以本领域技术人员已知的任何制剂提供至动物。动物饲料制剂的实例包括但不限于：递送基体、丸剂、片剂、凝胶、液体、喷雾、研磨颗粒或粉末。

在另一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶用于治疗易于遭受骨丢失比如骨质疏松、恶病质和可危害养分的适当摄取和利用的医学治疗——比如化学疗法——的个体。本发明的一个方面提供包括肌醇六磷酸酶的药物或饮食制剂。将本发明的肌醇六磷酸酶用于经受运动训练、高强度体育锻炼、医院饮食、缺乏微量元素养分的谷物与豆类饮食、学校午餐计划或任何其它营养计划的个体也是本领域中常见的。

在一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶用于生物燃料的工业生产和生物质转化中。例如，肌醇六磷酸酶用于发酵或醇生产过程中。在一个实施方式中，醇是乙醇，其可用于燃料用途或者是可饮用的乙醇。在一个实施方式中，发酵过程可利用淀粉和非淀粉植物材料，比如木质纤维素材料，比如纤维素、半纤维素和/或木质素。

在另一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶用于处理可溶干酒糟(distillersdriedsoluble)(DDS)；玉米干酒糟(distillersdriedgrains)(DDG)；可溶浓酸酒糟(condenseddistillerssoluble)(CDS)；玉米湿酒糟(distillerswetgrains)(DWG)；和含可溶物的玉米干酒糟(distillersdriedgrainswithsoluble)(DDGS)。这些醇发酵过程的副产物可被用作动物饲料的成分。在另一个实施方式中，肌醇六磷酸酶用于减少结垢并增加乙醇产量。

在另一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶用于将藻类、初榨植物油、废植物油、污物转变为燃料。

在另一个实施方式中，当与真菌、大肠杆菌、或修饰的大肠杆菌肌醇六磷酸酶比较时，本发明的肌醇六磷酸酶将具有增加的磷当量。

在另一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶具有0.11至0.23％的范围中的磷当量。

在另一个实施方式中，当与真菌、大肠杆菌、或修饰的大肠杆菌肌醇六磷酸酶比较时，肌醇六磷酸酶包括具有增加的磷生物利用度。

在另一个实施方式中，当与真菌或大肠杆菌肌醇六磷酸酶比较时，本发明的肌醇六磷酸酶具有高至少60至65％的磷生物利用度。

在另一个实施方式中，当与修饰的大肠杆菌肌醇六磷酸酶比较时，本发明的肌醇六磷酸酶具有高至少20至30％的磷生物利用度。

在另一个实施方式中，当与真菌、大肠杆菌肌、或修饰的大肠杆菌肌醇六磷酸酶比较时，本发明的肌醇六磷酸酶能够增加磷水解。

在另一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶水解高达90％的来自包括肌醇六磷酸的饲料的磷。

在另一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶能够水解高达90％的来自包括肌醇六磷酸的饲料的磷。

在另一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶在低pH下具有至少100％活性持续超过5分钟。在另一个实施方式中，pH是1.2至大约pH5.5。

在另一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶在0.2mM至5.1mM的肌醇六磷酸的肌醇六磷酸浓度下具有改进的活性。

在另一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶具有大于大约90摄氏度的解链温度。

在另一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶在2.5分钟时具有至少90％活性。

在另一个实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶水解大约91％至大约98％的范围的抗营养肌醇六磷酸酶IP2、IP3、IP4、IP5和IP6。

在一些实施方式中，本文公开的肌醇六磷酸酶包括在2013年3月12日提交的美国临时申请系列号61,777,139中公开的肌醇六磷酸酶，其公开内容在此通过引用以其全部并入。

实施例

实施例1：肌醇六磷酸酶比活性

测定(如下面描述的)在假单胞菌属中和毕赤酵母属中表达的肌醇六磷酸酶的比活性。肌醇六磷酸酶分子的比活性不被在两种分析的表达系统中的表达所影响(参见图1)。通过离心从发酵液移除毕赤酵母属细胞，并且使用DNA酶处理上清液，并且使用100mMTRIS，pH8.0交换缓冲液。使用微流化机(microfluidizer)溶解表达肌醇六磷酸酶的假单胞菌属细胞并进行离心。使用DNA酶处理上清液，并且使用100mMTris，pH8.0交换缓冲液。然后，将样品上样至离子交换柱(FPLC)上并收集馏分。测试洗脱的馏分的活性并在SDS-PAGE上电泳；合并纯化的馏分。

经由分光光度法(280nm下吸光度)测定蛋白质浓度。使用基于肽的软件计算器——VECTORNTI(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)测定比蛋白吸收系数(280nm)。基于肽序列的肌醇六磷酸酶分子的280nm系数被测定为OD₂₈₀1.0＝0.875mg/mL(SEQIDNO:6(由SEQIDNO:4编码)、SEQIDNO:6(由SEQIDNO:5编码)、SEQIDNO:3(由SEQIDNO:1编码)和SEQIDNO:3(由SEQIDNO:2编码))和0.897mg/mL(SEQIDNO:8，由SEQIDNO:7编码)。基于吸光度比值(260/280nm)，测定DNA低于可测量的值。

使用检测来自肌醇六磷酸的去磷酸化的游离磷酸的比色分析来测定肌醇六磷酸酶比活性。纯化的肌醇六磷酸酶的50μL等分试样被添加至预热(37℃)的950μL底物混合物(4mM肌醇六磷酸十二钠，100mM乙酸钠pH5.5)。每分钟取出50μL等分试样并在50μL显色/停止(color/stop)溶液(钼酸盐-钒酸盐)中猝灭。10分钟后，当黄颜色完全显影后，使用SpectraMaxPlus吸光度读取器测量OD415。通过下面图解的计算确定活性。

一个单位定义为由酶每分钟释放的磷酸盐的微摩尔数

实施例2：高温(DSCTm)下的肌醇六磷酸酶活性

为测定肌醇六磷酸酶的热稳定性，采用Perkin-ElmerPyris1示差扫描热量计(DSC)测定肌醇六磷酸酶变体的解链温度(Tm)。使用100mM柠檬酸盐作为缓冲液在pH5.5(类似于水性饲料提取物)下进行Tm分析。在具有或不具有10％山梨醇-10％NaCl的情况下进行DSC试验。DSC分析指示10％山梨醇-10％NaCl改进肌醇六磷酸酶的热稳定性。在液体形式中，可以达到大于98℃的Tm(图2)。仅在缓冲液中，假单胞菌属表达的肌醇六磷酸酶显示比毕赤酵母属表达的肌醇六磷酸酶低～1-2℃的Tm，然而，当添加10％山梨醇-10％NaCl时未观察到此温度降低(图3)。

实施例3：pH曲线

当在毕赤酵母属或假单胞菌属中表达时(图4)，肌醇六磷酸酶的pH最佳条件被确定为pH3.5-pH4.5。为了移除因转换缓冲液以覆盖pH1.0-pH5.5的测试范围而造成的混淆变量，使用Britton-Robinson缓冲液测定肌醇六磷酸酶在不同pH点下对肌醇六磷酸底物的活性。不同pH下的活性被归一化至4的pH最佳条件。

实施例4：低pH(模拟胃液(SGF))条件下的肌醇六磷酸酶活性和pH曲线

通过在pH1.2下的模拟胃液(SGF)中处理肌醇六磷酸酶分子持续60分钟的时间过程来评估胃稳定性。将胃蛋白酶以10个胃蛋白酶单位每μg肌醇六磷酸酶添加至SGF。在10、30和60分钟处，移出SGF-肌醇六磷酸酶混合物的等分试样并在200mM碳酸钠缓冲液pH11.0中猝灭。然后，通过SDS-PAGE分析样品以测定蛋白消化的程度。SDS-PAGE(图5)结果展示SEQIDNO:8(由SEQIDNO:7编码)分子的肌醇六磷酸酶条带在10分钟SGF+胃蛋白酶处理内降解。在毕赤酵母属(SEQIDNO:3(由SEQIDNO:2编码)和SEQIDNO:6(由SEQIDNO:5编码))与假单胞菌属(SEQIDNO:3(由SEQIDNO:1编码)和SEQIDNO:6(由SEQIDNO:4编码))中表达的其它肌醇六磷酸酶分子在60分钟后显示最小降解。

基于先前的报道，大肠杆菌野生型appA肌醇六磷酸酶展示2.4分钟的SGF半衰期(Garrett等，2004)。SEQIDNO:8(由SEQIDNO:7编码)的肌醇六磷酸酶在10分钟后实际上不具有活性，并且其它肌醇六磷酸酶(SEQIDNO:3(由SEQIDNO:2编码)、SEQIDNO:6(由SEQIDNO:5编码)、SEQIDNO:3(由SEQIDNO:1编码)和SEQIDNO:6(由SEQIDNO:4编码))在60分钟后维持完整的蛋白质(图5)和活性(图6)。

实施例5：肌醇六磷酸酶表达

毕赤酵母属表达系统利用经RCT许可的毕赤酵母GS115菌株和甲醇诱导型启动子(AOX)。肌醇六磷酸酶被分泌入发酵液。在30L发酵罐中测试在毕赤酵母属中表达的SEQIDNO:3(由SEQIDNO:2编码)的肌醇六磷酸酶，并且在在120小时后达到7.0g/L。肌醇六磷酸酶SEQIDNO:6(由SEQIDNO:5编码)的发酵结果小于7.0g/L。

来自DOW的假单胞菌属表达系统利用具有插入至pDOW1169(可由IPTG诱导)的肌醇六磷酸酶序列的菌株(DC454)。细胞内表达肌醇六磷酸酶，并且因此需要细胞溶解以回收肌醇六磷酸酶(参见图7)。在假单胞菌属中的细胞内肌醇六磷酸酶(SEQIDNO:3(由SEQIDNO:1编码)和SEQIDNO:6(由SEQIDNO:4编码))表达的一式三份的结果在大约5g/L至大约35.0g/L的范围。

实施例6：肌醇六磷酸酶胃稳定性

根据U.S.Pharmacopeia.2000.Simulatedgastricfluid,TS.NationalFormularyno.24/19,2235.NationalPublishing,Philadelphia,Pa.使用10U胃蛋白酶/mg蛋白质pH1.5和使用4mM肌醇六磷酸pH5.5的改进的AOAC(动力学)活性分析，在模拟胃液(SGF)条件下测试肌醇六磷酸酶。图8和此实施例下方所列的表中的结果显示本发明的肌醇六磷酸酶在模拟胃液条件下保留至少大约96％肌醇六磷酸酶活性持续超过5分钟。此外，结果显示本发明的肌醇六磷酸酶保留至少大约96％肌醇六磷酸酶活性持续至少30分钟。另一方面，大肠杆菌肌醇六磷酸酶(ECP)、修饰的大肠杆菌肌醇六磷酸酶(ModECP)和真菌肌醇六磷酸酶(FP)在SGF条件下在30分钟后具有4％、26％和0％活性。

实施例7：低肌醇六磷酸盐浓度中的肌醇六磷酸酶活性

在0.0mM至5.1mM(工业标准)的多种浓度的肌醇六磷酸下测试大肠杆菌肌醇六磷酸酶(ECP)、修饰的大肠杆菌肌醇六磷酸酶(ModECP)、真菌肌醇六磷酸酶(FP)、和本发明的肌醇六磷酸酶(SEQIDNO.:3)的活性，并且结果显示在图9中。使用改进的AOAC(动力学)分析、0.2-5.1mM肌醇六磷酸pH5.5测量活性。可溶性肌醇六磷酸盐浓度取决于多种因素，比如饲料中肌醇六磷酸盐的浓度、饲料水合作用、消化物的pH、肌醇六磷酸钙镁(phytin)-矿物质络合物。本发明的肌醇六磷酸酶在多种浓度的肌醇六磷酸下比ECP、ModECP和FP活性更强。

实施例8：肌醇六磷酸酶解链温度

使用示差扫描热量计(DSC)测量多种肌醇六磷酸酶的解链温度，所述示差扫描热量计(DSC)允许进行蛋白质的解链温度Tm的受控评估(图10)。其中1/2的蛋白质已经去折叠的点是蛋白质的解链温度。结果显示当与大肠杆菌肌醇六磷酸酶(ECP)；修饰的大肠杆菌肌醇六磷酸酶ModECP；和真菌肌醇六磷酸酶(FP)比较时，本发明的肌醇六磷酸酶(SEQIDNO.:3)具有优越的固有热稳定性。

实施例9：肌醇六磷酸酶活化

使用肌醇六磷酸酶活性分析、使用4mM肌醇六磷酸pH5.5的改进的AOAC(动力学)分析，测试肌醇六磷酸酶以测定其达到大于90％活性的所花费时间量。图11中显示的结果显示本发明的肌醇六磷酸酶(SEQIDNO.:3)在2.5分钟后具有大于90％活性。另一方面，真菌肌醇六磷酸酶直到17.5分钟才具有大于90％活性。

实施例10：肌醇六磷酸酶水解抗营养肌醇六磷酸酶(IP6和IP5)

肌醇六磷酸酶活性是复杂的，并且导致可通HPLC量化的不同的水解产物。分析工具比如ICP和HPLC的组合可以提供在实际应用中肌醇六磷酸酶反应的更好理解。

ICP：电感耦合等离子体

HPLC：高效液相色谱

消化物样品收集自43天的肉鸡

样品收集自农作物、砂囊、空肠和髂骨

-20℃下冷冻样品，并且然后冻干以恰当地保存材料

图12的结果显示当与真菌肌醇六磷酸酶(FP)、大肠杆菌肌醇六磷酸酶(ECP)、和修饰的大肠杆菌肌醇六磷酸酶(ModECP)比较时，在250U/Kg；500U/Kg；和2000U/Kg的剂量下，本发明的肌醇六磷酸酶(SEQIDNO.:3)更有效地水解抗营养肌醇六磷酸盐(IP6和IP5)。而且，图13的结果显示本发明的肌醇六磷酸酶比大肠杆菌肌醇六磷酸酶(ECP)；修饰的大肠杆菌肌醇六磷酸酶(ModECP)；或真菌肌醇六磷酸酶(FP)更有效地水解消化物中的肌醇六磷酸盐(IP2、IP3、IP4、IP5和IP6)和相关联的肌醇磷酸酯。

实施例11：动物研究

为了研发替代养分值，进行动物研究以测定不同剂量下的本发明的肌醇六磷酸酶(SEQIDNO.:3)功效，并与其他肌醇六磷酸酶比较。

·饮食：

–玉米大豆粉饮食

–缺乏磷和次最优的无机磷

–遵循Agristats的养分说明书的商业饮食。

–颗粒温度85C

·酶剂量：

–250、500和2000FTU/kg。

–相同浓度下比较的肌醇六磷酸酶

·测量：

–体能、胫骨灰分、和回肠养分消化率

·磷滴定：

·使用非肌醇六磷酸盐磷研发磷剂量应答

·拟合最佳标准曲线(即线性、二次)

·响应变量(增重(gain)、饲料转化率、胫骨灰分)

·研发酶的P当量值

研究1：使用肌醇六磷酸酶(SEQIDNO.:3)和其它肌醇六磷酸酶的剂量应答的地面圈(floorpen)磷滴定研究

注意1：取决于阶段(开始期/生长期/结束期(starter/grower/finisher))，针对Ca和npp(非肌醇六磷酸盐磷)二者调节+ve和-ve对照饮食二者以满足鸟的需要。

注意2：用于T3的Agristat2012值：开始期-0.45％npp、0.93％Ca；生长期-0.41％npp、0.84％Ca；结束期0.38％npp、0.77％Ca。

每个圈20只鸟和每次处理8个圈；基于玉米-SBM的饮食，调节温度是85C。

磷(P)当量值的结果(相对值)

·酶的磷当量值随年龄增加

·磷当量值随体能变量变化：

–饲料转化率作为线性应答的反应具有较高的P值

–增重作为其二次方程应答的反应具有较低的P值

·当与其它肌醇六磷酸酶比较时，本发明的肌醇六磷酸酶(SEQIDNO.:3)具有较高的P当量值。

研究3：较大剂量应答组(battery)试验的滴定

注意1：取决于阶段(开始期/生长期)，针对Ca和npp(非肌醇六磷酸盐磷)二者调节+ve和-ve对照饮食二者以满足鸟的需要。

注意2：用于T3的Agristat2012值：开始期-0.45％npp、0.93％Ca；生长期-0.41％npp、0.84％Ca。

在85C下造粒/粉碎。

每次处理12个圈和每个圈8只小鸡；测量体能和胫骨灰分。

图14中的结果显示当与其它肌醇六磷酸酶比较时，SEQIDNO.:3的肌醇六磷酸酶基于饲料转化率的P当量值更好。另外地，图15显示当与本领域中已知的肌醇六磷酸酶比较时，SEQIDNO.:3的肌醇六磷酸酶基于胫骨灰分的P当量值显著更大。同样地，图16显示当SEQIDNO.:3的肌醇六磷酸酶的剂量在250U/kg、500U/kg和2000U/kg时，其基于体重增加的P当量值显著大于当本领域中已知的肌醇六磷酸酶的剂量在500U/kg时获得的值。

动物试验总结：

·使用肌醇六磷酸酶SEQIDNO.:3获得的磷当量值随年龄和研究变化。当剂量在500FTU/kg时，肌醇六磷酸酶SEQIDNO.:3产生：

–增重：范围为0.11至0.16％的P当量

–FCR：范围为0.18至0.20％的P当量

–骨灰：范围为0.12至0.13％的P当量

·当使用500FTU/kg时，SEQIDNO.:3在这些实验内具有增重和胫骨灰分的最佳结果。

–当量磷相对值对

·真菌肌醇六磷酸酶+36％

·大肠杆菌肌醇六磷酸酶+38％

·增强的大肠杆菌肌醇六磷酸酶+78％

剂量应答研究指示在2,000FTU/kg下在玉米大豆饮食中磷高达0.23％的释放，这暗示肌醇六磷酸盐磷几乎完全水解。

增重或FCR的磷当量值比胫骨灰分矿化高，这指示本发明的肌醇六磷酸酶——例如SEQIDNO.:3——的作用超出了磷释放。

Claims

1.一种肌醇六磷酸酶，当与真菌、大肠杆菌或修饰的大肠杆菌肌醇六磷酸酶比较时，其具有增加的磷当量。

2.权利要求1所述的肌醇六磷酸酶，其中所述肌醇六磷酸酶具有0.11至0.23％的范围内的磷当量。

3.一种肌醇六磷酸酶，当与真菌、大肠杆菌或修饰的大肠杆菌肌醇六磷酸酶比较时，其具有增加的磷生物利用度。

4.权利要求3所述的肌醇六磷酸酶，其中当与真菌或大肠杆菌肌醇六磷酸酶比较时，所述肌醇六磷酸酶具有高至少60至65％的磷生物利用度。

5.权利要求3所述的肌醇六磷酸酶，其中当与修饰的大肠杆菌肌醇六磷酸酶比较时，所述肌醇六磷酸酶具有高至少20至30％的磷生物利用度。

6.一种肌醇六磷酸酶，当与真菌、大肠杆菌或修饰的大肠杆菌肌醇六磷酸酶比较时，其能够增加磷水解。

7.权利要求6所述的肌醇六磷酸酶，其中所述肌醇六磷酸酶水解高达90％的来自包括肌醇六磷酸的饲料的磷。

8.一种肌醇六磷酸酶，其能够水解高达90％的来自包括肌醇六磷酸的饲料的磷。

9.一种肌醇六磷酸酶，其在低pH下具有至少100％活性持续超过5分钟。

10.一种肌醇六磷酸酶，其在0.2mM至5.1mM的肌醇六磷酸的肌醇六磷酸浓度下具有改进的活性。

11.一种肌醇六磷酸酶，其具有大于大约90摄氏度的解链温度。

12.一种肌醇六磷酸酶，其在2.5分钟处具有至少90％活性。

13.一种肌醇六磷酸酶，其水解大约91％至大约98％的范围的抗营养肌醇六磷酸酶IP2、IP3、IP4、IP5和IP6。