DE60215534T2

DE60215534T2 - Antimikrobielle polypeptide aus pseudoplectania nigrella

Info

Publication number: DE60215534T2
Application number: DE60215534T
Authority: DE
Inventors: Matthew Kirk SCHNORR; Trier Mogens Hansen; Holse Per MYGIND; Raventos Dorotea SEGURA; Hans-Henrik Kristensen Hogenhaug
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes Biopharma DK AS
Priority date: 2001-11-20
Filing date: 2002-11-20
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2022-11-21
Also published as: JP2005533481A; BR0214302A; EP1448595A1; PL209403B1; PL371388A1; IL161769A; CA2467927A1; RU2336278C2; HUP0402271A3; AU2002349293B2; MXPA04004704A; ATE342917T1; NO20042570L; NZ532962A; CN1606567B; PT1448595E; US20050124064A1; CA2467927C; WO2003044049A1; EP1448595B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide mit antimikrobieller Aktivität und Polynukleotide, die eine Nukleotidsequenz aufweisen, welche die Polypeptide kodiert. Die Erfindung betrifft ebenfalls Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Wirtszellen, welche die Nukleinsäurekonstrukte umfassen, sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung der Polypeptide.
HINTERGRUND
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Polypeptide mit antimikrobieller Aktivität und Polynukleotide, welche die Polypeptide kodieren, bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG
In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid mit antimikrobieller Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einem Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 65 % Identität mit den Aminosäuren 1 bis 40 aus SEQ ID NR: 2 aufweist;
(b) einem Polypeptid, welches durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, welche unter mittleren Stringenzbedingungen, unter Verwendung von 0,2 × SSC bei 42 °C zum Waschen, mit einer Polynukleotidsonde, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
(i) dem komplementären Strang der Nukleotide 166 bis 285 aus SEQ ID NR: 1,
(ii) dem komplementären Strang der Nukleotide 70 bis 285 aus SEQ ID NR: 1, und
(iii) dem komplementären Strang der Nukleotide 1 bis 285 aus SEQ ID NR: 1; hybridisiert, und
(c) einem Fragment von (a) oder (b), das antimikrobielle Aktivität aufweist.

In einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Polynukleotide, die eine Nukleotidsequenz aufweisen, welche das Polypeptid der Erfindung kodiert.
In einem dritten Aspekt betriff die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt, welches die Nukleotidsequenz umfasst, die das Polypeptid der Erfindung kodiert, die funktionsfähig mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen verknüpft ist, welche die Herstellung des Polypeptids in einem geeigneten Wirt steuert/steuern, umfasst.
In einem vierten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen rekombinanten Expressionsvektor, welcher das Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung umfasst.
In einem fünften Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine rekombinante Wirtszelle, welche das Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung umfasst.
In einem sechsten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der Erfindung, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Kultivieren eines Stammes, der in seiner Wildtypform in der Lage ist, das Polypeptid herzustellen, zur Herstellung des Polypeptids; und
(b) Gewinnen des Polypeptids.

In einem siebten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der Erfindung, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Kultivieren einer rekombinanten Wirtszelle der Erfindung unter Bedingungen, die der Herstellung des Polypeptids zuträglich sind; und
(b) Gewinnen des Polypeptids.

Andere Aspekte der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung und den angefügten Ansprüchen.
DEFINITIONEN
Vor Erläuterung der vorliegenden Erfindung in weiteren Details, werden zuerst die folgenden Begriffe und gebräuchlichen Ausdrücke definiert:
Im Wesentlichen reines Polypeptid: In dem vorliegenden Zusammenhang bezeichnet der Begriff „im Wesentlichen reines Polypeptid" eine Polypeptidzubereitung, welche höchstens 10 Gew.-% an anderem Polypeptidmaterial enthält, mit dem es nativ assoziiert ist (geringere Prozentsätze an anderem Polypeptidmaterial sind bevorzugt, z. B. höchstens 8 Gew.-%, höchstens 6 Gew.-%, höchstens 5 Gew.-%, höchstens 4 %, höchstens 3 Gew.-%, höchstens 2 Gew.-%, höchstens 1 Gew.-% und höchstens ½ Gew.-%). Demnach ist es bevorzugt, dass das im Wesentlichen reine Polypeptid mindestens 92 % rein ist, d.h., dass das Polypeptid mindestens 92 Gew.-% des gesamten Polypeptidmaterials, das in der Zubereitung vorhanden ist, darstellt, wobei höhere Prozentsätze bevorzugt sind, wie mindestens 94 % rein, mindestens 95 % rein, mindestens 96 % rein, mindestens 96 % rein, mindestens 97 % rein, mindestens 98 % rein, mindestens 99 % rein und höchstens 99,5 % rein. Die hierin offenbarten Polypeptide liegen vorzugsweise in einer im Wesentlichen reinen Form vor. Insbesondere ist es bevorzugt, dass die hierin offenbarten Polypeptide in „tatsächlich reiner Form" vorliegen, d.h., dass die Polypeptidzubereitung tatsächlich frei von anderem Polypeptidmaterial ist, mit dem sie nativ assoziiert ist. Dies kann beispielsweise erreicht werden, indem das Polypeptid mittels gut bekannter rekombinanter Verfahren hergestellt wird. Der Begriff „im Wesentlichen reines Polypeptid" hierin, ist synonym zu den Begriffen „isoliertes Polypeptid" und „Polypeptid in isolierter Form".
Antimikrobielle Aktivität: Der Begriff „antimikrobielle Aktivität" wird hierin als eine Aktivität definiert, welche in der Lage ist, das Wachstum von mikrobiellen Zellen abzutöten oder zu inhibieren. In dem Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „antimikrobiell", dass eine bakterizide und/oder eine bakteriostatische und/oder fungizide und/oder fungistatische Wirkung und/oder eine viruzide Wirkung vorliegt, wobei der Begriff „bakterizid" als die Fähigkeit, bakterielle Zellen abzutöten, zu verstehen ist. Der Begriff „bakteriostatisch" ist als Fähigkeit, bakterielles Wachstum zu inhibieren, zu verstehen, d.h. das Wachstum bakterieller Zellen zu inhibieren. Der Begriff „fungizid" ist als die Fähigkeit zu verstehen, Pilzzellen abzutöten. Der Begriff „fungistatisch" ist als die Fähigkeit zu verstehen, ein Pilzwachstum zu inhibieren, d.h. das Wachsen von Pilzzellen zu inhibieren. Der Begriff „viruzid" ist als die Fähigkeit zu verstehen, einen Virus zu inaktivieren. Der Begriff „mikrobielle Zellen" bezeichnet bakterielle Zellen oder Pilzzellen (einschließlich Hefen).
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Inhibieren des Wachstums von mikrobiellen Zellen", dass die Zellen im nicht-wachsenden Zustand sind, d.h. dass sie nicht in der Lage sind sich zu vermehren.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann eine antimikrobielle Aktivität gemäß der Vorgehensweise bestimmt werden, die von Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, Bd. 137 (2), S. 167 – 174 (1991) beschrieben wird.
Polypeptide mit antimikrobieller Aktivität können in der Lage sein, die Anzahl von lebenden Zellen von Escherichia coli (DSM 1576) auf 1/100 nach 30 Minuten Inkubation bei 20 °C in einer wässrigen Lösung von 25 % (w/w); bevorzugt in einer wässrigen Lösung von 10 % (w/w); stärker bevorzugt in einer wässrigen Lösung von 5 % (w/w); noch stärker bevorzugt in einer wässrigen Lösung von 1 % (w/w); am stärksten bevorzugt in einer wässrigen Lösung von 0,5 % (w/w); und insbesondere in einer wässrigen Lösung von 0,1 % (w/w) der Polypeptide mit antimikrobieller Aktivität zu reduzieren.
Polypeptide mit antimikrobieller Aktivität können ebenfalls in der Lage sein, den Auswuchs („outgrowth") von Eschericia coli (DSM 1576) für 24 Stunden bei 25 °C in einem mikrobiellen Wachstumssubstrat zu inhibieren, wenn sie in einer Konzentration von 1000 ppm hinzugefügt werden; bevorzugt, wenn sie in einer Konzentration von 500 ppm hinzugefügt werden; stärker bevorzugt, wenn sie in einer Konzentration von 250 ppm hinzugefügt werden; noch stärker bevorzugt, wenn sie in einer Konzentration von 100 ppm hinzugefügt werden; am stärksten bevorzugt, wenn sie in einer Konzentration von 50 ppm hinzugefügt werden; und insbesondere, wenn sie in einer Konzentration von 25 ppm hinzugefügt werden.
Polypeptide mit antimikrobieller Aktivität können in der Lage sein, die Anzahl an lebenden Zellen von Bacillus subtilis (ATCC 6633) auf 1/100 nach 30 Minuten Inkubation bei 20 °C in einer wässrigen Lösung von 25 % (w/w), bevorzugt in einer wässrigen Lösung von 10 % (w/w); stärker bevorzugt in einer wässrigen Lösung von 5 % (w/w); noch stärker bevorzugt in einer wässrigen Lösung von 1 % (w/w); am stärksten bevorzugt in einer wässrigen Lösung von 0,5 % (w/w); und insbesondere in einer wässrigen Lösung von 0,1 % (w/w) der Polypeptide mit antimikrobieller Aktivität zu reduzieren.
Polypeptide mit antimikrobieller Aktivität können ebenfalls in der Lage sein, den Auswuchs von Bacillus subitilis (ATCC 6633) für 24 Stunden bei 25 °C in einem mikrobiellen Wachstumssubstrat zu inhibieren, wenn sie in einer Konzentration von 1000 ppm hinzugefügt werden; bevorzugt, wenn sie in einer Konzentration von 500 ppm hinzugefügt werden; stärker bevorzugt, wenn sie in einer Konzentration von 250 ppm hinzugefügt werden; noch stärker bevorzugt, wenn sie in einer Konzentration von 100 ppm hinzugefügt werden; am stärksten bevorzugt, wenn sie in einer Konzentration von 50 ppm hinzugefügt werden; und insbesondere, wenn sie in einer Konzentration von 25 ppm hinzugefügt werden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung sollten mindestens 20 % der antimikrobiellen Aktivität des Polypeptids aufweisen, welches aus der Aminosäuresequenz besteht, die als Aminosäuren 1 bis 40 aus SEQ ID NR: 2 gezeigt ist. In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform sollten die Polypeptide mindestens 40 %, wie mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 60 %, wie mindestens 70 %, stärker bevorzugt mindestens 80 %, wie mindestens 90 %, am stärksten bevorzugt mindestens 95 %, wie ungefähr oder mindestens 100 % der antimikrobiellen Aktivität des Polypeptids aufweisen, das aus der Aminosäuresequenz besteht, die als Aminosäuren 1 bis 40 aus SEQ ID NR: 2 gezeigt ist.
Identität: In dem vorliegenden Zusammenhang wird die Homologie zwischen zwei Aminosäuresequenzen oder zwischen zwei Nukleotidsequenzen durch den Parameter „Identität" beschrieben.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Identitätsgrad zwischen zwei Aminosäuresequenzen unter der Verwendung des Programms FASTA, das in der Version 2.0x des FASTA-Programmpakets enthalten ist, bestimmt (siehe W. R. Pearson und D. J. Lipman (1988), „Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85: 2444 – 2448; und W. R. Pearson (1990) „Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183: 63 – 98). Die verwendete „scoring matrix" war BLOSUM50, die „gap penalty" betrug –12 und die „gap extension penalty" betrug –2.
Der Identitätsgrad zwischen zwei Nukleotidsequenzen wird unter Verwendung des gleichen Algorithmus und Softwarepakets, wie oben beschrieben, bestimmt. Die verwendete „scoring matrix" war die Identitätsmatrix, die „gap penalty" betrug –16 und die „gap extension penalty" betrug –4.
Fragment: Wenn hierin verwendet, stellt ein „Fragment" aus SEQ ID NR: 2 ein Polypeptid dar, bei welchem eine oder mehrere Aminosäuren von dem Amino- und/oder Carboxyl-Terminus dieser Aminosäuresequenz deletiert sind.
Allele Variante: In dem vorliegenden Zusammenhang bezeichnet der Begriff „allele Variante" eine beliebige von zwei oder mehreren alternativen Formen eines Gens, welches denselben chromosomalen Ort besetzt. Eine allele Variation tritt auf natürliche Weise durch Mutation auf und kann in einem Polymorphismus innerhalb der Populationen resultieren. Genmutationen können still sein (keine Veränderung in dem kodierten Polypeptid) oder können Polypeptide kodieren, die veränderte Aminosäuresequenzen aufweisen. Eine allele Variante eines Polypeptids ist ein Polypeptid, das durch eine allele Variante eines Gens kodiert wird.
Im Wesentlichen reines Polynukleotid: Der Begriff „im Wesentlichen reines Polynukleotid" wir hierin verwendet, bezieht sich auf eine Polynukleotidzubereitung, wobei das Polynukleotid aus seinem natürlichen genetischen Milieu entfernt worden ist, und damit frei von anderen fremden oder unerwünschten kodierenden Sequenzen ist, und in einer Form vorliegt, die für die Verwendung in gentechnischen System zur Proteinherstellung ist. Somit enthält ein im Wesentlichen reines Polynukleotid höchstens 10 Gew.-% an anderem Polynukleotidmaterial, mit dem es nativ assoziiert ist (geringere Prozentsätze an anderem Polynukleotidmaterial sind bevorzugt, d.h. höchstens 8 Gew.-%, höchstens 6 Gew.-%, höchstens 5 Gew.-%, höchstens 4 %, höchstens 3 Gew.-%, höchstens 2 Gew.-%, höchstens 1 Gew.-% und höchstens ½ Gew.-%). Ein im Wesentlichen reines Polynukleotid kann jedoch natürlich auftretende 5'- und 3'-nicht-translatierte Regionen einschließen, wie Promotoren und Terminatoren. Es ist bevorzugt, dass das im Wesentlichen reine Polynukleotid mindestens 92 % rein ist, d.h., dass das Polynukleotid mindestens 92 Gew.-% des gesamten in der Zubereitung vorhandenen Polynukleotidmaterials darstellt, wobei höhere Prozentsätze bevorzugt sind, wie mindestens 94 % rein, mindestens 95 % rein, mindestens 96 % rein, mindestens 96 % rein, mindestens 97 % rein, mindestens 98 % rein, mindestens 99 % rein, und mindestens 99,5 % rein. Die hierin offenbarten Polynukleotide liegen vorzugsweise in einer im Wesentlichen reinen Form vor. Insbesondere ist es bevorzugt, dass die hierin offenbarten Polynukleotide in „tatsächlich reiner Form" vorliegen, d.h., dass die Polynukleotidzubereitung tatsächlich frei von anderem Polynukleotidmaterial ist, mit welchem sie nativ assoziiert ist. Der Begriff „im Wesentlichen reines Polynukleotid" hierin, ist synonym mit den Begriffen „isoliertes Polynukleotid" und „Polynukleotid in isolierter Form".
Modifikation(en): In dem Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Modifikation(en)" jede beliebige chemische Modifikation des Polypeptids, das aus der Aminosäuresequenz, gezeigt als Aminosäuren 1 bis 40 aus SEQ ID NR: 2 besteht, ebenso wie genetische Manipulation der DNA, die das Polypeptid kodiert. Die Modifikation(en) kann/können ein Austausch/Austausche der Aminosäureseitenkette(n), Substitution(en), Deletion(en) und/oder Insertion(en) in oder an der/den interessanten Aminosäure(n) sein.
Künstliche Variante: Wenn hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „künstliche Variante" ein Polypeptid mit antimikrobieller Aktivität, welches von einem Organismus produziert worden ist, der ein modifiziertes Gen im Vergleich zu SEQ ID NR: 1 exprimiert. Das modifizierte Gen, von welchem die Variante produziert wird, wenn es in einem geeigneten Wirt exprimiert wird, wird durch humane Intervention („human intervention") erhalten, indem die in SEQ ID NR: 1 offenbarte Nukleotidsequenz modifiziert wird.
cDNA: Der Begriff „cDNA", wenn er in dem vorliegenden Zusammenhang verwendet wird, erfasst ein DNA-Molekül, welches durch reverse Transkription von einem reifen, gespleißten, mRNA-Molekül, das von einer eukaryotischen Zelle abgeleitet ist, zubereitet werden kann. Einer cDNA fehlen die Intronsequenzen, die gewöhnlicherweise in der entsprechenden genomischen DNA vorhanden sind. Das primäre RNA-Ausgangstranskript ist ein Vorläufer der mRNA und durchläuft eine Reihe von Prozessierungsereignissen, bevor es als reife gespleißte mRNA erscheint. Diese Ereignisse schließen das Entfernen von Intronsequenzen durch einen Prozess, der als Spleißen bezeichnet wird, ein. Wenn eine cDNA von einer mRNA abgeleitet wird, fehlen ihr daher Intronsequenzen.
Nukleinsäurekonstrukt: Wenn hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Nukleinsäurekonstrukt" ein Nukleinsäuremolekül, entweder einzel- oder doppelsträngig, welches von einem natürlich auftretenden Gen isoliert wird, oder welches modifiziert worden ist, um Segmente von Nukleinsäuren in einer Art zu enthalten, die ansonsten in der Natur nicht existieren würde. Der Begriff Nukleinsäurekonstrukt ist synonym zu dem Begriff „Expressionskassette", wenn das Nukleinsäurekonstrukt die Kontrollsequenzen enthält, die für die Expression einer kodierenden Sequenz der vorliegenden Erfindung erforderlich sind.
Kontrollsequenz: Der Begriff „Kontrollsequenz" wird hierin so definiert, alle Komponenten einzuschließen, die erforderlich oder vorteilhaft für die Expression eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung sind. Jede Kontrollsequenz kann nativ oder fremd zu der Nukleotidsequenz, welche das Polypeptid kodiert, sein. Solche Kontrollsequenzen schließen ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt, einen Leader, eine Polyadenylierungssequenz, eine Propeptidsequenz, einen Promotor, eine Signalpeptidsequenz und einen Transkriptionsterminator. Die Kontrollsequenzen schließen mindestens einen Promotor und Transkriptions- und Translations-Stoppsignale ein. Die Kontrollsequenzen können mit Linkern ausgeatattet sein, um spezifische Restriktionsstellen einzuführen, welche die Ligation der Kontrollsequenzen mit der kodierenden Region der Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, vereinfachen.
Funktionsfähig verknüpft: Der Begriff „funktionsfähig verknüpft" wird hierin als eine Anordnung definiert, in welcher eine Kontrollsequenz auf geeignete Weise an einer Position platziert ist, die relativ zu der kodierenden Sequenz der DNA-Sequenz liegt, so dass die Kontrollsequenz die Expression eines Polypeptids steuert.
Kodierende Sequenz: Wenn hierin verwendet, deckt der Begriff „kodierende Sequenz" eine Nukleotidsequenz ab, welche direkt die Aminosäuresequenz ihres Proteinprodukts bestimmt. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden im Allgemeinen durch einen offenen Leserahmen bestimmt, welcher gewöhnlicherweise mit dem ATG-Startkodon beginnt. Die kodierende Sequenz schließt typischerweise DNA, cDNA und rekombinante Nukleotidsequenzen ein.
Expression: In dem vorliegenden Zusammenhang schließt der Begriff „Expression" jeden beliebigen Schritt ein, der in die Herstellung des Polypeptids involviert ist, einschließlich, jedoch nicht hierauf beschränkt, Transkription, post-transkriptionale Modifikation, Translation, posttranslationale Modifikation und Sekretion.
Expressionsvektor: In dem vorliegenden Zusammenhang deckt der Begriff „Expressionsvektor" ein DNA-Molekül, linear oder zirkulär, ab, das ein Segment umfasst, welches ein Polypeptid der Erfindung kodiert, und welches funktionsfähig mit zusätzlichen Segmenten, die für seine Transkription sorgen, funktionsfähig verknüpft ist.
Wirtszelle: Der Begriff „Wirtszelle", wie hierin verwendet, schließt jeden beliebigen Zelltyp ein, welcher für die Transformation mit einem Nukleinsäurekonstrukt geeignet (empfänglich) ist.
Die Begriffe „Polynukleotidsonde", „Hybridisierung", ebenso wie die verschiedenen Stringenzbedingungen, werden in dem Abschnitt mit dem Titel „Polypeptide mit antimikrobieller Aktivität" beschrieben.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Polypeptide mit antimikrobieller Aktivität
In einer ersten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Polypeptide mit antimikrobieller Aktivität, und wobei die Polypeptide eine Aminosäuresequenz umfassen, bevorzugt aus ihr bestehen, welche einen Identitätsgrad mit den Aminosäuren 1 bis 40 aus SEQ ID NR: 2 (d.h. dem reifen Polypeptid) von mindestens 65 %, bevorzugt mindestens 70 %, z. B. mindestens 75 %, stärker bevorzugt mindestens 80 %, wie mindestens 85 %, noch stärker bevorzugt mindestens 90 %, am stärksten bevorzugt mindestens 95 %, z. B. mindestens 96 %, wie mindestens 97 %, und noch stärker bevorzugt mindestens 98 %, wie mindestens 99 % aufweist (nachfolgend „homologe Peptide"). In einer interessanten Ausführungsform unterscheidet sich die Aminosäuresequenz in höchstens zehn Aminosäuren (z. B. durch zehn Aminosäuren), insbesondere durch höchstens fünf Aminosäuren (z. B. durch fünf Aminosäuren), wie durch höchstens vier Aminosäuren (z. B. durch vier Aminosäuren), z. B. durch höchstens drei Aminosäuren (z. B. durch drei Aminosäuren) von den Aminosäuren 1 bis 40 aus SEQ ID NR: 2. In einer besonders interessanten Ausführungsform unterscheidet sich die Aminosäuresequenz durch höchstens zwei Aminosäuren (z. B. durch zwei Aminosäuren), wie durch eine Aminosäure von den Aminosäuren 1 bis 40 aus SEQ ID NR: 2.
Bevorzugt umfassend die Polypeptide der vorliegenden Erfindung die Aminosäuresequenz aus SEQ ID NR: 2 oder ein Fragment hiervon, das antimikrobielle Aktivität aufweist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polypeptid der vorliegenden Erfindung die Aminosäuren 1 bis 40 aus SEQ ID NR: 2. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das Polypeptid aus den Aminosäuren 1 bis 40 aus SEQ ID NR: 2.
Die Aminosäuren, aus denen das Polypeptid der Erfindung aufgebaut ist, können unabhängig voneinander aus D- oder L-Formen ausgewählt sein.
Das Polypeptid der Erfindung kann ein Wildtyp-Polypeptid sein, welches antimikrobielle Aktivität aufweist, das aus einer natürlichen Quelle identifiziert und isoliert wird. Nach solchen Wildtyp-Polypeptiden kann spezifisch gescreent werden, durch im Stand der Technik bekannte Standardtechniken. Weiterhin kann das Polypeptid der Erfindung durch DNA-Shuffling-Technik hergestellt werden, wie in J. E. Ness et al. Nature Biotechnology 17, 893 – 896 (1999) beschrieben.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ein Gen aus Pseudoplectania nigrella isoliert, welches ein Polypeptid mit antimikrobieller Aktivität kodiert. Der Stamm Pseudoplectania nigrella, der das Gen beherbergt, wurde gemäß des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren am 28. Januar 1997 bei dem Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Niederlande (alternativ P.O. Box 85167, 3508 AD Utrecht, Niederlande) hinterlegt und mit der Zugriffsnummer CBS 44497 bezeichnet.
In einer dritten Ausführungform betrifft die vorliegende Erfindung Polypeptide mit antimikrobieller Aktivität, welche durch Nukleotidsequenzen kodiert werden, die unter mittleren Stringenzbedingungen, stärker bevorzugt unter mittleren bis hohen Stringenzbedingungen, noch stärker bevorzugt unter hohen Stringenzbedingungen und am meisten bevorzugt unter sehr hohen Stringenzbedingungen mit einer Polynukleotidsonde hybridisieren, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (i) dem komplementären Strang der Nukleotide 166 bis 285 aus SEQ ID NR: 1, (ii) dem komplementären Strang der cDNA-Sequenz, die in den Nukleotiden 70 bis 285 aus SEQ ID NR: 1 enthalten ist, und (iii) dem komplementären Strang der Nukleotide 1 bis 285 aus SEQ ID NR: 1 (J. Sambrook, E. F. Fritsch, und T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor, New York).
Die Nukleotidsequenz aus SEQ ID NR: 1 oder eine Untersequenz davon, ebenso wie die Aminosäuresequenz aus SEQ ID NR: 2 oder ein Fragment davon, können verwendet werden, um gemäß im Stand der Technik gut bekannten Verfahren eine Polynukleotidsonde zum Identifizieren und Klonieren von DNA, die Polypeptide mit antimikrobieller Aktivität von Stämmen verschiedener Gattungen oder Arten kodiert, zu gestalten. Insbesondere können solche Sonden für die Hybridisierung mit der genomischen oder der cDNA der interessierenden Gattung oder Art verwendet werden, gefolgt von Southern Blotting Standardvorgehensweisen, um das entsprechende Gen darin zu identifizieren und zu isolieren. Solche Sonden können beträchtlich kürzer sein als die gesamte Sequenz, sollten jedoch eine Länge von mindestens 15, bevorzugt mindestens 25, stärker bevorzugt mindestens 35 Nukleotiden haben, wie eine Länge von mindestens 70 Nukleotiden. Es ist jedoch bevorzugt, dass die Polynukleotidsonde eine Länge von mindestens 100 Nukleotiden hat. Zum Beispiel kann die Polynukleotidsäure eine Länge von mindestens 200 Nukleotide, eine Länge von mindestens 300 Nukleotiden, eine Länge von mindestens 400 Nukleotide oder eine Länge von mindestens 500 Nukleotide haben. Noch längere Sonden können verwendet werden, z. B. Polynukleotidsonden, welche eine Länge von mindestens 600 Nukleotide, eine Länge von mindestens 700 Nukleotide, eine Länge von mindestens 800 Nukleotide oder eine Länge von mindestens 900 Nukleotide haben. Sowohl DNA- als auch RNA-Sonden können verwendet werden. Die Sonden werden typischerweise zum Detektieren des entsprechenden Gens markiert (z. B. mit ³²P, ³H, ³⁵S, Biotin oder Avidin).
Demnach kann eine genomische DNA- oder cDNA-Bibliothek, die von solchen anderen Organismen hergestellt wird, nach DNA gescreent (durchmustert) werden, welche mit den oben beschriebenen Sonden hybridisiert, und welche ein Polypeptid mit antimikrobieller Aktivität kodiert. Genomisch oder andere DNA von solchen anderen Organismen kann durch Agarose- oder Polyacrylamidgelelektrophorese oder durch andere Separierungstechniken separiert werden. DNA aus den Bibliotheken oder die separierte DNA kann auf Nitrocellulose oder andere geeigneten Trägermaterialien transferiert werden und immobilisiert werden. Um einen Klon oder eine DNA, der/die homolog zu SEQ ID NR: 1 ist, zu identifizieren, wird das Trägermaterial mit der immobilisierten DNA in einem Southern Blot verwendet.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung zeigt eine Hybridisierung an, dass die Nukleotidsequenz mit einer markierten Polynukleotidsonde hybridisiert, die mit der in SEQ ID NR: l gezeigten Nukleotidsequenz hybridisiert, unter sehr niedrigen bis sehr hohen Stringenzbedingungen. Moleküle, mit denen die Polynukleotidsonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, können unter Verwendung eines Röntgenfilms oder durch jedes beliebige andere im Stand der Technik bekannte Verfahren detektiert werden. Wann immer der Begriff „Polynukleotidsonde" in dem vorliegenden Zusammenhang verwendet wird, ist zu verstehen, dass eine solche Sonde mindestens 15 Nukleotide enthält.
In einer interessanten Ausführungsform ist die Polynukleotidsonde der komplementäre Strang der Nukleotide 166 bis 286, der Nukleotide 70 bis 285 oder der Nukleotide 1 bis 285 aus SEQ ID NR: 1.
In einer anderen interessanten Ausführungsform ist die Polynukleotidsonde der komplementäre Strang der Nukleotidsequenz, welche das Polypeptid aus SEQ ID NR: 2 kodiert. In einer weiteren interessanten Ausführungsform ist die Polynukleotidsonde der komplementäre Strang aus SEQ ID NR: 1. In noch einer weiteren interessanten Ausführungsform ist die Polynukleotidsonde der komplementäre Strang, der für das reife Polypeptid kodierenden Region aus SEQ ID NR: 1.
Für lange Sonden mit einer Länge von mindestens 100 Nukleotiden, werden sehr niedrige bis sehr hohe Stringenzbedingungen definiert als Prähybridisierung und Hybridisierung bei 42 °C in 5 × SSPE, 1,0 % SDS, 5 × Denhardt's Lösung, 100 μg/ml gescherter und denaturierter Lachssperma-DNA, gefolgt von Southern Blotting-Standardvorgehensweisen. Vorzugsweise enthalten die langen Sonden mit mindestens 100 Nukleotiden nicht mehr als 1000 Nukleotide. Für lange Sonden mit einer Länge von mindestens 100 Nukleotiden, wird das Trägermaterial am Schluss dreimal für jeweils 15 Minuten unter Verwendung von 2 × SSC, 0,1 % SDS bei 42 °C gewaschen (sehr niedrige Stringenz), bevorzugt dreimal für jeweils 15 Minuten unter Verwendung von 0,5 × SSC, 0,1 % SDS bei 42 °C gewaschen (niedrige Stringenz), stärker bevorzugt dreimal für jeweils 15 Minuten unter Verwendung von 0,2 × SSC, 0,1 % SDS bei 42 °C gewaschen (mittlere Stringenz), noch stärker bevorzugt dreimal für jeweils 15 Minuten unter Verwendung von 0,2 × SSC, 0,1 % SDS und 55 °C gewaschen (mittlere bis hohe Stringenz), am stärksten bevorzugt dreimal für jeweils 15 Minuten unter Verwendung von 0,1 × SSC, 0,1 % SDS bei 60 °C gewaschen (hohe Stringenz), und insbesondere dreimal für jeweils 15 Minuten unter Verwendung von 0,1 × SSC, 0,1 % SDS bei 68 °C gewaschen (sehr hohe Stringenz).
Obwohl es nicht insbesondere bevorzugt wird, ist in Erwägung zu ziehen, dass kürzere Sonden, z. B. Sonden, welche eine Länge von ungefähr 15 bis 99 Nukleotiden haben, wie eine Länge von ungefähr 15 bis ungefähr 70 Nukleotiden, ebenfalls verwendet werden können. Für solche kurzen Sonden sind die Stringenzbedingungen definiert als Prähybridisierung, Hybridisierung und einem Waschen nach der Hybridisierung bei 5 °C bis 10 °C unterhalb der berechneten T_m unter Verwendung der Berechnung nach Bolton und McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390) in 0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl, pH 7,6, 6 mM EDTA, 0,5 % NP-40, 1 × Denhardt's Lösung, 1 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Natrium-einwertiges Phosphat, 0,1 mM ATP und 0,2 mg Hefe-RNA pro ml, unter Befolgen von Southern Blotting-Standardvorgehensweisen folgend.
Für kurze Sonden, welche eine Länge von ungefähr 15 Nukleotiden bis 99 Nukleotiden haben, wird das Trägermaterial einmal in 6 × SSC plus 0,1 % SDS für 15 Minuten und zweimal für jeweils 15 Minuten unter Verwendung von 6 × SSC bei 5 °C bis 10 °C unterhalb der berechneten T_m gewaschen.
N-terminale Extension
Eine N-terminale Extension (Verlängerung) kann geeigneterweise aus von 1 bis 50 Aminosäuren, bevorzugt 2 bis 20 Aminosäuren, besonders 3 bis 15 Aminosäuren, bestehen. In einer Ausführungsform enthält eine N-terminate Peptidverlängerung kein Arg (R). In einer anderen Ausführungsform umfasst die N-terminale Extension eine kex2- oder kex2-ähnliche Schnittstelle, wie sie nachfolgend näher definiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die N-terminale Extension ein Peptid, welches mindestens zwei Glu (E) und/oder Asp (D) Aminosäurereste umfasst, wie eine N-terminale Extension, welche eine der folgenden Sequenzen umfasst:
EAE, EE, DE, DD.
Kex2-Stellen
Kex2-Stellen (siehe z. B. Methods in Enzymology, Bd. 185, Hrsg. D. Goeddel, Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology") und kex2-ähnliche Stellen sind zweiwertige Erkennungsstellen (d.h. Schnittstellen), die zwischen der Propeptid-kodierenden Region und der reifen Region einiger Proteine gefunden wird.
Die Insertion einer kex2-Stelle oder einer kex2-ähnlichen Stelle hat in bestimmten Fällen gezeigt, dass ein korrektes Prozessieren der Endopeptidase an der Propeptid-Schnittstelle verbessert wird, was erhöhte Proteinsekretionslevel ergibt.
Im Zusammenhang der Erfindung ergibt die Insertion einer kex2- oder kex2-ähnlichen Stelle die Möglichkeit, einen Schnitt an einer bestimmten Position in der N-terminalen Extension zu erhalten, was ein antimikrobielles Polypeptid ergibt, das im Vergleich zu dem reifen Polypeptid, das als Aminosäuren 1 bis 40 aus SEQ ID NR: 2 gezeigt ist, verlängert ist.
Quellen für Polypeptide mit antimikrobieller Aktivität
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann von Mikroorganismen einer jeden beliebigen Gattung erhalten werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „erhalten von", wie er hierin verwendet wird, dass das Polypeptid, das durch die Nukleotidsequenz kodiert wird, von einer Zelle produziert wird, in welcher die Nukleotidsequenz natürlicherweise vorhanden ist, oder in welche die Nukleotidsequenz eingefügt worden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Polypeptid extrazellulär sekretiert.
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein bakterielles Polypeptid sein. Zum Beispiel kann das Polypeptid ein grampositives bakterielles Polypeptid sein, wie ein Polypeptid von Bacillus, z. B. ein Polypeptid von Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis oder Bacillus thuringiensis; oder ein Polypeptid von Streptomyces, z. B. ein Polypeptid von Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus; oder ein gramnegatives bakterielles Polypeptid, z. B. ein Polypeptid von E. coli oder Pseudomonas sp.
Ein Polypeptid der vorliegenden kann ein Polypeptid von einem Pilz sein, und stärker bevorzugt ein Polypeptid von einer Hefe, wie ein Polypeptid von Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces oder Yarrowia; oder stärker bevorzugt ein Polypeptid von einem filamentösen Pilz sein, wie ein Polypeptid von Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium oder Trichoderma.
In einer interessanten Ausführungsform ist das Polypeptid ein Polypeptid von Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis oder Saccharomyces oviformis.
In einer anderen interessanten Ausführungsform ist das Polypeptid ein Polypeptid von Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogentun, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei oder Trichoderma viride.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid ein Polypeptid von Pseudoplectania nigrella, und stärker bevorzugt ein Polypeptid von Pseudoplectania nigrella CBS 444.97, z. B. das Polypeptid, das aus der Aminosäuresequenz l bis 40 aus SEQ ID NR: 2 besteht.
Es ist zu verstehen, dass für die vorstehend genannten Arten die Erfindung sowohl perfekte und Imperfekte Zustände und andere taxonimische Äquivalente, z. B. Anamorphe („anamorphs"), unabhängig von dem Artennamen, unter dem sie bekannt sind, umfasst. Der Fachmann wird leicht die Identität von geeigneten Äquivalenten erkennen.
Stämme von diesen Arten sind für die Öffentlichkeit in einer Anzahl von Kultursammlungen leicht zugänglich, wie der American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) und Agriculture Resarch Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
Weiterhin können solche Polypeptide unter Verwendung der oben erwähnten Sonden von anderen Quellen identifiziert und erhalten werden, einschließlich Mikroorganismen, die aus der Natur (z. B. Erde, Kompost, Wasser, usw.) isoliert werden. Techniken zum Isolieren von Mikroorganismen aus natürlichen Umgebungen sind im Stand der Technik gut bekannt. Die Nukleotidsequenz kann dann abgeleitet werden, indem eine genomische oder cDNA-Bibliothek eines anderen Mikroorganismus auf ähnliche Weise gescreent wird. Sobald eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, mit der/den Sonde/n detektiert worden ist, kann die Sequenz unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann im Stand der Technik bekannt sind (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, supra), isoliert oder kloniert werden.
Polypeptide, die von Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung kodiert werden, schließen ebenfalls fusionierte Polypeptide oder Fusionspolypeptide, die geschnitten werden können, bei denen ein anderes Polypeptid mit dem N-Terminus oder dem C-Terminus des Polypeptids oder eines Fragments hiervon fusioniert ist. Ein fusioniertes Polypeptid wird hergestellt, indem eine Nukleotidsequenz (oder ein Teil hiervon), die ein anderes Polypeptid kodiert, mit einer Nukleotidsequenz (oder einem Teil hiervon) der vorliegenden Erfindung fusioniert wird. Techniken zur Herstellung von Fusionspolypeptiden sind im Stand der Technik bekannt und schließen das Ligieren der kodierenden Sequenzen, welche die Polypeptide kodieren, ein, so dass sie im Rahmen sind, und dass die Expression des fusionierten Polypeptids unter der Kontrolle desselben/derselben Promotors/Promotoren und Terminators steht.
Polynukleotide und Nukleotidsequenzen
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Polynukleotide mit einer Nukleotidsequenz, welche ein Polypeptid der Erfindung kodiert. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Polynukleotide, die aus einer Nukleotidsequenz bestehen, welche ein Polypeptid der Erfindung kodiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleotidsequenz die in SEQ ID NR: 1 dargestellte. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleotidsequenz die das reife Polypeptid kodierende Region aus SEQ ID NR: 1. Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Polynukleotide, die Nukleotidsequenzen aufweisen, bevorzugt aus diesen bestehen, welche ein Polypeptid, welches aus der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NR: 2 besteht, oder das reife Polypeptid hiervon kodieren, welches sich von SEQ ID NR: 1 durch die Degeneration des genetischen Codes unterscheidet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Polynukleotide, die eine Untersequenz von SEQ ID NR: 1 aufweisen, bevorzugt aus dieser bestehen, welche Fragmente aus SEQ ID NR: 2 kodieren, die antimikrobielle Aktivität aufweisen. Eine Untersequenz aus SEQ ID NR: 1 ist eine Nukleotidsequenz, die von SEQ ID NR: 1 umfasst ist, mit der Ausnahme, dass ein oder mehrere Nukleotide von dem 5'- und/oder 3'-Ende deletiert worden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Polynukleotide, die eine modifizierte Nukleotidsequenz aufweisen, bevorzugt aus dieser bestehen, welche mindestens eine Modifikation in der das reife Polypeptid kodierenden Sequenz aus SEQ ID NR: l umfasst, und wobei die modifizierte Nukleotidsequenz ein Polypeptid kodiert, welches aus den Aminosäuren 1 bis 40 aus SEQ ID NR: 2 besteht.
Die Techniken, die verwendet werden, um eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, zu isolieren oder klonieren, sind im Stand der Technik bekannt, und schließen die Isolierung aus genomischer DNA, Präparationen aus cDNA oder eine Kombination hiervon ein. Die Klonierung der Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung aus einer solchen genomischen DNA kann, z. B. unter Verwendung der gut bekannten Polymerasekettenreaktion (PCR) oder einem Antibody-Screening von Expressionsbibliotheken, um klonierte DNA-Fragmente zu detektieren, die strukturelle Eigenschaften teilen, bewirkt werden. Siehe z. B. Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Andere Amplifikationsvorgehensweisen, wie die Ligasekettenreaktion (LCR), ligierte aktivierte Transkription (LAT) und Nukleotidsequenzbasierte Amplifikation (NASBA) können verwendet werden. Die Nukleotidsequenz kann von einem Stamm mit antimikrobieller Polypeptid-kodierender Nukleotidsequenz, vorhanden in Pseudoplectania, oder einem anderen oder verwandten Organismus, kloniert werden und kann daher zum Beispiel eine allele Variante oder Artenvariante der Polypeptid-kodierenden Region der Nukleotidsequenz sein.
Die Nukleotidsequenz kann durch standardgemäße Klonierungsvorgehensweisen, die in der Gentechnik verwendet werden, um die Nukleotidsequenz von ihrem natürlichen Ort an eine hiervon verschiedene Stelle zu relokalisieren, wo sie reproduziert wird, erhalten werden. Die Klonierungsvorgehensweisen können die Excision (das Ausschneiden) und die Isolation eines gewünschten Fragments, das die Nukleotidsequenz umfasst, welche das Polypeptid kodiert, die Insertion des Fragments in ein Vektormolekül und den Einbau des rekombinanten Vektors in eine Wirtszelle, wo mehrere Kopien oder Klone der Nukleotidsequenz repliziert werden, involvieren. Die Nukleotidsequenz kann von genomicher, cDNA, RNA, halbsynthetischer, synthetischer Herkunft oder jeden beliebigen Kombinationen hiervon sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Polynukleotid, welches eine Nukleotidsequenz aufweist, bevorzugt aus ihr besteht, welche mindestens 65 % Identität mit den Nukleotiden 166 bis 285 aus SEQ ID NR: 1 aufweist. Bevorzugt weist die Nukleotidsequenz mindestens 70 % Identität, z. B. mindestens 80 % Identität, wie mindestens 90 % Identität, stärker bevorzugt mindestens 95 % Identität, wie mindestens 96 % Identität, z. B. mindestens 97 % Identität, noch stärker bevorzugt mindestens 98 % Identität, wie mindestens 99 % mit den Nukleotiden 166 bis 285 aus SEQ ID NR: 1 auf. Bevorzugt kodiert die Nukleotidsequenz ein Polypeptid mit antimikrobieller Aktivität. Der Identitätsgrad zwischen zwei Nukleotidsequenzen wird bestimmt, wie vorstehend beschrieben (siehe den Abschnitt mit dem Titel „Definitionen"). Bevorzugt umfasst die Nukleotidsequenz die Nukleotide 166 bis 285 aus SEQ ID NR: 1. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform besteht die Nukleotidsequenz aus den Nukleotiden 166 bis 285 aus SEQ ID NR: 1.
Die Modifikation einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, kann für die Synthese eines Polypeptids erforderlich sein, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens eine Substitution, Deletion und/oder Insertion im Vergleich zu den Aminosäuren 1 bis 40 aus SEQ ID NR: 2 aufweist. Diese künstlichen Varianten können sich in einigen technischen Hinsichten von dem Polypeptid, das aus seiner nativen Quelle isoliert wird, unterscheiden, z. B. Varianten, die sich in der spezifischen Aktivität, Thermostabilität, pH-Optimum oder dergleichen unterscheiden.
Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass solche Modifikationen außerhalb der Regionen, die kritisch für die Funktion des Moleküls sind, durchgeführt werden können, und dennoch in einem aktiven Polypeptid resultieren. Aminosäurereste, die essentiell für die Aktivität des Polypeptids, das durch die Nukleotidsequenz der Erfindung kodiert wird, sind, und demnach vorzugsweise nicht Gegenstand der Modifikation, wie einer Substitution, sind, können gemäß im Stand der Technik bekannter Vorgehensweisen identifiziert werden, wie der ortsspezifischen Mutagenese oder der Alanin-Scanning-Mutagenese (siehe z. B. Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081 – 1085). Bei der letztgenannten Technik werden Modifikationen an jedem positiv geladenen Rest in dem Molekül eingeführt und das resultierende mutierte Molekül wird auf seine antimikrobielle Aktivität hin überprüft, um Aminosäurereste zu identifizieren, die kritisch für die Aktivität des Moleküls sind. Stellen der Substrat-Enzym-Interaktion können ebenfalls durch die Analyse der dreidimensionalen Struktur bestimmt werden, wie sie durch Techniken bestimmt werden kann, wie kernmmagnetische Resonanzanalyse, Kristallographie oder Fotoaffinitätsmarkierung (siehe z. B. de Vos et al., 1992, Science 255: 306 – 312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899 – 904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59 – 64).
Darüber hinaus kann eine Nukleotidsequenz, welche ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, durch Einführen von Nukleotidsubstitutionen modifiziert werden, welche nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz des Polypeptids, das durch die Nukleotidsequenz kodiert wird, führen, welche aber mit der Codon-Nutzung (codon usage) des Wirtsorganismus, der für die Herstellung des Enzyms vorgesehen ist, korrespondieren. Die Einführung einer Mutation in die Nukleotidsequenz, um ein Nukleotid gegen ein anderes Nukleotid auszutauschen, kann durch ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung von beliebigen, im Stand der Technik bekannten Verfahren erreicht werden. Insbesondere verwendbar ist die Vorgehensweise, welche einen „supercoiled" doppelsträngigen DNA-Vektor mit einem interessierenden Insert und zwei synthetischen Primern, welche die gewünschte Mutation enthalten, nutzt. Die Oligonukleotidprimer, von denen jeder komplementär zu entgegengesetzten Strängen des Vektors ist, verlängern während des Temperaturzyklus („temperature cycling") mittels der Pfu-DNA-Polymerase. Über die Einführung der Primer wird ein mutiertes Plasmid, welches versetzte Brüche enthält, erzeugt. Dem Temperaturzyklus folgend, wird das Produkt mit DpnI behandelt, welches spezifisch für methylierte und hemimethylierte DNA ist, um das Eltern-DNA-Template zu verdauen, und um synthetisierte DNA, welche die Mutation enthält, zu selektieren. Andere im Stand der Technik bekannte Vorgehensweisen können ebenfalls verwendet werden. Für eine allgemeine Beschreibung einer Nukleotidsubstitution siehe z. B. Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95 – 107.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Polynukleotide, welche eine Nukleotidsequenz aufweisen, bevorzugt aus ihr entstehen, welche ein Polypeptid mit antimikrobieller Aktivität kodiert, und welche unter sehr niedrigen Stringenzbedingungen, bevorzugt unter niedrigen Stringenzbedingungen, stärker bevorzugt unter mittleren Stringenzbedingungen, noch stärker bevorzugt unter mittleren bis hohen Stringenzbedingungen, noch stärker bevorzugt unter hohen Stringenzbedingungen, und am stärksten bevorzugt unter sehr hohen Stringenzbedingungen mit einer Polynukleotidsonde hybridisiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (i) dem komplementären Strang der Nukleotide 166 bis 285 aus SEQ ID NR: 1, (ii) dem komplementären Strang der cDNA-Sequenz, welche in den Nukleotiden 70 bis 285 aus SEQ ID NR: 1 enthalten ist, und (iii) dem komplementären Strang der Nukleotide 1 bis 285 aus SEQ ID NR: 1.
Es versteht sich, dass Einzelheiten und Besonderheiten, welche die Hybridisierung der Nukleotidsequenzen betreffen, die gleichen sind wie, oder analog sind zu den Hybridisierungsaspekten, die in dem Abschnitt hierin mit dem Titel „Polypeptide mit antimikrobieller Aktivität" diskutiert werden.
Nukleinsäurekonstrukte
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Nukleinsäurekonstrukte, welche eine Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung umfassen, die funktionsfähig mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen verknüpft ist, welche die Expression der kodierenden Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle unter Bedingungen, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind, steuert/steuern.
Eine Nukleotidsequenz, welche ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, kann auf vielfältige Art und Weise manipuliert werden, um für die Expression des Polypeptids ausgestattet zu sein. Eine Manipulation der Nukleinsäuresequenz vor ihrer Insertion in einen Vektor kann, abhängig von dem Expressionsvektor, wünschenswert oder erforderlich sein. Die Techniken zur Modifizierung von Nukleotidsequenzen unter Nutzung von rekombinanten DNA-Verfahren sind im Stand der Technik gut bekannt.
Die Kontrollsequenz kann eine geeignete Promotorsequenz sein, eine Nukleotidsequenz, welche von der Wirtszelle für die Expression der Nukleotidsequenz erkannt wird. Die Promotorsequenz enthält Transkriptionskontrollsequenzen, welche die Expression des Polypeptids vermitteln. Der Promotor kann jede beliebige Nukleotidsequenz sein, die Transkriptionsaktivität in der gewählten Wirtszelle zeigt, einschließlich mutierter, verkürzter und Hybrid-Promotoren, und kann von Genen erhalten werden, die extrazelluläre oder intrazelluläre Polypeptide kodieren, die entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle sind.
Beispiele für geeignete Promotoren zum Steuern der Transkription der Nukleinsäurekonstrukte der vorliegenden Erfindung, insbesondere in einer bakteriellen Wirtszelle, sind die Promotoren, die von dem lac-Operon von E. coli, dem Agarasegen (dagA) von Streptomyces coelicolor, dem Levansucrasegen (sacB) von Bacillus subtilis, dem alpha-Amylasegen (amyL) von Bacillus licheniformis, dem maltogenen Amylasegen (amyM) von Bacillus stearothermophilus, dem alpha-Amylasegen (amyQ) von Bacillus amyloliquefaciens, dem Penicillinasegen (penP) von Bacillus licheniformis, den xylA- und xylB-Genen und dem prokaryotischen beta-Lactamasegen von Bacillus subtilis erhalten werden (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727 – 3731), ebenso wie der tac-Promotor (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21 – 25). Weitere Promotoren sind beschrieben in „Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74 – 94; und in Sambrook et al, 1989, supra.
Beispiele für geeignete Promotoren zum Steuern der Transkription der Nukleinsäurekonstrukte der vorliegenden Erfindung in filamentösen Pilzwirtszellen sind Promotoren, die von den Genen für TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae, Asparaginproteinase von Rhizomucor miehei, neutrale alpha-Amylase von Aspergillus niger, säurestabile alpha-Amylase von Aspergillus niger, Glucoamylase (glaA) von Aspergillus niger oder Aspergillus awamori, Lipase von Rhizomucor miehei, alkalische Protease von Aspergillus oryzae, Triosephosphatisomerase von Aspergillus oryzae, Acetamidase von Aspergillus nidulans und Trypsin-ähnliche Protease von Fusarium oxysporum (WO 96/00787) erhalten werden, ebenso wie der NA2-tpi-Promotor (ein Hybrid aus den Promotoren von den Genen für die neutrale alpha-Amylase von Aspergillus niger und die Triosephosphatisomerase von Aspergillus oryzae) und mutierte, verkürzte und Hybridpromotoren hiervon.
In einem Hefewirt werden verwendbare Promotoren von den Genen für Enolase (ENO-1) von Saccharomyces cerevisiae, Galactokinase (GAL1) von Saccharomyces cerevisiae, Alkoholdehydrogenase/Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (ADH2/GAP) von Saccharomyces cerevisiae und 3-Phosphoglyceratkinase von Saccharomyces cerevisiae erhalten. Andere verwendbare Promotoren für Hefewirtszellen werden von Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423 – 488, beschrieben.
Die Kontrollsequenz kann ebenfalls eine geeignete Transkriptionsterminatorsequenz sein, eine Sequenz, die von einer Wirtszelle erkannt wird, um die Transkription zu beenden. Die Terminatorsequenz ist funktionsfähig mit dem 3'-Terminus der Nukleotidsequenz, welche das Polypeptid kodiert, verknüpft. Jeder beliebige Terminator, welcher in der gewählten Wirtszelle funktionell ist, kann für die vorliegende Erfindung verwendet werden.
Bevorzugte Terminatoren für filamentöse Pilzwirtszellen werden von den Genen für TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae, Glucoamylase von Aspergillus niger, Anthranilatsynthase von Aspergillus nidulans, alpha-Glucosidase von Aspergillus niger und Trypsin-ähnliche Protease von Fusarium oxysporum erhalten.
Bevorzugte Terminatoren für Hefewirtszellen werden von den Genen für Enolase von Saccharomyces cerevisiae, Cytochrom C (CYCI) von Saccharomyces cerevisiae und Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase von Saccharomyces cerevisiae erhalten. Andere verwendbare Terminatoren für Hefewirtszellen werden von Romanos et al., 1992, supra, beschrieben.
Die Kontrollsequenz kann ebenfalls eine geeignete Leadersequenz sein, eine nicht-translatierte Region einer mRNA, welche wichtig für die Translation durch die Wirtszelle ist. Die Leadersequenz ist funktionsfähig mit dem 5'-Terminus der Nukleotidsequenz, welche das Polypeptid kodiert, verknüpft. Jede beliebige Leadersequenz, die in der gewählten Wirtszelle funktionell ist, kann für die vorliegende Erfindung verwendet werden.
Bevorzugte Leader für filamentöse Pilzwirtszellen werden von den Genen für TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae und Triosephosphatisomerase von Aspergillus nidulans erhalten.
Geeignete Leader für Hefewirtszellen werden von den Genen für Enolase (ENO-1) von Saccharomyces cerevisiae, 3-Phosphoglyceratkinase von Saccharomyces cerevisiae, alpha-Faktor von Saccharomyces cerevisiae und Alkoholdehydrogenase/Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase (ADH2/GAP) von Saccharomyces cerevisiae erhalten.
Die Kontrollsequenz kann ebenfalls eine Polyadenylierungssequenz sein, eine Sequenz, die funktionsfähig mit dem 3'-Terminus der Nukleotidsequenz verknüpft ist, und welche, wenn sie transkribiert wird, von der Wirtszelle als ein Signal erkannt wird, um Polyadenosinreste zu der transkribierten mRNA hinzuzufügen. Jede beliebige Polyadenylierungssequenz, welche in der gewählten Wirtszelle funktionell ist, kann für die vorliegende Erfindung verwendet werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssequenzen für filamentöse Pilzwirtszellen werden von den Genen für TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae, Glucoamylase von Aspergillus niger, Anthranilatsynthase von Aspergillus nidulans, Trypsin-ähnliche Protease von Fusarium oxysporum und alpha-Glucosidase von Aspergillus niger erhalten.
Verwendbare Polyadenylierungssequenzen für Hefewirtszellen werden von Guo und Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983 – 5990, beschrieben.
Die Kontrollsequenz kann ebenfalls eine Signalpeptid-kodierende Region sein, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, welche mit dem Aminoterminus eines Polypeptids verknüpft ist, und das kodierte Polypeptid in den Sekretionsweg der Zelle steuert. Das 5'-Ende der kodierenden Sequenz der Nukleotidsequenz kann schon von sich aus (inhärent) eine Signalpeptid-kodierende Region enthalten, die natürlicherweise in dem Translationsleserahmen mit dem Segment der kodierenden Region verknüpft ist, welche das sekretierte Polypeptid kodiert. Alternativ kann das 5'-Ende der kodierenden Sequenz eine Signalpeptid-kodierende Region enthalten, welche fremd zu der kodierenden Sequenz ist. Die das fremde Signalpeptid kodierende Region kann erforderlich sein, wenn die kodierende Sequenz nicht natürlicherweise eine Signalpeptid-kodierende Region enthält. Alternativ kann die das fremde Signalpeptid kodierende Region einfach die natürliche Signalpeptid-kodierende Region ersetzen, um die Sekretion des Polypeptids zu steigern. Jedoch kann jede beliebige Signalpeptid-kodierende Region, welche das exprimierte Polypeptid in den Sekretionsweg einer gewählten Wirtszelle steuert, für die vorliegende Erfindung verwendet werden.
Die Signalpeptid-kodierende Region stellen die Nukleotide 1 bis 69 aus SEQ ID NR: 1 dar, welche die Aminosäuren –55 bis –33 aus SEQ ID NR: 2 (oder die Aminosäuren 1 bis 23 aus SEQ ID NR: 3) kodieren.
Effektive Signalpeptid-kodierende Regionen für bakterielle Wirtszellen sind die Signalpeptidkodierenden Regionen, die von Genen für NCIB 11837 maltogene Amylase von Bacillus, alpha-Amylase von Bacillus stearothermophilus, Subtilisin von Bacillus licheniformis, beta-Lactamase von Bacillus licheniformis, neutrale Proteasen (nprT, nprS, nprM) von Bacillus stearothermophilus und prsA von Bacillus subtilis erhalten werden. Weitere Signalpeptide werden von Simonen und Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109 – 137 beschrieben.
Effektive Signalpeptid-kodierende Regionen für filamentöse Pilzwirtszellen sind die Signalpeptidkodierenden Regionen, die von den Genen für TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae, neutrale Amylase von Aspergillus niger, Glucoamylase von Aspergillus niger, Asparaginproteinase von Rhizomucor miehei, Cellulase von Humicola insolens und Lipase von Humicola lanuginosa erhalten werden.
Geeignete Signalpeptide für Hefewirtszellen werden von den Genen für alpha-Faktor von Saccharomyces cerevisiae und Invertase von Saccharomyces cerevisiae erhalten. Andere geeignete Signalpeptid-kodierende Regionen werden von Romanos et al., 1992, supra, beschrieben.
Die Kontrollsequenz kann ebenfalls eine Propeptid-kodierende Region sein, die eine Aminosäuresequenz kodiert, die an dem Aminoterminus eines Polypeptids positioniert ist. Das resultierende Polypeptid ist als ein Proenzym oder Propolypeptid (oder in einigen Fällen als ein Zymogen) bekannt. Ein Propolypeptid ist im Allgemeinen inaktiv und kann in ein reifes aktives Polypeptid durch katalytische oder autokatalytische Spaltung des Propeptids von dem Propolypeptid umgewandelt werden. Die Propeptid-kodierende Region kann von den Genen für alkalische Protease (aprE) von Bacillus subtilis, neutrale Protease (nprT) von Bacillus subtilis, alpha-Faktor von Saccharomyces cerevisiae, Asparaginproteinase von Rhizomucor miehei und Laccase von Myceliophthora thermophila (WO 95/33836) erhalten werden.
Die Propeptid-kodierende Region stellen die Nukleotide 70 bis 165 aus SEQ ID NR: 1 dar, welche die Aminosäuren –32 bis –1 aus SEQ ID NR: 2 (oder die Aminosäuren 24 bis 55 aus SEQ ID NR: 3) kodieren.
Wenn sowohl Signalpeptid- als auch Propeptidregionen an dem Aminoterminus eines Polypeptids vorhanden sind, ist die Propeptidregion neben dem Aminoterminus eines Polypeptids positioniert und die Signalpeptidregion neben Aminoterminus der Propeptidregion positioniert.
Es kann ebenfalls wünschenswert sein, regulatorische Sequenzen hinzuzufügen, welche die Regulation der Expression des Polypeptids relativ zu dem Wachstum der Wirtszelle ermöglichen. Beispiele für regulatorische Systeme sind solche, welche es bewirken, dass die Expression des Gens in Antwort auf einen chemischen oder physikalischen Reiz, einschließlich der Gegenwart einer regulatorischen Verbindung, angeschaltet oder abgeschaltet wird. Regulatorische Systeme in prokaryotischen Systemen schließen die lac-, tac- und trp-Operatorsysteme ein. In Hefe kann das ADH2-System oder das GAL1-System verwendet werden. In filamentösen Pilzen können der TAKA-alpha-Amylasepromotor, Glucoamylasepromotor von Aspergillus niger und Glucoamylasepromotor von Aspergillus oryzae als regulatorische Sequenzen verwendet werden. Andere Beispiele für regulatorische Sequenzen sind solche, welche eine Genamplifikation ermöglichen. In eukaryotischen Systemen schließen diese das Dihydrofolatreduktasegen ein, welches in der Gegenwart von Methotrexat amplifiziert wird und die Metallothioneingene, welche mit Schwermetallen amplifiziert werden. In diesen Fällen würde die Nukleotidsequenz, welche das Polypeptid kodiert, funktionsfähig mit der regulatorischen Sequenz verknüpft werden.
Expressionsvektoren
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls rekombinante Expressionsvektoren, welche das Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung umfassen. Die verschiedenen, oben beschriebenen Nukleotid- und Kontrollsequenzen können miteinander verbunden werden, um einen rekombinanten Expressionsvektor herzustellen, welcher eine oder mehrere geeignete Restriktionsstellen einschließt, welche die Insertion oder Substitution der Nukleotidsequenz, welche das Polypeptid kodiert, an solchen Stellen ermöglichen. Alternativ kann die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung exprimiert werden, indem die Nukleotidsequenz oder ein Nukleinsäurekonstrukt, welches die Sequenz umfasst, in einen geeigneten Vektor zur Expression eingefügt wird. Beim Erzeugen des Expressionsvektors wird die kodierende Sequenz in dem Vektor so lokalisiert, dass die kodierende Sequenz funktionsfähig verknüpft ist mit den für die Expression geeigneten Kontrollsequenzen.
Der rekombinante Expressionsvektor kann jeder beliebige Vektor (z. B. ein Plasmid oder Virus) sein, welcher dazu geeignet ist, rekombinanten DNA-Vorgehensweisen unterworfen zu werden und die Expression der Nukleotidsequenz bewirken kann. Die Wahl des Vektors wird typischerweise von der Kompatibilität des Vektors mit der Wirtszelle, in welche der Vektor einzuführen ist, abhängig ein. Die Vektoren können lineare oder geschlossen zirkuläre Plasmide sein.
Der Vektor kann ein autonom replizierender Vektor sein, d.h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit existiert, und dessen Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation erfolgt, z. B. ein Plasmid, ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom.
Der Vektor kann beliebige Mittel zum Gewährleisten einer Selbstreplikation enthalten. Alternativ kann der Vektor einer sein, der, wenn er in die Wirtszelle eingeführt wird, in das Genom integriert wird, und zusammen mit dem/den Chromosom(en), in welches/welche er integriert worden ist, repliziert wird. Weiterhin kann ein einzelner Vektor oder ein einzelnes Plasmid oder können zwei oder mehrere Vektoren oder Plasmide, welche zusammen die gesamte in das Genom der Wirtszelle einzuführende DNA enthalten, oder ein Transposon verwendet werden.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten einen oder mehrere Selektionsmarker, welche die einfache Selektion von transformierten Zellen ermöglichen. Ein Selektionsmarker ist ein Gen, dessen Produkt eine Biozidresistenz oder virale Resistenz, Resistenz gegenüber Schwermetallen, Prototrophie oder Auxotrophe und dergleichen bereitstellt.
Beispiele für bakterielle Selektionsmarker sind die dal-Gene von Bacillus subtilis oder Bacillus licheniformis oder Marker, welche eine Antibiotikaresistenz übertragen, wie eine Ampicillin-, Kanamycin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclinresistenz. Geeignete Marker für Hefewirtszellen sind ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 und URA3. Selektionsmarker zur Verwendung in einer filamentösen Pilzwirtszelle schließen ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt, amdS (Acetamidase), argB (Ornithincarbamoyltransferase), bar (Phosphinothricinacetyltransferase), hygB (Hygromycinphosphotransferase), niaD (Nitratreduktase), pyrG (Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase), sC (Sulfatadenyltransferase), trpC (Anthranilatsynthase), ebenso wie Äquivalente hiervon.
Bevorzugt für die Verwendung in einer Zelle von Aspergillus sind die Gene amdS und pyrG von Aspergillus nidulans oder Aspergillus oryzae und das Gen bar von Streptomyces hygroscopicus.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten bevorzugt ein Element/Elemente, welches / welche die stabile Integration des Vektors in das Genom der Wirtszelle oder die autonome Replikation des Vektors in der Zelle, unabhängig von dem Genom, ermöglicht.
Für die Integration in das Wirtszellgenom kann der Vektor auf die Nukleotidsequenz, welche das Polypeptid kodiert, oder jedem anderen Element des Vektors zur stabilen Integration des Vektors in das Genom durch homologe oder nicht-homologe Rekombination angewiesen sein.
Alternativ kann der Vektor zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Steuerung der Integration durch homologe Rekombination in das Genom der Wirtszelle enthalten. Die zusätzlichen Nukleotidsequenzen ermöglichen es dem Vektor, in das Wirtszellgenom an einem genauen Ort / genauen Orten in das/die Chromosom(en) integriert zu werden. Um die Wahrscheinlichkeit der Integration an einem genauen Ort zu erhöhen, sollten die Integrationselemente vorzugsweise eine aureichende Anzahl Nukleotide enthalten, wie 100 bis 1500 Basenpaare, bevorzugt 400 bis 1500 Basenpaare, und am stärksten bevorzugt 800 bis 1500 Basenpaare, welche in hohem Grad homolog zu der entsprechenden Zielsequenz sind, um die Wahrscheinlichkeit einer homologen Rekombination zu erhöhen. Die Integrationselemente können jede beliebige Sequenz sein, die homolog zu der Zielsequenz in dem Genom der Wirtszelle ist. Weiterhin können die Integrationselemente nicht-kodierende oder kodierende Nukleotidsequenzen sein. Auf der anderen Seite kann der Vektor in das Genom der Wirtszelle durch nicht-homologe Rekombination integriert werden.
Für eine autonome Replikation kann der Vektor weiterhin einen Replikationsursprung umfassen, welcher es dem Vektor ermöglicht, sich in der in Frage stehenden Wirtszelle autonom zu replizieren. Beispiele für bakterielle Replikationsursprünge sind die Replikationsursprünge der Plasmide pBR322, pUC19, pACYC177 und pACYC184, welche eine Replikation in E. coli ermöglichen, und pUB110, pE194, pTA1060 und pAMβ1, welche ein Replikation in Bacillus ermöglichen. Beispiele für Replikationsursprünge, die in einer Hefewirtszelle verwendbar sind, sind der 2-Mikron-Replikationsursprung („2 micron origin of replication"), ARS1, ARS4, die Kombination aus ARS1 und CEN3 und die Kombination aus ARS4 und CEN6. Der Replikationsursprung kann einer sein, der eine Mutation aufweist, welche seine Funktion in der Wirtszelle Temperatur-sensitiv macht (siehe z. B. Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Science USA 75: 1433).
Es kann mehr als eine Kopie einer Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung in die Wirtszelle eingefügt werden, um die Produktion des Genprodukts zu erhöhen. Eine Erhöhung der Kopienanzahl der Nukleotidsequenz kann erhalten werden, indem mindestens eine zusätzliche Kopie der Sequenz in das Wirtszellgenom integriert wird, oder, indem ein amplifizierbares Selektionsmarkergen zusammen mit der Nukleotidsequenz eingesetzt wird, wodurch die Zellen, die amplifizierte Kopien des Selektionsmarkergens, und dadurch zusätzliche Kopien der Nukleotidsequenz, enthalten, selektiert werden können, indem die Zellen in Gegenwart des geeigneten Selektionswirkstoffes kultiviert werden.
Die Vorgehensweisen, die verwendet werden, um die oben beschriebenen Elemente zu ligieren, um die rekombinanten Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung zu konstruieren, sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, supra).
Wirtszellen
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine rekombinante Wirtszelle, welche das Nukleinsäurekonstrukt umfasst, welche vorteilhafterweise für die rekombinante Herstellung der Polypeptide verwendet wird. Ein Vektor, welcher ein Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung umfasst, wird in eine Wirtszelle eingeführt, so dass der Vektor chromosomal integriert oder als ein selbst-replizierender extrachromosomaler Vektor, wie zuvor beschrieben, verbleibt.
Die Wirtszelle kann ein einzelliger Mikroorganismus, z. B. ein Prokaryot, oder ein nicht-einzelliger Mikroorganismus, z. B. ein Eukaryot, sein.
Verwendbare Einzelzellen („unicellular cells") sind bakterielle Zellen, wie grampositive Bakterien, einschließlich, jedoch nicht hierauf beschränkt, eine Zelle von Bacillus, z. B. Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis und Bacillus thuringiensis; oder eine Zelle von Streptomyces, z. B. Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus, oder ein gramnegatives Bakterium, wie E. coli und Pseudomonas sp. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die bakterielle Wirtszelle eine Zelle von Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus oder Bacillus subtilis. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle von Bacillus ein alkanophiler Bacillus.
Die Einführung eines Vektors in eine bakterielle Wirtszelle kann zum Beispiel durch Protoplastentransformation (siehe z. B. Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111 – 115), unter Verwendung von kompetenten Zellen (siehe z. B. Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823 – 829, oder Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209 – 221), Elektroporation (siehe z. B. Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742 – 751) oder Konjugation (siehe z. B. Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771 – 5278) bewirkt werden.
Die Wirtszelle kann ein Eukaryot sein, wie eine Zelle von einem Säugetier, Insekt, Pflanze oder Pilz.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Pilzzelle. „Pilz", wie hierin verwendet, schließt sowohl die Stämme Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota und Zygomycota (wie definiert von Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, B. Ausgabe, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) als auch die Oomycota (wie zitiert in Hawksworth et al., 1995, supra, Seite 171) und alle mitosporischen Pilze (Hawksworth et al., 1995, supra) ein.
In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Pilzzelle eine Hefezelle. „Hefe", wie hierin verwendet, schließt ascosporogene Hefen (Endomycetales), basidiosporogene Hefen und Hefen, die den Fungi Imperfecti (Blastomycetes) angehören, ein. Da sich die Klassifikation von Hefen in der Zukunft ändern kann, sollen für die Zwecke der vorliegenden Erfindung Hefen definiert werden, wie beschrieben in Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., Hrsg., Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).
In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Hefezelle eine Zelle von Candida, Hanseula, Klzyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces oder Yarrowia.
In einer sehr stark bevorzugten Ausführungsform ist die Hefewirtszelle eine Zelle von Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis oder Saccharomyces oviformis.
In einer anderen sehr stark bevorzugten Ausführungsform ist die Hefewirtszelle eine Zelle von Kluyveromyces lactis. In einer anderen sehr stark bevorzugten Ausführungsform ist die Hefewirtszelle von Yarrowia lipolytica.
In einer anderen stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Hefewirtszelle eine filamentöse Pilzzelle. „Filamentöse Pilz" schließen alle filamentösen Formen der Untereinteilung Eumycota und Oomycota (wie definiert von Hawksworth et al., 1995, supra) ein. Die filamentösen Pilze sind gekennzeichnet durch eine myceliale Wand, die aus Chitin, Cellulose, Glucan, Chitosan, Mannan und anderen komplexen Polysacchariden zusammengesetzt ist. Das vegetative Wachstum erfolgt durch hyphale Verlängerung und der Kohlenstoffkatabolismus ist obligat aerob. Im Gegensatz dazu erfolgt das vegetative Wachstum bei Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae, durch Knospung eines unizellulären Thallus und der Kohlenstoffkatabolismus kann fermentativ sein.
In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Zelle von einer Art von, jedoch nicht hierauf beschränkt, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium oder Trichoderma.
In einer sehr stark bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Zelle von Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger oder Aspergillus oryzae. In einer anderen sehr stark bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Zelle von Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides oder Fusarium venenatum. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Eltern-Pilzzelle eine Zelle von Fusarium venenatum (Nirenberg sp. nov.). In einer anderen sehr stark bevorzugten Ausführungsform ist die filamentöse Pilzwirtszelle eine Zelle von Humicola insolens, Humicola Zanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei oder Trichoderma viride.
Pilzzellen können durch ein Verfahren transformiert werden, welches eine Protoplastenbildung, eine Transformation der Protoplasten und eine Regeneration der Zellwand in einer per se bekannten Weise einschließt. Geeignete Vorgehensweisen zur Transformation von Wirtszellen von Aspergillus werden in EP 238 023 und Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Scienies USA 81: 1470 – 1474 beschrieben. Geeignete Verfahren zum Transformieren von Arten von Fusarium werden von Malardier et al., 1989, Gene 78: 147 – 156 und WO 96/00787 beschrieben. Hefe kann unter Verwendung der von Becker und Guarente, In Abelson, J. N. und Simon, M. I., Hrsg., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology Methods in Enzymology Bd. 194, S. 182 – 187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153; 163; und Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920, beschrieben Vorgehensweisen, transformiert werden.
Verfahren zur Herstellung
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung, wobei das Verfahren umfasst (a) Kultivieren eines Stammes, der in seiner Wildtypform in der Lage ist, das Polypeptid herzustellen; und (b) Gewinnen des Polypeptids. Bevorzugt ist der Stamm einer der Gattung Pseudoplectania und stärker bevorzugt Pseudoplectania nigrella.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung, wobei das Verfahren umfasst (a) Kultivieren einer Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Herstellung des Polypeptids zuträglich sind; und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Bei den Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung werden die Zellen in einem Nährmedium kultiviert, das für die Herstellung des Polypeptids geeignet ist, unter Verwendung von im Stand der Technik bekannter Verfahren. Zum Beispiel kann die Zelle durch Schüttelflaschenkultivierung, Fermentation in kleinem Maßstab oder in großem Maßstab (einschließlich kontinuierlicher, Batch-, Fed-Batch- oder Festbetfermentationen), in Laborfermentatoren oder in industriellen Fermentatoren kultiviert werden, durchgeführt in einem geeigneten Medium und unter Bedingungen, die es dem Polypeptid erlauben, exprimiert und/oder isoliert zu werden. Die Kultivierung erfolgt in einem geeigneten Nährmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze umfasst, unter Verwendung von im Stand der Technik bekannter Vorgehensweisen. Geeignete Medien sind von kommerziellen Anbietern erhältlich oder können gemäß veröffentlichter Zusammensetzungen zubereitet werden (z. B. in den Katalogen der American Type Culture Collection). Wenn das Polypeptid in das Nährmedium sekretiert wird, kann das Polypeptid direkt aus dem Medium gewonnen werden. Wenn das Polypeptid nicht sekretiert wird, kann es aus den Zelllysaten gewonnen werden.
Die Polypeptide können unter Verwendung von im Stand der Technik bekanntgen Verfahren, die spezifisch für die Polypeptide sind, detektiert werden. Diese Detektionsverfahren können die Verwendung von spezifischen Antikörpern, die Bildung eines Enzymprodukts oder das Verschwinden eines Enzymsubstrats einschließen. Zum Beispiel kann ein Enzymassay verwendet werden, um die Aktivität der hierin beschriebenen Polypeptide zu bestimmen.
Die resultierenden Polypeptide können durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, gewonnen werden. Zum Beispiel können die Polypeptide aus dem Nährmedium durch herkömmliche Vorgehensweisen gewonnen werden, einschließlich, jedoch nicht hierauf beschränkt, Zentrifugation, Filtration, Extrakion, Spray-Trocknen, Evaporation oder Präzipitation.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Vorgehensweisen aufgereinigt werden, einschließlich, jedoch nicht hierauf beschränkt, Chromatographie (z. B. Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophobe Chromatographie, chromatofokussierende Chromatographie und Größenausschlusschromatographie), elektrophoretische Vorgehensweisen (z. B. präparative isoelektrische Fokussierung), differentielle Löslichkeit (z. B. Ammoniumsulfatpräzipitation), SDS-PAGE oder Extraktion (siehe z. B. Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, Hrsg., VCH Publishers, New York, 1989).
Pflanzen
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine transgene Pflanze, einen Pflanzenteil oder eine Pflanzenzelle, welche/welcher mit einer Nukleotidsequenz, welche ein Polypeptid mit antimikrobieller Aktivität der vorliegenden Erfindung kodiert, transformiert worden ist, um das Polypeptid in gewinnbaren Mengen zu exprimieren und zu produzieren. Das Polypeptid kann aus der Pflanze oder dem Pflanzenteil gewonnen werden. Alternativ kann die Pflanze oder der Pflanzenteil, welche/welcher das rekombinante Polypeptid enthält, als solche/solcher verwendet werden, um die Qualität von Nahrungsmitteln oder Futter zu verbessern, z. B. um den Nährwert, die Schmackhaftigkeit und die rheologischen Eigenschaften zu verbessern, oder um einen antinutritiven Faktor zu zerstören. Das wiedergewonnene Polypeptid, die Pflanze oder der Pflanzenteil kann ebenfalls verwendet werden, um die Verdauungsflora bei Tieren und Vieh zu verbessern.
Die transgene Pflanze kann zweikeimblättrig (eine Dicotyle) oder einkeimblättrig (eine Monocotyle) sein. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind Gräser, wie Wiesengras (blaues Gras, Poa), Futtergras, wie Festuca, Lolium, Gras aus gemäßigten Zonen („temperate gras"), wie Agrostis und Cerealien, z. B. Weizen, Hafer, Roggen, Gerste, Reis, Sorghum und Mais (Getreide).
Beispiele für dicotyle Pflanzen sind Tabak, Kartoffel, Zuckerrübe, Gemüse (Hülsenfrüchte), wie Lupinien, Erbsen, Bohnen und Sojabohnen, und Kreuzblütler (Familie Brassicaceae), wie Blumenkohl, Rapssamen und der nahe verwandte Modellorganismus Arabidopsis thaliana.
Beispiele für Pflanzenteile sind der Stamm, der Kallus, die Blätter, die Wurzel, die Früchte, die Samen und die Knollen. Ebenso werden spezifische Pflanzengewebe wie Chloroplast, Apoplast, Mitochondrien, Vakuole, Peroxisomen und Cytoplasma als Pflanzenteile betrachtet. Weiterhin wird jede beliebige Pflanzenzelle, von welcher Gewebeherkunft auch immer, als Pflanzenteil betrachtet.
Ebenfalls in den Schutzbereich (Gegenstand) der vorliegenden Erfindung eingeschlossen ist die Vermehrung solcher Pflanzen, Pflanzenteile und Pflanzenzellen.
Die transgene Pflanze oder Pflanzenzelle, welche ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung exprimiert, kann gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren konstruiert werden. Kurz beschrieben, wird die Pflanze oder Pflanzenzelle konstruiert, indem ein oder mehrere Expressionskonstrukt(e), welches/welche ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert / kodieren, in das Pflanzenwirtsgenom eingebaut wird und die resultierende modifizierte Pflanze oder Pflanzenzelle in eine transgene Pflanze oder Pflanzenzelle vermehrt wird.
Herkömmlicherweise ist das Expressionskonstrukt ein Nukleinsäurekonstrukt, welches eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, und welche funktionsfähig mit geeigneten regulatorischen Sequenzen, welche für die Expression der Nukleotidsequenz in der gewählten Pflanze oder dem gewählten Pflanzenteil erforderlich sind, verknüpft ist. Weiterhin kann das Expressionskonstrukt einen Selektionsmarker umfassen, welcher für die Identifizierung von Wirtszellen, in welche das Expressionskonstrukt integriert worden ist, verwendbar ist, und DNA-Sequenzen, welche für die Einführung des Konstrukts in die in Frage stehende Pflanze notwendig sind, umfassen (die letztgenannten hängen von dem zu verwendenden Verfahren für die Einführung der DNA ab).
Die Wahl von regulatorischen Sequenzen, wie Promotor- und Terminatorsequenzen und optional Signal- oder Transitsequenzen, wird z. B. auf der Basis bestimmt, wann, wo und wie es gewünscht ist, das Polypeptid zu exprimieren. Zum Beispiel kann die Expression des Gens, welches ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, konstitutiv oder induzierbar sein, oder kann entwicklungsabhängig, phasen- oder gewebsspezifisch sein, und das Genprodukt kann auf ein spezifisches Gewebe oder Pflanzenteil, wie Samen oder Blätter, gerichtet sein („targeted"). Regulatorische Sequenzen werden z. B. von Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506 beschrieben.
Für eine konstitutive Expression kann der 35S-CaMV-Promotor verwendet werden (Franck et al., 1980, Cell 21: 285 – 294). Organ-spezifische Promotoren können zum Beispiel ein Promotor aus „sink" Speichergewebe („storage sink tissue"), wie Samen, Kartoffelknollen und Früchten sein (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275 – 303), oder aus „sink" Abbaugeweben („ metabolic sink tissues"), wie Meristemen sein (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863 – 878), ein Samen-spezifischer Promotor sein, wie dem Glutelin-, Prolamin-, Globulin- oder Albumin-Promotor aus Reis (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885 – 889), ein Promotor von Vicia faba von dem Gemüse B4 und dem unbekannten Samenproteingen von Vicia faba sein (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708 – 711), ein Promotor von einem Samenölkörperprotein („seed oil body protein") sein (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935 – 941), der Promoter des Speicherproteins napA von Brassica napus sein oder jeder beliebige andere im Stand der Technik bekannte Samen-spezifische Promotor sein, z. B. wie in WO 91/14772 beschrieben. Weiterhin kann der Promotor ein Blatt-spezifischer Promotor sein, wie der rbcs-Promotor von Reis oder Tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991 – 1000, the chlorella virus adenine methyltransferase gene Promoter (Mitra and Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85 – 93), oder der aldP-Genpromotor von Reis (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668 – 674) oder ein durch eine Wunde induzierbarer Promotor, wie der pin2-Promotor von Kartoffel (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573 – 588) sein.
Ein Promotor-Enhancer-Element kann ebenfalls verwendet werden, um eine höhere Expression des Enzyms in der Pflanze zu erzielen. Zum Beispiel kann das Promotor-Enhancer-Element ein Intron sein, welches zwischen dem Promotor und der Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, platziert ist. Zum Beispiel offenbaren Xu et al., 1993, supra, die Verwendung des ersten Introns des Actin 1-Gens von Reis, um die Expression zu verstärken.
Das Selektionsmarkergen und jede beliebigen anderen Teile des Expressionskonstruktes können aus solchen, die im Stand der Technik zugänglich sind, ausgewählt werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt wird in das Pflanzengenom gemäß herkömmlichen, im Stand der Technik bekannten Techniken eingebaut, einschließlich Agrobacterium-vermittelter Transformation, Virus-vermittelter Transformation, Mikroinjektion, Partikelbeschuss, biolistischer Transformation und Elektroporation (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).
Gegenwärtig ist der Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Gentransfer das gewählte Verfahren, um transgene Dicotylen zu erzeugen (für einen Überblick siehe Hooykas und Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15 – 38). Es kann jedoch auch für die Transformation von Monocotylen verwendet werden, obwohl andere Transformationsverfahren im Allgemeinen für diese Pflanzen bevorzugt werden. Gegenwärtig ist das gewählte Verfahren zur Erzeugung von transgenen Monocotylen der Partikelbeschuss (mikroskopische Gold- oder Wolframpartikel, die mit der zu transformierenden DNA beschichtet sind von embryonalen Kalli oder sich entwickelnden Embryonen (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275 – 281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158 – 162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667 – 674). Ein alternatives Verfahren zum Transformieren von Monocotylen basiert auf der Protoplastentransformation, wie von Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415 – 428 beschrieben.
Der Transformation folgend werden die Transformanten, in welche das Expressionskonstrukt eingebaut worden ist, selektiert und in ganze Pflanzen regeneriert, gemäß im Stand der Technik gut bekannter Verfahren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung, welches (a) das Kultivieren einer transgenen Pflanze oder einer Pflanzenzelle, die eine Nukleotidsequenz, welche ein Polypeptid mit antimikrobieller Aktivität der vorliegenden Erfindung kodiert, umfasst, unter Bedingungen, die für die Herstellung des Polypeptids zuträglich sind; und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Zusammensetzungen
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, wie pharmazeutische Zusammensetzungen, welche ein antimikrobielles Polypeptid der Erfindung umfassen.
Die Zusammensetzung kann ein Polypeptid der Erfindung als die Hauptkomponente an Polypeptid umfassen, z. B. eine Einzelkomponentenzusammensetzung. Alternativ kann die Zusammensetzung mehrfache enzymatische Aktivitäten umfassen, wie eine Aminopeptidase, Amylase, Carbohydrase, Carboxypeptidase, Catalase, Cellulase, Chitinase, Cutinase, Cyclodextringlycosyltransferase, Desoxyribonuklease, Esterase, alpha-Galactosidae, beta-Galactosidase, Glucoamylase, alpha-Glucosidase, beta-Glucosidase, Haloperoxidase, Inverase, Laccase, Lipase, Mannosidase, Oxidase, pektinolytisches Enzym, Peptidoglutaminase, Peroxidase, Phytase, Polyphenoloxidase, proteolytisches Enzym, Ribonuklease, Transgluatminase oder Xylanase.
Die Zusammensetzungen können weiterhin einen anderen pharmazeutisch aktiven Wirkstoff enthalten, wie einen zusätzlichen Biozidwirkstoff, wie ein anderes antimikrobielles Polypeptid, welches antimikrobielle Aktivität, wie oben definiert, aufweist. Der Biozidwirkstoff kann ein antibiotischer sein, wie im Stand der Technik bekannt. Klassen von Antibiotika schließen Penicilline, z. B. Penicillin G, Penicillin V, Methicillin, Oxacillin, Carbenicillin, Nafcillin, Ampicillin, usw.; Penicilline in Kombination mit beta-Lactamase-Inhibitoren, Cephalosporine, z. B. Cefaclor, Cefazolin, Cefuroxim, Moxalactam, usw.; Carbapeneme; Monobactame; Aminoglycoside; Tetracycline; Macrolide; Lincomycine; Polymyxine; Sulfonamide; Quinolone; Chloramphenicol; Metronidazol; Spectinomycin; Trimethoprim; Vancomycin; usw. ein. Der Biozidwirkstoff kann ebenfalls ein anti-mykotischer Wirkstoff sein, einschließlich Polyene, z. B. Amphotericin B, Nystatin; 5-Flucosyn; und Azole, z. B. Miconazol, Ketoconazol, Itraconazol und Fluconazol.
In einer Ausführungsform ist der Biozidwirkstoff ein nicht-enzymatischer chemischer Wirkstoff. In einer anderen Ausführungsform ist der Biozidwirkstoff ein chemischer Wirkstoff, der kein Polypeptid ist.
Der Biozidwirkstoff kann in der Lage sein, die Anzahl lebender Zellen von Escherichia coli (DSM 1576) auf 1/100 nach 30 Minuten Inkubation bei 20 °C in einer wässrigen Lösung aus 25 % (w/w); bevorzugt in einer wässrigen Lösung aus 10 % (w/w); stärker bevorzugt in einer wässrigen Lösung aus 5 % (w/w); noch stärker bevorzugt in einer wässrigen Lösung aus 1 % (w/w); am stärksten bevorzugt in einer wässrigen Lösung aus 0,5 % (w/w); und insbesondere in einer wässrigen Lösung von 0,1 % (w/w) des Biozidwirkstoffs zu reduzieren.
Der Biozidwirkstoff kann ebenfalls in der Lage sein, den Auswuchs („outgrowth") von Escherichia coli (DSM 1576) für 24 Stunden bei 25 °C in einem mikrobiellen Wachstumssubstrat zu inhibieren, wenn dieses in einer Konzentration von 1000 ppm hinzugefügt wird; bevorzugt, wenn dieses in einer Konzentration von 500 ppm hinzugefügt wird; stärker bevorzugt, wenn dieses in einer Konzentration von 250 ppm hinzugefügt wird; noch stärker bevorzugt, wenn dieses in einer Konzentration von 100 ppm hinzugefügt wird; am stärksten bevorzugt, wenn dieses in einer Konzentration von 50 ppm hinzugefügt wird; und insbesondere, wenn dieses in einer Konzentration von 25 ppm hinzugefügt wird.
Der Biozidwirkstoff kann ebenfalls in der Lage sein, die Anzahl an lebenden Zellen von Bacillus subtilis (ATCC 6633) auf 1/100 nach 30 Minuten Inkubation bei 20 °C in einer wässrigen Lösung aus 25 % (w/w); bevorzugt in einer wässrigen Lösung aus 10 % (w/w); stärker bevorzugt in einer wässrigen Lösung aus 5 % (w/w); noch stärker bevorzugt in einer wässrigen Lösung aus 1 % (w/w); am stärksten bevorzugt in einer wässrigen Lösung aus 0,5 % (w/w); und insbesondere in einer wässrigen Lösung von 0,1 % (w/w) des Biozidwirkstoffs zu reduzieren.
Der Biozidwirkstoff kann ebenfalls in der Lage sein, den Auswuchs von Bacillus subtilis (ATCC 6633) für 24 Stunden bei 25 °C in einem mikrobiellen Wachstumssubstrat zu inhibieren, wenn dieses in einer Konzentration von 1000 ppm hinzugefügt wird; bevorzugt, wenn dieses in einer Konzentration von 500 ppm hinzugefügt wird; stärker bevorzugt, wenn dieses in einer Konzentration von 250 ppm hinzugefügt wird; noch stärker bevorzugt, wenn dieses in einer Konzentration von 100 ppm hinzugefügt wird; am stärksten bevorzugt, wenn dieses in einer Konzentration von 50 ppm hinzugefügt wird; und insbesondere, wenn dieses in einer Konzentration von 25 ppm hinzugefügt wird.
Das antimikrobielle Polypeptid der Erfindung und der Biozidwirkstoff der Zusammensetzung können so ausgewählt werden, dass ein synergistischer antimikrobieller Effekt erhalten wird.
Das antimikrobielle Polypeptid und der Biozidwirkstoff der Zusammensetzung können so ausgewählt werden, dass die Anzahl lebender Zellen von E. coli (DSM 1576), wenn sie 10 Minuten bei 20 °C in einer wässrigen Lösung inkubiert werden, die 50 % w/w (bevorzugt 25 % w/w, stärker bevorzugt 10 % w/w, am stärksten bevorzugt 5 % w/w) des Biozidwirkstoffs und 0,5 ppm (bevorzugt 0,1 ppm) des antimikrobiellen Polypeptids enthält, mindestens 5 % (bevorzugt mindestens 10 %) stärker reduziert werden, im Vergleich zu dem, was erhalten wird, wenn die Resultate von separaten Inkubationen mit dem Biozidwirkstoff und dem antimikrobiellen Polypeptid allein addiert werden, d.h. ein einfacher additiver Effekt.
Die enzymatische Komponente und der Biozidwirkstoff der Zusammensetzung können ebenfalls so ausgewählt werden, dass den Auswuchs von E. coli (DSM 1576) bei 25 °C in einem mikrobiellen Wachstumssubstrat, welches 500 ppm (bevorzugt 250 ppm, stärker bevorzugt 100 ppm, am stärksten bevorzugt 50 ppm) des Biozidwirkstoffs und 0,5 ppm (bevorzugt 0,1 ppm) des antimikrobiellen Polypeptids enthält, mindestens 5 % (mindestens 10 %) länger inhibiert wird, im Vergleich zu dem, was erhalten wird, wenn die Resultate von separaten Inkubationen mit dem Biozidwirkstoff und dem antimikrobiellen Polypeptid allein addiert werden, d.h. ein einfacher additiver Effekt.
Das antimikrobielle Polypeptid und der Biozidwirkstoff der Zusammensetzung können ebenfalls so ausgewählt werden, dass die Anzahl lebender Zellen von Bacillus subtilis (ATCC 6633), wenn sie 10 Minuten bei 20 °C in einer wässrigen Lösung inkubiert werden, welche 50 % (w/w) (bevorzugt 25 % w/w, stärker bevorzugt 10 % w/w, am stärksten bevorzugt 5 % w/w) des Biozidwirkstoffs und 0,5 ppm (bevorzugt 0,1 ppm) des antimikrobiellen Polypeptids enthält, mindestens 5 % (bevorzugt mindestens 10 %) stärker reduziert wird, im Vergleich zu dem, was erhalten wird, wenn die Resultate von separaten Inkubationen mit dem Biozidwirkstoff und dem antimikrobiellen Polypeptid allein addiert werden, d.h. ein einfacher additiver Effekt.
Die enzymatische Komponente und der Biozidwirkstoff der Zusammensetzung können ebenfalls so ausgewählt werden, dass den Auswuchs von Bacillus subtilis (ATCC 6633) bei 25 °C in einem mikrobiellen Wachstumssubstrat, welches 500 ppm (bevorzugt 250 ppm, stärker bevorzugt 100 ppm, am stärksten bevorzugt 50 ppm) des Biozidwirkstoffs und 0,5 ppm (bevorzugt 0,1 ppm) des antimikrobiellen Polypeptids enthält, mindestens 5 % (bevorzugt mindestens 10 %) länger inhibiert wird, im Vergleich zu dem, was erhalten wird, wenn die Ergebnisse von separaten Inkubationen mit dem Biozidwirkstoff und dem antimikrobiellen Polypeptid allein addiert werden, d.h. ein einfacher additiver Effekt.
Die Zusammensetzungen können ein geeignetes Trägermaterial enthalten. Die Zusammensetzungen können ebenfalls ein geeignetes Zulieferungsvehikel umfassen, welches in der Lage ist, die antimikrobiellen Polypeptide der Erfindung an den gewünschten Ort zu bringen, wenn die Zusammensetzungen als ein Medikament verwendet werden.
Die Zusammensetzungen können gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren zubereitet werden und können in Form einer flüssigen oder einer trockenen Zusammensetzung vorliegen. Zum Beispiel kann die Polypeptidzusammensetzung in der Form eines Granulats oder Mikrogranulats vorliegen. Das in die Zusammensetzung einzuschließende Polypeptid kann gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren stabilisiert werden.
Beispiele werden nachfolgend gegeben, bei den bevorzugten Verwendungen der Polypeptidzusammensetzungen der Erfindung. Die Dosierung der Polypeptidzusammensetzung der Erfindung und andere Bedingungen, unter denen die Zusammensetzung verwendet wird, kann auf der Basis von im Stand der Technik bekannten Verfahren bestimmt werden.
Verfahren und Verwendungen
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls zahlreiche Verwendungen der antimikrobiellen Polypeptide. Die antimikrobiellen Polypeptide sind typischerweise verwendbar an jedem beliebigen Ort, der einer Kontamination durch Bakterien, Pilze, Hefe oder Algen unterliegt. Typischerweise befinden sich die Orte in wässrigen Systemen, wie Kühlwassersystemen, Waschspülwasser, Ölsystemen, wie Schneidölen (Kühlölen), Schmierölen, Ölfeldern und dergleichen, wo es erforderlich ist, Mikroorganismen abzutöten, oder wo es erforderlich ist, ihr Wachstum zu kontrollieren. Jedoch kann die vorliegende Erfindung ebenfalls auf allen Anwendungsgebieten, für welche bekannte antimikrobielle Zusammensetzungen verwendbar sind, verwendet werden, wie zum Schutz von Holz, Latex, Adhäsiv, Klebstoff, Papier, Pappe, Textil, Leder, Plastik, Abdichtungsmittel und Futter.
Andere Verwendungen schließen die Konservierung von Nahrungsmitteln, Getränken, Kosmetika, wie Lotionen, Cremes, Gelen, Salben, Seifen, Shampoos, Conditioners, Antiperspirantien, Deodorantien, Mundwäsche, Kontaktlinsenprodukten, Enzymformulierungen und Nahrungsmittelbestandteilen ein.
Demnach können die antimikrobiellen Polypeptide der Erfindung als Desinfektionsmittel, z. B. in der Behandlung von Akne, Infektionen im Auge oder im Mund, Hautinfektionen; in Antitranspirantien oder Deodorantien; in Fußbadesalzen; zum Reinigen und Desinfizieren von Kontaktlinsen, harten Oberflächen, Zähnen (Mundpflege), Wunden, Prellungen und dergleichen verwendbar sein.
Im Allgemeinen ist in Erwägung zu ziehen, dass die antimikrobiellen Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendbar sind zum Reinigen, Desinfizieren oder zum Inhibieren mikrobiellen Wachstums auf jeder beliebigen harten Oberfläche. Beispiel für Oberflächen, welche vorteilhafterweise mit den antimikrobiellen Polypeptiden der Erfindung in Kontakt gebracht werden können, sind Oberflächen einer Verarbeitungsausrüstung („process equipment"), z. B. Molkereien, chemische oder pharmazeutische Verarbeitungsanlagen, Wassersanierungssysteme, Ölverarbeitungsanlagen, Papierzellstoff-Verarbeitungsanlagen, Wasserbehandlungsanlagen und Kühltürmen. Die antimikrobiellen Polypeptide der Erfindung sollten in einer Menge verwendet werden, die ausreichend ist zum Reinigen, Desinfizieren oder Inhibieren mikrobiellen Wachstums auf der in Frage stehenden Oberfläche.
Weiterhin ist in Betracht zu ziehen, dass die antimikrobiellen Polypeptide der Erfindung vorteilhafterweise in einem „cleaning-in-place" (C.I.P.) System zum Reinigen einer Verarbeitungsausrüstung jeder beliebigen Art verwendet werden können.
Die antimikrobiellen Polypeptide der Erfindung können zusätzlich zum Reinigen von Oberflächen und Kochutensilien in Nahrungsmittelverarbeitungsanlagen und in jedem beliebigen Bereich, in dem Nahrungsmittel zubereitet oder serviert werden, wie in Krankenhäusern, Altenheimen, Restaurants, insbesondere Fast-Food-Restaurants, Delikatessengeschäften und dergleichen verwendet werden. Sie können ebenfalls verwendet werden als eine antimikrobielle Substanz („antimicrobial") in Nahrungsmittelprodukten, und sie wären insbesondere geeignet als eine antimikrobielle Oberfläche bei Käse, Früchten und Gemüsen und Nahrungsmitteln an Salatbuffets.
Sie können ebenfalls als Konservierungsmittel oder als Desinfektionsmittel in Wasser-basierten Farben (Lacken) verwendet werden.
Die antimikrobiellen Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls für die mikrobielle Kontrolle von Wasserleitungen und für die Desinfektion von Wasser, insbesondere für die Desinfektion von Industriegewässer, verwendbar.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines antimikrobiellen Polypeptids oder einer Zusammensetzung der Erfindung als ein Medikament. Weiterhin kann ein antimikrobielles Polypeptid oder eine Zusammensetzung der Erfindung ebenfalls verwendet werden für die Herstellung eines Medikaments zum Kontrollieren oder zum Bekämpfen von Mikroorganismen, wie Pilzorganismen oder Bakterien, bevorzugt grampositiven Bakterien.
Die Zusammensetzung und das antimikrobielle Polypeptid der Erfindung können als ein antimikrobieller, veterinär- oder humantherapeutischer oder prophylaktischer Wirkstoff verwendet werden. Demnach kann die Zusammensetzung und das antimikrobielle Polypeptid der Erfindung in der Zubereitung von veterinär- oder humantherapeutischen Wirkstoffen oder prophylaktischen Wirkstoffen für die Behandlung von mikrobiellen Infektionen, wie bakteriellen Infektionen oder Pilzinfektionen, bevorzugt grampositiven bakteriellen Infektionen, verwendet werden. Insbesondere können die mikrobiellen Infektionen mit Lungenerkrankungen assoziiert sein, einschließlich, jedoch nicht hierauf beschränkt, Tuberkulose und zystische Fibrose; und geschlechtsübermittelten Krankheiten, einschließlich, jedoch nicht hierauf beschränkt, Gonorrhö und Chlamydia.
Die Zusammensetzung der Erfindung umfasst eine effektive Menge des antimikrobiellen Polypeptids der Erfindung.
Der Begriff „effektive Menge", wenn er hierin verwendet wird, bedeutet eine Menge des antimikrobiellen Polypeptids, welches die Aminosäuresequenz, gezeigt als Aminosäuren 1 bis 40 aus SEQ ID NR: 2, oder einem Fragment oder einer Variante hiervon umfasst, welche ausreichend ist, um das Wachstum der in Frage stehenden Mikroorganismen zu inhibieren.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Wundheilungszusammensetzungen oder Produkte, wie Bandagen, medizinische Vorrichtungen, wie z. B. Katheter, und weiterhin Anti-Schuppen-Haarprodukte, wie Shampoos.
In vitro-Synthese
Die antimikrobiellen Peptide der Erfindung können durch in vitro-Synthese unter Verwendung von herkömmlichen, im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Zahlreiche kommerzielle synthetische Apparaturen sind verfügbar, z. B. automatisierte Synthetisierer von Applied Biosystems Inc., Beckman, usw. Bei der Verwendung von Synthetisierern können natürlich vorkommende Aminosäuren durch nicht-natürliche Aminosäuren substituiert werden, insbesondere D-Isomere (oder D-Formen), z. B. D-Alanin und D-Isoleucin, Diastereoisomere, Seitenketten mit verschiedenen Längen oder Funktionalitäten und dergleichen. Die besondere Sequenz und die Art der Zubereitung bestimmt sich durch Nutzen, Wirtschaftlichkeit, der erforderlichen Reinheit und dergleichen.
Eine chemische Verknüpfung kann zu verschiedenen Peptiden oder Proteinen bereitgestellt werden, die zweckmäßige Funktionalitäten für eine Bindung umfassen, wie Aminogruppen für Amid- oder substituierte Amidbildung, z. B. reduktive Amination, Thiolgruppen für Thioether- oder Disulfidbildung, Carboxylgruppen für Amidbildung und dergleichen.
Wenn es erwünscht ist, können verschiedene Gruppen in das Peptid während der Synthese oder während der Expression eingeführt werden, welche die Verknüpfung zu anderen Molekülen oder zu einer Oberfläche ermöglichen. Demnach können Cysteine verwendet werden, um Thioester herzustellen, Histidine zum Verknüpfen mit einem Metallionenkomplex, Carboxylgruppen zum Bilden von Amiden oder Estern, Aminogruppen zum Bilden von Amiden, und dergleichen.
Die Polypeptide können ebenfalls gemäß herkömmlichen Verfahren der rekombinanten Synthese isoliert und aufgereinigt werden. Ein Lysat kann von dem Expressionswirt zubereitet werden, und das Lysat unter Verwendung von HPLC, Ausschlusschromatographie, Gelelektrophorese, Affinitätschromatographie oder anderen Aufreinigungstechniken aufgereinigt werden. Zum größten Teil umfassen die Zusammensetzungen, welche verwendet werden, mindestens 20 Gew.-% des gewünschten Produkts, stärker üblich mindestens ungefähr 75 %, bevorzugt mindestens ungefähr 95 Gew.-%, und für therapeutische Zwecke, üblicherweise mindestens ungefähr 99,5 Gew.-%, in Bezug auf die Kontaminanten, zusammenhängend mit dem Verfahren zur Herstellung des Produkts und seiner Aufreinigung. Üblicherweise basieren die Prozentsätze auf dem Gesamtprotein (Gehalt).
Tierfutter
Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls auf Verfahren zur Verwendung der Polypeptide mit antimikrobieller Aktivität in Tierfutter gerichtet, ebenso wie auf Futterzusammensetzungen und Futterzusätze, welche die antimikrobiellen Polypeptide der Erfindung umfassen.
Der Begriff Tier schließt alle Tiere ein, einschließlich Menschen. Beispiele für Tiere sind nicht-wiederkäuende Tiere und Wiederkäuer, wie Kühe, Schafe und Pferde. In einer besonderen Ausführungsform ist das Tier ein nicht-wiederkäuendes Tier. Nicht-wiederkäuende Tiere schließen monogastrische Tiere ein, z. B. Schweine oder Säue (einschließlich, jedoch nicht hierauf beschränkt, Ferkel, wachsende Schweine und Mutterschweine); Geflügel, wie Truthähne und Hühner (einschließlich, jedoch nicht hierauf beschränkt Brathähnchen, „layers"); junge Kälber; und Fisch (einschließlich, jedoch nicht hierauf beschränkt Lachs).
Der Begriff Futter oder Futterzusammensetzung bedeutet jede beliebige Verbindung, Zubereitung, Mischung oder Zusammensetzung, die für die Aufnahme durch ein Tier geeignet ist oder hierfür vorgesehen ist.
In der Verwendung gemäß der Erfindung kann das antimikrobielle Polypeptid an das Tier vor, nach oder gleichzeitig mit der Nahurng gefüttert werden. Letztgenanntes ist bevorzugt.
In einer besonderen Ausführungsform ist das antimikrobielle Polypeptid, in der Form, in welcher es dem Futter zugesetzt wird, oder wenn es in einem Futteradditiv eingeschlossen wird, genau definiert. Genau definiert bedeutet, dass die antimikrobielle Polypeptidzubereitung mindestens 50 % rein ist, wie anhand einer Größenausschlusschromatographie bestimmt wird (siehe Beispiel 12 von WO 01/58275). In anderen besonderen Ausführungsformen ist die antimikrobielle Polypeptidzubereitung mindestens 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 oder mindesten 95 % rein, wie anhand dieses Verfahrens bestimmt.
Eine genau definierte antimikrobielle Polypeptidzubereitung ist von Vorteil. Zum Beispiel ist es viel einfacher, ein antimikrobielles Polypeptid, das im Wesentlichen frei von störenden oder kontaminierenden anderen antimikrobiellen Polypeptiden ist, korrekt zu dem Futter zu dosieren. Der Begriff korrekt dosieren bezieht sich insbesondere auf die Aufgabe, konsistente und konstante Ergebnisse zu erhalten, und die Fähigkeit, die Dosierung auf der Basis des gewünschten Effekts zu optimieren.
Für die Verwendung in Tierfutter ist es jedoch nicht erforderlich, dass das antimikrobielle Polypeptid derart rein vorliegt; es kann zum Beispiel andere Enzyme einschließen, in welchem Fall es als eine antimikrobielle Polypeptidzubereitung bezeichnet werden kann.
Die antimikrobielle Polypeptidzubereitung kann (a) dem Futter direkt zugesetzt werden (oder direkt in einem Behandlungsverfahren von Pflanzenproteinen verwendet werden) oder es kann (b) in der Herstellung von einer oder mehreren Zwischenzusammensetzungen verwendet werden, wie Futterzusätzen oder Vormischungen, die nachfolgend zu dem Futter hinzugefügt werden (oder in einem Behandlungsverfahren verwendet werden). Der oben beschriebene Reinheitsgrad bezieht sich auf die Reinheit der originalen antimikrobiellen Polypeptidzubereitung, entweder gemäß obigem (a) oder (b) verwendet.
Antimikrobielle Polypeptidzubereitungen mit Reinheiten dieser Größenordnung sind insbesondere unter Verwendung von rekombinanten Herstellungsverfahren erhältlich, wobei sie nicht so leicht erhalten werden und ebenfalls einer viel höheren „batch-to-batch"-Variation unterworfen sind, wenn das antimikrobielle Polypeptid durch herkömmliche Fermentationsverfahren hergestellt wird.
Eine solche antimikrobielle Polypeptidzubereitung kann selbstverständlich mit anderen Enzymen vermischt werden.
Der Begriff Pflanzenproteine, wie hierin verwendet, bezieht sich auf jede beliebige Verbindung, Zusammensetzung, Zubereitung oder Mischung, welche mindestens ein Protein einschließt, das von einer Pflanze abgeleitet ist oder von einer Pflanze stammt, einschließlich modifizierter Proteine und Proteinderivate. In besonderen Ausführungsformen beträgt der Proteingehalt des Pflanzenproteins mindestens 10, 20, 30, 40, 50 oder 60 % (w/w).
Pflanzenproteine können von pflanzlichen Proteinquellen abgeleitet werden, wie Gemüse (Hülsenfrüchten) und Ceralien, z. B. Materien von Pflanzen der Familien Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae und Poaceae, wie Sojabohnenmehl, Lupinenmehl und Rapssamenmehl.
In einer besonderen Ausführungsform ist die pflanzliche Proteinquelle das Material von einer oder mehreren Pflanzen der Familie Fabaceae, z. B. Sojabohne, Lupine, Erbse oder Bohne.
In einer anderen besonderen Ausführungsform ist die pflanzliche Proteinquelle das Material von einer oder mehreren Pflanzen der Familie Chenopodiaceae, z. B. Rübe, Zuckerrübe, Spinat oder Reismelde.
Andere Beispiele für pflanzliche Proteinquellen sind Rapssamen und Kohl.
Sojabohne ist eine bevorzugte pflanzliche Proteinquelle.
Andere Beispiele für pflanzliche Proteinquellen sind Cerealien, wie Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais (Korn), Reis und Sorghum.
Das antimikrobielle Polypeptid kann dem Futter in jeder beliebigen Form zugefügt werden, sei es als ein relativ reines antimikrobielles Polypeptid oder in einer Beimischung mit anderen Komponenten, die für die Zugabe zu Tierfutter vorgesehen sind, d.h. in der Form von Tierfutteradditiven, wie die so genannten Vormischungen für Tierfutter.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen zur Verwendung in Tierfutter, wie Tierfutter und Tierfutteradditive, z. B. Vormischungen.
Abgesehen von dem antimikrobiellen Polypeptid der Erfindung können die Tierfutteradditive der Erfindung ebenfalls mindestens ein fettlösliches Vitamin und/oder mindestens ein wasserlösliches Vitamin und/oder mindestens ein Spurenmineral und/oder mindestens ein Makromineral enthalten.
Weiterhin sind Futteradditivbestandteile optional Färbungsmittel, Aromaverbindungen, Stabilisatoren und/oder mindestens ein anderes Enzym, ausgewählt aus Phytasen EC 3.1.3.8 oder 3.1.3.26; Xylanasen EC 3.2.1.8; Galactanasen EC 3.2.1.89; und/oder beta-Glucanasen EC 3.2.1.4.
In einer besonderen Ausführungsform sind diese anderen Enzyme genau definiert (wie oben beschrieben für die antimikrobiellen Polypeptidzubereitungen).
Beispiele für andere antimikrobielle Peptide (AMP's) sind CAP18, Leucocin A, Tritrpticin, Protegrin-1, Thanatin, Defensin, Ovispirin, wie Novispirin (Robert Lehrer, 2000) und Varianten oder Fragmente hiervon, welche die antimikrobielle Aktivität beibehalten.
Beispiele für andere antifungale Polypeptide (AFP's) sind die Peptide von Aspergillus giganteus und Aspergillus niger, ebenso wie Varianten und Fragmente hiervon, welche die antifungale Aktivität beibehalten, wie offenbart in WO 94/01459 und PCT/DK02/00289 [ersetzt durch die einmal veröffentlichte WO-Nummer].
Gewöhnlicherweise bilden fett- und wasserlösliche Vitamine, ebenso wie Spurenmineralien einen Teil einer so genannten Vormischung, die für die Zugabe zu dem Futter vorgesehen ist, wobei Makromineralien gewöhnlicherweise separat zu dem Futter hinzugefügt werden. Beide dieser Arten von Zusammensetzung sind, wenn sie mit einem antimikrobiellen Polypeptid der Erfindung angereichert werden, ein Tierfutteradditiv der Erfindung.
In einer besonderen Ausführungsform ist das Tierfutteradditiv der Erfindung dazu vorgesehen, in Tiernahrung oder Futter eingeschlossen zu sein (oder wie vorbeschrieben eingeschlossen zu werden) bei einem Level von 0,01 bis 10,0 %; stärker bevorzugt 0,05 bis 5,0 %; oder 0,2 bis 1,0 (% bedeutet Gramm Additiv pro 100 g Futter). Dies ist insbesondere der Fall bei Vormischungen.
Die nachfolgenden sind nicht-ausschließliche Listen von Beispielen dieser Komponenten:
Beispiele für fettlösliche Vitamine sind Vitamin A, Vitamin D3, Vitamin E und Vitamin K, z. B. Vitamin K3.
Beispiele für wasserlösliche Vitamine sind Vitamin B12, Biotin und Cholin, Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B6, Niacin, Folsäure und Panthothenat, z. B. Ca-D-Panthothenat.
Beispiele für Spurenmineralien sind Mangan, Zink, Eisen, Kupfer, Jod, Selen und Kobalt.
Beispiele für Makromineralien sind Calcium, Phosphor und Natrium.
Der Nährstoffbedarf an diesen Komponenten (erprobt an Geflügel und Ferkeln/Schweinen) ist in Tabelle A aus WO 01/58275 aufgelistet. Der Nährstoffbedarf bedeutet, dass diese Komponenten in dem Nahrungsmittel in den angezeigten Konzentrationen bereitgestellt werden sollten.
Alternativ umfasst das Tierfutteradditiv der Erfindung mindestens eine der individuellen Komponenten, die in Tabelle A aus WO 01/58275 spezifiziert sind. Mindestens eine bedeutet eine von, eine oder mehrere von, eine oder zwei oder drei oder vier usw. bis zu allen dreizehn oder bis zu allen fünfzehn individuellen Komponenten. Genauer ist diese mindestens eine individuelle Komponente in dem Additiv der Erfindung in einer solchen Menge eingeschlossen, die eine „in-feed"-Konzentration innerhalb des Bereichs, der in Spalte 4 oder Spalte 5 oder Spalte 6 aus Tabelle A angezeigt ist, bereitstellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Tierfutterzusammensetzungen. Tierfutterzusammensetzungen oder -nahrungsmittel besitzen einen relativ hohen Proteingehalt. Nahrungsmittel für Geflügel und Schweine können wie in Tabelle B aus WO 01/58275, Spalten 2 bis 3 angezeigt, charakterisier werden. Nahrungsmittel für Fische können wie in Spalte 4 dieser Tabelle B angezeigt charakterisiert werden. Weiterhin besitzen solche Nahrungsmittel für Fische gewöhnlicherweise einen reinen Fettgehalt von 200 bis 310 g/kg.
Eine Tierfutterzusammensetzung gemäß der Erfindung weist einen Gehalt an reinem Protein von 500 bis 800 g/kg auf und umfasst weiterhin mindestens ein antimikrobielles Polypeptid, wie hierin beansprucht.
Weiterhin oder als Alternative (zu dem oben angezeigten reinen Proteingehalt) weist die Tierfutterzusammensetzung der Erfindung einen Gehalt an abbaubarer Energie von 10 bis 30 MJ/kg; und/oder einen Calciumgehalt von 0,1 bis 200 g/kg; und/oder einen Gehalt an verfügbarem Phosphor von 0,1 bis 2 g/kg; und/oder einen Methioningehalt von 0,1 bis 100 g/kg; und/oder einen Gehalt an Methionin plus Cystein von 0,1 bis 150 g/kg; und/oder einen Lysingehalt von 0,5 bis 50 g/kg auf.
In besonderen Ausführungsformen liegt der Gehalt an abbaubarer Energie, reinem Protein, Calcium, Phosphor, Methionin, Methionin plus Cystein und/oder Lysin innerhalb eines beliebigen der Bereiche 2, 3, 4 oder 5 aus Tabelle B von WO 01/58275 (R. 2-5).
Reines Protein wird berechnet als Stickstoff (N) multipliziert mit einem Faktor 6,25, d.h. reines Protein (g/kg) = N (g/kg) × 6,25. Der Stickstoffgehalt wird anhand des Kjeldahl-Verfahrens bestimmt (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis, 14. Auflage, Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).
Die abbaubare Energie kann auf der Basis der NRC-Publikation Nutrient requirements in swine, 9. überarbeitete Auflage 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council, National Academy Press, Washington, D.C., S. 2 – 6, und der europäischen Tabelle für Energiewerte für Geflügelnahrungsmittelstoffe, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Niederlande, Grafisch bedrijf Ponsen & Iooijen bv, Wageningen, ISBN 90-71463-12-5 berechnet werden.
Der Nahrungsmittelgehalt an Calcium, verfügbarem Phosphor und Aminosäuren in Tiervollnahrungsmitteln wird auf der Basis von Nahrungsmitteltabellen berechnet, wie Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde von voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg, 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.
In einer besonderen Ausführungsform enthält die Tierfutterzusammensetzung der Erfindung mindestens ein pflanzliches Protein oder eine Proteinquelle, wie oben definiert.
In noch weiteren besonderen Ausführungsformen enthält die Tierfutterzusammensetzung der Erfindung 0 bis 80 % Mais; und/oder 0 bis 80 % Sorghum; und/oder 0 bis 70 % Weizen; und/oder 0 bis 70 % Gerste; und/oder 0 bis 30 % Hafer; und/oder 0 bis 40 % Sojabohnenmehl; und/oder 0 bis 10 % Fischmehl; und/oder 0 bis 20 % Molke. Tiernahrungsmittel können beispielsweise als Futterbrei (nicht pelletiert) oder pelletiertes Futter hergestellt werden. Typischerweise werden die gemahlenen Nahrungsmittelstoffe gemischt und ausreichende Mengen an essentiellen Vitaminen und Mineralien werden gemäß den für die in Frage stehenden Arten vorliegenden Spezifikationen hinzugefügt. Enzyme können als feste oder flüssige Enzymformulierungen hinzugefügt werden. Zum Beispiel wird eine feste Enzymformulierung typischerweise vor oder während des Vermischungsschritts hinzugefügt; und eine flüssige Enzympräparation wird typischerweise nach dem Pelletierungsschritt hinzugefügt. Das Enzym kann ebenfalls in einem Futteradditiv oder einer Vormischung eingebaut werden.
Die Endkonzentration an Enzym in dem Nahrungsmittel liegt innerhalb des Bereichs von 0,01 bis 200 mg Enzymprotein pro kg Nahrungsmittel, zum Beispiel in dem Bereich von 5 bis 30 mg Enzymprotein pro kg Tiernahrungsmittel.
Das antimikrobielle Polypeptid kann in einer oder mehreren der folgenden Mengen (Dosierungsbereich) verabreicht werden: 0,01 – 200; oder 0,01 – 100; oder 0,05 – 100; oder 0,05 – 50; oder 0,10 – 10 – wobei sämtliche dieser Bereiche in mg antimikrobielles Polypeptidprotein pro kg Futter (ppm) angegeben sind.
Zum Bestimmen der mg an antimikrobiellem Polypeptidprotein pro kg Futter, wird das antimikrobielle Polypeptid aus der Futterzusammensetzung aufgereinigt und die spezifische Aktivität des aufgereinigten antimikrobiellen Polypeptids wird unter Verwendung eines einschlägigen Assays bestimmt (siehe unter antimikrobielle Aktivität, Substrate und Assays). Die antimikrobielle Aktivität der Futterzusammensetzung als solche wird ebenfalls unter Verwendung des gleichen Assays bestimmt, und auf der Basis dieser zwei Bestimmungen wird die Dosierung in mg antimikrobiellem Polypeptidprotein pro kg Futter berechnet.
Die gleichen Prinzipien finden für die Bestimmung von mg antimikrobiellem Polypeptidprotein in Futteradditiven Anwendung. Selbstverständlich wird, wenn eine Probe des antimikrobiellen Polypeptids, das für die Zubereitung des Futteradditivs oder des Futters verwendet wird, verfügbar ist, die spezifische Aktivität von dieser Probe bestimmt (es besteht kein Bedarf, das antimikrobielle Polypeptid aus der Futterzusammensetzung oder dem Additiv aufzureinigen).
Detergentzusammensetzung
Die antimikrobiellen Polypeptide der Erfindung können einer Detergentzusammensetzung hinzugefügt werden, und somit eine Komponente einer Detergentzusammensetzung werden.
Die Detergentzusammensetzung der Erfindung kann zum Beispiel als eine Detergentzusammensetzung für Hand- oder Maschinenwäsche formuliert sein, einschließlich einer Waschadditivzusammensetzung, die geeignet für die Vorbehandlung von verschmutzten Geweben ist, und einer Weichspülerzusammensetzung, die dem Spülvorgang hinzugefügt wird, oder kann als eine Detergentzusammensetzung für die Verwendung von allgemeinen Reinigungsvorgänge von harten Oberflächen im Haushalt formuliert sein, oder kann für Hand- oder Maschinengeschirrspülvorgänge formuliert sein.
In einem spezifischen Aspekt stellt die Erfindung ein Detergentadditiv bereit, welches die antimikrobiellen Polypeptide der Erfindung und ein Tensid umfasst. Die Detergentadditive, ebenso wie die Detergentzusammensetzung, kann ein oder mehrere andere Enzyme umfassen, wie eine Protease, eine Lipase, eine Cutinase, eine Amylase, eine Carbohydrase, eine Cellulase, eine Pectinase, eine Mannanase, eine Arabinase, eine Galactanase, eine Xylanase, eine Oxidase (wie eine Laccase) und/oder eine Peroxidase (wie eine Haloperoxidase).
Im Allgemeinen sollten die Eigenschaften des/der gewählten Enzyms/Enzyme kompatibel sein mit dem ausgewählten Detergent (d.h. pH-Optimum, Kompatibilität mit anderen enzymatischen und nicht-enzymatischen Bestandteilen usw.) und das/die Enzym(e) sollte/sollten in wirksamen Mengen vorhanden sein.
Proteasen: Geeignete Proteasen schließen solche von tierischer, pflanzlicher oder mikrobieller Herkunft ein. Mikrobielle Herkunft ist bevorzugt. Chemisch modifizierte oder proteintechnisch hergestellte Mutanten sind eingeschlossen. Die Protease kann eine Serinprotease oder eine Metalloprotease, bevorzugt eine alkalische mikrobielle Protease oder eine Trypsin-ähnliche Protease, sein. Beispiele für alkalische Proteasen sind Subtilisine, insbesondere solche, die von Bacillus abgeleitet werden, z. B. Subtilisin Novo, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin 309, Subtilisin 147 und Subtilisin 168 (beschrieben in WO 89/06279). Beispiele für Trypsin-ähnliche Proteasen sind Trypsin (z. B. mit Herkunft von Schwein oder vom Rind) und die Protease von Fusarium, beschrieben in WO 89/06270 und WO 94/25583.
Beispiele für verwendbare Proteasen sind die Varianten, die in WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 und WO 98/34946 beschrieben werden, insbesondere die Varianten mit Substitutionen an einer oder mehreren der folgenden Positionen: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 und 274.
Lipasen: Geeignete Lipasen schließen solche mit bakterieller oder fungaler Herkunft ein. Chemisch modifizierte oder proteintechnisch hergestellte Mutanten sind eingeschlossen. Beispiele für geeignete Lipasen schließen die Lipasen von Humicola (Synonym Thermomyces), z. B. von H. lanuginosa (T. lanuginosus), wie beschrieben in EP 258 068 und EP 305 216 , oder von N. insolens, wie beschrieben in WO 96/13580, eine Lipase von Pseudomonas, z. B. von P. alcaligenes oder P. pseudoalcaligenes ( EP 218 272 ), P. cepacia ( EP 331 376 ), P. stutzeri ( GB 1,372,034 ), P. fluorescens, Pseudomonas sp. Stamm SD 705 (WO 95/06720 und WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), eine Lipase von Bacillus, z. B. von B. subtitlis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253 – 360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) oder B. pumilus (WO 91/16422), ein.
Andere Beispiele sind Lipasevarianten, wie solche, die in WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225 , EP 260 105 , WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 und WO 97/07202 beschrieben sind.
Amylasen: Geeignete Amylasen (alpha- und/oder beta-) schließen solche von bakterieller oder fungaler Herkunft ein. Chemisch modifizierte oder proteintechnisch hergestellte Mutanten sind eingeschlossen. Amylasen schließen zum Beispiel alpha-Amylasen ein, die von Bacillus erhalten werden, z. B. einem speziellen Stamm von B. licheniformis, der in weiterem Detail in GB 1,296,839 beschrieben wird.
Beispiele für verwendbare Amylasen sind die Varianten, die in WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 und WO 97/43424 beschrieben werden, insbesondere die Varianten mit Substitutionen an einer oder mehreren der folgenden Positionen: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 und 444.
Cellulasen: Geeignete Cellulasen schließen solche von bakterieller oder fungaler Herkunft ein. Chemisch modifizierte oder proteintechnisch hergestellte Mutanten sind eingeschlossen. Geeignete Cellulasen schließen Cellulasen der Gattungen Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium ein, z. B. die fungalen Cellulasen, die von Humicola insolens, Myceliophthora thermophila und Farsarium oxysporum, offenbart in US 4,435,307 , US 5,648,263 , US 5,691,178 , US 5,776,757 und WO 89/09259 hergestellt werden.
Insbesondere geeignete Cellulasen sind die alkalischen oder neutralen Cellulasen, die Vorteile für die Farbpflege aufweisen. Beispiele für solche Cellulasen sind die Cellulasen, beschrieben in EP 0 495 257 , EP 0 531 372 , WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Andere Beispiele sind Cellulasevarianten, wie solche, die in WO 94/07998, EP 0 531 315 , US 5,457,046 , US 5,686,593 , US 5,763,254 , WO 95/24471, WO 98/12307 und PCT/DK98/00299 beschrieben werden.
Peroxidasen/Oxidasen: Geeignete Peroxidasen/Oxidasen schließen solche von pflanzlicher, bakterieller oder fungaler Herkunft ein. Chemisch modifizierte oder proteintechnisch hergestellte Mutanten sind eingeschlossen. Beispiele für verwendbare Peroxidasen schließen Peroxidasen von Coprinus, z. B. von C. cinereus, und Varianten hiervon, wie solche, die in WO 93/24618, WO 95/10602 und WO 98/15257 beschrieben werden, ein.
Das/die Detergentenzym(e) kann/können in eine Detergentzusammensetzung eingeschlossen werden, indem separate Additive, die ein oder mehrere Enzym(e) enthalten, hinzugefügt werden, oder indem ein kombiniertes Additiv, welches alle dieser Enzyme umfasst, hinzugefügt wird. Ein Detergentadditiv der Erfindung, d.h. ein separates Additiv oder ein kombiniertes Additiv, kann zum Beispiel als ein Granulat, eine Flüssigkeit, ein Brei, usw. formuliert werden. Bevorzugte Detergentadditivformulierungen sind Granulate, insbesondere nicht-staubende Granulate, Flüssigkeiten, insbesondere stabilisierte Flüssigkeiten, oder Brei.
Nicht-staubende Granulate können hergestellt werden, wie beispielsweise in US 4,106,991 und 4,661,452 beschrieben, und können optional durch im Stand der Technik bekannte Verfahren beschichtet werden. Beispiele für Wachsbeschichtungsmaterialien sind Poly(ethylenoxid)-Produkte (Polyethylenglycol, PEG) mit mittleren Molekulargewichten von 1000 bis 20.000; ethoxylierte Nonylphenole, die von 16 bis 50 Ethylenoxideinheiten aufweisen; ethoxylierte Fettalkohole, in welchen der Alkohol von 12 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist, und in welchen 15 bis 18 Ethylenoxideinheiten vorliegen; Fettalkohole, Fettsäuren; und Mono- und Di- und Triglyceride von Fetsäuren. Beispiele für filmbildende Beschichtungsmaterialien, die für die Anwendung mittels Flussbetttechniken geeignet sind, sind in GB 1483591 gegeben. Flüssige Enzymzubereitungen können zum Beispiel durch Hinzufügen eines Polyols, wie eines Propylenglycols, eines Zuckers oder Zuckeralkohols, Milchsäure oder Borsäure, gemäß etablierter Verfahren, stabilisiert werden. Geschützte Enzyme können gemäß dem in EP 238,216 offenbarten Verfahren zubereitet werden.
Die Detergentzusammensetzung der Erfindung kann in jeder beliebigen passenden Form vorliegen, z. B. einem Strang, einer Tablette, einem Pulver, einem Granulat, einer Paste oder einer Flüssigkeit. Ein flüssiges Detergent kann wässrig sein, und typischerweise bis zu 70 % Wasser und 0 bis 30 % organisches Lösungsmittel enthalten, oder kann nicht-wässrig sein.
Die Detergentzusammensetzung umfasst ein oder mehrere Tenside, welche nicht-ionisch, einschließlich semi-polar und/oder anionisch und/oder kationisch und/oder zwitterionisch sein können. Die Tenside sind typischerweise bei einem Level von 0,1 % bis 60 Gew.-% vorhanden.
Wenn es hierin eingeschlossen ist, enthält das Detergent gewöhnlicherweise von ungefähr 1 % bis ungefähr 40 % eines anionischen Tensids, wie eines linearen Alkylbenzolsulfonats, alpha-Olefinsulfonats, Alkylsulfats (Fettalkoholsulfats), Alkoholethoxysulfats, sekundären Alkansulfonats, alpha-Sulfofettsäuremethylesters, Alkyl- oder Alkenylsuccinsäure oder Seife.
Wenn hierin enthalten, enthält das Detergent gewöhnlicherweise von ungefähr 0,2 % bis ungefähr 40 % eines nicht-ionischen Tensids, wie eines Alkoholethoxylats, Nonylphenolethoxylats, Alkylpolyglycosids, Alkyldimethylaminoxids, ethoxylierten Fettsäuremonoethanolamids, Fettsäuremonoethanolamids, Polyhydroxyalkylfettsäureamids oder N-Acyl-N-alkyl-Derivate von Glucosamin („Glucamide").
Das Detergent kann 0 bis 50 % an Detergent-Builder oder komplexbildenden Mittels enthalten, wie Zeolith, Diphosphat, Triphosphat, Phosphonat, Carbonat, Citrat, Nitrilotriessigsäure, Ethylendiamintetraessigsäure, Diethylentriaminpentaessigsäure, Alkyl- oder Alkenylsuccinsäure, lösliche Silikate oder Schichtsilikate (z. B. SKS-6 von Hoechst).
Das Detergent kann ein oder mehrere Polymere umfassen. Beispiele sind Carboxymethylcellulose, Poly(vinylpyrrolidon), Poly(ethylenglycol), Poly(vinylalkohol), Poly(vinylpyridin-N-oxid), Poly(vinylimidazol), Polycarboxylate, wie Polyacrylate, Malein-/Acrylsäure-Copolymere und Laurylmethacrylat-/Acrylsäure-Copolymere.
Das Detergent kann ein Bleichsystem enthalten, welches eine H₂O₂-Quelle umfassen kann, wie Perborat oder Percarbonat, welches mit einem Peracid-bildenden Bleichaktivator kombiniert sein kann, wie Tetraacetylethylendiamin oder Nonanoyloxybenzolsulfonat. Alternativ kann das Bleichsystem Peroxysäuren umfassen, beispielsweise des Amid-, Imid- oder Sulfontyps.
Das/die Enzym(e) der Detergentzusammensetzung der Erfindung kann/können unter Verwendung von herkömmlichen Stabilisierungsmitteln stabilisiert werden, z. B. einem Polyol, wie Propylenglycol oder Glycerol, einem Zucker oder Zuckeralkohol, Milchsäure, Borsäure („boric acid") oder einem Borsäurederivat („boric acid derivate"), z. B. einem aromatischen Boratester, oder einem Phenylborsäurederivat („phenyl boronic acid derivat"), wie 4-Formylphenylborsäure („4-formylphenyl boronic acid"), und die Zusammensetzung kann, wie beispielsweise in WO 92/19709 und WO 92/19708 beschrieben, formuliert werden.
Das Detergent kann ebenfalls andere herkömmliche Detergentbestandteile enthalten, wie beispielsweise Stoffverbesserer, einschließlich Tonerde, Schaumverstärker, Seifenlaugenunterdrücker, Anti-Korrosionsmittel, Schmutz-suspendierende Mittel, Anti-Schmutz- Redepositionsmittel, Farbstoffe, Bakterizide, optische Aufheller, Hydrotropika, Trübungsinhibitoren oder Duftstoffe.
Es ist gegenwärtig in Erwägung zu ziehen, dass in die Detergentzusammensetzungen jedes beliebige Enzym und die antimikrobiellen Polypeptide der Erfindung in einer Menge hinzugefügt werden können, die 0,01 bis 100 mg des Enzymproteins pro Liter Waschflüssigkeit entspricht, bevorzugt 0,05 bis 10 mg Enzymprotein pro Liter Waschflüssigkeit, stärker bevorzugt 0,1 bis 5 mg Enzymprotein pro Liter Waschflüssigkeit und am stärksten bevorzugt 0,1 bis 1 mg Enzymprotein pro Liter Waschflüssigkeit.
Die antimikrobiellen Polypeptide der Erfindung können zusätzlich in die Detergentformulierungen, die in WO 97/07202 offenbart sind, eingebaut werden.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin anhand der folgenden Beispiele beschrieben, welche nicht nicht dahingehend zu interpretiert werden sollten, dass sie den Schutzbereich der Erfindung limitieren.
BEISPIELE
Chemikalien, die als Puffer und Substrate verwendet wurden, waren herkömmliche Produkte von mindestens Reinheitsgrad.
BEISPIEL 1
Identifizierung eines antimikrobiellen Polypeptids von Pseudoplectania nigrella
Materialien und Verfahren
Es wurde eine cDNA-Bibliothek von P. nigrella-Medium hergestellt, welches für fünf Tage mit Mex-1-Medium induziert wurde (das Protokoll befindet sich in den Beispielen der internationalen Patentanmeldung WO 98/38288). PolyA-angereicherte RNA wurde aufgereinigt, cDNA wurde synthetisiert und die Bibliothek wurde hergestellt, gemäß molekularbiologischen Standardvorgehensweisen. Ein ausführliches Protokoll des allgemeinen Verfahrens kann in den Beispielen der internationalen Patentanmeldung WO 01/12794 gefunden werden. Der für die Klonierung verwendete Vektor war pMhas5, welcher in SEQ ID NR: 4 dargestellt ist, und welcher die folgenden Merkmale aufweist:
Tabelle 1. Eigenschaften des Vektors pMhas5.
Beachtenswerte Merkmale dieses Plasmids sind die EcoRI-NotI-Restriktionsstellen, die in der Nähe der Shine-Dalgarno-Region des Lac-Promotors liegen. Dies erlaubt es, EcoRI-Notl-adaptierte cDNAs in den Vektor zu klonieren und die resultierenden Konstrukte aktiv in dem E. coli-Wirt aktiv zu transkribieren und zu translatieren.
Konstruktion der Bibliothek Pseudoplectania nigrella und Signal-Trapping (Signal-Einfangen) des cDNA-ergebenden Plasmidpools
Ein cDNA-Plasmidpool wurde von gesamt 20.000 Transformanten („20,000 total transformants") aus der ursprünglichen cDNA-pMHas5-Vektorligation zubereitet. Plasmid-DNA wurde direkt von einem Pool von Kolonien präpariert, die von festem LB-Selektivmedium gewonnen wurden, gemäß dem Qiagen-Protokoll für Plasmid-DNA-Isolierung (Qiagen Inc.). Der Plasmidpool wurde mit dem Transposon SigA2 und der MuA-Transposase behandelt, gemäß den Instruktionen der Hersteller der Transposase (Finnizyme, Finnland). Allgemeine Informationen über Transposonunterstütztes Signal-Trapping kann in der internationalen Patentanmeldung WO 01/77315 gefunden werden. Die resultierende Mischung wurde Ethanol-präzipitiert, um den Überschuss an Salz zu entfernen, und 1,5 Mikroliter wurden in 20 Mikroliter DH10B ultra-kompetente Zellen elektroporiert, gemäß dem Standardprotokoll, das mit den Zellen bereitgestellt wird (Gibco-BRL). Die elektroporierten Zellen wurden in SOC-Medium unter Schütteln inkubiert (28 °C, zwei Stunden, 250 Upm), bevor sie auf Selektivmedien ausplattiert wurden. Es wurden drei Agar-Medien verwendet:
LB + 50 Mikrogramm pr. ml Kanamycin,
LB + Kanamycin + 15 Mikrogramm pr. ml Chloramphenicol oder
LB + Kanamycin + Chloramphenicol + 12,5 Mikrogramm pr. ml Ampicillin
Aus der Verdünnungs-Ausplattierung von der Elektroporation auf LB + Kanamycin + Chloramphenicol-Medium wurde bestimmt, dass ungefähr 119.000 Kolonien vorhanden waren, die ein cDNA-Bibliotheks-Plasmid mit einer SigA2-Transposition enthielten. Alle 363 Kolonien wurden aus dem Experiment unter Dreifachselektion gewonnen. Alle 363 Kolonien wurden Replika-plattiert auf einer Dreifachselektion mit 50 Mikrogramm pr. ml Ampicillin, um nach echten Signal-Trappants zu selektieren. Eine Gesamtmenge von 336 Kolonien war in der Lage, unter der erhöhten Ampicillin-Konzentration zu wachsen, und aus diesen wurden Minipräps gemäß dem Qiagen Qiaturbo96-Protokoll (Qiagen Inc.) hergestellt. Die Plasmide wurden nachfolgend sequenziert mit den Transposon-Vorwärts- und Rückwärtsprimern (Primer A und B) gemäß der Vorgehensweise, die in den Beispielen der internationalen Patentanmeldung WO 01/77315 offenbart ist.

Primer A: agcgt ttgcg gccgc gatcc (SEQ ID NR: 16)
Primer B: ttatt cggtc gaaaa ggatc c (SEQ ID NR: 17)

Die DNA-Sequenz für die Reaktionen wurde anhand eines AB3700-Kapillarsequenzierers erhalten. Die Sequenzen wurden angepasst (beschnitten), um die Vektor- und Transposonsequenz zu entfernen, und die Primer A und B lasen die Sequenz für jedes zusammengesetzte Plasmid ab. Dies resultierte in 225 zusammengesetzten Sequenzen, welche anhand der Sequenzhomologie in 145 Kontingente eingeteilt wurden. Alle 145 Kontingente wurden unabhängig Blast unterzogen („blasted") und die Resultate wurden analysiert. Ein Plasmid (Plectasin_6_B12) teilte eine gewisse Aminosäurehomologie mit bekannten antimikrobiellen Polypeptiden (Defensin-ähnliche Polypeptide).
In den folgenden Beispielen wird das Polypeptid der Erfindung als „Plectasin" bezeichnet.
BEISPIEL 2
Konstruktion eines Expressionsvektors von Aspergillus für Plectasin
Die Plectasin-kodierende Sequenz wurde von der oben beschriebenen cDNA-Bibliothek amplifiziert (siehe Beispiel 1 oben) in folgender Weise: 1 Mikroliter cDNA (ungefähr 100 Nanogramm DNA) wurde als Template in einer PCR-Reaktion mit den zwei Primern 178 und 179 verwendet.

Primer 178: tctgg atcca ccatg caatt tacca ccatc ctctc (SEQ ID NR: 7)
Primer 179: tctct cgagc tagta acact tgcaa acaaa gc (SEQ ID NR: 8)

10 pmol von jedem Primer wurden in einem Reaktionsvolumen von 100 Mikroliter verwendet. Die Annealingtemperatur betrug 55 Grad Celsius und die Extension erfolgte bei 72 Grad Celsius für 1 Minute. Eine Gesamtanzahl von 35 Zyklen wurde laufen gelassen. Das Expand High Fidelity PCR System (Roche) wurde verwendet.
Aliquots aus der PCR-Reaktion wurden über ein 4%-iges Agarosegel separiert. Zwei deutliche Banden waren zu sehen: die am stärksten auftretende Bande bei einer Größe von ungefähr 300 Bp und eine etwas schwächere Bande bei ungefähr 350 Bp.
Beide Fragmente wurden mit BamHI und XhoI verdaut, welche die Überhänge abschnitten, die durch die PCR-Primer eingeführt wurden. Die verdauten Fragmente wurden isoliert und in pMT2188 kloniert, einem Expressionsplasmid von Aspergillus, das auf dem Plasmid pCaHj527 basiert (siehe die Beispiele der internationalen Patentanmeldung WO 00/70064), konstruiert wie in Beispiel 7 der dänischen Patentanmeldung PA 2001 00088 beschrieben. Für das kürzere Fragment wurde festgestellt, dass es die Plectasin-kodierende Sequenz enthielt, wie sie aus dem Signal-Trapping-Experiment bestimmt wurde (siehe Beispiel 1 oben). Die Sequenz dieses kürzeren PCR-Fragments ist als SEQ ID NR: 5 dargestellt.
Gleichzeitig wurde für die Sequenz des längeren PCR-Fragments bestimmt, dass sie die Plectasinkodierende Sequenz und ein zusätzliches Insert von 58 Bp enthält. Es wurde festgestellt, dass das 58-Bp-Insert die Konsensusmerkmale eines Pilzintrons enthält, und die Amplifikation dieses Produkts wird als Beweis für eine unvollständige Entfernung des Introns in dem mRNA-Pool und der abgeleiteten cDNA-Bibliothek angesehen. Die Sequenz dieses längeren PCR-Fragments ist als SEQ ID NR: 6 dargestellt. Das Expressionsplasmid von Aspergillus für das kürzere PCR-Produkt (SEQ ID NR: 5) wurde pMT2548 genannt.
BEISPIEL 3
Expression von Plectasin in Aspergillus:
PMT2548 wurde in den Stamm BECh2 von Aspergillus oryzae (offenbart in der internationalen Patentanmeldung WO 00/39322) und in MBin118 von Aspergillus niger transformiert. 30 Transformanten von jedem Stamm wurden zweimal re-isoliert unter selektiven und nicht-induzierenden Bedingungen auf Cove-Minimalplatten mit Sacharose und Acetamid. Um die Expression von Plectasin zu überprüfen, wurden die Transformanten für 6 Tage bei 30 Grad Celsius in Röhrchen mit 10 ml YPM (2 % Pepton, 1 % Hefeextrakt, 2 % Maltose) wachsen gelassen. Die Überstände wurden über NuPage 10 % Bis-Tris-SDS-Gele (Invitrogen) laufen gelassen, wie von den Herstellern empfohlen mit MES-Laufpuffer, um die Separation in dem niedrigen Molekulargewichtsbereich zu ermöglichen. Beide Stämme von Aspergillus wuchsen gut, selbst wenn die Expression von Plectasin induziert wurde. Eine deutliche Bande mit der Größe, die für Plectasin erwartet wurde, wurde bei den meisten Transformanten gesehen, wobei diese Bande nicht gesehen wurde bei den nicht-transformierten Wirtsstämmen BECh2 von A. oryzae und MBin118 von A. niger. Es hatte den Anschein, dass die Plectasin-Bande bei den BECh2-Transformanten stärker auftrat als bei den MBin118-Transformanten. Es wurde sehr grob und lediglich auf der Basis der Anfärbungsintensität geschätzt, dass die Ausbeute unter diesen Wachstumsbedingungen in der Größenordnung von 10 bis 50 mg pro Liter Kulturmedium betrug.
BEISPIEL 4
Klonieren von Plectasin in das Suizid-Expression-System (SES)
Das Plectasin-Fragment wurde mittels PCR amplifiziert, unter Verwendung der Volllängen-cDNA von Plectasin als Template (Plectasin 6 B12) und den NcoI- und XbaI-Linkerprimern DR34F und DR34R.

DR34F: ccggccatgg gatttggatg caatggtcct tggg (SEQ ID NR: 9)
DR34R: gccgtctaga gccatctagt aacacttgca aacaaagccc cccttagc (SEQ ID NR: 10)

Die PCR-Amplifizierung wurde unter Verwendung der PWO DNA-Polymerase gemäß den Angaben des Herstellers (Roche Bioscience, CA) durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde mit NcoI und XbaI verdaut und in pHNA- und pHH-Plasmide direktional eingefügt (offenbart in den Beispielen der internationalen Patentanmeldung WO 00/73433). Die resultierenden Plasmide wurden pDR-18-Plectasin für die cytoplasmatische Expression des Peptids und pDRS-18-Plectasin für die periplasmatische Expression genannt.
Beide Plasmide enthielten die folgende Aminosäuresequenz des Plectasin-Fragments:
mGFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY (SEQ ID NR: 11)
wobei m (Methionin) nicht in dem nativen Plectasin vorhanden ist, jedoch als ein Resultat der Klonierungsstrategie eingeführt wurde.
Wachstumsinhibierung von E. coli über die Expression von Plectasin
Um zu bewerten, ob das Wachstum von E. coli in Flüssigmedium über die Induktion einer endogenen Plectasinexpression inhibiert wurde, wurde das folgende Experiment durchgeführt, wie in den Beispielen der internationalen Patentanmeldung WO 00/73433 offenbart. Kurz beschrieben, wurden frische Übernachtkulturen von Zellen, welche entweder pDRS-18-Plectasin-, pDR-18-Plectasin-, pHH- oder pHHA-Plasmid enthielten, wurden 300-fach in 150 Mikroliter LB oder LB, enthaltend 0,1 % Arabinose, in einer Mikrotiterplatte verdünnt und bei 37 Grad Celsius unter heftigem Schütteln inkubiert. Die Wachstumskurve wurde überwacht, indem die OD₄₅₀ in regelmäßigen Intervallen unter Verwendung eines ELISA-Readers gemessen wurde. Die Resultate zeigten, dass Plectasin 41 % des Zellwachstums inhibierte, wenn es in das Periplasma gelenkt wurde, es beeinflusste jedoch nicht das Zeltwachstum, wenn es in dem Cytoplasma exprimiert wurde (siehe nachfolgende Tabelle).
Tabelle 2. Inhibition des Zellwachstums.
BEISPIEL 5
Klonieren, Expression und Aktivitätsbewertung von Plectasin von P. nigrella in E. coli Klonieren von Plectasin von P. nigrella in pET31b+
Um Plectasin für antimikrobielle Aktivitätsassays herzustellen, wurde die cDNA, die das Plectasin kodiert, in den Expressionsvektor pET31b+ (Novagen Inc., WI) eingefügt. Durch spezifisch gestaltete Oligonukleotide (Primer 1 und Primer 2) wurde das Plectasingen mittels Polymerasekettenreaktion unter Verwendung der PWO DNA-Polymerase gemäß den Angaben des Herstellers (Roche Bioscience, CA) amplifiziert.

Primer 1: attattcagatgctggatcc gaaaaacctgcgtcgcatta tccgcaaaggcatccatatc (SEQ ID NR: 12)
Primer 2: aataatctcgagttattagc catattttttaatgatatgg atgcctttgcggataatgcg ac (SEQ ID NR: 13)

Die enzymatische Verdauung der flankierenden Restriktionsendonukleasestellen (A1wNI/Aval) ermöglichte es, dieses Gen als ein Fusionskonstrukt in pET31b+ zu klonieren (Standardvorgehensweisen wie von dem Hersteller beschrieben (New England Biolabs Inc., MA)). Alle Standardprotokolle sind anderswo beschrieben worden (Sambrook, Fritsch und Maniatis, 1989).
Transformation und Expression von Plectasin von P. nigrella in E. coli
Rekombinantes pET31b+ wurde in E. coli Novablue transformiert, wie von dem Hersteller (Novagen) beschrieben. Das Plasmid wurde mittels QIAprep-Minisäulen (QIAGEN Inc., CA) präpariert und anhand automatischer Sequenzierung unter Verwendung der Plasmid-spezifischen Primer (Primer 3 und Primer 4) sequenziert.

Primer 3: tgctagttat tgctcagcgg (SEQ ID NR: 14)
Primer 4: accgtagttg cgcccatcg (SEQ ID NR: 15)

Das Plasmid wurde in E. coli BLR-DE3 gemäß den Angaben des Herstellers (Novagen) transformiert Die. Bakterien wurden in LB-Medium bis zu einer OD₆₀₀ ~ 0,8 kultiviert und die rekombinante Proteinsynthese wurde durch 1 mM IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid) initiiert.
Nach 3 Stunden Induktion wurden die Bakterien geerntet, in 1/10 Volumen Puffer A (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 8) resuspendiert und durch Druckzerstörung lysiert (1500 mbar). Das resultierende Pellet wurde zweimal in Puffer B (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 0,5 % TritonX-100, 100 mM NaCl, pH 8) gewaschen. Alle Standardprotokolle sind anderswo beschrieben worden (Sambrook, Fritsch und Maniatis, 1989).
Aufreinigung von Plectasin von P. nigrella aus Einschlusskörpern von E. coli
Das Pellet, welches aus der obigen Aufreinigung resultiert, enthielt aufgereinigte Einschlusskörper. Um das Peptid von dem KSI-Fusionspartner freizusetzen, wurde eine saure Hydrolyse über eine technische („engineered") ASP-Pro-Stelle, die N-terminal zu dem Plectasin-kodierenden Gen eingeführt wurde, durchgeführt.
Die Einschlusskörper wurden in 100 mM Natriumphosphat (pH 2,3) resuspendiert und über Nacht bei 85 Grad Celsius inkubiert. Der resultierende Überstand enthielt Prolin-Plectasin und die Probe wurde mit 100 mM Natriumphosphat (pH 12,3) neutralisiert. Die Identität des Prolin-Plectasins wurde durch Massenspektrometrie bestätigt. Alle Standardprotokolle sind anderswo beschrieben worden (Sambrook, Fritsch und Maniatis, 1989).
Antimikrobielle Aktivität durch Radialdiffusionsassay („Radial Diffusion Assay")
Eine modifizierte Version eines kürzlich veröffentlichten Protokolls ist angewendet worden für die Detektion von antimikrobieller Aktivität (Lehrer et al., (1991) Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides J Immunol Methods 137: 167 – 173). Zielbakterien (10⁶ Koloniebildende Einheiten („colony forming units" (CFU)) wurden zu 10 ml Agaroseunterlage („underlay agarose") (1 % Niedrig-Elektro-Endosmose-Agar, 0,03 % Trypticase-Sojabrühe, 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 37 Grad Celsius) hinzugefügt. Die Suspension wurde in einer INTEGRID-Petrischale verfestigt (Becton Dickinson Labware, NJ). Ein 3 mm Gelausstecher wurde verwendet, um Löcher in die Agaroseunterlage zu stechen (Amersham Pharmacia Biotech, Schweden). Proben wurden in die Löcher gegeben und bei 37 Grad Celsius 3 Stunden inkubiert. Eine Überschichtung wurde auf die Oberfläche gegossen und die Platte wurde über Nacht inkubiert (LB-Medium, 7,5 % Agar). Die antimikrobielle Aktivität war als eine bakterielle Klärungszone rund um die Vertiefungen gesehen. Lebende Zellen wurden Kontrast-angefärbt durch Hinzufügen von 10 ml, 0,2 mM MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromidthiazolylblau). Alle Standardprotokolle sind anderswo beschrieben worden (Sambrook, Fritsch, and Maniatis, 1989).
Antimikrobielle Aktivität von Plectasin gegenüber Bacillus subtilis
Um die antimikrobielle Aktivität von Plectasin zu bewerten, wurden Fermentationsbrühen von rekombinantem Aspergillus oryzae in zweifacher Reihenverdünnung in einem Radialdiffusionsassay angewendet (oben beschrieben). Es wurden große Klärungszonen gesehen, wenn die Proben dem obigen Protokoll folgend, gegenüber Bacillus subtilis überprüft wurden. Die größte Klärungszone wurde mit unverdünnter Fermentationsbrühe (15 mM) erhalten, wobei Proben, die von nicht-rekombinantem Aspergillus oryzae genommen wurden, keine antimikrobielle Aktivität gegenüber Bacillus subtilis zeigten.
Plectasin, exprimiert über Einschlusskörper in einem alternativen E. coli-Wirt
Um die Menge an Plectasin mit antimikrobieller Aktivität zu erhöhen, wurde Plectasin in E. coli Origami-DE3 (Novagen Inc.) exprimiert. Dieser Stamm trägt eine Mutation in den Genen, welche Thioredoxinreduktase (trxB) und Glutathionreduktase (gor) kodieren. Das rekombinante pET31b+ -Plasmid, welches Plectasin kodiert, wurde in E. coli Origami-DE3 gemäß den Angaben des Herstellers (Novagen) transformiert. Die Kultivierung, die Expression und die Isolierung von Plectasin-enthaltenden Einschlusskörpern wurde wie oben beschrieben durchgeführt (Transformation und Expression von Plectasin von P. nigrella in E. coli). Die Gewinnung von Plectasin wurde wie oben beschrieben durchgeführt (Aufreinigung von Plectasin von P. nigrella aus Einschlusskörper von E. coli). Nachfolgend wurde das Radialdiffusionsassay verwendet, um auf die antimikrobielle Aktivität zuzugreifen (siehe oben: antimikrobielle Aktivität durch Radialdiffusionsassay).
Die Resultate zeigen, dass das Produzieren von Plectasinpeptiden in E. coli Origami-DE3 in einem 5- bis 10-fachen Anstieg der antimikrobiellen Aktivität des Peptids resultiert. Die erhöhte biologische Aktivität von Plectasin wurde weiterhin durch die Tatsache gestützt, dass ähnliche Resultate erhalten wurden, wenn ein anderes Defensin, das humane beta-Defensin 3, exprimiert wurde. Es wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass Stämme von E. coli, welche die Bildung von Disulfidbrücken in dem Cytoplasma erlauben, im Allgemeinen anwendbar sind in der Biosynthese von biologisch aktiven Defensinen und anderen antimikrobiellen Peptiden mit Disulfidbrücken.
BEISPIEL 6
Konstruktion eines Expressionsvektors von Saccharomyces cerevisiae für Plectasin
Um die Expression von Plectasin in S. cerevisiae zu bewerten, wurden zwei verschiedene Plasmidkonstrukte, pHH3875 und pHH3876, hergestellt. pHH3875 kodiert den alpha-Leader von S. cerevisiae, der mit dem reifen Plectasin fusioniert ist. Das Plectasin kann von dem alpha-Leader freigesetzt werden und folglich reifen (zum reifen Plectasin führen) über eine KEX2-Schnittsequenz. pHH3876 kodiert den alpha-Leader, der mit der Pro-Region von Plectasin fusioniert ist, gefolgt von dem reifen Plectasin. In diesem Konstrukt ist eine KEX2-Stelle zwischen dem alpha-Leader und der Pro-Region von Plectasin vorhanden, während eine andere KEX2-Stelle die Pro-Region von Plectasin von dem Plectasin selbst separiert.
Konstruktion von pHH3875 – alpha-Leader/KEX2/Plectasin
Das Plectasingen wurde in einer PCR-Standardreaktion unter Verwendung der Primer pHH3875-Forw und pHH3875-Rev, nachfolgend beschrieben, amplifiziert. Das Plasmid pMT2548 von Aspergillus aus Beispiel 2 wurde als DNA-Template in der PCR-Reaktion verwendet. Das resultierende DNA-Fragment wurde unter Verwendung des PCR-Aufreinigungskits (Qiagen) aufgereinigt und mit XbaI und ClaI, welche die Überhänge, welche durch die Primer eingeführt wurden, schneiden, restriktiert. Das Fragment wurde weiterhin aus einem 2%-igen Agarosegel aufgereinigt und in einen Expressionsvektor von S. cerevisiae ligiert, der ebenfalls mit XbaI und ClaI restriktiert wurde. Dieser 2μ-basierte E. coli/Hefe-Shuttle-Vektor verwendet den konstitutiven tpi-Promotor, um die Expression der alpha-Leader/Plectasin-Fusion zu steuern, verwendet beta-Lactamase für eine phänotypische Selektion in E. coli und trägt das POT-Gen für eine Plasmidselektion in der Δtpi Hefe (MT663; a/α, Δtpi/Δtpi, pep4-3/pep4-3).
Primer pHH3875-Forw:

gaagg ggtat cgatg gctaa gagag gattt ggatg caatg gtcct tggga tgagg (SEQ ID NR: 18)

Primer pHH3875-Rev:

cttag tttct agact agtaa cactt gcaaa caaag ccccc c (SEQ ID NR: 19)

Konstruktion von pHH3876 – alpha-Leader/KEX2/Pro-Region/KEX2/Plectasin
Das Protokoll für die Konstruktion von pHH3876 ist identisch zu der von pHH3875, mit der Ausnahme, dass DNA-Primer angewendet wurden. Für pHH3876 wurden die nachfolgend beschriebenen Primer verwendet:
Primer pHH3876-Forw:

gaagg ggtat cgatg gctaa gagag caccc cagcc tgttc ccgag gctta cgc (SEQ ID NR: 20)

Primer pHH3876-Rev (identisch zu pHH3875-Rev):

cttag tttct agact agtaa cactt gcaaa caaag ccccc c (SEQ ID NR: 21)

Expression von Plectasin in S. cerevisiae
Die Plasmide pHH3902 (Kontrolle), pHH3875 und pHH3876 wurden in den Stamm MT633 von S. cerevisiae unter Verwendung eines Lithiumacetat-Protokolls transformiert. Es wurden einige Transformanten von pHH3902, pHH3875 und pHH3876 selektiert, auf "SC ground/agar" (enthaltend „SC ground agar", 2% D-Glucose, 0,02% Threonin)-Platten ausgestrichen und bei 30 Grad Celsius inkubiert, bis sich Kolonien entwickelten.
Um die Expression zu überprüfen, wurden einzelnen Kolonien in 10 ml flüssigem „SC ground" (enthaltend „SC ground", 2% D-Glucose, 0,02% Threonin), inkubiert unter heftigem Schütteln bei 30 Grad Celsius für 3 Tage. Die Überstände wurden über ein 16%-iges Tricingel (Novex) laufen gelassen, um eine optimale Separation in dem Bereich des geringen Molekulargewichts zu ergeben.
Parallel hierzu wurden Überstände von 500 Mikroliter auf 20 Mikroliter unter Verwendung einer Microcon-Drehsäule mit einem MW-Durchlass von 3kDa konzentriert. Alle Proben von pHH3875 und pHH3876 zeigten Peptidbanden der erwarteten Größe. Die konzentrierten Proben zeigten die am stärksten auftretenden Banden.
Um detailliertere Informationen zu erhalten, wurden die Überstände unter Verwendung eines Massenspektrometersdes MALDI-Typs (Voyager DE-Pro von Perseptive Biosystems) analysiert.
Für pHH3875 wurde ein Hauptpeak bei den Massen 4410 – 4411 beobachtet. Dies ist sehr nahe an der erwarteten Größe von 4402 für korrekt hergestelltes und prozessiertes Plectasin.
Für pHH3876 wurden mehrere Peaks beobachtet. Die zwei am stärksten auftretenden Peaks wurden bei Massen von 4411 – 4413 und 7870 – 7871 gefunden. Der Peak 4411 ist wiederum in Übereinstimmung mit korrekt prozessiertem Plectasin. Der Peak bei 7870 entspricht am ehesten halb-prozessiertem Plectasin, bei dem die Pro-Region nicht von dem Plectasin nicht abgespalten ist. Mehrere Störprodukte, wahrscheinlich von dem Peak 7870 wurden beobachtet.
Aktivität von Plectasin von pHH3875 und pHH3876
Die oben beschriebenen Überstände wurden in einem Radialdiffusionsassay analysiert, wie in Beispiel 5 beschrieben.
Tabelle 3. Ungefähre Inhibierungszone (mm).
Überraschenderweise erzielte pHH3876 die größte Inhibierungszone, was mehr Produkt oder ein Produkt mit höherer Aktivität im Vergleich zu pHH3875 anzeigt.
HTP-Screening von Plectasinvarianten
Um die antimikrobielle Aktivität von Plectasin weiter zu optimieren, ist ein Assay mit hohem Durchsatz („high throughput" (HTP)) erwünscht. Um ein solches System einzustellen, wurden Hefezellen, welche das Kontrollplasmid, pHH3902 oder die zwei Plectasin-Expressionsplasmide, pHH3875 und pHH3876, enthalten, wurden in 96-Well-Mikrotiterplatten wachsen gelassen. Bei einer geeigneten Zelldichte wurden entweder 5 oder 20 Mikroliter der Hefekultur von den Mikrotiterplatten entfernt und in einem Radialdiffusionsassay, wie in Beispiel 5 beschrieben, verwendet. Wiederum erschienen Klärungszonen auf den Radiadiffusionstestplatten von den Überständen, welche von den zwei Plectasin-herstellenden Stämmen, pHH3875 und pHH3876 stammten. Wie oben beobachtet, waren die Klärungszonen für die Überstände, die von pHH3876 stammten, größer. Keine Klärungszonen wurden für das Kontrollplasmid beobachtet. Dieses zeigt an, dass dieser einfache HTP-Assay zwischen Hefezellen, welche unterschiedliche Level an antimikrobieller Aktivität exprimieren, unterscheiden können, und zum Screenen von Plectasinvarianten mit gewünschten Aktivitäten brauchbar ist.
BEISPIEL 7
Konstruktion von induzierbarer Hefeproduktion und HTP-Screeningsystem für Plectasin – Konstruktion von pYES2-3902, pHH3886 (Plectasin) und pHH3887 (Pro-Plectasin
Um induzierbare Expressionssysteme und das Potential zum Einstellen eines HTP-Screeningsystems zum Identifizieren von Plectasinvarianten mit verbesserter Bioaktivität zu bewerten, wurden induzierbare Expressionsvektoren, welche Plectasin und Pro-Plectasin kodieren, unter Verwendung von pYES2 konstruiert.
pYES2 (Invitrogen) ist ein Vektor mit 5,9 kB, der für eine induzierbare Expression von rekombinanten Proteinen und Peptiden in Saccharomyces cerevisiae gestaltet ist. Der Vektor enthält Merkmale, wie einen GAL1-Hefepromotor für induzierbare Expression auf hohem Level durch Galactose und Repression durch Glucose. Uracil-Prototrophie und Ampicillin-Resistenz werden für die Selektion von Transformanten in der Hefe- bzw. E. coli-Zelle verwendet.
Drei Plasmide wurden konstruiert; ein Kontrollplasmid, pYES-3902 und zwei Plasmide, welche Plectasin kodieren, pHH3886 und pHH3887.
Da pYES2 ein Nicht-Fusionsvektor ist, wurden die vollständigen alpha-Leaderregionen von pHH3902, pHH3875 und pHH3876 PCR-amplifiziert in einer PCR-Standardreaktion. Die Fragmente wurden über ein 2%-iges Agarosegel laufen gelassen, unter Verwendung des Qiagen-Aufreinigungskits aufgereinigt und mit HindIII und XbaI restriktiert und mit den entsprechenden Stellen in dem Plasmid pYES2 ligiert. Bei diesen Positionen war der alpha-Leader vor dem GAL1-Promotor. Die Ligationsmischung wurde in kompetente E. coli transformiert. Die Transformanten wurden wieder ausgestrichen und eine Anzahl einzelner Klone für Plasmide mit einem Insert der korrekten Größe analysiert. Eine endgültige Verifizierung wurde anhand DNA-Sequenzierung unter Verwendung der Primer AOP107 und AOP446 durchgeführt. Die Plasmide werden als pYES2-3902 (Kontrolle), pHH3886 (Plectasin) und pHH3887 (Pro-Plectasin) bezeichnet.

Primer AOP 107: caata taaaa aagct agctt tccg (SEQ ID NR: 22)
Primer AOP446: ccggc tgaag ctgct atcgg (SEQ ID NR: 23)

Die drei Plasmide, pYES-3902, pHH3886 und pHH3887 wurden in den Hefestamm JG169 transformiert und auf Glucose (0,5 %)/Galactose (1,5 %)-enthaltende Platten ausplattiert. Die Glucose sichert die Bildung von Kolonien einer geeigneten Größe und nach der Verarmung an Glucose, sichert Galactose ein weiteres Wachstum, die Induktion der Transkription und entsprechend die Produktion von Plectasin. Nachdem sich Kolonien gebildet hatten, wurde ein Rasen („lawn") (ungefähr 106 cfu) eines Indikatorstamms, B. subitilis, auf die Kolonien geschichtet und die Platten wurden weiter über Nacht inkubiert. Wie es für die anderen, oben beschriebenen Hefeplasmide gesehen wurde, resultiert der Hefestamm, welcher das Kontrollplasmid beherbergt, nicht in einer Klärungszone, wohingegen pHH3886 und pHH3887 beide zu Klärungzonen führten. Die größten Klärungszonen wurden mit pHH3887, welches Pro-Plectasin kodiert, beobachtet.
BEISPIEL 8
Konstruktion von induzierbarer Hefeproduktion und HTP-Screeningsystem für Plectasin-Konstruktion von mutierten Plectasin-Bibliotheken
Mutierte Plectasin-Bibliotheken wurden unter Verwendung von „Error Prone"-PCR konstruiert. Zufällig mutierte DNA-Fragmente wurden unter Verwendung der Primer pYES-mut und pHH3885-Rev und entweder dem Template pHH3875 (Pro-Plectasin) oder pHH3876 (Plectasin) in einer PCR-Reaktion, welche 0,5 mM MnCl₂ enthielt, erzeugt.
Primer pYES-mut:

taaatactac tattgccagc attgctgcta aagaagaagg ggtatcgatg gccaagaga (SEQ ID NR: 24)

Primer pHH3885-Rev:

tgtaagcgtg acataactaa ttacatgatg cggccctcta ga (SEQ ID NR: 25)

Die Fragmente wurden über ein 2%-iges Agarosegel laufen gelassen, unter Verwendung des Qiagen-Aufreinigungskits aufgereinigt und in das Plasmid pYES2-3902 eingefügt. Die Plasmide wurden elektroporiert in kompetente Hefezellen JG169.
Die zwei verschiedenen Bibliotheken wurden auf große Agarplatten (23 cm × 23 cm) ausplattiert, welche 0,5 % Glucose und 1,5 % Galactose enthielten. Nach einer Inkubation bei 30 Grad Celsius für 2 Tage wurden die Bibliotheks-Platten mit einer dünnen Agaroseschicht, welche ungefähr 10' cfu B. subtilis enthielt, überschichtet. Die Platten wurden für weitere 24 Stunden bei 30 Grad Celsius inkubiert. Ungefähr 10.000 Kolonien wurden überprüft. Hefekolonien, die zu signifikanten Klärungszonen führten, wurden für eine weitere Charakterisierung isoliert.
HINTERLEGUNG VON BIOLOGISCHEM MATERIAL
Das folgende biologische Material ist unter den Bedingungen des Budapester Vertrages bei dem Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Niederlande (alternativ P.O.Box 85167, 3508 AD Utrecht, Niederlande), hinterlegt worden und erhielten die folgenden Zugriffsnummern:
Die Hinterlegung wurde von Novo Nordisk A/S vorgenommen und später auf Novozymes A/S übertragen.
Klassifizierung von Pseudoplectania nigrella:

Eukaryota; Fungi; Ascomycota; Pezizomycotina; Pezizomycetes; Pezizales; Sarcosomataceae; Pseudoplectania. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid mit antimikrobieller Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 65 % Identität mit den Aminosäuren 1 bis 40 aus SEQ ID NR: 2 aufweist; (b) einem Polypeptid, welches durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, welche unter mittleren Stringenzbedingungen, unter Verwendung von 0,2 × SSC bei 42 °C zum Waschen, mit einer Polynukleotidsonde, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) dem komplementären Strang der Nukleotide 166 bis 285 aus SEQ ID NR: 1, (ii) dem komplementären Strang der Nukleotide 70 bis 285 aus SEQ ID NR: 1, und (iii) dem komplementären Strang der Nukleotide 1 bis 285 aus SEQ ID NR: 1; hybridisiert, und (c) einem Fragment von (a) oder (b), das antimikrobielle Aktivität aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 1, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, welche mindestens 70 % Identität mit den Aminosäuren 1 bis 40 aus SEQ ID NR: 2, bevorzugt mindestens 80 % Identität, mindestens 85 % Identität, mindestens 90 % Identität, mindestens 95 % Identität oder mindestens 99 % Identität mit den Aminosäuren 1 bis 40 aus SEQ ID NR: 2, aufweist.
Polypeptide nach Anspruch 2, welches die Aminosäuren 1 bis 40 aus SEQ ID NO: 2 umfasst.
Polypeptide nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, welches aus den Aminosäuren 1 bis 40 aus SEQ ID NO: 2 besteht.
Polypeptid nach Anspruch 1, welches durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, die unter mittleren-hohen Stringenzbedingungen, unter Verwendung von 0,2 × SSC bei 55 °C zum Waschen, bevorzugt unter hohen Stringenzbedingungen, unter Verwendung von 0,1 × SSC bei 60 °C zum Waschen, mit einer Polynukleotidsonde, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) dem komplementären Strang der Nukleotide 166 bis 285 aus SEQ ID NR: 1, (ii) dem komplementären Strang der Nukleotide 70 bis 285 aus SEQ ID NR: 1, und (iii) dem komplementären Strang der Nukleotide 1 bis 285 aus SEQ ID NR: 1; hybridisiert.
Polypeptid nach Anspruch 5, welches durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, die unter mittleren-hohen Stringenzbedingungen, unter Verwendung von 0,2 × SSC bei 55 °C zum Waschen, bevorzugt unter hohen Stringenzbedingungen, unter Verwendung von 0,1 × SSC bei 60 °C zum Waschen, mit einer Polynukleotidsonde hybridisiert, die der komplementäre Strang der Nukleotide 166 bis 285 aus SEQ ID NR. 1 ist.
Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, welche das in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 definierte Polypeptid kodiert.
Nukleinsäurekonstrukt, das die in Anspruch 7 definierte Nukleotidsequenz umfasst, die funktionsfähig mit einer oder mehreren Kontrollsequenz(en) verknüpft ist, welche die Herstellung des Polypeptids in einem geeigneten Wirt steuert/steuern.
Rekombinanter Expressionsvektor, der das in Anspruch 8 definierte Nukleinsäurekonstrukt umfasst.
Rekombinante Wirtszelle, die das in Anspruch 8 definierte Nukleinsäurekonstrukt umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 definiert, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Kultivieren eines Stammes, der in seiner Wildtypform in der Lage ist, das Polypeptid herzustellen, zur Herstellung des Polypeptids; und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 definiert, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Kultivieren einer rekombinanten Wirtszelle, wie in Anspruch 10 definiert, unter Bedingungen, die der Herstellung des Polypeptids zuträglich sind; und (b) Gewinnen des Polypeptids.
Verfahren zum Abtöten oder Inhibieren des Wachstums mikrobieller Zellen, welches nicht ein Verfahren zur therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers ist, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der mikrobiellen Zellen mit einem antimikrobiellen Polypeptid, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 definiert, umfasst.
Antimikrobielles Polypeptid, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 definiert, zur Verwendung als Medikament.
Verwendung eines antimikrobiellen Polypeptids, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, in der Zubereitung eines veterinär- oder humantherapheutischen Wirkstoffs zur Behandlung einer mikrobiellen Infektion oder zur prophylaktischen Verwendung.
Verwendung von mindestens einem antimikrobiellen Polypeptid, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 definiert, in Tierfutter.