CN1913785A - 稳定酶制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种稳定的固态或者液态酶制剂，其包含至少一种酶和至少一种选自阿拉伯胶、至少一种植物蛋白及其混合物的稳定剂。本发明也涉及用于制备这些制剂，特别是固态制剂(例如颗粒)的方法及其在动物和/或人类营养品中的用途。

Description

稳定酶制剂
技术领域
本发明涉及固态或者液态酶制剂，这些酶制剂具有通过加入稳定剂而获得的增加稳定性，优选是热稳定性。
本发明涉及将酶，尤其是饲料酶(feed-enzyme)配制成含有糖类(例如淀粉-)的颗粒和/或液态制剂，并且涉及制备此类含酶颗粒和液态制剂的方法。然后，这些(可食用的)颗粒和液态制剂可用于动物饲料和/或人类营养品中。该含酶颗粒和液态制剂显示出改进的贮存和加工稳定性。
发明背景
各种酶在人类营养品或者动物(例如家畜)饲料中的应用已经变成近乎普遍的行为。这些酶通常通过在工业酶生产者操作的大型发酵罐中培养微生物来生产。在发酵的最后，通常得到的“培养液”经过一系列过滤步骤来从目的酶(在溶液中)中分离出生物质(微生物)。然后，该酶溶液以液态出售或者被加工为干制剂。
在饲料和食品工业中，酶的液态和干制剂以工业规模使用。液态制剂在造粒(pelleting)后加入到饲料或食品中，以避免造粒工艺中将发生的一种或多种酶的热失活。然而，酶在最终饲料或食品制品中的量通常非常少，这使得酶在饲料或食品中的均匀分布很难实现，并且众所周知液体比干成分更难混合均匀。此外，在造粒后需要专门的(昂贵的)设备将液体加入饲料中，目前这在大多数饲料加工厂无法达到(因为额外的成本)。即使使用含有酶的液态制剂，这类制剂的贮存稳定性通常也是一个问题。
另一方面，一种或多种酶的干制剂具有在造粒过程中酶热失活的缺点。饲料和食品工业中优选的制造方法包括蒸汽造粒，其中饲料或食品在造粒之前经历蒸汽喷雾。在随后的造粒步骤中，饲料或者食品被推过模型或者模具，然后将所得到的窄条切割为不同长度的合适小丸(pellet)。在即将造粒之前，含湿量一般介于10％到20％之间。在该工艺期间，温度可能上升到60-95℃。高含湿量和高温的联合作用对大多数酶是不利的。这些缺点在其他类型的热机械处理中也会遇到，例如挤压和膨胀中。
多个酶制造商已经开发出可替代的配制方法，试图提高造粒和贮存期间干酶产品和液态酶产品的稳定性。
EP 0 758 018 A1公开了一种通过加入无机盐来改进干酶制剂的加工和贮存稳定性的方法。
GB 2 167 758公开了一种酶制粒法(enzyme granulating method)和一种含酶粒状组合物，其含有1wt％到35wt％的酶和0.5wt％到30wt％的合成纤维碎片或者纸浆。
EP 1 069 832 A1(WO 00/47060)描述了一种制备含酶颗粒的方法，其中混合含酶水性液体与固相载体及任选的添加剂成分；然后机械加工为颗粒，干燥并随后用聚乙二醇包衣。
EP 858 266(WO 97/16076)公开了一种适合在动物饲料组合物的生产中使用的微粒型含酶制品。
EP 862 623 A1(WO 97/12958)公开了一种微颗粒型酶组合物，其平均粒度在大约20到400微米之间。
所引用的参考文献中没有一份公开了用阿拉伯胶(gummi arabicum)或者植物蛋白稳定的含酶制剂。
DE 1 958 104描述了一种制备适用于清洁剂和洗衣组合物的含酶颗粒的方法，其中无机酸或者有机酸的碱金属盐被用作载体。
DE 2 137 043和DE 2 137 042公开了一种适用于清洁剂组合物的含酶组合物，其中载体包含无机盐。
EP 716 685公开了多酶颗粒及无机和/或有机载体材料，所述颗粒适合加入到含有酶的清洁剂和洗涤组合物中。
WO 00/36927公开了一种生产含有酶且适用于饲养动物的颗粒的方法。
WO 03/059087描述了一种制备含酶颗粒的方法，其中水性液体，任选补充的固相载体和/或添加剂成分加工为颗粒、干燥并随后用聚烯烃包衣。
WO 03/059086描述了一种含酶颗粒的制备的方法，其中水性液体，任选补充的固相载体和/或添加剂成分加工成颗粒、干燥并随后用含有疏水物质粒子(particle)的分散体包衣，优选是聚烯烃。
对于饲料应用，稳定的酶，优选是热稳定的酶通常具有普遍价值的，以便避免在配制(例如喷雾干燥、制粒)和饲料处理工艺(例如造粒、挤压、膨胀)过程中可能发生的问题，其中暂时性高温(高达80-120℃)，湿度和剪切应力可能影响蛋白质结构并且导致不期望的活性损失。
酶通常由于各种原因被加入到饲料和食品制品中。在食品应用中，例如在烘焙中或在酿酒厂里加入酶。酶在饲料应用中的作用常常是提高饲料的转化率，例如通过降低消化物粘度或者通过减少某些饲料化合物的抗营养作用。也可使用饲料酶以便例如减少粪尿中对环境有害的化合物的量。
在所有各种应用中，酶经常被暴露在热考验下，例如热量、湿度或温度暴露，这可能导致酶的部分或者完全失活。
尽管在饲料中存在大量植酸磷(phytate phosphorus)形式的磷酸盐，但单胃动物，像猪和家禽，缺乏使用这种形式的磷酸盐的能力。植酸(phyticacid)的碱或者碱土金属盐主要天然存在于谷类中。由于单胃动物不能使用该类型的磷酸盐，所以通常的作法是将无机磷酸盐加入到动物饲料中。
另一方面，已知在植物及一些微生物中存在一种称为植酸酶(phytase)(肌醇六磷酸盐磷酸水解酶)的酶。由于植酸酶可以通过发酵产生，在本领域已知使用植酸酶作为动物饲料添加剂，以便通过从植酸(肌醇六磷酸盐)释放无机磷酸盐来增加植物材料的营养价值。因为动物能够利用使用植酸酶从植酸盐(phytate)解放出来的磷酸盐，通过将植酸酶加入到动物饲料中可以降低环境的磷污染水平。
Gist-Brocades的国际专利申请WO 93/16175(EP 626 010)描述了植酸酶的稳定液态制剂。建议使用尿素和水溶性多元醇作为稳定剂，由此提及山梨糖醇、甘油和分子量为6000的聚乙二醇。
Hoffmann-La Roche的欧洲专利申请EP-A1 0 969 089描述了稳定酶制剂，其包括植酸酶和至少一种稳定剂，该稳定剂选自a)含有五个碳原子的多元醇，优选是C5糖，更优选是木糖醇或者核糖醇，b)分子量在600-4000Da之间的聚乙二醇，c)丙二酸、戊二酸和琥珀酸的二钠盐，d)羧甲基纤维素，和e)藻酸钠。该专利进一步描述了通过交联或者通过与戊二醛的化学反应；或者通过b)与高碘酸钠的氧化反应以及随后加入己二酸二酰肼稳定化的植酸酶制剂。
WO 98/54980描述了含有植酸酶的颗粒，WO 98/55599描述了含有它们的高活性植酸酶液体和饲料制剂。
除了本领域情况下的不同方法，仍然存在对适用于人和/或动物营养的稳定酶制剂的需求，并且该制剂在加工、造粒和贮存期间显示出增强的稳定性。该制剂应该是容易获得的，并且易于与日常食物和/或饲料成分相容。另外，这些制剂，特别是固态制剂应该是易于加工的，例如提供低粉尘特性，在期望的基质中易于分散或者混合。
本发明的一个目的是提供另一种稳定剂以及改进酶的稳定性，尤其是酶的热稳定性，因此，稳定性被定义为能在各种条件下保持活性的能力。该稳定性方面涉及酶的整个存在周期，其包括生产(发酵、下游处理和配制)、流通(运输和贮存)以及最终应用(饲料和/或食物的生产和存储)。对于商业上感兴趣的酶，例如植酸酶，重要的是经受各种饲料和/或食品处理过程，例如造粒、挤压和膨胀(高达80-120℃)中所达到的高温和高湿度，以及在加入饲料和/或食物之后的贮存期间是稳定的，尤其是长期贮存期间。本发明的另一个目的是提供另一种稳定剂，其能以比本领域中已知的那些稳定剂更小的量使用，而最终制剂中稳定剂的量限制了可加入含酶制剂中的其他成分。本发明的另一个目的是提供可特别用于酶混合物的稳定剂。如果从多于一种的培养液中制备酶制剂，那么就限制了可以加入到最终制剂中的稳定剂数量。特别受关注的是，如果在最终产物中期望高的酶浓度，由此限制了可加入到最终制剂中的稀释剂的量。在本发明的另一个方面，如果使用酶混合物，那么稳定剂应该也优选稳定不止一种酶，而是稳定混合物中的所有酶。
本发明使用的术语“稳定性”涉及工业酶的所有规格，其包括的方面如活性、专一性、保存期稳定性、机械稳定性、微生物稳定性、毒性、化学组成和物理参数如密度、粘度、吸湿性，也包括颜色、气味和尘埃。本发明的一个优选的方面涉及酶的稳定性，优选是对配制以及饲料和/或食物处理过程(如造粒、挤压和膨胀)中的热失活有抵抗的磷酸酶和/或糖苷酶。
酶，尤其是植酸酶、木聚糖酶和葡聚糖酶的广泛使用的一个主要障碍是热稳定性(80-120℃)的约束，这要求这些酶耐受饲料和/或食品处理加工期间的失活。当前可获得的用于饲料和/或食品应用的大多数工业酶对热失活的内在抗性不足。作为备选的或者除了分子生物学方法外，本发明通过加入不同添加剂增强了酶的稳定性，尤其是酶的热稳定性。
发明内容
本发明的第一个方面提供了一种稳定的固态或者液态酶制剂，其包括至少一种酶和至少一种选自阿拉伯胶、至少一种植物蛋白及其混合物的稳定剂。
术语“酶制剂”包括所有液态和固态制剂，其中一种或多种酶可以是商品化的。优选地，用于该制剂的酶的来源是从发酵培养液获得的较粗的液态制品。对于本发明的液态酶制剂的制备，所选择的稳定剂可以直接加入到发酵培养液中，或者发酵培养液可以通过例如过滤或者超滤纯化，然后在过滤步骤后加入稳定剂。
为了获得稳定的，优选热稳定的固态制剂，该一种或多种酶可以在所选择的稳定剂存在的情况下被喷雾干燥或者制粒。
固态制剂优选是一种包含低于15％(w/w)，优选低于10％(w/w)，特别优选低于8％(w/w)的水的制剂。
本发明的一个优选实施方案中，稳定酶制剂是固态的，优选是一个或多个颗粒的形式。
本发明的另一个方面，提供了一种制备一个或多个含酶颗粒的方法，该方法包括处理至少一种酶，一种包括至少15％(w/w)可食用糖类聚合物的固相载体和至少一种稳定剂，其中该稳定剂选自阿拉伯胶、至少一种植物蛋白及其混合物。本发明的另一个方面提供通过这种方法获得的一个或多个含酶颗粒。
本发明的另一个方面，提供了一个或多个颗粒，其包括至少一种酶、一种包括至少15％(w/w)可食用糖类聚合物的固相载体和至少一种稳定剂，其中该稳定剂选自阿拉伯胶、至少一种植物蛋白及其混合物。
本发明的另一个方面提供了一个或多个颗粒，其包括至少一种酶，一种包括至少15％(w/w)可食用糖类聚合物的固相载体和至少一种稳定剂，其中该稳定剂选自阿拉伯胶、至少一种植物蛋白及其混合物，其中该颗粒是包衣的。
本发明中使用的术语“颗粒(granules)”或者“一个或多个颗粒(granule(s))”均包括单个颗粒以及没有区别的复数个颗粒。术语颗粒和颗粒物(granulate)以相同的意思使用。
通过该方法获得的一个或多个含酶颗粒意在解决或者至少缓解现有技术中遇到的问题。因此，本发明提供了颗粒形式的稳定酶制剂的制备方法，其使用糖类作为载体。该载体可以是微粒或者粉末形式。
大量现有技术文献提及含有多种酶的小丸，但是这些发现作为清洁剂，常常作为洗涤组合物的用途。相反，本申请发现在动物饲料或者适于人的营养品组合物中的用途，由于这个原因，本发明的一个或多个颗粒是(动物)可食用的，优选也是可完全消化的。因此，令人毫不惊讶的是，本发明的颗粒和组合物不含例如，但不限于肥皂、清洁剂和漂白剂或者漂白化合物、沸石。
至少15％(w/w)的固相载体包含可食用的糖类聚合物(如淀粉)。然而，优选至少30％(w/w)，最优选至少40％(w/w)的固相载体包含糖类。有利地是固相载体的主要成分是糖类(例如淀粉)，例如超过50％(w/w)、优选至少60％(w/w)、合适地是至少70％(w/w)，最适是至少80％(w/w)。这些重量百分比是基于最终干颗粒中的非酶成分的总重量。
应该选择可食用的糖类聚合物，以便是分别供给动物或者人的可食用饲料或者食品，优选也是至少部分可消化的。聚合物优选包括葡萄糖(例如含葡萄糖的聚合物)，或者(C6H10O5)n单元。该糖类聚合物优选包括α-D-吡喃型葡萄糖单元、直链淀粉(线性(1-＞4)α-D-葡聚糖聚合物)和/或支链淀粉(支链D-葡聚糖，具有α-D-(1-＞4)和α-D-(1-＞6)键)。淀粉是优选的糖类聚合物。其他可用于代替淀粉，或者除了淀粉之外可以使用的合适的含葡萄糖的聚合物包括：α-葡聚糖，β-葡聚糖，果胶(如原果胶)和糖原。虽然最好避免凝胶化淀粉，也可以考虑这些糖类聚合物的衍生物，如它们的醚和/或酯，因此，可以不存在凝胶化淀粉。合适地，糖类聚合物是水不溶性的。
合适的糖类聚合物是玉米淀粉、马铃薯淀粉和稻淀粉。然而，从其他(例如植物，如蔬菜或者农作物)来源获得的淀粉也同样可以使用，这些来源如木薯(tapioca)、木薯(cassava)、小麦、黑小麦、玉米、西米、黑麦、燕麦、大麦、薯蓣、高梁或者竹芋。同样，天然或者修饰(例如糊精)类型的淀粉可以用于本发明。优选地，糖类(例如淀粉)含有少量蛋白质或者不含蛋白质，例如少于5％(w/w)，如少于2％(w/w)，优选少于1％(w/w)。不考虑淀粉(或者其他糖类聚合物)的类型，其应该是允许在动物饲料中使用的形式，换句话说，是可食用或者至少部分地可消化的形式。
加工中可以加水。在本发明的另一个实施方案中，颗粒在加工后被干燥。在一个实施方案中应该理解，无论加工中是否加入水，颗粒都可以被干燥。
酶和水优选以含酶(优选水性的)液体提供，如溶液或者浆液，其可以与固相载体混合，并且允许吸收到载体上。在混合过程中或者混合后，含酶液体和载体被加工为颗粒，随后被干燥。使用糖类载体可以允许吸收大量的含酶液体(因此吸收大量的酶)。混合物可用于形成塑性糊或者无弹性团，其易于加工为颗粒，例如其可以被挤压。
在本发明的方法中，酶和水在接触固相载体之前可以存在于同一组合物中。在这一方面，可以提供一种含酶水性液体。该液体可以是来自或者来源于发酵过程的溶液或者浆液。发酵过程通常是产生酶的过程。发酵过程可以产生含有微生物(其产生目的酶)和水性溶液的培养液。这种水性溶液一旦与微生物分离(例如通过过滤)，就可成为本发明中使用的含酶水性液体。因此在优选的实施方案中，含酶水性液体是滤液，尤其是从导致酶产生的发酵方法来源的滤液。基于从发酵培养液中分离酶的分离方法，酶也可以存在于保留物中。
可吸收到载体上的含酶液体(以及因此吸收的酶)的量通常受到可吸收的水的量的限制。优选地，加入到固相载体中的液体的量是被固相载体中存在的糖类吸收的(水性)液体中的(基本上)所有水。
在提高的温度下，处于溶胀状态下的淀粉和其他糖类聚合物可以吸收大量的水。由于这个原因，糖类聚合物能理想地吸收水(或者含酶水性液体)。例如，玉米淀粉在60℃可以吸收高达其重量三倍的水，在70℃下高达10倍。因此，本发明也考虑到使用较高的温度来吸收更大量的含酶液体，实际上当用热稳定酶处理时较高温度是特别优选的。因此，对于这些酶固相载体和液体(或者酶和水)和稳定剂的混合可以在提高的温度(例如，高于环境温度)下进行，如高于30℃，优选高于40℃，最适高于50℃。备选地或者此外，可以在这种温度下提供液体。
然而，一般来说较低(例如环境)温度下的非溶胀条件是优选的。这可以将(热敏感)酶在较高温度下的不稳定性引起的活性损失最小化。合适地，酶和水的混合过程中的温度在10-60℃之间，如10-50℃，优选20-40℃，优选20-25℃。
本发明中将酶、任选地将水(例如含酶液体)、稳定剂和固相载体的混合物制成颗粒(换句话说制粒)的机械加工可以使用在食品、饲料和酶制剂加工中常用的已知技术。这可以包括膨胀、挤压、滚圆、造粒、高剪切制粒、鼓式造粒、流化床成团或者其组合。这些方法的特征通常在于机械能的输入，如螺旋的驱动、混合装置的旋转、造粒仪器的旋转装置的压力、流化床成团器(fluid bed agglomerator)的旋转底板带来的粒子运动、或者气流造成的粒子运动或者其组合。这些方法允许固相载体(例如粉末形式)与酶以及任选地水，例如含酶液体(水溶液或者浆液)、稳定剂混合，并且随后制粒。
或者，固相载体与酶(例如粉末形式)和稳定剂混合，然后在该混合物中可以任选加入水，如液体(或者浆液)(它们可以作为制粒液体)。
本发明的另一个实施方案中通过将含酶液体喷雾或者包衣到载体上形成颗粒(例如，团)，该含酶液体之前已经与稳定剂在例如流化床成团器上混合。此处得到的颗粒可以包括在流化床成团器中产生的团。
优选地，含酶液体、固相载体和稳定剂的混合额外包括混合物的捏和。这可以提高混合物的可塑性，以便有助于制粒(例如挤压)。
在优选的实施方案中，颗粒通过挤压形成，优选在低压下挤压形成。这可以提供被挤压的混合物的温度将不会增加，或者仅仅有一点增加的优点。低压挤压包括例如在Fuji Paudal篮式(blasket-)或者圆顶式(dome-)挤压机中的挤压。挤压可以自然地产生颗粒(该颗粒在通过模具之后可能破裂)，或者使用切断器产生颗粒。
合适地，在干燥之前颗粒的含水率将在15到50％之间，如20-40％之间，如25-35％，优选33-37％。在干燥之前，颗粒的酶含量可以在1-85％，尤其是1-70％，如2-60％，优选2-50％，优选2-25％，如3-15％，如5-12％(例如至少50,000ppm)之间(通常为颗粒总重量计的重量百分比)。
得到的颗粒可经受制圆(例如滚圆)，如在滚圆机中，例如MARUMERISERTM机器；和/或压紧。如果干燥所得到的颗粒，那么优选在干燥之前进行滚圆。在干燥之前可对颗粒进行滚圆，因为这可以降低最终颗粒中的灰尘组成和/或有助于颗粒的任何包衣。
然后干燥颗粒，如在流化床干燥器中，或者在流化床成团(aglomeration)的情况下，可以立即干燥(在成团器中)以便得到(固态干燥的)颗粒。技术人员可使用食品、饲料或者酶工业中干燥颗粒的其他已知方法。合适地，颗粒是易流动的。干燥优选在25到60℃的温度下进行，如30-50℃。此时干燥可持续10分钟至数小时。所需要的时间长度当然将依赖于要干燥的颗粒的量。
颗粒干燥后，得到的干燥颗粒的含水率优选在3-10wt％之间，如5-9wt％之间。
本发明的一个优选的实施方案中提供了一个方法，其中该方法包括：
a)将含酶的水性液体与固相载体及稳定剂混合；
b)机械加工a)中得到的混合物，以便获得含酶颗粒；和
c)干燥b)中获得的含酶颗粒。
其中稳定剂选自阿拉伯胶、至少一种植物蛋白及其混合物。
本发明的另一个实施方案中颗粒被包衣。将涂层应用于颗粒以便产生额外的(例如有利的)特征或者特性，例如低灰尘含量、颜色、保护酶免受周围环境的影响、在一个颗粒中不同的酶活性或者其组合。在干燥之前或者未干燥之前对颗粒包衣。颗粒可以用脂肪、蜡、聚合物、盐、软膏和/或油膏或者含有(第二种)酶的涂层或其组合物进行包衣。显而易见，如果期望可以应用好几层(不同的)涂层。为了将涂层应用在颗粒上，可以使用许多已知的方法，其包括使用流化床、高剪切成粒机、混合成粒机或者Nauta混合机。
在一个实施方案中，颗粒优选在干燥后使用适合于饲料类的有机聚合物来包衣，例如干燥到残留水分低于大约10wt％，其通过如下步骤进行：
(a)在流化床上用有机聚合物的熔化物、溶液或者分散体喷雾颗粒，或者在流化床上用有机聚合物进行粉末包衣；或者
(b)在混合器中熔化有机聚合物来包衣颗粒，或者用有机聚合物的熔化物、溶液或者分散体喷雾粗颗粒，或者用有机聚合物进行粉末包衣；
并且如果需要，干燥后，冷却和/或从粗组分释放每个得到的聚合物包衣颗粒。
根据本发明所述方法的一个优选的实施方案，颗粒被填充到流化床上，流化并且用水性或者非水性的，优选是有机聚合物的水性溶液或者分散体喷射包衣。对于该目的，使用尽可能高浓度并且仍然可以喷洒的液体，例如水性或者非水性溶液或者分散体，其含有10-50wt％的至少一种聚合物，该聚合物选自：
a)聚烷撑二醇，尤其是数均分子量在大约400-15,000之间，例如大约400-10,000之间的聚乙二醇；
b)数均分子量在大约4000到20,000之间，例如大约7700到14,600之间的聚环氧烷聚合物或者共聚物；尤其是聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物；
c)数均分子量在大约7000到1,000,000之间，例如大约44,000到54,000之间的聚乙烯吡咯烷酮；
d)数均分子量在大约30,000到100,000之间，例如大约45,000到70,000之间的乙烯基吡咯烷酮/乙烯基乙酸酯共聚物；
e)数均分子量在大约10,000到200,000之间，例如大约20,000到100,000之间的聚乙烯醇；
f)数均分子量在大约6000到80,000之间，例如大约12,000到65,000之间的纤维素衍生物，如羟丙基甲基纤维素。
根据另一个优选方法的变通方案，对于涂层，使用可喷雾的水性或非水性溶液或者分散体，其含有10-40wt％，优选大约20-35wt％的至少一种聚合物，该聚合物选自：
g)数均分子量在大约100,000到1,000,000之间的甲基丙烯酸烷基酯聚合物和共聚物；尤其是丙烯酸乙酯/甲基丙烯酸甲酯共聚物和丙烯酸甲酯/丙烯酸乙酯共聚物；和
h)数均分子量在大约250,000到700,000之间的聚乙酸乙烯酯，使用可能稳定的聚乙烯吡咯烷酮。
通常，由于以下几个原因优选考虑水溶液或者水性分散体：不需要特别的措施建立溶剂或者回收；一些涂层材料优选以水溶液或者分散体提供。
然而，在特殊的情况下，使用非水溶液或者分散体也可能是有优势的。涂层材料非常快地溶解，或者可以分散有利地高比例涂层材料。用该方式，可以喷雾具有高固体含量的喷雾液体，这导致较短的加工时间。非水溶剂蒸发的较低焓也导致较短的加工时间。
可以根据本发明使用的分散体通过在水性或者非水性的，优选是在水性的液相中使用或不使用常规的分散体分散上述聚合物获得。聚合物溶液或分散体优选以这种方式喷雾，即颗粒被填充到流化床装置或者混合器中，将喷雾材料喷雾上去，同时加热装入料。能量通过与加热干燥气体(通常是空气)接触供给流化床装置，并且通过与加热壁，如果适当与加热混合工具接触供给混合器。如果最后喷雾材料可以用高干物质含量喷雾，那么预热溶液或分散体可能是有利的。当使用有机液相时，溶剂回收是有利的。包衣过程中的产品温度应该在大约35-50℃之间。包衣可以在流化床装置中进行，原则上用底部喷雾方法(喷嘴在气体分布器平板中，向上喷雾)，或者顶部喷雾方法(涂层从顶部喷雾到流化床上)进行。
合适的聚烷撑二醇a)的实例为：聚丙二醇，尤其是不同摩尔质量的聚乙二醇(PEG)，例如从BASFAG获得，商品名为Lutrol E 4000和LutrolE 6000的PEG 4000或者PEG 6000。
在一个优选的实施方案中，聚烷撑二醇涂层按照WO 00/47060中第4页第11到14行和第10页第28行到第11页第9行描述的进行，该文献在此处被引入作为参考。
上述聚合物b)的实例为：聚环氧乙烷和聚环氧丙烷、环氧乙烷/环氧丙烷混合的聚合物以及由聚环氧乙烷和聚环氧丙烷嵌段组成的嵌段共聚物，例如可以从BASFAG获得商品名为Lutrol F 68和Lutrol F 127的聚合物。对于聚合物a)和b)，优选可有利地使用基于溶液的总重量高达大约50wt％的高度浓缩溶液，例如大约30-50wt％。
上述聚合物c)的实例是：市售的聚乙烯吡咯烷酮，例如BASF AG出售的，商品名为Kollidon或者Luviskol。在这些聚合物中，可有利地使用基于溶液的总重量，固体含量为大约30-40wt％的的高度浓缩溶液。
上面描述的聚合物d)的实例是由BASF AG出售的商品名为KollidonVA64的乙烯基吡咯烷酮/乙烯基乙酸酯共聚物。可尤其有利地使用这些共聚物的大约30-40wt％的高度浓缩溶液(基于溶液的总重量)。
上述聚合物e)的实例是：市售的产品，例如Hoechst出售的商品名为Mowiol的产品。可以有利地使用固体含量在大约8wt％到20wt％的这些聚合物的溶液。
合适的聚合物f)的实例是：羟丙基甲基-纤维素，例如Shin Etsu出售的，商品名为Pharmacoat。
上面提到的聚合物g)的实例是：甲基丙烯酸烷基酯聚合物和共聚物，其烷基基团具有1到4个碳原子。合适的共聚物的具体实例是：市售的丙烯酸乙酯/甲基丙烯酸甲酯共聚物，例如BASF AG出售的商品名为Kollicoat EMM 30D，或者Rhm出售的商品名为Eutragit NE 30D；以及市售的甲基丙烯酸酯/丙烯酸乙酯共聚物，例如BASFAG出售的商品名为Kollicoat MAE 30DP，Rhm出售的商品名为Eutragit 30/55。这种类型的共聚物可以根据本发明来加工，例如为10-40wt％的分散体。
上述聚合物h)的实例是：市售的聚乙烯吡咯烷酮稳定的聚乙酸乙烯酯分散体，例如BASFAG出售的商品名为Kollicoat SR 30D(分散体中固体含量在大约20-30wt％之间)。
根据本发明所述方法的另一个优选实施方案，颗粒被装载到流化床上，并且用粉末包衣。粉末包衣优选使用固态聚合物的粉末进行，所述固态聚合物选自数均分子量在大约6000到80,000之间的羟丙基甲基纤维素(HPMC)；其在和增塑剂的混合物中。用于粉末包衣的合适的材料也是以粉状形式存在的所有其他的涂层材料，它们既不以溶化物也不以高度浓缩的溶液应用(例如使用HPMC的情况下)。
粉末包衣优选以这样的方式进行，即涂层材料被连续地加入到填充到流化床中的颗粒上。涂层材料的细小颗粒(粒度在大约10到100μm之间)位于粗颗粒的相对粗糙的表面上。通过喷雾到增塑剂溶液中，涂层材料颗粒被粘附在一起。合适的增塑剂的实例是聚乙二醇溶液、柠檬酸三乙酯、山梨糖醇溶液、石蜡油及其类似物。为了去除溶剂，使用轻微加热完成包衣。这种情况下的产品温度低于大约60℃，例如在大约40到50℃之间。原则上，粉末包衣也可以在混合器中进行。在这种情况下，加入粉末混合物，并且增塑剂也通过喷嘴注射。干燥通过混合器的壁，如果适当通过混合工具提供能量来进行。正如在流化床中的包衣和干燥，此处也必须维持低产品温度。
根据本发明所述方法的另一个优选的实施方案，被填充到流化床或者混合器中的颗粒使用至少一种聚合物的熔化物来包衣，该聚合物选自：
a)数均分子量在大约1000到15,000之间的聚烷撑二醇，尤其是聚乙二醇；和
b)数均分子量在大约4000到20,000之间的聚环氧烷聚合物或者共聚物，尤其是聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物。
在流化床中进行的熔化物包衣优选以被包衣的颗粒填充到流化床装置中的方式进行。涂层材料在外部贮存器中熔化，并且泵入到喷雾喷嘴，例如通过可加热的管道。加热喷嘴气体是有利的。喷雾速率和溶化物入口温度必须以这样的方式设置，即涂层材料仍然易于在颗粒的表面上操作，并且可以均匀包衣。在溶化物喷雾之前预加热颗粒是可能的。在涂层材料具有高熔点的情况下，必须注意这样的一个事实，即产品温度一定不能设置得太高，以便最小化酶活性的损失。产品温度应该在大约35到50℃的范围内。溶化物包衣原则上也可以通过底部喷雾方法或者通过顶部喷雾方法进行。溶化物包衣可以以两种不同的方式在混合器中进行。被包衣的颗粒填充到合适的混合器中，涂层材料的溶化物喷雾进混合器中，或者在另一种可能的情况下，固体形式的涂层材料与产品混合。通过容器壁或者通过混合工具供给能量，涂层材料溶化，从而包衣粗颗粒。如果要求，可以时而加入一些释放剂。合适的释放剂是，例如水杨酸(salicic acid)、滑石、硬脂酸盐和磷酸三钙。
用于包衣的聚合物溶液、聚合物分散体或者溶化物熔化物可以包含其他加入，如加入微晶纤维素、滑石或者高岭土。
在本发明的另一个实施方案中，颗粒可以使用WO 03/059087第二页第19行到第4页第15行所描述的聚烯烃来包衣。
在本发明的另一个实施方案中，颗粒可以使用WO 03/059086第2页第18行到第4页第8行所描述的包括分散在合适溶剂中的疏水物质的颗粒的分散体来包衣。在该涂层的优选实施方案中使用了聚烯烃，特别优选是聚乙烯和/或聚丙烯。
颗粒优选具有相对窄的粒度分布(例如，它们是单分散性)。这有助于酶在动物饲料中的颗粒中的均匀分布。本发明的方法趋向于生产具有窄粒度分布的颗粒。然而，如果需要，在该方法中可以包括一个额外的步骤，以便进一步使颗粒的粒度分布变窄，如筛选。颗粒的平均粒度分布合适地在100μm到2000μm之间，优选在200μm到1800μm之间，优选在300μm到1600μm之间。颗粒可以是不规则的形状(但优选具有规则形状)，例如接近球体。在一个优选的实施方案中，颗粒的平均粒度分布在500μm到2000μm之间，优选在500μm到1800μm之间，优选在6300μm到1000μm之间。平均粒度分布可以通过使用Mastersizer S(一种MalvernInstrumentss GmbH机器，型号为32734-08)来确定。平均粒度分布的特征在于D(v，0.1)，D(v，0.5)和D(v，0.9)以及平均粒度分布D(4，3)的数值。平均粒度分布可以通过筛选确定，例如使用Fa.Retsch经销的筛选机器Typ Vibro VS 1000。
因此根据本发明的优选的方法包括：
a)混合(任选的)水、酶、稳定剂和包括至少15％(w/w)的可食用的糖类聚合物的固相载体，例如将固相载体和至少一种稳定剂与含酶水性液体混合；
b)任选地捏和所得到的混合物；
c)例如通过机械加工将混合物制粒，以便获得含酶颗粒，例如通过使用制粒机或者通过挤压；
d)任选地滚圆颗粒；
e)将所得的颗粒干燥，以得到含酶颗粒。
其中稳定剂选自阿拉伯胶、至少一种植物蛋白及其混合物。
在一个优选的实施方案中，步骤e)中获得的含酶颗粒被进一步包衣。
在一个优选的实施方案中，可以有针对性的保持最高温度以便在整个工艺过程中酶被暴露在低于80℃的温度下。
水或者含酶液体可以包括一种或多种酶，并通常是微生物来源，例如从微生物发酵获得。一般地，酶将是活性形式(例如可以具有催化或者生理学活性)。优选的液体是浓缩形式，如超滤液(UF)或者保留物，其允许产生具有期望活性水平的颗粒。
本发明的另一个方面提供了一种液态制剂，其包括至少一种酶和至少一种稳定剂，其中稳定剂选自阿拉伯胶、至少一种植物蛋白及其混合物。
液态制剂可以使用食品、饲料和酶制剂加工中常用的技术来制备。在一个实施方案中，一种或多种稳定剂可以直接加入到溶解了或者分散了酶的液体中。在本发明的另一个实施方案中，稳定剂被首先溶解在额外的水中，任选地可以调节所获得的溶液的pH，随后将如此获得的溶液与酶或者酶浓缩物或者液态酶制剂混合。如此获得的混合物的pH的调节是任选的。可以用有机或者无机盐和/或酸调节pH。
在一个优选的实施方案中，液态制剂包括至少一种磷酸酶，优选为至少一种植酸酶。
稳定剂选自阿拉伯胶、至少一种植物蛋白及其混合物。可以理解的是稳定剂可以选自一种试剂，如仅仅选自阿拉伯胶，或者由一种混合物组成，例如一种植物蛋白和阿拉伯胶的混合物，或者两种或者三种或者多种不同植物蛋白的混合物。在一个优选的实施方案中，稳定剂是阿拉伯胶。在一个优选的实施方案中，稳定剂是至少一种植物蛋白。
在一个实施方案中，稳定剂是阿拉伯胶。阿拉伯胶的其他叫法是阿拉伯胶(gum Arabic)或者阿拉伯胶(gum acacia)。阿拉伯胶从Acadia树(豆科(Leguminosae))(例如sub-Saharan(非洲撒哈拉以南地区)(萨赫勒地区)阿拉伯胶树(Acacia Senegal)的Acadia树和塞伊耳相思树(Acacis seyal))的茎和枝的渗出物制得，在称作流胶现象(gummosis)过程中作为大结节天然产生以封闭树皮上的伤口。阿拉伯胶是阿拉伯半乳聚糖寡糖、多糖和糖蛋白的复合物和可变混合物。根据来源，聚糖成分相对于D-半乳糖(Acaia seyal)而言含有很大比例的L-阿糖，或者相对于L-阿糖(Acacia Senegal)而言含有很大比例的D-半乳糖。与来自阿拉伯胶树的树胶相比，来自塞伊耳相思树的树胶也含有显著多的4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸，但较少量的L-鼠李糖和未取代的D-葡萄糖醛酸。根据本发明的阿拉伯胶包括来自阿拉伯胶树和/或来自塞伊耳相思树和/或来自Acacia laeta和/或卡路金合欢(Acacia Karrod)的阿拉伯胶。
阿拉伯胶是支链糖蛋白的混合物，所述糖蛋白的主要部分为β-1，3-吡喃半乳糖(galactopyran)核心与rhamnoglucuronoarabino五糖侧链。在一个优选的实施方案中，使用分子量MR在100 000到2 000 000之间，优选在200 000到1 500 000之间，优选在300 000到1 200 000之间的阿拉伯胶。
阿拉伯胶可以CAS号9000-01-5商购获得，例如从Colloides NaturelsInternational CNI(129Chemin de Croisset，PO BOX 4151-76723RouenCédex，法国)获得。
阿拉伯胶注册为食品的工艺添加剂(technological additive)，分类为E 414(参考：Merck Index(默克索引)，12，11.SAX，AQQ 500)。
在一个实施方案中，稳定剂是至少一种植物蛋白。根据本发明的植物蛋白可以从任何植物获得，例如从谷物(谷类植物)、豆类植物(pulses)、蔬菜或者水果。植物蛋白可以分离自任何种类的植物，如叶子、种子、茎、花等等。由于植物蛋白通常从植物获得，所以其可以含有高达20％(重量百分比)的非蛋白质组分，优选高达15％，优选高达10％，尤其是高达5％。根据本发明的植物蛋白也可以是从植物蛋白获得的全部或者部分水解产物。在一个优选的实施方案中，植物蛋白选自谷物蛋白、豆类植物蛋白、蔬菜蛋白、水果蛋白、其水解产物及其混合物。
植物蛋白例如可以从谷物(谷类)如小麦、黑麦、燕麦、大麦、玉米(可能是玉蜀黍(zea mays))、稻和稷获得。这些谷物的蛋白质部分可以以单一组分或者以混合物使用。谷物的蛋白质组分是清蛋白、球蛋白、谷醇溶蛋白和谷蛋白、所谓的Osborne-Fractions。下表列出了优选谷物的蛋白质组分：
  组分   小麦  黑麦   燕麦   大麦   玉米   稻   稷
  清蛋白   麦清蛋白
  球蛋白   麻仁球蛋白   Avenalin
  谷醇溶蛋白   麦醇溶蛋白  黑麦碱   麦醇溶蛋白   大麦醇溶蛋白   玉米醇溶蛋白   Oryzin   高梁醇溶蛋白
  谷蛋白   麦谷蛋白  Secalinin   燕麦蛋白   Hordenin   齐阿宁(Zeanin)   米谷蛋白
在本发明的一个实施方案中，可以使用谷物的单一组分或者由上述组分的混合物组成的蛋白质。
在一个优选的实施方案中，使用了谷物蛋白质(＝谷类蛋白质)，其获自小麦，尤其是所谓的包括小麦的谷醇溶蛋白和谷蛋白部分的小麦麦麸。
植物蛋白可以从豆类植物获得，如蚕豆和豌豆(豆类植物，豆类)，包括但不限于来自蝶形花科(Papilionaceae)的菜豆属和豌豆属植物，例如大豆(Glycine max)、蚕豆(Vicia faba)、青豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、多花菜豆(P.coccineus))、利马豆(金甲豆(Phaseolus lunatus))、绿色豌豆(Pisa sativa)以及花生(落花生(Arachis hyopgaea))和腰果。
在一个优选的实施方案中，植物蛋白选自谷物蛋白和/或豆类蛋白。
植物蛋白可以从蔬菜获得，包括但不限于马铃薯、甘薯、西红柿、黄瓜、籽苗(sprout)、卷心菜等等。
植物蛋白可以从水果获得，包括但不限于香蕉、苹果、梨等等。
下表列出了可商购获得的植物蛋白，这些蛋白可以根据本发明来使用。
  植物蛋白  名称   批号   生产商/经销商   CAS-号   其他号码
  大豆蛋白  Supro670   IP  NonGM   IP 094/2003   ProteinTechnologiesInternational   9010-10-0
  大豆蛋白  Supro1751   GMO frei   M330000575   ProteinTechnologiesInternational   9010-10-0   EG-Nr.200-061-5
  马铃薯蛋白  Alburex   SP   Roquette   100209-45-8   EINECS309-353-8
  小麦蛋白  Solpro100   E 031579   Amylum   RN100684-25-1
在一个优选的实施方案中，植物蛋白选自豆科(Fabaceae)、禾本科(Poaceae)、豆科(Legaminosae)和茄科(Solanaceae)及其混合物。
在一个优选的实施方案中，植物蛋白选自大豆蛋白、小麦蛋白和马铃薯蛋白及其混合物。
用作本发明的稳定剂的植物蛋白可以例如从下述植物获得：
漆树科(Anacardiaceae)，如黄连木属(Pistacia)、芒果属(Mangifera)、腰果属(Anacardium)，例如阿月浑子(Pistacia vera)[阿月浑子]，芒果(Mangifer indica)[芒果]或者腰果(Anacardium occidentale)[腰果]
菊科(Asteraceae)，如金盏花属(Calendula)、红蓝花属(Carthamus)、矢车菊属(Centaurea)、菊苣属(Cichorium)、菜蓟属(Cynara)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、Locusta、万寿菊属(Tagetes)、缬草属(Valeriana)，例如金盏花(Calendula officinalis)[金盏花]、红花(Carthamus tinctorius)[红花]、矢车菊(Centaurea cyanus)[矢车菊]、菊苣(Cichorium intybus)[蓝雏菊]、洋蓟(Cynara scolymus)[洋蓟]、向日葵(Helianthus annus)[向日葵]、莴苣(Lactuca sativa)、Lactuca crispa、Lactucaesculenta、Lactuca scariola、莴苣(L.ssp.Sativa)、Lactuca scariola L.var.integrata、Lactuca scariola L.var.integrifolia、Lactuca sativa subsp.Romana、Locusta communis、Valeriana locusta[莴苣]、香叶万寿菊(Tageteslucida)、万寿菊(Tagetes erecta)或者细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)[万寿菊]。
伞形科(Apiaceae)，如胡萝卜属(Daucu)，例如胡萝卜(Daucuscarota)[胡萝卜]。
桦木科(Betulaceae)，如榛属(Corylus)(榛木)，例如欧洲榛(Corylusavellana)或者土耳其榛(Corylus colurna)榛果]。
紫草科(Boraginaceae)，如玻璃苣属(Borago)，例如玻璃苣(Boragoofficinalis)[玻璃苣]。
十字花科(Brassicaceae)，如芸苔属(Brassica)、Melanosinapis、白芥属(Sinapis)、鼠耳芥属(Arabadopsis)，例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜青(Brassica rapa ssp.)[油菜(canola)，油菜(oilseed rape)，球茎甘蓝(turnip rape)]、野芥菜(Sinapis arvensis)、芥菜(Brassica juncea)、芥菜(Brassica juncea var.juncea)、皱叶芥菜(Brassica juncea var.crispifolia)、大叶芥菜(Brassica juncea var.foliosa)、黑芥(Brassica nigra)、Brassicasinapioides、Melanosinapis communis[芥菜]、甘蓝(Brassica oleracea)[饲料甜菜]或者鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)。
凤梨科(Bromeliaceae)，例如凤梨属(Anana)、凤梨科凤梨属(Bromelia(pineaple))，例如凤梨(Anana comosus)、Ananas ananas或者Bromeliacomosa[凤梨]。
番木瓜科(Caricaceae)，例如番木瓜属(Carica)，例如番木瓜(Caricapapaya)[木瓜]。
大麻科(Cannabaceae)，如大麻属(Cannabis)，例如大麻(Cannabissative)[大麻]。
旋花科(Convolvulaceae)，例如番薯属(Ipomea)、旋花属(Convolvulus)，例如甘薯(Ipomoea batatus)、提琴叶牵牛花(Ipomoeapandurata)、Convolvulus batatas、Convolvulus tiliaceus、Ipomoeafastigiata、Ipomoea tiliacea或者Convolvulus panduratus[Batate、甘薯、Man of the Earth、野洋芋]。
藜科(Chenopodiaceae)，例如甜菜属(Beta)，即甜菜(Beta vulgaris)、甜萝卜(Beta vulgaris var.altissima)、甜菜(原变种)(Beta vulgaris var.Vulgaris)、野甜菜(Beta maritima)、Beta vulgaris var.perennis、Betavulgaris var.conditiva或者Beta vulgaris var.esculenta[甜菜]。
葫芦科(Cucurbitaceae)，例如南瓜属(Cucubita)，例如笋瓜(Cucurbitamaxima)、灰子南瓜(Cucurbita mixta)、西葫芦(Cucurbita pepo)或者南瓜(Cucurbita moschata)[南瓜(pumpkin)，南瓜(squash)]。
胡颓子科(Elaeagnaceae)，例如胡颓子属(Elaeagnus)，例如油橄榄(Olea europaea)[橄榄]。
杜鹃花科(Ericaceae)，例如山月桂属(Kalmia)，例如宽叶山月桂(Kalmia latifolia)、狭叶山月桂(Kalmia angustifolia)、小叶山月桂(Kalmiamicrophylla)、沼泽月桂树(Kalmia polifolia)、Kalmia occidentalis、Cistuschamaerhodendros或者Kalmia lucida[美国月桂(American laurel)、阔叶月桂(broad-leafed laurel)、山月桂(calico bush)、spoon wood、狭叶山月桂(sheep laurel)、alpine laurel、苔地月桂(bog laurel)、western bog-laurel、swamp-laurel]。
大戟科(Euphorbiaceae)，例如木薯属(Manihot)、Janipha、膏桐(Jatropha)、蓖麻属、例如木薯(Manihot utilissima)、Janipha manihot、Jatropha manihot、Manihot aipil、甜木薯(Manihot dulcis)、Manihotmanihot、Manihot melanobasis、木薯(Manihot esculenta)[木薯、竹芋、木薯(tapioca)、木薯(cassava)]或者蓖麻(Ricinus communis)[蓖麻子(castor bean)、Castor Oil Bush、蓖麻(Castor Oil Plant)、蓖麻(PalmaChristi)、Wonder Tree]。
豆科(Fabaceae)，例如豌豆属(Pisum)、合欢属(Albizia)、Cathormion、Feuillea、音加属(Inga)、围涎树属(Pithecolobium)、金合欢属(Acacia)、含羞草属(Mimosa)、苜蓿属(Medicajo)、大豆属(Glycine)、镰扁豆属(Dolichos)、菜豆属(Phaseolus)、野生大豆属(soja)，例如豌豆(Pisumsativum)、饲料豌豆(Pisum arvense)、Pisum humile[豌豆]、Albiziaberteriana、合欢(Albizia julibrissin)、阔荚合欢(Albizia lebbeck)、Acaciaberteriana、Acacia littoralis、Albizia berteriana、Albizzia berteriana、Cathormion berteriana、Feuillea berteriana、Inga fragrans、Pithecellobiumberterianum、Pithecellobium fragrans、Pithecolobium berterianum、Pseudalbizzia berteriana、Acacia julibrissin、Acacia nemu、Albizia nemu、Feuilleea julibrissin、Mimosa julibrissin、Mimosa speciosa、Sericanrdajulibrissin、Acacia lebbeck、Acacia macrophylla、阔荚合欢(Albizialebbeck)、Feuilleea lebbeck、Mimosa lebbeck、Mimosa speciosa[bastardlogwood、合欢(silk tree)、East Indian Walnu]、紫苜蓿(Medicago sativa)、野苜蓿(Medicago facata)、杂交苜蓿(Medicago varia)[紫花苜蓿]、大豆(Glycine max)Dolichos soja、宽叶蔓豆(Glycine gracillis)、大豆(Glycinehispida)、黄豆(Phaseolus max)、Soja hispida或者Soja hispida[大豆]。
牻牛儿苗科(Geraniacea)，例如天竺葵属(Pelargonium)、椰子属(Cocos)、Oleum，例如椰子(Cocos nucifera)、茶藨子天竺葵(Pelargoniumgrossularioides)或者Oleum cocois[椰子]。
禾本科(Gramineae)，例如甘蔗属(Saccharum)，例如甘蔗(Saccharumofficinarum)。
核桃科(Juglandaceae)，例如核桃属(Juglans)、Wallia，例如核桃(Juglans regia)、日本核桃(Juglans ailanthifolia)、山核桃(Juglanssieboldiana)、灰核桃(Juglans cinerea)、Wallia cinerea、Juglans bixbyi、加州黑核桃(Juglans californica)、印度黑核桃(Juglans hindsii)、Juglansintermedia、Juglans jamaicensis、大核桃(Juglans major)、小果核桃(Juglans microcarpa)、黑核桃(Juglans nigra)或者Wallia nigra[胡桃(walnut)、黑胡桃(black walnut)、胡桃(common walnut)、胡桃(Persianwalnut)、白胡桃(white walnut)、灰胡桃(butternut)、黑胡桃(blackwalnut)]。
樟科(Lauraceae)，例如鳄梨属(Persea)(鳄梨)、月桂属(Laurus)，例如月桂(Laurus nobilis)、[月桂树(bay)、月桂树(laurel)，月桂树(baylaurel)，香月桂(sweet bay)]、鳄梨(Persea americana)、酪梨(Perseagratissima)或者Persea persea[酪梨]。
豆科(Leguminosae)，例如落花生属(Arachis)，例如落花生(Arachishypogaea)[花生]。
亚麻科(Linaceae)，例如亚麻属(Linum)、Adenolium，例如亚麻(Linumusitatissimum)、Linum humile、奥地利亚麻(Linum austriacum)、窄叶亚麻(Linum angustifolium)、泻亚麻(Linum catharticum)、金黄亚麻(Linumflavum)、大花亚麻(Linum grandiflorum)、Adenolinum grandiflorum、刘易斯亚麻(Linum lewisii)、那旁亚麻(Linum narbonense)、宿根亚麻(Linumperenne)、Linum perenne var.lewisii、Linum pratense或者Linumtrigynum[亚麻(flax)、亚麻子(linseed)]。
Lythrarieae，例如石榴属(Punica)，例如石榴(Punica granatum)[石榴]。
锦葵科(Malvaceae)，例如棉属(Gossypium)，例如陆地棉(Gossypiumhirsutum)、树棉(Gossypium arboreum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)或者瑟伯氏棉(Gossypium thurberi)[棉花]。
芭蕉科(Musaceae)，例如芭蕉属(Musa)，例如香蕉(Musa nana)、小果野蕉(Musa acuminata)、大蕉(Musa paradisiaca)、香蕉(Musa spp.)[香蕉]。
柳叶菜科(Onagraceae)，如Camissonia、月见草属(Oenothera)，例如月见草(Oenothera biennis)或者Camissonia brevipes[樱草(primrose)、月见草(evening primrose)]。
棕榈科(Palmae)，如油棕属(Elacis)，例如油棕(Elaeis guineensis)[油棕]。
罂粟科(Papaveraceae)，如罂粟属(Papaver)，例如东方罂栗(Papaverorientale)、虞美人(Papaver rhoeas)、Papaver dubium[罂粟(poppy)，东洋罂粟花(oriental poppy)、角罂粟花(corn poppy)、虞美人(field poppy)、虞美人(Shirley poppies)、虞美人、长荚罂粟(long-headed poppy)、长荚罂粟(long-pod poppy)]。
胡麻科(Pedaliaceae)，如胡麻属(Sesamum)，例如胡麻(Sesamumindicum)[芝麻]。
胡椒科(Piperaceae)，如胡椒属(Piper)、Artanthe、草胡椒属(Peperomia)、Steffensia，例如树胡椒(Pipre aduncum)、Piper amalago、狭叶胡椒(Piper angustifolium)、Piper auritum、萎叶(Piper betel)、毕橙茄(Piper cubeba)、荜茇(Piper longum)、胡椒(Piper nigrum)、假荜茇(Piperretrofractum)、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piper elongatum、Steffensia elongata[番椒(Cayenne pepper)、花椒(wildpepper)]。
禾本科(Poaceae)，如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、蜀黍属(Sorghum)、须芒草属(Andropogon)、绒毛草属(Holcus)、稷属(Panicum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)(玉米)、Tritico saecale、小麦属(Triticum)，例如大麦(Hordeum vulgare)、芒颖大麦草(Hordeumjubatum)、鼠大麦(Hordeum murinum)，短芒大麦草(Hordeum secalinum)、栽培二棱大麦(Hordeum distichon)、Hordeum aegiceras、Hordeumhexastichon、栽培六棱大麦(Hordeum hexastichum)、Hordeum irregulare、大麦(Hordeum sativum)、Hordeum secalinum[大麦、珍珠大麦(pearlbarley)、狐尾大麦(foxtail barley)、wall barley、草甸大麦(meadowbarley)]、黑麦(Secale cereale)[黑麦(rye)]、燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avenafatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avenahybrida)[燕麦(oat)]、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、石茅高梁(Sorghumhalepense)、甜高梁(Sorghum saccharatum)、蜀黍(Sorghum vulgare)、Andropogon drummondii、Holcus biolor、蜀黍(Holcus sorghum)、Sorghumaethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡佛尔高梁(Sorghum caffrorum)、垂穗高梁草(Sorghum cernuum)、Sorghum dochna，Sorghum drummondii，硬高梁草(Sorghum durra)、Sorghum guineense、Sorghum lanceolatum、多脉高梁草(Sorghum nervosum)、甜高梁(Sorghum saccharatum)、Sorghum subglabrescens、Sorghum verticilliflorum、蜀黍(Sorghum vulgare)、石茅高梁(Holcus halepensis)、Sorghum miliaceum millet、野生稷(Panicummilitaceum)[高梁、稷(millet)]、稻(Oryza sativa)、稻(Oryza latifolia)[稻]、玉蜀黍(Zea mays)[玉米(corn)、玉米(maize)]、普通小麦(Triticumaestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticumsativum)或者普通小麦(Triticum vulgare)[小麦(wheat)、面包小麦(breadwheat)、普通小麦(common wheat)]、Tritico saecale[“小黑麦(Tricale)”]。
山龙眼科(Proteaceae)、如澳洲坚果属(Macadamia)、例如全缘叶澳洲坚果(Macadamia intergrifolia)[澳洲坚果(macadamia)]。
茜草科(Rubiaceae)，如咖啡属(Coffea)，例如咖啡(Cofea spp.)、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffea canephora)或者大果咖啡(Coffealiberica)[咖啡(coffee)]。
玄参科(Scrophulariaceae)，如毛蕊花属(Verbascum)，例如毛瓣毛蕊花(Verbascum blattaria)、东方毛蕊花(Verbascum chaixii)、Verbascumdensiflorum、Verbascum lagurus、Verbascum longifolium、Verbascumlychnitis、黑毛蕊花(Verbascum nigrum)、奥林匹克毛蕊花(Verbascumolympicum)、Verbascum phlomoides、紫毛蕊花(Verbascum phoenicum)、Verbascum pulverulentum或者毛蕊花(Verbascum thapsus)[毛蕊花(mullein)、白蛾毛蕊花(white moth mullein)、nettle-leaved mullein、dense-flowered mullein、silver mullein、长叶毛蕊花(long-leaved mullein)、白色毛蕊花(white mullein)、黑毛蕊花(dark mullein)、greek mullein、橙色毛蕊花(orange mullein)、紫毛蕊花(purple mullein)、灰毛蕊花(hoarymullein)、大毛蕊花(great mullein)]。
茄科(Solanaceae)，如辣椒属(Capsicum)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、蕃茄属(Lycopersicon)，例如辣椒(Capsicum annuum)、朝天椒(Capsicum annuum var.glabriusculum)、小米辣(Capsicumfrutescens)[辣椒(pepper)]、辣椒[红辣椒]、烟草(Nicotiana tabacum)、花烟草(Nicotiana alata)、野生烟草(Nicotiana attenuata)、光烟草(Nicotianaglauca)、Nicotiana langsdorffii、Nicotiana obtusifolia、Nicotianaquadrivalvis、浅波烟草(Nicotiana repanda)、黄花烟草(Nicotiana rustica)、野生种烟草(Nicotiana sylvestris)[烟草(tobacco)]、马铃薯(Solanumtuberosum)[马铃薯(potato)]、茄(Solanum melongena)[茄子(egg-plant)]、番茄(Lycopersicon esculentum)、番茄(Lycopersicon lycopersicum)、Lycopersicon pyriforme、红茄(Solanum integrifolium)或者番茄(Solanumlycopersicum)[番茄]。
梧桐科(Sterculiaceae)，如可可树属(Theobroma)，例如可可树(Theobroma cacao)[可可树]。
山茶科(Theaceae)，如山茶属(Camellia)，例如大叶茶(amellia sinensis)[茶树]。
基于将被加工的混合物的总重量(对于固态制剂)或者基于最终液态制剂的总重量，稳定剂通常以0.01-50wt％的量加入，如1-30wt％，如1-20wt％，如3-10wt％。一种或多种稳定剂可以与载体混合，或与酶混合，或直接加入到液态制剂中。
在其他实施方案中，额外的成分可引入酶制剂中，例如作为加工助剂，用于进一步改进造粒稳定剂和/或贮存稳定性。下面讨论了许多这种优选的添加剂。
盐可以包括在稳定的固态或者液态酶制剂中(例如与固相载体或者水)。优选(正如EP-A-0,758,018中建议的)可以加入一种或多种无机盐，其可以改进加工和贮存稳定性。优选的无机盐是水溶性的。它们可以包括二价阳离子，如锌(尤其是)、镁和钙或者单价阳离子，如钠或者钾。尽管可以使用水可溶性的其他阴离子(例如碳酸盐)，硫酸盐是最好的阴离子，。这些盐可以以固态形式加入(例如，加入到混合物中)。然而，在与固相载体混合之前，这些一种或多种盐可以溶解在水中或者含酶液体中。
对于液态制剂，这些一种或多种盐可以直接加入液态酶制剂中。合适地，盐以0.1-40wt％的量提供，优选为0.5-30wt％，尤其是1-25wt％，优选1-20(wt％，基于最终液态制剂)。
因此，例如颗粒的固态制剂可以包括低于25％(w/w)的盐，优选低于12％，例如2.5-7.5％，例如4-6％(wt％，基于最终固态制剂)。
进一步考虑的是可以将已知的稳定剂加入到固态和/或液态酶制剂中，如尿素、甘油、聚乙二醇，优选分子量为6000Da的聚乙二醇或者其混合物。可以加入到固态或者液态制剂中的其他稳定剂的其他实例是C5糖，优选是木糖醇或者核糖醇或者山梨糖醇，分子量在600-4000Da之间，优选1000-3350Da之间的聚乙二醇、丙二酸、戊二酸和琥珀酸的二钠盐，羧甲基纤维素和藻酸盐，优选是藻酸钠。
造粒稳定性的进一步改进可以通过引入疏水的凝胶形成或者缓溶(例如在水中)化合物来获得。这些可以以1-10wt％，如2-8wt％和优选4-6wt％(基于用于固态制剂的水和固相载体成分的重量)或者基于液态制剂的重量，1-20％来提供，。合适的物质包括衍生的纤维素，如HPMC(羟基-丙基-甲基-纤维素)，CMC(羧基-甲基-纤维素)，HEC(羟基-乙基-纤维素)，微晶纤维素；聚乙烯醇(PVA)；和/或可食用油。可食用油，如大豆油或者油菜籽油可作为加工助剂加入(例如加入到将造粒的混合物中)。
在本发明的一个优选的实施方案中，稳定的固态或者液态酶制剂包含阿拉伯胶和微晶纤维素。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，稳定的固态或者液态酶制剂包含植酸酶、阿拉伯胶和微晶纤维素。
在本发明的一个优选的实施方案中，稳定的固态或者液态酶制剂包含阿拉伯胶和一种或多种无机盐。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，稳定的固态或者液态酶制剂包含植酸酶、阿拉伯胶和一种或多种无机盐。
本文所用的术语“一种酶”“一种或多种酶”和“多种酶”包括单一酶和不同酶(例如植酸酶和木聚糖酶)的混合物以及不同来源(例如真菌植酸酶和细菌植酸酶)的相同酶的混合物。
用于本发明的制剂的优选的酶包含那些在食品(包括烘焙)和饲料工业中有用的酶。
这样的酶包括但不限于蛋白酶(细菌、真菌、酸、中性或者碱性)，优选具有中性和/或酸性最适pH。
蛋白酶(蛋白水解酶)可以是微生物酶，优选来源于细菌或者真菌菌株的蛋白酶，或者蛋白酶可以是胰蛋白酶或者胃蛋白酶。在一个优选的实施方案中，蛋白水解酶是来自芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株或者地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株的细菌蛋白酶。可商购的杆菌蛋白酶是AlcaseTM和NeutraseTM(Novozymes，丹麦)。在另一个优选的实施方案中，蛋白水解酶是来源于曲霉属(Aspergillus)菌株的蛋白酶，优选是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)菌株，黑曲霉(Aspergillus niger)菌株，米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株。可商购的曲霉菌蛋白酶是FlavourzymeTM(Novozymes，丹麦)。
这样的酶包括但不限于脂肪酶(真菌、细菌、哺乳动物)，优选是磷脂酶，如哺乳动物胰磷脂酶A2或者任何三酯甘油脂肪酶(E.C.3.1.1.3)。
这样的酶包括但不限于葡糖氧化酶。
这样的酶包括但不限于糖苷酶(E.C.3.2，也称为糖酶)，例如淀粉酶(α或者β)，纤维素酶(全纤维素酶或者其功能组分)，尤其是木聚糖酶、葡聚糖酶，优选是β-葡聚糖酶、半乳糖苷酶、果胶酶和-半乳糖苷酶，如α-或者β-半乳糖苷酶。
这样的酶包括但不限于磷酸酶，如植酸酶(3-植酸酶和6-植酸酶)和/或酸性磷酸酶。优选的磷酸酶是植酸酶。
糖苷酶可以是任何糖苷酶(EC 3.2.1，也称为糖酶)。优选地，糖苷酶是淀粉酶，尤其是α-淀粉酶或者β-淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶，尤其是内切-1，4-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)或者内切-1，3-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.6)、木聚糖酶，尤其是内切-1，4-β-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)或者木聚糖-内切-1，3-β-木糖苷酶(E.C.3.2.1.32)、α-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.22)、多聚半乳糖醛酸酶(E.C.3.2.1.15，也称为果胶酶)、纤维素-1，4-β-纤维二糖苷酶(cellobiosidase)(E.C.3.2.1.91，也称为纤维二糖水解酶)、内切-葡聚糖酶，尤其是内切-1，6-δ-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.75)、内切-1，2-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.71)、内切-1，3-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.39)或者内切-1，3-α-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.59)。它们也包括甘露聚糖酶(mannanases)，如β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)和甘露聚糖-内切-1，4-β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.78)。
本发明优选的内切-1，4-β-葡聚糖酶(EC.3.2.1.4)是WO 01/70998(BASFAG)中描述的内切-1，4-β-葡聚糖酶，该参考文献在此引为参考。
在一个优选的实施方案中，该酶选自磷酸酶、糖苷酶及其混合物。
在一个优选的实施方案中，该酶选自植酸酶、木聚糖酶、葡聚糖酶及其混合物。
在本发明的一个优选的实施方案中，该酶是至少一种木聚糖酶。木聚糖酶可以从微生物来源获得，例如黑曲霉、热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)、瑞氏木霉(Trichoderma reesei)、微紫青霉(Penicilliumjanthinellum)以及芽孢杆菌属和链霉菌属(Streptomyces)的种类。木聚糖酶也可以通过重组表达来获得，例如EP 121 138中描述的。在一个优选的实施方案中，可以根据本发明使用EP 0 463 706 B1(BASF AG)和/或WO02/24926 A1(BASF AG)中描述的木聚糖酶。
本发明合适的木聚糖酶可以是内切-木聚糖酶和/或外切-木聚糖酶，优选是内切-木聚糖酶，尤其是内切-β-木聚糖酶。
合适的酶是包括在动物饲料中的那些酶，所述动物饲料包括宠物食品和/或人类营养品。这些酶的功能通常是提高饲料转化率，例如通过降低粘度，或者通过降低某些饲料化合物的抗营养作用。饲料酶也可以使用，例如用来降低对环境有害的肥料中的化合物的量。
当本发明的酶制剂用于食品应用中时，酶必须是食品等级。
在本发明的范围内，使用了至少一种，优选两种，优选三种或者更多种不同的酶。这些酶可以是来自相同类别的酶，例如两种不同的植酸酶，或者来自不同种类的酶，例如植酸酶和木聚糖酶。应该理解的是不管什么时候关于该酶或酶的术语也包括酶的混合物，无论这种混合物是否能直接在单一发酵中获得，或者通过混合在不同发酵中获得的酶来获得；其进一步包括可以通过重组微生物的发酵获得的酶。
在一个优选的实施方案中，该酶是至少一种植酸酶。
术语“植酸酶(phytase)”不仅指天然产生的植酸酶，也包括具有植酸酶活性的任何酶，该活性例如催化涉及从肌醇磷酸盐中去除或者释放无机磷(磷酸盐)的反应的能力。优选地，植酸酶属于类别EC 3.1.3.8。该植酸酶可以是3-植酸酶和/或6-植酸酶。
一单位植酸酶活性(＝FTU)定义为在pH 5.5及37℃下，每分钟从0.0051mol/l的磷酸钠中释放1微摩尔无机磷的酶的量。
该分析方法基于从过量加入的植酸钠中释放无机磷酸盐。在pH 5.5和37℃下，孵育时间为60分钟。所释放的磷酸盐通过黄色钼-钒复合物来确定，在415nm波长下光度测定计算。已知活性的植酸酶标准物也平行试验作为比较。产品样品测量的吸收增加表示为与标准物的比率(相对方法，官方AOAC方法)。
植酸酶活性可以根据“Determination of Phytase Activity in Feed by aColorimetric Enzymatic Method”：Collaborative Interlaboratory StudyEngelen等人：Journal of AOAC International第84卷，第3期，2001来确定。
本发明的植酸酶可以是微生物来源和/或可以通过天然产生的植酸酶的遗传修饰获得和/或通过从头构建(遗传工程)获得。
在一个优选的实施方案中，该植酸酶是植物植酸酶、真菌植酸酶、细菌植酸酶或者可通过酵母产生的植酸酶。
植酸酶优选来自微生物来源，如细菌、真菌和酵母，但也可以是植物来源。在一个优选的实施方案中，该植酸酶来源于真菌菌株，尤其是曲霉属菌株，例如黑曲霉、米曲霉、无花果曲霉(Aspergillus ficuum)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和土曲霉(Aspergillus terreus)。最优选的植酸酶是来自黑曲霉菌株或者米曲霉菌株的植酸酶。
在另一个优选的实施方案中，该植酸酶来源于细菌菌株，尤其是芽孢杆菌属菌株或者假单胞菌属(Pseudomonas)菌株。优选地，该植酸酶来源于枯草芽孢杆菌菌株。
在另一个优选的实施方案中，该植酸酶来源于细菌菌株，尤其是大肠杆菌(E.coli)菌株。
在另一个优选的实施方案中，该植酸酶来源于酵母，尤其是克鲁维酵母菌属(Kluveromyces)菌株或者酵母属(Saccharomyces)菌株。优选地，该植酸酶来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。
本发明中“来自...的酶”包括通过特定菌株天然产生的酶，或者从该菌株回收的酶，或者由从该菌株分离的DNA序列编码的酶以及在用所述DNA序列转化的宿主微生物中产生的酶。
通过使用任何合适的技术，植酸酶可以来源于所述的微生物。尤其是，植酸酶可以通过产生植酸酶的微生物在合适的营养培养基中发酵，随后通过本领域已知的方法分离酶来获得。
用于培养的培养液或者培养基可以是适合所述的宿主细胞生长的任何传统培养基，并且可以根据现有技术的原理来构成。培养基优选含有碳源和氮源以及其他无机盐。合适的培养基，例如基本培养基或者复合培养基可以从商业供应商处获得，或者可以根据已出版的文献来制备，例如美国典型微生物保藏中心(ATCC)的菌株目录。
培养后，植酸酶通过从培养液分离并纯化蛋白质的常规方法来回收。熟知的纯化方法包括通过离心或者过滤从培养基分离细胞，通过如硫酸铵的盐沉淀培养基的蛋白质成分及层析方法，如例如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等等。
备选地，植酸酶优选使用重组DNA技术大量产生，例如EP-A1-0 420358中描述的技术，将其公开内容在此引为参考。
优选地，将用从无花果曲霉或者黑曲霉菌株获得的编码植酸酶的基因转化的曲霉菌的真菌，在EP-A1-0 420 358中描述的引导编码植酸酶的基因表达的条件下进行培养。
含植酸酶的发酵培养液在用于本发明的制剂中之前，优选通过过滤及超滤两种方法来处理。
在本发明的另一个优选实施方案中，使用通过分子工程得到的植酸酶，例如WO 94/03072(Rhm)、WO 99/49022(Novozymes)、WO 00/43503(Novozymes)或者WO 03/102174(BASF AG)中描述的遗传工程修饰的植酸酶。
本发明中优选使用的另一种植酸酶是所谓的共有(consensus)植酸酶。这是根据理论分子生物方法开发的一种植酸酶，其与曲霉菌植酸酶相比具有较高的内在稳定性，参见欧洲专利申请第897 985号。在本发明的实践中，也使用了实施例3-13中具体描述的共有植酸酶。
也可以通过遗传工程(通过将从真菌获得的基因转入宿主生物中，例如细菌(如大肠杆菌)、酵母或者另一种真菌)产生这种植酸酶，关于进一步的细节参见如欧洲专利申请第68431 3号和欧洲专利申请第897 010号。
在本发明的一个优选实施方案中，可以使用如EP-B1 420 358的植酸酶。
如果酶是磷酸酶，如植酸酶，那么固态或者液态酶制剂的活性优选将在1,000到80,000FTU/g之间，如2,000到70,000FTU/g，如3,000到60,000FTU/g，优选4,000到50,000FTU/g，如5,000到25,000FTU/g，如5,000到15,000FTU/g，如5,000到10,000FTU/g，如6,000到8,000FTU/g。
如果酶是植物细胞壁降解酶，如木聚糖酶，那么固态或者液态酶制剂的酶活性的范围将在3,000到500,000EXU/g，优选4,000到250,000EXU/g，优选5,000到100,000EXU/g，优选6,000到80,000EXU/g以及最优选在8,000到70,000EXU/g之间。
如果酶是纤维素酶，如葡聚糖酶，优选β-葡聚糖酶，那么固态或者液态酶制剂的酶活性将在100到150,000BGU/g，如500到100,000BGU/g，优选750到50,000BGU/g，优选1,000到10,000BGU/g以及最优选在1,500到7,000BGU/g之间。
一个单位的内切-木聚糖酶活性(EXU)定义为在测试条件下(pH 3.5和55℃)，每分钟释放1.00微摩尔还原糖(表示为木糖等效物)的酶的量。
一个单位的β-葡聚糖酶单位(BGU)定义为在测试条件下(pH 3.5和40℃)，每分钟释放0.258微摩尔还原糖(表示为葡萄糖等效物)的酶的量。
内切-木聚糖酶活性(EXU)和β-葡聚糖酶活性(BGU)可以根据Engelen等人的Journal of AOAC International第79卷，第5期，1019(1996)来确定。
固态制剂，例如颗粒可以包括1-20wt％，例如5-20wt％，例如7-15wt％的酶。
液态制剂可以包括0.5-20wt％，例如5-15wt％的酶。
本发明的另一个方面涉及动物饲料或者动物饲料的预混合物(premix)或者前体的制备方法，该方法包括将第1-10项中任一项和/或第26项所定义的固态和/或液态酶制剂与一种或者多种动物饲料物质(例如种子)或者成分混合。然后将其灭菌，例如经受热处理。然后，所得的组合物被恰当地加工为颗粒并且任选地被干燥。
酶补充饲料可以经受好几种饲料加工方法，像挤压、膨胀和造粒，其中可能发生短暂的高温，并且热稳定是有利的。
可以使用本发明的稳定酶制剂，例如在饲料颗粒中使用。热稳定液态酶制剂可以用自来水稀释，以便产生具有期望酶活性的溶液。在酶或者其中一种酶是植酸酶的情况下，优选稀释溶液，以便获得100-1000FTU/g，优选200-700FTU/g，尤其是300-500FTU/g活性的溶液。饲料颗粒可以被转移到机械混合器中，稀释的酶制剂被喷雾到饲料颗粒上，同时搅动，以便产生具有增加的酶活性的均匀产品。含植酸酶的饲料颗粒的实例优选产生大约500FTU/kg活性的饲料颗粒。
备选地，在该混合物经受加工如造粒、膨胀或者挤压之前，固态或者液态酶制剂可以直接与糊状饲料混合。
本发明的另一个方面涉及用于一种组合物、或者适合于人营养品的预混合物或者前体的制备方法，该方法包括将第1-10项中任一项和/或第26项中定义的固态和/或液态酶制剂与一种或者多种食品物质或者成分混合。然后对其灭菌，例如经受热处理。然后将所得到的组合物恰当地加工为颗粒，并且任选地干燥。
优选地，固态制剂(例如颗粒)和一种或多种饲料或者食品物质或者成分以如下比例混合，即颗粒：一种或多种饲料或者食品物质或者成分低于1g∶1kg，优选低于0.5g∶1kg，尤其是低于0.1g∶1kg，优选低于0.05g∶1kg。
本发明的另一个方面涉及第1-10项中任一项和/或第26项中定义的固态和/或液态酶制剂在人和/或动物营养品中的用途。因此，本发明包括组合物，如动物饲料组合物或者适于人类营养品的组合物。这些组合物优选是小丸形式(每个小丸可以有1-5，例如2-4个干颗粒)。这些组合物的含水量为8-20％，例如12-15％。酶的量可以在0.0001-0.0005wt％之间，合适地在0.0005-0.0012wt％之间，如至少5ppm。
本发明的另一个方面涉及一种为单胃动物提供饮食需要的磷的方法，其中该动物用本发明的饲料饲养，因而不需要在饲料中加入额外的磷。
另一个方面涉及一种促进动物的生长和/或提高饲料转化率的方法，该方法包括用包含如第1-10项中任一项和/或第26项中定义的固态和/或液态酶制剂的食物饲养动物。
合适地，该组合物包括0.05-2.0，如0.3-1.0，最适为0.4-0.6FTU/g的磷酸酶，例如植酸酶。木聚糖酶可以0.5-50EXU/g的量存在，例如1-40EXU/g，优选2-25EXU/g，特别优选2-15EXU/g。备选地或者此外，纤维素酶可以0.05-1.5BGU/g的量存在，如0.1-1.0BGU/g，如0.2-0.6BGU/g。
本发明的另一个方面涉及第1-10项中任一项和/或第26项中定义的固态和/或液态酶制剂在动物饲料中的用途或者用于动物食物中，或者作为动物饲料的一种组分。
当第1-10项中任一项和/或第26项中定义的固态和/或液态酶制剂供给动物和/或人时，有助于降低对环境的污染。进一步，当将它们供给动物时，可以提高用第1-10项中任一项和/或第26项中定义的固态和/或液态酶制剂饲养的动物获得的动物产品(例如内、蛋)的质量。
合适的动物包括经济动物(猪、家禽、家畜)、非反刍动物或者单胃动物(猪、禽类、家禽、海洋动物如鱼)、反刍动物(牛或者绵羊，例如奶牛、绵羊、山羊、鹿、小牛、小羊)。家禽包括鸡、母鸡、火鸡、鹅和鸭。
本发明的另一个方面涉及至少一种稳定剂在含酶组合物中改进酶的造粒稳定性的用途，该稳定剂选自阿拉伯胶、至少一种植物蛋白或其混合物。
本发明的另一个方面涉及至少一种稳定剂作为生产固态和/或液态酶制剂，优选固态酶制剂的添加剂的用途，该稳定剂选自阿拉伯胶、至少一种植物蛋白或其混合物。在本发明的该实施方案中，一种或多种稳定剂优选以固态化合物添加到标准制粒混合物中。这种制剂可以例如在高剪切制粒过程后测定植酸酶活性时产生增加的复性(高达20％)，该过程包括颗粒45℃下在流化床干燥器中15分钟的干燥步骤。此外，与没有这种添加剂的颗粒相比，当含有本发明的一种或多种稳定剂的这种颗粒与饲料和/或食物混合时，在饲料和/或食物处理(例如85℃的造粒过程)后可以显示出的酶促活性的增加复性。
本发明一个方面的优选特性和特征同样适用于本发明的另一种改变。
实施例
除非另外说明，所有百分比是(w/w)。
实施例V1(参比)
经过捏和、挤压、圆球化和干燥进行的基于玉米淀粉的酶颗粒的制备
第一步，将玉米淀粉填充到实验室混合器(Loedige Typ M5 RMK)中并缓慢搅拌。将含有植酸酶的超滤液、ZnSO4x6H2O、PVA(聚乙烯醇)和额外的水的混合物注入烧杯中并且溶解/分散。将该混合物倒在Loedige混合器中的玉米淀粉上。
然后，通过在Loedige混合器中以100-250转/分钟混合并且捏和66％(w/w)的玉米淀粉、20％(w/w)的含植酸酶的超滤液、1％(w/w)的PVA、和0.3％(w/w)ZnSO4x6H2O和12.7％(w/w)额外的水，获得含酶面团。
第二步，使用型号为DG-L1的Fuji Paudal实验室挤压机挤压该含酶面团，获得湿挤压物，然后使该挤压物在实验室滚圆机(spheroniser)制成圆形，获得平均直径为500-800μm之间的圆颗粒。
随后在流化床干燥器(Niro-Aeromatic，型号为MP-1)中将这些颗粒干燥60-90分钟，床温为大约40℃。干燥大约1.5kg的湿颗粒，随后使其冷却。所得的干酶颗粒的活性为8920FTU/g。
 实施例1   玉米淀粉   超滤液   PVA   ZnSO4x6H2O   水
 面团   66.0％   20.0％   1.0％   0.3％   12.7％
 颗粒   83.6％   8.6％   1.4％   0.4％   6.0％
实施例1：大豆蛋白作为稳定剂
根据实施例V1获得含酶(植酸酶)的颗粒。使用大豆蛋白(Supro 670；名称：IP Non GM；批号IP 094/2003，由Protein TechnologiesInternational经销，CAS号9010-10-0)代替PVA。
所得到的干酶颗粒的活性为7840FTU/g。
 实施例1   玉米淀粉   超滤液   大豆蛋白  ZnSO4x6H2O   水
 面团   62.0％   20.0％   5.0％  0.3％   12.7％
 颗粒   78.3％   8.6％   6.8％  0.4％   6.0％
实施例2：大豆蛋白作为稳定剂
根据实施例V1获得含酶(植酸酶)的颗粒。使用大豆蛋白Supro 1751(批号M 330000575，由Protein Technologies International经销，CAS号9010-10-0)代替PVA。
所得到的干酶颗粒的活性为7890FTU/g。
 实施例2   玉米淀粉   超滤液   大豆蛋白   ZnSO4x6H2O   水
 面团   53.5％   18.7％   9.4％   0.3％   18.1％
 颗粒   71.7％   8.5％   13.4％   0.4％   6.0％
实施例3：马铃薯蛋白作为稳定剂
根据实施例V1获得含酶(植酸酶)的颗粒。使用马铃薯蛋白AlburexSP(SP，由Roquette经销，CAS号100209-45-8)代替PVA。
所得到的干酶颗粒的活性为8110FTU/g。
 实施例3   玉米淀粉   超滤液   马铃薯蛋白   ZnSO4x6H2O   水
 面团   62.0％   20.0％   5.0％   0.3％   12.7％
 颗粒   78.5％   8.5％   6.6％   0.4％   6.0％
实施例4：阿拉伯胶作为稳定剂
根据实施例V1获得含酶(植酸酶)的颗粒。使用阿拉伯胶(InstantSenegal，Spraygum IRX 51693，批号3S4120，由Colloides NaturelsInternational经销，CAS号9000-01-5)代替PVA。
所得到的干酶颗粒的活性为7720FTU/g。
 实施例4   玉米淀粉   超滤液   阿拉伯胶   ZnSO4x6H2O   水
 面团   62.0％   20.0％   5.0％   0.3％   12.7％
 颗粒   78.7％   8.6％   6.3％   0.4％   6.0％
实施例5：小麦蛋白作为稳定剂
根据实施例V1获得含酶(植酸酶)的颗粒。使用小麦蛋白Solpro 100(批号E 031579，由Amylum经销，CAS号RN 100684-25-1)代替PVA。
所得到的干酶颗粒的活性为8570FTU/g。
 实施例5   玉米淀粉   超滤液   小麦蛋白   ZnSO4x6H2O   水
 面团   62.0％   20.0％   5.0％   0.3％   12.7％
 颗粒   78.3％   8.5％   6.8％   0.4％   6.0％
造粒稳定性的比较
本发明的不同酶颗粒经受造粒试验，并且将它们的造粒稳定性与根据标准配方(＝实施例V1(实施例2)制备的颗粒比较。造粒试验包括将不同的酶颗粒与标准烘烤食物以1g/kg饲料的水平混合。这种含酶的饲料通过蒸汽注射到调节装置中，然后立即造粒挤压来造粒，得到饲料小球，随后使其冷却。造粒挤压后直接测量的小球温度为78℃。该类型的过程一般用于饲料工业中，以获得饲料小球。所有实施例表明，与实施例V1相比，造粒稳定性有至少10％的增加，一些有超过20％的增加。

Claims (31)

1.一种稳定的固态或者液态酶制剂，其包含至少一种酶和至少一种选自阿拉伯胶、至少一种植物蛋白及其混合物的稳定剂。
2.根据权利要求1所述的酶制剂，其中所述酶选自磷酸酶、糖苷酶及其混合物。
3.根据任一前述权利要求所述的酶制剂，其中所述酶选自植酸酶、木聚糖酶、葡聚糖酶及其混合物。
4.根据任一前述权利要求所述的酶制剂，其中所述酶是植酸酶，优选植物植酸酶、真菌植酸酶、细菌植酸酶、通过酵母产生的植酸酶或共有植酸酶。
5.根据任一前述权利要求所述的酶制剂，其中所述植物蛋白选自谷物蛋白、豆类蛋白、蔬菜蛋白、水果蛋白、它们的水解产物及其混合物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的酶制剂，其中所述制剂是液态的。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的酶制剂，其中所述制剂是固态的。
8.根据权利要求7所述的酶制剂，其中所述固态制剂是一个或多个颗粒的形式。
9.根据权利要求8所述的酶制剂，其中所述一个或多个颗粒包含至少一种酶，一种包括至少15％(w/w)可食用糖类聚合物的固相载体和至少一种稳定剂，其中所述稳定剂选自阿拉伯胶、至少一种植物蛋白及其混合物。
10.根据权利要求9所述的酶制剂，其中所述一个或多个颗粒是包衣的。
11.一种制备一个或多个含酶颗粒的方法，所述方法包括加工：
(i)至少一种酶，
(ii)包括至少15％(w/w)可食用糖类聚合物的固相载体，及
(iii)至少一种稳定剂，其中所述稳定剂选自阿拉伯胶、至少一种植物蛋白及其混合物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中水被加入到所述加工中。
13.根据权利要求11-12中任一项所述的方法，其中所述水和酶以一种或多种含酶水性液体提供。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述液体是来源于导致酶产生的发酵过程的滤液。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述颗粒在所述加工后被干燥。
16.根据权利要求11-15中任一项所述的方法，其中所述植物蛋白选自谷物蛋白、豆类蛋白、蔬菜蛋白、水果蛋白、它们的水解产物及其混合物。
17.根据权利要求11-16中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
a)将含所述酶的水性液体与所述固相载体及所述稳定剂混合；
b)机械加工a)中获得的混合物，以便得到含酶颗粒；及
c)干燥b)中获得的一个或多个含酶颗粒。
18.根据权利要求11-17中任一项所述的方法，其中所述加工是机械的，并且包括挤压、造粒、高剪切制粒、膨胀、流化床成团、滚圆、鼓式制粒或者其组合。
19.根据权利要求11-18中任一项所述的方法，其中混合含酶水性液体、所述固相载体和所述稳定剂，并且在制粒前捏合所得的混合物。
20.根据权利要求11-19中任一项所述的方法，其中所述加工是在低压和/或在篮式或者圆顶式挤压机中进行的挤压。
21.根据权利要求11-20中任一项所述的方法，其中所述一个或多个颗粒是滚圆的。
22.根据权利要求11-21中任一项所述的方法，其中所述一个或多个颗粒是包衣的。
23.根据权利要求11-22中任一项所述的方法，其中所述酶选自磷酸酶、糖苷酶及其混合物。
24.根据权利要求11-23中任一项所述的方法，其中所述酶是植酸酶，优选是植物植酸酶、真菌植酸酶、细菌植酸酶、通过酵母产生的植酸酶或者共有植酸酶。
25.根据权利要求11-24中任一项所述的方法，其中如果所述酶是植酸酶，那么所述一个或多个颗粒具有的植酸酶活性的范围将在1,000到80,000FTU/g之间，优选在2,000到70,000FTU/g之间，优选在3,000到60,000FTU/g之间，更优选在4,000到50,000FTU/g之间，更优选在5,000到15,000FTU/g之间。
26.通过权利要求11-25中任一项所述的方法获得的一个或多个含酶颗粒。
27.一种制备动物饲料、或者动物饲料的预混合物或前体的方法，所述方法包括将根据权利要求1-10中任一项和/或权利要求26所述的稳定的固态和/或液态制剂与一种或者多种动物饲料物质或者成分混合。
28.一种制备适用于人类营养品的组合物、或者预混合物或前体的方法，所述方法包括将根据权利要求1-10中任一项和/或权利要求26的稳定的固态和/或液态制剂与一种或者多种食品物质或者成分混合。
29.根据权利要求27-28中任一项所述的方法，其中所述一种或者多种饲料或食物与根据权利要求1-10中任一项和/或权利要求26的稳定的固态和/或液态制剂的混合物被灭菌或蒸汽处理、造粒并且任选地干燥。
30.根据权利要求1-10中任一项和/或权利要求26的稳定的固态和/或液态制剂在人和/或动物营养品中的用途。
31.一种用于促进动物生长和/或提高饲料转换率的方法，所述方法包括用包含根据权利要求1-10中任一项和/或权利要求26的稳定的固态和/或液态制剂的食物饲养动物。
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