BR112020018166A2 - composição de ração para ruminantes compreendendo uma muramidase - Google Patents

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muramidase
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ruminant
amino acids
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Adam Christian Storm
Lene Venke Kofod
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Novozymes A/S
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Abstract

  A presente invenção refere-se a métodos para melhorar a diges-tibilidade em ruminantes com o uso de ração para ruminantes que compreen-de polipeptídeos que têm atividade de muramidase.

Description

“COMPOSIÇÃO DE RAÇÃO PARA RUMINANTES COMPREENDENDO UMA MURAMIDASE” Referência à listagem de sequências
[0001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador. A forma legível por computador é incorpo- rada ao presente documento a título de referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A presente invenção refere-se a métodos para me- lhorar a digestibilidade em ruminantes com o uso de ração para ruminantes que compreende polipeptídeos que têm atividade de muramidase.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0003] Muramidase, é uma lisozima, também conhecida como N-acetilmuramida glicanidrolase, que é uma O-glicosil hidrolase produ- zida como um mecanismo de defesa contra bactérias por muitos organismos. A enzima causa a hidrólise de parede celular bacteriana através de clivagem das ligações glicosídicas de peptidoglicano; uma molécula estrutural impor- tante em bactérias. Após terem a sua parede celular enfraquecida pela ação da muramidase, as células bacterianas sofrem lise devido a uma pressão osmótica desequilibrada.
[0004] A muramidase ocorre naturalmente em muitos or- ganismos como vírus, plantas, insetos, pássaros, répteis e mamíferos. Nos mamíferos, a Muramidase foi isolada de secreções nasais, saliva, lágrimas, conteúdo intestinal, urina e leite. A enzima cliva a ligação glicosídica entre o carbono número 1 do ácido N-acetilmurâmico e o carbono número 4 da N- acetil-D-glucosamina. In vivo, esses dois carboidratos são polimerizados para formar o polissacarídeo de parede celular de muitos micro-organismos.
[0005] A muramidase foi classificada em sete famílias di- ferentes de glicosídeo hidrolase (GH) (CAZy, www.cazy.org): GH18, GH19, lisozima de clara de ovo de galinha (GH22), lisozima de clara de ovo de ganso (GH23), muramidase de T4 de bacteriófago (GH24), proteína flagelar de Sphingomonas (GH73) e muramidases de Chalaropsis (GH25). As mura- midases das famílias GH23 e GH24 são principalmente conhecidas de bac- teriófagos e foram apenas recentemente identificadas em fungos. Se desco- briu que a família de muramidase GH25 não está estruturalmente relacio- nada com as outras famílias de muramidase. Além disso, uma classe adicio- nal de polipeptídeos que têm atividade de muramidase foi identificada no do- cumento PCT/CN2017/084074, tais muramidases são chamadas no pre- sente documento de polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de muramidase, em que a atividade de muramidase é definida na seção de de- finição e muramidases representativas são listadas na listagem de sequên- cias.
[0006] A muramidase foi tradicionalmente extraída da clara de ovo de galinha e chamada de lisozima de clara de ovo de galinha devido à sua abundância natural. Até muito recentemente, a lisozima de clara de ovo de galinha era a única muramidase investigada para uso na alimentação animal. A muramidase extraída de clara de ovo de galinha é o produto pri- mário disponível no mercado comercial, porém, não cliva ácido N,6-O-diace- tilmurâmico, por exemplo, paredes celulares Staphylococcus aureus e é, as- sim, incapaz de lisar esse patógeno humano importante dentre outros (Mas- schalck B, Deckers D, Michiels CW (2002), "Lytic and nonlytic mechanism of inactivation of gram-positive bacteria by muramidase under atmospheric and high hidrostatic pressure", J Food Prot. 65(12):1916 a 23).
[0007] O documento WO2000/21381 revela uma composi- ção que compreende pelo menos duas enzimas antimicrobianas e um ácido graxo poli-insaturado, em que uma das enzimas antimicrobianas era uma muramidase GH22 de clara de ovo de galinha. O documento GB2379166 revela uma composição que compreende um composto que interrompe a ca-
mada de peptidoglicano de bactérias e um composto que interrompe a ca- mada de fosfolipídios de bactérias, em que o composto de interrupção de peptidoglicano era uma muramidase GH22 de clara de ovo de galinha.
[0008] O documento WO2004/026334 revela uma compo- sição antimicrobiana para suprimir o crescimento de patógenos entéricos no intestino de gado que compreende (a) uma substância de lise da parede ce- lular ou seu sal, (b) uma substância antimicrobiana, (c) um agente seques- trante e (d) um antibiótico, em que a substância de lise da parede celular ou seu sal é uma muramidase GH22 de clara de ovo de galinha.
[0009] A demanda por produtos de ruminantes, tais como laticínios e carne, está aumentando, o que está levando a um aumento na demanda por ração para ruminantes. É um objetivo da invenção melhorar a eficiência da utilização de nutrientes na ração para reduzir o impacto ambi- ental da produção de laticínios e carne bovina.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0010] A invenção fornece composições de ração para ru- minantes, tais como uma ração para ruminantes, suplementos alimentares para ruminantes ou aditivos alimentares para ruminantes, que compreendem uma ou mais muramidases em que a muramidase é em uma quantidade su- ficiente para administração em um nível de 1 a 200 mg de proteína enzimá- tica por kg de ração para ruminantes.
[0011] Além disso, é fornecido um método para aumentar a digestibilidade de matéria seca de uma ração para ruminantes, suplemento alimentar para ruminantes ou aditivo alimentar para ruminantes que compre- ende as etapas de: a) fornecer pelo menos uma muramidase; b) fornecer uma ração para ruminantes, suplemento alimentar para ruminantes ou aditivo alimentar para ruminantes adequado para um animal ruminante; c) aplicar a muramidase à ração para ruminantes, suplemento alimentar para ruminantes ou aditivo alimentar para ruminantes para formar uma composição de ração para ruminantes; e d) administrar para o animal ruminante a composição ali- mentar para ruminantes, de modo que que seja efetuado um aumento na digestibilidade de matéria seca.
[0012] Em uma modalidade da invenção, a produção de ácidos graxos voláteis (AGV) no rúmen é aumentada em comparação com a produção de AGV no rúmen de um ruminante não alimentado com uma mu- ramidase. Em uma modalidade adicional, a produção de propionato no rú- men é aumentada em comparação com a produção de propionato no rúmen de um ruminante não alimentado com uma muramidase e/ou a produção de acetato no rúmen é aumentada em comparação com a produção de acetato no rúmen de um ruminante não alimentado com uma muramidase.
[0013] A muramidase usada na presente invenção pode ser de origem microbiana. Em uma modalidade, a muramidase compreende um ou mais domínios de uma família de glicosídeo hidrolase (GH) selecio- nada da lista que consiste em GH24, GH25 e polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de muramidase.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0014] A Figura 1 mostra o efeito de 9 muramidases (A: SEQ ID NO: 3, B: SEQ ID NO: 6, C: SEQ ID NO: 9, D: SEQ ID NO: 12, E: SEQ ID NO: 15, F: SEQ ID NO: 18, G: SEQ ID NO: 21, H: SEQ ID NO: 24 e I: SEQ ID NO: 27) de 3 famílias diferentes de glicosídeo hidrolase (GH) (GH24, GH25 e polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de mura- midase) e controle positivo (PC, com monensina) na melhoria relativa da di- gestibilidade de matéria seca dada em melhoria percentual sobre o controle após 48 h de fermentação em fluido ruminal e solução tampão.
[0015] A Figura 2 mostra a diferença relativa na digestibili- dade de matéria seca ruminal em comparação com o controle negativo como um efeito do aumento da dosagem de muramidase após 12 h de fermentação (NC é controle negativo, PC é controle positivo com monensina, A é SEQ ID
NO: 28, B é SEQ ID NO: 21, C é SEQ ID NO: 12, D é SEQ ID NO: 18, E é SEQ ID NO: 9).
[0016] A Figura 3 mostra a diferença relativa na produção de acetato ruminal em comparação com o controle negativo como um efeito do aumento da dosagem de muramidase após 12 h de fermentação (NC é controle negativo, PC é controle positivo com monensina, A é SEQ ID NO: 28, B é SEQ ID NO: 21, C é SEQ ID NO: 12, D é SEQ ID NO: 18, E é SEQ ID NO: 9).
[0017] A Figura 4 mostra a diferença relativa na produção de propionato ruminal em comparação com o controle negativo como um efeito do aumento da dosagem de muramidase após 12 h de fermentação (PC é o controle positivo com monensina, A é SEQ ID NO: 28, B é SEQ ID NO: 21, C é SEQ ID NO: 12, D é SEQ ID NO: 18, E é SEQ ID NO: 9).
[0018] A Figura 5 mostra a diferença relativa na produção de butirato ruminal em comparação com o controle negativo como um efeito do aumento da dosagem de muramidase após 12 h de fermentação (PC é o controle positivo com monensina, A é SEQ ID NO: 28, B é SEQ ID NO: 21, C é SEQ ID NO: 12, D é SEQ ID NO: 18, E é SEQ ID NO: 9).
[0019] A Figura 6 mostra a diferença relativa na produção total de AGV ruminal em comparação com o controle negativo como um efeito do aumento da dosagem de muramidase após 12 h de fermentação (PC é o controle positivo com monensina, A é SEQ ID NO: 28, B é SEQ ID NO: 21, C é SEQ ID NO: 12, D é SEQ ID NO: 18, E é SEQ ID NO: 9).
[0020] A Figura 7 mostra a diferença relativa em carbono na produção total de AGV ruminal em comparação com o controle negativo como um efeito do aumento da dosagem de muramidase após 12 h de fer- mentação (PC é o controle positivo com monensina, A é SEQ ID NO: 28, B é SEQ ID NO: 21, C é SEQ ID NO: 12, D é SEQ ID NO: 18, E é SEQ ID NO: 9).
[0021] A Figura 8 mostra a diferença relativa na digestibili- dade de matéria seca ruminal em comparação com o controle negativo após 12 h de fermentação, como um efeito da suplementação de muramidase e monensina (NC é controle negativo, PC é controle positivo com monensina, A é SEQ ID NO: 28, B é SEQ ID NO: 21, C é SEQ ID NO: 12, D é SEQ ID NO: 29, E é SEQ ID NO: 30, F é SEQ ID NO: 31, G é SEQ ID NO: 32, H é SEQ ID NO: 33, I é SEQ ID NO: 34, J é SEQ ID NO: 35, K é SEQ ID NO: 36, L é SEQ ID NO: 36, M é SEQ ID NO: 37).
[0022] A Figura 9 mostra a diferença relativa na concentra- ção de propionato ruminal em comparação com o controle negativo após 12 h de fermentação, como um efeito da suplementação de muramidase e mo- nensina (NC é controle negativo, PC é controle positivo com monensina, A é SEQ ID NO: 28, B é SEQ ID NO: 21, C é SEQ ID NO: 12, D é SEQ ID NO: 29, E é SEQ ID NO: 30, F é SEQ ID NO: 31, G é SEQ ID NO: 32, H é SEQ ID NO: 33, I é SEQ ID NO: 34, J é SEQ ID NO: 35, K é SEQ ID NO: 36, L é SEQ ID NO: 36, M é SEQ ID NO: 37).
[0023] A Figura 10 mostra a diferença relativa na concen- tração de butirato ruminal em comparação com o controle negativo após 12 h de fermentação, como um efeito da suplementação de muramidase e mo- nensina (NC é controle negativo, PC é controle positivo com monensina, A é SEQ ID NO: 28, B é SEQ ID NO: 21, C é SEQ ID NO: 12, D é SEQ ID NO: 29, E é SEQ ID NO: 30, F é SEQ ID NO: 31, G é SEQ ID NO: 32, H é SEQ ID NO: 33, I é SEQ ID NO: 34, J é SEQ ID NO: 35, K é SEQ ID NO: 36, L é SEQ ID NO: 36, M é SEQ ID NO: 37).
[0024] A Figura 11 mostra a diferença relativa na produção ruminal total de AGV em comparação com o controle negativo como um efeito da suplementação de muramidase após 12 h de fermentação (NC é controle negativo, PC é controle positivo com monensina, A é SEQ ID NO: 38, B é SEQ ID NO: 39, C é SEQ ID NO: 40, D é SEQ ID NO: 41, E é SEQ
ID NO: 42, F é SEQ ID NO: 43, G é SEQ ID NO: 44, H é SEQ ID NO: 45, I é SEQ ID NO: 46, J é SEQ ID NO: 47, K é SEQ ID NO: 48, L é SEQ ID NO: 49, M é SEQ ID NO: 50, N é SEQ ID NO: 51, O é SEQ ID NO: 52, S é SEQ ID NO: 55, T é SEQ ID NO: 56, U é SEQ ID NO: 57, V é SEQ ID NO: 58, W é SEQ ID NO: 59, Y é SEQ ID NO: 53, Z é SEQ ID NO: 54).
[0025] A Figura 12 mostra a diferença relativa em carbono na produção ruminal de AGV em comparação com o controle negativo como um efeito da suplementação de muramidase após 12 h de fermentação (NC é controle negativo, PC é controle positivo com monensina, A é SEQ ID NO: 38, B é SEQ ID NO: 39, C é SEQ ID NO: 40, D é SEQ ID NO: 41, E é SEQ ID NO: 42, F é SEQ ID NO: 43, G é SEQ ID NO: 44, H é SEQ ID NO: 45, I é SEQ ID NO: 46, J é SEQ ID NO: 47, K é SEQ ID NO: 48, L é SEQ ID NO: 49, M é SEQ ID NO: 50, N é SEQ ID NO: 51, O é SEQ ID NO: 52, S é SEQ ID NO: 55, T é SEQ ID NO: 56, U é SEQ ID NO: 57, V é SEQ ID NO: 58, W é SEQ ID NO: 59, Y é SEQ ID NO: 53, Z é SEQ ID NO: 54).
[0026] 13 mostra a diferença relativa na produção de ace- tato ruminal em comparação com o controle negativo como um efeito da su- plementação de muramidase após 12 h de fermentação (NC é controle ne- gativo, PC é controle positivo com monensina, A é SEQ ID NO: 38, B é SEQ ID NO: 39, C é SEQ ID NO: 40, D é SEQ ID NO: 41, E é SEQ ID NO: 42, F é SEQ ID NO: 43, G é SEQ ID NO: 44, H é SEQ ID NO: 45, I é SEQ ID NO: 46, J é SEQ ID NO: 47, K é SEQ ID NO: 48, L é SEQ ID NO: 49, M é SEQ ID NO: 50, N é SEQ ID NO: 51, O é SEQ ID NO: 52, S é SEQ ID NO: 55, T é SEQ ID NO: 56, U é SEQ ID NO: 57, V é SEQ ID NO: 58, W é SEQ ID NO: 59, Y é SEQ ID NO: 53, Z é SEQ ID NO: 54).
[0027] 14 mostra a diferença relativa na produção de pro- pionato ruminal em comparação com o controle negativo como um efeito da suplementação de muramidase após 12 h de fermentação (NC é controle negativo, PC é controle positivo com monensina, A é SEQ ID NO: 38, B é
SEQ ID NO: 39, C é SEQ ID NO: 40, D é SEQ ID NO: 41, E é SEQ ID NO: 42, F é SEQ ID NO: 43, G é SEQ ID NO: 44, H é SEQ ID NO: 45, I é SEQ ID NO: 46, J é SEQ ID NO: 47, K é SEQ ID NO: 48, L é SEQ ID NO: 49, M é SEQ ID NO: 50, N é SEQ ID NO: 51, O é SEQ ID NO: 52, S é SEQ ID NO: 55, T é SEQ ID NO: 56, U é SEQ ID NO: 57, V é SEQ ID NO: 58, W é SEQ ID NO: 59, Y é SEQ ID NO: 53, Z é SEQ ID NO: 54).
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS
[0028] SEQ ID NO: 1 é a sequência de cDNA de um poli- peptídeo de muramidase como isolado de Trichoderma koningiopsis.
[0029] SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos como deduzida do SEQ ID NO: 1.
[0030] SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácidos do po- lipeptídeo de muramidase maduro de Trichoderma koningiopsis.
[0031] SEQ ID NO: 4 é a sequência de cDNA de um poli- peptídeo de muramidase como isolado de Thielavia terrestris.
[0032] SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos como deduzida do SEQ ID NO: 4.
[0033] SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos do po- lipeptídeo de muramidase maduro de Thielavia terrestris.
[0034] SEQ ID NO: 7 é a sequência de cDNA de um poli- peptídeo de muramidase como isolado de Tilletia indica.
[0035] SEQ ID NO: 8 é a sequência de aminoácidos como deduzida do SEQ ID NO: 7.
[0036] SEQ ID NO: 9 é a sequência de aminoácidos do po- lipeptídeo de muramidase maduro de Tilletia indica.
[0037] SEQ ID NO: 10 é a sequência de cDNA de um poli- peptídeo de muramidase como isolado de Acremonium alcalophilum.
[0038] SEQ ID NO: 11 é a sequência de aminoácidos como deduzida do SEQ ID NO: 10.
[0039] SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Acremonium alcalophilum.
[0040] SEQ ID NO: 13 é a sequência de cDNA de um poli- peptídeo de muramidase como isolado de Cladorrhinum bulbillosum
[0041] SEQ ID NO: 14 é a sequência de aminoácidos como deduzida do SEQ ID NO: 13.
[0042] SEQ ID NO: 15 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Cladorrhinum bulbillosum.
[0043] SEQ ID NO: 16 é a sequência de cDNA de um poli- peptídeo de muramidase como isolado de Onygena equina.
[0044] SEQ ID NO: 17 é a sequência de aminoácidos como deduzida do SEQ ID NO: 16.
[0045] SEQ ID NO: 18 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Onygena equina.
[0046] SEQ ID NO: 19 é a sequência de cDNA de um poli- peptídeo de muramidase como isolado de Trichophaea saccata.
[0047] SEQ ID NO: 20 é a sequência de aminoácidos como deduzida do SEQ ID NO: 19.
[0048] SEQ ID NO: 21 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Trichophaea saccata.
[0049] SEQ ID NO: 22 é a sequência de cDNA de um poli- peptídeo de muramidase como isolado de Pleurotus ostreatus.
[0050] SEQ ID NO: 23 é a sequência de aminoácidos como deduzida do SEQ ID NO: 22.
[0051] SEQ ID NO: 24 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Pleurotus ostreatus.
[0052] SEQ ID NO: 25 é a sequência de cDNA de um poli- peptídeo de muramidase isolado de Cladosporium sp-9768.
[0053] SEQ ID NO: 26 é a sequência de aminoácidos como deduzida do SEQ ID NO: 25.
[0054] SEQ ID NO: 27 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Cladosporium sp-9768.
[0055] SEQ ID NO: 28 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Chaetomium thermophilum var. ther- mophilum.
[0056] SEQ ID NO: 29 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Acremonium alcalophilum.
[0057] SEQ ID NO: 30 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Coprinopsis cinerea okayama.
[0058] SEQ ID NO: 31 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Rasamsonia brevistipitata.
[0059] SEQ ID NO: 32 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Acremonium alcalophilum.
[0060] SEQ ID NO: 33 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Poronia punctata.
[0061] SEQ ID NO: 34 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Aspergillus deflectus.
[0062] SEQ ID NO: 35 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Poronia punctata.
[0063] SEQ ID NO: 36 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Paecilomyces sp.
[0064] SEQ ID NO: 37 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Hamigera sp.
[0065] SEQ ID NO: 38 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Penicillium citrinum.
[0066] SEQ ID NO: 39 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Pyronema domesticum.
[0067] SEQ ID NO: 40 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Thielavia sp.
[0068] SEQ ID NO: 41 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Chaetomium sp.
[0069] SEQ ID NO: 42 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Metarhizium iadini.
[0070] SEQ ID NO: 43 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Aspergillus deflectus.
[0071] SEQ ID NO: 44 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Sporormia fimetaria.
[0072] SEQ ID NO: 45 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Lecanicillium psalliotae.
[0073] SEQ ID NO: 46 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Trichocladium asperum.
[0074] SEQ ID NO: 47 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Clavicipitaceae sp-70249.
[0075] SEQ ID NO: 48 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Thielavia terrestris.
[0076] SEQ ID NO: 49 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Westerdykella.
[0077] SEQ ID NO: 50 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Onygena equina.
[0078] SEQ ID NO: 51 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Ovatospora brasiliensis.
[0079] SEQ ID NO: 52 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Purpureocillium lilacinum.
[0080] SEQ ID NO: 53 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Ovatospora brasiliensis.
[0081] SEQ ID NO: 54 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Penicillium wellingtonense.
[0082] SEQ ID NO: 55 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Aspergillus sp.
[0083] SEQ ID NO: 56 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Chaetomium sp.
[0084] SEQ ID NO: 57 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Zopfiella sp.
[0085] SEQ ID NO: 58 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Acremonium exiguum.
[0086] SEQ ID NO: 59 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de muramidase maduro de Chaetomium sp.
DEFINIÇÕES
[0087] Acetato: O acetato é usado no presente documento de forma intercambiada com o termo "ácido acético" e é um dos ácidos gra- xos voláteis (AGV) produzidos no rúmen. O mesmo é um precursor para a síntese de gordura do leite de mamíferos e também é usado para o metabo- lismo da energia muscular e síntese de gordura corporal. A quantidade de acetato no rúmen é uma medida da fermentação ruminal da ração ingerida; um aumento no acetato ruminal é, portanto, uma indicação de aumento do suprimento de energia para ruminantes.
[0088] Atividade antimicrobiana: O termo "atividade an- timicrobiana" é definida aqui como uma atividade que mata ou inibe o cresci- mento de microrganismos, tais como algas, archaea, bactérias, fungos e/ou protozoários. A atividade antimicrobiana pode, por exemplo, ser bactericida significando morte de bactérias ou bacteriostática significando a prevenção do crescimento bacteriano. A atividade antimicrobiana pode incluir catálise da hidrólise de ligações 1,4-beta entre o ácido N-acetilmurâmico e resíduos de N-acetil-D-glucosamina em uma peptidoglicano e entre resíduos de N-
acetil-D-glucosamina em quitodextrinas. A atividade antimicrobiana pode também incluir a ligação de muramidase à superfície do micro-organismo e inibição do seu crescimento. O efeito antimicrobiano pode também incluir o uso dos muramidases da presente invenção para ativação de autolisinas bacterianas, como um imunoestimulante, por inibição ou redução de toxinas bacterianas e por um efeito de opsoninas.
[0089] Produção de carne: O termo "produção de carne" é definido no presente documento como a produção de carne de gado criado para a produção de carne. A produção de carne pode, por exemplo, ser me- dida pela ingestão de ração, ingestão de ração diária, ganho de peso corpo- ral, ganho médio diário, cobertura de carcaça presente, composição da car- caça e pontuação da carcaça.
[0090] Butirato: "Butirato" é usado no presente docu- mento indistintamente com o termo "ácido butírico" e é um dos ácidos graxos voláteis (AGV) produzidos no rúmen. O mesmo é um precursor do β-OH- butirato, usado para a síntese de gordura do leite de mamíferos e também é usado para o metabolismo da energia muscular e síntese de gordura corpo- ral. A quantidade de butirato no rúmen é uma medida da fermentação ruminal da ração ingerida; um aumento no butirato é, portanto, uma indicação de maior suprimento de energia para ruminantes.
[0091] Concentrados: O termo "concentrado" significa ra- ção com alta e rápida digestibilidade de Matéria Seca (DMd). Tipicamente, os concentrados são alimentos para animais com concentrações relativa- mente altas de proteína e/ou energia e baixa concentração de Fibra Deter- gente de Nutriente (NDF), tais como melaços, oligossacarídeos, sorgo, se- mentes e grãos (inteiros ou preparados por esmagamento, moagem, etc. de, por exemplo, milho, aveia, centeio, cevada, trigo), bolo de prensagem de se- mente oleaginosa, farinha de prensagem de semente oleaginosa (por exem- plo, de caroço de algodão, cártamo, girassol, soja (tal como farinha de soja),
colza/canola, amendoim ou feijão de batata), bolo de palmiste material, deri- vado de levedura e grãos de destilaria (tais como grãos de destilaria úmidos (WDS) e grãos de destilaria secos com solúveis (DDGS)).
[0092] Digestibilidade de Matéria Seca (DMd): A digesti- bilidade se refere à extensão em que um alimento para animais é degradado e absorvido pelo corpo de um animal enquanto passa pelo trato digestivo. O termo "digestibilidade de Matéria Seca" significa o desaparecimento de ma- téria seca de ração do trato gastrointestinal (GI) por um dado animal em um nível especificado de ingestão de ração. A DMd é medida como a diferença percentual na proporção de matéria seca (DM) entre a ração ingerida e as fezes excretadas provenientes da ração ingerida. A DMd ruminal é, portanto, a diferença percentual na proporção de matéria seca entre a ração ingerida e a digesta passada para os compartimentos distais do rúmen, e descreve o potencial para os micróbios ruminais retrocederem e digerirem a DM da ra- ção.
[0093] Leite Corrigido para Energia (ECM): "Leite Corri- gido para Energia" é um meio de ajustar a produção de leite para a quanti- dade de componentes principais no leite que afetam a concentração de ener- gia (lactose, gordura e proteína) no leite e determina a quantidade de leite produzida ajustada para 3,5 por cento de gordura e 3,2 por cento de proteína. ECM é calculado no presente documento conforme descrito por Sjaunja, L.O., Baevre, L., Junkkarinen, L., Pedersen, J., Setälä, J. "A Nordic proposal for an energy corrected milk (ECM) formula" em: P. Gaillon, Y. Chabert (Eds.) "Performance Recording of Animals: State of the Art, 1990": Proceedings of the 27th Biennial Session of the International Committee for Animal Record- ing. Wageningen Academic Publishers, Wageningen, Holanda; 1991:156 a
157.
[0094] Razão de Conversão da Ração (FCR): FCR é uma medida de uma eficiência do animal (no presente documento, um rumi- nante) na conversão da massa alimentar para a produção desejada, por exemplo, massa corporal. A FCR é calculada como o consumo de ração di- vidido pelo ganho de peso do animal, ao longo de um período especificado. Por "razão de conversão da ração inferior " ou "razão de conversão da ração melhorada" entende-se que menos ração é necessária para aumentar o peso do animal e/ou a produção de leite do animal. Uma melhoria de FCR de 2% significa que a FCR foi reduzida em 2%.
[0095] Eficiência de ração: O termo "eficiência de ração" é a relação entre ganho de peso vivo e ingestão de matéria seca (CMS), ou a produção de Leite Corrigida para Energia por kg de ingestão de matéria seca (kg MEC/kg CMS). Quanto maior o número, melhor.
[0096] Forragem: O termo “forragem” como definido aqui, inclui também volumoso. A forragem é um material vegetal rico em FDN, tal como feno e silagem de plantas forrageiras, gramíneas e outras plantas for- rageiras, algas marinhas e leguminosas ou qualquer combinação dos mes- mos. São exemplos de plantas forrageiras Alfafa (luzerna), cornichão, brás- sica (por exemplo, couve, colza (canola), rutabaga (couve-nabo), nabo), trevo (por exemplo, trevo híbrido, trevo vermelho, trevo subterrâneo, trevo branco), grama (por exemplo grama Bermuda, bromo, falsa aveia, festuca, grama de urze, grama de pradaria, grama de pomar, azevém, capim-Timó- teo), produtos vegetais integrais com o uso de milho (maís), milheto, cevada, aveia, centeio, sorgo, soja e trigo e vegetais tais como beterraba. A forragem inclui adicionalmente resíduos de colheita da produção de grãos (tais como palha de milho; palha de trigo, cevada, aveia, centeio e outros grãos); resí- duos de vegetais como topo de beterraba; resíduos da produção de semen- tes oleaginosas como caules e folhas de soja, colza e outras leguminosas.
[0097] Muramidase fúngica: O termo "muramidase fún- gica" significa um polipeptídeo que tem atividade de muramidase que é ob- tido ou obtenível a partir de uma fonte fúngica. Exemplos de fontes fúngicas são fungos; isto é, a muramidase é obtida ou obtenível do reino de Fungos, em que o termo reino é a classificação taxonômica. Em particular, a murami- dase fúngica é obtida ou obtenível a partir do filo Ascomycota, tal como o subfilo Pezizomycotina, em que os termos filo e subfilo são as classificações taxonômicas.
[0098] Se a classificação taxonômica de um polipeptídeo não for conhecida, essa pode ser facilmente determinada por um perito na especialidade através da realização de uma pesquisa BLASTP do polipeptí- deo (usando, por ex., o Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCIB) website http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e comparando-o com os homó- logos mais próximos. Um polipeptídeo desconhecido que é um fragmento de um polipeptídeo conhecido é considerado como sendo da mesma espécie taxonômica. Um polipeptídeo natural desconhecido ou variante artificial que compreende uma substituição, deleção e/ou inserção em até 10 posições é considerado como sendo da mesma espécie taxonômica que o polipeptídeo conhecido.
[0099] Ionóforo: O termo "ionóforo" é utilizado no pre- sente documento para antibióticos, por exemplo, antibióticos macrólidos e/ou aditivos alimentares para animais, tais como ruminantes, que catalisam o transporte de íons através de membranas hidrofóbicas, tais como bicamadas lipídicas encontradas nas células vivas e exibem altas afinidades para íons, tais como, por exemplo, Na+, H+, Ca2+, Mg2+ e/ou K+. Exemplos de ionóforos incluem Monensina, sem limitações, que é, por exemplo, usada nas indús- trias de carne e laticínios para prevenir coccidiose, aumentar a produção de ácido propiônico e prevenir o meteorismo.
[0100] Isolado: O termo “isolado” designa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limi- tantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocor- rendo naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou todos os consti- tuintes ocorrendo naturalmente aos quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (por exemplo, múltiplas cópias de um gene que codifica a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor na- turalmente associado ao gene que codifica a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.
[0101] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo ma- duro” significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, trun- cação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc.
[0102] Produção de leite: O termo "produção de leite" é usado para descrever toda a produção de leite do gado leiteiro. A produção de leite é medida em quantidade total de leite produzido, podendo ser ex- pressa como produção diária de leite ou produção de leite por lactação defi- nida como o período desde o dia do parto até o dia de secagem definido como o dia em que a vaca deixa de dar leite. O dia de secagem é normal- mente cerca de 300 dias após o parto. A produção de leite é medida em Kg de leite ou Kg de leite corrigido para energia (ECM) para compensar a varia- ção em sólidos do leite.
[0103] Muramidase: O termo "muramidase" é usado para polipeptídeos que têm atividade de glicosídeo hidrolase e catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta entre o ácido N-acetilmurâmico e resíduos de N-acetil- D-glucosamina em peptidoglicano. Essa hidrólise, por sua vez, compromete a integridade das paredes das células bacterianas, que provoca a lise das bactérias. Outros termos para muramidase incluem "lisozima" e "N-acetilmu- ramida glicanidrolase".
[0104] Atividade de muramidase: O termo “atividade de muramidase” significa a hidrólise enzimática das ligações 1,4-beta entre o ácido N-acetilmurâmico e resíduos de N-acetil-D-glucosamina em um pepti- doglicano ou entre resíduos de N-acetil-D-glucosamina em quitodextrinas, resultando em bacteriólise devido a pressão osmótica. A muramidase per- tence à classe de enzimas EC 3.2.1.17. A atividade da muramidase é tipica- mente medida por determinação turbidimétrica. O método é baseado nas al- terações em turbidez de uma suspensão de Micrococcus luteus ATCC 4698 induzidas pela ação lítica da muramidase. Em condições experimentais apro- priadas, essas alterações são proporcionais à quantidade de muramidase no meio (c.f. INS 1105 do Compêndio Combinado de Especificações de Aditivos Alimentares da Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricul- tura (www.fao.org)).
[0105] Digestibilidade de Matéria Orgânica (OMd): A di- gestibilidade de matéria orgânica é definida como DMd, mas em que a quan- tidade de matéria orgânica é calculada como: OM = DM-cinza, em que o conteúdo de cinza é determinado após a combustão total da DM de ração.
[0106] Propionato: O termo "Propionato" é usado no pre- sente documento indistintamente com o termo "ácido propiônico" e é um dos ácidos graxos voláteis (AGV) produzidos no rúmen. O propionato é o princi- pal precursor da síntese de glicose pelos ruminantes, a glicose é utilizada para a lactose e o metabolismo energético. A quantidade de propionato no rúmen é uma medida da fermentação ruminal da ração ingerida; um aumento no propionato ruminal é, portanto, uma indicação de suprimento de glicose aumentado para ruminantes.
[0107] Ruminante: O termo "ruminante" significa um ma- mífero que digere alimentos à base de plantas inicialmente fermentando/de- gradando-os dentro do primeiro compartimento do complexo de estômago anterior do animal, principalmente através de ações bacterianas, retendo en- tão pequenas partículas e regurgitando uma massa semidegradada longa, agora conhecida como ruminação e mastigando-a novamente. O processo de mastigar novamente a ruminação para quebrar adicionalmente a matéria vegetal e estimular a digestão é chamado de "ruminação". Exemplos de ru- minantes são gado, vaca, gado leiteiro, gado de corte, búfalo, bezerro, cabra, ovelha, cordeiro, veado, rena, iaque, camelo e lhama.
[0108] Alimentação para ruminantes: O termo "alimenta- ção para ruminantes" ou "alimentação animal para ruminantes" se refere a qualquer composto, preparação ou mistura adequada ou destinada a ser in- gerida por um ruminante. A alimentação para ruminantes compreende tipica- mente forragens (incluindo grama fresca, volumoso e silagem) e pode adici- onalmente compreender concentrados, bem como vitaminas, minerais, enzi- mas, microbiano de alimentação direta (DFM), aminoácidos e/ou outros in- gredientes de alimentação (tal como em uma pré-mistura) A alimentação dos ruminantes pode ser fornecida como ração mista total (TMR), em que todos os componentes da alimentação são misturados antes da alimentação e for- necidos como uma mistura, ou como ração misturada parcialmente (PMR), em que a maioria dos componentes da alimentação são misturados e forne- cidos juntos, mas parte do concentrado é fornecida separadamente ou pode ser fornecida separadamente, em que todos os componentes são fornecidos separadamente sem mistura.
[0109] Identidade de sequências: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é des- crita pelo parâmetro “identidade de sequência”.
[0110] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EM- BOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277), preferencialmente a versão
5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de la- cunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de subs- tituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Ne- edle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a porcentagem de identidade e é calculado como se segue:
[0111] (Resíduos idênticos x 100)/(Comprimento do ali- nhamento - Número total de lacunas no alinhamento).Silagem: A silagem é um tipo de forragem produzida a partir da fermentação natural de material vegetal úmido, tal como grama fresca, e colheitas inteiras, por exemplo, milho e cevada. O processo de fermentação é realizado para preservar o material úmido para que o mesmo possa ser utilizado durante todo o ano.
[0112] Polipeptídeo substancialmente puro: O termo “polipeptídeo substancialmente puro” significa uma preparação que contém no máximo 10%, no máximo 8%, no máximo 6%, no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2%, no máximo 1% e no máximo 0,5% em peso de outro material de polipeptídeo ao qual está nativa ou recombinante- mente associado. Preferencialmente, o polipeptídeo é pelo menos 92% puro, por exemplo, pelo menos 94% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 96% puro, pelo menos 97% puro, pelo menos 98% puro, pelo menos 99% puro, pelo menos 99,5% puro e 100% puro em peso do material de polipeptídeo total presente na preparação. Os polipeptídeos da presente invenção estão preferencialmente em uma forma substancialmente pura. Isto pode ser al- cançado, por exemplo, por preparação do polipeptídeo por métodos recom- binantes bem conhecidos ou por métodos de purificação clássicos.
[0113] Variante: O termo “variante” significa um polipeptí- deo que tem atividade de muramidase compreendendo uma alteração, ou seja, uma substituição, inserção e/ou deleção, de um ou mais (vários) resí- duos de aminoácidos em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Uma substituição significa a substituição do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa a remoção do aminoá- cido ocupando uma posição; e uma inserção significa a adição de 1, 2 ou 3 aminoácidos adjacentes ao e imediatamente a seguir ao aminoácido ocu- pando a posição.
[0114] Em um aspecto, uma variante da muramidase, de acordo com a invenção, pode compreender de 1 a 5; de 1 a 10; de 1 a 15; de 1 a 20; de 1 a 25; de 1 a 30; de 1 a 35; de 1 a 40; de 1 a 45; ou de 1-50, ou seja, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 alterações e ter pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95 %, ou pelo menos 100% da atividade de muramidase da muramidase parental, tal como SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50,
SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, e SEQ ID NO: 59.
[0115] Ácidos graxos voláteis (AGV)/ácidos graxos de cadeia curta (SCFA): Os ácidos graxos voláteis (AGV), também denomina- dos como ácidos graxos de cadeia curta (SCFA), são ácidos graxos com menos de seis átomos de carbono e, por exemplo, incluem ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico e ácido iso- valérico. Os ácidos graxos voláteis (AGV) são produzidos a partir da fermen- tação de carboidratos no rúmen e fornecem a fonte de energia principal em ruminantes. O aumento de AGV pode, portanto, ser usado como uma indica- ção de aumento no suprimento de energia e nutrientes para ruminantes.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0116] Métodos de Melhoraria de Desempenho de Rumi- nantes
[0117] A utilização de nutrientes de alimentação para rumi- nantes é importante para a produção ideal e a saúde animal nos sistemas de produção modernos. Foi surpreendentemente descoberto que suplementar a ração de ruminantes com uma muramidase de acordo com a invenção re- sulta em maior digestibilidade de matéria seca ruminal em comparação com a suplementação de ração de ruminantes sem a muramidase (como con- trole). Aumentando-se a digestibilidade de matéria seca ruminal, os ruminan- tes recebem mais nutrientes para a produção.
[0118] A eficiência da utilização de nutrientes foi assim me- lhorada e a conversão de matéria orgânica, tal como, por exemplo, proteína microbiana em leite pelo gado leiteiro ou em carne pelo gado de corte, au- mentou em comparação com a conversão obtida pela ração para ruminantes sem muramidase.
[0119] Além disso, foi surpreendentemente descoberto que a digestibilidade de matéria seca ruminal é melhorada em comparação com a digestibilidade de matéria seca ruminal obtida ao fornecer ionóforos comumente usados no mercado para ruminantes.
[0120] Em um aspecto da invenção, a eficiência de utiliza- ção de nutrientes da ração para ruminantes é aumentada. Aumentando-se a utilização de nutrientes de ração para ruminantes, a mesma quantidade de leite e/ou carne pode ser produzida de menos animais ruminantes, reduzindo o uso de recursos naturais e as emissões de gases de efeito estufa (GEE) por unidade de leite e/ou unidade de carne produzida. Isso também leva à excreção diminuída de nitrogênio e fosfato por animal ruminante e, portanto, uma redução total na excreção de fosfato e nitrogênio por unidade de produ- ção.
[0121] A determinação da digestibilidade de matéria seca pode, por exemplo, ser realizada com o uso de um modelo de fermentação in vitro adaptado de Menke KH, Steingass H. 1988 (Estimation of the ener- getic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid. Anim Res Dev. (1988) 28:7 a 55) como descrito no exem- plo 1.
[0122] Em um aspecto, a produção de ácidos graxos volá- teis (AGV) no rúmen é aumentada em comparação com os AGV produzidos no rúmen de um ruminante não alimentado com uma muramidase.
[0123] Em um aspecto, a produção de propionato no rú- men é aumentada em comparação com o propionato produzido no rúmen de um ruminante não alimentado com uma muramidase.
[0124] Em um aspecto, a produção de acetato no rúmen é aumentada em comparação com a produção de acetato no rúmen de um ruminante não alimentado com uma muramidase
[0125] Em uma modalidade, a muramidase é dosada em um nível de 1 a 200 mg de proteína enzimática por kg de DM de ração para ruminantes, tal como 5 a 150 mg, 5 a 125 mg, 5 a 100 mg, 5 a 75 mg, 5 a 50 mg, 5 a 40 mg, 10 a 50 ou 5 a 25 mg de proteína enzimática por kg de DM de ração para ruminantes ou qualquer combinação desses intervalos.
[0126] Em uma modalidade, o ruminante é selecionado do grupo que consiste em: gado, vaca, gado leiteiro, gado de corte, búfalo, be- zerro jovem, cabra, ovelha, cordeiro, veado, iaque, camelo e lhama. Em uma modalidade adicional, o ruminante é selecionado do grupo que consiste em gado, gado leiteiro e gado de corte.
[0127] A muramidase pode ser fornecida ao ruminante du- rante qualquer período de tempo do nascimento até o abate. Em uma moda- lidade preferencial, a muramidase é fornecida ao ruminante em uma base diária. Em uma modalidade adicional, a muramidase é fornecida ao rumi- nante em uma base diária durante o tempo de vida do ruminante.
[0128] Em uma modalidade, a muramidase é fornecida a ruminantes selecionados do grupo que consiste em: gado, vaca, gado lei- teiro, gado de corte, búfalo, bezerro, cabra, ovelha, cordeiro, veado, iaque, camelo e lhama. Em uma modalidade, a muramidase é fornecida a ruminan- tes em crescimento. Em uma modalidade, a muramidase é fornecida ao gado leiteiro. Em uma modalidade adicional, a muramidase é fornecida ao gado leiteiro durante a lactação. Em uma modalidade, a muramidase é fornecida ao gado de corte na fase de crescimento da produção de gado de corte. Em uma modalidade, a muramidase é fornecida ao gado de corte na fase de acabamento da produção de gado de corte.
[0129] A muramidase pode ser fornecida ao ruminante de qualquer maneira adequada. Em uma modalidade, a muramidase é fornecida ao ruminante em uma ração, um suplemento alimentar ou um aditivo alimen- tar. Em modalidade adicional, a muramidase é fornecida ao ruminante na água potável. Em ainda outra modalidade, a muramidase é fornecida ao ru- minante como administração em bolus. Em ainda outra modalidade, a mura- midase é fornecida ao ruminante como uma aplicação de pulverização pós-
alimentação aplicada à ração para ruminantes. Em uma modalidade, a mu- ramidase é fornecida aos ruminantes em forma líquida como uma bebida. Em modalidade adicional, a muramidase é fornecida ao ruminante em forma líquida como uma poção. Em outra modalidade, a muramidase é fornecida ao ruminante no leite ou em um substituto do leite.
[0130] Em uma modalidade, a muramidase é de origem microbiana. Em uma modalidade adicional, a muramidase é de origem fún- gica. Em uma modalidade, a muramidase é obtida ou obtenível a partir do filo Ascomycota, tal como o subfilo Pezizomicotina.
[0131] Em uma modalidade, a muramidase compreende um ou mais domínios de uma família de glicosídeo hidrolase (GH) selecio- nada da lista que consiste em GH24, GH25 e polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de muramidase.
[0132] Em uma modalidade, a muramidase compreende um ou mais domínios da família de glicosídeo hidrolase (GH) GH24.
[0133] Em uma modalidade, a muramidase compreende um ou mais domínios da família de glicosídeo hidrolase (GH) GH25.
[0134] Em uma modalidade, a muramidase compreende um ou mais domínios dos polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de muramidase.
[0135] Em uma modalidade preferencial, a invenção se re- fere a um método para melhorar a digestibilidade de Matéria Seca (DMd) e/ou produção de ácido graxo volátil (AGV) e/ou produção de carne e/ou pro- dução de leite de um ruminante, que compreende administrar uma ração para ruminantes, suplemento alimentar para ruminantes ou aditivo alimentar para ruminantes que compreende uma ou mais muramidases para o rumi- nante, em que:
[0136] (a) a muramidase é uma muramidase que com- preende um ou mais domínios de uma família de glicosídeo hidrolase (GH)
selecionada da lista que consiste em GH24, GH25 e polipeptídeos MUR ino- vadores que têm atividade de muramidase e é dosada em um nível de 1 a 200 mg de proteína enzimática por kg de DM de ração para ruminantes;
[0137] (b) o ruminante é selecionado do grupo que con- siste em: gado, vaca, gado leiteiro, gado de corte, búfalo, bezerro, cabra, ovelha, cordeiro, veado, iaque, camelo e lhama; e
[0138] (c) a digestibilidade de matéria seca (DMd) e/ou produção de ácidos graxos voláteis (AGV) e/ou produção de carne e/ou pro- dução de leite é melhorada em pelo menos 1% em comparação com o con- trole; e
[0139] (d) opcionalmente, a muramidase é fornecida ao ruminante em uma base diária durante pelo menos 30 dias durante a vida do ruminante.
[0140] Em uma modalidade do método, a produção de leite corrigido para energia (ECM) é melhorada em pelo menos 1,25%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em compara- ção com o controle. Em uma modalidade adicional, a produção de ECM é melhorada entre 1% e 5%, tal como entre 1% e 4%, entre 1% e 3%, entre 1,25% e 2,5%, ou entre 1,5% e 2% em comparação com o controle, ou qual- quer combinação desses intervalos.
[0141] Em uma modalidade do método, a digestibilidade de matéria seca ruminal (DMd) é melhorada em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em compara- ção com o controle. Em uma modalidade adicional, a digestibilidade de ma- téria seca é melhorada entre 1% e 15%, tal como entre 1% e 10%, entre 1% e 7%, 1% e 5%, ou 2% e 5% em comparação com o controle, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0142] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é selecionado dentre acetato, propionato, butirato, isobutirato, va- lerato, isovalerato e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade adicional, o ácido graxo volátil (AGV) é selecionado dentre acetato, propio- nato, butirato e qualquer combinação dos mesmos. Em ainda outra modali- dade, o ácido graxo volátil (AGV) é acetato e/ou propionato.
[0143] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é melhorado em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em comparação com o controle. Em uma modalidade adicional, o ácido graxo volátil é melhorado entre 1% e 15%, tal como entre 1% e 10%, entre 1% e 7%, 1% e 5%, ou 2% e 5% em compa- ração com o controle, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0144] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é o acetato. Em uma modalidade adicional, o acetato é melhorado em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em comparação com o controle. Em outra modalidade, o acetato é melhorado entre 1% e 15%, tal como entre 1% e 10%, entre 1% e 7%, 1% e 5% ou 2% e 5% em comparação com o controle, ou qualquer com- binação desses intervalos.
[0145] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é propionato. Em uma modalidade adicional, o propionato é me- lhorado em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em comparação com o controle. Em outra mo- dalidade, o propionato é melhorado entre 1% e 15%, tal como entre 1% e 10%, entre 1% e 7%, 1% e 5% ou 2% e 5% em comparação com o controle, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0146] Em uma modalidade do método, o FCR é melho- rado em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,25%, pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em comparação com o controle. Em outra modalidade, o FCR é melhorado entre 1% e 10%, tal como entre 1% e 9%, tal como entre 1% e 8%, tal como entre 1% e 7%, tal como entre 1% e 6 %, como entre 1% e 5%, como entre 1% e 4%, entre 1% e 3%, entre 1,25% e 2,5%, ou entre 1,5% e 2% em comparação com o controle, ou qualquer combinação de esses intervalos. Uma melhoria de 1% no FCR é definida como uma redução de 1/100 no FCR do ruminante suplementado com mu- ramidase em comparação com o FCR do ruminante não suplementado com muramidase.
[0147] Em uma modalidade, a muramidase é dosada em um nível de 1 a 200 mg de proteína enzimática por kg de DM de ração para ruminantes, tal como 5 a 150 mg, 5 a 125 mg, 5 a 100 mg, 5 a 75 mg, 5 a 50 mg, 5 a 40 mg, 10 a 50 ou 5 a 25 mg de proteína enzimática por kg de ração para ruminantes ou qualquer combinação desses intervalos.
[0148] Em uma modalidade, a muramidase é fornecida ao ruminante durante qualquer período de tempo desde o nascimento até o abate. Em uma modalidade preferencial, a muramidase é fornecida ao rumi- nante em uma base diária. Em uma modalidade adicional, a muramidase é fornecida ao ruminante em uma base diária durante toda a vida do ruminante.
[0149] Em uma modalidade, a muramidase é fornecida a ruminantes em crescimento. Em uma modalidade, a muramidase é fornecida ao gado leiteiro. Em uma modalidade adicional, a muramidase é fornecida ao gado leiteiro durante a lactação. Em uma modalidade, a muramidase é fornecida ao gado de corte na fase de crescimento da produção de gado de corte. Em uma modalidade, a muramidase é fornecida ao gado de corte na fase de acabamento da produção de gado de corte. Em uma modalidade adicional, a muramidase é fornecida a bezerros no leite. Em uma modali- dade, a muramidase é fornecida a ruminantes selecionados do grupo que consiste em: gado, vaca, gado leiteiro, gado de corte, búfalo, bezerro, cabra, ovelha, cordeiro, veado, iaque, camelo e lhama.
[0150] Em uma modalidade, a muramidase é de origem microbiana. Em uma modalidade adicional, a muramidase é de origem fún- gica. Em uma modalidade, a muramidase é obtida ou obtenível a partir do filo Ascomycota, tal como o subfilo Pezizomicotina.
[0151] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 3.
[0152] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma variante alélica da mesma e um mar- cador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro as- pecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 3.
[0153] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 3, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou
50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 3 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 3 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 3 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 3 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 3 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0154] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 6.
[0155] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou uma variante alélica da mesma e um mar- cador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro as- pecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 6.
[0156] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 6, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 6 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 6 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 6 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 6 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 6 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0157] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 9.
[0158] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou uma variante alélica da mesma e um mar- cador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro as- pecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 9.
[0159] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 9, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 9 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35,
1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 9 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 9 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 9 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 9 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0160] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 12.
[0161] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 12.
[0162] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 12, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 12 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 12 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 12 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 12 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 12 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0163] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos
96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 15.
[0164] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 15.
[0165] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 15, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 15 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 15 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 15 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 15 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 15 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0166] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 18.
[0167] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 18.
[0168] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 18, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 18 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 18 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 18 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 18 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 18 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0169] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 21.
[0170] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 21.
[0171] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 21, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 21 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 21 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 21 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi-
tuições conservativas, em SEQ ID NO: 21 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 21 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0172] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 24.
[0173] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 24.
[0174] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 24, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou
50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 24 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 24 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 24 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 24 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 24 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0175] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 27.
[0176] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 27.
[0177] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 27, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 27 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 27 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 27 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 27 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 27 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0178] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 28.
[0179] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 28.
[0180] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 28, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 28 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35,
1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 28 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 28 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 28 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 28 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0181] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 29.
[0182] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 29.
[0183] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 29, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 29 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 29 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 29 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 29 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 29 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0184] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos
96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 30.
[0185] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 30.
[0186] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 30, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 30 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 30 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 30 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 30 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 30 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0187] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 31.
[0188] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 31.
[0189] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 31, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 31 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 31 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 31 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 31 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 31 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0190] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 32.
[0191] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 32.
[0192] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 32, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 32 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 32 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 32 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi-
tuições conservativas, em SEQ ID NO: 32 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 32 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0193] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 33.
[0194] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 33.
[0195] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 33, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou
50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 33 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 33 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 33 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 33 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 33 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0196] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 34.
[0197] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 34.
[0198] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 34, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 34 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 34 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 34 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 34 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 34 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0199] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 35.
[0200] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 35.
[0201] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 35, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 35 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35,
1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 35 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 35 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 35 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 35 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0202] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 36.
[0203] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 36.
[0204] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 36, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 36 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 36 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 36 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 36 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 36 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0205] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos
96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 37.
[0206] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 37.
[0207] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 37, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 37 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 37 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 37 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 37 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 37 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0208] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 38.
[0209] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 38.
[0210] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 38, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 38 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 38 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 38 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 38 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 38 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0211] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 39.
[0212] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 39.
[0213] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 39, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 39 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 39 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 39 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi-
tuições conservativas, em SEQ ID NO: 39 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 39 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0214] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 40.
[0215] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 40.
[0216] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 40, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou
50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 40 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 40 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 40 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 40 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 40 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0217] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 41.
[0218] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 41.
[0219] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 41, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 41 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 41 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 41 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 41 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 41 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0220] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 42.
[0221] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 42.
[0222] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 42, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 42 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35,
1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 42 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 42 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 42 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 42 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0223] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 43.
[0224] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 43.
[0225] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 43, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 43 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 43 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 43 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 43 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 43 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0226] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos
96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 44.
[0227] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 44.
[0228] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 44, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 44 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 44 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 44 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 44 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 44 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0229] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 45.
[0230] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 45.
[0231] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 45, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 45 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 45 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 45 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 45 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 45 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0232] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 46.
[0233] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 46.
[0234] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 46, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 46 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 46 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 46 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi-
tuições conservativas, em SEQ ID NO: 46 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 46 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0235] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 47.
[0236] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 47.
[0237] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 47, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou
50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 47 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 47 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 47 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 47 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 47 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0238] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 48.
[0239] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 48.
[0240] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 48, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 48 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 48 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 48 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 48 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 48 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0241] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 49.
[0242] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 49.
[0243] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 49, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 49 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35,
1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 49 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 49 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 49 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 49 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0244] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 50.
[0245] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 50.
[0246] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 50, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 50 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 50 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 50 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 50 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 50 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0247] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos
96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 51.
[0248] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 51.
[0249] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 51, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 51 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 51 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 51 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 51 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 51 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0250] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 52.
[0251] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 52.
[0252] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 52, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 52 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 52 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 52 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 52 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 52 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0253] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 53.
[0254] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 53.
[0255] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 53, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 53 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 53 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 53 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi-
tuições conservativas, em SEQ ID NO: 53 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 53 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0256] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 54.
[0257] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 54.
[0258] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 54, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou
50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 54 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 54 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 54 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 54 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 54 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0259] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 55.
[0260] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 55.
[0261] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 55, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 55 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 55 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 55 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 55 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 55 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0262] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 56.
[0263] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 56.
[0264] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 56, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 56 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35,
1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 56 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 56 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 56 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 56 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0265] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 57.
[0266] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 57.
[0267] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 57, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 57 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 57 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 57 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 57 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 57 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0268] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos
96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 58.
[0269] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 58.
[0270] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 58, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 58 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 58 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 58 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 58 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ ID NO: 58 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
[0271] Em uma modalidade, a muramidase tem pelo me- nos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 59.
[0272] Em uma modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 ou uma variante alélica da mesma; ou é um fragmento da mesma que tem atividade de mu- ramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 ami- noácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos. Em outra modalidade, a muramidase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 ou uma variante alélica da mesma e um marcador de His e/ou marcador de HQ N-terminal e/ou C-terminal. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 59.
[0273] Em outra modalidade, a muramidase é uma vari- ante de SEQ ID NO: 59, em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições e/ou uma ou mais deleções e/ou uma ou mais inserções ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições; Em outra modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer com- binação das mesmas em SEQ ID NO: 59 é entre 1 e 45, tal como 1-40, 1-35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 ou 1-5posições. Em uma modalidade, o número de posições compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em SEQ ID NO: 59 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em outra modali- dade, o número de substituições, deleções, e/ou inserções em SEQ ID NO: 59 é não mais do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições, preferencialmente substi- tuições conservativas, em SEQ ID NO: 59 é não mais do que 10, por exem- plo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 Em uma modalidade adicional, o número de substituições conservativas em SEQ
[0274] As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conser- vativas que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina no terminal amino; um pequeno peptídeo ligante de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga total ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.
[0275] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), ami- noácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e va- lina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhe- cidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições co- muns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.
[0276] Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo po- dem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura por alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Em esta última téc- nica são introduzidas mutações únicas de alanina em todos os resíduos na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à ativi- dade de muramidase para identificar resíduos de aminoácidos que são críti- cos para a atividade da molécula. Consultar ainda, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699 a 4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determi- nado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação por fotoafinidade, em conjunção com mu- tação de aminoácidos de local de contato putativo. Consultar, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.
[0277] A estrutura em cristal da muramidase Acremonium alcalophilum CBS114.92 foi resolvida a uma resolução de 1,3 Å, conforme revelado em WO 2013/076253. Essas coordenadas abúlicas podem ser uti- lizadas para gerar um modelo tridimensional que descreve a estrutura da muramidase Acremonium alcalophilum CBS114.92 ou estruturas homólogas (tais como as variantes da presente invenção). Com o uso da estrutura de raios X, os resíduos de aminoácidos D95 e E97 foram identificados como resíduos catalíticos.
[0278] Em uma modalidade preferencial, a invenção se re- fere a um método para melhorar a digestibilidade de Matéria Seca (DMd) e/ou produção de ácido graxo volátil (AGV) e/ou produção de carne e/ou pro- dução de leite de um ruminante, que compreende administrar uma ração para ruminantes, suplemento alimentar para ruminantes ou aditivo alimentar para ruminantes que compreende uma ou mais muramidases para o rumi- nante, em que:
[0279] (a) a muramidase é obtida ou obtenível do filo Ascomycota, e é dosada em um nível de 1 a 200 mg de proteína enzimática por kg de Matéria Seca (DM) de ração para ruminantes;
[0280] (b) o ruminante é um selecionado do grupo que consiste em: gado, vaca, gado leiteiro, gado de corte, búfalo, bezerro, cabra, ovelha, cordeiro, veado, iaque, camelo e lhama;
[0281] (c) a digestibilidade de matéria seca (DMd) e/ou produção de ácidos graxos voláteis (AGV) e/ou produção de carne e/ou pro- dução de leite é melhorada em pelo menos 1% em comparação com o con- trole; e
[0282] (d) opcionalmente, a muramidase é fornecida ao ruminante em uma base diária durante pelo menos 30 dias durante a vida do ruminante.
[0283] Em uma modalidade, o método é fornecido para ru- minantes em crescimento. Em uma modalidade, o método é fornecido para gado leiteiro. Em uma modalidade adicional, o método é fornecido para gado leiteiro durante a lactação. Em uma modalidade, o método é fornecido para gado de corte na fase de crescimento da produção de gado de corte. Em uma modalidade, o método é fornecido para gado de corte na fase de aca- bamento da produção de gado de corte.
[0284] Em uma modalidade, a produção de leite corrigido para energia (ECM) é melhorada em pelo menos 1,25%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em comparação com o controle. Em uma modalidade adicional, a produção de ECM é melhorada entre 1% e 5%, tal como entre 1% e 4%, entre 1% e 3%, entre 1,25% e 2,5%, ou entre 1,5% e 2% em comparação com o controle, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0285] Em uma modalidade, a digestibilidade de matéria seca ruminal (DMd) é melhorada em pelo menos 1%, tal como em pelo me- nos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em comparação com o controle. Em uma modalidade adicional, a digestibilidade de matéria seca é melhorada entre 1% e 15%, tal como entre 1% e 10%, entre 1% e 7%, 1% e 5%, ou 2% e 5% em comparação com o controle, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0286] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é selecionado dentre acetato, propionato, butirato, isobutirato, va- lerato, isovalerato e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade adicional, o ácido graxo volátil (AGV) é selecionado dentre acetato, propio- nato, butirato e qualquer combinação dos mesmos. Em ainda outra modali- dade, o ácido graxo volátil (AGV) é acetato e/ou propionato.
[0287] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é melhorado em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%,
pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em comparação com o controle. Em uma modalidade adicional, o ácido graxo volátil é melhorado entre 1% e 15%, tal como entre 1% e 10%, entre 1% e 7%, 1% e 5%, ou 2% e 5% em compa- ração com o controle, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0288] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é o acetato. Em uma modalidade adicional, o acetato é melhorado em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em comparação com o controle. Em outra modalidade, o acetato é melhorado entre 1% e 15%, tal como entre 1% e 10%, entre 1% e 7%, 1% e 5% ou 2% e 5% em comparação com o controle, ou qualquer com- binação desses intervalos.
[0289] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é propionato. Em uma modalidade adicional, o propionato é me- lhorado em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em comparação com o controle. Em outra mo- dalidade, o propionato é melhorado entre 1% e 15%, tal como entre 1% e 10%, entre 1% e 7%, 1% e 5% ou 2% e 5% em comparação com o controle, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0290] Em uma modalidade do método, a muramidase é dosada em um nível de 1 a 200 mg de proteína enzimática por kg de DM de ração para ruminantes, tal como 5 a 150 mg, 5 a 125 mg, 5 a 100 mg, 5 a 75 mg, 5 a 50 mg, 5 a 40 mg, 10 a 50 ou 5 a 25 mg de proteína enzimática por kg de DM de ração para ruminantes ou qualquer combinação desses inter- valos.
[0291] Em uma modalidade, a muramidase é fornecida ao ruminante com o uso de um dos regimes revelados no presente documento.
[0292] Em outra modalidade preferencial, a invenção se refere a um método para melhorar a digestibilidade de Matéria Seca (DMd)
e/ou produção de ácido graxo volátil (AGV) e/ou produção de carne e/ou pro- dução de leite de um ruminante, que compreende administrar uma ração para ruminantes, suplemento alimentar para ruminantes ou aditivo alimentar para ruminantes que compreende uma ou mais muramidases para o rumi- nante, em que:
[0293] (a) a muramidase é uma muramidase GH24 ob- tida ou obtenível do filo Ascomycota, é dosada em um nível de 1 a 200 mg de proteína enzimática por kg de DM de ração para ruminantes;
[0294] (b) o ruminante é um selecionado do grupo que consiste em: gado, vaca, gado leiteiro, gado de corte, búfalo, bezerro, cabra, ovelha, cordeiro, veado, iaque, camelo e lhama;
[0295] (c) a digestibilidade de matéria seca (DMd) e/ou produção de ácidos graxos voláteis (AGV) e/ou produção de carne e/ou pro- dução de leite é melhorada em pelo menos 1% em comparação com o con- trole; e
[0296] (d) opcionalmente, a muramidase é fornecida ao ruminante em uma base diária durante pelo menos 30 dias durante a vida do ruminante.
[0297] Em uma modalidade, o método é fornecido para ru- minantes em crescimento. Em uma modalidade, o método é fornecido para gado leiteiro. Em uma modalidade adicional, o método é fornecido para gado leiteiro durante a lactação. Em uma modalidade, o método é fornecido para gado de corte na fase de crescimento da produção de gado de corte. Em uma modalidade, o método é fornecido para gado de corte na fase de aca- bamento da produção de gado de corte.
[0298] Em uma modalidade do método, a produção de leite corrigido para energia (ECM) é melhorada em pelo menos 1,25%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em compara- ção com o controle. Em uma modalidade adicional, a produção de ECM é melhorada entre 1% e 5%, tal como entre 1% e 4%, entre 1% e 3%, entre 1,25% e 2,5%, ou entre 1,5% e 2% em comparação com o controle, ou qual- quer combinação desses intervalos.
[0299] Em uma modalidade do método, a digestibilidade de matéria seca ruminal (DMd) é melhorada em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em compara- ção com o controle. Em uma modalidade adicional, a digestibilidade de ma- téria seca é melhorada entre 1% e 15%, tal como entre 1% e 10%, entre 1% e 7%, 1% e 5%, ou 2% e 5% em comparação com o controle, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0300] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é selecionado dentre acetato, propionato, butirato, isobutirato, va- lerato, isovalerato e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade adicional, o ácido graxo volátil (AGV) é selecionado dentre acetato, propio- nato, butirato e qualquer combinação dos mesmos. Em ainda outra modali- dade, o ácido graxo volátil (AGV) é acetato e/ou propionato.
[0301] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é melhorado em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em comparação com o controle. Em uma modalidade adicional, o ácido graxo volátil é melhorado entre 1% e 15%, tal como entre 1% e 10%, entre 1% e 7%, 1% e 5%, ou 2% e 5% em compa- ração com o controle, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0302] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é o acetato. Em uma modalidade adicional, o acetato é melhorado em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em comparação com o controle. Em outra modalidade, o acetato é melhorado entre 1% e 15%, tal como entre 1% e 10%, entre 1% e 7%, 1% e 5% ou 2% e 5% em comparação com o controle, ou qualquer com- binação desses intervalos.
[0303] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é propionato. Em uma modalidade adicional, o propionato é me- lhorado em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em comparação com o controle. Em outra mo- dalidade, o propionato é melhorado entre 1% e 15%, tal como entre 1% e 10%, entre 1% e 7%, 1% e 5% ou 2% e 5% em comparação com o controle, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0304] Em uma modalidade do método, a muramidase é dosada em um nível de 1 a 200 mg de proteína enzimática por kg de DM de ração para ruminantes, tal como 5 a 150 mg, 5 a 125 mg, 5 a 100 mg, 5 a 75 mg, 5 a 50 mg, 5 a 40 mg, 10 a 50 ou 5 a 25 mg de proteína enzimática por kg de DM de ração para ruminantes ou qualquer combinação desses inter- valos.
[0305] Em uma modalidade do método, a muramidase é fornecida ao ruminante com o uso de um dos regimes revelados no presente documento.
[0306] Em outra modalidade preferencial, a invenção se refere a um método para melhorar a digestibilidade de Matéria Seca (DMd) e/ou produção de ácido graxo volátil (AGV) e/ou produção de carne e/ou pro- dução de leite de um ruminante, que compreende administrar uma ração para ruminantes, suplemento alimentar para ruminantes ou aditivo alimentar para ruminantes que compreende uma ou mais muramidases para o rumi- nante, em que:
[0307] (a) a muramidase é uma muramidase GH25 ob- tida ou obtenível do filo Ascomycota, é dosada em um nível de 1 a 200 mg de proteína enzimática por kg de DM de ração para ruminantes;
[0308] (b) o ruminante é um selecionado do grupo que consiste em: gado, vaca, gado leiteiro, gado de corte, búfalo, bezerro, cabra, ovelha, cordeiro, veado, iaque, camelo e lhama;
[0309] (c) a digestibilidade de matéria seca (DMd) e/ou produção de ácidos graxos voláteis (AGV) e/ou produção de carne e/ou pro- dução de leite é melhorada em pelo menos 1% em comparação com o con- trole; e
[0310] (d) opcionalmente, a muramidase é fornecida ao ruminante em uma base diária durante pelo menos 30 dias durante a vida do ruminante.
[0311] Em uma modalidade, o método é fornecido para ru- minantes em crescimento. Em uma modalidade, o método é fornecido para gado leiteiro. Em uma modalidade adicional, o método é fornecido para gado leiteiro durante a lactação. Em uma modalidade, o método é fornecido para gado de corte na fase de crescimento da produção de gado de corte. Em uma modalidade, o método é fornecido para gado de corte na fase de aca- bamento da produção de gado de corte.
[0312] Em uma modalidade do método, a produção de leite corrigido para energia (ECM) é melhorada em pelo menos 1,25%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em compara- ção com o controle. Em uma modalidade adicional, a produção de ECM é melhorada entre 1% e 5%, tal como entre 1% e 4%, entre 1% e 3%, entre 1,25% e 2,5%, ou entre 1,5% e 2% em comparação com o controle, ou qual- quer combinação desses intervalos.
[0313] Em uma modalidade do método, a digestibilidade de matéria seca ruminal (DMd) é melhorada em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em compara- ção com o controle. Em uma modalidade adicional, a digestibilidade de ma- téria seca é melhorada entre 1% e 15%, tal como entre 1% e 10%, entre 1% e 7%, 1% e 5%, ou 2% e 5% em comparação com o controle, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0314] Em uma modalidade do método, a muramidase é dosada em um nível de 1 a 200 mg de proteína enzimática por kg de DM de ração para ruminantes, tal como 5 a 150 mg, 5 a 125 mg, 5 a 100 mg, 5 a 75 mg, 5 a 50 mg, 5 a 40 mg, 10 a 50 ou 5 a 25 mg de proteína enzimática por kg de ração para ruminantes ou qualquer combinação desses intervalos.
[0315] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é selecionado dentre acetato, propionato, butirato, isobutirato, va- lerato, isovalerato e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade adicional, o ácido graxo volátil (AGV) é selecionado dentre acetato, propio- nato, butirato e qualquer combinação dos mesmos. Em ainda outra modali- dade, o ácido graxo volátil (AGV) é acetato e/ou propionato.
[0316] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é melhorado em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em comparação com o controle. Em uma modalidade adicional, o ácido graxo volátil é melhorado entre 1% e 15%, tal como entre 1% e 10%, entre 1% e 7%, 1% e 5%, ou 2% e 5% em compa- ração com o controle, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0317] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é o acetato. Em uma modalidade adicional, o acetato é melhorado em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em comparação com o controle. Em outra modalidade, o acetato é melhorado entre 1% e 15%, tal como entre 1% e 10%, entre 1% e 7%, 1% e 5% ou 2% e 5% em comparação com o controle, ou qualquer com- binação desses intervalos.
[0318] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é propionato. Em uma modalidade adicional, o propionato é me- lhorado em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em comparação com o controle. Em outra mo- dalidade, o propionato é melhorado entre 1% e 15%, tal como entre 1% e
10%, entre 1% e 7%, 1% e 5% ou 2% e 5% em comparação com o controle, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0319] Em uma modalidade do método, a muramidase é fornecida ao ruminante com o uso de um dos regimes revelados no presente documento.
[0320] Em outra modalidade preferencial, a invenção se refere a um método para melhorar a digestibilidade de Matéria Seca (DMd) e/ou produção de ácido graxo volátil (AGV) e/ou produção de carne e/ou pro- dução de leite de um ruminante, que compreende administrar uma ração para ruminantes, suplemento alimentar para ruminantes ou aditivo alimentar para ruminantes que compreende uma ou mais muramidases para o rumi- nante, em que:
[0321] (a) a muramidase é um polipeptídeo MUR inova- dor que tem atividade de muramidase, a muramidase obtida ou obtenível do filo Ascomycota, é dosada em um nível de 1 a 200 mg de proteína enzimática por kg de DM de ração para ruminantes;
[0322] (b) o ruminante é um selecionado do grupo que consiste em: gado, vaca, gado leiteiro, gado de corte, búfalo, bezerro, cabra, ovelha, cordeiro, veado, iaque, camelo e lhama;
[0323] (c) a digestibilidade de matéria seca (DMd) e/ou produção de ácidos graxos voláteis (AGV) e/ou produção de carne e/ou pro- dução de leite é melhorada em pelo menos 1% em comparação com o con- trole; e
[0324] (d) opcionalmente, a muramidase é fornecida ao ruminante em uma base diária durante pelo menos 30 dias durante a vida do ruminante.
[0325] Em uma modalidade, o método é fornecido para ru- minantes em crescimento. Em uma modalidade, o método é fornecido para gado leiteiro. Em uma modalidade adicional, o método é fornecido para gado leiteiro durante a lactação. Em uma modalidade, o método é fornecido para gado de corte na fase de crescimento da produção de gado de corte. Em uma modalidade, o método é fornecido para gado de corte na fase de aca- bamento da produção de gado de corte.
[0326] Em uma modalidade do método, a produção de leite corrigido para energia (ECM) é melhorada em pelo menos 1,25%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em compara- ção com o controle. Em uma modalidade adicional, a produção de ECM é melhorada entre 1% e 5%, tal como entre 1% e 4%, entre 1% e 3%, entre 1,25% e 2,5%, ou entre 1,5% e 2% em comparação com o controle, ou qual- quer combinação desses intervalos.
[0327] Em uma modalidade do método, a digestibilidade de matéria seca ruminal (DMd) é melhorada em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em compara- ção com o controle. Em uma modalidade adicional, a digestibilidade de ma- téria seca é melhorada entre 1% e 15%, tal como entre 1% e 10%, entre 1% e 7%, 1% e 5%, ou 2% e 5% em comparação com o controle, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0328] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é selecionado dentre acetato, propionato, butirato, isobutirato, va- lerato, isovalerato e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade adicional, o ácido graxo volátil (AGV) é selecionado dentre acetato, propio- nato, butirato e qualquer combinação dos mesmos. Em ainda outra modali- dade, o ácido graxo volátil (AGV) é acetato e/ou propionato.
[0329] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é melhorado em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em comparação com o controle. Em uma modalidade adicional, o ácido graxo volátil é melhorado entre 1% e 15%,
tal como entre 1% e 10%, entre 1% e 7%, 1% e 5%, ou 2% e 5% em compa- ração com o controle, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0330] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é o acetato. Em uma modalidade adicional, o acetato é melhorado em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em comparação com o controle. Em outra modalidade, o acetato é melhorado entre 1% e 15%, tal como entre 1% e 10%, entre 1% e 7%, 1% e 5% ou 2% e 5% em comparação com o controle, ou qualquer com- binação desses intervalos.
[0331] Em uma modalidade do método, o ácido graxo vo- látil (AGV) é propionato. Em uma modalidade adicional, o propionato é me- lhorado em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em comparação com o controle. Em outra mo- dalidade, o propionato é melhorado entre 1% e 15%, tal como entre 1% e 10%, entre 1% e 7%, 1% e 5% ou 2% e 5% em comparação com o controle, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0332] Em uma modalidade do método, a muramidase é dosada em um nível de 1 a 200 mg de proteína enzimática por kg de DM de ração para ruminantes, tal como 5 a 150 mg, 5 a 125 mg, 5 a 100 mg, 5 a 75 mg, 5 a 50 mg, 5 a 40 mg, 10 a 50 ou 5 a 25mg de proteína enzimática por kg de DM de ração para ruminantes ou qualquer combinação desses inter- valos.
[0333] Em uma modalidade do método, a muramidase é fornecida ao ruminante com o uso de um dos regimes revelados no presente documento. Agente de formulação
[0334] A enzima da invenção pode ser formulada como um líquido ou um sólido. Para uma formulação líquida, o agente de formulação pode compreender um poliol (como por exemplo, glicerol, etileno glicol ou propileno glicol), um sal (como por exemplo, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio) ou um açúcar ou derivado de açúcar (como por exemplo, dextrina, glicose, sacarose e sorbitol). Assim, em uma modalidade, a composição é uma composição líquida compreendendo o polipeptídeo da invenção e um ou mais agentes de formulação selecionados da lista consis- tindo em glicerol, etilenoglicol, 1,2-propilenoglicol, 1,3-propilenoglicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, dextrina, glucose, saca- rose e sorbitol. A formulação líquida pode ser pulverizada na ração após ter sido peletizada ou pode ser adicionada à água potável dada aos ruminantes.
[0335] Para uma formulação sólida, a formulação pode ser por exemplo como um grânulo, pó seco por pulverização ou aglomerado. O agente de formulação pode compreender um sal (sais orgânicos ou inorgâ- nicos de zinco, sódio, potássio ou cálcio tais como, p.ex., tais como acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, citrato de potássio, sorbato de potássio, sulfato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, carbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, ace- tato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco, sorbato de zinco, sulfato de zinco), amido ou um açúcar ou derivado de açúcar (tal como, p.ex., sacarose, dextrina, glucose, lactose, sorbitol).
[0336] Em uma modalidade, a composição sólida está na forma de granulado. O grânulo pode ter uma estrutura em matriz onde os componentes são misturados homogeneamente. No entanto, o grânulo com- preende tipicamente uma partícula nuclear e um ou mais revestimentos, que são tipicamente revestimentos de sal e/ou cera. Exemplos de ceras são po- lietilenoglicóis; polipropilenos; Cera de Carnaúba; Cera de candelila; cera de abelha; óleo vegetal hidrogenado ou sebo de ruminante tal como sebo de boi hidrogenado, óleo de palma hidrogenado, sementes de algodão hidrogenado e/ou óleo de soja hidrogenado; álcoois de ácidos graxos; monoglicéridos e/ou di-glicéridos, tais como estearato de glicerilo, em que o estearato é uma mis- tura de ácido esteárico e palmítico; cera microcristalina; parafinas; e ácidos graxos, tais como ácidos graxos de cadeia longa linear hidrogenados e seus derivados. Uma cera preferencial é óleo de palma ou óleo de palma hidroge- nado. A partícula nuclear tanto pode ser uma combinação homogênea de muramidase da invenção opcionalmente combinada com uma ou mais enzi- mas adicionais e opcionalmente em conjunto com um ou mais sais ou uma partícula inerte com a muramidase da invenção opcionalmente combinada com uma ou mais enzimas adicionais aplicadas sobre si.
[0337] Em uma modalidade, o material das partículas do núcleo é selecionado do grupo que consiste em sais inorgânicos (tais como acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, potássio citrato, sorbato de potássio, sulfato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, carbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco, sorbato de zinco, sulfato de zinco), amido ou um açú- car ou derivado de açúcar (tal como, p.ex., sacarose, dextrina, glucose, lac- tose, sorbitol), açúcar ou derivado de açúcar (tal como, p.ex., sacarose, dex- trina, glucose, lactose, sorbitol), moléculas orgânicas pequenas, amido, fari- nha, celulose e minerais e minerais de argila (também conhecidos como fi- lossilicatos de alumínio hidratados). Em uma modalidade preferencial, o nú- cleo compreende um mineral de argila tal como caulinita ou caulim.
[0338] O revestimento de sal tem tipicamente pelo menos 1 µm de espessura e pode ser um sal particular ou uma mistura de sais, tais como Na2SO4, K2SO4, MgSO4 e/ou citrato de sódio. Outros exemplos são aqueles descritos em, p.ex., WO 2008/017659, WO 2006/034710, WO
1997/05245, WO 1998/54980, WO 1998/55599, WO 2000/70034 ou revesti- mento de polímero tal como descrito em WO 2001/00042.
[0339] Em outra modalidade, a composição é uma compo- sição sólida compreendendo a muramidase da invenção e um ou mais agen- tes de formulação selecionados da lista consistindo em cloreto de sódio, ben- zoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de só- dio, dextrina, glucose, sacarose, sorbitol, lactose, amido e celulose. Em uma modalidade preferencial, o agente de formulação é selecionado de um ou mais dos seguintes compostos: sulfato de sódio, dextrina, celulose, tiossul- fato de sódio e carbonato de cálcio. Em uma modalidade preferencial, a com- posição sólida está na forma de granulado. Em uma modalidade, a composi- ção sólida está na forma de granulado e compreende uma partícula nuclear, uma camada de enzima compreendendo a muramidase da invenção e um revestimento de sal.
[0340] Em uma modalidade adicional, o agente de formu- lação é selecionado de um ou mais dos seguintes compostos: glicerol, etileno glicol, 1,2-propileno glicol ou 1,3-propileno glicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dex- trina, glucose, sacarose, sorbitol, lactose, amido, caulim e celulose. Em uma modalidade preferencial, o agente de formulação é selecionado de um ou mais dos seguintes compostos: 1,2-propileno glicol, 1,3-propileno glicol, sul- fato de sódio, dextrina, celulose, tiossulfato de sódio, caulim e carbonato de cálcio. Ração para Ruminantes, Suplemento Alimentar para Ruminan- tes e Aditivos Alimentares para Ruminantes
[0341] Uma composição ou componente de ração para ru- minantes, de acordo com a invenção, tem um teor de proteína bruta entre 50 e 800 g/kg e, além disso, compreende um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase como descrito no presente documento.
[0342] Além disso, ou em alternativa (ao teor de proteína bruta indicado acima), a composição de ração para ruminantes da invenção tem um teor de energia metabolizável de 5 a 30 MJ/kg.
[0343] Em modalidades particulares, o teor de energia me- tabolizável, proteína bruta, cálcio e/ou fósforo está dentro de qualquer um dos intervalos 2, 3, 4 ou 5 na Tabela B do documento WO 2001/058275 (R. 2 a 5).
[0344] Em modalidades particulares, a ração para rumi- nantes compreende nitrogênio não proteico obtido de, por exemplo, ureia.
[0345] O conteúdo de nitrogênio é determinado pelo mé- todo Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14a ed., Associa- tion of Official Analytical Chemists, Washington DC) e a proteína bruta é cal- culada como nitrogênio (N) multiplicado por um fator 6,25 (ou seja, Proteína bruta (g/kg)= N (g/kg) x 6,25).
[0346] A energia metabolizável pode ser calculada com base na publicação NRC Nutrient requirements in ruminant, sétima edição revisada 2001, subcommittee on ruminant nutrition, committee on ruminant nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., páginas 2 a 6.
[0347] Em uma modalidade particular, a composição de ra- ção para ruminantes da invenção contém pelo menos uma proteína vegetal como definido acima.
[0348] A composição de ração para ruminantes da inven- ção pode também compreender Grãos Secos Destilados com Solúveis (DDGS), tipicamente em quantidades de 0-30%.
[0349] Em adicionalmente outras modalidades particula- res, a composição de ração para ruminantes da invenção contém 0 a 80%
de milho; e/ou 0 a 80% de sorgo; e/ou 0 a 70% de trigo; e/ou 0 a 70% de cevada; e/ou 0 a 30% de aveia; e/ou 0 a 40% de farinha de soja; e/ou 0 a 20% de soro de leite.
[0350] A ração para ruminantes pode compreender proteí- nas vegetais. Em modalidades particulares, o conteúdo de proteína das pro- teínas vegetais é pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% (p/p). As proteínas vegetais podem ser derivadas de fontes de proteínas vegetais, tais como leguminosas e cereais, por exemplo, materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae e Poaceae, tais como farelo de soja, farelo de tremoço, farelo de colza e suas combinações.
[0351] Em uma modalidade particular, a fonte de proteínas vegetais é material de uma ou mais plantas da família Fabaceae, p.ex., soja, tremoço, ervilha ou feijão. Em outra modalidade particular, a fonte de proteí- nas vegetais é material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, p.ex., beterraba, beterraba-sacarina, espinafre ou quinoa. Outros exemplos de fontes de proteínas vegetais são colza e couve. Em outra modalidade particular, a soja é uma fonte de proteína vegetal preferencial. Outros exem- plos de fontes de proteínas vegetais são cereais, tais como cevada, trigo, centeio, aveia, maís (milho), arroz e sorgo.
[0352] Em uma modalidade particular, plantas forrageiras, tais como milho (maís), leguminosas e gramíneas, que foram picadas e ar- mazenadas anaerobicamente e fermentadas para preservação. Isso é co- nhecido como silagem ou ensilagem e pode compilar até 90% da dieta do gado.
[0353] Em uma modalidade particular, fontes de nitrogênio não proteico (NPN) podem fazer parte da dieta. Um exemplo é a ureia que constitui até 25% da Proteína Bruta total das dietas bovinas.
[0354] O concentrado de ruminantes que compreende muitos alimentos pode, por exemplo, ser fabricado como ração em purê (não peletizada) ou ração peletizada. Tipicamente, os gêneros alimentares moí- dos são misturados e quantidades suficientes de vitaminais e minerais es- senciais são adicionadas de acordo com as especificações para a espécie em questão. As enzimas podem ser adicionadas como formulações de enzi- mas sólidas ou líquidas. Por exemplo, para ração em purê uma formulação de enzima sólida ou líquida pode ser adicionada antes do ou durante o passo de mistura de ingredientes. Para ração peletizada, a preparação de murami- dase/enzima (líquida ou sólida) pode ser também adicionada antes do ou durante o passo de ingredientes da ração. Tipicamente, uma preparação de enzima líquida compreende a muramidase da invenção opcionalmente com um poliol, tal como glicerol, etilenoglicol ou propilenoglicol, e é adicionada após o passo de peletização, tal como por pulverização da formulação líquida nos péletes. A muramidase também pode ser incorporada em um suple- mento alimentar, um aditivo alimentar ou uma pré-mistura.
[0355] Alternativamente, a muramidase pode ser prepa- rada por congelação de uma mistura de solução de enzima líquida com um agente de volume tal como farelo de soja moída e, depois, liofilização da mistura.
[0356] Em uma modalidade, a composição compreende uma ou mais enzimas adicionais. Em uma modalidade, a composição com- preende um ou mais micro-organismos. Em uma modalidade, a composição compreende uma ou mais vitaminas. Em uma modalidade, a composição compreende um ou mais minerais. Em uma modalidade, a composição com- preende um ou mais aminoácidos. Em uma modalidade, a composição com- preende um ou mais de outros ingredientes da ração.
[0357] Em outra modalidade, a composição compreende um ou mais dos polipeptídeos da invenção, um ou mais agentes de formula- ção e um ou mais enzimas adicionais. Em uma modalidade, a composição compreende um ou mais dos polipeptídeos da invenção, um ou mais agentes de formulação e um ou mais micro-organismos. Em uma modalidade, a com- posição compreende um ou mais dos polipeptídeos da invenção, um ou mais agentes de formulação e uma ou mais vitaminas. Em uma modalidade, a composição compreende um ou mais dos polipeptídeos da invenção e um ou mais minerais. Em uma modalidade, a composição compreende o poli- peptídeo da invenção, um ou mais agentes de formulação e um ou mais ami- noácidos. Em uma modalidade, a composição compreende um ou mais dos polipeptídeos da invenção, um ou mais agentes de formulação e um ou mais de outros ingredientes da ração.
[0358] Em uma modalidade adicional, a composição com- preende um ou mais dos polipeptídeos da invenção, um ou mais agentes de formulação e um ou mais componentes selecionados da lista consistindo em uma ou mais enzimas adicionais, um ou mais micróbios; uma ou mais vita- minas; um ou mais minerais; um ou mais aminoácidos; um ou mais de outros ingredientes da ração.
[0359] A concentração de muramidase final na dieta está dentro da faixa de 0,01 a 200 mg de proteína enzimática por kg de DM de ração para ruminantes, tal como 0,1 a 150 mg, 0,5 a 100 mg, 1 a 75 mg, 2 a 50 mg, 3 a 25 mg, 2 a 80 mg, 5 a 60 mg, 8 a 40 mg ou 10 a 30 mg de proteína enzimática por kg de DM de ração para ruminantes, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0360] É contemplado no presente que a muramidase seja administrada em uma ou mais das seguintes quantidades (faixas de dosa- gem): 0,01 a 200; 0,01 a 100; 0,5 a 100; 1 a 50; 5 a 100; 5 a 50; 10 a 100; 0,05 a 50; 5 a 25 ou 0,10 a 10 - sendo todas essas gamas em mg de mura- midase por kg de DM de ração (ppm).
[0361] Para determinar mg de proteína muramidase por kg de DM de ração, a muramidase é purificada a partir da composição de ração, e a atividade específica da muramidase purificada é determinada com o uso de um ensaio relevante (consultar sob atividade de muramidase). A atividade de muramidase da composição de ração como tal é também determinada usando o mesmo ensaio e, com base em estas duas determinações, a dosa- gem em mg de proteína muramidase por kg de ração é calculada.
[0362] Em uma modalidade particular, o aditivo de ração para ruminantes da invenção se destina a estar incluído (ou prescrito como tendo de estar incluído) em dietas ou ração para ruminantes em níveis de 0,01 a 10,0%; mais particularmente 0,05 a 5,0%; ou 0,2 a 1,0% (significando % g de aditivo por 100 g de ração). Isto é assim em particular para pré-mis- turas.
[0363] Os mesmos princípios se aplicam para determinar mg de proteína muramidase em suplementos alimentares e aditivos alimen- tares. Naturalmente, se uma amostra estiver disponível da muramidase usada para preparar o aditivo alimentar ou a ração, a atividade específica é determinada a partir dessa amostra (não há necessidade de purificar a mu- ramidase da composição de ração, suplemento alimentar ou aditivo alimen- tar). Enzimas Adicionais
[0364] Em outra modalidade, as composições descritas no presente documento incluem opcionalmente uma ou mais enzimas. As enzi- mas podem ser classificadas com base no manual Enzyme Nomenclature de NC-IUBMB, 1992, consultar também o site ENZYME na internet: http://www.expasy.ch/enzyme/. ENZYME é um repositório de informação em relação à nomenclatura de enzimas. O mesmo é principalmente baseado nas recomendações do Nomenclature Committee of the International Union of Bi- ochemistry and Molecular Biology (IUB-MB), Academic Press, Inc., 1992, e descreve cada tipo de enzima caracterizada para a qual um número de EC (Comissão de Enzima - Enzyme Commission) foi fornecido (Bairoch A. The
ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304 a 305). Essa nomencla- tura de Enzimas IUB-MB é baseada na sua especificidade pelo substrato e ocasionalmente no seu mecanismo molecular; uma tal classificação não re- flete as características estruturais destas enzimas.
[0365] Uma outra classificação de certas enzimas de glico- sídeo hidrolase, como endoglucanase, xilanase, galactanase, mananase, dextranase, muramidase e galactosidase, é descrita em Henrissat et al, "The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013", Nucl. Acids Res. (1 de janeiro de 2014) 42 (D1): D490 a D495; consultar também www.cazy.org.
[0366] Assim, a composição da invenção também pode compreender pelo menos uma outra enzima selecionada dentre o grupo compreendendo xilanase (EC 3.2.1.8); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-ga- lactosidase (EC 3.2.1.22); protease (EC 3.4); fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipase (EC 3.1.1.5); fosfolipase C (3.1.4.3); fosfolipase D (EC 3.1.4.4); amilase, tal como, por exemplo, alfa- amilase (EC 3.2.1.1); arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55); beta-xilosidase (EC
3.2.1.37); acetil xilana esterase (EC 3.1.1.72); feruloil esterase (EC 3.1.1.73); celulase (EC 3.2.1.4); celobioidrolases (EC 3.2.1.91); beta-glucosidase (EC
3.2.1.21); pululanase (EC 3.2.1.41), alfa-manosidase (EC 3.2.1.24), mana- nase (EC 3.2.1.25) e beta-glucanase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6), ou qualquer combinação das mesmas.
[0367] Em uma modalidade particular, a composição da in- venção compreende uma fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26). Exemplos de fitases comercialmente disponíveis incluem Bio-FeedTM Phytase (Novozymes), Ro- nozyme® P, Ronozyme® NP e Ronozyme® HiPhos (DSM Nutritional Pro- ducts), NatuphosTM (BASF), Finase® e Quantum® Blue (AB Enzymes), Op- tiPhos® (Huvepharma), Phyzyme® XP (Verenium/DuPont) e Axtra® PHY (DuPont). Outras fitases preferenciais incluem aquelas descritas, por exem- plo, nos documentos WO 98/28408, WO 00/43503 e WO 03/066847.
[0368] Em uma modalidade particular, a composição da in- venção compreende uma xilanase (EC 3,2.1.8). Exemplos de xilanases co- mercialmente disponíveis incluem Ronozyme® WX e Ronozyme® G2 (DSM Nutritional Products), Econase® XT e Barley (AB Vista), Xylathin® (Vere- nium), Hostazym® X (Huvepharma) e Axtra® XB (Xilanase/beta-glucanase, DuPont).
[0369] Em uma modalidade particular, a composição da in- venção compreende uma protease (EC 3.4). Exemplos de proteases comer- cialmente disponíveis incluem Ronozyme® ProAct (DSM Nutritional Pro- ducts).
[0370] Em uma modalidade particular, a composição da in- venção compreende uma alfa-amilase (EC 3.2.1.1). Exemplos de alfa-amila- ses comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® Rumistar (DSM Nutriti- onal Products). Micróbios
[0371] Em uma modalidade, a composição de ração para ruminantes compreende adicionalmente um ou mais micróbios adicionais. Em uma modalidade particular, a composição de ração para ruminantes com- preende adicionalmente uma bactéria de um ou mais dos seguintes gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Entero- coccus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphaera ou qualquer sua combinação.
[0372] Em uma modalidade preferencial, a composição de ração para ruminantes compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Ba- cillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Enterococcus fae- cium, Enterococcus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacte- rium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farci- minus, lactobacillus rhamnosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium ani- malis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius ssp. saliva- rius, Megasphaera elsdenii, Propionibacteria sp.
[0373] Em uma modalidade mais preferencial, a composi- ção, suplemento alimentar para ruminantes, aditivo alimentar para ruminan- tes ou ração para ruminantes compreende adicionalmente uma bactéria se- lecionada de uma ou mais das seguintes cepas: Enterococcus faecium cepa 8G-1 (NRRL B-50173), Enterococcus faecium cepa 8G-73 (NRRL B-50172), Bacillus pumilus cepa 8G-134 (NRRL B-50174), M. elsdenii cepa NCIMB 41125, Propionibacterium cepa P169 (PTA-5271), Propionibacterium cepa P170 (PTA-5272) cepas, Propionibacterium cepa P179 (NRRL B-50133), Propionibacterium cepa P195 (NRRL B-50132), Propionibacterium cepa P261 (NRRL B-50131), Propionibacteria jensenii cepa P63 (DSM22192), Propionibacterium cepa P5 (ATCC 55467), Propionibacterium cepa P54 (NRRL B-50494), Propionibacterium cepa P25 (NRRL B-50497), Propioni- bacterium cepa P49 (NRRL B-50496), Propionibacterium cepa P104 (NRRL B-50495), B. licheniformis cepa 3-12a (NRRL B-50504), B. subtilis cepa 4-7d (NRRL B-50505), B. licheniformis cepa 4-2a (NRRL B-50506), B. subtilis cepa 3-5h (NRRL B-50507), Bacillus 747 (NRRL B-67257) ou uma cepa que tem todas as características de identificação de Bacillus 747 (NRRL B- 67257), Bacillus cepa 1104 (NRRL B-67258), Bacillus cepa 1781 (NRRL B- 67259), Bacillus cepa 1541 (NRRL B-67260), Bacillus cepa 2018 (NRRL B- 67261) e Bacillus cepa 1999 (NRRL B-67318).
[0374] Em uma modalidade mais preferencial, a composi- ção, suplemento alimentar para ruminantes, aditivo alimentar para ruminan- tes ou ração para ruminantes compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus subtilis: 3A-P4 (PTA-6506), 15A-P4 (PTA-6507), 22C-P1 (PTA-6508), 2084 (NRRL B-500130), LSSA01
(NRRL-B-50104), BS27 (NRRL B-501 05), BS 18 (NRRL B-50633), BS 278 (NRRL B-50634), DSM 29870, DSM 29871, NRRL B-50136, NRRL B-50605, NRRL B-50606, NRRL B-50622 e PTA-7547.
[0375] Em uma modalidade mais preferencial, a composi- ção, suplemento alimentar para ruminantes, aditivo alimentar para ruminan- tes ou ração para ruminantes compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus pumilus: NRRL B-50016, ATCC 700385, NRRL B-50885 ou NRRL B-50886.
[0376] Em uma modalidade mais preferencial, a composi- ção, suplemento alimentar para ruminantes, aditivo alimentar para ruminan- tes ou ração para ruminantes compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus lichenformis: NRRL B 50015, NRRL B-50621 ou NRRL B-50623.
[0377] Em uma modalidade mais preferencial, a composi- ção, suplemento alimentar para ruminantes, aditivo alimentar para ruminan- tes ou ração para ruminantes compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus amyloliquefaciens: DSM 29869, DSM 29872, NRRL B 50607, PTA-7543, PTA-7549, NRRL B-50349, NRRL B-50606, NRRL B-50013, NRRL B-50151, NRRL B-50141, NRRL B- 50147 ou NRRL B-50888.
[0378] A contagem bacteriana de cada uma das cepas bacterianas na composição de ração para ruminantes é entre 1x104 e 1x1014 CFU/kg de matéria seca, preferencialmente entre 1x106 e 1x1012 CFU/kg de matéria seca e, mais preferencialmente, entre 1x107 e 1x1011 CFU/kg de ma- téria seca. Em uma modalidade mais preferencial, a contagem bacteriana de cada uma das cepas bacterianas na composição de ração para ruminantes é entre 1x108 e 1x1010 CFU/kg de matéria seca.
[0379] A contagem bacteriana de cada uma das estirpes bacterianas na composição de ração para ruminantes é entre 1x105 e 1x1015
CFU/ruminante/dia, preferencialmente entre 1x107 e 1x1013 CFU/rumi- nante/dia e, mais preferencialmente, entre 1x108 e 1x1012 CFU/rumi- nante/dia. Em uma modalidade mais preferencial, a contagem bacteriana de cada uma das estirpes bacterianas na composição de ração para ruminantes está entre 1x109 e 1x1011 CFU/animal/dia.
[0380] Em outra modalidade, a uma ou mais cepas bacte- rianas estão presentes na forma de um esporo estável. Pré-mistura
[0381] Em uma modalidade, a ração para ruminantes pode incluir uma pré-mistura compreendendo, p.ex., vitaminas, minerais, enzimas, aminoácidos, conservantes, antibióticos, outros ingredientes da ração ou qualquer combinação dos mesmos que seja misturada na ração para rumi- nantes. Aminoácidos
[0382] A composição da invenção pode compreender adi- cionalmente um ou mais aminoácidos. Exemplos de aminoácidos que são usados em ração para ruminantes são lisina, alanina, beta-alanina, treonina, metionina e triptofano. Vitaminas e Minerais
[0383] Em outra modalidade, a ração para ruminantes pode incluir uma ou mais vitaminas, tais como uma ou mais vitaminas solú- veis em gordura e/ou uma ou mais vitaminas solúveis em água. Em outra modalidade, a ração para ruminantes pode incluir opcionalmente um ou mais minerais, tais como um ou mais minerais vestigiais e/ou um ou mais macro- minerais.
[0384] Usualmente, as vitaminas solúveis em gordura e água, bem como minerais vestigiais, formam parte de uma assim chamada pré-mistura destinada à adição à ração, ao mesmo tempo que os macromi- nerais são usualmente adicionados separadamente à ração.
[0385] Exemplos não limitantes de vitaminas solúveis em gordura incluem vitamina A, vitamina D3, vitamina E, e vitamina K, p.ex., vi- tamina K3.
[0386] Exemplos não limitantes de vitaminas solúveis em água incluem vitamina B12, biotina e colina, vitamina B1, vitamina B2, vita- mina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo, Ca-D-pantotenato.
[0387] Exemplos não limitantes de minerais vestigiais in- cluem boro, cobalto, cloreto, crômio, cobre, flúor, iodo, ferro, manganês, mo- libdênio, selênio e zinco.
[0388]Exemplos não limitantes de macrominerais incluem cálcio, magnésio, potássio e sódio.
[0389] Em alternativa, o suplemento alimentar para rumi- nantes ou aditivo alimentar para ruminantes da invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados em "Nutrient require- ments in ruminant", sétima edição revisada de 2001, subcommittee on rumi- nant nutrition, committee on ruminant nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C. Tabela A de WO 01/58275. Pelo menos um significa qualquer um de, um ou mais do que, um ou dois ou três ou quatro e assim por diante até todos os treze, ou até todos os quinze, componentes individuais. Mais especificamente, este pelo menos um componente individual é incluído no aditivo da invenção em uma tal quantidade de modo a proporcionar uma concentração na ração dentro da gama indicada na coluna quatro ou coluna cinco ou coluna seis da Tabela A. Outros ingredientes de ração
[0390] A composição da invenção pode adicionalmente compreender agentes corantes naturais ou sintéticos, estabilizadores da flora intestinal, estabilizadores de pH/moduladores de pH, intensificadores de di-
gestibilidade, aditivos de melhoria de crescimento, compostos de aroma/aro- matizantes, ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs); óleos essenciais, espé- cies reativas de geração de oxigênio, peptídeos antifúngicos, polipeptídeos antifúngicos, peptídeos antimicrobianos, extratos e culturas de fermentação de fungos, aditivos imunomoduladores, aditivos antioxidantes, intensificado- res metabólicos, modificadores de fermentação ruminal, receptores de elé- trons e catalisadores ruminais, outros aditivos zootecnológicos, tais como aglutinantes, agentes antiaglomerantes e coagulantes, agentes de controle de amônia, antimicrobianos botânicos, antimetanógenos e/ou ionóforos.
[0391] Exemplos de agentes corantes incluem, porém, sem limitação, carotenoides, tais como betacaroteno, astaxantina e luteína.
[0392] Exemplos de estabilizadores da flora intestinal e/ou estabilizadores de pH incluem, porém, sem limitação, levedura viva ou cultu- ras de levedura, tais como Saccharomyces cerevisiae.
[0393] Exemplos de intensificadores de digestibilidade in- cluem, porém, sem limitação, enzimas, por exemplo, alfa-amilase.
[0394] Exemplos de compostos de aroma/aromatizantes incluem, porém, sem limitação, creosol, anetol, deca-, undeca- e/ou dodeca- lactonas, iononas, irona, gingerol, piperidina, propilidenofatalida, butilide- nofatalida, capsaicina ou tanino.
[0395] Exemplos de ácidos graxos poli-insaturados in- cluem, porém, sem limitação, ácidos graxos poli-insaturados C18, C20 e C22, tais como ácido araquidônico, ácido docosohexaenoico, ácido eicosa- pentaenoico e ácido gama-linoleico.
[0396] Exemplos de óleos essenciais incluem, porém, sem limitação, anis, cade, pimentão, canela, cravo, endro, alho, eugenol ou cina- maldeído e seus ingredientes ativos.
[0397] Exemplos de espécies reativas de geração de oxi- gênio incluem, porém, sem limitação, produtos químicos tais como perborato,
persulfato ou percarbonato; e enzimas, tais como uma oxidase, uma oxige- nase ou uma sintetase, ácido acidônico, ácido docosohexaenoico, ácido ei- cosapentaenoico e ácido gama-linoleico.
[0398] Exemplos de polipeptídeos antifúngicos (AFP's) in- cluem, porém, sem limitação, os peptídeos Aspergillus giganteus e Asper- gillus niger, bem como variantes e fragmentos dos mesmos que retêm ativi- dade antifúngica, conforme revelado nos documentos WO 94/01459 e WO 02/090384.
[0399] Exemplos de agentes estabilizadores, tais como, por exemplo, tampões e/ou acidificantes incluem, porém, sem limitação, Le- vedura viva, Bicarbonato de Sódio, Algas Marinhas Calcárias e Lecitinas.
[0400] Exemplos de peptídeos antimicrobianos (AMP) in- cluem, porém, sem limitação, CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina e Ovispirina tal como Novis- pirina (Robert Lehrer, 2000), Plectasinas, Estatinas, incluindo os compostos e polipeptídeos divulgados nos documentos WO 03/044049 e WO 03/048148, bem como variantes ou fragmentos do supracitado que retêm atividade antimicrobiana.
[0401] Exemplos de agentes imunomoduladores incluem, porém, sem limitação, B-glucanos, Saccharomyces cerevisiae.
[0402] Exemplos de agentes antioxidantes incluem, po- rém, sem limitação, vitaminas A, E e outros antioxidantes naturais; por exem- plo, lecitina.
[0403] Exemplos de agentes receptores de elétrons in- cluem, porém, sem limitação, nitrato e seus compostos orgânicos.
[0404] Exemplos de extratos de fermentação de fungos e culturas incluem, porém, sem limitação, Aspergillus oryzae comercializado como Amaferm Vitaferm (Biozyme Enterprises Inc.).
[0405] Exemplos de agentes antiaglomerantes e ligantes incluem, porém, sem limitação, aluminatos de cálcio sintéticos.
[0406] Exemplos de aditivos zootecnológicos incluem, por exemplo, controle de amônia.
[0407] Exemplos de ionóforos incluem monensina tal como, por exemplo, Rumensin® da Elanco.
[0408] A composição da invenção pode compreender adi- cionalmente pelo menos um aminoácido. Exemplos de aminoácidos que são usados na ração para ruminantes incluem, porém, sem limitação, lisina, ala- nina, beta-alanina, treonina, metionina e triptofano. Uso de Muramidase para Melhorar o Desempenho de Rumi- nantes
[0409] Em outro aspecto, a invenção se refere ao uso de um suplemento alimentar para ruminantes, um aditivo alimentar para rumi- nantes ou uma ração para ruminantes para melhorar a Razão de Conversão Alimentar (FCR) em um ruminante em que a ração para ruminantes, suple- mento alimentar para ruminantes ou aditivo alimentar para ruminantes com- preende uma ou mais muramidases, em que a muramidase é administrada em um nível de 1 a 200 mg de proteína enzimática por kg de DM de ração para ruminantes.
[0410] Em uma modalidade preferencial, a melhoria é comparada a uma ração para ruminantes, suplemento alimentar para rumi- nantes ou aditivo alimentar para ruminantes em que a muramidase não está presente (no presente documento denominado como o controle negativo).
[0411] Em uma modalidade, a FCR é melhorada em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,25%, pelo menos 1,5%, pelo menos 1,75% ou pelo menos 2,0% em comparação com o controle. Em uma moda- lidade adicional, a FCR é melhorada entre 1% e 5%, tal como entre 1% e 4%,
entre 1% e 3%, 1,25% e 2,5%, 1,5% e 2% em comparação com o controle, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0412] Em uma modalidade, a muramidase é dosada em um nível de 1 a 200 mg de proteína enzimática por kg de DM de ração para ruminantes, tal como 5 a 150 mg, 5 a 125 mg, 5 a 100 mg, 5 a 75 mg, 5 a 50 mg, 5 a 40 mg, 10 a 50 ou 5 a 25 mg de proteína enzimática por kg de DM de ração para ruminantes ou qualquer combinação desses intervalos.
[0413] Em uma modalidade, o ruminante é selecionado do grupo que consiste em: gado, vaca, gado leiteiro, gado de corte, búfalo, be- zerro, cabra, ovelha, cordeiro, veado, iaque, camelo e lhama. Em uma mo- dalidade preferencial, o ruminante é selecionado do grupo que consiste em: gado, vaca, gado leiteiro, gado de corte, búfalo e bezerro. Em uma modali- dade mais preferencial, o ruminante é selecionado do grupo que consiste em: gado, gado leiteiro e gado de corte.
[0414] Em uma modalidade, a muramidase é fornecida ao ruminante durante qualquer período de tempo desde o nascimento até o abate. Em uma modalidade preferencial, a muramidase é fornecida ao rumi- nante em uma base diária. Em uma modalidade adicional, a muramidase é fornecida ao ruminante em uma base diária durante toda a vida do ruminante.
[0415] Em uma modalidade, a muramidase é fornecida a ruminantes em crescimento. Em uma modalidade, a muramidase é fornecida ao gado leiteiro. Em uma modalidade, a muramidase é fornecida ao gado de corte na fase de crescimento da produção de gado de corte. Em uma moda- lidade, a muramidase é fornecida ao gado de corte na fase de acabamento da produção de gado de corte. Em uma modalidade adicional, a muramidase é fornecida a bezerros no leite.
[0416] Em uma modalidade, a muramidase é de origem microbiana. Em uma modalidade adicional, a muramidase é de origem fún- gica. Em uma modalidade, a muramidase é obtida ou obtenível a partir do filo Ascomycota, tal como o subfilo Pezizomicotina.
[0417] Em uma modalidade, a muramidase compreende um ou mais domínios de uma família de glicosídeo hidrolase (GH) selecio- nada da lista que consiste em GH24, GH25 e polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de muramidase.
MODALIDADES PREFERENCIAIS
[0418] O que se segue é uma lista de modalidades prefe- renciais compreendidas pela invenção:
[0419] 1. Composição de ração para ruminantes, tal como uma ração para ruminantes, suplemento alimentar para ruminantes ou aditivo alimentar para ruminantes que compreende uma ou mais muramida- ses, em que a muramidase é em uma quantidade suficiente para administra- ção em um nível de 1 a 200 mg de proteína enzimática por kg de ração para ruminantes.
[0420] 2. A composição de ração para ruminantes, de acordo com a modalidade 1, em que a muramidase é dosada em um nível de 1 a 200 mg de proteína enzimática por kg de matéria seca de ração para ruminantes.
[0421] 3. A composição de ração para ruminantes da modalidade 1 ou 2, em que a muramidase é dosada em um nível de 5 a 150 mg, de 5 a 125 mg, de 5 a 100 mg, de 5 a 75 mg, de 5 a 50 mg, de 5 a 40 mg, de 10 a 50, de 5 a 25 mg de proteína enzimática por kg de matéria seca de ração para ruminantes, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0422] 4. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que a produção de leite corrigido para energia (ECM) de ruminantes após a administração é melhorada em pelo menos 1,0%, de preferência pelo menos 1,5%, mais preferencialmente pelo menos 2,0% em comparação com o controle.
[0423] 5. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que o ruminante é selecionado do grupo que consiste em: gado, vaca, gado leiteiro, gado de corte, búfalo, be- zerro jovem, cabra, ovelha, cordeiro, veado, iaque, camelo e lhama.
[0424] 6. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que o ruminante é selecionado do grupo que consiste em: gado, gado leiteiro e gado de corte.
[0425] 7. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 1 a 6, em que a muramidase é fornecida ao ruminante durante toda a vida do ruminante.
[0426] 8. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que a muramidase é de origem microbiana.
[0427] 9. A composição de ração para ruminantes da modalidade 8, em que a muramidase é de origem fúngica.
[0428] 10. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que a muramidase é obtida ou obtenível do filo Ascomycota.
[0429] 11. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 1 a 10, em que a muramidase é obtida ou obtenível do subfilo Pezizomicotina.
[0430] 12. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 1 a 11, em que a muramidase compreende um ou mais domínios de uma família de glicosídeo hidrolase (GH) selecio- nada da lista que consiste em GH24, GH25 e polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de muramidase.
[0431] 13. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 1 a 12, em que a muramidase é selecionada do grupo que consiste em:
[0432] (a) um polipeptídeo que tem pelo menos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, e SEQ ID NO: 59;
[0433] (b) uma variante de uma sequência de aminoá- cidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID
NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, e SEQ ID NO: 59 em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições de ami- noácidos e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos e/ou uma ou mais in- serções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições;
[0434] (c) um fragmento do polipeptídeo de (a) ou (b) que tem atividade de muramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoáci- dos, pelo menos 190 aminoácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo me- nos 200 aminoácidos;
[0435] 14. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 1 a 13, em que a composição de ração para ruminantes compreende adicionalmente um ou mais componentes selecio- nados da lista que consiste em: um ou mais portadores; uma ou mais enzimas adicionais; um ou mais micróbios; uma ou mais vitaminas; um ou mais minerais; um ou mais aminoácidos; um ou mais ácidos orgânicos; e um ou mais outros ingredientes de ração.
[0436] 15. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 1 a 14, em que a muramidase é na forma granulada.
[0437] 16. A composição de ração para ruminantes, de acordo com a modalidade 15, em que o granulado é revestido.
[0438] 17. A composição de ração para ruminantes, de acordo com a modalidade 16, em que o revestimento compreende um sal e/ou cera e/ou farinha.
[0439] 18. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 1 a 17, em que a muramidase é em uma formulação líquida.
[0440] 19. A composição de ração para ruminantes, de acordo com a modalidade 18, em que a formulação líquida é pulverizada so- bre a ração após ter sido peletizada.
[0441] 20. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 4 a 19, em que o controle é uma composição de ração para ruminantes que não compreende muramidase.
[0442] 21. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 4 a 20, em que o controle é uma composição de ração para ruminantes que não compreende muramidase GH24, murami- dase GH25 ou polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de murami- dase.
[0443] 22. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 4 a 21, em que o controle é uma composição de ração para ruminantes que compreende Lisozima de Clara de Ovo de Galinha (HEWL).
[0444] 23. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 4 a 21, em que o controle é monensina.
[0445] 24. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 1 a 23, em que a composição de ração para ruminantes que compreende muramidase é administrada a um ruminante se- lecionado do grupo que consiste em: Um ruminante em crescimento, um gado leiteiro, um gado de corte na fase de crescimento da produção de gado de corte, um gado de corte na fase de terminação da produção de gado de corte e um bezerro.
[0446] 25. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que a composição de ração para ruminantes que compreende muramidase é administrada a um ruminante em crescimento.
[0447] 26. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que a composição de ração para ruminantes que compreende muramidase é administrada a um gado leiteiro.
[0448] 27. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que a composição de ração para ruminantes que compreende muramidase é administrada a um gado de corte na fase de crescimento da produção de gado de corte.
[0449] 28. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que a composição de ração para ruminantes que compreende muramidase é administrada a um gado de corte na fase de acabamento da produção de gado de corte.
[0450] 29. A composição de ração para ruminantes de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que a composição de ração para ruminantes que compreende muramidase é administrada a um bezerro.
[0451] 30. Método para melhorar a produção de leite corrigido para energia (ECM) de um ruminante, que compreende a adminis- tração ao ruminante de uma composição alimentar de ruminante de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 29.
[0452] 31. Método para aumentar a digestibilidade de matéria seca (DMd) de uma ração para ruminantes, suplemento alimentar para ruminantes ou aditivo alimentar para ruminantes, que compreende as etapas de: a) fornecer pelo menos uma muramidase; b) fornecer uma ração para ruminantes, suplemento alimentar para ruminantes ou aditivo alimentar para ruminantes adequado para um animal ruminante; c) aplicar a murami- dase à ração para ruminantes, suplemento alimentar para ruminantes ou adi- tivo alimentar para ruminantes para formar uma composição de ração para ruminantes; e d) alimentar o animal ruminante com a composição alimentar para ruminantes, de modo que que seja efetuado um aumento na digestibili- dade de matéria seca.
[0453] 32. O método da modalidade 31, em que DMd é medida de acordo com o exemplo 2.
[0454] 33. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 32, em que a DMd é aumentada em comparação com a DMd na alimen- tação preparada como na modalidade 31, mas sem muramidase adicionada na etapa c).
[0455] 34. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 33, em que a produção de ácidos graxos voláteis (AGV) no rúmen é aumentada em comparação com a produção de AGV no rúmen de um rumi- nante não alimentado com uma muramidase.
[0456] 35. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 34, em que a produção de propionato no rúmen é aumentada em com- paração com a produção de propionato no rúmen de um ruminante não ali- mentado com uma muramidase.
[0457] 36. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 35, em que a produção de acetato no rúmen é aumentada em compa- ração com a produção de acetato no rúmen de um ruminante não alimentado com uma muramidase.
[0458] 37. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 36, em que a muramidase é dosada em um nível de 1 a 310 mg de proteína enzimática por kg de matéria seca de ração para ruminantes.
[0459] 38. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 37, em que a muramidase é dosada em um nível de 5 a 150 mg, de 5 a 125 mg, de 5 a 100 mg, de 5 a 75 mg, de 5 a 50 mg, de 5 a 40 mg, de 10 a 50, de 5 a 25 mg de proteína enzimática por kg de matéria seca da ração para ruminantes, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0460] 39. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 38, em que a produção de Leite Corrigido para Energia (ECM) de rumi- nantes após a administração é melhorada em pelo menos 1,0%, de prefe- rência pelo menos 1,5%, mais preferencialmente pelo menos 2,0% em com- paração com o controle.
[0461] 40. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 39, em que o ruminante é selecionado do grupo que consiste em: gado, vaca, gado leiteiro, gado de corte, búfalo, bezerro jovem, cabra, ovelha, cor- deiro, veado, iaque, camelo e lhama.
[0462] 41. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 40, em que o ruminante é selecionado do grupo que consiste em: gado, gado leiteiro e gado de corte.
[0463] 42. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 41, em que a muramidase é fornecida ao ruminante durante toda a vida do ruminante.
[0464] 43. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 42, em que a muramidase é de origem microbiana.
[0465] 44. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 42, em que a muramidase é de origem fúngica.
[0466] 45. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 44, em que a muramidase é obtida ou obtenível a partir do filo As- comycota.
[0467] 46. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 45, em que a muramidase é obtida ou obtenível a partir do subfilo Pezi- zomicotina.
[0468] 47. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 46, em que a muramidase compreende um ou mais domínios de uma família de glicosídeo hidrolase (GH) selecionada da lista que consiste em GH24, GH25 e polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de murami- dase.
[0469] 48. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 47, em que a muramidase é selecionada do grupo que consiste em:
[0470] (a) um polipeptídeo que tem pelo menos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, e SEQ ID NO: 59;
[0471] (b) uma variante de uma sequência de aminoá- cidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 3, SEQ ID
NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, e SEQ ID NO: 59 em que a variante tem atividade de muramidase e compreende uma ou mais substituições de ami- noácidos e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos e/ou uma ou mais in- serções de aminoácidos ou qualquer combinação das mesmas em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 posições;
[0472] (c) um fragmento do polipeptídeo de (a) ou (b) que tem atividade de muramidase, em que o fragmento compreende pelo menos 170 aminoácidos, tal como pelo menos 175 aminoácidos, pelo menos 177 aminoácidos, pelo menos 180 aminoácidos, pelo menos 185 aminoáci- dos, pelo menos 190 aminoácidos, pelo menos 195 aminoácidos ou pelo me- nos 200 aminoácidos;
[0473] 49. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 48, em que a muramidase é na forma granulada.
[0474] 50. O método da modalidade 49, em que o gra- nulado é revestido.
[0475] 51. O método da modalidade 50, em que o reves- timento compreende um sal e/ou cera e/ou uma farinha.
[0476] 52. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 51, em que a muramidase é em uma formulação líquida.
[0477] 53. O método da modalidade 52, em que a for- mulação líquida é pulverizada sobre a ração após a mesma ter sido peleti- zada.
[0478] 54. O método de qualquer uma das modalidades 39 a 53, em que o controle é uma composição de ração para ruminantes que não compreende muramidase.
[0479] 55. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 39 a 53, em que o controle é uma composição de ração para ruminantes que não compreende muramidase GH24, muramidase GH25 ou polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de muramidase.
[0480] 56. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 39 a 55, em que o controle é uma composição de ração para ruminantes que compreende Lisozima de Clara de Ovo de Galinha (HEWL).
[0481] 57. O método de qualquer uma das modalidades 39 a 55, em que o controle é monensina.
[0482] 58. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 31 a 57, em que a composição de ração para ruminantes que compreende muramidase é administrada a um ruminante selecionado do grupo que consiste em: Um ruminante em crescimento, um gado leiteiro, um gado de corte na fase de crescimento da produção de gado de corte, um gado de corte na fase de terminação da produção de gado de corte e um bezerro.
[0483] 59. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 58, em que a composição de ração para ruminantes que compreende muramidase é administrada a um ruminante em crescimento.
[0484] 60. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 58, em que a composição de ração para ruminantes que compreende muramidase é administrada a um gado leiteiro.
[0485] 61. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 58, em que a composição de ração para ruminantes que compreende muramidase é administrada a um gado de corte na fase de crescimento da produção de gado de corte.
[0486] 62. O método de qualquer uma das modalidades 31 a 58, em que a composição de ração para ruminantes que compreende muramidase é administrada a um gado de corte na fase de acabamento da produção de gado de corte.
[0487] 63. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 31 a 58, em que a composição de ração para ruminantes que compreende muramidase é administrada a um bezerro.
EXEMPLOS
[0488] As muramidases foram clonadas, expressas, carac- terizadas e testadas quanto à atividade de muramidase conforme descrito no documento WO 2013/076253.
[0489] Exemplo 1 - Efeito da muramidase na produção de gás de fermentação ruminal e digestibilidade de matéria seca da ração
[0490] Material e métodos:
[0491] O modelo de fermentação in vitro foi adaptado de Menke e Steingass, (Menke KH, Steingass H. (Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid. Anim Res Dev. (1988) 28:7 a 55). O projeto experimental incluiu tratamentos de controle negativo (NC, apenas ração e solução tampão rumi- nal), controle positivo (PC, ração e solução tampão ruminal adicionado de um modificador ruminal comercial (Monensina)), muramidase (SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 e 27, controle negativo com muramidases) e bran- cos (apenas solução tampão ruminal), Tabela 1. O ensaio foi repetido 2 ve- zes (ensaio 1 e ensaio 2) para aumentar o poder do estudo geral.
[0492] Tabela 1 Tratamento N Ração Classe de enzima Dosagem g mg EP/kg de ração Teste Teste 1 2 Branco 3 3 - NC 4 6 0,5 PC (Monensina) 3 4 0,5 Produto não enzimático 22 SEQ ID NO: 3 3 3 0,5 polipeptídeos MUR 50 inovadores que têm atividade de muramidase SEQ ID NO: 6 3 3 0,5 polipeptídeos MUR 50 inovadores que têm atividade de muramidase SEQ ID NO: 9 3 3 0,5 polipeptídeos MUR 50 inovadores que têm atividade de muramidase SEQ ID NO: 12 3 3 0,5 GH25 50 SEQ ID NO: 15 3 3 0,5 GH25 50 SEQ ID NO: 18 3 3 0,5 GH25 50 SEQ ID NO: 21 3 3 0,5 GH24 25 SEQ ID NO: 24 3 3 0,5 GH24 25 SEQ ID NO: 27 3 3 0,5 polipeptídeos MUR 50 inovadores que têm atividade de muramidase
[0493] O método baseou-se na incubação de ração para ruminantes em uma solução de tampão e fluido ruminal por um período de 48 h, obtendo-se a produção de gases cumulativa e a digestibilidade da DM da ração. A solução mineral tampão usada foi preparada de acordo com Menke e Steingass (1988), e foi aquecida em banho-maria a 39 °C e purgada continuamente com CO2 por 60 minutos. Sulfito de sódio foi usado como agente redutor na solução tampão (0,33 g/l de solução). O fluido ruminal foi coletado de 2 novilhas Jersey (alojadas na fazenda experimental da Univer- sidade de Copenhagen, Dinamarca). O fluido ruminal foi coletado através da cânula ruminal e vertido em dois frascos térmicos pré-aquecidos a 39,0 ± 0,5 °C e imediatamente transferido para o laboratório. O fluido ruminal foi filtrado através de 3 camadas de morim para eliminar as partículas de ração e mis- turado com a solução mineral tampão em uma razão de 1 para 2 (Menke e Steingass, 1988).
[0494] O fluido ruminal e a solução tampão foram dispen- sados em frasco Duran de 90 ml com tampa equipada com transdutor de pressão sem fio e válvula de gás (Ankom RF Gas Production System, Ankom Technology®, Macedon, NY, USA). Após preenchimento com 0,5000 ± 0,0010 g de amostra de ração (silagem de milho, farelo de soja na razão de
2:1 em uma base de matéria seca) e pré-aquecidos durante a noite a 39 °C.
Os frascos Duram foram dosados com 1,00 ml de solução de tratamento (água ou solução de murimidase, ou solução de controle positivo) e foram administrados e misturados antes do fechamento dos frascos.
As soluções enzimáticas (A a I) foram todas produzidas pela Novozymes e foram dosadas de acordo com mg de proteína enzimática por kg de ração, Tabela 1. Como PC foi usada Monensina (Hidrato de sal de monensina sódica, lote # BCBR9717V, Sigma-Aldrich, Buchs Suíça) na concentração de 22 mg/kg de ração, Tabela 1. Todos os procedimentos foram realizados sob purga contí- nua com CO2. O espaço livre de cada frasco após o enchimento foi de 41 ml.
O gás de fermentação era liberado automaticamente dos frascos pela válvula de gás sempre que a pressão do gás aumentava 0,75 PSI.
A diferença de pressão relacionada à abertura da válvula de gás foi usada para calcular a produção de gás acumulada (ΔP) com o uso de a lei do gás ideal: GP = (ΔP/Po) Vo (1) em que: ΔP é a mudança de pressão acumulada (kPa) no espaço vazio da garrafa; Vo é o volume do espaço livre da garrafa (41 ml), Po é a pressão atmosférica.
Os dados da produção de gás foram expressos como ml/g de DM incubada sob pressão padrão e não foram incluídos no exemplo atual, mas foram usados para garantir a atividade de fermentação suficiente.
A matéria seca após a fermentação foi medida e relacionada à matéria seca inicial nos frascos para determinar a digestibilidade de matéria seca como (matéria seca antes - matéria seca depois)/matéria seca antes). Os dados foram expressos como a melhoria relativa de DMd em comparação com o controle quando se leva em consideração o conhecimento de fermen- tação dos brancos.
Os dados foram analisados estatisticamente pelo proce- dimento ANOVA em repouso dentro de JMP 12.1.0 (SAS Institute Inc.) e apresentados como médias LS, o modelo inicial incluiu tratamento, ensaio e interações, e foi após a avaliação do modelo reduzido ao efeito principal do tratamento.
[0495] Resultados
[0496] O resultado da DMd relativa é apresentado na fi- gura 1, e mostra que a adição de muramidase aumenta a digestão ruminal in vitro da matéria seca da ração em 48h em comparação com o controle posi- tivo (Monensina). Os dados também mostram que a adição de algumas mu- ramidases pode aumentar a DMd da ração para ruminantes em comparação com NC.
[0497] Conclusões
[0498] Em conclusão, em duas repetições do mesmo es- tudo, uma gama de muramidases de 3 classes diferentes mostrou uma me- lhoria na digestibilidade de matéria seca ruminal em relação ao aditivo rumi- nal Monensina comumente usado. Os dados também mostraram que a mai- oria das muramidases melhora a digestibilidade de matéria seca da ração ruminal sobre o NC.
[0499] Exemplo 2 - Efeito de resposta à dosagem de 5 muramidase na fermentação ruminal e digestibilidade de matéria seca da ração
[0500] Resumo:
[0501] A fermentação ruminal in vitro com o uso de fluido ruminal e tampão mostrou que a muramidase pode aumentar a digestibili- dade de matéria seca e aumentar a produção de acetato, propionato, AGV total ruminal e aumentar o agregado de carbono total no AGV ruminal.
[0502] Material e métodos:
[0503] O ensaio foi realizado pela Alimetrics (Alimetrics Ltd, Koskelontie 19B, FIN-02920 Espoo, Finlândia) com o uso de garrafas de soro de 120 ml como vasos de fermentação. A preparação e o procedimento de fermentação são apresentados em Kettunen et al., (Kettunen H., J. Vuo- renmaa, D. Gaffney e J. Apajalahti (2016): Yeast hydrolysate product enhan- ces ruminal fermentation in vitro. J. App. Anim. Nutr., Vol. 4; e1; página 1 de
7). Resumindo, o método é o seguinte: Todas as garrafas foram inicialmente preenchidas com 1g de DM de ração composta de silagem de milho, farelo de cevada, farelo de soja, nas quantidades de 0,5; 0,4 e 0,1 g de DM, res- pectivamente. Posteriormente, as garrafas foram lavadas com CO2, passa- das através de um catalisador de cobre quente para eliminação de O2 e se- ladas com rolha de borracha butílica espessa. Solução tampão de saliva ar- tificial anaeróbica, reduzida e ajustada à temperatura (+ 38 °C) (Modificada de Agriculture Handbook No. 379, (USDA, Washington, DC, 1975), volume de 37,65 ml), fluido ruminal recentemente coado (inóculo a 5%; volume de 2 ml), e os compostos de teste (volume de 0,35 ml) foram introduzidos nos recipientes de fermentação sob o fluxo de CO2 sem oxigênio. Após a coleta de fluido ruminal de uma vaca canulada no rúmen. O fluido ruminal foi bom- beado diretamente do rúmen para uma garrafa térmica pré-aquecida e ime- diatamente fechada e transportada para o laboratório da Alimetrics. O fluido ruminal foi usado para inoculação dentro de 2 horas após a colheita. Para garantir que micróbios ruminais associados tanto ao líquido quanto à partí- cula estivessem presentes no inóculo, ambas as frações foram obtidas. As frações líquidas e sólidas foram coadas através de uma malha de metal (ta- manho da malha 3 × 3 mm) sob condições anaeróbicas antes da diluição do tampão.
[0504] Após a inoculação com fluido ruminal, tampão e so- lução de teste, os recipientes foram vedados com septo de borracha butílica. Todos os recipientes de fermentação foram inoculados em ordem aleatória para impedir os possíveis efeitos de bloco. A hora de inoculação para cada recipiente de fermentação foi registrada e levada em consideração em cada amostragem para garantir que a duração da fermentação fosse a mesma para cada amostra. A fermentação continuou durante 12h em agitador gira- tório a + 38 °C. O gás de fermentação produzido foi medido e aliviado pela coleta do gás de fermentação em seringas nos tempos de 3, 6, 9 e 12h. Os resíduos de ração foram medidos após 12h de fermentação.
[0505] O projeto do ensaio foi uma resposta de dosagem, um projeto randomizado completo com 28 tratamentos com o uso de 150 recipientes de fermentação de acordo com a Tabela 2. As 25 soluções de muramidase foram diluídas para a concentração necessária em tampão de enzima (BSA, Tween 20, tampão de acetato, Cálcio, NaOH, ajustado para pH 6). O controle negativo foi suplementado com a mesma solução tampão que foi usada para diluir as enzimas para atingir o mesmo volume de líquido que os recipientes de fermentação suplementados. O ionóforo Monensina (sal de sódio de Monensina, 90 a 95% TLC (Sigma Aldrich; Código do pro- duto: M5273-1G)) foi escolhido como um controle positivo porque é um adi- tivo alimentar para ruminantes que afeta a produção de ácidos graxos volá- teis (AGV).
[0506] Tabela 2: tratamentos, dosagem e projeto do es- tudo Dosagem N/dosa- SEQ ID Classe de enzima 1 2 3 4 5 gem mg/40 ml NC 15 PC 5 Produto não enzimático 0,05 0,25 (Monensina) A 5 SEQ ID GH24 0,05 0,1 0,2 0,4 0,8 NO: 28 B 5 SEQ ID GH24 0,05 0,1 0,2 0,4 0,8 NO: 21 C 5 SEQ ID GH25 0,05 0,1 0,2 0,4 0,8 NO: 12 D 5 SEQ ID GH25 0,05 0,1 0,2 0,4 0,8 NO: 18 E 5 THX3038 polipeptídeos MUR 0,05 0,1 0,2 0,4 0,8 SEQ ID inovadores que têm atividade NO: 9 de muramidase
[0507] Coleta de amostras
[0508] As amostras líquidas obtidas às 12h foram analisa- das quanto à concentração de AGV (acetato, propionato, butirato e valerato) por GC-FID com o uso de uma coluna de vidro embalada com 80/120 carbo- pack B-DA/4% Carbowax estacionário e hélio como gás de transporte (Kettu- nen H., J. Vuorenmaa, T. Rinttilä, H. Grönberg, E. Valkonen e J. Apajalahti (2015): Natural resin acid –enriched composition as a modulator of intestinal microbiota and performance enhancer in broiler chicken. J. App. Anim. Nutr., Vol. 3; e2; página 1 de 9).
[0509] A digestibilidade de matéria seca foi quantificada pela determinação da matéria seca na matriz alimentar original e em todos os recipientes de fermentação após 12h de fermentação. Os resíduos de ra- ção dos recipientes de fermentação foram obtidos por filtração em filtros de vidro sinterizado tarados, lavados com água e secos a 105 °C por 12 horas. Finalmente, os filtros de vidro são pesados para a matéria seca residual da alimentação.
[0510] Cálculos e estatística
[0511] A digestibilidade de matéria seca foi calculada pela razão entre os resíduos de ração após o término da fermentação e a matéria seca alimentada. A soma de AGV foi calculada como a soma de acetato, propionato, butirato e valerato, e o carbono somado em AGV foi calculado atribuindo-se o respectivo número de átomos de carbono em acetato, propi- onato, butirato e valerato, 2, 3, 4, e 5, respectivamente. A melhoria relativa em comparação com NC foi calculada para DMd, e a concentração de ace- tato, propionato, butirato, AGV total e carbono total em AGV.
[0512] Os dados foram analisados para efeitos lineares e quadráticos com o uso do algoritmo de regressão linear em repouso no pro- cedimento misto proc do SAS (instituto SAS). Os dados apresentados são estimativas de regressão linear e erro padrão, bem como médias dos míni- mos quadrados e erro padrão, salvo indicação em contrário.
[0513] Resultados:
[0514] Os dados mostram que as muramidases podem afetar a digestibilidade de matéria seca ruminal e a produção de AGV in vitro Figuras 2 a 7. Todos os tratamentos com muramidase aumentaram a DMd quando comparados ao controle. A maior melhoria foi para o tratamento C (9,5%) quando a fermentação foi suplementada com 0,8 mg/40 ml.
[0515] Todos os tratamentos com muramidase aumenta- ram a produção ruminal de acetato e propionato numericamente em compa- ração ao controle. O acetato aumentou 16,0% quando o tratamento A foi su- plementado com 0,4 mg/40 ml, na mesma dosagem o propionato aumentou 24%, resultando em um aumento de 11% na produção total de AGV, Figuras 3 e 4, respectivamente. Os tratamentos A e B também diminuíram a produ- ção de butirato ruminal em comparação com o controle, Figura 5. No entanto, o carbono em AGV ainda foi afetado positivamente, apesar da redução no butirato, a melhoria em relação ao NC foi de até 7,3%, Figura 7.
[0516] A análise de regressão linear identificou os trata- mentos A, B e C como os mais potentes em aumentar a produção ruminal de acetato e propionato. A análise de regressão linear também identificou os tratamentos A, B e C como os mais potentes na redução da produção ruminal de butirato. O efeito sobre o acetato e o propionato pela dosagem dos trata- mentos A, B e C foram quadráticos. A produção total de AGV ruminal e o carbono total em AGV ruminal foram afetados de modo quadrático pela do- sagem de muramidase para o tratamento C.
[0517] Conclusão:
[0518] Em conclusão, os dados mostram que a murami- dase pode aumentar a digestibilidade de matéria seca e aumentar a produ- ção de acetato, propionato, AGV total e aumentar o agregado de carbono total no AGV ruminal in vitro.
[0519] Exemplo 3 - Efeito de 13 muramidases na fer- mentação ruminal e digestibilidade de matéria seca da ração in vitro
[0520] Resumo:
[0521] Um estudo de fermentação foi realizado com o uso de 13 muramidases das famílias de glicosídeo hidrolase (GH) GH24, GH25 e polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de muramidase, o nú- mero de enzimas testadas foi 5, 4 e 4, respectivamente. A fermentação foi realizada in vitro com o uso de fluido ruminal e solução de saliva artificial em fermentadores de 120 ml. A hipótese era que as muramidases podem au- mentar a produção de produtos da fermentação ruminal.
[0522] Em conclusão, os dados mostram que as murami- dases das famílias de glicosídeo hidrolase (GH) GH24, GH25 e polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de muramidase podem afetar a digesti- bilidade de matéria seca ruminal e a fermentação ruminal, aumentando-se a produção de propionato, ácidos graxos voláteis totais e carbono total em áci- dos graxos voláteis.
[0523] Material e métodos:
[0524] O ensaio foi realizado pela Alimetrics (Alimetrics Ltd, Koskelontie 19B, FIN-02920 Espoo, Finlândia) com o uso de garrafas de soro de 120 ml como vasos de fermentação. A preparação e o procedimento de fermentação são apresentados em Kettunen et al., (Kettunen H., J. Vuo- renmaa, D. Gaffney e J. Apajalahti (2016): Yeast hydrolysate product enhan- ces ruminal fermentation in vitro. J. App. Anim. Nutr., Vol. 4; e1; página 1 de 7). Resumindo, o método é o seguinte: Todas as garrafas foram inicialmente preenchidas com 1g de DM de ração composta de silagem de milho, farelo de cevada, farelo de soja, nas quantidades de 0,5; 0,4 e 0,1 g de DM, res- pectivamente. Posteriormente, as garrafas foram lavadas com CO2, passa- das através de um catalisador de cobre quente para eliminação de O2 e se- ladas com rolha de borracha butílica espessa. Solução tampão de saliva ar- tificial anaeróbica, reduzida e ajustada à temperatura (+ 38 °C) (Modificada de Agriculture Handbook No. 379, (USDA, Washington, DC, 1975), volume de 37,65 ml), fluido ruminal recentemente coado (inóculo a 5%; volume de 2 ml), e os compostos de teste (volume de 0,35 ml) foram introduzidos nos recipientes de fermentação sob o fluxo de CO2 sem oxigênio. Após a coleta de fluido ruminal de uma vaca canulada no rúmen. O fluido ruminal foi bom- beado diretamente do rúmen para uma garrafa térmica pré-aquecida e ime- diatamente fechada e transportada para o laboratório da Alimetrics. O fluido ruminal foi usado para inoculação dentro de 2 horas após a colheita. Para garantir que micróbios ruminais associados tanto ao líquido quanto à partí- cula estivessem presentes no inóculo, ambas as frações foram obtidas. As frações líquidas e sólidas foram coadas através de uma malha de metal (ta- manho da malha 3 × 3 mm) sob condições anaeróbicas antes da diluição do tampão.
[0525] Após a inoculação com fluido ruminal, tampão e so- lução de teste, os recipientes foram vedados com septo de borracha butílica. Todos os recipientes de fermentação foram inoculados em ordem aleatória para impedir os possíveis efeitos de bloco. A hora de inoculação para cada recipiente de fermentação foi registrada e levada em consideração em cada amostragem para garantir que a duração da fermentação fosse a mesma para cada amostra. A fermentação continuou durante 12h em agitador gira- tório a + 38 °C. O gás de fermentação produzido foi medido e aliviado pela coleta do gás de fermentação em seringas nos tempos de 3, 6, 9 e 12h. Os resíduos de ração foram medidos após 12h de fermentação.
[0526] O projeto do ensaio foi uma resposta de dosagem, um projeto randomizado completo com 28 tratamentos com o uso de 150 recipientes de fermentação de acordo com a Tabela 3. As 13 soluções de muramidase foram diluídas para a concentração necessária em tampão de enzima (BSA, Tween 20, tampão de acetato, Cálcio, NaOH, ajustado para pH 6). O controle negativo foi suplementado com a mesma solução tampão que foi usada para diluir as enzimas para atingir o mesmo volume de líquido que os recipientes de fermentação suplementados. O ionóforo Monensina (sal de sódio de Monensina, 90 a 95% TLC (Sigma Aldrich; Código do pro- duto: M5273-1G)) foi escolhido como um controle positivo porque é um adi- tivo alimentar para ruminantes que afeta a produção de ácidos graxos volá- teis (AGV).
[0527] Tabela 3: tratamentos, dosagem e projeto do es- tudo Dosagem N/dosa- SEQ ID Classe de enzima 1 2 3 4 5 gem mg/40 ml NC 15 PC 5 Produto não enzimático 0,01 0,1 (Monensina) A 5/25 SEQ ID NO: 28 GH24 0,025 0,05 0,1 0,2 0,4 B 5/25 SEQ ID NO: 21 GH24 0,025 0,05 0,1 0,2 0,4 C 5/25 SEQ ID NO: 12 GH25 0,025 0,05 0,1 0,2 0,4 D 5 SEQ ID NO: 29 GH24 0,2 E 5 SEQ ID NO: 30 GH24 0,2 F 5 SEQ ID NO: 31 GH24 0,2 G 5 SEQ ID NO: 32 GH25 0,2 H 5 SEQ ID NO: 33 GH25 0,2 I 5 SEQ ID NO: 34 GH25 0,2 J 5 SEQ ID NO: 35 polipeptídeos MUR 0,2 inovadores que têm atividade de muramidase K 5 SEQ ID NO: 36 polipeptídeos MUR 0,2 inovadores que têm atividade de muramidase L 5 SEQ ID NO: 36 polipeptídeos MUR 0,2 inovadores que têm atividade de muramidase M 5 SEQ ID NO: 37 polipeptídeos MUR 0,2 inovadores que têm atividade de muramidase
[0528] Coleta de amostras
[0529] As amostras líquidas obtidas às 12h foram analisa- das quanto à concentração de AGV (acetato, propionato, butirato e valerato) por GC-FID com o uso de uma coluna de vidro embalada com 80/120 carbo- pack B-DA/4% Carbowax estacionário e hélio como gás de transporte (Kettu- nen H., J. Vuorenmaa, T. Rinttilä, H. Grönberg, E. Valkonen e J. Apajalahti (2015): Natural resin acid –enriched composition as a modulator of intestinal microbiota and performance enhancer in broiler chicken. J. App. Anim. Nutr., Vol. 3; e2; página 1 de 9).
[0530] A digestibilidade de matéria seca foi quantificada pela determinação da matéria seca na matriz alimentar original e em todos os recipientes de fermentação após 12h de fermentação. Os resíduos de ra- ção dos recipientes de fermentação foram obtidos por filtração em filtros de vidro sinterizado tarados, lavados com água e secos a 105 °C por 12 horas. Finalmente, os filtros de vidro são pesados para a matéria seca residual da alimentação.
[0531] Cálculos e estatística
[0532] A digestibilidade de matéria seca (DMd) foi calcu- lada pela razão entre os resíduos da ração após o término da fermentação e a matéria seca fornecida. A soma de AGV foi calculada como a soma de acetato, propionato, butirato e valerato, e o carbono somado em AGV foi cal- culado atribuindo-se o respectivo número de átomos de carbono em acetato,
propionato, butirato e valerato 2, 3, 4 e 5, respectivamente. Os dados foram calculados como a melhoria relativa em comparação ao NC para a digestibi- lidade da DM e a concentração de acetato, propionato, butirato, AGV soma- dos e carbono total em AGV.
[0533] Os dados foram divididos em dois conjuntos de da- dos. Conjunto de dados um, incluía dados do NC de tratamento e todos os tratamentos de muramidase na dosagem 0,20 mg/40ml, e PC na dosagem 0,01 mg/40mL, para análise com o uso do procedimento misto de SAS (SAS institute) e o tratamento como efeito principal. Conjunto de dados dois, incluía dados do tratamento A, B e C, para todas as 5 dosagens, para análise dos efeitos lineares e quadráticos com o uso do algoritmo de regressão linear em repouso no procedimento misto proc do SAS (SAS institute). Os dados apre- sentados são estimativas de regressão linear e erro padrão, bem como mé- dias dos mínimos quadrados e erro padrão, salvo indicação em contrário.
[0534] Resultados:
[0535] Os dados do estudo atual mostram que as murami- dases podem afetar a produção ruminal de DMd e AGV in vitro, Tabela 4 e Figuras 8 a 10. A diferença em DMd entre os tratamentos NC não suplemen- tado e muramidase foi positiva para 10 das 13 muramidases, quando avalia- das na mesma dosagem (0,2 mg/40 ml). A melhoria máxima em DMd foi 8,6%, Figura 8. A resposta crescente em DMd foi distribuída uniformemente nas 3 famílias de glicosídeo hidrolase (GH) (GH24, GH 25 e polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de muramidase definida no presente do- cumento, com 5/5, 2/4 e 3/4, respectivamente). Os dados também mostram um efeito claro da suplementação de muramidase na produção de propio- nato. A produção de propionato aumentou comparada ao NC para 9 das 13 muramidases quando avaliadas na mesma dosagem (0,2 mg/40 ml). O au- mento na produção de propionato foi de até 14,4%, Figura 9. A resposta crescente na produção de propionato foi dividida nas famílias de glicosídeo hidrolase (GH) GH24, GH25 e polipeptídeos MUR inovadores que têm ativi- dade de muramidase, nessa ordem (5/5, 3/4 e 1/4, respectivamente). Os tra- tamentos com muramidase diminuíram a produção de butirato em relação ao controle para 9 das 13 muramidases quando avaliados na mesma dosagem (0,2 mg/40 ml). A diminuição na produção de butirato foi de até 49,3%, Figura
10. A resposta decrescente na produção de butirato foi dividida nas famílias de glicosídeo hidrolase (GH) GH24, GH25 e polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de muramidase (4/5, 2/4 e 3/4, respectivamente). O efeito da suplementação de 0,2 mg de muramidase/40 ml aumentou a produção geral de AGV e o carbono total em AGV para 8 de 13 tratamentos em com- paração com a tabela de controle 4. O aumento total de AGV e carbono total em AGV foi dividido nas famílias de glicosídeo hidrolase (GH) GH24, GH25 e polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de muramidase, nessa ordem (4/5, 2/4 e 2/4, respectivamente).
[0536] Para as três muramidases A, B e C, foi realizada análise de regressão. A análise de regressão mostrou que a produção de propionato aumentou com o aumento da dosagem de muramidase, e que a produção de butirato diminuiu com o aumento da dosagem de muramidase, também observado nas Figuras 9 e 10, respectivamente.
[0537] Tabela 4: Efeito de 13 muramidases (dosagem 0,2 mg/40 ml) na digestibilidade de matéria seca e produção de AGV (mmol/l) após 12h de fermentação ruminal in vitro DMd Acetato Propionato Butirato: AGV Total Carbono em AGV NC 0,57 48,5 41,2 6,62 97 250 A 0,59 49,8 47,2 3,35 101 256 B 0,58 49,5 45,2 4,27 99 254 C 0,58 48,8 42,4 6,3 98 252 D 0,61 48,1 42,2 6,27 97 250 E 0,58 48,7 42,9 6,52 99 255
F 0,57 49,3 43,2 6,93 100 258 G 0,56 48,6 42,3 5,70 97 249 H 0,59 51,8 45,1 7,19 105 270 I 0,56 47,1 40 6,62 94 243 J 0,6 47,9 41,2 6,38 96 247 K 0,58 49,3 42,2 6,79 99 255 L 0,58 46,1 38,8 6,21 92 236 M 0,56 48,3 40 6,48 95 245 PC 0,55 47,5 46,4 3,86 98 251 SEM 0,016 1,38 1,47 0,21 3 7,8
[0538] Conclusão:
[0539] Em conclusão, os dados mostram que as murami- dases das famílias de glicosídeo hidrolase (GH) GH24, GH25 e polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de muramidase podem afetar a digesti- bilidade de matéria seca ruminal e a fermentação ruminal, aumentando a produção de propionato, AGV total e carbono total em AGV.
[0540] Exemplo 4 - Efeito de 22 muramidases na fer- mentação ruminal e digestibilidade de matéria seca da ração in vitro
[0541] Resumo:
[0542] Um estudo de fermentação foi realizado com o uso de muramidases das famílias de glicosídeo hidrolase (GH) GH24, GH25 e polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de muramidase, o número de enzimas testadas foi 9, 8 e 7, respectivamente. A fermentação foi reali- zada in vitro com o uso de fluido ruminal e solução de saliva artificial em fermentadores de 120 ml. A hipótese era que as muramidases podem au- mentar a produção de produtos da fermentação ruminal.
[0543] Em conclusão, a fermentação ruminal melhorou com a suplementação de muramidases das três famílias de glicosídeo hidro- lase (GH) GH24, GH25 e polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de muramidase. A melhoria foi observada como uma produção aumentada de ácidos graxos voláteis totais, acetato e propionato.
[0544] Material e métodos:
[0545] O ensaio foi realizado pela Alimetrics (Alimetrics Ltd, Koskelontie 19B, FIN-02920 Espoo, Finlândia) com o uso de garrafas de soro de 120 ml como vasos de fermentação. A preparação e o procedimento de fermentação são apresentados em Kettunen et al., (Kettunen H., J. Vuo- renmaa, D. Gaffney e J. Apajalahti (2016): Yeast hydrolysate product enhan- ces ruminal fermentation in vitro. J. App. Anim. Nutr., Vol. 4; e1; página 1 de 7). Resumindo, o método é o seguinte: Todas as garrafas foram inicialmente preenchidas com 1g de DM de ração composta de silagem de milho, farelo de cevada, farelo de soja, nas quantidades de 0,5; 0,4 e 0,1 g de DM, res- pectivamente. Posteriormente, as garrafas foram lavadas com CO2, passa- das através de um catalisador de cobre quente para eliminação de O2 e se- ladas com rolha de borracha butílica espessa. Solução tampão de saliva ar- tificial anaeróbica, reduzida e ajustada à temperatura (+ 38 °C) (Modificada de Agriculture Handbook No. 379, (USDA, Washington, DC, 1975), volume de 37,65 ml), fluido ruminal recentemente coado (inóculo a 5%; volume de 2 ml), e os compostos de teste (volume de 0,35 ml) foram introduzidos nos recipientes de fermentação sob o fluxo de CO2 sem oxigênio. Em seguida, fluido ruminal foi coletado de uma vaca canulada no rúmen. O fluido ruminal foi bombeado diretamente do rúmen para uma garrafa térmica pré-aquecida e imediatamente fechada e transportada para o laboratório da Alimetrics. O fluido ruminal foi usado para inoculação dentro de 2 horas após a colheita. Para garantir que micróbios ruminais associados tanto ao líquido quanto à partícula estivessem presentes no inóculo, ambas as frações foram obtidas.
As frações líquidas e sólidas foram coadas através de uma malha de metal (tamanho da malha 3 × 3 mm) sob condições anaeróbicas antes da diluição do tampão.
[0546] Após a inoculação com fluido ruminal, tampão e so- lução de teste, os recipientes foram vedados com septo de borracha butílica. Todos os recipientes de fermentação foram inoculados em ordem aleatória para impedir os possíveis efeitos de bloco. A hora de inoculação para cada recipiente de fermentação foi registrada e levada em consideração em cada amostragem para garantir que a duração da fermentação fosse a mesma para cada amostra. A fermentação continuou durante 12h em agitador gira- tório a + 38 °C. O gás de fermentação produzido foi medido e aliviado pela coleta do gás de fermentação em seringas nos tempos de 3, 6, 9 e 12h. Os resíduos de ração foram medidos após 12h de fermentação.
[0547] O projeto do ensaio foi uma resposta de dosagem, um projeto randomizado completo com 27 tratamentos com o uso de 145 recipientes de fermentação de acordo com a Tabela 5. As 24 soluções de muramidase foram diluídas para a concentração necessária em tampão de enzima (BSA, Tween 20, tampão de acetato, Cálcio, NaOH, ajustado para pH 6). O controle negativo foi suplementado com a mesma solução tampão que foi usada para diluir as enzimas para atingir o mesmo volume de líquido que os recipientes de fermentação suplementados. O ionóforo Monensina (sal de sódio de Monensina, 90 a 95% TLC (Sigma Aldrich; Código do pro- duto: M5273-1G)) foi escolhido como um controle positivo porque é um adi- tivo alimentar para ruminantes que afeta a produção de ácidos graxos volá- teis (AGV).
[0548] Tabela 5: Tratamentos, dosagem e projeto do es- tudo Dosagem N/dosagemSEQ ID Classe de enzima 1 2 mg/40 ml NC 15
PC 5 Produto não enzimático 0,01 0,10 (Monensina) A 5 SEQ ID NO: 38 GH24 0,20 B 5 SEQ ID NO: 39 GH24 0,20 C 5 SEQ ID NO: 40 GH24 0,20 D 5 SEQ ID NO: 41 GH24 0,20 E 5 SEQ ID NO: 42 GH24 0,20 F 5 SEQ ID NO: 43 GH24 0,20 G 5 SEQ ID NO: 44 GH24 0,20 H 5 SEQ ID NO: 45 GH24 0,20 I 5 SEQ ID NO: 46 GH24 0,20 J 5 SEQ ID NO: 47 GH25 0,20 K 5 SEQ ID NO: 48 GH25 0,20 L 5 SEQ ID NO: 49 GH25 0,20 M 5 SEQ ID NO: 50 GH25 0,20 N 5 SEQ ID NO: 51 GH25 0,20 O 5 SEQ ID NO: 52 GH25 0,20 S 5 SEQ ID NO: 55 polipeptídeos MUR 0,20 inovadores que têm atividade de muramidase T 5 SEQ ID NO: 56 polipeptídeos MUR 0,20 inovadores que têm atividade de muramidase U 5 SEQ ID NO: 57 polipeptídeos MUR 0,20 inovadores que têm atividade de muramidase V 5 SEQ ID NO: 58 polipeptídeos MUR 0,20 inovadores que têm atividade de muramidase W 5 SEQ ID NO: 59 polipeptídeos MUR 0,20 inovadores que têm atividade de muramidase Y 5 SEQ ID NO: 53 polipeptídeos MUR 0,20 inovadores que têm atividade de muramidase Z 5 SEQ ID NO: 54 polipeptídeos MUR 0,20 inovadores que têm atividade de muramidase
[0549] Coleta de amostras
[0550] As amostras líquidas obtidas às 12h foram analisa- das quanto à concentração de AGV (acetato, propionato, butirato e valerato) por GC-FID com o uso de uma coluna de vidro embalada com 80/120 carbo- pack B-DA/4% Carbowax estacionário e hélio como gás de transporte (Kettu- nen H., J. Vuorenmaa, T. Rinttilä, H. Grönberg, E. Valkonen e J. Apajalahti (2015): Natural resin acid –enriched composition as a modulator of intestinal microbiota and performance enhancer in broiler chicken. J. App. Anim. Nutr., Vol. 3; e2; página 1 de 9).
[0551] A digestibilidade de matéria seca foi quantificada pela determinação da matéria seca na matriz alimentar original e em todos os recipientes de fermentação após 12h de fermentação. Os resíduos de ra- ção dos recipientes de fermentação foram obtidos por filtração em filtros de vidro sinterizado tarados, lavados com água e secos a 105 °C por 12 horas. Finalmente, os filtros de vidro são pesados para a matéria seca residual da alimentação.
[0552] Cálculos e estatística
[0553] A digestibilidade de matéria seca (DMd) foi calcu- lada pela razão entre os resíduos da ração após o término da fermentação e a matéria seca fornecida. A soma de AGV foi calculada como a soma de acetato, propionato, butirato e valerato, e o carbono somado em AGV foi cal- culado atribuindo-se o respectivo número de átomos de carbono em acetato, propionato, butirato, 2, 3, 4 e 5, respectivamente. Os dados foram calculados como a melhoria relativa em comparação com NC para DMd e a concentra- ção de acetato, propionato, AGV somados e carbono total em AGV.
[0554] Um tratamento foi retirado do conjunto de dados, porque a quantidade de enzima usada não era conhecida. Assim, os dados desse tratamento não podem ser comparados ao restante dos tratamentos no estudo atual.
[0555] Os dados foram analisados com o uso do procedi- mento misto de SAS (SAS institute) incluindo o efeito principal do tratamento.
[0556] Os dados apresentados são médias dos mínimos quadrados e erro padrão, a menos que seja indicado de outra forma.
[0557] Resultados:
[0558] Os dados mostram que a fermentação ruminal me- lhorou com a suplementação com muramidases in vitro. Isso foi demonstrado a partir do aumento no AGV ruminal total e carbono total em AGV para 23 dos 24 tratamentos de muramidases, Tabela 6. A resposta positiva foi divi- dida uniformemente nas três famílias de enzima glicosídeo hidrolase (GH) (GH24, GH25 e polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de mura- midase). O AGV total aumentou até 12,2 ± 1,99% e o carbono total no AGV aumentou até 12,5 ± 2,02% Figuras 13 e 14, respectivamente. O aumento no AGV total e no carbono total no AGV veio de um aumento no acetato e propionato ruminal, Tabela 6. A fermentação do acetato aumentou até 10,7 ± 1,99% e a fermentação do propionato aumentou até 14,2 ± 2,21%, Figuras 13 e 14, respectivamente.
[0559] Tabela 6: Efeito de 24 muramidases na digestibili- dade de matéria seca (DMd) e na produção de ácidos graxos voláteis (AGV) (mmol/L) após 12h de fermentação ruminal in vitro Item DMd Acetato Propionato Butirato: AGV Total Carbono em AGV NC 0,58 48,4 39,5 7,1 96 246 PC 0,51 44,2 42,8 3,7 91 234 A 0,56 52,9 45,1 6,7 105 271 B 0,60 49,1 40,4 7,2 97 251 C 0,58 52,0 44,3 7,2 104 269 D 0,57 50,1 43,0 5,9 99 255
E 0,57 49,9 42,3 6,2 99 254 F 0,58 51,6 42,5 7,2 102 263 G 0,56 49,7 41,1 7,3 99 255 H 0,59 52,6 44,7 5,3 103 264 I 0,56 49,3 42,9 5,4 98 252 J 0,56 47,6 39,1 6,9 94 243 K 0,57 49,5 40,9 7,2 98 254 L 0,56 50,7 42,0 7,3 101 259 M 0,60 50,7 42,0 7,3 101 259 N 0,59 49,3 40,8 7,2 98 253 O 0,59 51,1 42,0 7,3 101 260 S 0,58 49,4 41,2 7,1 98 254 T 0,57 53,6 45,1 7,8 107 277 U 0,60 49,1 40,5 7,1 97 251 V 0,59 49,2 40,6 7,1 97 252 W 0,59 48,9 40,9 6,7 97 250 Y 0,57 50,8 43,1 6,1 100 258 Z 0,56 48,7 39,6 6,9 96 247 SEM 0,02 0,96 0,87 0,29 1,90 4,96
[0560] Conclusão:
[0561] Em conclusão, a fermentação ruminal melhorou com a suplementação de muramidases das três famílias de glicosídeo hidro- lase (GH) GH24, GH25 e polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de muramidase. A melhoria foi observada como um aumento da produção de ácidos graxos voláteis totais, acetato e propionato.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição de ração para ruminantes, tal como uma ra- ção para ruminantes, suplemento alimentar para ruminantes ou aditivo ali- mentar para ruminantes que compreende uma ou mais muramidases, carac- terizado por a muramidase estar em uma quantidade suficiente para admi- nistração em um nível de 1 a 200 mg de proteína enzimática por kg de ração para ruminantes.
2. Composição de ração para ruminantes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o ruminante ser selecionado do grupo que consiste em: gado, gado leiteiro e gado de corte.
3. Composição de ração para ruminantes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada por a muramidase com- preender um ou mais domínios de uma família de glicosídeo hidrolase (GH) selecionada da lista que consiste em GH24, GH25 e polipeptídeos MUR ino- vadores que têm atividade de muramidase.
4. Método para melhorar a produção de Leite Corrigido para Energia (ECM) de um ruminante caracterizado por compreender administra- ção ao ruminante de uma composição de ração para ruminantes, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Método para aumentar a digestibilidade de matéria seca (DMd) de uma ração para ruminantes, suplemento alimentar para ruminantes ou aditivo alimentar para ruminantes, caracterizado por compreender as eta- pas de: a) fornecer pelo menos uma muramidase; b) fornecer uma ração para ruminantes, suplemento alimentar para ruminantes ou aditivo alimentar para ruminantes adequado para um animal ruminante; c) aplicar a muramidase à ração para ruminantes, suplemento alimentar para ruminantes ou aditivo ali- mentar para ruminantes para formar uma composição de ração para rumi- nantes; e d) alimentar o animal ruminante com a composição alimentar para ruminantes, de modo que que seja efetuado um aumento na digestibilidade de matéria seca.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a produção de ácidos graxos voláteis (AGV) no rúmen ser aumentada em comparação com a produção de AGV no rúmen de um ruminante não alimentado com uma muramidase.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 6, caracterizado por a produção de propionato no rúmen ser aumentada em comparação com a produção de propionato no rúmen de um ruminante não alimentado com uma muramidase.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado por a produção de acetato no rúmen ser aumentada em comparação com a produção de acetato no rúmen de um ruminante não ali- mentado com uma muramidase.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado por a muramidase ser dosada em um nível de 1 a 200 mg de proteína enzimática por kg de matéria seca de ração para ruminantes.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9, caracterizado por a produção de Leite Corrigido para Energia (ECM) de ruminantes após a administração ser melhorada em pelo menos 1,0%, preferencialmente pelo menos 1,5%, mais preferencialmente pelo menos 2,0% em comparação com o controle.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizado por a muramidase ser de origem microbiana.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 11, caracterizado por a muramidase compreender um ou mais domínios de uma família de glicosídeo hidrolase (GH) selecionada da lista que consiste em GH24, GH25 e polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de mu- ramidase.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 12, caracterizado por o controle ser uma composição de ração para ru- minantes que não compreende muramidase.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 12, caracterizado por o controle ser uma composição de ração para ru- minantes que não compreende muramidase GH24, muramidase GH25 ou polipeptídeos MUR inovadores que têm atividade de muramidase.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 14, caracterizado por o controle ser monensina.
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