BR112020021365A2

BR112020021365A2 - Ração animal, método para melhoria do fator de eficiência de produção europeu, ganho de peso corporal e/ou razão de conversão de ração de um animal monogástrico, uso de pelo menos um probiótico em combinação com um polipeptídeo tendo atividade de muramidase em uma composição de ração, e, composição de ração ou uma composição de pré-mistura, ou um aditivo de ração para animais.

Info

Publication number: BR112020021365A2
Application number: BR112020021365-9A
Authority: BR
Inventors: Rual Lopez-Ulibarri; Estefania Perez Calvo; Wolfgang SCHLIFFKA
Original assignee: Novozymes A/S; Dsm Ip Assets B.V.
Priority date: 2018-04-25
Filing date: 2019-04-25
Publication date: 2021-01-19
Also published as: MX2020011133A; US20210112827A1; CN112004417A; EP3784048A1; WO2019207053A1

Abstract

a presente invenção se relaciona com composições de ração animal compreendendo pelo menos um probiótico e polipeptídeos tendo atividade de muramidase.

Description

1 / 95 RAÇÃO ANIMAL, MÉTODO PARA MELHORIA DO FATOR DE EFICIÊNCIA DE PRODUÇÃO EUROPEU, GANHO DE PESO CORPORAL E/OU RAZÃO DE CONVERSÃO DE RAÇÃO DE UM ANIMAL MONOGÁSTRICO, USO DE PELO MENOS UM PROBIÓTICO

EM COMBINAÇÃO COM UM POLIPEPTÍDEO TENDO ATIVIDADE DE MURAMIDASE EM UMA COMPOSIÇÃO DE RAÇÃO, E, COMPOSIÇÃO DE RAÇÃO OU UMA COMPOSIÇÃO DE PRÉ- MISTURA, OU UM ADITIVO DE RAÇÃO PARA ANIMAIS REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em formato legível por computador, que é incorporada aqui por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Área da Invenção

[002] A presente invenção se relaciona com composições de ração animal compreendendo polipeptídeos tendo atividade de muramidase e probióticos e seus usos. Descrição da Técnica Relacionada

[003] A muramidase é uma O-glicosil hidrolase produzida como um mecanismo de defesa contra bactérias por muitos organismos. A enzima causa a hidrólise de paredes celulares bacterianas por clivagem das ligações glicosídicas de peptidoglicana; uma molécula estrutural importante em bactérias. Após terem as suas paredes celulares enfraquecidas pela ação da muramidase, as células bacterianas lisam em resultado de pressão osmótica desequilibrada.

[004] A muramidase ocorre naturalmente em muitos organismos tais como vírus, plantas, insetos, pássaros, répteis e mamíferos. Nos mamíferos, a Muramidase foi isolada a partir de secreções nasais, saliva, lágrimas, conteúdo intestinal, urina e leite. A enzima cliva a ligação glicosídica entre o carbono número 1 do ácido N-acetilmurâmico e o carbono número 4 da N-

2 / 95 acetil-D-glucosamina. In vivo, estes dois carboidratos são polimerizados para formar o polissacarídeo da parede celular de muitos microrganismos.

[005] A muramidase foi classificada em cinco diferentes famílias de glicosídeo hidrolases (GH) (CAZy, www.cazy.org): lisozima da clara de ovo da galinha (GH22), lisozima da clara de ovo do ganso (GH23), muramidase do bacteriófago T4 (GH24), proteína flagelar de Sphingomonas (GH73) e muramidases de Chalaropsis (GH25). A lisozima extraída a partir da clara do ovo da galinha (uma muramidase GH22) é o principal produto disponível no mercado comercial e, tradicionalmente, acaba de ser referida como lisozima, embora hoje em dia existam muitas outras lisozimas conhecidas.

[006] Os probióticos são microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, estão associados a um benefício para a saúde no hospedeiro. Os probióticos podem defender contra patógenos no intestino para proporcionar benefícios à saúde. Os probióticos podem competir contra os patógenos pelos mesmos nutrientes essenciais, deixando menos disponíveis para o patógeno utilizar. Alternativamente podem se ligar aos locais de adesão, evitando a anexação dos patógenos por redução da área superficial disponível para a colonização dos patógenos. Um mecanismo postulado inclui sinalização de células imunitárias por probióticos pode resultar na secreção de citocinas, visando o patógeno para destruição. Finalmente, alguns propuseram que os probióticos podem atacar organismos patogênicos por liberação de bacteriocinas, os matando diretamente.

[007] Foi mostrado em WO 2017/001703 que as muramidases microbianas melhoram o desempenho animal. No entanto, a combinação de diferentes tipos de enzimas não resulta frequentemente em nenhuns resultados benéficos sobre a enzima única, ver TT dos Santos et al., “Protease, protease and superdosing phytase interactions in broiler performance, carcass yield and digesta transit time”, Animal Nutrition (2017), 3, 121-126 e Adeola e Cowieson, ”Opportunities and challenges in using exogenous enzymes to

3 / 95 improve nonruminant animal production”, J Anim Sci, (2011), 89, 189-3218.

[008] A melhoria do desempenho de crescimento dos animais de fazenda é necessário em um mundo com uma população em crescimento comendo mais proteína animal, e é o objetivo da presente invenção conceber soluções que ajudem a enfrentar este desafio.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] Os inventores do presente pedido descobriram surpreendentemente que a combinação de polipeptídeos tendo atividade de muramidase e pelo menos um probiótico tem um grande potencial para uso em nutrição animal, por exemplo, para melhoria da razão de conversão de ração (FCR) e/ou ganho de peso e/ou para a modulação da flora intestinal e/ou para melhoria da biodisponibilidade de probióticos. Adicionalmente, os inventores descobriram surpreendentemente que as novas composições de ração têm também atividade contra microrganismos Gram+ resultando em uma mortalidade reduzida.

[0010] A presente invenção se relaciona com uma composição, aditivo de ração animal ou ração animal compreendendo um ou mais polipeptídeos tendo atividade de muramidase e pelo menos um probiótico. A presente invenção é, além do mais, dirigida a ração animal compreendendo um aditivo de ração animal, uma ou mais fontes de proteína e uma ou mais fontes de energia caracterizada por a ração animal compreender adicionalmente um ou mais probióticos e um ou mais polipeptídeos fúngicos tendo atividade de muramidase.

[0011] A presente invenção se relaciona adicionalmente com um método de melhoria de um ou mais parâmetros de desempenho em um animal compreendendo administração a um ou mais animais de uma ração animal ou aditivo de ração animal compreendendo pelo menos um probiótico e um ou mais polipeptídeos tendo atividade de muramidase, em que o um ou mais parâmetros de desempenho são selecionados do grupo consistindo no Fator de

4 / 95 Eficiência de Produção Europeu (EPEF) e Razão de Conversão de Ração (FCR).

[0012] A presente invenção se relaciona adicionalmente com métodos de melhoria do Fator de Eficiência de Produção Europeu (EPEF) e/ou Razão de Conversão de Ração (FCR) de um animal compreendendo administração ao animal da ração animal ou do aditivo de ração animal da invenção; uso da ração animal ou aditivo de ração animal da invenção para melhoria do Fator de Eficiência de Produção Europeu (EPEF) e/ou Razão de Conversão de Ração (FCR); uma ração animal ou aditivo de ração animal da invenção para uso no tratamento de uma infecção por Clostridium perfringens; e um método de aumento da população de bactérias do gênero Faecalibacterium na microbiota do trato GI de um animal, compreendendo administração ao animal de uma ração animal ou aditivo de ração animal da invenção.

[0013] Um aspecto adicional da invenção é dirigido a um método de melhoria do fator de eficiência de produção europeu (EPEF), ganho de peso corporal (BWG) e/ou razão de conversão de ração (FCR) de um animal monogástrico compreendendo: (a) preparação da ração animal compreendendo um aditivo de ração animal, uma ou mais fontes de proteína e uma ou mais fontes de energia caracterizada por a ração animal compreender adicionalmente um ou mais probióticos e um ou mais polipeptídeos fúngicos tendo atividade de muramidase; e b) fornecimento da ração animal ao animal monogástrico.

[0014] A invenção é dirigida a um uso de pelo menos um probiótico em combinação com um polipeptídeo tendo atividade de muramidase em uma composição de ração para melhoria da razão de conversão de ração e/ou ganho de peso diário e/ou para a modulação da flora intestinal e/ou para melhoria da biodisponibilidade do probiótico, em que o polipeptídeo tendo atividade de muramidase é uma muramidase GH24 ou muramidase GH25

5 / 95 fúngica e em que o probiótico é selecionado do grupo consistindo em um Lactobacillus, uma Bifidobacterium, uma Saccharomyces, um Enterococcus, um Streptococcus, um Pediococcus, um Leuconostoc, um Lactococcus, um Oenococcus, um Bacillus, Carnobacterium, Propionibacterium, Clostridium, Megasphaera e uma Escherichia ou suas combinações.

[0015] Um aspecto adicional da invenção é dirigido a uma composição de ração ou uma composição de pré-mistura, ou um aditivo de ração para animais, compreendendo pelo menos um polipeptídeo tendo atividade de muramidase e pelo menos um probiótico, em que o polipeptídeo tendo atividade de muramidase é uma muramidase GH24 ou muramidase GH25 fúngica e em que o probiótico é selecionado do grupo consistindo em um Lactobacillus, uma Bifidobacterium, uma Saccharomyces, um Enterococcus, um Streptococcus, um Pediococcus, um Leuconostoc, um Lactococcus, um Oenococcus, um Bacillus, Carnobacterium, Propionibacterium, Clostridium, Megasphaera e uma Escherichia ou suas combinações.

VISÃO GERAL DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0016] SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Acremonium alcalophilum como descrito em WO2013/076253 (SEQ ID NO: 4)

[0017] SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Acremonium alcalophilum como descrito em WO2013/076253 (SEQ ID NO: 8).

[0018] SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Aspergillus fumigatus como descrito em WO2011/104339 (SEQ ID NO: 3).

[0019] SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Trichoderma reesei como descrito em WO2009/102755 (SEQ ID NO: 4).

6 / 95

[0020] SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Trametes cinnabarina como descrito em WO2005/080559 (SEQ ID NO: 2).

[0021] SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Sporormia fimetaria como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 3).

[0022] SEQ ID NO: 7 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Poronia punctata como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 6).

[0023] SEQ ID NO: 8 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Poronia punctata como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 9).

[0024] SEQ ID NO: 9 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Lecanicillium sp. WMM742 como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 12).

[0025] SEQ ID NO: 10 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Lecanicillium sp. WMM742 como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 15).

[0026] SEQ ID NO: 11 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Onygena equina como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 18).

[0027] SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Purpureocillium lilacinum como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 21).

[0028] SEQ ID NO: 13 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Trichobolus zukalii como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 24).

[0029] SEQ ID NO: 14 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Penicillium citrinum como descrito em

7 / 95 PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 27).

[0030] SEQ ID NO: 15 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Cladorrhinum bulbillosum como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 30).

[0031] SEQ ID NO: 16 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Umbelopsis westeae como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 33).

[0032] SEQ ID NO: 17 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Zygomycetes sp. XZ2655 como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 36).

[0033] SEQ ID NO: 18 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Chaetomium cupreum como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 39).

[0034] SEQ ID NO: 19 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Cordyceps cardinalis como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 42).

[0035] SEQ ID NO: 20 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Penicillium sp. 'qii’ como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 45).

[0036] SEQ ID NO: 21 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Aspergillus sp. nov XZ2609 como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 48).

[0037] SEQ ID NO: 22 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Paecilomyces sp. XZ2658 como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 51).

[0038] SEQ ID NO: 23 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Paecilomyces sp. XZ2658 como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 54).

[0039] SEQ ID NO: 24 é a sequência de aminoácidos madura de uma

8 / 95 muramidase GH25 de Pycnidiophora cf dispera como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 60).

[0040] SEQ ID NO: 25 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Thermomucor indicae-seudaticae como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 63).

[0041] SEQ ID NO: 26 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Isaria farinosa como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 66).

[0042] SEQ ID NO: 27 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Lecanicillium sp. WMM742 como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 69).

[0043] SEQ ID NO: 28 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Zopfiella sp. t180-6 como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 72).

[0044] SEQ ID NO: 29 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Malbranchea flava como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 75).

[0045] SEQ ID NO: 30 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Hypholoma polytrichi como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 80).

[0046] SEQ ID NO: 31 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Aspergillus deflectus como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 83).

[0047] SEQ ID NO: 32 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Ascobolus stictoideus como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 86).

[0048] SEQ ID NO: 33 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Coniochaeta sp. como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 89).

9 / 95

[0049] SEQ ID NO: 34 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Daldinia fissa como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 92).

[0050] SEQ ID NO: 35 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Rosellinia sp. como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 95).

[0051] SEQ ID NO: 36 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Ascobolus sp. ZY179 como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 98).

[0052] SEQ ID NO: 37 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Curreya sp. XZ2623 como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 101).

[0053] SEQ ID NO: 38 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Coniothyrium sp. como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 104).

[0054] SEQ ID NO: 39 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Hypoxylon sp. como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 107).

[0055] SEQ ID NO: 40 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Xylariaceae sp. 1653h como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 110).

[0056] SEQ ID NO: 41 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Hypoxylon sp. como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 113).

[0057] SEQ ID NO: 42 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Yunnania penicillata como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 116).

[0058] SEQ ID NO: 43 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Engyodontium album como descrito em

10 / 95 PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 119).

[0059] SEQ ID NO: 44 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Metapochonia bulbillosa como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 122).

[0060] SEQ ID NO: 45 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Hamigera paravellanea como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 125).

[0061] SEQ ID NO: 46 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Metarhizium iadini como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 128).

[0062] SEQ ID NO: 47 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Thermoascus aurantiacus como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 131).

[0063] SEQ ID NO: 48 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Clonostachys rossmaniae como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 134).

[0064] SEQ ID NO: 49 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Simplicillium obclavatum como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 137).

[0065] SEQ ID NO: 50 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Aspergillus inflatus como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 140).

[0066] SEQ ID NO: 51 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Paracremonium inflatum como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 143).

[0067] SEQ ID NO: 52 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Westerdykella sp. como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 146).

[0068] SEQ ID NO: 53 é a sequência de aminoácidos madura de uma

11 / 95 muramidase GH25 de Stropharia semiglobata como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 155).

[0069] SEQ ID NO: 54 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Gelasinospora cratophora como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 158).

[0070] SEQ ID NO: 55 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Flammulina velutipes como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 221).

[0071] SEQ ID NO: 56 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Deconica coprophila como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 224).

[0072] SEQ ID NO: 57 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Rhizomucor pusillus como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 227).

[0073] SEQ ID NO: 58 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Stropharia semiglobata como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 230).

[0074] SEQ ID NO: 59 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Stropharia semiglobata como descrito em PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 233).

[0075] SEQ ID NO: 60 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Myceliophthora fergusii como descrito em PCT/CN2017/075960 (SEQ ID NO: 3).

[0076] SEQ ID NO: 61 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Mortierella alpina como descrito em PCT/CN2017/075960 (SEQ ID NO: 15).

[0077] SEQ ID NO: 62 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Penicillium atrovenetum como descrito em PCT/CN2017/075960 (SEQ ID NO: 27).

12 / 95

[0078] SEQ ID NO: 63 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Trichophaea saccata como descrito em WO2017/000922 (SEQ ID NO: 257).

[0079] SEQ ID NO: 64 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Chaetomium thermophilum como descrito em WO2017/000922 (SEQ ID NO: 264).

[0080] SEQ ID NO: 65 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Trichoderma harzianum como descrito em WO2017/000922 (SEQ ID NO: 267).

[0081] SEQ ID NO: 66 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Trichophaea minuta como descrito em WO2017/000922 (SEQ ID NO: 291).

[0082] SEQ ID NO: 67 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Chaetomium sp. ZY287 como descrito em WO2017/000922 (SEQ ID NO: 294).

[0083] SEQ ID NO: 68 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Mortierella sp. ZY002 como descrito em WO2017/000922 (SEQ ID NO: 297).

[0084] SEQ ID NO: 69 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Metarhizium sp. XZ2431 como descrito em WO2017/000922 (SEQ ID NO: 300).

[0085] SEQ ID NO: 70 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Geomyces auratus como descrito em WO2017/000922 (SEQ ID NO: 303).

[0086] SEQ ID NO: 71 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Ilyonectria rufa como descrito em WO2017/000922 (SEQ ID NO: 306).

DEFINIÇÕES

[0087] Animal: O termo “animal” se refere a qualquer animal exceto

13 / 95 humanos. Exemplos de animais são animais monogástricos, incluindo mas não se limitando a porcos ou suínos (incluindo, mas não se limitando a, leitões, porcos em crescimento e porcas); aves domésticas tais como perus, patos, codornas, galinha-de-angola, gansos, pombos (incluindo filhotes de pombo) e frangos (incluindo mas não se limitando a frangos para corte (referidos aqui como frangos de corte), pintos, galinhas poedeiras (referidas aqui como poedeiras)); cavalos (incluindo mas não se limitando a sangue quente, sangue frio e sangue morno), crustáceos (incluindo mas não se limitando a camarões e pitus) e peixes (incluindo mas não se limitando a charuteiro, pirarucu, barbo, robalo, anchova, bocachico, goraz, peixe-gato, cachama, carpa, peixe-lobo, catla, chanos, savelino, ciclídeo, fogueteiro- galego, bacalhau, perca, dourada, calafate, enguia, caboz, peixe-dourado, gurami, garoupa, guapote, alabote, jamelão, labeo, lai, verdemã, cavalinha, peixe-leite, sargo, peixe-lama, tainha, pacu, pearlspot, peixe-rei, robalo, lúcio, pâmpano, ruivaca, salmão, sampa, picão, robalo-legítimo, panga, shiner, amoré, cabeça-de-cobra, lutjanídeo, falso robalo, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, peixe-doce, tenca, terror, tilápia, truta, atum, areeiro, corégono- branco, picão-verde e peixe-magro).

[0088] Ração animal: O termo “ração animal” se refere a qualquer composto, preparação ou mistura adequado para a, ou destinado à, ingestão por um animal. A ração animal para um animal monogástrico compreende tipicamente concentrados bem como vitaminas, minerais, enzimas, alimento direto microbiano, aminoácidos e/ou outros ingredientes de ração (tal como em uma pré-mistura) ao passo que a ração animal para ruminantes compreende geralmente forragem (incluindo alimento grosseiro e silagem) e pode compreender adicionalmente concentrados bem como vitaminas, minerais, enzimas, alimento direto microbiano, aminoácido e/ou outros ingredientes de ração (tal como em uma pré-mistura).

[0089] Ganho de Peso Corporal: O termo “ganho de peso” significa

14 / 95 um aumento no peso vivo de um animal durante um dado período de tempo, por exemplo, o aumento no peso do dia 1 ao dia 21.

[0090] Concentrados: O termo “concentrados” significa ração com elevadas concentrações de proteína e energia, tais como farelo de peixe, melaços, oligossacarídeos, sorgo, sementes e grãos (seja inteiros ou preparados por trituração, moagem, etc. a partir de, por exemplo, milho, aveia, centeio, cevada, trigo), bagaço oleaginoso (por exemplo, a partir de semente de algodão, cártamo, girassol, soja (tal como farelo de soja), colza/canola, amendoim ou amêndoa), bagaço de palmiste, material derivado de levedura e grãos de destilação (tais como grãos de destilação úmidos (WDS) e grãos de destilação secos com solúveis (DDGS)).

[0091] Fator de Eficácia de Produção Europeu (EPEF): O Fator de Eficácia de Produção Europeu é uma maneira de comparar o desempenho de animais. Esta figura única facilita a comparação de desempenho dentro de e entre fazendas e pode ser usada para se avaliarem variáveis de gestão ambiental, climática e animal. O EPEF é calculado como [(habitabilidade (%) x Peso vivo (kg)) / (Idade na redução (dias) x FCR)] x 100, em que a habitabilidade é a percentagem de animais vivos no abate, o Peso vivo é o peso médio dos animais no abate, a idade de redução é a idade dos animais no abate e FCR é razão de conversão de ração no abate.

[0092] Razão de Conversão de Ração (FCR): FCR é uma medida da eficiência de um animal na conversão de massa de ração em aumentos do resultado desejado. Em animais criados para carne – tais como suínos, aves domésticas e peixes – o resultado é a massa ganha pelo animal. Especificamente, a FCR é calculada como consumo de ração dividido pelo ganho de peso, tudo ao longo de um período especificado. A melhoria em FCR significa redução do valor de FCR. Uma melhoria de FCR de 2% significa que a FCR foi reduzida em 2%.

[0093] Eficiência de ração: O termo “eficiência de ração” significa a

15 / 95 quantidade de ganho de peso por unidade de ração quando o animal é alimentado ad libitum ou uma quantidade especificada de alimento durante um período de tempo. Por “eficiência de ração aumentada” se entende que o uso de uma composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção na ração resulta em um ganho de peso aumentado por unidade de consumo de ração em comparação com um animal alimentado sem a referida composição de aditivo de ração estando presente.

[0094] Forragem: O termo “forragem” como definido aqui inclui também alimento grosseiro. A forragem é material vegetal fresco tal como feno e silagem de plantas de forragem, grama e outras plantas de forragem, alga marinha, grãos germinados e leguminosas ou qualquer sua combinação. Exemplos de plantas forrageiras são Alfalfa (luzerna), cornichão, brássica (por exemplo, couve, colza (canola), couve-nabo (nabo-da-suécia), nabo), trevo (por exemplo, trevo híbrido, trevo vermelho, trevo subterrâneo, trevo branco), grama (por exemplo, grama das Bermudas, bromo, grama de aveia falsa, galho, grama da charneca, gramas do prado, grama do pomar, azevém, grama Timothy), milho, milheto, cevada, aveia, centeio, sorgo, soja e trigo e legumes e hortaliças tais como beterrabas. A forragem inclui adicionalmente resíduos de cultura da produção de grãos (tais como restolho de milho; palha de trigo, cevada, aveia, centeio e outros grãos); resíduos de legumes e hortaliças tais como folhas de beterraba; resíduos da produção de oleaginosas como caules e folhas de soja, colza e outras leguminosas; e frações da refinação de grãos para consumo animal ou humano ou da produção de combustível ou outras indústrias.

[0095] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo ou um domínio catalítico tendo um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos ausentes no terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro ou domínio; em que o fragmento tem atividade de muramidase.

[0096] Em um aspecto, um fragmento de uma muramidase GH24 (tal

16 / 95 como uma da SEQ ID NO: 63 a 71) compreende pelo menos 230 aminoácidos, tal como pelo menos 235 aminoácidos, pelo menos 240 aminoácidos ou pelo menos 245 aminoácidos e tem atividade de muramidase. Em outro aspecto, um fragmento de uma muramidase GH24 (tal como uma da SEQ ID NO: 63 a 71) compreende pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro, tal como pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% do comprimento do polipeptídeo maduro e tem atividade de muramidase.

[0097] Em um aspecto, um fragmento de uma muramidase GH25 (tal como uma da SEQ ID NO: 1 a 72) compreende pelo menos 180 aminoácidos, tal como pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 aminoácidos, pelo menos 195 aminoácidos, pelo menos 200 aminoácidos, pelo menos 205 aminoácidos ou pelo menos 210 aminoácidos e tem atividade de muramidase. Em outro aspecto, um fragmento de uma muramidase GH25 (tal como uma da SEQ ID NO: 1 a 72) compreende pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro, tal como pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% do comprimento do polipeptídeo maduro e tem atividade de muramidase.

[0098] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente aos quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (por exemplo, múltiplas cópias de um gene

17 / 95 codificando a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

[0099] Atividade de muramidase: O termo “atividade de muramidase” significa a hidrólise enzimática das ligações 1,4-beta entre o ácido N-acetilmurâmico e resíduos de N-acetil-D-glucosamina em uma peptidoglicana ou entre resíduos de N-acetil-D-glucosamina em quitodextrinas, resultando em bacteriólise devido a pressão osmótica. A muramidase pertence à classe de enzimas EC 3.2.1.17. A atividade da muramidase é tipicamente medida por determinação turbidimétrica. O método é baseado nas alterações em turbidez de uma suspensão de Micrococcus luteus ATCC 4698 induzidas pela ação lítica da muramidase. Em condições experimentais apropriadas, estas mudanças são proporcionais à quantidade de muramidase no meio (c.f. INS 1105 do Combined Compendium of Food Additive Specifications of the Food and Agriculture Organisation of the UN (www.fao.org)). Para o propósito da presente invenção, a atividade de muramidase é determinada de acordo com o ensaio de turbidez descrito no exemplo 3 (“Determinação da Atividade de Muramidase”) e o polipeptídeo tem atividade de muramidase se mostrar atividade contra uma ou mais bactérias tais como Micrococcus luteus ATCC 4698 e/ou Exiguobacterium undea (DSM14481). Em um aspecto, a muramidase GH25 da presente invenção tem pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de muramidase da SEQ ID NO: 1. Em um aspecto, a muramidase GH24 da presente invenção tem pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de muramidase da SEQ ID NO: 63.

[00100] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro”

18 / 95 significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc.

[00101] Obtido ou obtenível de: O termo “obtido ou obtenível” significa que o polipeptídeo pode ser encontrado em um organismo a partir de uma classificação taxonômica específica. Em uma modalidade, o polipeptídeo é obtido ou obtenível do reino Fungi, em que o termo reino é a classificação taxonômica. Em uma modalidade preferencial, o polipeptídeo é obtido ou obtenível do filo Ascomycota, em que o termo filo é a classificação taxonômica. Em outra modalidade preferencial, o polipeptídeo é obtido ou obtenível do subfilo Pezizomycotina, em que o termo subfilo é a classificação taxonômica. Em outra modalidade preferencial, o polipeptídeo é obtido ou obtenível da classe Eurotiomycetes, em que o termo classe é a classificação taxonômica.

[00102] Se a classificação taxonômica de um polipeptídeo não for conhecida pode ser facilmente determinada por um perito na técnica por realização de uma pesquisa BLASTP do polipeptídeo (usando, por exemplo, o website do National Center for Biotechnology Information (NCIB) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e sua comparação com os homólogos mais próximos. O perito pode também comparar a sequência com aquelas do pedido como depositado. Um polipeptídeo desconhecido que é um fragmento de um polipeptídeo conhecido é considerado como sendo da mesma espécie taxonômica. Um polipeptídeo natural desconhecido ou variante artificial que compreende uma substituição, deleção e/ou inserção em até 10 posições é considerado como sendo da mesma espécie taxonômica que o polipeptídeo conhecido.

[00103] Alimento grosseiro: O termo “alimento grosseiro” significa material vegetal seco com elevados níveis de fibra, tais como fibra, farelo, cascas de sementes e grãos e resíduos de cultura (tais como restolho de milho,

19 / 95 copra, palha, joio, resíduo de beterraba-sacarina).

[00104] Identidade de sequências: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequências”.

[00105] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Resíduos idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento – Número Total de Lacunas no Alinhamento)

[00106] Polipeptídeo substancialmente puro: O termo “polipeptídeo substancialmente puro” significa uma preparação que contém no máximo 10%, no máximo 8%, no máximo 6%, no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2%, no máximo 1% e, no máximo, 0,5% em peso de outro material de polipeptídeo ao qual está nativamente ou recombinantemente associado. Preferencialmente, o polipeptídeo é pelo menos 92% puro, por exemplo, pelo menos 94% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 96% puro, pelo menos 97% puro, pelo menos 98% puro, pelo menos 99% puro, pelo menos 99,5% puro e 100% puro em peso do material de polipeptídeo total presente na preparação. Os polipeptídeos da presente invenção estão preferencialmente em uma forma substancialmente pura. Isto pode ser alcançado, por exemplo, por preparação do polipeptídeo por métodos

20 / 95 recombinantes bem conhecidos ou por métodos de purificação clássicos.

[00107] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo que tem atividade de muramidase compreendendo uma alteração, i.e., uma substituição, inserção e/ou deleção, de um ou mais (vários) resíduos de aminoácidos em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Uma substituição significa substituição do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de 1, 2 ou 3 aminoácidos adjacentes ao e imediatamente após o aminoácido ocupando a posição.

[00108] Em um aspecto, uma variante de muramidase pode compreender de 1 a 10 alterações, i.e., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 alterações e ter pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de muramidase da muramidase parental, tal como a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 63.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Ração animal e aditivo de ração animal compreendendo polipeptídeos tendo atividade de muramidase e pelo menos um probiótico

[00109] Foi surpreendentemente descoberto que a suplementação de uma ração animal compreendendo um aditivo de ração animal, uma ou mais fontes de proteína e uma ou mais fontes de energia com uma muramidase (preferencialmente uma muramidase fúngica) e um probiótico dá um benefício de desempenho adicional em animais em comparação com a mesma ração animal mas sem a muramidase presente.

[00110] Assim, em um primeiro aspecto, a invenção se relaciona com uma ração animal compreendendo um aditivo de ração animal, uma ou mais fontes de proteína e uma ou mais fontes de energia caracterizada por a ração animal compreender adicionalmente um ou mais probióticos e um ou mais

21 / 95 polipeptídeos fúngicos tendo atividade de muramidase.

[00111] Em uma modalidade, a muramidase é uma muramidase GH24, preferencialmente uma muramidase GH24 fúngica, preferencialmente obtida ou obtenível do filo Ascomycota, mais preferencialmente da classe Eurotiomycetes. Em uma modalidade, a muramidase é uma muramidase GH25, preferencialmente uma muramidase GH25 fúngica, preferencialmente obtida ou obtenível do filo Ascomycota, mais preferencialmente da classe Eurotiomycetes. Em uma modalidade preferencial, a muramidase é uma muramidase GH25.

[00112] Em uma modalidade, a invenção se relaciona com uma ração animal compreendendo um aditivo de ração animal, uma ou mais fontes de proteína e uma ou mais fontes de energia caracterizada por a ração animal ou aditivo de ração compreender adicionalmente um ou mais probióticos e um ou mais polipeptídeos fúngicos tendo atividade de muramidase, em que o polipeptídeo fúngico tendo atividade de muramidase é selecionado do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 1; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 3; (d) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 4; (e) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo

22 / 95 menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 5; (f) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 6; (g) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 7; (h) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 8; (i) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 9; (j) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 10; (k) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 11; (l) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 12; (m) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 13; (n) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 14;

23 / 95

(o) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 15; (p) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 16; (q) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 17; (r) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 18; (s) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 19; (t) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 20; (u) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 21; (v) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 22; (w) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 23; (x) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de

24 / 95 sequências com a SEQ ID NO: 24; (y) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 25; (z) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 26; (aa) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 27; (ab) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 28; (ac) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 29; (ad) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 30; (ae) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 31; (af) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 32; (ag) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 33; (ah) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo,

25 / 95 pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 34; (ai) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 35; (aj) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 36; (ak) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 37; (al) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 38; (am) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 39; (an) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 40; (ao) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 41; (ap) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 42; (aq) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 43;

26 / 95

(ar) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 44; (as) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 45; (at) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 46; (au) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 47; (av) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 48; (aw) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 49; (ax) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 50; (ay) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 51; (az) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 52; (ba) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade

27 / 95 de sequências com a SEQ ID NO: 53; (bb) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 54; (bc) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 55; (bd) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 56; (be) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 57; (bf) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 58; (bg) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 59; (bh) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 60; (bi) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 61; (bj) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 62; (bk) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo,

28 / 95 pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 63; (bl) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 64; (bm) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 65; (bn) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 66; (bo) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 67; (bp) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 68; (bq) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 69; (br) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 70; (bs) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 71; (bt) uma variante da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12,

29 / 95

SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 ou SEQ ID NO: 71 compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos (preferencialmente substituições conservativas), e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 posições; (bu) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (a), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc), (d l), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (m l), (bn), (bo), (bp), (bq), (l), (s l) ou (t l) e uma extensão N-terminal e/ou C- terminal dentre 1 e 10 aminoácidos; e (bv) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (at), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc), (bd), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (bm), (bn), (bo), (bp),

30 / 95 (bq), (br), (bs) ou (bt) tendo atividade de muramidase e tendo pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro.

[00113] Em uma modalidade, a muramidase compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos 1 a 218 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 4, aminoácidos 1 a 215 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 8, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 10, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 11, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 12, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 13, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 14, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 15, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 16, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 17, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 18, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 19, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 20, aminoácidos 1 a 218 da SEQ ID NO: 21, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 22, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 23, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 24, aminoácidos 1 a 210 da SEQ ID NO: 25, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 26, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 27, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 28, aminoácidos 1 a 217 da SEQ ID NO: 29, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 30, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 31, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 32, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 33, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 34, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 35, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 36, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 37, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 38, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 39, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 40, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 41, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 42, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 43, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 44, aminoácidos 1 a 215 da SEQ ID NO: 45, aminoácidos 1 a 217 da SEQ ID NO: 46,

31 / 95 aminoácidos 1 a 214 da SEQ ID NO: 47, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 48, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 49, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 50, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 51, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 52, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 53, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 54, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 55, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 56, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 57, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 58, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 59, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 60, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 61, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 62, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 63, aminoácidos 1 a 249 da SEQ ID NO: 64, aminoácidos 1 a 248 da SEQ ID NO: 65, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 66, aminoácidos 1 a 249 da SEQ ID NO: 67, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 68, aminoácidos 1 a 247 da SEQ ID NO: 69, aminoácidos 1 a 250 da SEQ ID NO: 70 ou aminoácidos 1 a 240 da SEQ ID NO: 71.

[00114] Em uma modalidade da invenção, a muramidase tem pelo menos 90% de identidade de sequências com a enzima do produto comercial Balancius™. Tipicamente, a muramidase tem pelo menos 95% de identidade de sequências com a enzima do produto comercial Balancius™, tal como pelo menos 98% de identidade de sequências ou pelo menos 99% de identidade de sequências. Balancius™ é definido aqui pela SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO.2.

[00115] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L.

32 / 95 Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly. Outros exemplos de substituições conservativas são G por A; A por G, S; V por I, L, A, T, S; I por V, L, M; L por I, M, V; M por L, I, V; P por A, S, N; F por Y, W, H; Y por F, W, H; W por Y, F, H; R por K, E, D; K por R, E, D; H por Q, N, S; D por N, E, K, R, Q; E por Q, D, K, R, N; S por T, A; T por S, V, A; C por S, T, A; N por D, Q, H, S; Q por E, N, H, K, R.

[00116] Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na especialidade, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura por alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Em esta última técnica são introduzidas mutações únicas de alanina em todos os resíduos na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade de muramidase para se identificarem resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver ainda, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons ou marcação por fotoafinidade, em conjunção com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[00117] WO 2013/076253 divulgou que os resíduos de aminoácidos D95 e E97 da SEQ ID NO: 8 de WO 2013/076253 são resíduos catalíticos. PCT/CN2017/075960 descreve os aminoácidos catalíticos de 12 muramidases

33 / 95 GH25. Este alinhamento pode ser usado para se determinar a posição dos aminoácidos catalíticos para as muramidases reivindicadas. Em uma modalidade, nenhuma alteração é feita a um aminoácido correspondendo a E97 e D95 quando se usa SEQ ID NO: 39 para numeração. Os aminoácidos catalíticos para as muramidases GH24 podem ser determinados por alinhamento das sequências com sequências conhecidas onde o(s) aminoácido(s) catalítico(s) já foi/foram determinado(s) (ver www.uniprot.org).

[00118] A invenção se relaciona com uma ração animal ou aditivo de ração animal compreendendo um aditivo de ração animal, uma ou mais fontes de proteína e uma ou mais fontes de energia caracterizada por a ração animal ou aditivo de ração compreender adicionalmente um ou mais probióticos, um ou mais polipeptídeos fúngicos tendo atividade de muramidase, em que o probiótico é selecionado de quaisquer microrganismos que estão associados a um benefício para a saúde no hospedeiro.

[00119] Em uma modalidade típica, o um ou mais probióticos podem ser selecionados do grupo consistindo em um Lactobacillus, uma Bifidobacterium, uma Saccharomyces, um Enterococcus, um Streptococcus, um Pediococcus, um Leuconostoc, um Lactococcus, um Oenococcus, um Bacillus, Carnobacterium, Propionibacterium, Clostridium, Megasphaera e uma Escherichia ou suas combinações.

[00120] Em uma modalidade adequada, a composição de ração animal compreende um ou mais probióticos selecionados do grupo consistindo em Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Enterococcus faecium, Enterococcus spp. e Pediococcus spp., Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminus, lactobacillus

34 / 95 rhamnosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Megasphaera elsdenii e Propionibacteria sp.

[00121] Em uma modalidade adequada adicional, a estirpe de Lactobacillus pode ser selecionada do grupo consistindo em Lactobacillus acidophilus; Lactobacillus casei; Lactobacillus gasseri; Lactobacillus rhamnosus; Lactobacillus salivarius; Lactobacillus reuteri, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosus e Lactobacillus johnsonii e suas combinações.

[00122] Modalidades preferenciais de Lactobacillus podem ser selecionadas do grupo consistindo em Lactobacillus acidophilus; Lactobacillus casei; Lactobacillus reuteri, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus e Lactobacillus johnsonii e suas combinações.

[00123] A Bifidobacterium pode incluir várias bactérias anaeróbias não móveis Gram-positivas. Estirpes do gênero Bifidobacterium são também frequentemente usadas como bactérias probióticas pois são conhecidas por sua variedade de mecanismos de resistência aos sais biliares, o que é importante uma vez que os efeitos benéficos das bactérias probióticas são frequentemente gerados na presença deste fluido biológico. As Bifidobactérias podem ser selecionadas do grupo consistindo em Bifidobacterium bifidum; Bifidobacterium animalis; Bifidobacterium infantis; Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum e Bifidobacterium breve.

[00124] As Saccharomyces podem ser selecionadas do grupo consistindo em Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces thermophilus e Saccharomyces boulardii, particularmente Saccharomyces thermophilus e Saccharomyces boulardii.

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[00125] Um Lactococcus adequado é Lactococcus lactis.

[00126] Em uma modalidade adequada, o Enterococcus é selecionado do grupo consistindo em Enterococcus durans e Enterococcus faecium.

[00127] Em uma modalidade adequada, o Streptococcus é Streptococcus thermophilus.

[00128] Em uma modalidade adequada, o Bacillus é selecionado do grupo consistindo em Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus lichenformis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus. Bacillus cereus, nomeadamente Bacillus cereus NVH 75/95, é um probiótico eficiente para animais.

[00129] Em uma modalidade típica, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal compreende um probiótico de uma ou mais das seguintes estirpes de Bacillus subtilis: 3A-P4 (PTA-6506), 15A-P4 (PTA- 6507), 22C-P1 (PTA-6508), 2084 (NRRL B-500130), LSSA01 (NRRL-B- 50104), BS27 (NRRL B-501 05), BS 18 (NRRL B-50633), BS 278 (NRRL B-50634), DSM 29870, DSM 29871, DSM 32315, NRRL B-50136, NRRL B-50605, NRRL B-50606, NRRL B-50622 e PTA-7547.

[00130] Adequadamente, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal compreende adicionalmente um probiótico de uma ou mais das seguintes estirpes de Bacillus pumilus: NRRL B-50016, ATCC 700385, NRRL B-50885 ou NRRL B-50886.

[00131] Em uma modalidade típica adicional, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal compreende um probiótico de uma ou mais das seguintes estirpes de Bacillus lichenformis: NRRL B 50015, NRRL B-50621 ou NRRL B-50623.

[00132] Em uma modalidade adequada adicional, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal compreende um probiótico de uma ou mais das seguintes estirpes de Bacillus amyloliquefaciens: DSM 29869, DSM 29869, NRRL B 50607, PTA-7543, PTA-7549, NRRL B-50349, NRRL

36 / 95 B-50606, NRRL B-50013, NRRL B-50151, NRRL B-50141, NRRL B-50147 ou NRRL B-50888.

[00133] Em uma modalidade adequada, a Escherichia é selecionada do grupo consistindo em Escherichia coli Nissle, tal como Escherichia coli Nissle 1917.

[00134] Em uma modalidade interessante, a ração animal ou aditivo de ração animal da invenção é caracterizado por o um ou mais probióticos serem uma combinação compreendendo uma estipe de Bacillus subtilis 2084 n.º de Acesso NRRI B-50013, estirpe de Bacillus subtilis LSSAO1 n.º de Acesso NRRL B-50104 e estirpe de Bacillus subtilis 15A-P4 ATCC n.º de Acesso PTA-65.

[00135] Em uma modalidade interessante adicional, a ração animal ou aditivo de ração animal da invenção é caracterizado por o um ou mais probióticos serem a Estirpe de Bacillus subtilis C3102.

[00136] Como afirmado, em uma modalidade típica, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal compreende uma combinação de probióticos selecionados do grupo consistindo em Lactobacillus, uma Bifidobacterium, uma Saccharomyces, um Enterococcus, um Streptococcus, um Pediococcus, um Leuconostoc, um Lactococcus, um Oenococcus, um Bacillus, Carnobacterium, Propionibacterium, Clostridium, Megasphaera e uma Escherichia. Combinações preferenciais incluem uma combinação de um ou mais Lactobacillus e uma ou mais Saccharomyces, um ou mais Lactobacillus e um ou mais Streptococcus, um ou mais Lactobacillus e um ou mais Bacillus, um ou mais Lactobacillus e uma ou mais Bifidobacterium, uma ou mais Saccharomyces e um ou mais Streptococcus, uma ou mais Saccharomyces e um ou mais Bacillus, uma ou mais Saccharomyces e uma ou mais Bifidobacterium, uma ou mais Saccharomyces e um ou mais Bacillus, um ou mais Streptococcus e uma ou mais Bifidobacterium, um ou mais Streptococcus e um ou mais Bacillus, um ou mais Bacillus e uma ou mais

37 / 95 Bifidobacterium.

[00137] Em outra modalidade típica, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal compreende uma combinação de estirpes de Lactobacillus tais como uma combinação de Lactobacillus acidophilus e L. johnsonii; Lactobacillus acidophilus e L. casei; Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus rhamnosus; L. johnsonii e Lactobacillus acidophilus; L. johnsonii e L. casei; e L. johnsonii e Lactobacillus rhamnosus.

[00138] Em uma modalidade adicional, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal compreende uma combinação de S. thermophilus e L. bulgaricus. Outra combinação adequada pode ser selecionada do grupo consistindo em Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Saccharomyces boulardii, Bifidobacterium bifidum e Bacillus coagulans.

[00139] Em outra modalidade, a uma ou mais estirpes bacterianas atuando como probióticos estão presentes na forma de um esporo estável.

[00140] A contagem bacteriana de cada uma das estirpes bacterianas atuando como probióticos na composição de ração animal é tipicamente entre 1x104 e 1x1014 CFU/kg de matéria seca, preferencialmente entre 1x106 e 1x1012 CFU/kg de matéria seca e, mais preferencialmente, entre 1x107 e 1x1011 CFU/kg de matéria seca. Em uma modalidade mais preferencial, a contagem bacteriana de cada uma das estirpes bacterianas na composição de ração animal é entre 1x108 e 1x1010 CFU/kg de matéria seca.

[00141] A contagem bacteriana de cada uma das estirpes bacterianas atuando como probióticos na composição de ração animal é entre 1x105 e 1x1015 CFU/animal/dia, preferencialmente entre 1x107 e 1x1013 CFU/animal/dia e, mais preferencialmente, entre 1x108 e 1x1012 CFU/animal/dia. Em uma modalidade mais preferencial, a contagem bacteriana de cada uma das estirpes bacterianas na composição de ração animal é entre 1x109 e 1x1011 CFU/animal/dia. Em uma modalidade, a quantidade de probióticos é 0,001% a 10% em peso da composição.

38 / 95

[00142] Exemplos de produtos comerciais atuando como probióticos são Cylactin® (DSM Nutritional Products), Alterion (Adisseo), Enviva PRO (DuPont Animal Nutrition), Syncra® (mistura enzima + probiótico, DuPont Animal Nutrition), Calsporin®, Gallipro®, GalliproMax®, Proflora®, Ecobiol® e Fecinor® (Norel/Evonik), CSI®, Sorbiflora®, Animavit® e GutCare® PY1 (Evonik). Em uma modalidade adequada, o probiótico é selecionado do grupo consistindo em qualquer um de Cylactin® (DSM Nutritional Products), Alterion (Adisseo), Enviva PRO (DuPont Animal Nutrition), Syncra® (mistura enzima + probiótico, DuPont Animal Nutrition), Calsporin®, Gallipro®, GalliproMax®, Proflora®, Ecobiol® e Fecinor® (Norel/Evonik), CSI®, Sorbiflora®, Animavit® e GutCare® PY1 (Evonik) e a muramidase é uma muramidase tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com

[00143] Como afirmado, a muramidase é uma muramidase GH25. Foi surpreendentemente descoberto que as muramidases GH25 podem melhorar a saúde intestinal de um animal por redução da quantidade de células de Lactobacillus johnsonii mortas no trato digestivo do referido animal. Em uma combinação de modalidades interessantes da invenção, a muramidase é uma muramidase GH25 e o um ou mais probióticos compreendem Lactobacillus johnsonii. Sem estar vinculado à teoria particular, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal compreendendo uma muramidase GH25 e o um ou mais probióticos, tais como Lactobacillus johnsonii, melhora a saúde intestinal em um animal.

[00144] Os prebióticos são substâncias que induzem o crescimento ou atividade de microrganismos (por exemplo, bactérias e fungos) que contribuem para o bem-estar de seu hospedeiro. Os prebióticos são tipicamente compostos de fibra não digeríveis que passam não digeridos através da parte superior do trato gastrointestinal e estimulam o crescimento ou atividade de bactérias vantajosas que colonizam o intestino grosso atuando como substrato para os mesmos. Normalmente, os prebióticos

39 / 95 aumentam o número ou atividade de bifidobactérias e bactérias do ácido láctico no trato GI.

[00145] Os derivados de levedura (leveduras totais desativadas ou paredes de célula de levedura) podem ser também considerados como prebióticos. Compreendem adicionalmente manana-oligossacarídeos, beta- glucanas de levedura ou conteúdos de proteína e são normalmente derivados da parede de célula da levedura, Saccharomyces cerevisiae.

[00146] Em uma modalidade, a quantidade de prebiótico é 0,001% a 10% em peso da composição. Exemplos de produtos de levedura são Yang® e Agrimos (Lallemand Animal Nutrition).

[00147] Em uma modalidade típica, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal, ou métodos, da invenção compreendem o produto comercial Balancius™, ou uma muramidase tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com a enzima do produto comercial Balancius™, em combinação com um probiótico de uma ou mais das seguintes estirpes de Bacillus lichenformis: NRRL B 50015, NRRL B-50621 ou NRRL B-50623. Tipicamente, a combinação compreende uma muramidase tendo pelo menos 95% de identidade de sequências com a enzima do produto comercial Balancius™, tal como pelo menos 98% de identidade de sequências ou pelo menos 99% de identidade de sequências.

[00148] Em uma modalidade adequada, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal, ou métodos, da invenção compreendem o produto comercial Balancius™, ou uma muramidase tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com a enzima do produto comercial Balancius™, em combinação com um probiótico de uma ou mais das seguintes estirpes de Bacillus amyloliquefaciens: DSM 29869, DSM 29869, NRRL B 50607, PTA- 7543, PTA-7549, NRRL B-50349, NRRL B-50606, NRRL B-50013, NRRL B-50151, NRRL B-50141, NRRL B-50147 ou NRRL B-50888. Tipicamente, a combinação compreende uma muramidase tendo pelo menos 95% de

40 / 95 identidade de sequências com a enzima do produto comercial Balancius™, tal como pelo menos 98% de identidade de sequências ou pelo menos 99% de identidade de sequências.

[00149] Em uma modalidade adequada, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal, ou métodos, da invenção compreendem o produto comercial Balancius™, ou uma muramidase tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a enzima do produto comercial Balancius™, em combinação com uma Escherichia selecionada do grupo consistindo em Escherichia coli Nissle, tal como Escherichia coli Nissle 1917. Tipicamente, a combinação compreende uma muramidase tendo pelo menos 95% de identidade de sequências com a enzima do produto comercial Balancius™, tal como pelo menos 98% de identidade de sequências ou pelo menos 99% de identidade de sequências.

[00150] Em uma modalidade interessante, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal, ou métodos, da invenção compreendem o produto comercial Balancius™, ou uma muramidase tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com a enzima do produto comercial Balancius™, em combinação com uma combinação de probióticos, compreendendo a referida combinação uma estirpe de Bacillus subtilis 2084 n.º de Acesso NRRI B-50013, estirpe de Bacillus subtilis LSSAO1 n.º de Acesso NRRL B- 50104 e estirpe de Bacillus subtilis 15A-P4 ATCC n.º de Acesso PTA-65. Tipicamente, a combinação compreende uma muramidase tendo pelo menos 95% de identidade de sequências com a enzima do produto comercial Balancius™, tal como pelo menos 98% de identidade de sequências ou pelo menos 99% de identidade de sequências.

[00151] Em uma modalidade interessante adicional, a composição, aditivo de ração animal ou ração animal, ou métodos, da invenção compreendem o produto comercial Balancius™, ou uma muramidase tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com a enzima do produto

41 / 95 comercial Balancius™, em combinação com o probiótico Estirpe de Bacillus subtilis C3102. Tipicamente, a combinação compreende uma muramidase tendo pelo menos 95% de identidade de sequências com a enzima do produto comercial Balancius™, tal como pelo menos 98% de identidade de sequências ou pelo menos 99% de identidade de sequências.

[00152] Em uma modalidade adequada, o probiótico é selecionado do grupo consistindo em qualquer um de Cylactin® (DSM Nutritional Products), Alterion (Adisseo), Enviva PRO (DuPont Animal Nutrition), Syncra® (mistura enzima + probiótico, DuPont Animal Nutrition), Calsporin®, Gallipro®, GalliproMax®, Proflora®, Ecobiol® e Fecinor® (Norel/Evonik), CSI®, Sorbiflora®, Animavit® e GutCare® PY1 (Evonik) e a muramidase é selecionada do grupo consistindo no produto comercial Balancius™, ou uma muramidase tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com a enzima do produto comercial Balancius™, tal como pelo menos 95% de identidade de sequências com a enzima do produto comercial Balancius™, tal como pelo menos 98% identidade de sequências ou pelo menos 99% de identidade de sequências.

[00153] Balancius™ é definido aqui pela SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO.2.

[00154] Em uma modalidade, o BWG é melhorado em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,5%, pelo menos 2,0%, pelo menos 2,5%, pelo menos 3%, pelo menos 3,5%, pelo menos 4% ou pelo menos 5%. Em outra modalidade, o BWG é melhorado em entre 1% e 15%, tal como entre 1% e 12%, entre 1% e 10%, 1,5% e 8%, 2,0% e 7% ou qualquer combinação destes intervalos.

[00155] Em uma modalidade, a FCR é melhorada em pelo menos 1%, tal como em pelo menos 1,25%, pelo menos 1,5% ou pelo menos 1,75%. Em outra modalidade, a FCR é melhorada em entre 1% e 5%, tal como entre 1% e 4%, entre 1% e 3%, 1,25% e 2,5%, 1,5% e 2% ou qualquer combinação

42 / 95 destes intervalos.

[00156] Em uma modalidade, o polipeptídeo tendo atividade de muramidase é doseado a um nível de 0,1 a 150 ppm de proteína enzimática por kg de ração animal, tal como 0,5 a 100 ppm, 1 a 75 ppm, 2 a 50 ppm, 3 a 25 ppm, 2 a 80 ppm, 5 a 60 ppm, 8 a 40 ppm, 10 a 30 ppm, 13 a 75 ppm, 15 a 50 ppm, 17,5 a 40 ppm, 25 a 75 ppm ou 30 a 60 ppm de proteína enzimática por kg de ração animal ou qualquer combinação destes intervalos.

[00157] Em uma modalidade, o animal é um animal monogástrico, por exemplo, porcos ou suínos (incluindo, mas não se limitando a, leitões, porcos em crescimento e porcas); aves domésticas (incluindo mas não se limitando a aves domésticas, peru, pato, codorna, galinha-de-angola, ganso, pombo, filhote de pombo, frango, frango de corte, poedeira, franga e pinto); peixe (incluindo mas não se limitando a charuteiro, pirarucu, barbo, robalo, anchova, bocachico, goraz, peixe-gato, cachama, carpa, peixe-lobo, catla, chanos, savelino, ciclídeo, fogueteiro-galego, bacalhau, perca, dourada, calafate, enguia, caboz, peixe-dourado, gurami, garoupa, guapote, alabote, jamelão, labeo, lai, verdemã, cavalinha, peixe-leite, sargo, peixe-lama, tainha, pacu, pearlspot, peixe-rei, robalo, lúcio, pâmpano, ruivaca, salmão, sampa, picão, robalo-legítimo, panga, shiner, amoré, cabeça-de-cobra, lutjanídeo, falso robalo, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, peixe-doce, tenca, terror, tilápia, truta, atum, areeiro, corégono-branco, picão-verde e peixe-magro); e crustáceos (incluindo mas não se limitando a camarões e pitus). Em uma modalidade mais preferencial, o animal é selecionado do grupo consistindo em suínos, aves domésticas, crustáceos e peixe. Em uma modalidade ainda mais preferencial, o animal é selecionado do grupo consistindo em suínos, leitão, porco em crescimento, porca, frango, frango de corte, poedeira, franga e pinto.

[00158] Em uma modalidade, o polipeptídeo tendo atividade de muramidase é doseada entre 0,001% e 25% p/p de formulação líquida,

43 / 95 preferencialmente 0,01% e 25% p/p, mais preferencialmente 0,05% e 20% p/p, mais preferencialmente 0,2% e 15% p/p, ainda mais preferencialmente 0,5% e 15% p/p ou o mais preferencialmente 1,0% e 10% p/p de polipeptídeo.

[00159] Em uma modalidade, a formulação líquida compreende adicionalmente 20%-80% de poliol (i.e., quantidade total de poliol), preferencialmente 25%-75% de poliol, mais preferencialmente 30%-70% de poliol, mais preferencialmente 35%-65% de poliol ou o mais preferencialmente 40%-60% de poliol. Em uma modalidade, a formulação líquida compreende 20-80% de poliol, preferencialmente 25%-75% de poliol, mais preferencialmente, 30%-70% de poliol, mais preferencialmente 35%- 65% de poliol ou o mais preferencialmente 40%-60% de poliol em que o poliol é selecionado do grupo consistindo em glicerol, sorbitol, propilenoglicol (MPG), etilenoglicol, dietilenoglicol, trietilenoglicol, 1,2- propilenoglicol ou 1,3-propilenoglicol, dipropilenoglicol, polietilenoglicol (PEG) tendo um peso molecular médio abaixo de cerca de 600 e polipropilenoglicol (PPG) tendo um peso molecular médio abaixo de cerca de

600. Em uma modalidade, a formulação líquida compreende 20%-80% de poliol (i.e., quantidade total de poliol), preferencialmente 25%-75% de poliol, mais preferencialmente 30%-70% de poliol, mais preferencialmente 35%- 65% de poliol ou o mais preferencialmente 40%-60% de poliol em que o poliol é selecionado do grupo consistindo em glicerol, sorbitol e propilenoglicol (MPG).

[00160] Em uma modalidade, a formulação líquida compreende adicionalmente conservante, preferencialmente selecionado do grupo consistindo em sorbato de sódio, sorbato de potássio, benzoato de sódio e benzoato de potássio ou qualquer sua combinação. Em uma modalidade, a formulação líquida compreende 0,02% a 1,5% p/p de conservante, mais preferencialmente 0,05% a 1,0% p/p de conservante ou o mais preferencialmente 0,1% a 0,5% p/p de conservante. Em uma modalidade, a

44 / 95 formulação líquida compreende 0,001% a 2,0% p/p de conservante (i.e., quantidade total de conservante), preferencialmente 0,02% a 1,5% p/p de conservante, mais preferencialmente 0,05% a 1,0% p/p de conservante ou o mais preferencialmente 0,1% a 0,5% p/p de conservante em que o conservante é selecionado do grupo consistindo em sorbato de sódio, sorbato de potássio, benzoato de sódio e benzoato de potássio ou qualquer sua combinação.

[00161] Em uma modalidade, a formulação líquida compreende um ou mais agentes de formulação (tais como aqueles descritos aqui), preferencialmente um agente de formulação selecionado da lista consistindo em glicerol, etilenoglicol, 1,2-propilenoglicol ou 1,3-propilenoglicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de sódio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glucose, sacarose, sorbitol, lactose, amido, PVA, acetato e fosfato, preferencialmente selecionado da lista consistindo em 1,2- propilenoglicol, 1,3-propilenoglicol, sulfato de sódio, dextrina, celulose, tiossulfato de sódio, caulim e carbonato de cálcio.

[00162] Em uma modalidade, a fonte de proteína é selecionada do grupo consistindo em soja, soja selvagem, feijões, tremoço, feijão tepário, feijão escarlate, feijão slimjim, feijão de lima, feijão francês, feijão-fava, grão de bico, lentilha, amendoim, amendoim espanhol, canola, semente de girassol, semente de algodão, semente de colza (colza) ou ervilha ou em uma forma processada tal como farelo de soja, farelo de soja integral, concentrado de proteína de soja (SPC), farelo de soja fermentado (FSBM), farelo de girassol, farelo de semente de algodão, farelo de colza, farelo de peixe, farelo de osso, farelo de penas, soro de leite ou qualquer sua combinação.

[00163] Em uma modalidade, a fonte de energia é selecionada do grupo consistindo em milho, sorgo, cevada, trigo, aveia, arroz, triticale, centeio, beterraba, beterraba-sacarina, espinafre, batata, mandioca, quinoa,

45 / 95 repolho, switchgrass, milheto, milheto-pérola, milheto foxtail ou em uma forma processada tal como milho moído, amido de batata, amido de mandioca, sorgo moído, switchgrass moída, milheto moído, milheto foxtail moído, milheto-pérola moído ou qualquer sua combinação.

[00164] Em uma modalidade, o aditivo de ração animal compreende adicionalmente um ou mais componentes selecionados da lista consistindo em uma ou mais enzimas adicionas; um ou mais micróbios; uma ou mais vitaminas; um ou mais minerais; um ou mais aminoácidos; e um ou mais outros ingredientes de ração, como descrito aqui.

[00165] Em uma modalidade, o aditivo de ração animal compreende adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais, preferencialmente em que a enzima é selecionada do grupo consistindo em fitase, galactanase, alfa- galactosidase, beta-galactosidase, protease, xilanase, fosfolipase A1, fosfolipase A2, lisofosfolipase, fosfolipase C, fosfolipase D, amilase, arabinofuranosidase, beta-xilosidase, acetil xilano esterase, feruloil esterase, celulase, celobio-hidrolases, beta-glucosidase, pululanase, manosidase, mananase e beta-glucanase ou qualquer sua combinação.

[00166] Em uma modalidade, o aditivo de ração animal compreende adicionalmente um ou mais micróbios, preferencialmente em que o micróbio é selecionado do grupo consistindo em Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium sp., Carnobacterium sp., Clostridium butyricum, Clostridium sp., Enterococcus faecium, Enterococcus sp., Lactobacillus sp., Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Lactococcus sp., Leuconostoc sp., Megasphaera elsdenii, Megasphaera sp., Pediococsus acidilactici, Pediococcus sp., Propionibacterium thoenii,

46 / 95 Propionibacterium sp. e Streptococcus sp. ou qualquer sua combinação.

[00167] Em uma modalidade, o aditivo de ração animal compreende adicionalmente uma ou mais vitaminas como descrito aqui. Em uma modalidade, o aditivo de ração animal compreende adicionalmente um ou mais minerais como descrito aqui. Em uma modalidade, o aditivo de ração animal compreende adicionalmente um ou mais eubióticos como descrito aqui. Em uma modalidade, o aditivo de ração animal compreende adicionalmente um ou mais prebióticos como descrito aqui. Em uma modalidade, o aditivo de ração animal compreende adicionalmente um ou mais ácidos orgânicos como descrito aqui. Em uma modalidade, o aditivo de ração animal compreende adicionalmente um ou mais eubióticos como descrito aqui.

[00168] A enzima da invenção pode ser formulada como um líquido ou um sólido. Para uma formulação líquida, o agente de formulação pode compreender um poliol (tal como, por exemplo glicerol, etilenoglicol ou propilenoglicol), um sal (tal como, por exemplo, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio) ou um açúcar ou derivado de açúcar (tal como, por exemplo, dextrina, glucose, sacarose e sorbitol). Assim, em uma modalidade, a composição é uma composição líquida compreendendo o polipeptídeo da invenção e um ou mais agentes de formulação selecionados da lista consistindo em glicerol, etilenoglicol, 1,2-propilenoglicol, 1,3- propilenoglicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, dextrina, glucose, sacarose e sorbitol. A formulação líquida pode ser pulverizada na ração após ter sido peletizada ou pode ser adicionada à água potável dada aos animais.

[00169] Para uma formulação sólida, a formulação pode ser por exemplo como um grânulo, pó seco por pulverização ou aglomerado (por exemplo, como divulgado em WO2000/70034). O agente de formulação pode compreender um sal (sais orgânicos ou inorgânicos de zinco, sódio, potássio

47 / 95 ou cálcio tais como, por exemplo, tais como acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, citrato de potássio, sorbato de potássio, sulfato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, carbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco, sorbato de zinco, sulfato de zinco), amido ou um açúcar ou derivado de açúcar (tal como, por exemplo, sacarose, dextrina, glucose, lactose, sorbitol).

[00170] Em uma modalidade, a composição é uma composição sólida, tal como uma composição seca por pulverização, compreendendo a muramidase da invenção e um ou mais agentes de formulação selecionados da lista consistindo em cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glucose, sacarose, sorbitol, lactose, amido e celulose. Em uma modalidade preferencial, o agente de formulação é selecionado de um ou mais dos seguintes compostos: sulfato de sódio, dextrina, celulose, tiossulfato de sódio, sulfato de magnésio e carbonato de cálcio.

[00171] A presente invenção se relaciona também com grânulos/partículas de enzima compreendendo a muramidase da invenção opcionalmente combinada com uma ou mais enzimas adicionais. O grânulo é composto por um núcleo e, opcionalmente, um ou mais revestimentos (camadas externas) rodeando o núcleo.

[00172] Tipicamente, o tamanho do grânulo/partícula, medido como diâmetro esférico equivalente (tamanho médio de partícula baseado em volume), do grânulo é 20-2000 µm, particularmente 50-1500 µm, 100-1500 µm ou 250-1200 µm.

[00173] O núcleo pode ser preparado por granulação de uma

48 / 95 combinação dos ingredientes, por exemplo, por um método compreendendo técnicas de granulação tais como cristalização, precipitação, pan- revestimento, revestimento de leito fluidizado, aglomeração de leito fluidizado, atomização rotativa, extrusão, perolação, esferonização, métodos de redução do tamanho, granulação de tambor e/ou granulação de elevado cisalhamento.

[00174] Métodos para preparação do núcleo podem ser encontrados no Handbook of Powder Technology; Particle size enlargement por C. E. Capes; Volume 1; 1980; Elsevier. Métodos de preparação incluem tecnologias conhecidas de formulação de rações e grânulos, por exemplo: a) produtos secos por pulverização, em que uma solução contendo enzima líquida é atomizada em uma torre de secagem por pulverização para formar gotículas pequenas que durante seu trajeto para baixo na torre de secagem secam para formar um material particulado contendo enzima. b) produtos em camada, em que a enzima é revestida como uma camada em torno de uma partícula de núcleo inerte pré-formada, em que uma solução contendo enzima é atomizada, tipicamente em um dispositivo de leito fluidizado em que as partículas de núcleo pré-formadas são fluidizadas, e a solução contendo enzima adere às partículas de núcleo e seca para deixar uma camada de enzima seca na superfície da partícula de núcleo. As partículas de um tamanho desejado podem ser obtidas deste modo se uma partícula de núcleo útil do tamanho desejado puder ser encontrada. Este tipo de produto é descrito em, por exemplo, WO 97/23606; c) partículas de núcleo absorvidas, em que, em vez do revestimento da enzima como uma camada em torno do núcleo, a enzima é absorvida sobre a e/ou na superfície do núcleo. Um tal processo é descrito em WO 97/39116. d) produtos de extrusão ou peletizados, em que uma pasta

49 / 95 contendo enzima é pressionada em péletes ou sob pressão é extrudada através de uma pequena abertura e cortada em partículas que são subsequentemente secas.

Tais partículas têm usualmente um tamanho considerável porque o material no qual a abertura de extrusão é feita (usualmente uma placa com orifícios perfurados) define um limite na queda de pressão permissível através da abertura de extrusão.

Igualmente, pressões de extrusão muito elevadas quando se usa uma abertura pequena aumentam a geração de calor na pasta de enzima, o que é prejudicial à enzima; e) produtos perolizados, em que um pó contendo enzima é suspenso em cera fundida e a suspensão é pulverizada, por exemplo, através de um atomizador de disco rotativo, em uma câmara de resfriamento onde as gotículas solidificam rapidamente (Michael S.

Showell (editor); Powdered detergents; Surfactant Science Series; 1998; volume 71; páginas 140-142; Marcel Dekker). O produto obtido é um em que a enzima está uniformemente distribuída ao longo de um material inerte em vez de estar concentrada em sua superfície.

Igualmente, US 4,016,040 e US 4,713,245 são documentos se relacionando com esta técnica; f) produtos de granulação de misturador, em que um líquido é adicionado a uma composição de pó seco de, por exemplo, componentes de granulação convencionais, sendo a enzima introduzida através do líquido ou do pó ou ambos.

O líquido e o pó são misturados e, à medida que a umidade do líquido é absorvida no pó seco, os componentes do pó seco começarão a aderir e aglomerar e partículas se acumularão, formando granulados compreendendo a enzima.

Um tal processo é descrito em US 4,106,991 e documentos relacionados EP 170360, EP 304332, EP 304331, WO 90/09440 e WO 90/09428. Em um produto particular deste processo em que vários misturadores de elevado cisalhamento podem ser usados como granuladores, os granulados consistindo em enzima como enzima, enchimentos e aglutinantes, etc. são misturados com fibras de celulose para reforçar as

50 / 95 partículas para dar o assim chamado granulado T. As partículas reforçadas, sendo mais robustas, liberam menos poeira enzimática. g) redução de tamanho, em que os núcleos são produzidos por moagem ou esmagamento de partículas maiores, péletes, tabletes, briquetes, etc. contendo a enzima. A fração de partícula de núcleo desejada é obtida por peneiração do produto moído ou esmagado. As partículas sobre e subdimensionadas podem ser recicladas. A redução de tamanho é descrita em (Martin Rhodes (editor); Principles of Powder Technology; 1990; Capítulo 10; John Wiley & Sons); h) granulação de leito fluidizado, que envolve suspensão de particulados em uma corrente de ar e pulverização de um líquido nas partículas fluidizadas através de bocais. As partículas atingidas por gotículas de pulverização se tornam úmidas e se tornam pegajosas. As partículas pegajosas colidem com outras partículas e aderem às mesmas e formam um grânulo; i) os núcleos podem ser sujeitos a secagem, tal como em um secador de leito fluidizado. Outros métodos conhecidos para secagem de grânulos na indústria de rações ou detergentes podem ser usados pelo perito. A secagem ocorre preferencialmente a uma temperatura de produto de 25 a 90 °C. Para algumas enzimas é importante que os núcleos compreendendo a enzima contenham uma baixa quantidade de água antes do revestimento. Se enzimas sensíveis à água forem revestidas antes de a água excessiva ser removida será aprisionada no núcleo e pode afetar a atividade da enzima negativamente. Após secagem, os núcleos contêm preferencialmente 0,1-10% p/p de água.

[00175] O núcleo pode incluir materiais adicionais, tais como cargas, materiais de fibra (celulose ou fibras sintéticas), agentes estabilizantes, agentes solubilizantes, agentes de suspensão, agentes reguladores de viscosidade, esferas leves, plastificantes, sais, lubrificantes e fragrâncias.

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[00176] O núcleo pode incluir um aglutinante, tal como polímero sintético, cera, gordura ou carboidrato.

[00177] O núcleo pode incluir um sal de um cátion multivalente, um agente redutor, um antioxidante, um catalisador da decomposição de peróxido e/ou um componente de tampão ácido, tipicamente como uma combinação homogênea.

[00178] Em uma modalidade, o núcleo compreende um material selecionado do grupo consistindo em sais (tais como acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, citrato de potássio, sorbato de potássio, sulfato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, carbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco, sorbato de zinco, sulfato de zinco), amido ou um açúcar ou derivado de açúcar (tal como, por exemplo, sacarose, dextrina, glucose, lactose, sorbitol), açúcar ou derivado de açúcar (tal como, por exemplo, sacarose, dextrina, glucose, lactose, sorbitol), moléculas orgânicas pequenas, amido, farinha, celulose e minerais e minerais de argila (também conhecidos como filossilicatos de alumínio hidratados). Em uma modalidade, o núcleo compreende um mineral de argila tal como caulinita ou caulim.

[00179] O núcleo pode incluir uma partícula inerte com a enzima absorvida na mesma ou aplicada na superfície, por exemplo, por revestimento de leito fluidizado.

[00180] O núcleo pode ter um diâmetro de 20-2000 µm, particularmente 50-1500 µm, 100-1500 µm ou 250-1200 µm.

[00181] O núcleo pode estar rodeado por pelo menos um revestimento, por exemplo, para melhorar a estabilidade de armazenamento, para reduzir formação de poeira durante o manuseamento ou para colorir o grânulo. O(s)

52 / 95 revestimento(s) opcional(ais) pode(m) incluir um sal e/ou cera e/ou revestimento de farinha ou outros materiais de revestimento adequados.

[00182] O revestimento pode ser aplicado em uma quantidade de pelo menos 0,1% em peso do núcleo, por exemplo, pelo menos 0,5%, 1% ou 5%. A quantidade pode ser no máximo 100%, 70%, 50%, 40% ou 30%.

[00183] O revestimento tem preferencialmente pelo menos 0,1 µm de espessura, particularmente pelo menos 0,5 µm, pelo menos 1 µm ou pelo menos 5 µm. Em algumas modalidades, a espessura do revestimento é abaixo de 100 µm, como abaixo de 60 µm ou abaixo de 40 µm.

[00184] O revestimento deve encapsular a unidade de núcleo por formação de uma camada substancialmente contínua. Uma camada substancialmente contínua é para ser entendida como um revestimento tendo poucos ou nenhuns orifícios, tal que a unidade de núcleo seja encapsulada ou encerrada com poucas ou nenhumas áreas não revestidas. A camada ou revestimento deve ter em particular espessura homogênea.

[00185] O revestimento pode conter adicionalmente outros materiais como conhecidos na técnica, por exemplo, enchimentos, agentes antiaderentes, pigmentos, corantes, plastificantes e/ou aglutinantes, tais como dióxido de titânio, caulim, carbonato de cálcio ou talco.

[00186] Um revestimento de sal pode compreender pelo menos 60% em peso de um sal, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% em peso.

[00187] O sal pode ser adicionado a partir de uma solução de sal onde o sal é completamente dissolvido ou a partir de uma suspensão de sal em que as partículas finas são menores do que 50 µm, tal como menores do que 10 µm ou menores do que 5 μm.

[00188] O revestimento de sal pode compreender um único sal ou uma mistura de dois ou mais sais. O sal pode ser solúvel em água, em particular

53 / 95 tendo uma solubilidade pelo menos 0,1 g em 100 g de água a 20 °C, preferencialmente pelo menos 0,5 g por 100 g de água, por exemplo, pelo menos 1 g por 100 g de água, por exemplo, pelo menos 5 g por 100 g de água.

[00189] O sal pode ser um sal inorgânico, por exemplo, sais de sulfato, sulfito, fosfato, fosfonato, nitrato, cloreto ou carbonato ou sais de ácidos orgânicos simples (menos do que 10 átomos de carbono, por exemplo, 6 ou menos átomos de carbono) tal como citrato, malonato ou acetato. Exemplos de cátions em estes sais são íons de metais alcalinos ou metais alcalinoterrosos, o íon de amônio ou íons de metais da primeira série de transição, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio, zinco ou alumínio. Exemplos de ânions incluem cloreto, brometo, iodeto, sulfato, sulfito, bissulfito, tiossulfato, fosfato, fosfato monobásico, fosfato dibásico, hipofosfito, pirofosfato de di-hidrogênio, tetraborato, borato, carbonato, bicarbonato, metassilicato, citrato, malato, maleato, malonato, succinato, sorbato, lactato, formato, acetato, butirato, propionato, benzoato, tartarato, ascorbato ou gluconato. Em particular podem ser usados sais de metais alcalinos ou metais alcalinoterrosos de sulfato, sulfito, fosfato, fosfonato, nitrato, cloreto ou carbonato ou sais de ácidos orgânicos simples, tais como citrato, malonato ou acetato.

[00190] O sal no revestimento pode ter uma umidade constante a 20 °C acima de 60%, particularmente acima de 70%, acima de 80% ou acima de 85%, ou pode ser outra forma hidratada de um tal sal (por exemplo, anidrato). O revestimento de sal pode ser como descrito em WO1997/05245, WO1998/54980, WO1998/55599, WO2000/70034, WO2006/034710, WO2008/017661, WO2008/017659, WO2000/020569, WO2001/004279, WO1997/05245, WO2000/01793, WO2003/059086, WO2003/059087, WO2007/031483, WO2007/031485, WO2007/044968, WO2013/192043, WO2014/014647 e WO2015/197719 ou revestimento de polímero tal como em WO 2001/00042.

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[00191] Exemplos específicos de sais adequados são NaCl (CH20°C=76%), Na2CO3 (CH20°C=92%), NaNO3 (CH20°C=73%), Na2HPO4 (CH20°C=95%), Na3PO4 (CH25°C=92%), NH4Cl (CH20°C = 79,5%), (NH4)2HPO4 (CH20°C = 93,0%), NH4H2PO4 (CH20°C = 93,1%), (NH4)2SO4 (CH20°C=81,1%), KCl (CH20°C=85%), K2HPO4 (CH20°C=92%), KH2PO4 (CH20°C=96,5%), KNO3 (CH20°C=93,5%), Na2SO4 (CH20°C=93%), K2SO4 (CH20°C=98%), KHSO4 (CH20°C=86%), MgSO4 (CH20°C=90%), ZnSO4 (CH20°C=90%) e citrato de sódio (CH 25 °C = 86%). Outros exemplos incluem NaH2PO4, (NH4)H2PO4, CuSO4, Mg(NO3)2, acetato de magnésio, acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, citrato de potássio, sorbato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco e sorbato de zinco.

[00192] O sal pode estar em forma anidra ou pode ser um sal hidratado, i.e., um hidrato de sal cristalino com água(s) ligada(s) de cristalização, tal como descrito em WO 99/32595. Exemplos específicos incluem sulfato de sódio anidro (Na2SO4), sulfato de magnésio anidro (MgSO4), sulfato de magnésio hepta-hidratado (MgSO4.7H2O), sulfato de zinco hepta-hidratado (ZnSO4.7H2O), fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado (Na2HPO4.7H2O), nitrato de magnésio hexa-hidratado (Mg(NO3)2(6H2O)), citrato de sódio di- hidratado e acetato de magnésio tetra-hidratado.

[00193] Preferencialmente, o sal é aplicado como uma solução do sal, por exemplo, usando um leito fluidizado.

[00194] Um revestimento de cera pode compreender pelo menos 60% em peso de uma cera, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos

55 / 95 95% ou pelo menos 99% em peso.

[00195] Exemplos específicos de ceras são polietilenoglicóis; polipropilenos; cera de Carnaúba; cera de Candelila; cera de abelha; óleo vegetal hidrogenado ou sebo animal tal como polietilenoglicol (PEG), celulose de metila e hidróxi-propila (MHPC), álcool de polivinila (PVA), sebo de boi hidrogenado, óleo de palma hidrogenado, óleo de sementes de algodão hidrogenado e/ou de soja hidrogenado; álcoois de ácidos graxos; monoglicerídeos e/ou diglicerídeos, tais como estearato de glicerila, em que o estearato é uma mistura de ácido esteárico e palmítico; cera microcristalina; parafinas; e ácidos graxos, tais como ácidos graxos de cadeia longa linear hidrogenados e seus derivados. Uma cera preferencial é óleo de palma ou óleo de palma hidrogenado.

[00196] O grânulo pode compreender um núcleo compreendendo a muramidase da invenção, um ou mais revestimentos de sal e um ou mais revestimentos de cera. Exemplos de grânulos de enzima com múltiplos revestimentos são mostrados em WO1993/07263, WO1997/23606 e WO2016/149636.

[00197] Os granulados sem formação de poeira podem ser produzidos, por exemplo como divulgado nas Patentes dos E.U.A. n.os 4,106,991 e 4,661,452 e podem ser opcionalmente revestidos por métodos conhecidos na técnica. Os materiais de revestimento podem ser materiais de revestimento cerosos e materiais de revestimento formadores de filme. Exemplos de materiais de revestimento cerosos são produtos de poli(óxido de etileno) (polietilenoglicol, PEG) com pesos molares médios de 1000 a 20000; nonilfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados nos quais o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e nos quais existem 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidos graxos; e mono e di e triglicerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento formadores de filme adequados para aplicação por técnicas

56 / 95 de leito fluidizado são dados em GB 1483591.

[00198] O granulado pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais. Cada enzima estará então presente em mais grânulos assegurando uma distribuição mais uniforme das enzimas e também reduz a segregação física de diferentes enzimas devido a diferentes tamanhos de partículas. Métodos para produção de cogranulados de múltiplas enzimas são divulgados na divulgação de ip.com IPCOM000200739D.

[00199] Outro exemplo de formulação de enzimas pelo uso de cogranulados é divulgado em WO 2013/188331.

[00200] A presente invenção se relaciona também com enzimas protegidas preparadas de acordo com o método divulgado em EP 238.216.

[00201] As composições ou dietas de ração animal têm um conteúdo de proteína relativamente elevado. As dietas de aves domésticas e porcos podem ser caracterizadas como indicado na Tabela B de WO 01/58275, colunas 2-3. As dietas de peixes podem ser caracterizadas como indicado na coluna 4 desta Tabela B. Além do mais, tais dietas de peixes têm usualmente um conteúdo de gordura em bruto de 200-310 g/kg.

[00202] Uma composição de ração animal de acordo com a invenção tem um conteúdo de proteína em bruto de 50-800 g/kg e, além disso, compreende um ou mais probióticos e um ou mais polipeptídeos tendo atividade de muramidase como descrito aqui.

[00203] Além do mais, ou alternativamente (ao conteúdo de proteína em bruto indicado acima), a composição de ração animal da invenção tem um conteúdo de energia metabolizável de 10-30 MJ/kg; e/ou um conteúdo de cálcio de 0,1-200 g/kg; e/ou um conteúdo de fósforo disponível de 0,1-200 g/kg; e/ou um conteúdo de metionina de 0,1-100 g/kg; e/ou um conteúdo de metionina mais cisteína de 0,1-150 g/kg; e/ou um conteúdo de lisina de 0,5-50 g/kg.

[00204] Em modalidades particulares, o conteúdo de energia

57 / 95 metabolizável, proteína em bruto, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais cisteína e/ou lisina está dentro de qualquer uma das gamas 2, 3, 4 ou 5 na Tabela B de WO 01/58275 (R. 2-5).

[00205] A proteína em bruto é calculada como nitrogênio (N) multiplicado por um fator 6,25, i.e., proteína em bruto (g/kg) = N (g/kg) x 6,25. O conteúdo de nitrogênio é determinado pelo método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14a ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

[00206] A energia metabolizável pode ser calculada com base na publicação NRC Nutrient requirements in swine, nona edição revista 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., pp. 2-6, e a European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Países Baixos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN, 90- 71463-12-5.

[00207] O conteúdo na dieta de cálcio, fósforo disponível e aminoácidos em dietas animais completas é calculado com base em tabelas de rações tais como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN, 90-72839-13-7.

[00208] Em uma modalidade particular, a composição de ração animal da invenção contém pelo menos uma proteína vegetal como definido acima.

[00209] A composição de ração animal da invenção pode também conter proteína animal, tal como Farelo de Carne e Ossos, Farelo de penas e/ou Farelo de Peixe, tipicamente em uma quantidade de 0-25%. A composição de ração animal da invenção pode também compreender Grãos Secos Destilados com Solúveis (DDGS), tipicamente em quantidades de 0-30%.

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[00210] Ainda em modalidades adicionais particulares, a composição de ração animal da invenção contém 0-80% de milho; e/ou 0-80% de sorgo; e/ou 0-70% de trigo; e/ou 0-70% de Cevada; e/ou 0-30% de aveia; e/ou 0- 40% de farelo de soja; e/ou 0-25% de farelo de peixe; e/ou 0-25% de farelo de carne e ossos; e/ou 0-20% de soro de leite.

[00211] A ração animal pode compreender proteínas vegetais. Em modalidades particulares, o conteúdo de proteína das proteínas vegetais é pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% (p/p). As proteínas vegetais podem ser derivadas de fontes de proteínas vegetais, tais como leguminosas e cereais, por exemplo, materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae e Poaceae, tais como farelo de soja, farelo de tremoço, farelo de colza e suas combinações.

[00212] Em uma modalidade particular, a fonte de proteínas vegetais é material de uma ou mais plantas da família Fabaceae, por exemplo, soja, tremoço, ervilha ou feijão. Em outra modalidade particular, a fonte de proteínas vegetais é material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, por exemplo, beterraba, beterraba-sacarina, espinafre ou quinoa. Outros exemplos de fontes de proteínas vegetais são colza e couve. Em outra modalidade particular, a soja é uma fonte de proteína vegetal preferencial. Outros exemplos de fontes de proteínas vegetais são cereais tais como cevada, trigo, centeio, aveia, milho, arroz e sorgo.

[00213] As dietas animais podem, por exemplo, ser fabricadas como ração em purê (não peletizada) ou ração peletizada. Tipicamente, os gêneros alimentares moídos são misturados e quantidades suficientes de vitaminais e minerais essenciais são adicionadas de acordo com as especificações para a espécie em questão. As enzimas podem ser adicionadas como formulações de enzimas sólidas ou líquidas. Por exemplo, para ração em purê uma formulação de enzima sólida ou líquida pode ser adicionada antes do ou durante o passo de mistura de ingredientes. Para ração peletizada, a

59 / 95 preparação de enzima muramidase (líquida ou sólida) pode ser também adicionada antes do ou durante o passo de ingredientes da ração.

[00214] Em outra modalidade, a composição compreende um ou mais dos polipeptídeos da invenção, um ou mais agentes de formulação e um ou mais enzimas adicionais. Em uma modalidade, a composição compreende um ou mais dos polipeptídeos da invenção, um ou mais agentes de formulação e um ou mais microrganismos. Em uma modalidade, a composição compreende um ou mais dos polipeptídeos da invenção, um ou mais agentes de formulação e uma ou mais vitaminas. Em uma modalidade, a composição compreende um ou mais dos polipeptídeos da invenção e um ou mais minerais. Em uma modalidade, a composição compreende o polipeptídeo da invenção, um ou mais agentes de formulação e um ou mais aminoácidos. Em uma modalidade, a composição compreende um ou mais dos polipeptídeos da invenção, um ou mais agentes de formulação e um ou mais de outros ingredientes da ração.

[00215] Em uma modalidade adicional, a composição compreende um ou mais dos polipeptídeos da invenção, um ou mais agentes de formulação e um ou mais componentes selecionados da lista consistindo em uma ou mais enzimas adicionais, um ou mais micróbios; uma ou mais vitaminas; um ou mais minerais; um ou mais aminoácidos; um ou mais de outros ingredientes da ração.

[00216] A concentração final de muramidase na dieta está dentro da gama de 0,01-200 ppm de proteína enzimática por kg de ração animal, tal como 0,1 a 150 ppm, 0,5 a 100 ppm, 1 a 75 ppm, 2 a 50 ppm, 3 a 25 ppm, 2 a 80 ppm, 5 a 60 ppm, 8 a 40 ppm ou 10 a 30 ppm de proteína enzimática por kg de ração animal ou qualquer combinação destes intervalos.

[00217] Em uma modalidade particular, o aditivo de ração animal da invenção se destina a estar incluído (ou prescrito como tendo de estar incluído) em dietas ou ração animais a níveis de 0,01 a 10,0%; mais

60 / 95 particularmente 0,05 a 5,0%; ou 0,2 a 1,0% (significando % g de aditivo por 100 g de ração). Isto é assim em particular para pré-misturas.

[00218] Em outra modalidade, as composições descritas aqui incluem opcionalmente uma ou mais enzimas. As enzimas podem ser classificadas com base no manual Enzyme Nomenclature de NC-IUBMB, 1992, ver também o site ENZYME na internet: http://www.expasy.ch/enzyme/. ENZYME é um repositório de informação em relação à nomenclatura de enzimas. É principalmente baseado nas recomendações do Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUB-MB), Academic Press, Inc., 1992, e descreve cada tipo de enzima caracterizada para a qual um número de EC (Enzyme Commission) foi proporcionado (Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28: 304-305). Esta nomenclatura IUB-MB Enzyme é baseada na sua especificidade pelo substrato e ocasionalmente no seu mecanismo molecular; uma tal classificação não reflete as características estruturais destas enzimas.

[00219] Uma outra classificação de certas enzimas de glicosídeo hidrolase, tais como endoglucanase, galactanase, mananase, dextranase, muramidase e galactosidase, é descrita em Henrissat et al, “The carbohydrate- active enzymes database (CAZy) in 2013”, Nucl. Acids Res. (1 de janeiro de 2014) 42 (D1): D490-D495; ver também www.cazy.org.

[00220] Assim, a composição da invenção pode também compreender pelo menos uma outra enzima selecionada do grupo compreendendo acetilxilana esterase (EC 3.1.1.23), acilglicerol lipase (EC 3.1.1.72), alfa- amilase (EC 3.2.1.1), beta-amilase (EC 3.2.1.2), arabinofuranosidase (EC

3.2.1.55), celobio-hidrolases (EC 3.2.1.91), celulase (EC 3.2.1.4), feruloil esterase (EC 3.1.1.73), galactanase (EC 3.2.1.89), alfa-galactosidase (EC

3.2.1.22), beta-galactosidase (EC 3.2.1.23), beta-glucanase (EC 3.2.1.6), beta- glucosidase (EC 3.2.1.21), triacilglicerol lipase (EC 3.1.1.3), lisofosfolipase (EC 3.1.1.5), muramidase (EC 3.2.1.17), alfa-manosidase (EC 3.2.1.24), beta-

61 / 95 manosidase (mananase) (EC 3.2.1.25), fitase (EC 3.1.3.8, EC 3.1.3.26, EC

3.1.3.72), fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32), fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4), fosfolipase D (EC 3.1.4.4), pululanase (EC 3.2.1.41), pectinesterase (EC

3.1.1.11), beta-xilosidase (EC 3.2.1.37) ou qualquer sua combinação.

[00221] Em uma modalidade particular, a composição da invenção compreende uma galactanase (EC 3.2.1.89) e uma beta-galactosidase (EC

3.2.1.23).

[00222] Em uma modalidade particular, a composição da invenção compreende uma fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26). Exemplos de fitases comercialmente disponíveis incluem Bio-FeedTM Phytase (Novozymes), Ronozyme® P, Ronozyme® NP e Ronozyme® HiPhos (DSM Nutritional Products), NatuphosTM (BASF), NatuphosTM E (BASF), Finase® e Quantum® Blue (AB Enzymes), OptiPhos® (Huvepharma), AveMix® Phytase (Aveve Biochem), Phyzyme® XP (Verenium/DuPont) e Axtra® PHY (DuPont). Outras fitases preferenciais incluem aquelas descritas em, por exemplo, WO 98/28408, WO 00/43503 e WO 03/066847.

[00223] Em uma modalidade particular, a composição da invenção compreende uma alfa-amilase (EC 3.2.1.1). Exemplos de alfa-amilases comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® A e RONOZYME® RumiStar™ (DSM Nutritional Products).

[00224] Em uma modalidade, a composição da invenção compreende um produto de enzima multicompetente, tal como FRA® Octazyme (Framelco), Ronozyme® G2, Ronozyme® VP e Ronozyme® MultiGrain (DSM Nutritional Products), Rovabio® Excel ou Rovabio® Advance (Adisseo). Eubióticos

[00225] Os eubióticos são compostos que são desenhados para dar um equilíbrio saudável da microflora no trato gastrointestinal. Os eubióticos abrangem um número de aditivos de ração diferentes, tais como probióticos,

62 / 95 prebióticos, fitogênicos (óleos essenciais) e ácidos orgânicos que são descritos em mais detalhe em baixo. Fitogênicos

[00226] Os fitogênicos são um grupo de promotores de crescimento natural ou promotores de crescimento não antibióticos usados como aditivos de ração, derivados de ervas, especiarias ou outras plantas. Os fitogênicos podem ser substâncias únicas preparadas a partir de óleos essenciais/extratos, óleos essenciais/extratos, plantas únicas e mistura de plantas (produtos herbáceos) ou mistura de óleos essenciais/extratos/plantas (produtos especializados).

[00227] Exemplos de fitogênicos são alecrim, sálvia, orégano, tomilho, cravo e erva-limão. Exemplos de óleos essenciais são timol, eugenol, metacresol, vanilina, salicilato, resorcina, guajacol, gingerol, óleo de lavanda, iononas, irona, eucaliptol, mentol, óleo de hortelã-pimenta, alfa-pineno; limoneno, anetol, linalol, di-hidrojasmonato de metila, carvacrol, ácido propiônico/propionato, ácido acético/acetato, ácido butírico/butirato, óleo de alecrim, óleo de cravo, geraniol, terpineol, citronelol, salicilato de amila e/ou benzila, cinamaldeído, polifenol de planta (tanino), extrato de açafrão e curcuma.

[00228] Em uma modalidade, a quantidade de fitogênicos é 0,001% a 10% em peso da composição. Exemplos de produtos comerciais são Crina® (DSM Nutritional Products); CinergyTM, BiacidTM, ProHacidTM Classic e ProHacidTM AdvanceTM (todos Promivi/Cargill) e Envivo EO (DuPont Animal Nutrition). Ácidos Orgânicos

[00229] Os ácidos orgânicos (C1-C7) são amplamente distribuídos na natureza como constituintes normais de plantas ou tecidos animais. São também formados através de fermentação microbiana de carboidratos maioritariamente no intestino grosso. São frequentemente usados na produção

63 / 95 de suínos e aves domésticas como uma substituição de promotores de crescimento antibiótico uma vez que têm um efeito preventivo nos problemas intestinais como enterite necrótica em galinhas e infecção por Escherichia coli em porcos jovens. Os ácidos orgânicos podem ser vendidos como monocomponentes ou misturas de tipicamente 2 ou 3 ácidos orgânicos diferentes. Exemplos de ácidos orgânicos são ácidos graxos de cadeia curta (por exemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico), ácidos graxos de cadeia média (por exemplo, ácido caproico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico), ácidos di/tri-carboxílicos (por exemplo, ácido fumárico), hidroxiácidos (por exemplo, ácido láctico), ácidos aromáticos (por exemplo, ácido benzoico), ácido cítrico, ácido sórbico, ácido málico e ácido tartárico ou seu sal (tipicamente sal de sódio ou potássio tal como diformato de potássio ou butirato de sódio).

[00230] Em uma modalidade, a quantidade de ácido orgânico é 0,001% a 10% em peso da composição. Exemplos de produtos comerciais são VevoVitall® (DSM Nutritional Products), Amasil®, Luprisil®, Lupro-Grain®, Lupro-Cid®, Lupro-Mix® (BASF), n-Butyric Acid AF (OXEA) e Adimix Precision (Nutriad). Pré-mistura

[00231] A incorporação da composição de aditivos de ração como exemplificado anteriormente a rações animais, por exemplo rações de aves domésticas, é na prática levada a cabo usando um concentrado ou uma pré- mistura. Uma pré-mistura designa uma mistura preferencialmente uniforme de um ou mais microingredientes com diluente e/ou transportador. As pré- misturas são usadas para facilitar a dispersão uniforme de microingredientes em uma mistura maior. Uma pré-mistura de acordo com a invenção pode ser adicionada aos ingredientes de ração ou à água potável como sólidos (por exemplo como pó solúvel em água) ou líquidos. Aminoácidos

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[00232] A composição da invenção pode compreender adicionalmente um ou mais aminoácidos. Exemplos de aminoácidos que são usados em ração animal são lisina, alanina, beta-alanina, treonina, metionina e triptofano. Em uma modalidade, a quantidade de aminoácido é 0,001% a 10% em peso da composição. Vitaminas e Minerais

[00233] Em outra modalidade, a ração animal pode incluir uma ou mais vitaminas, tal como uma ou mais vitaminas solúveis em gordura e/ou uma ou mais vitaminas solúveis em água. Em outra modalidade, a ração animal pode incluir opcionalmente um ou mais minerais, tal como um ou mais minerais vestigiais e/ou um ou mais macrominerais.

[00234] Usualmente, as vitaminas solúveis em gordura e água, bem como os minerais vestigiais, formam parte de uma denominada pré-mistura destinada à adição à ração, embora os macrominerais sejam normalmente adicionados separadamente à ração.

[00235] Exemplos não limitantes de vitaminas solúveis em gordura incluem vitamina A, vitamina D3, vitamina E, e vitamina K, por exemplo, vitamina K3.

[00236] Exemplos não limitantes de vitaminas solúveis em água incluem vitamina C, vitamina B12, biotina e colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo, Ca-D- pantotenato.

[00237] Exemplos não limitantes de minerais vestigiais incluem boro, cobalto, cloreto, crômio, cobre, flúor, iodo, ferro, manganês, molibdênio, iodo, selênio e zinco.

[00238] Exemplos não limitantes de macrominerais incluem cálcio, magnésio, fósforo, potássio e sódio.

[00239] Em uma modalidade, a quantidade de vitaminas é 0,001% a 10% em peso da composição. Em uma modalidade, a quantidade de minerais

65 / 95 é 0,001% a 10% em peso da composição.

[00240] Os requisitos nutricionais destes componentes (exemplificadas com ave domésticas e leitões/porcos) são listados na Tabela A de WO 01/58275. Requisito nutricional significa que estes componentes devem ser proporcionados na dieta nas concentrações indicadas.

[00241] Em alternativa, o aditivo de ração animal da invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados na Tabela A de WO 01/58275. Pelo menos um significa qualquer um de, um ou mais do que, um ou dois ou três ou quatro e assim por diante até todos os treze, ou até todos os quinze, componentes individuais. Mais especificamente, este pelo menos um componente individual é incluído no aditivo da invenção em uma tal quantidade de modo a proporcionar uma concentração na ração dentro da gama indicada na coluna quatro ou coluna cinco ou coluna seis da Tabela A.

[00242] Em uma modalidade ainda adicional, o aditivo de ração animal da invenção compreende pelo menos uma das vitaminas em baixo, preferencialmente para proporcionar uma concentração em ração dentro das gamas especificadas na Tabela 1 em baixo (para dietas de leitões e dietas de frangos de corte, respectivamente). Tabela 1: Recomendações típicas de vitaminas Vitamina Dieta de leitões Dieta de frangos de corte Vitamina A 10,000-15,000 IU/kg de ração 8 a 12,500 IU/kg de ração Vitamina D3 1800-2000 IU/kg de ração 3000-5000 IU/kg de ração Vitamina E 60-100 mg/kg de ração 150-240 mg/kg de ração Vitamina K3 2-4 mg/kg de ração 2-4 mg/kg de ração Vitamina B1 2-4 mg/kg de ração 2-3 mg/kg de ração Vitamina B2 6-10 mg/kg de ração 7-9 mg/kg de ração Vitamina B6 4-8 mg/kg de ração 3-6 mg/kg de ração Vitamina B12 0,03-0,05 mg/kg de ração 0,015-0,04 mg/kg de ração Niacina (Vitamina B3) 30-50 mg/kg de ração 50-80 mg/kg de ração Ácido pantotênico 20-40 mg/kg de ração 10-18 mg/kg de ração Ácido fólico 1-2 mg/kg de ração 1-2 mg/kg de ração Biotina 0,15-0,4 mg/kg de ração 0,15-0,3 mg/kg de ração Cloreto de colina 200-400 mg/kg de ração 300-600 mg/kg de ração Outros ingredientes de ração

[00243] A composição da invenção pode compreender adicionalmente agentes corantes adicionais, estabilizantes, aditivos de melhoramento do

66 / 95 crescimento e compostos de aroma/aromatizantes, ácidos graxos polinsaturados (PUFA); espécies geradoras de oxigênio reativo, antioxidantes, peptídeos antimicrobianos, polipeptídeos antifúngicos e compostos de gerenciamento de micotoxina.

[00244] Exemplos de compostos de aroma/aromatizantes são creosol, anetol, deca-, undeca- e/ou dodeca-lactonas, iononas, irona, gingerol, piperidina, ftalídeo de propilideno, ftalídeo de butilideno, capsaícina e tanina.

[00245] Exemplos de peptídeos antimicrobianos (AMP) são CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina e Ovispirina tal como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), Plectasinas e Estatinas, incluindo os compostos e polipeptídeos divulgados em WO 03/044049 e WO 03/048148, bem como variantes ou fragmentos dos acima que retenham atividade antimicrobiana.

[00246] Exemplos de polipeptídeos antifúngicos (AFP) são os peptídeos de Aspergillus giganteus e Aspergillus niger, bem como suas variantes e fragmentos que retêm atividade antifúngica, como divulgado em WO 94/01459 e WO 02/090384.

[00247] Exemplos de ácidos graxos polinsaturados são ácidos graxos polinsaturados C18, C20 e C22, tais como ácido araquidônico, ácido docoso- hexaenoico, ácido eicosapentaenoico e ácido gama-linoleico.

[00248] Exemplos de espécies geradoras de oxigênio reativo são produtos químicos como perborato, persulfato ou percarbonato; e enzimas como uma oxidase, uma oxigenase ou uma sintetase.

[00249] Os antioxidantes podem ser usados para limitar o número de espécies reativas de oxigênio que podem ser geradas tal que o nível de espécies reativas de oxigênio esteja em equilíbrio com os antioxidantes.

[00250] As micotoxinas, tais como deoxinivalenol, aflatoxina, zearalenona e fumonisina, podem ser encontradas na ração animal e podem resultar em desempenho animal negativo ou doença. Compostos que podem

67 / 95 gerir os níveis de micotoxina, tal como através de desativação da micotoxina ou através da ligação da micotoxina, podem ser adicionados à ração para melhorar estes efeitos negativos. Exemplos de compostos de gestão de micotoxina são Vitafix®, Vitafix Ultra (Nuscience), Mycofix®, Mycofix® Secure, FUMzyme®, Biomin® BBSH, Biomin® MTV (Biomin), Mold-Nil®, Toxi-Nil® e Unike® Plus (Nutriad). Métodos de Preparação de uma Ração Animal

[00251] Em um quinto aspecto, a invenção se relaciona com um método de preparação da ração animal do primeiro aspecto, compreendendo os passos de: (a) mistura de um aditivo de ração animal com uma ou mais fontes de proteína e uma ou mais fontes de energia; (b) opcionalmente tratamento com vapor da ração animal de (a) seguido por prensagem da mistura tratada com vapor para formar péletes; e (c) opcionalmente pulverização de uma formulação líquida sobre a ração animal de (a) ou (b).

[00252] Em uma modalidade, o polipeptídeo tendo atividade de muramidase e o pelo menos um probiótico são adicionados no passo (a). Em uma modalidade, o polipeptídeo tendo atividade de muramidase é adicionado no passo (c) e o pelo menos um probiótico são adicionados no passo (a).

[00253] Em uma modalidade, a ração animal é peletizada por tratamento com vapor da mistura de (a) para se obter um conteúdo de umidade abaixo de 20% em peso da mistura e prensagem da mistura tratada com vapor para formar péletes. Em uma modalidade, a ração animal é peletizada por tratamento com vapor da mistura de (a) para se obter um conteúdo de umidade abaixo de 20% em peso da mistura em que o tratamento com vapor é entre 60 °C e 100 °C quando medido à saída do condicionador e prensagem a mistura tratada com vapor para formar péletes. Em uma

68 / 95 modalidade, o tempo de residência total no passo b) é entre 1 segundo e 10 minutos. Em uma modalidade, a temperatura dos péletes após peletização da mistura tratada com vapor é entre 70 °C e 105 °C. Modalidades Preferenciais da Invenção

[00254] 1. Um aditivo de ração animal compreendendo um ou mais probióticos e um ou mais polipeptídeos fúngicos tendo atividade de muramidase.

[00255] 2. A ração animal da modalidade 1, em que o polipeptídeo tendo atividade de muramidase é uma muramidase GH24 ou muramidase GH25 fúngica.

[00256] 3. O aditivo de ração animal de qualquer uma das modalidades 1 a 2, em que o probiótico é selecionado do grupo consistindo em um Lactobacillus, uma Bifidobacterium, uma Saccharomyces, um Enterococcus, um Streptococcus, um Pediococcus, um Leuconostoc, um Lactococcus, um Oenococcus, um Bacillus, Carnobacterium, Propionibacterium, Clostridium, Megasphaera e uma Escherichia ou suas combinações.

[00257] 4. O aditivo de ração animal de qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que o polipeptídeo tendo atividade de muramidase degrada os resíduos da parede celular de Lactobacillus johnsonii.

[00258] 5. O aditivo de ração animal de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que o polipeptídeo tendo atividade de muramidase é selecionado do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 1; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo

69 / 95 menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 3; (d) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 4; (e) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 5; (f) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 6; (g) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 7; (h) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 8; (i) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 9; (j) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 10; (k) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 11; (l) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 12;

70 / 95

(m) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 13; (n) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 14; (o) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 15; (p) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 16; (q) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 17; (r) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 18; (s) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 19; (t) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 20; (u) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 21; (v) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de

71 / 95 sequências com a SEQ ID NO: 22; (w) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 23; (x) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 24; (y) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 25; (z) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 26; (aa) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 27; (ab) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 28; (ac) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 29; (ad) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 30; (ae) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 31; (af) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo,

72 / 95 pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 32; (ag) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 33; (ah) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 34; (ai) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 35; (aj) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 36; (ak) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 37; (al) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 38; (am) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 39; (an) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 40; (ao) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 41;

73 / 95

(ap) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 42; (aq) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 43; (ar) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 44; (as) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 45; (at) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 46; (au) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 47; (av) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 48; (aw) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 49; (ax) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 50; (ay) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade

74 / 95 de sequências com a SEQ ID NO: 51; (az) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 52; (ba) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 53; (bb) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 54; (bc) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 55; (bd) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 56; (be) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 57; (bf) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 58; (bg) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 59; (bh) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 60; (bi) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo,

75 / 95 pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 61; (bj) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 62; (bk) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 63; (bl) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 64; (bm) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 65; (bn) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 66; (bo) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 67; (bp) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 68; (bq) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 69; (br) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 70;

76 / 95

(bs) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 71; (bt) uma variante da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 ou SEQ ID NO: 71 compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos (preferencialmente substituições conservativas), e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 posições; (bu) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (a), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc), (d l), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (m l), (bn), (bo), (bp), (bq), (l), (s l) ou (t l) e uma extensão N-terminal e/ou C-

77 / 95 terminal dentre 1 e 10 aminoácidos; e (bv) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (a), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc), (d l), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (m l), (bn), (bo), (bp), (bq), (l), (s l) ou (t l) tendo atividade de muramidase e tendo pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro.

[00259] 6. O aditivo de ração animal de qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que o probiótico é selecionado do grupo consistindo em Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Enterococcus faecium, Enterococcus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminus, lactobacillus rhamnosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Megasphaera elsdenii, e Propionibacteria sp.

[00260] 7. O aditivo de ração animal de qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que o probiótico é selecionado do grupo consistindo em uma combinação de um ou mais Lactobacillus e uma ou mais Saccharomyces, um ou mais Lactobacillus e um ou mais Streptococcus, um ou mais Lactobacillus e um ou mais Bacillus, um ou mais Lactobacillus e uma ou mais Bifidobacterium, uma ou mais Saccharomyces e um ou mais Streptococcus, uma ou mais Saccharomyces e um ou mais Bacillus, uma ou mais Saccharomyces e uma ou mais Bifidobacterium, uma ou mais Saccharomyces e um ou mais Bacillus, um ou mais Streptococcus e uma ou mais Bifidobacterium, um ou mais Streptococcus e um ou mais Bacillus, um ou

78 / 95 mais Bacillus e uma ou mais Bifidobacterium.

[00261] 8. O aditivo de ração animal de qualquer uma das modalidades 1 a 7, para adição a uma fonte de proteína em que a fonte de proteína é selecionada do grupo consistindo em soja, soja selvagem, feijões, tremoço, feijão tepário, feijão escarlate, feijão slimjim, feijão de lima, feijão francês, feijão-fava, grão de bico, lentilha, amendoim, amendoim espanhol, canola, semente de girassol, semente de algodão, semente de colza (colza) ou ervilha ou em uma forma processada tal como farelo de soja, farelo de soja integral, concentrado de proteína de soja (SPC), farelo de soja fermentado (FSBM), farelo de girassol, farelo de semente de algodão, farelo de colza, farelo de peixe, farelo de osso, farelo de penas, soro de leite ou qualquer sua combinação.

[00262] 9. O aditivo de ração animal de qualquer uma das modalidades 1 a 8, para adição a uma fonte de energia em que a fonte de energia é selecionada do grupo consistindo em milho, sorgo, cevada, trigo, aveia, arroz, triticale, centeio, beterraba, beterraba-sacarina, espinafre, batata, mandioca, quinoa, repolho, switchgrass, milheto, milheto-pérola, milheto foxtail ou em uma forma processada tal como milho moído, amido de batata, amido de mandioca, sorgo moído, switchgrass moída, milheto moído, milheto foxtail moído, milheto-pérola moído ou qualquer sua combinação.

[00263] 10. O aditivo de ração animal de qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o aditivo de ração animal compreende adicionalmente um ou mais componentes selecionados da lista consistindo em: uma ou mais enzimas adicionais; um ou mais micróbios; uma ou mais vitaminas; um ou mais minerais; um ou mais aminoácidos; e

79 / 95 um ou mais outros ingredientes de ração.

[00264] 11. O aditivo de ração animal de qualquer uma das modalidades 1 a 10, em que o polipeptídeo tendo atividade de muramidase é formulado como um grânulo.

[00265] 12. Um método para melhoria do fator de eficiência de produção europeu (EPEF), ganho de peso corporal (BWG) e/ou razão de conversão de ração (FCR) de um animal monogástrico compreendendo: (a) preparação do aditivo de ração animal de qualquer uma das modalidades 1 a 11; e (b) proporcionar do aditivo de ração animal ao animal monogástrico.

[00266] 13. Uso de pelo menos um probiótico em combinação com um polipeptídeo tendo atividade de muramidase em uma composição de ração para melhoria da razão de conversão de ração e/ou ganho de peso diário e/ou para a modulação da flora intestinal e/ou para melhoria da biodisponibilidade do probiótico, em que o polipeptídeo tendo atividade de muramidase é uma muramidase GH24 ou muramidase GH25 fúngica e em que o probiótico é selecionado do grupo consistindo em um Lactobacillus, uma Bifidobacterium, uma Saccharomyces, um Enterococcus, um Streptococcus, um Pediococcus, um Leuconostoc, um Lactococcus, um Oenococcus, um Bacillus, Carnobacterium, Propionibacterium, Clostridium, Megasphaera e uma Escherichia ou suas combinações.

[00267] 14. Uma composição de ração ou uma composição de pré- mistura, ou um aditivo de ração para animais, compreendendo pelo menos um polipeptídeo tendo atividade de muramidase e pelo menos um probiótico, em que o polipeptídeo tendo atividade de muramidase é uma muramidase GH24 ou muramidase GH25 fúngica e em que o probiótico é selecionado do grupo consistindo em um Lactobacillus, uma Bifidobacterium, uma Saccharomyces, um Enterococcus, um Streptococcus, um Pediococcus, um Leuconostoc, um

80 / 95 Lactococcus, um Oenococcus, um Bacillus, Carnobacterium, Propionibacterium, Clostridium, Megasphaera e uma Escherichia ou suas combinações.

[00268] 15. Uma ração animal compreendendo um aditivo de ração animal, uma ou mais fontes de proteína e uma ou mais fontes de energia caracterizada por a ração animal compreender adicionalmente um ou mais probióticos e um ou mais polipeptídeos fúngicos tendo atividade de muramidase.

[00269] 16. A ração animal da modalidade 15, ou aditivo de ração animal da reivindicação 2, em que o polipeptídeo tendo atividade de muramidase é uma muramidase GH24 ou muramidase GH25 fúngica.

[00270] 17. A ração animal de qualquer uma das modalidades 15 a 16, em que o probiótico é selecionado do grupo consistindo em um Lactobacillus, uma Bifidobacterium, uma Saccharomyces, um Enterococcus, um Streptococcus, um Pediococcus, um Leuconostoc, um Lactococcus, um Oenococcus, um Bacillus, Carnobacterium, Propionibacterium, Clostridium, Megasphaera e uma Escherichia ou suas combinações.

[00271] 18. A ração animal de qualquer uma das modalidades 15 a 17, em que o polipeptídeo tendo atividade de muramidase degrada os resíduos da parede celular de Lactobacillus johnsonii.

[00272] 19. A ração animal de qualquer uma das reivindicações 15 a 18, em que o polipeptídeo tendo atividade de muramidase é selecionado do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 1; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 2;

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(c) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 3; (d) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 4; (e) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 5; (f) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 6; (g) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 7; (h) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 8; (i) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 9; (j) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 10; (k) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 11; (l) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de

82 / 95 sequências com a SEQ ID NO: 12; (m) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 13; (n) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 14; (o) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 15; (p) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 16; (q) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 17; (r) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 18; (s) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 19; (t) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 20; (u) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 21; (v) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo

83 / 95 menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 22; (w) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 23; (x) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 24; (y) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 25; (z) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 26; (aa) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 27; (ab) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 28; (ac) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 29; (ad) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 30; (ae) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 31;

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(af) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 32; (ag) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 33; (ah) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 34; (ai) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 35; (aj) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 36; (ak) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 37; (al) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 38; (am) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 39; (an) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 40; (ao) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade

85 / 95 de sequências com a SEQ ID NO: 41; (ap) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 42; (aq) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 43; (ar) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 44; (as) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 45; (at) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 46; (au) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 47; (av) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 48; (aw) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 49; (ax) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 50; (ay) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo,

86 / 95 pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 51; (az) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 52; (ba) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 53; (bb) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 54; (bc) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 55; (bd) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 56; (be) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 57; (bf) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 58; (bg) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 59; (bh) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 60;

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(bi) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 61; (bj) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 62; (bk) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 63; (bl) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 64; (bm) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 65; (bn) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 66; (bo) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 67; (bp) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 68; (bq) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 69; (br) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade

88 / 95 de sequências com a SEQ ID NO: 70; (bs) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 71; (bt) uma variante da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 ou SEQ ID NO: 71 compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos (preferencialmente substituições conservativas), e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 posições; (bu) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (a), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc), (d l), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (m l),

89 / 95 (bn), (bo), (bp), (bq), (l), (s l) ou (t l) e uma extensão N-terminal e/ou C- terminal dentre 1 e 10 aminoácidos; e (bv) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (a), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc), (d l), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (m l), (bn), (bo), (bp), (bq), (l), (s l) ou (t l) tendo atividade de muramidase e tendo pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro.

[00273] 1. A ração animal de qualquer uma das modalidades 15 a 19, em que o probiótico é selecionado do grupo consistindo em Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Enterococcus faecium, Enterococcus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminus, lactobacillus rhamnosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Megasphaera elsdenii, e Propionibacteria sp.

[00274] 2. A ração animal de qualquer uma das modalidades 15 a 20, em que o probiótico é selecionado do grupo consistindo em uma combinação de um ou mais Lactobacillus e uma ou mais Saccharomyces, um ou mais Lactobacillus e um ou mais Streptococcus, um ou mais Lactobacillus e um ou mais Bacillus, um ou mais Lactobacillus e uma ou mais Bifidobacterium, uma ou mais Saccharomyces e um ou mais Streptococcus, uma ou mais Saccharomyces e um ou mais Bacillus, uma ou mais Saccharomyces e uma ou mais Bifidobacterium, uma ou mais Saccharomyces e um ou mais Bacillus, um ou mais Streptococcus e uma ou mais Bifidobacterium, um ou mais

90 / 95 Streptococcus e um ou mais Bacillus, um ou mais Bacillus e uma ou mais Bifidobacterium.

[00275] 3. A ração animal de qualquer uma das modalidades 15 a 21, em que a fonte de proteína é selecionada do grupo consistindo em soja, soja selvagem, feijões, tremoço, feijão tepário, feijão escarlate, feijão slimjim, feijão de lima, feijão francês, feijão-fava, grão de bico, lentilha, amendoim, amendoim espanhol, canola, semente de girassol, semente de algodão, semente de colza (colza) ou ervilha ou em uma forma processada tal como farelo de soja, farelo de soja integral, concentrado de proteína de soja (SPC), farelo de soja fermentado (FSBM), farelo de girassol, farelo de semente de algodão, farelo de colza, farelo de peixe, farelo de osso, farelo de penas, soro de leite ou qualquer sua combinação.

[00276] 4. A ração animal de qualquer uma das modalidades 15 a 22, em que a fonte de energia é selecionada do grupo consistindo em milho, sorgo, cevada, trigo, aveia, arroz, triticale, centeio, beterraba, beterraba- sacarina, espinafre, batata, mandioca, quinoa, repolho, switchgrass, milheto, milheto-pérola, milheto foxtail ou em uma forma processada tal como milho moído, amido de batata, amido de mandioca, sorgo moído, switchgrass moída, milheto moído, milheto foxtail moído, milheto-pérola moído ou qualquer sua combinação.

[00277] 5. A ração animal de qualquer uma das modalidades 15 a 23, em que o aditivo de ração animal compreende adicionalmente um ou mais componentes selecionados da lista consistindo em: uma ou mais enzimas adicionais; um ou mais micróbios; uma ou mais vitaminas; um ou mais minerais; um ou mais aminoácidos; e um ou mais outros ingredientes de ração.

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[00278] 1. A ração animal de qualquer uma das modalidades 15 a 24, em que o polipeptídeo tendo atividade de muramidase é formulado como um grânulo.

[00279] 2. Um método para melhoria do fator de eficiência de produção europeu (EPEF), ganho de peso corporal (BWG) e/ou razão de conversão de ração (FCR) de um animal monogástrico compreendendo: (a) preparação da ração animal de qualquer uma das modalidades 15 a 25; e b) fornecimento da ração animal ao animal monogástrico.

[00280] 1. Uso de pelo menos um probiótico em combinação com um polipeptídeo tendo atividade de muramidase em uma composição de ração para melhoria da razão de conversão de ração e/ou ganho de peso diário e/ou para a modulação da flora intestinal e/ou para melhoria da biodisponibilidade do probiótico, em que o polipeptídeo tendo atividade de muramidase é uma muramidase GH24 ou muramidase GH25 fúngica e em que o probiótico é selecionado do grupo consistindo em um Lactobacillus, uma Bifidobacterium, uma Saccharomyces, um Enterococcus, um Streptococcus, um Pediococcus, um Leuconostoc, um Lactococcus, um Oenococcus, um Bacillus, Carnobacterium, Propionibacterium, Clostridium, Megasphaera e uma Escherichia ou suas combinações.

[00281] 2. Uma composição de ração ou uma composição de pré- mistura, ou um aditivo de ração para animais, compreendendo pelo menos um polipeptídeo tendo atividade de muramidase e pelo menos um probiótico, em que o polipeptídeo tendo atividade de muramidase é uma muramidase GH24 ou muramidase GH25 fúngica e em que o probiótico é selecionado do grupo consistindo em um Lactobacillus, uma Bifidobacterium, uma Saccharomyces, um Enterococcus, um Streptococcus, um Pediococcus, um Leuconostoc, um Lactococcus, um Oenococcus, um Bacillus, Carnobacterium, Propionibacterium, Clostridium, Megasphaera e uma Escherichia ou suas

92 / 95 combinações.

[00282] 3. O aditivo de ração animal de qualquer uma das modalidades 1 a 10, em que o polipeptídeo tendo atividade de muramidase é selecionado do grupo consistindo em um polipeptídeo tendo pelo menos 85% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:1 e um polipeptídeo tendo pelo menos 85% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:2, tal como selecionado do grupo consistindo em um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:1 e um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:2, tal como selecionado do grupo consistindo em um polipeptídeo tendo pelo menos 95% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:1 e um polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:2, tal como selecionado do grupo consistindo em um polipeptídeo tendo pelo menos 98% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:1 e um polipeptídeo tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2, tal como selecionado do grupo consistindo em um polipeptídeo tendo pelo menos 99% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:1 e um polipeptídeo tendo pelo menos 99% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:2.

[00283] 4. A ração animal de qualquer uma das modalidades 15 a 24, em que o polipeptídeo tendo atividade de muramidase é selecionado do grupo consistindo em um polipeptídeo tendo pelo menos 85% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:1 e um polipeptídeo tendo pelo menos 85% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:2, tal como selecionado do grupo consistindo em um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:1 e um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:2, tal como selecionado do grupo consistindo em um polipeptídeo tendo pelo menos 95% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:1 e um polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:2, tal como selecionado do grupo

93 / 95 consistindo em um polipeptídeo tendo pelo menos 98% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:1 e um polipeptídeo tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2, tal como selecionado do grupo consistindo em um polipeptídeo tendo pelo menos 99% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:1 e um polipeptídeo tendo pelo menos 99% de identidade de sequências com a SEQ ID NO:2.

[00284] 5.

EXEMPLOS Exemplo 1: Determinação da Atividade de muramidase

[00285] A atividade de muramidase foi determinada por medição da diminuição (queda) na absorvância/densidade óptica de uma solução de Micrococcus lysodeikticus ATTC n.º 4698 suspensa (Sigma-Aldrich M3770) medida em um leitor de microplacas (Tecan Infinite M200) a 450 nm. Preparação de substrato de Micrococcus Iysodeikticus

[00286] Antes do uso, as células foram suspensas em água desionizada até uma concentração de 10 mg de células/mL e a absorvância/densidade ótica (OD) a 450 nm foi medida. A suspensão de células foi depois ajustada tal que a concentração de células no ensaio de turbidez (180 µL de tampão + 20 µL de amostra + 20 µL de substrato) igualasse uma OD450 = 1,0. A suspensão de células ajustada foi depois armazenada à temperatura ambiente antes do uso. As células suspensas foram usadas no espaço de 3 horas. Preparação de tampão de ácido cítrico – fosfato pH 4

[00287] 61,45 mL de ácido cítrico a 0,1 M foram misturados com 38,55 mL de hidrogenofosfato dissódico a 0,2 M, e o pH foi ajustado com ácido clorídrico ou hidróxido de sódio até pH 4. Medição da atividade antimicrobiana de muramidase no ensaio de turbidez

[00288] A amostra de muramidase a ser medida foi diluída até uma concentração de 50 mg de proteína enzimática/L em água desionizada e mantida em gelo até ao uso. Em uma placa de microtitulação de 96 poços

94 / 95 (Nunc) 180 µL de tampão de ácido cítrico - fosfato pH 4 e 20 μL da amostra de muramidase diluída foram adicionados e mantidos frios (5 °C). Para se iniciar a medição da atividade, 20 μL do substrato (Micrococcus Iysodeikticus) foram adicionados a cada poço, e a medição cinética de absorvância a 450 nm foi iniciada durante 1 hora a 37 °C em um leitor de microplacas. A absorvância medida a 450 nm foi monitorizada para cada poço e ao longo do tempo uma queda na absorvância foi vista se a muramidase tiver atividade de muramidase.

[00289] Após incubação, a atividade de muramidase contra Micrococcus Iysodeikticus foi determinada como Δ absorvância a 450 nm (valor inicial - valor final) de cada poço após 1 hora. A significância foi calculada usando o teste de Dunnett com nível p de teste de controle 0,05 em pacote de software estatístico JMP® versão 12.1.0 da SAS Institute Inc. Exemplo 2: Clonagem, Expressão e Purificação das Muramidases

[00290] As muramidases GH25 da SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2 foram clonadas e expressas como descrito no exemplo 2 de WO 2013/076253. A muramidase GH25 da SEQ ID NO: 3 pode ser clonada usando técnicas moleculares básicas (Ausubel et al., 2003, Curr. Prot. Mol. Biol., John Wiley & Sons, Cambridge, EUA; Christgau et al. 1995, Curr. Genet. 27, 135-141). A muramidase GH25 da SEQ ID NO: 4 pode ser clonada e expressa como descrito em WO2009/102755. A muramidase GH25 da SEQ ID NO: 5 foi clonada e expressa como descrito em WO2005/080559. As muramidases GH25 da SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 59 foram clonadas e expressas como descrito em PCT/CN2017/075978. As muramidases GH25 da SEQ ID NO: 60 a SEQ ID NO: 62 foram clonadas e expressas como descrito em PCT/CN2017/075960. As muramidases GH24 da SEQ ID NO: 63 a SEQ ID NO: 71 foram clonadas e expressas como descrito em WO2017/000922. Exemplo 3: Estudo de Digestibilidade

[00291] A digestibilidade de energia (AME) é significativamente

95 / 95 aumentada a partir do nível do controle negativo quando Balancius™ suplementa uma dieta de ração animal contendo probióticos em dietas compreendendo qualquer um de Cylactin® (DSM Nutritional Products), Alterion (Adisseo), Enviva PRO (DuPont Animal Nutrição) e GalliproMax®. Quando qualquer um dos DFM é suplementado com Balancius™ existe um aumento significativo na AME maior do que a soma do aumento da muramidase ou de qualquer um dos DFM sozinho.

Claims

1 / 13 REIVINDICAÇÕES

1. Ração animal que compreende um aditivo de ração animal, uma ou mais fontes de proteína e uma ou mais fontes de energia, caracterizada por a ração animal compreender adicionalmente um ou mais probióticos e um ou mais polipeptídeos fúngicos tendo atividade de muramidase.

2. Ração animal de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o polipeptídeo tendo atividade de muramidase ser uma muramidase GH24 ou muramidase GH25 fúngica.

3. Ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada por o probiótico ser selecionado do grupo consistindo em um Lactobacillus, uma Bifidobacterium, uma Saccharomyces, um Enterococcus, um Streptococcus, um Pediococcus, um Leuconostoc, um Lactococcus, um Oenococcus, um Bacillus, Carnobacterium, Propionibacterium, Clostridium, Megasphaera e uma Escherichia ou suas combinações.

4. Ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por o polipeptídeo tendo atividade de muramidase degradar os resíduos da parede celular de Lactobacillus johnsonii.

5. Ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por o polipeptídeo tendo atividade de muramidase ser selecionado do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 1; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 2;

2 / 13

3 / 13 sequências com a SEQ ID NO: 12; (m) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 13; (n) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 14; (o) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 15; (p) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 16; (q) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 17; (r) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 18; (s) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 19; (t) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 20; (u) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 21; (v) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo

4 / 13 menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 22; (w) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 23; (x) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 24; (y) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 25; (z) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 26; (aa) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 27; (ab) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 28; (ac) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 29; (ad) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 30; (ae) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 31;

5 / 13

6 / 13 de sequências com a SEQ ID NO: 41; (ap) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 42; (aq) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 43; (ar) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 44; (as) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 45; (at) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 46; (au) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 47; (av) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 48; (aw) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 49; (ax) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 50; (ay) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo,

7 / 13 pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 51; (az) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 52; (ba) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 53; (bb) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 54; (bc) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 55; (bd) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 56; (be) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 57; (bf) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 58; (bg) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 59; (bh) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 60;

8 / 13

9 / 13 de sequências com a SEQ ID NO: 70; (bs) um polipeptídeo tendo pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com a SEQ ID NO: 71; (bt) uma variante da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 ou SEQ ID NO: 71 compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos (preferencialmente substituições conservativas), e/ou uma ou mais deleções de aminoácidos, e/ou uma ou mais inserções de aminoácidos ou qualquer sua combinação em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 posições; (bu) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (a), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc), (d l), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (m l),

10 / 13 (bn), (bo), (bp), (bq), (l), (s l) ou (t l) e uma extensão N-terminal e/ou C- terminal dentre 1 e 10 aminoácidos; e (bv) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (a), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc), (d l), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (m l), (bn), (bo), (bp), (bq), (l), (s l) ou (t l) tendo atividade de muramidase e tendo pelo menos 90% do comprimento do polipeptídeo maduro.

6. Ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por o probiótico ser selecionado do grupo consistindo em Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Enterococcus faecium, Enterococcus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminus, lactobacillus rhamnosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Megasphaera elsdenii, e Propionibacteria sp.

7. Ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por o probiótico ser selecionado do grupo consistindo em uma combinação de um ou mais Lactobacillus e uma ou mais Saccharomyces, um ou mais Lactobacillus e um ou mais Streptococcus, um ou mais Lactobacillus e um ou mais Bacillus, um ou mais Lactobacillus e uma ou mais Bifidobacterium, uma ou mais Saccharomyces e um ou mais Streptococcus, uma ou mais Saccharomyces e um ou mais Bacillus, uma ou mais Saccharomyces e uma ou mais Bifidobacterium, uma ou mais Saccharomyces e um ou mais Bacillus, um ou mais Streptococcus e uma ou

11 / 13 mais Bifidobacterium, um ou mais Streptococcus e um ou mais Bacillus, um ou mais Bacillus e uma ou mais Bifidobacterium.

8. Ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada por a fonte de proteína ser selecionada do grupo consistindo em soja, soja selvagem, feijões, tremoço, feijão tepário, feijão escarlate, feijão slimjim, feijão de lima, feijão francês, feijão-fava, grão de bico, lentilha, amendoim, amendoim espanhol, canola, semente de girassol, semente de algodão, semente de colza (colza) ou ervilha, ou em uma forma processada, tal como farelo de soja, farelo de soja integral, concentrado de proteína de soja (SPC), farelo de soja fermentado (FSBM), farelo de girassol, farelo de semente de algodão, farelo de colza, farelo de peixe, farelo de osso, farelo de penas, soro de leite ou qualquer sua combinação.

9. Ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por a fonte de energia ser selecionada do grupo consistindo em milho, sorgo, cevada, trigo, aveia, arroz, triticale, centeio, beterraba, beterraba-sacarina, espinafre, batata, mandioca, quinoa, repolho, switchgrass, milheto, milheto-pérola, milheto foxtail ou em uma forma processada, tal como milho moído, amido de batata, amido de mandioca, sorgo moído, switchgrass moída, milheto moído, milheto foxtail moído, milheto-pérola moído ou qualquer sua combinação.

10. Ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por o aditivo de ração animal compreender adicionalmente um ou mais componentes selecionados da lista consistindo em: uma ou mais enzimas adicionais; um ou mais micróbios; uma ou mais vitaminas; um ou mais minerais; um ou mais aminoácidos; e

12 / 13 um ou mais outros ingredientes de ração.

11. Ração animal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada por o polipeptídeo tendo atividade de muramidase ser formulado como um grânulo.

12. Método para melhoria do fator de eficiência de produção europeu (EPEF), ganho de peso corporal (BWG) e/ou razão de conversão de ração (FCR) de um animal monogástrico, caracterizado por compreender: (a) a preparação da ração animal, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11; e (b) o fornecimento da ração animal ao animal monogástrico.

13. Uso de pelo menos um probiótico em combinação com um polipeptídeo tendo atividade de muramidase em uma composição de ração para melhoria da razão de conversão de ração e/ou ganho de peso diário e/ou para a modulação da flora intestinal e/ou para melhoria da biodisponibilidade do probiótico, caracterizado por o polipeptídeo tendo atividade de muramidase ser uma muramidase GH24 ou muramidase GH25 fúngica e em que o probiótico é selecionado do grupo consistindo em um Lactobacillus, uma Bifidobacterium, uma Saccharomyces, um Enterococcus, um Streptococcus, um Pediococcus, um Leuconostoc, um Lactococcus, um Oenococcus, um Bacillus, Carnobacterium, Propionibacterium, Clostridium, Megasphaera e uma Escherichia ou suas combinações.

14. Composição de ração ou uma composição de pré-mistura, ou um aditivo de ração para animais, caracterizada por compreender pelo menos um polipeptídeo tendo atividade de muramidase e pelo menos um probiótico, em que o polipeptídeo tendo atividade de muramidase é uma muramidase GH24 ou muramidase GH25 fúngica e em que o probiótico é selecionado do grupo consistindo em um Lactobacillus, uma Bifidobacterium, uma Saccharomyces, um Enterococcus, um Streptococcus, um Pediococcus,

13 / 13 um Leuconostoc, um Lactococcus, um Oenococcus, um Bacillus, Carnobacterium, Propionibacterium, Clostridium, Megasphaera e uma Escherichia ou suas combinações.