BR112021004826A2 - composições de ração animal e usos das mesmas - Google Patents

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Raffaella Aureli
Rual Lopez-Ulibarri
Estefania Perez Calvo
Wolfgang SCHLIFFKA
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Dsm Ip Assets B.V.
Novozymes A/S
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Abstract

A presente invenção se refere a uma composição e/ou uma ração animal compreendendo polipeptídeos que têm atividade de muramidase e polipeptídeos que têm atividade de protease e uso das mesmas.

Description

“COMPOSIÇÕES DE RAÇÃO ANIMAL E USOS DAS MESMAS” REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, que é incorporada ao presente documento a título de referência.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção
[0002] A presente invenção se refere a uma composição e/ou uma ração animal compreendendo polipeptídeos que têm atividade de muramidase e polipeptídeos que têm atividade de protease e uso das mesmas. Descrição da Técnica Relacionada
[0003] Muramidase, também chamada de lisozima, é uma O- glicosil hidrolase produzida como um mecanismo de defesa contra bactérias por muitos organismos. A enzima causa a hidrólise de paredes de célula bacteriana clivando-se as ligações glicosídicas de peptidoglicano; uma molécula estrutural importante nas bactérias. Após deixar suas paredes celulares enfraquecidas por meio da ação de muramidase, ocorre a lise das células bacterianas como resultado da pressão osmótica não balanceada.
[0004] Muramidase ocorre naturalmente em muitos organismos como vírus, plantas, insetos, aves, répteis e mamíferos. Em mamíferos, a Muramidase foi isolada das secreções nasais, saliva, lágrimas, conteúdo intestinal, urina e leite. A enzima cliva a ligação glicosídica entre o carbono número 1 de ácido N-acetilmurâmico e carbono número 4 de N-acetil-D-glucosamina. In vivo, esses dois carboidratos são polimerizados para formar o polissacarídeo de parede celular de muitos microrganismos.
[0005] Muramidase foi classificada em cinco famílias de glicosídeo hidrolase (GH) diferentes (CAZy, www.cazy.org): muramidase de clara de ovo de galinha (GH22), muramidase de clara de ovo de ganso (GH23), muramidase de bacteriófago T4 (GH24), proteína flagelar de Sphingomonas (GH73) e muramidases de Chalaropsis (GH25). A muramidase extraída da clara de ovo de galinha (uma muramidase GH22) é o produto primário disponível no mercado e, tradicionalmente, foi apenas referida como muramidase muito embora nos dias de hoje haja muitas outras muramidases conhecidas.
[0006] Proteases ou peptidases catabolizam ligações de peptídeo em proteínas que se quebram em fragmentos de cadeias de aminoácido, ou peptídeos. As proteases são classificadas com base em seu mecanismo catalítico nos seguintes grupos: serina proteases (S), cisteína proteases (C), proteases aspárticas (A), metaloproteases (M), e proteases desconhecidas (U), ou ainda não classificadas, consultar Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J. Barrett, N. D. Rawlings, J. F. Woessner (eds), Academic Press (1998), em particular a parte de introdução geral.
[0007] Há muitos pedidos de patente que revelam a combinação de uma protease e uma muramidase em combinação com muitos outros ingredientes de ração e/ou remédios herbais. No entanto, em todos os casos, a muramidase testada é a muramidase da clara do ovo e não é possível discernir se é a combinação de muramidase e protease sozinha que fornece qualquer benefício (caso haja) ou a mistura de todos os componentes.
[0008] Foi mostrado no documento WO 2017/001703 que as muramidases microbianas aprimoram o desempenho animal. No entanto, combinando-se diferentes tipos de enzimas frequentemente não resulta em quaisquer resultados benéficos sobre a única enzima, vide T. T. dos Santos et al., “Protease, protease and superdosing phytase interactions in broiler performance, carcass yield and digesta transit time”, Animal Nutrition (2017), 3, 121-126 e Adeola e Cowieson, “Opportunities and challenges in using exogenous enzymas to improve nonruminant animal production”, J Anim Sci, (2011), 89, 189-3218.
[0009] O aprimoramento da saúde de animais da fazenda é necessário em um mundo com uma população crescente que consome mais proteína animal, e é o objetivo da presente invenção planejar soluções que ajudem a satisfazer esse desafio.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0010] A presente invenção se refere a uma composição compreendendo um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de protease.
[0011] A presente invenção se refere a uma ração animal compreendendo um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de protease.
[0012] A presente invenção se refere adicionalmente a um método de aprimoramento do Fator de Eficiência de Produção Europeia (EPEF), Peso Corporal (BW) e/ou Razão de Conversão de Ração (FCR); aprimoramento da qualidade dos detritos e/ou dermatite no coxim; e/ou tratamento de infeção por Clostridium perfringens de um animal que compreende administrar a um animal a composição ou a ração animal da presente invenção.
[0013] A presente invenção se refere adicionalmente ao uso da composição ou da ração animal da presente invenção no aprimoramento de Fator de Eficiência de Produção Europeia (EPEF), Peso Corporal (BW) e/ou Razão de Conversão de Ração (FCR); aprimoramento da qualidade dos detritos e/ou dermatite no coxim; e/ou tratamento de infecção por Clostridium perfringens em um animal.
VISÃO GERAL DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0014] SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Acremonium alcalophilum conforme descrito no documento WO2013/076253 (SEQ ID NO: 4).
[0015] SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Acremonium alcalophilum conforme descrito no documento WO2013/076253 (SEQ ID NO: 8).
[0016] SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Aspergillus fumigatus conforme descrito no documento WO2011/104339 (SEQ ID NO: 3).
[0017] SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Trichoderma reesei conforme descrito no documento WO2009/102755 (SEQ ID NO: 4).
[0018] SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Trametes cinnabarina conforme descrito no documento WO2005/080559 (SEQ ID NO: 2).
[0019] SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Sporormia fimetaria conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 3).
[0020] SEQ ID NO: 7 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Poronia punctata conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 6).
[0021] SEQ ID NO: 8 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Poronia punctata conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 9).
[0022] SEQ ID NO: 9 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Lecanicillium sp. WMM742 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 12).
[0023] SEQ ID NO: 10 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Lecanicillium sp. WMM742 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 15).
[0024] SEQ ID NO: 11 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Onygena equina conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 18).
[0025] SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Purpureocillium lilacinum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 21).
[0026] SEQ ID NO: 13 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Trichobolus zukalii conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 24).
[0027] SEQ ID NO: 14 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Penicillium citrinum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 27).
[0028] SEQ ID NO: 15 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Cladorrhinum bulbillosum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 30).
[0029] SEQ ID NO: 16 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Umbelopsis westeae conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 33).
[0030] SEQ ID NO: 17 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Zygomycetes sp. XZ2655 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 36).
[0031] SEQ ID NO: 18 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Chaetomium cupreum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 39).
[0032] SEQ ID NO: 19 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Cordyceps cardinalis conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 42).
[0033] SEQ ID NO: 20 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Penicillium sp. 'qii' conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 45).
[0034] SEQ ID NO: 21 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Aspergillus sp. nov XZ2609 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 48).
[0035] SEQ ID NO: 22 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Paecilomyces sp. XZ2658 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 51).
[0036] SEQ ID NO: 23 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Paecilomyces sp. XZ2658 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 54).
[0037] SEQ ID NO: 24 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Pycnidiophora cf dispera conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 60).
[0038] SEQ ID NO: 25 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Thermomucor indicae-seudaticae conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 63).
[0039] SEQ ID NO: 26 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Isaria farinosa conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 66).
[0040] SEQ ID NO: 27 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Lecanicillium sp. WMM742 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 69).
[0041] SEQ ID NO: 28 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Zopfiella sp. t180-6 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 72).
[0042] SEQ ID NO: 29 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Malbranchea flava conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 75).
[0043] SEQ ID NO: 30 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Hypholoma polytrichi conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 80).
[0044] SEQ ID NO: 31 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Aspergillus deflectus conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 83).
[0045] SEQ ID NO: 32 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Ascobolus stictoideus conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 86).
[0046] SEQ ID NO: 33 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Coniochaeta sp. conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 89).
[0047] SEQ ID NO: 34 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Daldinia fissa conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 92).
[0048] SEQ ID NO: 35 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Rosellinia sp. conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 95).
[0049] SEQ ID NO: 36 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Ascobolus sp. ZY179 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 98).
[0050] SEQ ID NO: 37 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Curreya sp. XZ2623 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 101).
[0051] SEQ ID NO: 38 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Coniothyrium sp. conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 104).
[0052] SEQ ID NO: 39 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Hypoxylon sp. conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 107).
[0053] SEQ ID NO: 40 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Xylariaceae sp. 1653h conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 110).
[0054] SEQ ID NO: 41 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Hypoxylon sp. conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 113).
[0055] SEQ ID NO: 42 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Yunnania penicillata conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 116).
[0056] SEQ ID NO: 43 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Engyodontium album conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 119).
[0057] SEQ ID NO: 44 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Metapochonia bulbillosa conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 122).
[0058] SEQ ID NO: 45 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Hamigera paravellanea conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 125).
[0059] SEQ ID NO: 46 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Metarhizium iadini conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 128).
[0060] SEQ ID NO: 47 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Thermoascus aurantiacus conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 131).
[0061] SEQ ID NO: 48 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Clonostachys rossmaniae conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 134).
[0062] SEQ ID NO: 49 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Simplicillium obclavatum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 137).
[0063] SEQ ID NO: 50 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Aspergillus inflatus conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 140).
[0064] SEQ ID NO: 51 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Paracremonium inflatum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 143).
[0065] SEQ ID NO: 52 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Westerdykella sp. conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 146).
[0066] SEQ ID NO: 53 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Stropharia semiglobata conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 155).
[0067] SEQ ID NO: 54 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Gelasinospora cratophora conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 158).
[0068] SEQ ID NO: 55 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Flammulina velutipes conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 221).
[0069] SEQ ID NO: 56 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Deconica coprophila conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 224).
[0070] SEQ ID NO: 57 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Rhizomucor pusillus conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 227).
[0071] SEQ ID NO: 58 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Stropharia semiglobata conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 230).
[0072] SEQ ID NO: 59 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Stropharia semiglobata conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 233).
[0073] SEQ ID NO: 60 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Myceliophthora fergusii conforme descrito no documento PCT/CN2017/075960 (SEQ ID NO: 3).
[0074] SEQ ID NO: 61 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Mortierella alpina conforme descrito no documento PCT/CN2017/075960 (SEQ ID NO: 15).
[0075] SEQ ID NO: 62 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Penicillium atrovenetum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075960 (SEQ ID NO: 27).
[0076] SEQ ID NO: 63 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Trichophaea saccata conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 257).
[0077] SEQ ID NO: 64 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Chaetomium thermophilum conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 264).
[0078] SEQ ID NO: 65 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Trichoderma harzianum conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 267).
[0079] SEQ ID NO: 66 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Trichophaea minuta conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 291).
[0080] SEQ ID NO: 67 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Chaetomium sp. ZY287 conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 294).
[0081] SEQ ID NO: 68 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Mortierella sp. ZY002 conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 297).
[0082] SEQ ID NO: 69 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Metarhizium sp. XZ2431 conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 300).
[0083] SEQ ID NO: 70 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Geomyces auratus conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 303).
[0084] SEQ ID NO: 71 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Ilyonectria rufa conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 306).
DEFINIÇÕES
[0085] Animal: O termo “animal” se refere a qualquer animal exceto seres humanos. Exemplos de animais são animais monogástricos, incluindo, mas sem limitação, porcos ou suínos (incluindo, mas sem limitação, leitões, porcos em crescimento e porcas gestantes); aves como perus, patos, codornas, galinha-da-angola, gansos, pombos (incluindo pombos jovens) e galinha (incluindo, mas sem limitação, frangos que servem para corte (referido ao presente documento como frangos de corte), frangos, galinhas poedeiras (referidas no presente documento como poedeiras)); animais de estimação, como gatos e cachorros; cavalos (incluindo, mas sem limitação, de sangue quente, de sangue frio e de sangue morno), crustáceos (incluindo, mas sem limitação, camarões e pitus) e peixe (incluindo, mas sem limitação, seriola, pirarucu, barbo, achigã, anchova, bocachico, brema,
peixe-gato, cachama, carpa, bagre, catla, chanos, truta-de- lago, acará-grande, bijupirá, bacalhau, tipo de peixe branco, dourada, corvina, moreia, góbio, peixe-dourado, gourami, garoupa, guapote, linguado, java, labeo, lai, botia, cavala, peixe-leite, carapeba, salamandra, tainha, paco, peixe-mexerica, peixe-rei, perca, pike, pampo-galhudo, rutilis, salmão, sampa, sauger, robalo, dourada, shiner, góbio-dorminhoco, peixe cabeça-de-cobra, pargo, robalo comum, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, curimatã, peixe-médico, peixe terror, tilápia, truta, atum, rodovalho, cisco europeia, picão-verde e peixe-branco).
[0086] Ração animal: O termo “ração animal” se refere a qualquer composto, preparação ou mistura solúvel para, ou destinada para consumo por um animal. A ração animal para um animal monogástrico compreende tipicamente concentrados assim como vitaminas, minerais, enzimas, ingredientes microbianos de alimentação direta, aminoácidos e/ou outros ingredientes de ração (como em uma pré-mistura) enquanto a ração animal para ruminantes geralmente compreende forragem (incluindo fibras e silagem) e pode compreender adicionalmente concentrados assim como vitaminas, minerais, ingredientes microbianos de alimentação direta de enzimas, aminoácido e/ou outros ingredientes de ração (como em uma pré-mistura).
[0087] Concentrados: O termo “concentrados” significa ração com altas concentrações de proteína e energia, como farinha de peixe, melaços, oligossacarídeos, sorgo, sementes e grãos (sejam integrais ou preparados por meio de trituração, moagem, etc., de, por exemplo, milho, aveia, centeio, cevada, trigo), torta de prensagem de semente oleaginosa (por exemplo, de semente de algodão, cártamo, girassol, soja (como farinha de soja), colza/canola, amendoim ou planta oleaginosa da família do amendoim), torta de semente de palma, material derivado de levedura e grãos destiladores (como grãos úmidos de destiladores (WDS) e grãos secos de destiladores com solúveis (DDGS)).
[0088] Eficiência da ração: O termo “eficiência da ração” significa a quantidade de ganho de peso por unidade de ração quando o animal é alimentado à vontade ou uma quantidade especificada de alimento durante um período de tempo. Por "eficiência da ração aumentada" significa que o uso de uma composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção na ração resulta em um ganho de peso aumentado por unidade de consumo de ração em comparação com um animal alimentado sem a dita composição de aditivo de ração estar presente.
[0089] Forragem: O termo “forragem” conforme definido no presente documento também inclui fibra. Forragem é o material vegetal fresco como feno e silagem de plantas de forragem, gramíneas e outras plantas de forragem, alga do mar, grãos germinados e legumes, ou qualquer combinação dos mesmos. Exemplos de plantas de forragem são Alfalfa (luzerna), cornichão perene, brassica (por exemplo, couve-frisada, colza (canola), rutabaga (couve-nabo), nabo), trevo (por exemplo, trevo alsike, trevo vermelho, trevo subterrâneo, trevo branco), gramínea (por exemplo, grama-bermudas, capim, aveia-perene, festucas, cambaleia-grama, prados, panasco, azevém, erva-dos-prados), milho (maís), painço, cevada, aveia, centeio, sorgo, sojas e trigo e vegetais como beterrabas. Forragem inclui adicionalmente resíduos de cultura de produção de grãos (como palha de milho; palha de trigo, cevada, aveia, centeio e outros grãos); resíduos de vegetais como colos de beterraba; resíduos da produção de semente como caules e folhas da soja, colza e outros legumes; e frações do refino de grãos para consumo animal ou humano ou da produção de combustível ou outras indústrias.
[0090] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo ou um domínio catalítico que tem um ou mais (por exemplo, diversos) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro ou domínio; em que o fragmento tem atividade de muramidase.
[0091] Em um aspecto, um fragmento de uma muramidase GH24 (como uma da SEQ ID NO: 63 a 71) compreende pelo menos 230 aminoácidos, como pelo menos 235 aminoácidos, pelo menos 240 aminoácidos, ou pelo menos 245 aminoácidos e tem atividade de muramidase. Em um outro aspecto, um fragmento de uma muramidase GH24 (como uma da SEQ ID NO: 63 a 71) compreende pelo menos 90 % do comprimento do polipeptídeo maduro, como pelo menos 92 %, pelo menos 94 %, pelo menos 96 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % do comprimento do polipeptídeo maduro e tem atividade de muramidase.
[0092] Em um aspecto, um fragmento de uma muramidase GH25 (como uma da SEQ ID NO: 1 a 72) compreende pelo menos 180 aminoácidos, como pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 aminoácidos, pelo menos 195 aminoácidos, pelo menos 200 aminoácidos, pelo menos 205 aminoácidos ou pelo menos 210 aminoácidos e tem atividade de muramidase. Em um outro aspecto, um fragmento de uma muramidase GH25 (como uma da SEQ ID NO: 1 a 72) compreende pelo menos 90 % do comprimento do polipeptídeo maduro, como pelo menos 92 %, pelo menos 94
%, pelo menos 96 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % do comprimento do polipeptídeo maduro e tem atividade de muramidase.
[0093] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Os exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância que inclui, mas sem limitação a, qualquer enzima, variação, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou todos os constituintes de ocorrência natural com os quais a mesma está associada por natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem em relação àquela substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada pelo aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (por exemplo, múltiplas cópias de um gene que codifica a substância; uso de um promotor maior forte do que o promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.
[0094] Atividade de muramidase: O termo “atividade de muramidase” significa a hidrólise enzimática das 1,4-beta- ligações entre resíduos de ácido N-acetilmurâmico e N- acetil-D-glucosamina em um peptidoflicano ou entre resíduos de N-acetil-D-glucosamina em quitodextrinas, resultando em bacteriolise devido à pressão osmótica. A muramidase pertence à classe enzimática EC 3.2.1.17. A atividade de muramidase é tipicamente medida por meio de determinação turbidimétrica. O método se baseia nas alterações na turbidez de uma suspensão de Micrococcus luteus ATCC 4698 induzida pela ação lítica da muramidase. Em condições experimentais adequadas, essas alterações são proporcionais à quantidade de muramidase no meio (conforme INS 1105 do Combined Compendium of Food Additive Specifications da Food and Agriculture Organisation da UN (www.fao.org)). Para os fins da presente invenção, a atividade de muramidase é determinada de acordo com o ensaio de turbidez descrito no exemplo 1 (“Determinação de Atividade de Muramidase”) e o polipeptídeo tem atividade de muramidase se o mesmo mostrar atividade contra uma ou mais bactérias, como Micrococcus luteus ATCC 4698 e/ou Exiguobacterium undea (DSM14481). Como um exemplo, a muramidase GH25 da presente invenção tem pelo menos 20 %, por exemplo, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 100 % da atividade de muramidase da SEQ ID NO: 1. Como um outro exemplo, a muramidase GH24 da presente invenção tem pelo menos 20 %, por exemplo, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 100 % da atividade de muramidase da SEQ ID NO: 63.
[0095] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final que segue a tradução e quaisquer modificações pós-traducionais, como processamento de N-terminal, truncamento de C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc.
[0096] Na presente invenção, o polipeptídeo maduro pode ser aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos 1 a 218 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 4, aminoácidos 1 a 215 da
SEQ ID NO: 5, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 8, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 10, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 11, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 12, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 13, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 14, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 15, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 16, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 17, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 18, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 19, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 20, aminoácidos 1 a 218 da SEQ ID NO: 21, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 22, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 23, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 24, aminoácidos 1 a 210 da SEQ ID NO: 25, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 26, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 27, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 28, aminoácidos 1 a 217 da SEQ ID NO: 29, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 30, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 31, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 32, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 33, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 34, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 35, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 36, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 37, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 38, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 39, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 40, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 41, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 42, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 43, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 44, aminoácidos 1 a 215 da SEQ ID NO: 45, aminoácidos 1 a 217 da SEQ ID NO: 46, aminoácidos 1 a 214 da SEQ ID NO: 47, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 48, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 49, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 50,
aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 51, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 52, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 53, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 54, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 55, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 56, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 57, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 58, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 59, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 60, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 61, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 62, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 63, aminoácidos 1 a 249 da SEQ ID NO: 64, aminoácidos 1 a 248 da SEQ ID NO: 65, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 66, aminoácidos 1 a 249 da SEQ ID NO: 67, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 68, aminoácidos 1 a 247 da SEQ ID NO: 69, aminoácidos 1 a 250 da SEQ ID NO: 70, aminoácidos 1 a 240 da SEQ ID NO: 71.
[0097] Obtido ou obtenível de: O termo “obtido ou obtenível de” significa que o polipeptídeo pode ser encontrado em um organismo de uma classificação taxonômica específica. De preferência, o polipeptídeo é obtido ou obtenível do reino Fungi, em que o termo reino é a classificação taxonômica. Com mais preferência, o polipeptídeo é obtido ou obtenível do filo Ascomycota, em que o termo filo é a classificação taxonômica. Com mais preferência, o polipeptídeo é obtido ou obtenível do subfilo Pezizomycotina, em que o termo subfilo é a classificação taxonômica. Com mais preferência, o polipeptídeo é obtido ou obtenível da classe Eurotiomycetes, em que o termo classe é a classificação taxonômica.
[0098] Se a classificação taxonômica de um polipeptídeo não é conhecido, a mesma pode ser facilmente determinada por uma pessoa versada na técnica realizando-se uma busca BLASTP do polipeptídeo (com o uso, por exemplo, do site do National Center for Biotechnology Information (NCIB) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e comparando o mesmo aos homólogos mais próximos. A pessoa versada na técnica também pode comparar a sequência àquela do pedido conforme depositado. Um polipeptídeo desconhecido que é um fragmento de um polipeptídeo conhecido é considerado como da mesma espécie taxonômica. Um polipeptídeo natural desconhecido ou variante artificial que compreende uma substituição, deleção e/ou inserção em até 10 posições é considerado como sendo da mesma espécie taxonômica que o polipeptídeo conhecido.
[0099] Fibra: O termo “fibra” significa material vegetal seco com altos níveis de fibra, como fibra, farelo, cascas de sementes e grãos e resíduos de culturas (como paleta, copra, palha, joio, resíduo de beterraba sacarina).
[0100] Identidade de sequência: O parentesco entre duas sequências de aminoácido ou entre duas sequências de nucleotídeo é descrito pelo parâmetro “identidade de sequência”.
[0101] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada com o uso do algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), de preferência, versão
5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle identificado como
“identidade mais longa” (obtido com o uso da opção –nobrief) é usado como a identidade percentual e é calculado como a seguir: (Resíduos idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento – Número Total de Lacunas em Alinhamento)
[0102] Polipeptídeo substancialmente puro: O termo “polipeptídeo substancialmente puro” significa uma preparação que contém no máximo 10 %, no máximo 8 %, no máximo 6 %, no máximo 5 %, no máximo 4 %, no máximo 3 %, no máximo 2 %, no máximo 1 %, e no máximo 0,5 % em peso do outro material de polipeptídeo com o qual é associado de nativa ou recombinantemente. De preferência, o polipeptídeo é pelo menos 92 % puro, por exemplo, pelo menos 94 % puro, pelo menos 95 % puro, pelo menos 96 % puro, pelo menos 97 % puro, pelo menos 98 % puro, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % puro, e 100 % puro em peso do material de polipeptídeo total presente na preparação. Os polipeptídeos da presente invenção estão, de preferência, em uma forma substancialmente pura. Isso é alcançado, por exemplo, preparando-se o polipeptídeo por meio de métodos recombinantes bem conhecidos ou por meio de métodos de purificação clássicos.
[0103] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo que tem atividade de muramidase que compreende uma alteração, isto é, uma substituição, inserção e/ou deleção de um ou mais (diversos) resíduos de aminoácido em uma ou mais (por exemplo, diversas) posições. Uma substituição significa a substituição do aminoácido que ocupa uma posição com um aminoácido diferente; uma deleção significa a remoção do aminoácido que ocupa uma posição; e uma inserção significa adicional 1, 2, ou 3 aminoácidos adjacentes e imediatamente seguintes ao aminoácido que ocupa a posição.
[0104] Na presente invenção, uma variante de muramidase pode compreender de 1 a 10 alterações, isto é, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 alterações e ter pelo menos 20 %, por exemplo, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 100 % da atividade de muramidase da muramidase parental, como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 63.
[0105] Qualidade dos detritos: O termo “qualidade dos detritos” significa uma condição dos detritos excretados por um animal. Detrito é uma mistura de material de cama, excrementos, penas, ração desperdiçada e água desperdiçada. A qualidade pode ser caracterizada por umidade, valor de pH, teor de nitrogênio amônico, etc.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Composição
[0106] Constatou-se surpreendentemente que uma composição que compreende uma muramidase (de preferência, uma muramidase fúngica) e uma protease gera um benefício de desempenho adicional em animais.
[0107] Então, em um primeiro aspecto, a invenção se refere a uma composição que compreende um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de protease.
[0108] Na presente invenção, a muramidase pode ser uma muramidase GH24, de preferência, uma muramidase fúngica GH24, de preferência, obtida ou obtenível do filo Ascomycota, com mais preferência, da classe Eurotiomycetes. A muramidase também pode ser uma muramidase GH25, de preferência, uma muramidase fúngica GH25, de preferência, obtida ou obtenível do filo Ascomycota, com mais preferência, da classe Eurotiomycetes.
[0109] O polipeptídeo que tem atividade de protease da invenção pode ser proteases da família subtilases, incluindo as subfamílias listadas na tabela abaixo e protease do tipo subtilisina.
[0110] De preferência, o polipeptídeo que tem atividade de protease da invenção pode ser uma protease microbiana, sendo que o termo microbiano indica que a protease é derivada ou se origina de um microrganismo, ou um análogo, um fragmento, uma variante, um mutante, ou uma protease sintética derivada de um microrganismo. O mesmo pode ser produzido ou expresso na cepa microbiana do tipo selvagem original, em uma outra cepa microbiana, ou em uma planta; isto é, o termo cobre a expressão de proteases de ocorrência natural do tipo selvagem, assim como a expressão de qualquer hospedeiro de proteases recombinantes, sintéticas ou geneticamente modificadas.
[0111] Exemplos de microrganismos são bactérias, por exemplo, bactérias do filo Actinobacteria phy. nov., por exemplo, da classe I: Actinobacteria, por exemplo, da Subclasse V: Actinobacteridae, por exemplo, da Ordem I: Actinomycetales, por exemplo, da Subordem XII: Streptosporangineae, por exemplo, da Família II: Nocardiopsaceae, por exemplo, do Gênero I: Nocardiopsis, por exemplo, Nocardiopsis sp. NRRL 18262, e Nocardiopsis alba; por exemplo, da espécie Bacillus ou mutantes ou variantes da mesma que exibem atividade de protease. Essa taxonomia é baseada em Berge's Manual of Systematic Bacteriology, 2a edição, 2000, Springer (pré-impressão: Road Map to Bergey's). A atividade de protease pode ser medida com o uso de qualquer ensaio, em que é empregado um substrato, que inclui ligações peptídicas relevantes para a especificidade da protease em questão.
[0112] De preferência, o polipeptídeo que tem atividade de protease da invenção pode ser proteases estáveis em ácido. Exemplos de proteases estáveis em ácido são proteases derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262, e Nocardiopsis alba e proteases de pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou pelo menos 95 % de identidade de aminoácido em relação a qualquer uma dessas proteases.
[0113] Com mais preferência, o polipeptídeo que tem atividade de protease da invenção pode ser serina proteases estáveis em ácido derivadas de Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235 (A1918L1), Nocardiopsis prasina DSM 15649 (NN018335L1), Nocardiopsis prasina (anteriormente alba) DSM 14010 (NN18140L1), Nocardiopsis sp. DSM 16424 (NN018704L2), Nocardiopsis alkaliphila DSM 44657 (NN019340L2) e Nocardiopsis lucentensis DSM 44048
(NN019002L2), assim como proteases homólogas.
[0114] O termo "serina protease" se refere a serina peptidases e seus clãs, conforme definido no Handbook acima. Na versão de 1998 desse manual, serina peptidases e seus clãs são abordadas nos capítulos 1-175. Serina proteases podem ser definidas como peptidases, em que o mecanismo catalítico depende do grupo hidroxila de um resíduo de serina que age como o nucleófilo que ataca a ligação peptídica. Exemplos de serina proteases para o uso de acordo com a presente invenção são proteases do Clã SA, por exemplo, Família S2 (Estreptogrisina), por exemplo, Subfamília S2A (protease alfa-lítica), como definido no Handbook acima. Uma serina protease comercialmente disponível derivada de Nocardiopsis é Ronozyme®ProAct® (DSM Nutritional Products AG).
[0115] Não há limitações na origem da serina protease estável em ácido para o uso de acordo com a presente invenção. Desse modo, o termo "protease" inclui não apenas proteases naturais ou de tipo selvagem, mas também quaisquer mutantes, variantes, fragmentos etc. das mesmas que exibem atividade de protease, bem como proteases sintéticas, tais como proteases embaralhadas e proteases consenso. Tais proteases geneticamente modificadas podem ser preparadas conforme é geralmente conhecido na técnica, por exemplo, por Mutagênese Sítio-direcionada, por PCR (com o uso de um fragmento de PCR que contém a mutação desejada como um dos iniciadores nas reações de PCR) ou por Mutagênese Aleatória. A preparação de proteínas consenso é descrita, por exemplo, no documento EP 0 897 985.
[0116] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de protease da invenção, além de ser estável em ácido, também pode ser termoestável. O termo "termoestável" significa proteases de um ou mais dos seguintes: que a temperatura ideal é pelo menos 50 °C, 52 °C, 54 °C, 56 °C, 58 °C, 60 °C, 62 °C, 64 °C, 66 °C, 68 °C ou pelo menos 70 °C.
[0117] De preferência, a invenção se refere a uma composição que compreende um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de protease, em que o polipeptídeo que tem atividade de muramidase é selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1; (b) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3; (d) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4; (e) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5; (f) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 6; (g) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 7; (h) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8; (i) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 9; (j) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 10; (k) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 11; (l) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 12;
(m) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 13; (n) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 14; (o) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 15; (p) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 16; (q) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 17; (r) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 18; (s) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19; (t) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 20; (u) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 21; (v) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 22; (w) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 23; (x) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24; (y) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 25; (z) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 26; (aa) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 27;
(ab) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 28; (ac) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 29; (ad) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 30; (ae) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 31; (af) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 32; (ag) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 33; (ah) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 34; (ai) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 35; (aj) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 36; (ak) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 37; (al) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 38; (am) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 39; (an) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 40; (ao) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 41; (ap) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 42;
(aq) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 43; (ar) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 44; (as) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 45; (at) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 46; (au) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 47; (av) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 48; (aw) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 49; (ax) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 50; (ay) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 51; (az) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 52; (ba) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 53; (bb) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 54; (bc) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 55; (bd) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 56; (be) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 57;
(bf) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 58; (bg) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 59; (bh) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 60; (bi) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 61; (bj) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 62; (bk) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 63; (bl) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 64; (bm) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 65; (bn) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 66; (bo) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 67; (bp) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 68; (bq) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 69; (br) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 70; (bs) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 71; (bt) uma variante de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:
13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 ou SEQ ID NO: 71 que compreende uma ou mais substituições de aminoácido (de preferência, substituições conservativas), e/ou uma ou mais deleções de aminoácido, e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação dos mesmos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; (bu) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (at), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba),
(bb), (bc), (bd), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (bm), (bn), (bo), (bp), (bq), (br), (bs) ou (bt) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; e (bv) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (at), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc), (bd), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (bm), (bn), (bo), (bp), (bq), (br), (bs) ou (bt) que tem atividade de muramidase e que tem pelo menos 90 % do comprimento do polipeptídeo maduro.
[0118] De preferência, a invenção se refere a uma composição que compreende um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de protease, em que o polipeptídeo que tem atividade de protease é selecionado a partir de a) a família subtilases, incluindo subtilisina, termitase, kexina e pirolisina proteases; b) proteases microbianas estáveis em ácido, em particular, serina proteases estáveis em ácido derivadas de Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235 (A1918L1), Nocardiopsis prasina DSM 15649 (NN018335L1), Nocardiopsis prasina (anteriormente alba) DSM 14010 (NN18140L1), Nocardiopsis sp. DSM 16424 (NN018704L2), Nocardiopsis alkaliphila DSM 44657 (NN019340L2) e Nocardiopsis lucentensis DSM 44048 (NN019002L2), assim como homólogas; e c) proteases variantes de (a) e (b).
[0119] Na presente invenção, a muramidase pode compreender ou consistir em aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos 1 a 218 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 4, aminoácidos 1 a 215 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 8, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 10, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 11, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 12, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 13, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 14, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 15, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 16, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 17, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 18, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 19, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 20, aminoácidos 1 a 218 da SEQ ID NO: 21, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 22, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 23, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 24, aminoácidos 1 a 210 da SEQ ID NO: 25, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 26, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 27, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 28, aminoácidos 1 a 217 da SEQ ID NO: 29, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 30, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 31, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 32, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 33, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 34, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 35, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 36, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 37, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 38, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 39,
aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 40, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 41, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 42, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 43, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 44, aminoácidos 1 a 215 da SEQ ID NO: 45, aminoácidos 1 a 217 da SEQ ID NO: 46, aminoácidos 1 a 214 da SEQ ID NO: 47, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 48, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 49, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 50, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 51, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 52, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 53, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 54, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 55, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 56, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 57, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 58, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 59, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 60, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 61, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 62, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 63, aminoácidos 1 a 249 da SEQ ID NO: 64, aminoácidos 1 a 248 da SEQ ID NO: 65, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 66, aminoácidos 1 a 249 da SEQ ID NO: 67, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 68, aminoácidos 1 a 247 da SEQ ID NO: 69, aminoácidos 1 a 250 da SEQ ID NO: 70 ou aminoácidos 1 a 240 da SEQ ID NO: 71.
[0120] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácido que não alteram, geralmente, a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, Nova York. As substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly. Outros exemplos de substituições conservativas são G para A; A para G, S; V para I, L, A, T, S; I para V, L, M; L para I, M, V; M para L, I, V; P para A, S, N; F para Y, W, H; Y para F, W, H; W para Y, F, H; R para K, E, D; K para R, E, D; H para Q, N, S; D para N, E, K, R, Q; E para Q, D, K, R, N; S para T, A; T para S, V, A; C para S, T, A; N para D, Q, H, S; Q para E, N, H, K, R.
[0121] Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica, como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese por varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, as mutações de única alanina são introduzidas em todo resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas para atividade de muramidase para identificar resíduos de aminoácido que são críticos para a atividade da molécula. Vide também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica também pode ser determinada por meio de análise física da estrutura, conforme determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétron ou marcação por fotoafinidade, em combinação com a mutação de aminoácidos de sítio de contato putativo. Vide, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol.
224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais também pode ser inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.
[0122] O documento WO 2013/076253 revelou que resíduos de aminoácido D95 e E97 da SEQ ID NO: 8 do documento WO 2013/076253 são resíduos catalíticos. O documento PCT/CN2017/075960 revela os aminoácidos catalíticos de muramidases 12 GH25. Esse alinhamento pode ser usado para determinar a posição dos aminoácidos catalíticos para as muramidases reivindicadas. Em uma modalidade, nenhuma alteração é feita a um aminoácido que corresponde a E97 e D95 quando se usa SEQ ID NO: 39 para numeração. Os aminoácidos catalíticos para as muramidases de GH24 podem ser determinados alinhando-se as sequências com sequências conhecidas em que o aminoácido (ou aminoácidos) catalítico já foi determinado (vide www.uniprot.org).
[0123] Em uma modalidade preferencial, a invenção se refere a uma composição compreendendo um polipeptídeo que tem atividade de muramidase e um polipeptídeo que tem atividade de protease, em que o polipeptídeo que tem atividade de protease é selecionado dentre proteases derivadas do Gênero I: Nocardiopsis, por exemplo, Nocardiopsis sp. NRRL 18262, e Nocardiopsis alba; por exemplo, da espécie Bacillus ou mutantes ou variantes da mesma que exibem atividade de protease; e em que os polipeptídeos que têm atividade de muramidase são um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1. Com mais preferência, o polipeptídeo que tem atividade de protease é selecionado dentre serina proteases estáveis em ácido derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262, Nocardiopsis alba, Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235 (A1918L1), Nocardiopsis prasina DSM 15649 (NN018335L1), Nocardiopsis prasina (anteriormente alba) DSM 14010 (NN18140L1), Nocardiopsis sp. DSM 16424 (NN018704L2), Nocardiopsis alkaliphila DSM 44657 (NN019340L2) e Nocardiopsis lucentensis DSM 44048 (NN019002L2), e proteases de pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou pelo menos 95 % de identidade de aminoácido com qualquer uma dessas proteases; e em que os polipeptídeos que têm atividade de muramidase são um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1.
[0124] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de protease pode ser dosado de 0,1 a 150 ppm de proteína enzimática por kg de ração animal, como 0,5 a 100 ppm, 1 a 75 ppm, 2 a 50 ppm, 3 a 25 ppm, 2 a 80 ppm, 5 a 60 ppm, 8 a 40 ppm, 10 a 30 ppm, 13 a 75 ppm, 15 a 50 ppm, 17,5 a 40 ppm, 25 a 75 ppm ou 30 a 60 ppm de proteína enzimática por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0125] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase pode ser dosado de 0,1 a 150 ppm de proteína enzimática por kg de ração animal, como 0,5 a 100 ppm, 1 a 75 ppm, 2 a 50 ppm, 3 a 25 ppm, 2 a 80 ppm, 5 a 60 ppm, 8 a 40 ppm, 10 a 30 ppm, 13 a 75 ppm, 15 a 50 ppm, 17,5 a 40 ppm, 25 a 75 ppm ou 30 a 60 ppm de proteína enzimática por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0126] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de protease da composição pode ser formulado como uma formulação sólida; o polipeptídeo que tem atividade de muramidase da composição pode ser formulado como uma formulação sólida; ou tanto o polipeptídeo que tem atividade de protease quanto o polipeptídeo que tem atividade de muramidase da composição podem ser formulados como uma formulação sólida.
[0127] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de protease da composição também pode ser formulado como uma formulação líquida; o polipeptídeo que tem atividade de muramidase da composição também pode ser formulado como uma formulação líquida; ou tanto o polipeptídeo que tem atividade de protease quanto o polipeptídeo que tem atividade de muramidase da composição também podem ser formulados como uma formulação líquida.
[0128] Na presente invenção, a formulação líquida pode compreender adicionalmente 20 %-80 % de poliol (isto é quantidade total de poliol), de preferência 25 %-75 % de poliol, com mais preferência 30 %-70 % de poliol, com mais preferência, 35 %-65 % de poliol ou com máxima preferência, 40 %-60 % de poliol. De preferência, a formulação líquida compreende 20 %-80 % de poliol, com mais preferência, 25 %- 75 % de poliol, com mais preferência, 30 %-70 % de poliol, com mais preferência, 35 %-65 % de poliol ou com máxima preferência, 40 %-60 % de poliol em que o poliol é selecionado a partir do grupo que consiste em glicerol, sorbitol, propileno glicol (MPG), etileno glicol, dietileno glicol, trietileno glicol, 1, 2-propileno glicol ou 1, 3-
propileno glicol, dipropileno glicol, polietileno glicol (PEG) que tem um peso molecular médio abaixo de cerca de 600 e polipropileno glicol (PPG) que tem um peso molecular médio abaixo de cerca de 600. Com mais preferência, a formulação líquida compreende 20 %-80 % de poliol (isto é, a quantidade total de poliol), com mais preferência, 25 %-75 % de poliol, com mais preferência, 30 %-70 % de poliol, com mais preferência, 35 %-65 % de poliol ou, com máxima preferência, 40 %-60 % de poliol em que o poliol é selecionado a partir do grupo que consiste em glicerol, sorbitol e propileno glicol (MPG).
[0129] Na presente invenção, a formulação líquida pode compreender adicionalmente conservante, de preferência, selecionado a partir do grupo que consiste em sorbato de sódio, sorbato de potássio, benzoato de sódio e benzoato de potássio ou qualquer combinação dos mesmos. De preferência, a formulação líquida compreende 0,02 % a 1,5 % p/p de conservante, com mais preferência, 0,05 % a 1,0 % p/p de conservante ou, com máxima preferência, 0,1 % a 0,5 % p/p de conservante. Com mais preferência, a formulação líquida compreende 0,001 % a 2,0 % p/p de conservante (isto é, quantidade total de conservante), de preferência, 0,02 % a 1,5 % p/p de conservante, com mais preferência, 0,05 % a 1,0 % p/p de conservante ou, com máxima preferência, 0,1 % a 0,5 % p/p de conservante, em que o conservante é selecionado a partir do grupo que consiste em sorbato de sódio, sorbato de potássio, benzoato de sódio e benzoato de potássio ou qualquer combinação dos mesmos.
[0130] Na presente invenção, a formulação líquida pode compreender um ou mais agentes de formulação (como aqueles descritos no presente documento), de preferência, um agente de formulação selecionado a partir da lista que consiste em glicerol, etileno glicol, 1, 2-propileno glicol ou 1, 3- propileno glicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glicose, sacarose, sorbitol, lactose, amido, PVA, acetato e fosfato, de preferência, selecionado a partir da lista que consiste em 1, 2-propileno glicol, 1, 3-propileno glicol, sulfato de sódio, dextrina, celulose, tiossulfato de sódio, caulim e carbonato de cálcio.
[0131] Na presente invenção, a formulação sólida pode ser, por exemplo, como um grânulo, pó seco em aspersão ou aglomerado (por exemplo, conforme revelado no documento WO2000/70034). O agente de formulação pode compreender um sal (sais orgânicos ou inorgânicos de zinco, sódio, potássio ou cálcio como, por exemplo, como acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, citrato de potássio, sorbato de potássio, sulfato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, carbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco, sorbato de zinco, sulfato de zinco), amido ou um açúcar ou derivado de açúcar (como, por exemplo, sacarose, dextrina, glicose, lactose, sorbitol).
[0132] De preferência, os agentes de formulação da formulação sólida são selecionados a partir da lista que consiste em cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glicose, sacarose, sorbitol, lactose, amido e celulose. De preferência, o agente de formulação é selecionado dentre um ou mais dos seguintes compostos: sulfato de sódio, dextrina, celulose, tiossulfato de sódio, sulfato de magnésio e carbonato de cálcio.
[0133] De preferência, a composição da presente invenção é um grânulo de enzima que compreende as enzimas da invenção opcionalmente combinadas com uma ou mais enzimas adicionais. O grânulo é composto de um núcleo, e opcionalmente um ou mais revestimentos (camadas externas) que circundam o núcleo.
[0134] Tipicamente, o tamanho de grânulo, medido como diâmetro esférico equivalente (tamanho médio de partícula baseado em volume), do grânulo é 20-2000 µm, particularmente, 50-1500 µm, 100-1500 µm ou 250-1200 µm.
[0135] O núcleo pode ser preparado granulando-se uma mescla dos ingredientes, por exemplo, por meio de um método que compreende técnicas de granulação como cristalização, precipitação, revestimento em recipiente rotativo, revestimento em leito fluidizado, aglomeração de leito fluidizado, atomização giratória, extrusão, perolação, esferonização, métodos de redução de tamanho, granulação em tambor e/ou granulação de alto cisalhamento.
[0136] Métodos para preparar o núcleo podem ser encontrados em Handbook of Powder Technology; Particle size enlargement de C. E. Capes; Volume 1; 1980; Elsevier. Os métodos de preparação incluem tecnologias de formulação de grânulo conhecidas, por exemplo: a) produtos secos em aspersão, em que uma solução que contém enzima líquida é atomizada em uma torre de secagem em aspersão para formar pequenas gotículas que, durante sua descida, a torre de secagem seca para formar um material de particulado que contém enzima; b) produtos em camadas, em que a enzima é revestida como uma camada ao redor de uma partícula de núcleo inerte pré-formada, em que uma solução que contém enzima é atomizada, tipicamente, em um aparelho de leito fluidizado em que as partículas de núcleo pré-formadas são fluidizadas, e a solução que contém enzima adere às partículas de núcleo e secam para deixar uma camada de enzima seca na superfície da partícula de núcleo.
As partículas de um tamanho desejado podem ser obtidas desse modo se uma partícula de núcleo útil do tamanho desejado puder ser encontrada.
Esse tipo de produto é descrito, por exemplo, no documento WO 97/23606; c) partículas de núcleo absorvidas, em que ao invés de revestir a enzima como uma camada ao redor do núcleo, a enzima é absorvida na superfície do núcleo.
Tal processo é descrito no documento WO 97/39116. d) produtos de extrusão ou peletizados, em que uma pasta que contém enzima é prensada nos péletes ou sob pressão é extrusada através de uma pequena abertura e cortada em partículas que são subsequentemente secas.
Tais partículas têm, usualmente, um tamanho considerável devido ao fato de que o material em que a abertura de extrusão é feita (usualmente uma placa com furos) define um limite na queda de pressão permissível na abertura de extrusão.
Também, as pressões de extrusão muito altas quando se usa uma pequena abertura aumentam a geração de calor na pasta enzimática, que é nociva à enzima; e) produtos perolados, em que um pó que contém enzima é suspenso em cera derretida e a suspensão é aspergida, por exemplo, através de um atomizador de disco giratório, em uma câmara de resfriamento em que as gotículas rapidamente se solidificam (Michael S.
Showell (editor); Powdered detergents; Surfactant Science Series; 1998; vol. 71; páginas 140-142; Marcel Dekker). O produto obtido é um em que a enzima é uniformemente distribuída por todo um material inerte ao invés de ser concentrada em sua superfície.
Também, US 4.016.040 e US 4.713.245 são documentos relacionados a essa técnica; f) produtos de granulação em misturador, em que um líquido é adicionado a uma composição em pó seco de, por exemplo, componentes de granulação convencionais, sendo que a enzima é introduzida por meio do líquido ou do pó ou ambos.
O líquido e o pó são misturados e à medida que a umidade do líquido é absorvida no pó seco, os componentes do pó seco começarão a aderir e o aglomerado e as partículas irão se constituir, formando granulados que compreendem a enzima.
Tal processo é descrito no documento US 4.106.991 e documentos relacionados EP 170360, EP 304332, EP 304331, WO 90/09440 e WO 90/09428. Em um produto específico desse processo em que vários misturadores de alto cisalhamento podem ser usados como granuladores, granulados que consistem em enzima como enzima, cargas e aglutinantes etc. são misturados com fibras de celulose para reforçar as partículas para render o denominado T-granulado.
As partículas reforçadas, que são mais robustas, liberam menos poeira enzimática. g) redução de tamanho, em que os núcleos são produzidos através de moagem ou trituração de partículas maiores, péletes, tabletes, briquetas etc. que contêm a enzima. A fração de partícula de núcleo desejada é obtida peneirando- se o produto moído ou triturado. As partículas sob ou subdimensionada podem ser recicladas. A redução de tamanho é descrita em (Martin Rhodes (editor); Principles of Powder Technology; 1990; Capítulo 10; John Wiley & Sons); h) granulação de leito fluidizado, que envolve suspender particulados em um fluxo de ar e aspergir um líquido nas partículas fluidizadas por meio de bocais. As partículas atingidas por gotículas da aspersão ficam úmidas e se tornam pegajosas. As partículas pegajosas colidem com outras partículas e aderem às mesmas e formam um grânulo; i) os núcleos podem ser submetidos à secagem, como em um secador de leito fluidizado. Outros métodos conhecidos para secar grânulos na indústria alimentícia ou de detergente podem ser usados pela pessoa versado. A secagem ocorre, de preferência, em uma temperatura de produto de 25 a 90 °C. Para algumas enzimas é importante que os núcleos que compreendem a enzima contenham uma baixa quantidade de água antes do revestimento. Se as enzimas sensíveis a água forem revestidas antes da água em excesso ser removida, a mesma será presa dentro do núcleo e pode afetar a atividade da enzima negativamente. Após a secagem, os núcleos, de preferência, contêm 0,1-10 % p/p de água.
[0137] O núcleo pode incluir materiais adicionais como cargas, materiais de fibra (celulose ou fibras sintéticas),
agentes estabilizadores, agentes solubilizantes, agentes de suspensão, agentes de regulação de viscosidade, esferas de luz, plastificantes, sais, lubrificantes e fragrâncias.
[0138] O núcleo pode incluir um aglutinante, como polímero sintético, cera, gordura ou carboidrato.
[0139] O núcleo pode incluir um sal de um cátion multivalente, um agente de redução, um antioxidante, um catalisador de decomposição de peróxido e/ou um componente de tampão ácido, tipicamente como uma mescla homogênea.
[0140] Na presente invenção, o núcleo pode compreender um material selecionado a partir do grupo que consiste em sais (como acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, citrato de potássio, sorbato de potássio, sulfato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, carbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco, sorbato de zinco, sulfato de zinco), amido ou a açúcar ou derivado de açúcar (como por exemplo sacarose, dextrina, glicose, lactose, sorbitol), açúcar ou derivado de açúcar (como, por exemplo, sacarose, dextrina, glicose, lactose, sorbitol), pequenas moléculas orgânicas, amido, farinha, celulose e minerais e minerais de argila (também conhecidos como filossilicatos de alumínio hidroso). De preferência, o núcleo compreende um mineral de argila como caulimita ou caulim.
[0141] O núcleo também pode incluir uma partícula inerte com a enzima absorvida na mesma, ou aplicada na superfície,
por exemplo, através de revestimento em leito fluidizado.
[0142] O núcleo pode ter um diâmetro de 20-2000 µm, particularmente, 50-1500 µm, 100-1500 µm ou 250-1200 µm.
[0143] O núcleo pode ser circundado por pelo menos um revestimento, por exemplo, para aprimorar a estabilidade em armazenamento, para reduzir a formação de poeira durante a manipulação ou para colorir o grânulo. O revestimento (ou revestimentos) opcional pode incluir um revestimento de sal e/ou cera e/ou farinha ou outros materiais de revestimento adequados.
[0144] O revestimento pode ser aplicado em uma quantidade de pelo menos 0,1 % em peso do núcleo, por exemplo, pelo menos 0,5 %, 1 % ou 5 %. A quantidade pode ser, no máximo, 100 %, 70 %, 50 %, 40 % ou 30 % em peso do núcleo.
[0145] O revestimento tem, de preferência, pelo menos 0,1 µm de espessura, particularmente, pelo menos 0,5 µm, pelo menos 1 µm ou pelo menos 5 µm. Em algumas modalidades, a espessura do revestimento está abaixo de 100 µm, como abaixo de 60 µm, ou abaixo de 40 µm.
[0146] O revestimento deve encapsular a unidade de núcleo formando-se uma camada substancialmente contínua. Uma camada substancialmente contínua deve ser compreendida como um revestimento que tem menos ou nenhum furo, de modo que a unidade de núcleo seja encapsulada ou envolvida com poucas áreas ou nenhuma área não revestida. A camada ou revestimento deve, em particular, ser homogêneo em espessura.
[0147] O revestimento pode conter adicionalmente outros materiais conforme conhecidos na técnica, por exemplo, cargas, agentes antiaderentes, pigmentos, corantes, plastificantes e/ou aglutinantes, como dióxido de titânio,
caulim, carbonato de cálcio ou talco.
[0148] De preferência, os grânulos de enzima da invenção podem compreender um núcleo que compreende as enzimas da invenção, um ou mais revestimentos de sal e um ou mais revestimentos de cera. Exemplos de grânulos enzimáticos com múltiplos revestimentos são mostrados nos documentos WO1993/07263, WO1997/23606 e WO2016/149636.
[0149] O revestimento de sal pode compreender pelo menos 60 % em de um sal, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % em peso. O revestimento de sal pode ser conforme descrito nos documentos WO1997/05245, WO1998/54980, WO1998/55599, WO2000/70034, WO2006/034710, WO2008/017661, WO2008/017659, WO2000/020569, WO2001/004279, WO1997/05245, WO2000/01793, WO2003/059086, WO2003/059087, WO2007/031483, WO2007/031485, WO2007/044968, WO2013/192043, WO2014/014647 e WO2015/197719 ou revestimento polimérico como descritos no documento WO 2001/00042.
[0150] O sal no revestimento pode ter uma umidade constante a 20 °C acima de 60 %, particularmente acima de 70 %, acima de 80 % ou acima de 85 % ou pode ser uma outra forma de hidrato de tal sal (por exemplo, anidrato).
[0151] O sal pode ser um sal inorgânico, por exemplo, sais de sulfato, sulfito, fosfato, fosfonato, nitrato, cloreto ou carbonato ou sais de ácidos orgânicos simples (menores que 10 átomos de carbono, por exemplo, 6 ou menos átomos de carbono) como citrato, malonato ou acetato. Exemplos de cátions nesses sais são íons de metal alcalino ou metal alcalinoterroso, o íon de amônio ou íons de metal da primeira série de transição, como sódio, potássio, magnésio, cálcio, zinco ou alumínio. Exemplos de ânions incluem cloreto, brometo, iodeto, sulfato, sulfito, bissulfito, tiossulfato, fosfato, fosfato monobásico, fosfato dibásico, hipofosfito, pirofosfato de di-hidrogênio, tetraborato, borato, carbonato, bicarbonato, metassilicato, citrato, malato, maleato, malonato, succinato, sorbato, lactato, formato, acetato, butirato, propionato, benzoato, tartrato, ascorbato ou gluconato. Em particular, sais de metal alcalino ou metal alcalino terroso de sulfato, sulfito, fosfato, fosfonato, nitrato, cloreto ou carbonato ou sais de ácidos orgânicos simples como citrato, malonato ou acetato podem ser usados.
[0152] Exemplos específicos de sais adequados são NaCl (CH20 °C=76 %), Na2CO3 (CH20 °C=92 %), NaNO3 (CH20 °C=73 %), Na2HPO4 (CH20 °C=95 %), Na3PO4 (CH25 °C=92 %), NH4Cl (CH20 °C = 79,5 %), (NH4)2HPO4 (CH20 °C = 93,0 %), NH4H2PO4 (CH20 °C = 93,1 %), (NH4)2SO4 (CH20 °C=81,1 %), KCl (CH20 °C=85 %), K2HPO4 (CH20 °C=92 %), KH2PO4 (CH20 °C=96,5 %), KNO3 (CH20 °C=93,5 %), Na2SO4 (CH20 °C=93 %), K2SO4 (CH20 °C=98 %), KHSO4 (CH20 °C=86 %), MgSO4 (CH20 °C=90 %), ZnSO4 (CH20 °C=90 %) e citrato de sódio (CH25 °C=86 %). Outros exemplos incluem NaH2PO4, (NH4)H2PO4, CuSO4, Mg(NO3)2, magnésio acetato, acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, citrato de potássio, sorbato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco e sorbato de zinco.
[0153] O sal pode estar na forma anidra, ou pode ser um sal hidratado, isto é, um hidrato de sal cristalino com água (ou águas) ligada de cristalização, como descrito no documento WO 99/32595. Exemplos específicos incluem sulfato de sódio anidro (Na2SO4), sulfato de magnésio anidro (MgSO4), hepta-hidrato de sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O), hepta- hidrato de sulfato de zinco (ZnSO4.7H2O), hepta-hidrato dibásico de fosfato de sódio (Na2HPO4.7H2O), hexa-hidrato de nitrato de magnésio Mg(NO3)2(6H2O)), di-hidrato de citrato de sódio e tetra-hidrato de acetato de magnésio.
[0154] O revestimento de sal pode compreender um único sal ou uma mistura de dois ou mais sais. O sal pode ser solúvel em água, em particular, que tem uma solúvel em água pelo menos 0,1 g em 100 g de água a 20 °C, de preferência, pelo menos 0,5 g por 100 g de água, por exemplo, pelo menos 1 g per 100 g de água, por exemplo, pelo menos 5 g per 100 g de água. O sal pode ser adicionado a partir de uma solução de sal em que o sal é completamente dissolvido ou a partir de uma suspensão de sal em que as partículas finas são menores que 50 µm, como menores que 10 µm ou menores que 5 µm.
[0155] Um revestimento de cera pode compreender pelo menos 60 % em de uma cera, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % em peso.
[0156] Exemplos específicos de ceras são polietileno glicóis; polipropilenos; cera de carnaúba; cera de candelila; cera de abelha; óleo vegetal hidrogenado ou sebo animal como polietileno glicol (PEG), metil hidroxi-propil celulose (MHPC), álcool polivinílico (PVA), sebo de boi hidrogenado, óleo de palma hidrogenado, sementes de algodão hidrogenadas e/ou óleo de soja hidrogenado; álcoois de ácido graxo; monoglicerídeos e/ou diglicerídeos, como estearato de glicerila, em que o estearato é uma mistura de ácido esteárico e palmítico; cera microcristalina; parafinas; e ácidos graxos, como ácidos graxos de cadeia longa linear hidrogenados e derivados dos mesmos. Uma cera preferencial é o óleo de palma ou óleo de palma hidrogenado.
[0157] O granulado da presente invenção também pode ser produzido como um granulado de não pulverização, por exemplo, conforme revelado nas Patentes Nº US 4.106.991 e 4.661.452 e pode ser opcionalmente revestido por meio de métodos conhecidos na técnica. Os materiais de revestimento podem ser materiais de revestimento de cera e materiais de revestimento de formação de filme. Exemplos de materiais de revestimento de cera são produtos de poli(óxido de etileno) (polietileno glicol, PEG) com pesos molares médios de 1000 a 20000; nonilfenóis etoxilados que têm de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados em que o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e em que há 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidos graxos; e mono e di e triglicerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento de formação de filme adequados para aplicação por meio de técnicas de leito fluidizado são dados no documento GB 1483591.
[0158] O granulado pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais. Cada enzima estará presente, então, em mais grânulos garantindo uma distribuição mais uniforme das enzimas, e também reduz a segregação física de diferentes enzimas devido aos diferentes tamanhos de partícula. Métodos para produzir cogranulados de múltiplas enzimas são revelados na revelação ip.com IPCOM000200739D.
[0159] Um outro exemplo de formulação de enzimas através do uso de cogranulados é revelado no documento WO 2013/188331.
[0160] A presente invenção também se refere a enzimas protegidas preparadas de acordo com o método revelado no documento EP 238.216.
[0161] Então, de preferência, a presente invenção fornece um grânulo, que compreende: (a) um núcleo que compreende o polipeptídeo que tem atividade de protease e o polipeptídeo que tem atividade de muramidase de acordo com a invenção, e (b) um revestimento que consiste em uma ou mais camada (ou camadas) que circunda o núcleo.
[0162] Na presente invenção, o revestimento compreende um revestimento de sal conforme descrito no presente documento. De preferência, o revestimento compreende um revestimento de cera conforme descrito no presente documento. Com mais preferência, o revestimento compreende um revestimento de sal seguido por um revestimento de cera conforme descrito no presente documento. Ainda com mais preferência, o polipeptídeo que tem atividade de protease e o polipeptídeo que tem atividade de muramidase são cogranulados.
[0163] Na presente invenção, a composição pode compreender adicionalmente um ou mais componentes selecionados a partir da lista que consiste em um ou mais carreadores. O carreador pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em água, glicerol, etileno glicol, 1, 2-
propileno glicol ou 1, 3-propileno glicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, maltodextrina, glicose, sacarose, sorbitol, lactose, farinha de trigo, farelo de trigo, farinha de glúten de milho, amido, caulim e celulose ou qualquer combinação dos mesmos.
[0164] Na presente invenção, a composição pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais; um ou mais eubióticos; uma ou mais vitaminas; um ou mais minerais, e um ou mais aminoácidos, conforme descrito abaixo. Ração Animal
[0165] No segundo aspecto, a presente invenção se refere a uma ração animal que compreende um aditivo de ração animal, uma ou mais fontes de proteína e uma ou mais fontes de energia, sendo a ração animal caracterizada por compreender adicionalmente um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de protease como definido acima.
[0166] Dietas ou composições de ração animal têm um teor relativamente alto de proteína. As dietas de aves e porcos podem ser caracterizadas conforme indicado na Tabela B do documento WO 01/58275, colunas 2-3. As dietas de peixes podem ser caracterizadas conforme indicado na coluna 4 desta Tabela B. Ademais, tais dietas de peixe normalmente têm um teor de gordura bruta de 200-310 g/kg.
[0167] Uma composição de ração animal de acordo com a invenção tem um teor de proteína bruta de 50-800 g/kg. A fonte de proteína pode ser fonte de proteína vegetal e/ou proteína animal.
[0168] As proteínas vegetais podem ser derivadas de fontes de proteína vegetal, como legumes e cereais, por exemplo, materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, e Poaceae, como farinha de soja, farinha de tremoço, farinha de colza e combinações das mesmas. O teor de proteína das proteínas vegetais é pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90 % (p/p).
[0169] De preferência, a fonte de proteína vegetal pode ser material de uma ou mais plantas da família Fabaceae, por exemplo, soja, tremoço, ervilha ou feijão. A fonte de proteína vegetal também pode ser material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, por exemplo, beterraba, beterraba sacarina, espinafre ou quinoa. Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são colza e repolho. Na presente invenção, soja é uma fonte de proteína vegetal preferencial. Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são cereais como cevada, trigo, centeio, aveia, maís (milho), arroz e sorgo.
[0170] Além da proteína vegetal como definido acima, a ração animal da invenção também pode conter proteína animal, como Farinha de Carne e Ossos, Farinha de penas e/ou Farinha de peixe, tipicamente em uma quantidade de 0-25 %. A ração animal da invenção também pode compreender grão seco de destiladores com solúveis (DDGS), tipicamente em quantidades de 0-30 %.
[0171] De preferência, a fonte de proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em soja, soja selvagem, feijão, tremoço, feijão Tepary, feijão-da-Espanha, feijão slimjim, feijão-de-lima, vagem francesa, fava comum (feijão-
fava), grão de bico, lentilha, amendoim, amendoim Spanish, canola, semente de girassol, semente de algodão, colza (semente oleaginosa de colza) ou ervilha ou em uma forma processada como farinha de soja, farinha de soja integral, concentrado de proteína de soja (SPC), farinha de soja fermentada (FSBM), farinha de girassol, farinha de semente de algodão, farinha de colza, farinha de peixe, farinha de osso, farinha de pena, soro ou qualquer combinação dos mesmos.
[0172] Ademais, ou alternativamente (ao teor de proteína bruta indicado acima), a composição de ração animal da invenção pode ter um teor de energia metabolizável de 10-30 MJ/kg. Na presente invenção, a fonte de energia pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em maís, milho, sorgo, trigo, cevada, aveia, arroz, triticale, centeio, beterraba, beterraba sacarina, espinafre, batata, mandioca, quinoa, repolho, switchgrass, painço, milheto, milho-da- Itália ou em uma forma processada como milho moído, maís moído, amido de batata, amido de mandioca, sorgo moído, switchgrass moído, painço moído, milho-da-Itália moído, milheto moído, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0173] Ademais, ou alternativamente (ao teor de proteína bruta indicado acima), a composição de ração animal da invenção pode ter um teor de cálcio de 0,1-200 g/kg; e/ou um teor de fósforo disponível de 0,1-200 g/kg; e/ou um teor de metionina de 0,1-100 g/kg; e/ou um teor de metionina mais cisteína de 0,1-150 g/kg; e/ou um teor de lisina de 0,5-50 g/kg.
[0174] Em particular, o teor de energia metabolizável, proteína bruta, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais cisteína, e/ou lisina pode estar dentro de qualquer das faixas 2, 3, 4 ou 5, na Tabela B do documento WO 01/58275 (R. 2-5).
[0175] A proteína bruta é calculada como nitrogênio (N) multiplicado por um fator 6,25, isto é, proteína bruta (g/kg)= N (g/kg) x 6,25. O teor de nitrogênio é determinado através do método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analyse 14ª edição, Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).
[0176] A energia metabolizável pode ser calculada com base nos requisitos de Nutrientes da publicação de NRC em suíno, nona edição revisada 1988, subcomitê em nutrição suína, comitê em nutrição animal, junta de agricultura, conselho de pesquisa nacional. National Academy Press, Washington, D.C., páginas 2-6, e o European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Países- Baixos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5. a. teor dietário de cálcio, fósforo e aminoácidos disponíveis em dietas animais completas é calculado com base nas tabelas alimentícias como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.
[0177] De preferência, a ração animal da invenção contém 0-80 % de maís; e/ou 0-80 % de sorgo; e/ou 0-70 % de trigo; e/ou 0-70 % de cevada; e/ou 0-30 % de aveias; e/ou 0-40 % de farinha de soja; e/ou 0-25 % de farinha de peixe; e/ou 0-25 % de farinha de carne e ossos; e/ou 0-20 % de soro.
[0178] A ração animal pode, por exemplo, ser fabricada como ração amassada (não peletizada) ou ração peletizada. Tipicamente, os gêneros alimentícios moídos são misturados e quantidades suficientes de vitaminas e minerais essenciais são adicionados de acordo com as especificações para as espécies em questão. As enzimas podem ser adicionadas como formulações enzimáticas sólidas ou líquidas. Por exemplo, para ração amassada uma formulação enzimática sólida ou líquida pode ser adicionada antes ou durante a etapa de misturação de ingrediente. Para a ração peletizada (líquida ou sólida) a preparação de protease/muramidase/enzima também pode ser adicionada antes ou durante a etapa de ingrediente de ração. Tipicamente, uma preparação de enzima líquida compreende a protease, a muramidase ou tanto a protease quanto a muramidase da invenção opcionalmente com um poliol, como glicerol, etileno glicol ou propileno glicol, e é adicionada após a etapa de peletização, como aspergindo-se a formulação líquida nos péletes. A protease e/ou a muramidase também podem ser incorporadas em um aditivo de ração ou pré-mistura.
[0179] Alternativamente, a protease/muramidase pode ser preparada congelando-se uma mistura de solução de enzima líquida com um agente de tamponamento como farinha de soja triturada e, então, liofilizando-se a mistura.
[0180] Na presente invenção, a ração animal pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais; um ou mais eubióticos; uma ou mais vitaminas; um ou mais minerais, e um ou mais aminoácidos, conforme descrito abaixo.
[0181] A concentração de muramidase final na ração está dentro da faixa de 100 a 1000 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, como 200 a 900 mg, 300 a 800 mg, 400 a 700 mg ou 500 a 600 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0182] A concentração de protease final na ração está dentro da faixa de 50 a 300 mg por kg de ração animal, como 80 a 250 mg, 100 a 200 mg por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0183] A ração animal da presente invenção pode ser produzida por meio de qualquer processo conhecido. Por exemplo, a ração animal da presente invenção é preparada por meio de um processo que compreende as etapas de: (a) misturar um aditivo de ração animal com uma ou mais fontes de proteína e uma ou mais fontes de energia; (b) tratar opcionalmente com vapor a ração animal de (a) seguido pela prensagem da mistura tratada com vapor para formar péletes; e (c) aspergir opcionalmente uma formulação líquida na ração animal de (a) ou (b).
[0184] No presente processo, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase pode ser adicionado na etapa (a) e o polipeptídeo que tem atividade de protease pode ser adicionado na etapa (c). Em uma modalidade, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase é adicionado na etapa (c) e o polipeptídeo que tem atividade de protease é adicionado na etapa (a). Em uma modalidade, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase e o polipeptídeo que tem atividade de protease é adicionado na etapa (a). Em uma modalidade, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase e o polipeptídeo que tem atividade de protease é adicionado na etapa (c).
[0185] No presente processo, a ração animal pode ser peletizada por meio de tratamento com vapor da mistura de (a) para obter um teor de umidade abaixo de 20 % em peso da mistura, e prensar a mistura tratada com vapor para formar péletes. De preferência, a ração animal é peletizada através de tratamento com vapor da mistura de (a) para obter um teor de umidade abaixo de 20 % em peso da mistura em que o tratamento com vapor é entre 60 °C e 100 °C quando medido na saída do condicionador, e prensar a mistura tratada com vapor para formar péletes. No presente processo, o tempo de permanência total na etapa b) pode ser entre 1 segundo e 10 minutos. No presente processo, a temperatura dos péletes após a peletização da mistura tratada com vapor pode ser entre 70 °C e 105 °C. Enzimas Adicionais
[0186] Na presente invenção, as composições e/ou a ração animal descrita no presente documento podem incluir opcionalmente uma ou mais enzimas. As enzimas podem ser classificadas com base no handbook Enzyme Nomenclature de NC-IUBMB, 1992), vide também o site na internet: http://www.expasy.ch/enzyme/. ENZYME é um repositório de informações relativas à nomenclatura de enzimas. É principalmente baseado nas recomendações do Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUB-MB), Academic Press, Inc., 1992, e descreve cada tipo de enzima caracterizada para a qual um número de EC (Comissão de Enzima) foi fornecido (Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305). Essa nomenclatura de IUB-MB Enzyme se baseia em sua especificidade de substrato e, ocasionalmente em seu mecanismo molecular; como uma classificação não reflete as características estruturais dessas enzimas.
[0187] Uma outra classificação de determinadas enzimas de glicosídeo hidrolase, como endoglucanase, galactanase, mananase, dextranase e galactosidase é descrita em Henrissat et al, “The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013”, Nucl. Acids Res. (1 de janeiro de 2014) 42 (D1): D490- D495; vide também www.cazy.org.
[0188] Então, a composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da presente invenção podem compreender pelo menos uma outra enzima selecionada a partir do grupo que consiste em acetilxilan esterase (EC 3.1.1.23), acilglicerol lipase (EC 3.1.1.72), alfa-amilase (EC 3.2.1.1), beta- amilase (EC 3.2.1.2), arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55), celobio-hidrolases (EC 3.2.1.91), celulase (EC 3.2.1.4), feruloil esterase (EC 3.1.1.73), galactanase (EC 3.2.1.89), alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22), beta-galactosidase (EC
3.2.1.23), beta-glucanase (EC 3.2.1.6), beta-glucosidase (EC
3.2.1.21), triacilglicerol lipase (EC 3.1.1.3), lisofosfolipase (EC 3.1.1.5), muramidase (EC 3.2.1.17), alfa-manosidase (EC 3.2.1.24), beta-manosidase (mananase) (EC 3.2.1.25), fitase (EC 3.1.3.8, EC 3.1.3.26, EC 3.1.3.72), fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32), fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4), fosfolipase D (EC 3.1.4.4), protease (EC 3.4), pululanase (EC 3.2.1.41), pectinesterase (EC 3.1.1.11), xilanase (EC
3.2.1.8, EC 3.2.1.136), beta-xilosidase (EC 3.2.1.37), ou qualquer combinação dos mesmos.
[0189] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da invenção também pode compreender uma galactanase (EC 3.2.1.89) e uma beta-galactosidase (EC 3.2.1.23).
[0190] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da presente invenção também pode compreender uma fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26). Exemplos de fitases comercialmente disponíveis incluem Bio-FeedTM Phytase (Novozymes), Ronozyme® P, Ronozyme® NP e Ronozyme® HiPhos (DSM Nutritional Products), NatuphosTM (BASF), NatuphosTM E (BASF), Finase® e Quantum® Blue (AB Enzymes), OptiPhos® (Huvepharma), AveMix® Phytase (Aveve Biochem), Phyzyme® XP (Verenium/DuPont) e Axtra® PHY (DuPont). Outras fitases preferenciais incluem aquelas descritas, por exemplo, nos documentos WO 98/28408, WO 00/43503 e WO 03/066847.
[0191] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da presente invenção também pode compreender uma xilanase (EC 3.2.1.8). Exemplos de xilanases comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® WX (DSM Nutritional Products), Econase® XT e Barley (AB Vista), Xylathin® (Verenium), Hostazym® X (Huvepharma), Axtra® XB (Xilanase/beta- glucanase, DuPont) e Axtra® XAP (Xilanase/amilase/protease, DuPont), AveMix® XG 10 (xilanase/glucanase) e AveMix® 02 CS (xilanase/glucanase/pectinase, Aveve Biochem), e Naturgrain (BASF).
[0192] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da invenção também pode compreender uma protease (EC
3.4). Exemplos de proteases comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® ProAct (DSM Nutritional Products), Winzyme Pro Plus® (Suntaq International Limited) e Cibenza® DP100 (Novus International).
[0193] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da invenção também compreende uma alfa-amilase (EC
3.2.1.1). Exemplos de alfa-amilases comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® A e RONOZYME® RumiStar™ (DSM
Nutritional Products).
[0194] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da invenção também pode compreender um produto enzimático de múltiplos componentes, como FRA® Octazyme (Framelco), Ronozyme® G2, Ronozyme® VP e Ronozyme® MultiGrain (DSM Nutritional Products), Rovabio® Excel ou Rovabio® Advance (Adisseo). Eubióticos
[0195] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da invenção pode compreender adicionalmente eubióticos. Os eubióticos são compostos que são projetados para fornecer um equilíbrio saudável da microflora no trato gastrointestinal. Os eubióticos cobrem um número de aditivos de ração diferentes, como probióticos, pré-bióticos, fitogênicos (óleos essenciais) e ácidos orgânicos que são descritos em mais detalhes abaixo. Probióticos
[0196] Na presente invenção, a composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal pode compreender adicionalmente um ou mais probióticos adicionais. Em particular, a composição de ração animal pode compreender adicionalmente uma bactéria de um ou mais dos seguintes gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphaera ou qualquer combinação dos mesmos.
[0197] De preferência, a composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal compreendem adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Enterococcus faecium, Enterococcus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminus, lactobacillus rhamnosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Megasphaera elsdenii, Propionibacteria sp.
[0198] Com mais preferência, a composição ou a ração animal da presente invenção compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus subtilis: 3A-P4 (PTA-6506), 15A-P4 (PTA-6507), 22C-P1 (PTA- 6508), 2084 (NRRL B-500130), LSSA01 (NRRL-B-50104), BS27 (NRRL B-501 05), BS 18 (NRRL B-50633), BS 278 (NRRL B-50634), DSM 29870, DSM 29871, DSM 32315, NRRL B-50136, NRRL B-50605, NRRL B-50606, NRRL B-50622 e PTA-7547.
[0199] Com mais preferência, a composição ou a ração animal da presente invenção compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus pumilus: NRRL B-50016, ATCC 700385, NRRL B-50885 ou NRRL B-
50886.
[0200] Com mais preferência, a composição ou a ração animal da presente invenção compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus lichenformis: NRRL B 50015, NRRL B-50621 ou NRRL B-50623.
[0201] Com mais preferência, a composição ou a ração animal da presente invenção compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus amyloliquefaciens: DSM 29869, DSM 29869, NRRL B 50607, PTA- 7543, PTA-7549, NRRL B-50349, NRRL B-50606, NRRL B-50013, NRRL B-50151, NRRL B-50141, NRRL B-50147 ou NRRL B-50888.
[0202] A contagem bacteriana de cada uma das cepas bacterianas na composição, na ração animal ou no aditivo de ração animal é entre 1x104 e 1x1014 CFU/kg de matéria seca, de preferência, entre 1x106 e 1x1012 CFU/kg de matéria seca, e, com mais preferência, entre 1x107 e 1x1011 CFU/kg de matéria seca. De preferência, a contagem bacteriana de cada uma das cepas bacterianas na composição, na ração animal ou no aditivo de ração animal é entre 1x108 e 1x1010 CFU/kg de matéria seca.
[0203] A contagem bacteriana de cada uma das cepas bacterianas na composição, na ração animal ou no aditivo de ração animal é entre 1x105 e 1x1015 CFU/animal/dia, de preferência, entre 1x107 e 1x1013 CFU/animal/dia e, com mais preferência, entre 1x108 e 1x1012 CFU/animal/dia. De preferência, a contagem bacteriana de cada uma das cepas bacterianas na composição, na ração animal ou no aditivo de ração animal é entre 1x109 e 1x1011 CFU/animal/dia. Com mais preferência, a quantidade de probióticos é 0,001 % a 10 % em peso da composição ou da ração animal ou aditivo de ração animal.
[0204] Na presente invenção, a uma ou mais cepas bacterianas podem estar presentes na forma de um esporo estável.
[0205] Exemplos de produtos comerciais são Cylactin® (DSM Nutritional Products), Alterion (Adisseo), Enviva PRO (DuPont Animal Nutrition), Syncra® (mistura de enzima + probiótico, DuPont Animal Nutrition), Ecobiol® e Fecinor® (Norel/Evonik) e GutCare® PY1 (Evonik). Pré-bióticos
[0206] Os pré-bióticos são substâncias que induzem o crescimento ou a atividade de microrganismos (por exemplo, bactérias e fungos) que contribuem para o bem-estar de seu hospedeiro. Os pré-bióticos são tipicamente compostos de fibra não digeríveis que passam não digeridas através da parte superior do trato gastrointestinal e estimulam o crescimento ou a atividade de bactérias vantajosas que colonizam o intestino grosso agindo-se como substrato para os mesmos. Normalmente, os pré-bióticos aumentam o número ou a atividade de bactérias bífidas e bactérias formadoras de ácido láctico no trato GI.
[0207] Os derivados de levedura (leveduras integrais inativadas ou paredes celulares de levedura) também podem ser considerados como pré-bióticos. Os mesmos frequentemente compreendem manan-oligossacarídeos, beta-glucanos de levedura ou teores de proteína e são normalmente derivados da parede celular da levedura, Saccharomyces cerevisiae.
[0208] Na presente invenção, a quantidade de pré-bióticos pode ser 0,001 % a 10 % em peso da composição. Exemplos de produtos de levedura são Yang® e Agrimos (Lallemand Animal Nutrition). Fitogênicos
[0209] Os fitogênicos são um grupo de promotores de crescimento natural ou promotores de crescimento não antibiótico usados como aditivos de ração, derivados de ervas, especiarias ou outras plantas. Os fitogênicos podem ser substâncias únicas preparadas a partir de óleos essenciais/extratos, óleos essenciais/extratos, plantas únicas e misturas de plantas (produtos herbais) ou mistura de óleos essenciais/extratos/ plantas (produtos especializados).
[0210] Exemplos de fitogênicos são alecrim, sálvia, orégano, tomilho, cravo e capim-limão. Exemplos de óleos essenciais são timol, eugenol, meta-cresol, vanilina, salicilato, resorcina, guajacol, gingerol, óleo de lavanda, iononas, irona, eucaliptol, mentol, óleos de hortelã, alfa- pineno; limoneno, anetol, linalol, metil di-hidrojasmonato, carvacrol, ácido propiônico/propionato, ácido acético/acetato, ácido butírico/butirato, óleo de alecrim, óleo de cravo, geraniol, terpineol, citronelol, salicilato de amila e/ou benzila, cinamaldeído, polifenol vegetal (tanino), extrato de açafrão e cúrcuma.
[0211] Na presente invenção, a quantidade de fitogênicos pode ser 0,001 % a 10 % em peso da composição. Exemplos de produtos comerciais são Crina® (DSM Nutritional Products); CinergyTM, BiacidTM, ProHacidTM Classic e ProHacidTM AdvanceTM (todos Promivi/Cargill) e Envivo EO (DuPont Animal Nutrition). Ácidos Orgânicos
[0212] Os ácidos orgânicos (C1–C7) são amplamente distribuídos na natureza como constituintes normais de tecidos vegetais ou animais. Os mesmos também são formados através de fermentação microbiana de carboidratos principalmente no intestino grosso. Os mesmos são frequentemente usados em produção suína ou de aves como uma substituição de promotores de crescimento antibiótico uma vez que os mesmos têm um efeito preventivo nos problemas intestinais como enterite necrótica em galinhas e infecções por Escherichia coli em porcos jovens. Os ácidos orgânicos podem ser vendidos como monocomponente ou misturas de tipicamente 2 ou 3 ácidos orgânicos diferentes. Exemplos de ácidos orgânicos são ácidos graxos de cadeia curta (por exemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico), ácidos graxos de cadeia média (por exemplo, ácido caproico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico), ácidos di/tricarboxílicos (por exemplo, ácido fumárico), hidróxi ácidos (por exemplo, ácido láctico), ácidos aromáticos (por exemplo, ácido benzoico), ácido cítrico, ácido sórbico, ácido málico e ácido tartárico ou seu sal (tipicamente sal de sódio ou potássio como diformato de potássio ou butirato de sódio).
[0213] Na presente invenção, a quantidade de ácido orgânico pode ser 0,001 % a 10 % em peso da composição. Exemplos de produtos comerciais são VevoVitall® (DSM Nutritional Products), Amasil®, Luprisil®, Lupro-Grain®, Lupro-Cid®, Lupro-Mix® (BASF), n-Butyric Acid AF (OXEA) e Adimix Precision (Nutriad). Aminoácidos
[0214] A composição ou a ração animal da invenção pode compreender adicionalmente um ou mais aminoácidos. Exemplos de aminoácidos que são usados são lisina, alanina, beta- alanina, treonina, metionina e triptofano. Na presente invenção, a quantidade de aminoácido pode ser 0,001 % a 10 % em peso da composição ou da ração animal. Vitaminas e Minerais
[0215] Na presente invenção, a composição ou a ração animal pode incluir uma ou mais vitaminas, como uma ou mais vitaminas solúveis em gordura e/ou uma ou mais vitaminas solúveis em água. Além disso, a composição ou a ração animal pode incluir opcionalmente um ou mais minerais, como um ou mais minerais traço e/ou um ou mais macrominerais.
[0216] Geralmente, vitaminas solúveis em água e em gordura, bem como minerais traço formam parte de uma denominada pré-mistura pretendida para a adição à ração, ao passo que macrominerais geralmente são adicionados separadamente à ração.
[0217] Exemplos não limitantes de vitaminas solúveis em gordura incluem vitamina A, vitamina D3, vitamina E, e vitamina K, por exemplo, vitamina K3.
[0218] Exemplos não limitantes de vitaminas solúveis em água incluem vitamina C, vitamina B12, biotina e colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo, Ca-D-pantotenato.
[0219] Exemplos não limitantes de minerais traço incluem boro, cobalto, cloreto, cromo, cobre, fluoreto, iodeto, ferro, manganês, molibdênio, iodo, selênio e zinco.
[0220] Exemplos não limitantes de macrominerais incluem cálcio, magnésio, fósforo, potássio e sódio.
[0221] Na presente invenção, a quantidade de vitaminas pode ser 0,001 % a 10 % em peso da composição ou da ração animal. De preferência, a quantidade de minerais é 0,001 % a 10 % em peso da composição ou da ração animal.
[0222] Os requisitos nutricionais desses componentes (exemplificados com aves e leitões/porcos) são listados na Tabela A do documento WO 01/58275. Requisitos nutricionais significa que esses componentes devem ser fornecidos na dieta nas concentrações indicadas.
[0223] Alternativamente, a composição ou a ração animal da invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados na Tabela A do documento WO 01/58275. Pelo menos um significa qualquer um dentre, um ou mais de, um, ou dois, ou três, ou quatro e assim por diante até todos os treze ou até todos os quinze componentes individuais. Mais especificamente, esse pelo menos um componente individual está incluído no aditivo da invenção em tal quantidade de modo a fornecer uma concentração em ração dentro da faixa indicada na coluna quatro, ou coluna cinco, ou coluna seis da Tabela A.
[0224] De preferência, a composição ou a ração animal da invenção compreende pelo menos uma das vitaminas abaixo, de preferência, para fornecer uma concentração em ração dentro das faixas especificadas na Tabela 1 abaixo (para dietas de leitão e dietas de frango de corte, respectivamente). Tabela 1: Recomendações de vitamina típicas Dieta de frango Vitamina Dieta de leitão de corte
10.000-15.000 8-12.500 IU/kg Vitamina A IU/kg de ração de ração 1800-2000 IU/kg de 3000-5000 IU/kg Vitamina D3 ração de ração 60-100 mg/kg de 150-240 mg/kg de Vitamina E ração ração 2-4 mg/kg de Vitamina K3 2-4 mg/kg de ração ração Vitamina B1 2-4 mg/kg de ração 2-3 mg/kg de
Dieta de frango Vitamina Dieta de leitão de corte ração 6-10 mg/kg de 7-9 mg/kg de Vitamina B2 ração ração 3-6 mg/kg de Vitamina B6 4-8 mg/kg de ração ração 0,03-0,05 mg/kg de 0,015-0,04 mg/kg Vitamina B12 ração de ração Niacina (Vitamina 30-50 mg/kg de 50-80 mg/kg de B3) ração ração 20-40 mg/kg de 10-18 mg/kg de Ácido Pantotênico ração ração 1-2 mg/kg de Ácido fólico 1-2 mg/kg de ração ração 0,15-0,4 mg/kg de 0,15-0,3 mg/kg Biotina ração de ração 200-400 mg/kg de 300-600 mg/kg de Cloreto de colina ração ração Outros ingredientes de ração
[0225] A composição ou a ração animal da invenção pode compreender adicionalmente agentes colorantes, estabilizadores, aditivos de melhora de crescimento e compostos de aroma/saborizantes, ácidos graxos poli- insaturados (PUFAs); espécies geradoras de oxigênio reativo, antioxidantes, peptídeos antimicrobianos, polipeptídeos antifúngicos e compostos de gerenciamento de micotoxina.
[0226] Exemplos de agentes de coloração são carotenoides como beta-caroteno, astaxantina e luteína.
[0227] Exemplos de compostos de aroma/saborizantes são creosol, anetol, deca-, undeca- e/ou dodeca-lactonas, iononas, irona, gingerol, piperidina, ftaleto de propilideno, ftaleto de butilideno fataleto, capsaicina e tanino.
[0228] Exemplos de peptídeos antimicrobianos (AMP’s) são CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina e Ovispirina como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), Plectasinas e Estatinas, incluindo os compostos e polipeptídeos revelados nos documentos WO 03/044049 e WO 03/048148, assim como variantes ou fragmentos dos expostos acima que retêm atividade antimicrobiana.
[0229] Exemplos de polipeptídeos antifúngicos (AFP’s) são os peptídeos Aspergillus giganteus, e Aspergillus niger, assim como variantes e fragmento dos mesmos que retêm atividade antifúngica, conforme revelado nos documentos WO 94/01459 e WO 02/090384.
[0230] Exemplos de ácidos graxos poli-insaturados são ácidos graxos poli-insaturados C18, C20 e C22, tais como ácido araquidônico, ácido docoso-hexaenoico, ácido eicosapentaenoico e ácido gama-linoleico.
[0231] Exemplos de espécies geradoras de oxigênio reativo são produtos químicos como perborato, persulfato ou percarbonato; e enzimas como uma oxidase, uma oxigenase ou uma sintetase.
[0232] Os antioxidantes podem ser usados para limitar o número de espécies de oxigênio reativo que podem ser geradas de modo que o nível de espécies de oxigênio reativo esteja em equilíbrio com os antioxidantes.
[0233] Micotoxinas, como desoxinivalenol, aflatoxina, zearalenona e fumonisina podem ser encontradas em ração animal e podem resultar em desempenho negativo ou doença animal. Os compostos que podem gerenciar os níveis de micotoxina, como por meio de desativação da micotoxina ou por meio de ligação da micotoxina, podem ser adicionados à ração para melhorar esses efeitos negativos. Exemplos de compostos de gerenciamento de micotoxina são Vitafix®, Vitafix Ultra (Nuscience), Mycofix®, Mycofix® Secure, FUMzyme®, Biomin® BBSH, Biomin® MTV (Biomin), Mold-Nil®, Toxy-Nil® e Unike® Plus (Nutriad). Métodos de Aprimoramento de Desempenho de Animal e/ou Qualidade dos Detritos e/ou Dermatite no Coxim e/ou de Tratamento de Infecção contra Clostridium Perfringens
[0234] No terceiro aspecto, a invenção se refere adicionalmente a um método de aprimoramento de Fator de Eficiência de Produção Europeia (EPEF), Peso Corporal (BW) e/ou Razão de Conversão de Ração (FCR); aprimoramento da qualidade dos detritos e/ou dermatite no coxim; e/ou tratamento de infecção por Clostridium perfringens de um animal monogástrico que compreende administrar ao animal a composição ou a ração animal compreendendo um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de protease conforme definido acima.
[0235] Na presente invenção, o aprimoramento é comparado à mesma ração, mas exclui a muramidase.
[0236] Na presente invenção, o EPEF é aprimorado em pelo menos 1 %, como em pelo menos 1,5 %, pelo menos 2,0 %, pelo menos 2,5 %, pelo menos 3 %, pelo menos 3,5 %, pelo menos 4 % ou pelo menos 5 %. Em uma outra modalidade, a EPEF é aprimorada entre 1 % e 15 %, como entre 1 % e 12 %, entre 1 % e 10 %, 1,5 % e 8 %, 2,0 % e 7 %, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0237] Na presente invenção, a FCR é aprimorada em pelo menos 1 %, como em pelo menos 1,25 %, pelo menos 1,5 % ou pelo menos 1,75 %. Em uma outra modalidade, a FCR é aprimorada entre 1 % e 5 %, como entre 1 % e 4 %, entre 1 % e 3 %, 1,25 % e 2,5 %, 1,5 % e 2 %, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0238] Na presente invenção, um ou mais parâmetros da qualidade dos detritos pode ser aprimorada em pelo menos 0,5 %, como em pelo menos 1,0 %, pelo menos 1,5 % ou pelo menos 2,0 %.
[0239] Na presente invenção, o escore de dermatite no coxim pode ser aprimorado em pelo menos 1 %, como em pelo menos 1,25 %, pelo menos 1,5 % ou pelo menos 1,75 %.
[0240] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de protease pode ser dosado em um nível de 50 a 300 mg por kg de ração animal, como 80 a 250 mg, 100 a 200 mg por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0241] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase pode ser dosado em um nível de 100 a 1000 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, como 200 a 900 mg, 300 a 800 mg, 400 a 700 mg ou 500 a 600 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0242] Na presente invenção, o animal é um animal monogástrico, por exemplo, porcos ou suínos (incluindo, mas sem limitação, leitões, porcos em crescimento e porcas gestantes); aves (incluindo, mas sem limitação, ave, peru, pato, codorna, galinha-da-angola, ganso, pombo, pombo jovem, galinha, frango de corte, poedeira, franga e pinto); animais de estimação, como gatos e cachorros, peixe (incluindo, mas sem limitação, seriola, pirarucu, barbo, achigã, anchova, bocachico, brema, peixe-gato, cachama, carpa, bagre, catla, chanos, truta-de-lago, acará-grande, bijupirá, bacalhau, tipo de peixe branco, dourada, corvina, moreia, góbio, peixe- dourado, gourami, garoupa, guapote, linguado, java, labeo, lai, botia, cavala, peixe-leite, carapeba, salamandra, tainha, paco, peixe-mexerica, peixe-rei, perca, pike, pampo- galhudo, rutilis, salmão, sampa, sauger, robalo, dourada, shiner, góbio-dorminhoco, peixe cabeça-de-cobra, pargo, robalo comum, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, curimatã, peixe-médico, peixe terror, tilápia, truta, atum, rodovalho, cisco europeia, picão-verde e peixe-branco); e crustáceos (incluindo, mas sem limitação, camarões e pitus). Em uma modalidade mais preferencial, o animal é selecionado a partir do grupo que consiste em suíno, ave, crustáceos e peixe. Em uma modalidade ainda mais preferencial, o animal é selecionado a partir do grupo que consiste em suíno, leitão, porco em crescimento, porca gestante, galinha, frango de corte, poedeira, franga e pinto. Uso no Aprimoramento de Desempenho Animal
[0243] No quinto aspecto, a invenção se refere adicionalmente ao uso de uma composição ou uma ração animal no aprimoramento de Fator de Eficiência de Produção Europeia (EPEF), Peso Corporal (BW) e/ou Razão de Conversão de Ração (FCR); aprimoramento da qualidade dos detritos e/ou dermatite no coxim; e/ou tratamento de infecção por Clostridium perfringens de um animal monogástrico em que a composição e a ração animal compreendem um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de protease conforme definido acima.
[0244] Na presente invenção, o aprimoramento é comparado à mesma ração, mas exclui a muramidase.
[0245] Na presente invenção, o EPEF é aprimorado em pelo menos 1 %, como em pelo menos 1,5 %, pelo menos 2,0 %, pelo menos 2,5 %, pelo menos 3 %, pelo menos 3,5 %, pelo menos 4 % ou pelo menos 5 %. Em uma outra modalidade, a EPEF é aprimorada entre 1 % e 15 %, como entre 1 % e 12 %, entre 1 % e 10 %, 1,5 % e 8 %, 2,0 % e 7 %, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0246] Na presente invenção, a FCR é aprimorada em pelo menos 1 %, como em pelo menos 1,25 %, pelo menos 1,5 % ou pelo menos 1,75 %. Em uma outra modalidade, a FCR é aprimorada entre 1 % e 5 %, como entre 1 % e 4 %, entre 1 % e 3 %, 1,25 % e 2,5 %, 1,5 % e 2 %, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0247] Na presente invenção, um ou mais parâmetros da qualidade dos detritos pode ser aprimorada em pelo menos 0,5 %, como em pelo menos 1,0 %, pelo menos 1,5 % ou pelo menos 2,0 %.
[0248] Na presente invenção, o escore de dermatite no coxim pode ser aprimorado em pelo menos 1 %, como em pelo menos 1,25 %, pelo menos 1,5 % ou pelo menos 1,75 %.
[0249] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de protease pode ser dosado em um nível de 50 a 300 mg por kg de ração animal, como 80 a 250 mg, 100 a 200 mg por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0250] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase pode ser dosado em um nível de 100 a 1000 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, como 200 a 900 mg, 300 a 800 mg, 400 a 700 mg ou 500 a 600 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.
[0251] Na presente invenção, o animal é um animal monogástrico, por exemplo, porcos ou suínos (incluindo, mas sem limitação, leitões, porcos em crescimento e porcas gestantes); aves (incluindo, mas sem limitação, ave, peru, pato, codorna, galinha-da-angola, ganso, pombo, pombo jovem, galinha, frango de corte, poedeira, franga e pinto); peixe (incluindo, mas sem limitação, seriola, pirarucu, barbo, achigã, anchova, bocachico, brema, peixe-gato, cachama, carpa, bagre, catla, chanos, truta-de-lago, acará-grande, bijupirá, bacalhau, tipo de peixe branco, dourada, corvina, moreia, góbio, peixe-dourado, gourami, garoupa, guapote, linguado, java, labeo, lai, botia, cavala, peixe-leite, carapeba, salamandra, tainha, paco, peixe-mexerica, peixe- rei, perca, pike, pampo-galhudo, rutilis, salmão, sampa, sauger, robalo, dourada, shiner, góbio-dorminhoco, peixe cabeça-de-cobra, pargo, robalo comum, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, curimatã, peixe-médico, peixe terror, tilápia, truta, atum, rodovalho, cisco europeia, picão-verde e peixe-branco); e crustáceos (incluindo, mas sem limitação, camarões e pitus). Em uma modalidade mais preferencial, o animal é selecionado a partir do grupo que consiste em suíno, ave, crustáceos e peixe. Em uma modalidade ainda mais preferencial, o animal é selecionado a partir do grupo que consiste em suíno, leitão, porco em crescimento, porca gestante, galinha, frango de corte, poedeira, franga e pinto.
[0252] A presente invenção será adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos.
EXEMPLOS Exemplo 1: Determinação de Atividade de Muramidase
[0253] A atividade de muramidase foi determinada medindo- se a diminuição (queda) na absorvância/densidade óptica de uma solução de Micrococcus lisodeikticus suspenso ATTC nº 4698 (Sigma-Aldrich M3770) medida em um leitor de microplaca (Tecan Infinite M200) a 450 nm. Preparação de substrato de Micrococcus Iysodeikticus
[0254] Antes do uso as células foram suspensas em água desionizada para uma concentração de 10 mg de células/ml e a absorvância/densidade óptica (OD) a 450 nm foi medida. A suspensão celular foi, então, ajustada para que a concentração celular no ensaio de turbidez (180 µl de tampão + 20 µl de amostra + 20 µl de substrato) se igualasse a um OD450 = 1,0. A suspensão celular ajustada foi, então, armazenada à temperatura ambiente antes do uso. As células suspensas foram usadas em 3 horas. Preparação de tampão de ácido cítrico-fosfato pH 4
[0255] 61,45 ml de ácido cítrico a 0,1 M foi medido com 38,55 ml de hidrogenofosfato dissódico a 0,2 M, e o pH foi ajustado com ácido clorídrico ou hidróxido de sódio para pH
4. Medição de atividade antimicrobiana de muramidase no ensaio de turbidez
[0256] A amostra de muramidase a ser medida foi diluída para uma concentração de 50 mg de proteína enzimática/l em água desionizada, e mantida em gelo até o uso. Em uma placa de microtitulação de 96 poços (Nunc) 180 µl de tampão de ácido cítrico-fosfato pH 4 e 20 µl da amostra de muramidase diluída foram adicionados e mantidos frios (5 °C). Para começar a medição de atividade 20 µl do substrato (Micrococcus Iysodeikticus) foram adicionados a cada poço, e a medição cinética de absorvância a 450 nm foi iniciada por 1 hora a 37 °C em um leitor de microplaca. A absorvância medida a 450 nm foi monitorada para cada poço e ao longo do tempo, uma queda na absorvância foi vista se a muramidase tiver atividade de muramidase.
[0257] Seguindo a incubação, a atividade de muramidase contra Micrococcus Iysodeikticus foi determinada como Δ de absorvância a 450 nm (valor de partida - valor final) de cada poço após 1 hora. A significância foi calculada com o uso de Dunnett’s com nível de teste de controle de 0,05 em JMP® versão 12.1.0 de pacote de software estatístico do SAS Institute Inc. Exemplo 2: Teste de frango de corte in vivo Material e Método
[0258] O estudo foi realizado de setembro a outubro de 2017 no Didactics and Experimental Farm em Olsztyn, que pertencem a Olsztyn University of Warmia and Mazury (UWM), Department of Poultry Science, Olsztyn, Polônia.
[0259] Uma quantidade total de 3600 frangos de um dia de idade saudáveis, machos, Ross 308, foi distribuída em 60 galinheiros aleatórios de 60 aves/galinheiro. Os 3 tratamentos dietários foram alocados de modo que cada tratamento foi aplicado a 20 galinheiros de 60 frangos de corte. O projeto de estudo básico era um projeto de bloco completo semialeatório, e o galinheiro era a unidade experimental para fins estatísticos. Tratamentos:
[0260] T1 – Controle Negativo
[0261] T2 – T1 + Muramidase 25.000 LSU(F)/kg
[0262] T3 – T2 + 200 mg/kg de Ronozyme ProAct Dietas:
[0263] As dietas não contêm quaisquer enzimas ou aditivos de ração (além de Muramidase e Ronozyme ProAct), cocidiostatos (além de Clinacox), antibióticos veterinários ou quaisquer outros promotores de crescimento. As dietas basais foram formuladas para satisfazer ou exceder os requisitos de nutrientes recomendados para frangos de corte. Os ingredientes, pré-mistura de mineral-vitamina, as análises calculadas e reais das dietas foram apresentadas na Tabela 2. Tabela 2: Composição e análises calculadas das dietas basais de frango, % Composição T1 T2 T3 da dieta Inicial Inicial Inicial Crescimento Inicial Crescimento Milho 33,70 37,90 33,70 37,90 33,70 37,90 SBM 31,70 26,45 31,70 26,45 31,70 26,45 Trigo 30,00 30,00 30,00 30,00 30,00 30,00 Calcário 0,40 0,35 0,40 0,35 0,40 0,35 MCP 1,20 1,20 1,20 1,20 1,20 1,20 NaCl 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 DL- 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
Composição T1 T2 T3 da dieta Inicial Inicial Inicial Crescimento Inicial Crescimento Metionina L-Lisina 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 Óleo de 1,50 2,60 1,50 2,60 1,50 2,60 soja Pré- 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 mistura Clinacox 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 Ronozyme 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 HiPhos Ronozyme - - - - 0,02 0,02 ProAct Muramidase - - 0,0328 0,0328 0,0328 0,0328 Densidade de nutrientes calculada, % CP 21,00 19,10 21,00 19,10 21,00 19,10 ME, MJ/kg 12,50 12,90 12,50 12,90 12,50 12,90 P total 0,61 0,59 0,61 0,59 0,61 0,59 Ca 0,78 0,74 0,78 0,74 0,78 0,74 Av P 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 Lys 1,21 1,09 1,21 1,09 1,21 1,09 Dig-Lys 1,11 0,99 1,11 0,99 1,11 0,99 Met+Cis 0,85 0,80 0,85 0,80 0,85 0,80 Dig- 0,78 0,74 0,78 0,74 0,78 0,74 Met+Cys Thr 0,76 0,69 0,76 0,69 0,76 0,69 Dig-Thr 0,67 0,60 0,67 0,60 0,67 0,60 Na 0,17 0,17 0,17 0,17 0,17 0,17 Cl 0,33 0,32 0,33 0,32 0,33 0,32 Ca/P 1,28 1,25 1,28 1,25 1,28 1,25 Ca/AvP 2,60 2,47 2,60 2,47 2,60 2,47 Parâmetros:
[0264] Qualidade dos detritos: Os detritos de cada galinheiro foram avaliados no fim das fases inicial e de crescimento em um escore de 0 a 4 pontos com base no protocolo de avaliação de qualidade de bem-estar para aves (Welfare quality, 2009). O gerenciamento de detritos foi registrado.
[0265] Além disso, cinco amostras de cerca de 0,1 kg foram tiradas de 5 pontos diferentes (4 cantos e centro do galinheiro, excluindo as áreas diretamente sob o alimentador e o bebedouro) misturados e a umidade foi determinada em um forno de ar forçado a 75 °C por 48 h.
[0266] Dermatite de coxim como indicador de bem-estar do animal foi determinado no fim do estudo em 2 aves/galinheiro com o uso de um escore de 0-2 com base no protocolo de avaliação de qualidade de bem-estar para aves (Welfare quality, 2009) (http://www.welfarequality.net/network/45848/7/0/40):
[0267] 0: Nenhuma de cada lesão superficial pequena
[0268] 1: descoloração substancial do coxim, lesão superficial, papilas escuras
[0269] 2: Úlceras ou arranhões de tamanho significativo, sinais de hemorragias ou coxins seriamente inchados. Análise estatística
[0270] O projeto de estudo básico era um projeto de bloco completo aleatório, e o galinheiro era a unidade experimental para fins estatísticos. Os dados poderiam ser coletados para todas as gaiolas e pontos no tempo (sem dados faltantes). Nenhum ponto de dados foi excluído da análise. O modelo estatístico básico empregado era uma análise unidirecional de ANOVA de variância. O modelo supõe os pontos de dados independentes, homogeneidade de variâncias entre grupos de tratamento e normalidade de residuais. A primeira suposição é induzida pelo projeto, sendo o último verificado por meio de inspeção visual. Em ocasiões em que a hipótese nula geral de nenhuma diferença de tratamento poderia ser rejeitada, os meios de tratamento foram comparados com o grupo de controle negativo pelo teste de Duncan, que também controle a multiplicidade. Diferenças significativas foram declaradas a P≤0,05. A ESTATÍSTICA 13.1 foi usada como o software/programa estatístico. P (probabilidade) é obtido a partir do valor F na tabela ANOVA. A significância é declarada a P≤0,05 e uma tendência quase significativa entre 0,05<P≤0,10. Resultados
[0271] Os resultados de qualidade dos detritos foram mostrados na Tabela 3. Tabela 3. Qualidade de detritos Tratamento Qualidade dos detritos (escala: 0- 4 pontos) 21 dias 35 dias T1 (NC) 0,42 ± 0,50 1,15 ± 0,51 T2 (NC + 0,39 ± 0,50 1,03 ± 0,47 Muramidase) T3 (NC + Muramidase 0,36 ± 0,49 0,97 ± 0,39 + ProAct) SEM 0,049 0,046 valor P 0,884 0,265
[0272] O detrito em galinheiros durante todo o período experimental foi caracterizado por uma qualidade muito boa e as aves da muramidase & ProAct forneceram a melhor qualidade de detritos de acordo com a escala de escore (0 - seco, 4 - úmido e pegajoso) nos dias 21 e 35 (Tabela 3).
[0273] Os resultados sobre dermatite em coxim foram mostrados na Tabela 4.
Tabela 4. Tabela 11. Dermatite em coxim (fim do teste) % de aves Tratamento Pontos 0 1 2 0,30a ± T1 (NC) 75,0 20,0 5,0 0,56 T2 (NC + 1,13b ± 17,5 52,5 30,0 Muramidase) 0,69 T3 (NC + 1,18b ± Muramidase + 0,75 ProAct) 20,0 42,5 37,5 SEM 0,071 valor P <0,001
[0274] Os coxins das aves dos tratamentos tanto com muramidase quanto com muramidase & ProAct (T2 e T3) foram caracterizados por uma qualidade significativamente baixa do que aqueles das aves de controle (T1) - Tabela 4.
CONCLUSÕES
[0275] A inclusão de muramidase e protease resultou em melhor qualidade dos detritos e dermatite em coxim reduzida em frangos de corte.
[0276] A invenção descrita e reivindicada no presente documento não deve ter o escopo limitado pelos aspectos específicos revelados no presente documento, visto que esses aspectos se destinam a ser ilustrações de vários aspectos da presente invenção. Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da presente invenção além daquelas mostradas e descritas no presente documento ficarão claras para os indivíduos versados na técnica a partir da descrição anterior.
Tais modificações também se destinam a estar dentro do escopo das reivindicações anexas.
No caso de conflito, a presente revelação que inclui definições prevalecerá.

Claims (18)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição caracterizada por compreender um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de protease.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que tem atividade de muramidase é uma muramidase GH24 ou muramidase fúngica GH25.
3. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que tem atividade de protease é uma protease microbiana, ou um análogo, um fragmento, uma variante, um mutante ou uma protease sintética derivada de um microrganismo.
4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que tem atividade de protease é protease estável em ácido ou uma protease termoestável.
5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que tem atividade de protease é uma serina protease estável em ácido.
6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que tem atividade de muramidase é selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com
SEQ ID NO: 1; (b) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3; (d) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4; (e) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5; (f) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 6; (g) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 7; (h) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8; (i) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 9; (j) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 10; (k) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 11; (l) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 12; (m) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 13; (n) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 14; (o) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 15; (p) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com
SEQ ID NO: 16; (q) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 17; (r) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 18; (s) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19; (t) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 20; (u) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 21; (v) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 22; (w) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 23; (x) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24; (y) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 25; (z) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 26; (aa) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 27; (ab) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 28; (ac) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 29; (ad) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 30; (ae) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com
SEQ ID NO: 31; (af) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 32; (ag) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 33; (ah) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 34; (ai) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 35; (aj) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 36; (ak) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 37; (al) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 38; (am) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 39; (an) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 40; (ao) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 41; (ap) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 42; (aq) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 43; (ar) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 44; (as) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 45; (at) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com
SEQ ID NO: 46; (au) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 47; (av) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 48; (aw) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 49; (ax) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 50; (ay) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 51; (az) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 52; (ba) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 53; (bb) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 54; (bc) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 55; (bd) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 56; (be) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 57; (bf) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 58; (bg) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 59; (bh) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 60; (bi) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com
SEQ ID NO: 61; (bj) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 62; (bk) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 63; (bl) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 64; (bm) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 65; (bn) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 66; (bo) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 67; (bp) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 68; (bq) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 69; (br) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 70; (bs) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 71; (bt) uma variante de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO:
63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 ou SEQ ID NO: 71 que compreende uma ou mais substituições de aminoácido (de preferência, substituições conservativas), e/ou uma ou mais deleções de aminoácido, e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação dos mesmos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; (bu) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (at), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc), (bd), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (bm), (bn), (bo), (bp), (bq), (br), (bs) ou (bt) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; e (bv) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (at), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc), (bd), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (bm), (bn), (bo), (bp), (bq), (br), (bs) ou (bt) que tem atividade de muramidase e que tem pelo menos 90 % do comprimento do polipeptídeo maduro.
7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por compreender a muramidase da SEQ ID NO: 1 e uma serina protease estável em ácido.
8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que tem atividade de protease é selecionado dentre: a) a família subtilases, incluindo subtilisina, termitase, kexina e pirolisina proteases b) proteases microbianas estáveis em ácido, em particular, serina proteases estáveis em ácido derivadas de Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235 (A1918L1), Nocardiopsis prasina DSM 15649 (NN018335L1), Nocardiopsis prasina (anteriormente alba) DSM 14010 (NN18140L1), Nocardiopsis sp. DSM 16424 (NN018704L2), Nocardiopsis alkaliphila DSM 44657 (NN019340L2) e Nocardiopsis lucentensis DSM 44048 (NN019002L2), assim como homólogas e c) proteases variantes de (a) e (b).
9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que tem atividade de protease é selecionado dentre proteases derivadas do Gênero I: Nocardiopsis, por exemplo, Nocardiopsis sp. NRRL 18262, e Nocardiopsis alba; por exemplo, da espécie Bacillus ou mutantes ou variantes da mesma que exibem atividade de protease; e em que os polipeptídeos que têm atividade de muramidase são um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos
85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1.
10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que tem atividade de protease é selecionado dentre serina proteases estáveis em ácido derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262, Nocardiopsis alba, Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235 (A1918L1), Nocardiopsis prasina DSM 15649 (NN018335L1), Nocardiopsis prasina (anteriormente alba) DSM 14010 (NN18140L1), Nocardiopsis sp. DSM 16424 (NN018704L2), Nocardiopsis alkaliphila DSM 44657 (NN019340L2) e Nocardiopsis lucentensis DSM 44048 (NN019002L2), e proteases de pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou pelo menos 95 % de identidade de aminoácido com qualquer uma dessas proteases; e em que os polipeptídeos que têm atividade de muramidase são um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1.
11. Ração animal que compreende um aditivo de ração animal, uma ou mais fontes de proteína e uma ou mais fontes de energia, sendo a ração animal caracterizada por compreender adicionalmente um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais polipeptídeos que têm atividade de protease.
12. Ração animal, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a fonte de proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em soja, soja selvagem, feijão, tremoço, feijão Tepary, feijão-da-Espanha, feijão slimjim, feijão-de-lima, vagem francesa, fava comum
(feijão-fava), grão de bico, lentilha, amendoim, amendoim Spanish, canola, semente de girassol, semente de algodão, colza (semente oleaginosa de colza) ou ervilha ou em uma forma processada como farinha de soja, farinha de soja integral, concentrado de proteína de soja (SPC), farinha de soja fermentada (FSBM), farinha de girassol, farinha de semente de algodão, farinha de colza, farinha de peixe, farinha de osso, farinha de pena, soro ou qualquer combinação dos mesmos.
13. Ração animal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 12, caracterizada pelo fato de que a fonte de energia é selecionada a partir do grupo que consiste em maís, milho, sorgo, trigo, cevada, aveia, arroz, triticale, centeio, beterraba, beterraba sacarina, espinafre, batata, mandioca, quinoa, repolho, switchgrass, painço, milheto, milho-da-Itália ou em uma forma processada como milho moído, maís moído, amido de batata, amido de mandioca, sorgo moído, switchgrass moído, painço moído, milho-da-Itália moído, milheto moído, ou qualquer combinação dos mesmos.
14. Método caracterizado por ser de aprimoramento do Fator de Eficiência de Produção Europeia (EPEF), Peso Corporal (BW) e/ou Razão de Conversão de Ração (FCR); aprimoramento da qualidade dos detritos e/ou dermatite no coxim; e/ou tratamento de infecção por Clostridium perfringens de um animal monogástrico que compreende administrar ao animal a composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-10 ou a ração animal conforme definida em qualquer uma das reivindicações 11-13.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14,
caracterizado pelo fato de que a composição ou ração animal é dosada de modo que o polipeptídeo que tem atividade de protease esteja em um nível de 50 a 300 mg por kg de ração animal, como 80 a 250 mg, 100 a 200 mg por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.
16. Método, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a composição ou ração animal é dosada de modo que o polipeptídeo que tem atividade de muramidase esteja em um nível de 100 a 1000 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, como 200 a 900 mg, 300 a 800 mg, 400 a 700 mg ou 500 a 600 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-16, caracterizado pelo fato de que o animal é um animal monogástrico, por exemplo, porcos ou suínos (incluindo, mas sem limitação, leitões, porcos em crescimento e porcas gestantes); aves (incluindo, mas sem limitação, ave, peru, pato, codorna, galinha-da-angola, ganso, pombo, pombo jovem, galinha, frango de corte, poedeira, franga e pinto); animais de estimação, como gatos e cachorros, peixe (incluindo, mas sem limitação, seriola, pirarucu, barbo, achigã, anchova, bocachico, brema, peixe- gato, cachama, carpa, bagre, catla, chanos, truta-de-lago, acará-grande, bijupirá, bacalhau, tipo de peixe branco, dourada, corvina, moreia, góbio, peixe-dourado, gourami, garoupa, guapote, linguado, java, labeo, lai, botia, cavala, peixe-leite, carapeba, salamandra, tainha, paco, peixe- mexerica, peixe-rei, perca, pike, pampo-galhudo, rutilis, salmão, sampa, sauger, robalo, dourada, shiner, góbio-
dorminhoco, peixe cabeça-de-cobra, pargo, robalo comum, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, curimatã, peixe- médico, peixe terror, tilápia, truta, atum, rodovalho, cisco europeia, picão-verde e peixe-branco); e crustáceos (incluindo, mas sem limitação, camarões e pitus).
18. Uso caracterizado por ser da composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-10 ou da ração animal conforme definida em qualquer uma das reivindicações 11-13 no aprimoramento de Fator de Eficiência de Produção Europeia (EPEF), Peso Corporal (BW) e/ou Razão de Conversão de Ração (FCR); aprimoramento da qualidade dos detritos e/ou dermatite no coxim; e/ou tratamento de infecção por Clostridium perfringens de um animal monogástrico.
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