BR112021004817A2

BR112021004817A2 - composições de ração animal e usos das mesmas

Info

Publication number: BR112021004817A2
Application number: BR112021004817-0A
Authority: BR
Inventors: Rual Lopez-Ulibarri; Estefania Perez Calvo
Original assignee: Dsm Ip Assets B.V.; Novozymes A/S
Priority date: 2018-09-17
Filing date: 2019-09-17
Publication date: 2021-06-08
Also published as: WO2020058224A1; EP3852545A1; US20220040271A1; MX2021003074A

Abstract

A presente invenção se refere a composições de ração animal que compreendem polipeptídeos que têm atividade de muramidase e carotenoides e usos das mesmas.

Description

“COMPOSIÇÕES DE RAÇÃO ANIMAL E USOS DAS MESMAS” REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, que é incorporada ao presente documento a título de referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção

[0002] A presente invenção se refere a uma composição e/ou uma ração animal compreendendo polipeptídeos que têm atividade de muramidase e carotenoides e usos das mesmas. Descrição da Técnica Relacionada

[0003] Muramidase, também chamada de lisozima, é uma O- glicosil hidrolase produzida como um mecanismo de defesa contra bactérias por muitos organismos. A enzima causa a hidrólise de paredes de célula bacteriana clivando-se as ligações glicosídicas de peptidoglicano; uma molécula estrutural importante nas bactérias. Após deixar suas paredes celulares enfraquecidas por meio da ação de muramidase, ocorre a lise das células bacterianas como resultado da pressão osmótica não balanceada.

[0004] Muramidase ocorre naturalmente em muitos organismos como vírus, plantas, insetos, aves, répteis e mamíferos. Em mamíferos, a Muramidase foi isolada das secreções nasais, saliva, lágrimas, conteúdo intestinal, urina e leite. A enzima cliva a ligação glicosídica entre o carbono número 1 de ácido N-acetilmurâmico e carbono número 4 de N-acetil-D-glucosamina. In vivo, esses dois carboidratos são polimerizados para formar o polissacarídeo de parede celular de muitos microrganismos.

[0005] Muramidase foi classificada em cinco famílias de glicosídeo hidrolase (GH) diferentes (CAZy, www.cazy.org): muramidase de clara de ovo de galinha (GH22), muramidase de clara de ovo de ganso (GH23), muramidase de bacteriófago T4 (GH24), proteína flagelar de Sphingomonas (GH73) e muramidases de Chalaropsis (GH25). A muramidase extraída da clara de ovo de galinha (uma muramidase GH22) é o produto primário disponível no mercado e, tradicionalmente, foi apenas referida como muramidase muito embora nos dias de hoje haja muitas outras muramidases conhecidas.

[0006] Carotenoides são pigmentos orgânicos em uma gama de cores amarelo a vermelho que são naturalmente produzidos por certos organismos, incluindo organismos fotossintéticos (por exemplo, plantas, algas, cianobactérias), e alguns fungos. Carotenoides como luteína, cantaxantina, zeaxantina ou astaxantina são aditivos importantes na dieta do ser humano e gado como substâncias de pigmentação e precursores de derivados de vitamina A. Além disso, os carotenoides têm uma ação que promove a saúde como intensificando a resposta imune e, por razão de suas propriedades antioxidantes, uma ação de prevenção de câncer, que torna seu uso como nutracêuticos de interesse.

[0007] Foi mostrado no documento WO 2017/001703 que as muramidases microbianas aprimoram o desempenho animal. No entanto, combinando-se diferentes tipos de enzimas frequentemente não resulta em quaisquer resultados benéficos sobre a única enzima, vide T. T. dos Santos et al., “Protease, protease and superdosing phytase interactions in broiler performance, carcass yield and digesta transit time”, Animal Nutrition (2017), 3, 121-126 e Adeola e

Cowieson, “Opportunities and challenges in using exogenous enzymas to improve nonruminant animal production”, J Anim Sci, (2011), 89, 189-3218.

[0008] O aprimoramento do desempenho de crescimento e saúde de animais da fazenda é necessário em um mundo com uma população crescente que consome mais proteína animal, e é o objetivo da presente invenção planejar soluções que ajudem a satisfazer esse desafio.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A presente invenção se refere a uma composição que compreende um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais carotenoides.

[0010] A presente invenção também se refere a uma ração animal que compreende um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais carotenoides.

[0011] A presente invenção se refere adicionalmente a um método de aprimorar a taxa de conversão de ração (FCR), digestibilidade e/ou imunidade, e/ou reduzir Clostridium Perfringens do intestino em um animal que compreende administrar a um animal a composição ou a ração animal da presente invenção.

[0012] A presente invenção se refere adicionalmente ao uso da composição ou da ração animal da presente invenção ao aprimoramento de FCR, digestibilidade e/ou imunidade, e/ou redução de Clostridium Perfringens do intestino em um animal.

VISÃO GERAL DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0013] SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Acremonium alcalophilum conforme descrito no documento WO2013/076253 (SEQ ID NO: 4).

[0014] SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Acremonium alcalophilum conforme descrito no documento WO2013/076253 (SEQ ID NO: 8).

[0015] SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Aspergillus fumigatus conforme descrito no documento WO2011/104339 (SEQ ID NO: 3).

[0016] SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Trichoderma reesei conforme descrito no documento WO2009/102755 (SEQ ID NO: 4).

[0017] SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Trametes cinnabarina conforme descrito no documento WO2005/080559 (SEQ ID NO: 2).

[0018] SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Sporormia fimetaria conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 3).

[0019] SEQ ID NO: 7 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Poronia punctata conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 6).

[0020] SEQ ID NO: 8 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Poronia punctata conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 9).

[0021] SEQ ID NO: 9 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Lecanicillium sp. WMM742 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 12).

[0022] SEQ ID NO: 10 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Lecanicillium sp. WMM742 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 15).

[0023] SEQ ID NO: 11 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Onygena equina conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 18).

[0024] SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Purpureocillium lilacinum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 21).

[0025] SEQ ID NO: 13 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Trichobolus zukalii conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 24).

[0026] SEQ ID NO: 14 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Penicillium citrinum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 27).

[0027] SEQ ID NO: 15 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Cladorrhinum bulbillosum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 30).

[0028] SEQ ID NO: 16 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Umbelopsis westeae conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 33).

[0029] SEQ ID NO: 17 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Zygomycetes sp. XZ2655 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 36).

[0030] SEQ ID NO: 18 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Chaetomium cupreum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 39).

[0031] SEQ ID NO: 19 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Cordyceps cardinalis conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 42).

[0032] SEQ ID NO: 20 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Penicillium sp. 'qii' conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 45).

[0033] SEQ ID NO: 21 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Aspergillus sp. nov XZ2609 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 48).

[0034] SEQ ID NO: 22 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Paecilomyces sp. XZ2658 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 51).

[0035] SEQ ID NO: 23 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Paecilomyces sp. XZ2658 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 54).

[0036] SEQ ID NO: 24 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Pycnidiophora cf dispera conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 60).

[0037] SEQ ID NO: 25 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Thermomucor indicae-seudaticae conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 63).

[0038] SEQ ID NO: 26 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Isaria farinosa conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 66).

[0039] SEQ ID NO: 27 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Lecanicillium sp. WMM742 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 69).

[0040] SEQ ID NO: 28 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Zopfiella sp. t180-6 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 72).

[0041] SEQ ID NO: 29 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Malbranchea flava conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 75).

[0042] SEQ ID NO: 30 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Hypholoma polytrichi conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 80).

[0043] SEQ ID NO: 31 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Aspergillus deflectus conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 83).

[0044] SEQ ID NO: 32 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Ascobolus stictoideus conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 86).

[0045] SEQ ID NO: 33 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Coniochaeta sp. conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 89).

[0046] SEQ ID NO: 34 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Daldinia fissa conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 92).

[0047] SEQ ID NO: 35 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Rosellinia sp. conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 95).

[0048] SEQ ID NO: 36 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Ascobolus sp. ZY179 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 98).

[0049] SEQ ID NO: 37 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Curreya sp. XZ2623 conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 101).

[0050] SEQ ID NO: 38 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Coniothyrium sp. conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 104).

[0051] SEQ ID NO: 39 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Hypoxylon sp. conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 107).

[0052] SEQ ID NO: 40 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Xylariaceae sp. 1653h conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 110).

[0053] SEQ ID NO: 41 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Hypoxylon sp. conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 113).

[0054] SEQ ID NO: 42 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Yunnania penicillata conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 116).

[0055] SEQ ID NO: 43 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Engyodontium album conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 119).

[0056] SEQ ID NO: 44 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Metapochonia bulbillosa conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 122).

[0057] SEQ ID NO: 45 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Hamigera paravellanea conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 125).

[0058] SEQ ID NO: 46 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Metarhizium iadini conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 128).

[0059] SEQ ID NO: 47 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Thermoascus aurantiacus conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 131).

[0060] SEQ ID NO: 48 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Clonostachys rossmaniae conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 134).

[0061] SEQ ID NO: 49 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Simplicillium obclavatum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 137).

[0062] SEQ ID NO: 50 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Aspergillus inflatus conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 140).

[0063] SEQ ID NO: 51 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Paracremonium inflatum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 143).

[0064] SEQ ID NO: 52 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Westerdykella sp. conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 146).

[0065] SEQ ID NO: 53 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Stropharia semiglobata conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 155).

[0066] SEQ ID NO: 54 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Gelasinospora cratophora conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 158).

[0067] SEQ ID NO: 55 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Flammulina velutipes conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 221).

[0068] SEQ ID NO: 56 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Deconica coprophila conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 224).

[0069] SEQ ID NO: 57 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Rhizomucor pusillus conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 227).

[0070] SEQ ID NO: 58 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Stropharia semiglobata conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 230).

[0071] SEQ ID NO: 59 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Stropharia semiglobata conforme descrito no documento PCT/CN2017/075978 (SEQ ID NO: 233).

[0072] SEQ ID NO: 60 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Myceliophthora fergusii conforme descrito no documento PCT/CN2017/075960 (SEQ ID NO: 3).

[0073] SEQ ID NO: 61 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Mortierella alpina conforme descrito no documento PCT/CN2017/075960 (SEQ ID NO: 15).

[0074] SEQ ID NO: 62 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH25 de Penicillium atrovenetum conforme descrito no documento PCT/CN2017/075960 (SEQ ID NO: 27).

[0075] SEQ ID NO: 63 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Trichophaea saccata conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 257).

[0076] SEQ ID NO: 64 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Chaetomium thermophilum conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 264).

[0077] SEQ ID NO: 65 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Trichoderma harzianum conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 267).

[0078] SEQ ID NO: 66 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Trichophaea minuta conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 291).

[0079] SEQ ID NO: 67 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Chaetomium sp. ZY287 conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 294).

[0080] SEQ ID NO: 68 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Mortierella sp. ZY002 conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 297).

[0081] SEQ ID NO: 69 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Metarhizium sp. XZ2431 conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 300).

[0082] SEQ ID NO: 70 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Geomyces auratus conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 303).

[0083] SEQ ID NO: 71 é a sequência de aminoácidos madura de uma muramidase GH24 de Ilyonectria rufa conforme descrito no documento WO2017/000922 (SEQ ID NO: 306).

DEFINIÇÕES

[0084] Animal: O termo “animal” se refere a qualquer animal exceto seres humanos. Exemplos de animais são animais monogástricos, incluindo, mas sem limitação, porcos ou suínos (incluindo, mas sem limitação, leitões, porcos em crescimento e porcas gestantes); aves como perus, patos, codornas, galinha-da-angola, gansos, pombos (incluindo pombos jovens) e galinha (incluindo, mas sem limitação, frangos que servem para corte (referido ao presente documento como frangos de corte), frangos, galinhas poedeiras (referidas no presente documento como poedeiras)); animais de estimação, como gatos e cachorros; cavalos (incluindo, mas sem limitação, de sangue quente, de sangue frio e de sangue morno), crustáceos (incluindo, mas sem limitação, camarões e pitus) e peixe (incluindo, mas sem limitação, seriola, pirarucu, barbo, achigã, anchova, bocachico, brema, peixe-gato, cachama, carpa, bagre, catla, chanos, truta-de- lago, acará-grande, bijupirá, bacalhau, tipo de peixe branco, dourada, corvina, moreia, góbio, peixe-dourado, gourami, garoupa, guapote, linguado, java, labeo, lai, botia, cavala, peixe-leite, carapeba, salamandra, tainha, paco, peixe-mexerica, peixe-rei, perca, pike, pampo-galhudo, rutilis, salmão, sampa, sauger, robalo, dourada, shiner, góbio-dorminhoco, peixe cabeça-de-cobra, pargo, robalo comum, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, curimatã, peixe-médico, peixe terror, tilápia, truta, atum, rodovalho, cisco europeia, picão-verde e peixe-branco).

[0085] Ração animal: O termo “ração animal” se refere a qualquer composto, preparação ou mistura solúvel para, ou destinada para consumo por um animal. A ração animal para um animal monogástrico compreende tipicamente concentrados assim como vitaminas, minerais, enzimas, ingredientes microbianos de alimentação direta, aminoácidos e/ou outros ingredientes de ração (como em uma pré-mistura) enquanto a ração animal para ruminantes geralmente compreende forragem (incluindo fibras e silagem) e pode compreender adicionalmente concentrados assim como vitaminas, minerais, ingredientes microbianos de alimentação direta de enzimas, aminoácido e/ou outros ingredientes de ração (como em uma pré-mistura).

[0086] Concentrados: O termo “concentrados” significa ração com altas concentrações de proteína e energia, como farinha de peixe, melaços, oligossacarídeos, sorgo, sementes e grãos (sejam integrais ou preparados por meio de trituração, moagem, etc., de, por exemplo, milho, aveia, centeio, cevada, trigo), torta de prensagem de semente oleaginosa (por exemplo, de semente de algodão, cártamo, girassol, soja (como farinha de soja), colza/canola, amendoim ou planta oleaginosa da família do amendoim), torta de semente de palma, material derivado de levedura e grãos destiladores (como grãos úmidos de destiladores (WDS) e grãos secos de destiladores com solúveis (DDGS)).

[0087] Ganho de Peso Corporal: O termo “ganho de peso corporal” significa um aumento no peso vivo de um animal durante um dado período de tempo, por exemplo, o aumento em peso do dia 1 ao dia 21.

[0088] Razão de Conversão de Ração (FCR): FCR é uma medida de uma eficiência animal na conversão de massa alimentícia em aumentos do resultado desejado. Os animais criados para corte de carne – como suíno, ave e peixe – o resultado é a massa ganha pelo animal. Especificamente, FCR é calculada como consumo de ração dividida pelo ganho de peso, por todo um período especificado. Aprimoramento em FCR significa redução do valor de FCR. Um aprimoramento de FCR de 2 % significa que a FCR foi reduzida em 2 %.

[0089] Eficiência da ração: O termo “eficiência da ração” significa a quantidade de ganho de peso por unidade de ração quando o animal é alimentado à vontade ou uma quantidade especificada de alimento durante um período de tempo. Por "eficiência da ração aumentada" significa que o uso de uma composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção na ração resulta em um ganho de peso aumentado por unidade de consumo de ração em comparação com um animal alimentado sem a dita composição de aditivo de ração estar presente.

[0090] Forragem: O termo “forragem” conforme definido no presente documento também inclui fibra. Forragem é o material vegetal fresco como feno e silagem de plantas de forragem, gramíneas e outras plantas de forragem, alga do mar, grãos germinados e legumes, ou qualquer combinação dos mesmos. Exemplos de plantas de forragem são Alfalfa (luzerna), cornichão perene, brassica (por exemplo, couve-frisada, colza (canola), rutabaga (couve-nabo), nabo), trevo (por exemplo, trevo alsike, trevo vermelho, trevo subterrâneo, trevo branco), gramínea (por exemplo, grama-bermudas, capim, aveia-perene, festucas, cambaleia-grama, prados, panasco, azevém, erva-dos-prados), milho (maís), painço, cevada, aveia, centeio, sorgo, sojas e trigo e vegetais como beterrabas. Forragem inclui adicionalmente resíduos de cultura de produção de grãos (como palha de milho; palha de trigo, cevada, aveia, centeio e outros grãos); resíduos de vegetais como colos de beterraba; resíduos da produção de semente como caules e folhas da soja, colza e outros legumes; e frações do refino de grãos para consumo animal ou humano ou da produção de combustível ou outras indústrias.

[0091] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo ou um domínio catalítico que tem um ou mais (por exemplo, diversos) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro ou domínio; em que o fragmento tem atividade de muramidase.

[0092] Em um aspecto, um fragmento de uma muramidase GH24 (como uma da SEQ ID NO: 63 a 71) compreende pelo menos 230 aminoácidos, como pelo menos 235 aminoácidos, pelo menos 240 aminoácidos, ou pelo menos 245 aminoácidos e tem atividade de muramidase. Em um outro aspecto, um fragmento de uma muramidase GH24 (como uma da SEQ ID NO: 63 a 71) compreende pelo menos 90 % do comprimento do polipeptídeo maduro, como pelo menos 92 %, pelo menos 94 %, pelo menos 96 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % do comprimento do polipeptídeo maduro e tem atividade de muramidase.

[0093] Em um aspecto, um fragmento de uma muramidase GH25 (como uma da SEQ ID NO: 1 a 72) compreende pelo menos 180 aminoácidos, como pelo menos 185 aminoácidos, pelo menos 190 aminoácidos, pelo menos 195 aminoácidos, pelo menos 200 aminoácidos, pelo menos 205 aminoácidos ou pelo menos 210 aminoácidos e tem atividade de muramidase. Em um outro aspecto, um fragmento de uma muramidase GH25 (como uma da SEQ ID NO: 1 a 72) compreende pelo menos 90 % do comprimento do polipeptídeo maduro, como pelo menos 92 %, pelo menos 94 %, pelo menos 96 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % do comprimento do polipeptídeo maduro e tem atividade de muramidase.

[0094] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Os exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância que inclui, mas sem limitação a, qualquer enzima, variação, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou todos os constituintes de ocorrência natural com os quais a mesma está associada por natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem em relação àquela substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada pelo aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (por exemplo, múltiplas cópias de um gene que codifica a substância; uso de um promotor maior forte do que o promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

[0095] Atividade de muramidase: O termo “atividade de muramidase” significa a hidrólise enzimática das 1,4-beta- ligações entre resíduos de ácido N-acetilmurâmico e N- acetil-D-glucosamina em um peptidoflicano ou entre resíduos de N-acetil-D-glucosamina em quitodextrinas, resultando em bacteriolise devido à pressão osmótica. A muramidase pertence à classe enzimática EC 3.2.1.17. A atividade de muramidase é tipicamente medida por meio de determinação turbidimétrica. O método se baseia nas alterações na turbidez de uma suspensão de Micrococcus luteus ATCC 4698 induzida pela ação lítica da muramidase. Em condições experimentais adequadas, essas alterações são proporcionais à quantidade de muramidase no meio (conforme INS 1105 do Combined Compendium of Food Additive Specifications da Food and Agriculture Organisation da UN (www.fao.org)). Para os fins da presente invenção, a atividade de muramidase é determinada de acordo com o ensaio de turbidez descrito no exemplo 1 (“Determinação de Atividade de Muramidase”) e o polipeptídeo tem atividade de muramidase se o mesmo mostrar atividade contra uma ou mais bactérias, como Micrococcus luteus ATCC 4698 e/ou Exiguobacterium undea (DSM14481). Como um exemplo, a muramidase GH25 da presente invenção tem pelo menos 20 %, por exemplo, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 100 % da atividade de muramidase da SEQ ID NO: 1. Como um outro exemplo, a muramidase GH24 da presente invenção tem pelo menos 20 %, por exemplo, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 100 % da atividade de muramidase da SEQ ID NO: 63.

[0096] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final que segue a tradução e quaisquer modificações pós-traducionais, como processamento de N-terminal, truncamento de C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc.

[0097] Na presente invenção, o polipeptídeo maduro pode ser aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos 1 a 218 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 4, aminoácidos 1 a 215 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos

1 a 201 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 8, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 10, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 11, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 12, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 13, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 14, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 15, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 16, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 17, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 18, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 19, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 20, aminoácidos 1 a 218 da SEQ ID NO: 21, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 22, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 23, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 24, aminoácidos 1 a 210 da SEQ ID NO: 25, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 26, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 27, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 28, aminoácidos 1 a 217 da SEQ ID NO: 29, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 30, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 31, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 32, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 33, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 34, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 35, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 36, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 37, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 38, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 39, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 40, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 41, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 42, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 43, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 44, aminoácidos 1 a 215 da SEQ ID NO: 45, aminoácidos 1 a 217 da SEQ ID NO: 46, aminoácidos 1 a 214 da SEQ ID NO: 47, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 48, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 49, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 50, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 51, aminoácidos 1 a 208 da

SEQ ID NO: 52, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 53, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 54, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 55, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 56, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 57, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 58, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 59, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 60, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 61, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 62, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 63, aminoácidos 1 a 249 da SEQ ID NO: 64, aminoácidos 1 a 248 da SEQ ID NO: 65, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 66, aminoácidos 1 a 249 da SEQ ID NO: 67, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 68, aminoácidos 1 a 247 da SEQ ID NO: 69, aminoácidos 1 a 250 da SEQ ID NO: 70, aminoácidos 1 a 240 da SEQ ID NO: 71.

[0098] Obtido ou obtenível de: O termo “obtido ou obtenível de” significa que o polipeptídeo pode ser encontrado em um organismo de uma classificação taxonômica específica. De preferência, o polipeptídeo é obtido ou obtenível do reino Fungi, em que o termo reino é a classificação taxonômica. Com mais preferência, o polipeptídeo é obtido ou obtenível do filo Ascomycota, em que o termo filo é a classificação taxonômica. Com mais preferência, o polipeptídeo é obtido ou obtenível do subfiloPezizomycotina, em que o termo subfilo é a classificação taxonômica. Com mais preferência, o polipeptídeo é obtido ou obtenível da classe Eurotiomycetes, em que o termo classe é a classificação taxonômica.

[0099] Se a classificação taxonômica de um polipeptídeo não é conhecido, a mesma pode ser facilmente determinada por uma pessoa versada na técnica realizando-se uma busca BLASTP do polipeptídeo (com o uso, por exemplo, do site do National

Center for Biotechnology Information (NCIB) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e comparando o mesmo aos homólogos mais próximos. A pessoa versada na técnica também pode comparar a sequência àquela do pedido conforme depositado. Um polipeptídeo desconhecido que é um fragmento de um polipeptídeo conhecido é considerado como da mesma espécie taxonômica. Um polipeptídeo natural desconhecido ou variante artificial que compreende uma substituição, deleção e/ou inserção em até 10 posições é considerado como sendo da mesma espécie taxonômica que o polipeptídeo conhecido.

[0100] Fibra: O termo “fibra” significa material vegetal seco com altos níveis de fibra, como fibra, farelo, cascas de sementes e grãos e resíduos de culturas (como paleta, copra, palha, joio, resíduo de beterraba sacarina).

[0101] Identidade de sequência: O parentesco entre duas sequências de aminoácido ou entre duas sequências de nucleotídeo é descrito pelo parâmetro “identidade de sequência”.

[0102] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada com o uso do algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), de preferência, versão

5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle identificado como “identidade mais longa” (obtido com o uso da opção –nobrief)

é usado como a identidade percentual e é calculado como a seguir:

[0103] (Resíduos idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento – Número Total de Lacunas em Alinhamento)

[0104] Polipeptídeo substancialmente puro: O termo “polipeptídeo substancialmente puro” significa uma preparação que contém no máximo 10 %, no máximo 8 %, no máximo 6 %, no máximo 5 %, no máximo 4 %, no máximo 3 %, no máximo 2 %, no máximo 1 %, e no máximo 0,5 % em peso do outro material de polipeptídeo com o qual é associado de nativa ou recombinantemente. De preferência, o polipeptídeo é pelo menos 92 % puro, por exemplo, pelo menos 94 % puro, pelo menos 95 % puro, pelo menos 96 % puro, pelo menos 97 % puro, pelo menos 98 % puro, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % puro, e 100 % puro em peso do material de polipeptídeo total presente na preparação. Os polipeptídeos da presente invenção estão, de preferência, em uma forma substancialmente pura. Isso é alcançado, por exemplo, preparando-se o polipeptídeo por meio de métodos recombinantes bem conhecidos ou por meio de métodos de purificação clássicos.

[0105] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo que tem atividade de muramidase que compreende uma alteração, isto é, uma substituição, inserção e/ou deleção de um ou mais (diversos) resíduos de aminoácido em uma ou mais (por exemplo, diversas) posições. Uma substituição significa a substituição do aminoácido que ocupa uma posição com um aminoácido diferente; uma deleção significa a remoção do aminoácido que ocupa uma posição; e uma inserção significa adicional 1, 2, ou 3 aminoácidos adjacentes e imediatamente seguintes ao aminoácido que ocupa a posição.

[0106] Na presente invenção, uma variante de muramidase pode compreender de 1 a 10 alterações, isto é, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 alterações e ter pelo menos 20 %, por exemplo, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 100 % da atividade de muramidase da muramidase parental, como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 63.

[0107] Tratamento: o termo “tratamento” significa alívio, em todo ou em parte, de uma infecção, como infecções por Clostridium Perfringes, ou um sintoma das mesmas, ou desaceleração ou paralisação de progresso ou piora adicional de uma infecção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Composição

[0108] Constatou-se surpreendentemente que uma composição que compreende uma muramidase (de preferência, uma muramidase fúngica) e um carotenoide gera um desempenho adicional e benefício à saúde em animais.

[0109] Então, em um primeiro aspecto, a invenção se refere a uma composição que compreende um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais carotenoides.

[0110] Na presente invenção, a muramidase pode ser uma muramidase GH24, de preferência, uma muramidase fúngica GH24, de preferência, obtida ou obtenível do filo Ascomycota, com mais preferência, da classe Eurotiomycetes. A muramidase também pode ser uma muramidase GH25, de preferência, uma muramidase fúngica GH25, de preferência, obtida ou obtenível do filo Ascomycota, com mais preferência, da classe

Eurotiomycetes.

[0111] Na presente invenção, os carotenoides para uso de acordo com a presente invenção podem ser α- ou β--caroteno, 8'-apo-β-carotenal, ésteres de ácido 8'-apo-β-carotenoico como o éster etílico, cantaxantina, astaxantina, ésteres de astaxantina, licopeno, luteína, zeaxantina ou crocetina e seus derivados. Os carotenoides comercialmente disponíveis são Carophyll ®Red, Carophyll ®Pink ou Carophyll ®Yellow (DSM Nutritional Products AG).

[0112] De preferência, a invenção se refere a uma composição que compreende um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais carotenoides, em que o polipeptídeo que tem atividade de muramidase é selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1; (b) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3; (d) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4;

(e) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5; (f) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 6; (g) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 7; (h) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8; (i) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 9; (j) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 10; (k) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 11; (l) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 12; (m) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 13; (n) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 14; (o) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 15; (p) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 16; (q) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 17; (r) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 18; (s) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19;

(t) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 20; (u) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 21; (v) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 22; (w) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 23; (x) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24; (y) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 25; (z) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 26; (aa) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 27; (ab) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 28; (ac) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 29; (ad) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 30; (ae) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 31; (af) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 32; (ag) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 33; (ah) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 34;

(ai) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 35; (aj) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 36; (ak) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 37; (al) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 38; (am) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 39; (an) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 40; (ao) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 41; (ap) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 42; (aq) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 43; (ar) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 44; (as) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 45; (at) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 46; (au) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 47; (av) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 48; (aw) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 49;

(ax) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 50; (ay) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 51; (az) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 52; (ba) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 53; (bb) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 54; (bc) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 55; (bd) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 56; (be) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 57; (bf) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 58; (bg) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 59; (bh) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 60; (bi) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 61; (bj) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 62; (bk) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 63; (bl) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 64;

(bm) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 65; (bn) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 66; (bo) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 67; (bp) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 68; (bq) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 69; (br) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 70; (bs) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 71; (bt) uma variante de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:

6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 ou SEQ ID NO: 71 que compreende uma ou mais substituições de aminoácido (de preferência, substituições conservativas), e/ou uma ou mais deleções de aminoácido, e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação dos mesmos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; (bu) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac),

(ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (at), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc), (bd), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (bm), (bn), (bo), (bp), (bq), (br), (bs) ou (bt) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; e (bv) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (at), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc), (bd), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (bm), (bn), (bo), (bp), (bq), (br), (bs) ou (bt) que tem atividade de muramidase e que tem pelo menos 90 % do comprimento do polipeptídeo maduro.

[0113] De preferência, a invenção se refere a uma composição que compreende um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais carotenoides, em que o carotenoide é selecionado a partir do grupo que consiste em luteína, cantaxantina, zeaxantina ou astaxantina ou derivados das mesmas.

[0114] Na presente invenção, a muramidase pode compreender ou consistir em aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 1 a 213 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos 1 a 218 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 4, aminoácidos 1 a 215 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos 1 a 207 da

SEQ ID NO: 6, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 8, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 9, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 10, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 11, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 12, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 13, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 14, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 15, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 16, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 17, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 18, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 19, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 20, aminoácidos 1 a 218 da SEQ ID NO: 21, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 22, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 23, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 24, aminoácidos 1 a 210 da SEQ ID NO: 25, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 26, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 27, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 28, aminoácidos 1 a 217 da SEQ ID NO: 29, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 30, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 31, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 32, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 33, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 34, aminoácidos 1 a 201 da SEQ ID NO: 35, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 36, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 37, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 38, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 39, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 40, aminoácidos 1 a 202 da SEQ ID NO: 41, aminoácidos 1 a 206 da SEQ ID NO: 42, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 43, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 44, aminoácidos 1 a 215 da SEQ ID NO: 45, aminoácidos 1 a 217 da SEQ ID NO: 46, aminoácidos 1 a 214 da SEQ ID NO: 47, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 48, aminoácidos 1 a 203 da SEQ ID NO: 49, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 50, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 51,

aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 52, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 53, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 54, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 55, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 56, aminoácidos 1 a 208 da SEQ ID NO: 57, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 58, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 59, aminoácidos 1 a 207 da SEQ ID NO: 60, aminoácidos 1 a 204 da SEQ ID NO: 61, aminoácidos 1 a 216 da SEQ ID NO: 62, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 63, aminoácidos 1 a 249 da SEQ ID NO: 64, aminoácidos 1 a 248 da SEQ ID NO: 65, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 66, aminoácidos 1 a 249 da SEQ ID NO: 67, aminoácidos 1 a 245 da SEQ ID NO: 68, aminoácidos 1 a 247 da SEQ ID NO: 69, aminoácidos 1 a 250 da SEQ ID NO: 70 ou aminoácidos 1 a 240 da SEQ ID NO: 71.

[0115] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácido que não alteram, geralmente, a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, Nova York. As substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly. Outros exemplos de substituições conservativas são G para A; A para G, S; V para I, L, A, T,

S; I para V, L, M; L para I, M, V; M para L, I, V; P para A, S, N; F para Y, W, H; Y para F, W, H; W para Y, F, H; R para K, E, D; K para R, E, D; H para Q, N, S; D para N, E, K, R, Q; E para Q, D, K, R, N; S para T, A; T para S, V, A; C para S, T, A; N para D, Q, H, S; Q para E, N, H, K, R.

[0116] Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica, como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese por varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, as mutações de única alanina são introduzidas em todo resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas para atividade de muramidase para identificar resíduos de aminoácido que são críticos para a atividade da molécula. Vide também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica também pode ser determinada por meio de análise física da estrutura, conforme determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétron ou marcação por fotoafinidade, em combinação com a mutação de aminoácidos de sítio de contato putativo. Vide, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais também pode ser inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[0117] O documento WO 2013/076253 revelou que resíduos de aminoácido D95 e E97 da SEQ ID NO: 8 do documento WO 2013/076253 são resíduos catalíticos. O documento PCT/CN2017/075960 revela os aminoácidos catalíticos de muramidases 12 GH25. Esse alinhamento pode ser usado para determinar a posição dos aminoácidos catalíticos para as muramidases reivindicadas. Em uma modalidade, nenhuma alteração é feita a um aminoácido que corresponde a E97 e D95 quando se usa SEQ ID NO: 39 para numeração. Os aminoácidos catalíticos para as muramidases de GH24 podem ser determinados alinhando-se as sequências com sequências conhecidas em que o aminoácido (ou aminoácidos) catalítico já foi determinado (vide www.uniprot.org).

[0118] Com mais preferência, a composição da presente invenção compreende a muramidase da SEQ ID NO: 1 e a mistura de timol, eugenol e piperina.

[0119] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase pode ser dosado entre 0,001 % a 25 % p/p da composição, de preferência, 0,01 % a 25 % p/p, com mais preferência, 0,05 % a 20 % p/p, com mais preferência, 0,2 % a 15 % p/p, ainda com mais preferência, 0,5 % a 15 % p/p ou com máxima preferência, 1,0 % a 10 % p/p da composição.

[0120] Na presente invenção, o caratenoide pode ser dosado entre 0,01 % a 25 % p/p da composição, de preferência, 0,1 % a 25 % p/p, com mais preferência, 0,15 % a 20 % p/p, com mais preferência, 0,2 % a 15 % p/p, ainda com mais preferência, 0,5 % a 15 % p/p ou com máxima preferência, 1,0 % a 10 % p/p da composição.

[0121] Na presente invenção, o carotenoide da composição pode ser formulado como uma formulação sólida; o polipeptídeo que tem atividade de muramidase da composição pode ser formulado como uma formulação sólida; ou tanto o carotenoide quanto o polipeptídeo que tem atividade de muramidase da composição podem ser formulados como uma formulação sólida.

[0122] Na presente invenção, o carotenoide da composição também pode ser formulado como uma formulação líquida; o polipeptídeo que tem atividade de muramidase da composição também pode ser formulado como uma formulação líquida; ou tanto o carotenoide quanto o polipeptídeo que tem atividade de muramidase da composição podem ser formulados como uma formulação líquida.

[0123] Na presente invenção, a formulação líquida pode compreender adicionalmente 20 %-80 % de poliol (isto é quantidade total de poliol), de preferência 25 %-75 % de poliol, com mais preferência 30 %-70 % de poliol, com mais preferência, 35 %-65 % de poliol ou com máxima preferência, 40 %-60 % de poliol. De preferência, a formulação líquida compreende 20 %-80 % de poliol, com mais preferência, 25 %- 75 % de poliol, com mais preferência, 30 %-70 % de poliol, com mais preferência, 35 %-65 % de poliol ou com máxima preferência, 40 %-60 % de poliol em que o poliol é selecionado a partir do grupo que consiste em glicerol, sorbitol, propileno glicol (MPG), etileno glicol, dietileno glicol, trietileno glicol, 1, 2-propileno glicol ou 1, 3- propileno glicol, dipropileno glicol, polietileno glicol (PEG) que tem um peso molecular médio abaixo de cerca de 600 e polipropileno glicol (PPG) que tem um peso molecular médio abaixo de cerca de 600. Com mais preferência, a formulação líquida compreende 20 %-80 % de poliol (isto é, a quantidade total de poliol), com mais preferência, 25 %-75 % de poliol, com mais preferência, 30 %-70 % de poliol, com mais preferência, 35 %-65 % de poliol ou, com máxima preferência, 40 %-60 % de poliol em que o poliol é selecionado a partir do grupo que consiste em glicerol, sorbitol e propileno glicol (MPG).

[0124] Na presente invenção, a formulação líquida pode compreender adicionalmente conservante, de preferência, selecionado a partir do grupo que consiste em sorbato de sódio, sorbato de potássio, benzoato de sódio e benzoato de potássio ou qualquer combinação dos mesmos. De preferência, a formulação líquida compreende 0,02 % a 1,5 % p/p de conservante, com mais preferência, 0,05 % a 1,0 % p/p de conservante ou, com máxima preferência, 0,1 % a 0,5 % p/p de conservante. Com mais preferência, a formulação líquida compreende 0,001 % a 2,0 % p/p de conservante (isto é, quantidade total de conservante), de preferência, 0,02 % a 1,5 % p/p de conservante, com mais preferência, 0,05 % a 1,0 % p/p de conservante ou, com máxima preferência, 0,1 % a 0,5 % p/p de conservante, em que o conservante é selecionado a partir do grupo que consiste em sorbato de sódio, sorbato de potássio, benzoato de sódio e benzoato de potássio ou qualquer combinação dos mesmos.

[0125] Na presente invenção, a formulação líquida pode compreender um ou mais agentes de formulação (como aqueles descritos no presente documento), de preferência, um agente de formulação selecionado a partir da lista que consiste em glicerol, etileno glicol, 1, 2-propileno glicol ou 1, 3- propileno glicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glicose, sacarose, sorbitol, lactose, amido, PVA, acetato e fosfato, de preferência, selecionado a partir da lista que consiste em 1, 2-propileno glicol, 1, 3-propileno glicol, sulfato de sódio, dextrina, celulose, tiossulfato de sódio, caulim e carbonato de cálcio.

[0126] Na presente invenção, a formulação sólida pode ser, por exemplo, como um grânulo, pó seco em aspersão ou aglomerado (por exemplo, conforme revelado no documento WO2000/70034). O agente de formulação pode compreender um sal (sais orgânicos ou inorgânicos de zinco, sódio, potássio ou cálcio como, por exemplo, como acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, citrato de potássio, sorbato de potássio, sulfato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, carbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco, sorbato de zinco, sulfato de zinco), amido ou um açúcar ou derivado de açúcar (como, por exemplo, sacarose, dextrina, glicose, lactose, sorbitol).

[0127] De preferência, os agentes de formulação da formulação sólida são selecionados a partir da lista que consiste em cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glicose, sacarose, sorbitol, lactose, amido e celulose. De preferência, o agente de formulação é selecionado dentre um ou mais dos seguintes compostos: sulfato de sódio, dextrina, celulose, tiossulfato de sódio, sulfato de magnésio e carbonato de cálcio.

[0128] De preferência, a composição da presente invenção é um grânulo de enzima que compreende as enzimas da invenção opcionalmente combinadas com uma ou mais enzimas adicionais. O grânulo é composto de um núcleo, e opcionalmente um ou mais revestimentos (camadas externas) que circundam o núcleo.

[0129] Tipicamente, o tamanho de grânulo, medido como diâmetro esférico equivalente (tamanho médio de partícula baseado em volume), do grânulo é 20-2000 µm, particularmente, 50-1500 µm, 100-1500 µm ou 250-1200 µm.

[0130] O núcleo pode ser preparado granulando-se uma mescla dos ingredientes, por exemplo, por meio de um método que compreende técnicas de granulação como cristalização, precipitação, revestimento em recipiente rotativo, revestimento em leito fluidizado, aglomeração de leito fluidizado, atomização giratória, extrusão, perolação, esferonização, métodos de redução de tamanho, granulação em tambor e/ou granulação de alto cisalhamento.

[0131] Métodos para preparar o núcleo podem ser encontrados em Handbook of Powder Technology; Particle size enlargement de C. E. Capes; Volume 1; 1980; Elsevier. Os métodos de preparação incluem tecnologias de formulação de grânulo conhecidas, por exemplo: a) produtos secos em aspersão, em que uma solução que contém enzima líquida é atomizada em uma torre de secagem em aspersão para formar pequenas gotículas que, durante sua descida, a torre de secagem seca para formar um material de particulado que contém enzima; b) produtos em camadas, em que a enzima é revestida como uma camada ao redor de uma partícula de núcleo inerte pré-formada, em que uma solução que contém enzima é atomizada, tipicamente, em um aparelho de leito fluidizado em que as partículas de núcleo pré-formadas são fluidizadas, e a solução que contém enzima adere às partículas de núcleo e secam para deixar uma camada de enzima seca na superfície da partícula de núcleo.

As partículas de um tamanho desejado podem ser obtidas desse modo se uma partícula de núcleo útil do tamanho desejado puder ser encontrada.

Esse tipo de produto é descrito, por exemplo, no documento WO 97/23606; c) partículas de núcleo absorvidas, em que ao invés de revestir a enzima como uma camada ao redor do núcleo, a enzima é absorvida na superfície do núcleo.

Tal processo é descrito no documento WO 97/39116. d) produtos de extrusão ou peletizados, em que uma pasta que contém enzima é prensada nos péletes ou sob pressão é extrusada através de uma pequena abertura e cortada em partículas que são subsequentemente secas.

Tais partículas têm, usualmente, um tamanho considerável devido ao fato de que o material em que a abertura de extrusão é feita (usualmente uma placa com furos) define um limite na queda de pressão permissível na abertura de extrusão.

Também, as pressões de extrusão muito altas quando se usa uma pequena abertura aumentam a geração de calor na pasta enzimática, que é nociva à enzima; e) produtos perolados, em que um pó que contém enzima é suspenso em cera derretida e a suspensão é aspergida, por exemplo, através de um atomizador de disco giratório, em uma câmara de resfriamento em que as gotículas rapidamente se solidificam (Michael S.

Showell (editor); Powdered detergents; Surfactant Science Series; 1998; vol. 71; páginas 140-142; Marcel Dekker). O produto obtido é um em que a enzima é uniformemente distribuída por todo um material inerte ao invés de ser concentrada em sua superfície.

Também, US 4.016.040 e US 4.713.245 são documentos relacionados a essa técnica; f) produtos de granulação em misturador, em que um líquido é adicionado a uma composição em pó seco de, por exemplo, componentes de granulação convencionais, sendo que a enzima é introduzida por meio do líquido ou do pó ou ambos.

O líquido e o pó são misturados e à medida que a umidade do líquido é absorvida no pó seco, os componentes do pó seco começarão a aderir e o aglomerado e as partículas irão se constituir, formando granulados que compreendem a enzima.

Tal processo é descrito no documento US 4.106.991 e documentos relacionados EP 170360, EP 304332, EP 304331, WO 90/09440 e WO 90/09428. Em um produto específico desse processo em que vários misturadores de alto cisalhamento podem ser usados como granuladores, granulados que consistem em enzima como enzima, cargas e aglutinantes etc. são misturados com fibras de celulose para reforçar as partículas para render o denominado T-granulado.

As partículas reforçadas, que são mais robustas, liberam menos poeira enzimática. g) redução de tamanho, em que os núcleos são produzidos através de moagem ou trituração de partículas maiores, péletes, tabletes, briquetas etc. que contêm a enzima.

A fração de partícula de núcleo desejada é obtida peneirando- se o produto moído ou triturado.

As partículas sob ou subdimensionada podem ser recicladas.

A redução de tamanho é descrita em (Martin Rhodes (editor); Principles of Powder Technology; 1990; Capítulo 10; John Wiley & Sons);

h) granulação de leito fluidizado, que envolve suspender particulados em um fluxo de ar e aspergir um líquido nas partículas fluidizadas por meio de bocais. As partículas atingidas por gotículas da aspersão ficam úmidas e se tornam pegajosas. As partículas pegajosas colidem com outras partículas e aderem às mesmas e formam um grânulo; i) os núcleos podem ser submetidos à secagem, como em um secador de leito fluidizado. Outros métodos conhecidos para secar grânulos na indústria alimentícia ou de detergente podem ser usados pela pessoa versado. A secagem ocorre, de preferência, em uma temperatura de produto de 25 a 90 °C. Para algumas enzimas é importante que os núcleos que compreendem a enzima contenham uma baixa quantidade de água antes do revestimento. Se as enzimas sensíveis a água forem revestidas antes da água em excesso ser removida, a mesma será presa dentro do núcleo e pode afetar a atividade da enzima negativamente. Após a secagem, os núcleos, de preferência, contêm 0,1-10 % p/p de água.

[0132] O núcleo pode incluir materiais adicionais como cargas, materiais de fibra (celulose ou fibras sintéticas), agentes estabilizadores, agentes solubilizantes, agentes de suspensão, agentes de regulação de viscosidade, esferas de luz, plastificantes, sais, lubrificantes e fragrâncias.

[0133] O núcleo pode incluir um aglutinante, como polímero sintético, cera, gordura ou carboidrato.

[0134] O núcleo pode incluir um sal de um cátion multivalente, um agente de redução, um antioxidante, um catalisador de decomposição de peróxido e/ou um componente de tampão ácido, tipicamente como uma mescla homogênea.

[0135] Na presente invenção, o núcleo pode compreender um material selecionado a partir do grupo que consiste em sais (como acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, citrato de potássio, sorbato de potássio, sulfato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, carbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco, sorbato de zinco, sulfato de zinco), amido ou a açúcar ou derivado de açúcar (como por exemplo sacarose, dextrina, glicose, lactose, sorbitol), açúcar ou derivado de açúcar (como, por exemplo, sacarose, dextrina, glicose, lactose, sorbitol), pequenas moléculas orgânicas, amido, farinha, celulose e minerais e minerais de argila (também conhecidos como filossilicatos de alumínio hidroso). De preferência, o núcleo compreende um mineral de argila como caulimita ou caulim.

[0136] O núcleo também pode incluir uma partícula inerte com a enzima absorvida na mesma, ou aplicada na superfície, por exemplo, através de revestimento em leito fluidizado.

[0137] O núcleo pode ter um diâmetro de 20-2000 µm, particularmente, 50-1500 µm, 100-1500 µm ou 250-1200 µm.

[0138] O núcleo pode ser circundado por pelo menos um revestimento, por exemplo, para aprimorar a estabilidade em armazenamento, para reduzir a formação de poeira durante a manipulação ou para colorir o grânulo. O revestimento (ou revestimentos) opcional pode incluir um revestimento de sal e/ou cera e/ou farinha ou outros materiais de revestimento adequados.

[0139] O revestimento pode ser aplicado em uma quantidade de pelo menos 0,1 % em peso do núcleo, por exemplo, pelo menos 0,5 %, 1 % ou 5 %. A quantidade pode ser, no máximo, 100 %, 70 %, 50 %, 40 % ou 30 % em peso do núcleo.

[0140] O revestimento tem, de preferência, pelo menos 0,1 µm de espessura, particularmente, pelo menos 0,5 µm, pelo menos 1 µm ou pelo menos 5 µm. Em algumas modalidades, a espessura do revestimento está abaixo de 100 µm, como abaixo de 60 µm, ou abaixo de 40 µm.

[0141] O revestimento deve encapsular a unidade de núcleo formando-se uma camada substancialmente contínua. Uma camada substancialmente contínua deve ser compreendida como um revestimento que tem menos ou nenhum furo, de modo que a unidade de núcleo seja encapsulada ou envolvida com poucas áreas ou nenhuma área não revestida. A camada ou revestimento deve, em particular, ser homogêneo em espessura.

[0142] O revestimento pode conter adicionalmente outros materiais conforme conhecidos na técnica, por exemplo, cargas, agentes antiaderentes, pigmentos, corantes, plastificantes e/ou aglutinantes, como dióxido de titânio, caulim, carbonato de cálcio ou talco.

[0143] De preferência, os grânulos de enzima da invenção podem compreender um núcleo que compreende as enzimas da invenção, um ou mais revestimentos de sal e um ou mais revestimentos de cera. Exemplos de grânulos enzimáticos com múltiplos revestimentos são mostrados nos documentos WO1993/07263, WO1997/23606 e WO2016/149636.

[0144] O revestimento de sal pode compreender pelo menos 60 % em de um sal, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %,

pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % em peso. O revestimento de sal pode ser conforme descrito nos documentos WO1997/05245, WO1998/54980, WO1998/55599, WO2000/70034, WO2006/034710, WO2008/017661, WO2008/017659, WO2000/020569, WO2001/004279, WO1997/05245, WO2000/01793, WO2003/059086, WO2003/059087, WO2007/031483, WO2007/031485, WO2007/044968, WO2013/192043, WO2014/014647 e WO2015/197719 ou revestimento polimérico como descritos no documento WO 2001/00042.

[0145] O sal no revestimento pode ter uma umidade constante a 20 °C acima de 60 %, particularmente acima de 70 %, acima de 80 % ou acima de 85 % ou pode ser uma outra forma de hidrato de tal sal (por exemplo, anidrato).

[0146] O sal pode ser um sal inorgânico, por exemplo, sais de sulfato, sulfito, fosfato, fosfonato, nitrato, cloreto ou carbonato ou sais de ácidos orgânicos simples (menores que 10 átomos de carbono, por exemplo, 6 ou menos átomos de carbono) como citrato, malonato ou acetato. Exemplos de cátions nesses sais são íons de metal alcalino ou metal alcalinoterroso, o íon de amônio ou íons de metal da primeira série de transição, como sódio, potássio, magnésio, cálcio, zinco ou alumínio. Exemplos de ânions incluem cloreto, brometo, iodeto, sulfato, sulfito, bissulfito, tiossulfato, fosfato, fosfato monobásico, fosfato dibásico, hipofosfito, pirofosfato de di-hidrogênio, tetraborato, borato, carbonato, bicarbonato, metassilicato, citrato, malato, maleato, malonato, succinato, sorbato, lactato, formato, acetato, butirato, propionato, benzoato, tartrato, ascorbato ou gluconato. Em particular, sais de metal alcalino ou metal alcalinoterroso de sulfato, sulfito, fosfato, fosfonato,

nitrato, cloreto ou carbonato ou sais de ácidos orgânicos simples como citrato, malonato ou acetato podem ser usados.

[0147] Exemplos específicos de sais adequados são NaCl (CH20 °C = 76 %), Na2CO3 (CH20 °C = 92 %), NaNO3 (CH20 °C = 73 %), Na2HPO4 (CH20 °C = 95 %), Na3PO4 (CH25 °C = 92 %), NH4Cl (CH20 °C = 79,5 %), (NH4)2HPO4 (CH20 °C = 93,0 %), NH4H2PO4 (CH20 °C = 93,1 %), (NH4)2SO4 (CH20 °C = 81,1 %), KCl (CH20 °C = 85 %), K2HPO4 (CH20 °C = 92 %), KH2PO4 (CH20 °C = 96,5 %), KNO3 (CH20 °C = 93,5 %), Na2SO4 (CH20 °C = 93 %), K2SO4 (CH20 °C = 98 %), KHSO4 (CH20 °C = 86 %), MgSO4 (CH20 °C = 90 %), ZnSO4 (CH20 °C = 90 %) e citrato de sódio (CH25 °C = 86 %). Outros exemplos incluem NaH2PO4, (NH4)H2PO4, CuSO4, Mg(NO3)2, magnésio acetato, acetato de cálcio, benzoato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, sorbato de cálcio, sulfato de cálcio, acetato de potássio, benzoato de potássio, carbonato de potássio, cloreto de potássio, citrato de potássio, sorbato de potássio, acetato de sódio, benzoato de sódio, citrato de sódio, sulfato de sódio, acetato de zinco, benzoato de zinco, carbonato de zinco, cloreto de zinco, citrato de zinco e sorbato de zinco.

[0148] O sal pode estar na forma anidra, ou pode ser um sal hidratado, isto é, um hidrato de sal cristalino com água (ou águas) ligada de cristalização, como descrito no documento WO 99/32595. Exemplos específicos incluem sulfato de sódio anidro (Na2SO4), sulfato de magnésio anidro (MgSO4), hepta-hidrato de sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O), hepta- hidrato de sulfato de zinco (ZnSO4.7H2O), hepta-hidrato dibásico de fosfato de sódio (Na2HPO4.7H2O), hexa-hidrato de nitrato de magnésio (Mg(NO3)2(6H2O)), di-hidrato de citrato de sódio e tetra-hidrato de acetato de magnésio.

[0149] O revestimento de sal pode compreender um único sal ou uma mistura de dois ou mais sais. O sal pode ser solúvel em água, em particular, que tem uma solúvel em água pelo menos 0,1 g em 100 g de água a 20 °C, de preferência, pelo menos 0,5 g por 100 g de água, por exemplo, pelo menos 1 g per 100 g de água, por exemplo, pelo menos 5 g per 100 g de água. O sal pode ser adicionado a partir de uma solução de sal em que o sal é completamente dissolvido ou a partir de uma suspensão de sal em que as partículas finas são menores que 50 µm, como menores que 10 µm ou menores que 5 µm.

[0150] Um revestimento de cera pode compreender pelo menos 60 % em de uma cera, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % em peso.

[0151] Exemplos específicos de ceras são polietileno glicóis; polipropilenos; cera de carnaúba; cera de candelila; cera de abelha; óleo vegetal hidrogenado ou sebo animal como polietileno glicol (PEG), metil hidroxi-propil celulose (MHPC), álcool polivinílico (PVA), sebo de boi hidrogenado, óleo de palma hidrogenado, sementes de algodão hidrogenadas e/ou óleo de soja hidrogenado; álcoois de ácido graxo; monoglicerídeos e/ou diglicerídeos, como estearato de glicerila, em que o estearato é uma mistura de ácido esteárico e palmítico; cera microcristalina; parafinas; e ácidos graxos, como ácidos graxos de cadeia longa linear hidrogenados e derivados dos mesmos. Uma cera preferencial é o óleo de palma ou óleo de palma hidrogenado.

[0152] O granulado da presente invenção também pode ser produzido como um granulado de não pulverização, por exemplo, conforme revelado nas Patentes Nº US 4.106.991 e 4.661.452 e pode ser opcionalmente revestido por meio de métodos conhecidos na técnica. Os materiais de revestimento podem ser materiais de revestimento de cera e materiais de revestimento de formação de filme. Exemplos de materiais de revestimento de cera são produtos de poli(óxido de etileno) (polietileno glicol, PEG) com pesos molares médios de 1000 a 20000; nonilfenóis etoxilados que têm de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados em que o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e em que há 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidos graxos; e mono e di e triglicerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento de formação de filme adequados para aplicação por meio de técnicas de leito fluidizado são dados no documento GB 1483591.

[0153] O granulado pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais. Cada enzima estará presente, então, em mais grânulos garantindo uma distribuição mais uniforme das enzimas, e também reduz a segregação física de diferentes enzimas devido aos diferentes tamanhos de partícula. Métodos para produzir cogranulados de múltiplas enzimas são revelados na revelação ip.com IPCOM000200739D.

[0154] Um outro exemplo de formulação de enzimas através do uso de cogranulados é revelado no documento WO 2013/188331.

[0155] A presente invenção também se refere a enzimas protegidas preparadas de acordo com o método revelado no documento EP 238.216.

[0156] Então, de preferência, a presente invenção fornece um grânulo, que compreende: (a) um núcleo que compreende um carotenoide e muramidase de acordo com a invenção, e (b) um revestimento que consiste em uma ou mais camada (ou camadas) que circunda o núcleo.

[0157] Na presente invenção, o revestimento compreende um revestimento de sal conforme descrito no presente documento. De preferência, o revestimento compreende um revestimento de cera conforme descrito no presente documento. Com mais preferência, o revestimento compreende um revestimento de sal seguido por um revestimento de cera conforme descrito no presente documento. Ainda com mais preferência, o carotenoide e o polipeptídeo que tem atividade de muramidase são cogranulados.

[0158] Na presente invenção, a composição pode compreender adicionalmente um ou mais componentes selecionados a partir da lista que consiste em um ou mais carreadores. O carreador pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em água, glicerol, etileno glicol, 1, 2- propileno glicol ou 1, 3-propileno glicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, maltodextrina, glicose, sacarose, sorbitol, lactose, farinha de trigo, farelo de trigo, farinha de glúten de milho, amido, caulim e celulose ou qualquer combinação dos mesmos.

[0159] Na presente invenção, a composição pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais; um ou mais eubióticos; uma ou mais vitaminas; um ou mais minerais, e um ou mais aminoácidos, conforme descrito abaixo. Ração Animal

[0160] Em um segundo aspecto, a presente invenção se refere a uma ração animal que compreende um aditivo de ração animal, uma ou mais fontes de proteína e uma ou mais fontes de energia, sendo a ração animal caracterizada por compreender adicionalmente um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais carotenoides como definido acima.

[0161] Dietas ou composições de ração animal têm um teor relativamente alto de proteína. As dietas de aves e porcos podem ser caracterizadas conforme indicado na Tabela B do documento WO 01/58275, colunas 2-3. As dietas de peixes podem ser caracterizadas conforme indicado na coluna 4 desta Tabela B. Ademais, tais dietas de peixe normalmente têm um teor de gordura bruta de 200-310 g/kg.

[0162] Uma composição de ração animal de acordo com a invenção tem um teor de proteína bruta de 50-800 g/kg. A fonte de proteína pode ser fonte de proteína vegetal e/ou proteína animal.

[0163] As proteínas vegetais podem ser derivadas de fontes de proteína vegetal, como legumes e cereais, por exemplo, materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, e Poaceae, como farinha de soja, farinha de tremoço, farinha de colza e combinações das mesmas. O teor de proteína das proteínas vegetais é pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90 % (p/p).

[0164] De preferência, a fonte de proteína vegetal pode ser material de uma ou mais plantas da família Fabaceae, por exemplo, soja, tremoço, ervilha ou feijão. A fonte de proteína vegetal também pode ser material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, por exemplo, beterraba, beterraba sacarina, espinafre ou quinoa. Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são colza e repolho. Na presente invenção, soja é uma fonte de proteína vegetal preferencial. Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são cereais como cevada, trigo, centeio, aveia, maís (milho), arroz e sorgo.

[0165] Além da proteína vegetal como definido acima, a ração animal da invenção também pode conter proteína animal, como Farinha de Carne e Ossos, Farinha de penas e/ou Farinha de peixe, tipicamente em uma quantidade de 0-25 %. A ração animal da invenção também pode compreender grão seco de destiladores com solúveis (DDGS), tipicamente em quantidades de 0-30 %.

[0166] De preferência, a fonte de proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em soja, soja selvagem, feijão, tremoço, feijão Tepary, feijão-da-Espanha, feijão slimjim, feijão-de-lima, vagem francesa, fava comum (feijão- fava), grão de bico, lentilha, amendoim, amendoim Spanish, canola, semente de girassol, semente de algodão, colza (semente oleaginosa de colza) ou ervilha ou em uma forma processada como farinha de soja, farinha de soja integral, concentrado de proteína de soja (SPC), farinha de soja fermentada (FSBM), farinha de girassol, farinha de semente de algodão, farinha de colza, farinha de peixe, farinha de osso, farinha de pena, soro ou qualquer combinação dos mesmos.

[0167] Ademais, ou alternativamente (ao teor de proteína bruta indicado acima), a composição de ração animal da invenção pode ter um teor de energia metabolizável de 10-30 MJ/kg. Na presente invenção, a fonte de energia pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em maís, milho, sorgo, trigo, cevada, aveia, arroz, triticale, centeio, beterraba, beterraba sacarina, espinafre, batata, mandioca, quinoa, repolho, switchgrass, painço, milheto, milho-da- Itália ou em uma forma processada como milho moído, maís moído, amido de batata, amido de mandioca, sorgo moído, switchgrass moído, painço moído, milho-da-Itália moído, milheto moído, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0168] Ademais, ou alternativamente (ao teor de proteína bruta indicado acima), a composição de ração animal da invenção pode ter um teor de cálcio de 0,1-200 g/kg; e/ou um teor de fósforo disponível de 0,1-200 g/kg; e/ou um teor de metionina de 0,1-100 g/kg; e/ou um teor de metionina mais cisteína de 0,1-150 g/kg; e/ou um teor de lisina de 0,5-50 g/kg.

[0169] Em particular, o teor de energia metabolizável, proteína bruta, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais cisteína, e/ou lisina pode estar dentro de qualquer das faixas 2, 3, 4 ou 5, na Tabela B do documento WO 01/58275 (R. 2-5).

[0170] A proteína bruta é calculada como nitrogênio (N) multiplicado por um fator 6,25, isto é, proteína bruta (g/kg)= N (g/kg) x 6,25. O teor de nitrogênio é determinado através do método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analyse 14ª edição, Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

[0171] A energia metabolizável pode ser calculada com base nos requisitos de Nutrientes da publicação de NRC em suíno, nona edição revisada 1988, subcomitê em nutrição suína, comitê em nutrição animal, junta de agricultura, conselho de pesquisa nacional. National Academy Press, Washington, D.C., páginas 2-6, e o European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, The Países-Baixos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.

[0172] O teor dietário de cálcio, fósforo e aminoácidos disponíveis em dietas animais completas é calculado com base nas tabelas alimentícias como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

[0173] De preferência, a ração animal da invenção contém 0-80 % de maís; e/ou 0-80 % de sorgo; e/ou 0-70 % de trigo; e/ou 0-70 % de cevada; e/ou 0-30 % de aveias; e/ou 0-40 % de farinha de soja; e/ou 0-25 % de farinha de peixe; e/ou 0-25 % de farinha de carne e ossos; e/ou 0-20 % de soro.

[0174] A ração animal pode, por exemplo, ser fabricada como ração amassada (não peletizada) ou ração peletizada. Tipicamente, os gêneros alimentícios moídos são misturados e quantidades suficientes de vitaminas e minerais essenciais são adicionados de acordo com as especificações para as espécies em questão. As enzimas podem ser adicionadas como formulações enzimáticas sólidas ou líquidas. Por exemplo, para ração amassada uma formulação enzimática sólida ou líquida pode ser adicionada antes ou durante a etapa de misturação de ingrediente. Para a ração peletizada (líquida ou sólida) a preparação de carotenoide/muramidase/enzima também pode ser adicionada antes ou durante a etapa de ingrediente de ração. Tipicamente, uma preparação de enzima líquida compreende o carotenoide, a muramidase ou tanto o carotenoide quanto a muramidase da invenção opcionalmente com um poliol, como glicerol, etileno glicol ou propileno glicol, e é adicionada após a etapa de peletização, como aspergindo-se a formulação líquida nos péletes. O carotenoide e/ou a muramidase também pode ser incorporado em um aditivo de ração ou pré-mistura.

[0175] Alternativamente, o carotenoide/muramidase pode ser preparado congelando-se uma mistura de solução de enzima líquida com um agente de tamponamento como farinha de soja triturada e, então, liofilizando-se a mistura.

[0176] Na presente invenção, a ração animal pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais; um ou mais eubióticos; uma ou mais vitaminas; um ou mais minerais, e um ou mais aminoácidos, conforme descrito abaixo.

[0177] A concentração de muramidase final na ração está dentro da faixa de 100-1000 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, como 200 a 900 mg, 300 a 800 mg, 400 a 700 mg ou 500 a 600 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.

[0178] A concentração de carotenoide final na ração está dentro da faixa de 20 a 200 mg por kg de ração animal, como 30 a 150 mg, 50 a 120 mg, 60 a 100 mg por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.

[0179] A ração animal da presente invenção pode ser produzida por meio de qualquer processo conhecido. Por exemplo, a ração animal da presente invenção é preparada por meio de um processo que compreende as etapas de: (a) misturar um aditivo de ração animal com uma ou mais fontes de proteína e uma ou mais fontes de energia; (b) tratar opcionalmente com vapor a ração animal de (a) seguido pela prensagem da mistura tratada com vapor para formar péletes; e (c) aspergir opcionalmente uma formulação líquida na ração animal de (a) ou (b).

[0180] No presente processo, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase pode ser adicionado na etapa (a) e o carotenoide pode ser adicionado na etapa (c). Em uma modalidade, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase é adicionado na etapa (c) e o carotenoide é adicionado na etapa (a). Em uma modalidade, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase e o carotenoide são adicionados na etapa (a). Em uma modalidade, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase e o carotenoide são adicionados na etapa (c).

[0181] No presente processo, a ração animal pode ser peletizada por meio de tratamento com vapor da mistura de (a) para obter um teor de umidade abaixo de 20 % em peso da mistura, e prensar a mistura tratada com vapor para formar péletes. De preferência, a ração animal é peletizada através de tratamento com vapor da mistura de (a) para obter um teor de umidade abaixo de 20 % em peso da mistura em que o tratamento com vapor é entre 60 °C e 100 °C quando medido na saída do condicionador, e prensar a mistura tratada com vapor para formar péletes. No presente processo, o tempo de permanência total na etapa b) pode ser entre 1 segundo e 10 minutos. No presente processo, a temperatura dos péletes após a peletização da mistura tratada com vapor pode ser entre 70 °C e 105 °C. Enzimas Adicionais

[0182] Na presente invenção, as composições e/ou a ração animal descrita no presente documento podem incluir opcionalmente uma ou mais enzimas. As enzimas podem ser classificadas com base no handbook Enzyme Nomenclature de NC-IUBMB, 1992), vide também o site na internet: http://www.expasy.ch/enzyme/. ENZYME é um repositório de informações relativas à nomenclatura de enzimas. É principalmente baseado nas recomendações do Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUB-MB), Academic Press, Inc., 1992, e descreve cada tipo de enzima caracterizada para a qual um número de EC (Comissão de Enzima) foi fornecido (Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305). Essa nomenclatura de IUB-MB Enzyme se baseia em sua especificidade de substrato e, ocasionalmente em seu mecanismo molecular; como uma classificação não reflete as características estruturais dessas enzimas.

[0183] Uma outra classificação de determinadas enzimas de glicosídeo hidrolase, como endoglucanase, galactanase, mananase, dextranase e galactosidase é descrita em Henrissat et al, “The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013”, Nucl. Acids Res. (1 de janeiro de 2014) 42 (D1): D490- D495; vide também www.cazy.org.

[0184] Então, a composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da presente invenção podem compreender pelo menos uma outra enzima selecionada a partir do grupo que consiste em acetilxilan esterase (EC 3.1.1.23), acilglicerol lipase (EC 3.1.1.72), alfa-amilase (EC 3.2.1.1), beta- amilase (EC 3.2.1.2), arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55), celobio-hidrolases (EC 3.2.1.91), celulase (EC 3.2.1.4), feruloil esterase (EC 3.1.1.73), galactanase (EC 3.2.1.89), alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22), beta-galactosidase (EC

3.2.1.23), beta-glucanase (EC 3.2.1.6), beta-glucosidase (EC

3.2.1.21), triacilglicerol lipase (EC 3.1.1.3), lisofosfolipase (EC 3.1.1.5), muramidase (EC 3.2.1.17), alfa-manosidase (EC 3.2.1.24), beta-manosidase (mananase) (EC 3.2.1.25), fitase (EC 3.1.3.8, EC 3.1.3.26, EC 3.1.3.72), fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32), fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4), fosfolipase D (EC 3.1.4.4), protease (EC 3.4), pululanase (EC 3.2.1.41), pectinesterase (EC 3.1.1.11), xilanase (EC

3.2.1.8, EC 3.2.1.136), beta-xilosidase (EC 3.2.1.37), ou qualquer combinação dos mesmos.

[0185] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da invenção também pode compreender uma galactanase (EC 3.2.1.89) e uma beta-galactosidase (EC 3.2.1.23).

[0186] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da presente invenção também pode compreender uma fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26). Exemplos de fitases comercialmente disponíveis incluem Bio-FeedTM Phytase (Novozymes), Ronozyme® P, Ronozyme® NP e Ronozyme® HiPhos (DSM Nutritional Products), NatuphosTM (BASF), NatuphosTM E (BASF), Finase® e Quantum® Blue (AB Enzymes), OptiPhos® (Huvepharma), AveMix® Phytase (Aveve Biochem), Phyzyme® XP (Verenium/DuPont) e Axtra® PHY (DuPont). Outras fitases preferenciais incluem aquelas descritas, por exemplo, nos documentos WO 98/28408, WO 00/43503 e WO 03/066847.

[0187] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da presente invenção também pode compreender uma xilanase (EC 3.2.1.8). Exemplos de xilanases comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® WX (DSM Nutritional Products), Econase® XT e Barley (AB Vista), Xylathin® (Verenium), Hostazym® X (Huvepharma), Axtra® XB (Xilanase/beta- glucanase, DuPont) e Axtra® XAP (Xilanase/amilase/protease, DuPont), AveMix® XG 10 (xilanase/glucanase) e AveMix® 02 CS (xilanase/glucanase/pectinase, Aveve Biochem), e Naturgrain (BASF).

[0188] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da invenção também pode compreender uma protease (EC

3.4). Exemplos de proteases comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® ProAct (DSM Nutritional Products), Winzyme Pro Plus® (Suntaq International Limited) e Cibenza® DP100 (Novus International).

[0189] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da invenção também compreende uma alfa-amilase (EC

3.2.1.1). Exemplos de alfa-amilases comercialmente disponíveis incluem Ronozyme® A e RONOZYME® RumiStar™ (DSM Nutritional Products).

[0190] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da invenção também pode compreender um produto enzimático de múltiplos componentes, como FRA® Octazyme (Framelco), Ronozyme® G2, Ronozyme® VP e Ronozyme® MultiGrain (DSM Nutritional Products), Rovabio® Excel ou Rovabio® Advance (Adisseo). Eubióticos

[0191] A composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal da invenção pode compreender adicionalmente eubióticos. Os eubióticos são compostos que são projetados para fornecer um equilíbrio saudável da microflora no trato gastrointestinal. Os eubióticos cobrem um número de aditivos de ração diferentes, como probióticos, pré-bióticos, fitogênicos (óleos essenciais) e ácidos orgânicos que são descritos em mais detalhes abaixo. Probióticos

[0192] Na presente invenção, a composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal pode compreender adicionalmente um ou mais probióticos adicionais. Em particular, a composição de ração animal pode compreender adicionalmente uma bactéria de um ou mais dos seguintes gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphaera ou qualquer combinação dos mesmos.

[0193] De preferência, a composição, a ração animal ou o aditivo de ração animal compreendem adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Enterococcus faecium, Enterococcus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminus, lactobacillus rhamnosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Megasphaera elsdenii, Propionibacteria sp.

[0194] Com mais preferência, a composição ou a ração animal da presente invenção compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus subtilis: 3A-P4 (PTA-6506), 15A-P4 (PTA-6507), 22C-P1 (PTA- 6508), 2084 (NRRL B-500130), LSSA01 (NRRL-B-50104), BS27 (NRRL B-501 05), BS 18 (NRRL B-50633), BS 278 (NRRL B-50634), DSM 29870, DSM 29871, DSM 32315, NRRL B-50136, NRRL B-50605, NRRL B-50606, NRRL B-50622 e PTA-7547.

[0195] Com mais preferência, a composição ou a ração animal da presente invenção compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus pumilus: NRRL B-50016, ATCC 700385, NRRL B-50885 ou NRRL B-

50886.

[0196] Com mais preferência, a composição ou a ração animal da presente invenção compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus lichenformis: NRRL B 50015, NRRL B-50621 ou NRRL B-50623.

[0197] Com mais preferência, a composição ou a ração animal da presente invenção compreende adicionalmente uma bactéria de uma ou mais das seguintes cepas de Bacillus amyloliquefaciens: DSM 29869, DSM 29869, NRRL B 50607, PTA- 7543, PTA-7549, NRRL B-50349, NRRL B-50606, NRRL B-50013, NRRL B-50151, NRRL B-50141, NRRL B-50147 ou NRRL B-50888.

[0198] A contagem bacteriana de cada uma das cepas bacterianas na composição, na ração animal ou no aditivo de ração animal é entre 1x104 e 1x1014 CFU/kg de matéria seca, de preferência, entre 1x106 e 1x1012 CFU/kg de matéria seca, e, com mais preferência, entre 1x107 e 1x1011 CFU/kg de matéria seca. De preferência, a contagem bacteriana de cada uma das cepas bacterianas na composição, na ração animal ou no aditivo de ração animal é entre 1x108 e 1x1010 CFU/kg de matéria seca.

[0199] A contagem bacteriana de cada uma das cepas bacterianas na composição, na ração animal ou no aditivo de ração animal é entre 1x105 e 1x1015 CFU/animal/dia, de preferência, entre 1x107 e 1x1013 CFU/animal/dia e, com mais preferência, entre 1x108 e 1x1012 CFU/animal/dia. De preferência, a contagem bacteriana de cada uma das cepas bacterianas na composição, na ração animal ou no aditivo de ração animal é entre 1x109 e 1x1011 CFU/animal/dia. Com mais preferência, a quantidade de probióticos é 0,001 % a 10 % em peso da composição ou da ração animal ou aditivo de ração animal.

[0200] Na presente invenção, a uma ou mais cepas bacterianas podem estar presentes na forma de um esporo estável.

[0201] Exemplos de produtos comerciais são Cylactin® (DSM Nutritional Products), Alterion (Adisseo), Enviva PRO (DuPont Animal Nutrition), Syncra® (mistura de enzima + probiótico, DuPont Animal Nutrition), Ecobiol® e Fecinor® (Norel/Evonik) e GutCare® PY1 (Evonik). Pré-bioticos

[0202] Os pré-bióticos são substâncias que induzem o crescimento ou a atividade de microrganismos (por exemplo, bactérias e fungos) que contribuem para o bem-estar de seu hospedeiro. Os pré-bióticos são tipicamente compostos de fibra não digeríveis que passam não digeridas através da parte superior do trato gastrointestinal e estimulam o crescimento ou a atividade de bactérias vantajosas que colonizam o intestino grosso agindo-se como substrato para os mesmos. Normalmente, os pré-bióticos aumentam o número ou a atividade de bactérias bífidas e bactérias formadoras de ácido láctico no trato GI.

[0203] Os derivados de levedura (leveduras integrais inativadas ou paredes celulares de levedura) também podem ser considerados como pré-bióticos. Os mesmos frequentemente compreendem manan-oligossacarídeos, beta-glucanos de levedura ou teores de proteína e são normalmente derivados da parede celular da levedura, Saccharomyces cerevisiae.

[0204] Na presente invenção, a quantidade de pré-bióticos pode ser 0,001 % a 10 % em peso da composição. Exemplos de produtos de levedura são Yang® e Agrimos (Lallemand Animal Nutrition). Fitogênicos

[0205] Os fitogênicos são um grupo de promotores de crescimento natural ou promotores de crescimento não antibiótico usados como aditivos de ração, derivados de ervas, especiarias ou outras plantas. Os fitogênicos podem ser substâncias únicas preparadas a partir de óleos essenciais/extratos, óleos essenciais/extratos, plantas únicas e misturas de plantas (produtos herbais) ou mistura de óleos essenciais/extratos/ plantas (produtos especializados).

[0206] Exemplos de fitogênicos são alecrim, sálvia, orégano, tomilho, cravo e capim-limão. Exemplos de óleos essenciais são timol, eugenol, meta-cresol, vanilina, salicilato, resorcina, guajacol, gingerol, óleo de lavanda, iononas, irona, eucaliptol, mentol, óleos de hortelã, alfa- pineno; limoneno, anetol, linalol, metil di-hidrojasmonato, carvacrol, ácido propiônico/propionato, ácido acético/acetato, ácido butírico/butirato, óleo de alecrim, óleo de cravo, geraniol, terpineol, citronelol, salicilato de amila e/ou benzila, cinamaldeído, polifenol vegetal (tanina), extrato de açafrão e cúrcuma.

[0207] Na presente invenção, a quantidade de fitogênicos pode ser 0,001 % a 10 % em peso da composição. Exemplos de produtos comerciais são Crina® (DSM Nutritional Products); CinergyTM, BiacidTM, ProHacidTM Classic e ProHacidTM AdvanceTM (todos Promivi/Cargill) e Envivo EO (DuPont Animal Nutrition). Ácidos Orgânicos

[0208] Os ácidos orgânicos (C1–C7) são amplamente distribuídos na natureza como constituintes normais de tecidos vegetais ou animais. Os mesmos também são formados através de fermentação microbiana de carboidratos principalmente no intestino grosso. Os mesmos são frequentemente usados em produção suína ou de aves como uma substituição de promotores de crescimento antibiótico uma vez que os mesmos têm um efeito preventivo nos problemas intestinais como enterite necrótica em galinhas e infecções por Escherichia coli em porcos jovens. Os ácidos orgânicos podem ser vendidos como monocomponente ou misturas de tipicamente 2 ou 3 ácidos orgânicos diferentes. Exemplos de ácidos orgânicos são ácidos graxos de cadeia curta (por exemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico), ácidos graxos de cadeia média (por exemplo, ácido caproico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico), ácidos di/tricarboxílicos (por exemplo, ácido fumárico), hidróxi ácidos (por exemplo, ácido láctico), ácidos aromáticos (por exemplo, ácido benzoico), ácido cítrico, ácido sórbico, ácido málico e ácido tartárico ou seu sal (tipicamente sal de sódio ou potássio como diformato de potássio ou butirato de sódio).

[0209] Na presente invenção, a quantidade de ácido orgânico pode ser 0,001 % a 10 % em peso da composição. Exemplos de produtos comerciais são VevoVitall® (DSM Nutritional Products), Amasil®, Luprisil®, Lupro-Grain®, Lupro-Cid®, Lupro-Mix® (BASF), n-Butyric Acid AF (OXEA) e Adimix Precision (Nutriad). Aminoácidos

[0210] A composição ou a ração animal da invenção pode compreender adicionalmente um ou mais aminoácidos. Exemplos de aminoácidos que são usados são lisina, alanina, beta- alanina, treonina, metionina e triptofano. Na presente invenção, a quantidade de aminoácido pode ser 0,001 % a 10 % em peso da composição ou da ração animal. Vitaminas e Minerais

[0211] Na presente invenção, a composição ou a ração animal pode incluir uma ou mais vitaminas, como uma ou mais vitaminas solúveis em gordura e/ou uma ou mais vitaminas solúveis em água. Além disso, a composição ou a ração animal pode incluir opcionalmente um ou mais minerais, como um ou mais minerais traço e/ou um ou mais macrominerais.

[0212] Geralmente, vitaminas solúveis em água e em gordura, bem como minerais traço formam parte de uma denominada pré-mistura pretendida para a adição à ração, ao passo que macrominerais geralmente são adicionados separadamente à ração.

[0213] Exemplos não limitantes de vitaminas solúveis em gordura incluem vitamina A, vitamina D3, vitamina E, e vitamina K, por exemplo, vitamina K3.

[0214] Exemplos não limitantes de vitaminas solúveis em água incluem vitamina C, vitamina B12, biotina e colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo, Ca-D-pantotenato.

[0215] Exemplos não limitantes de minerais traço incluem boro, cobalto, cloreto, cromo, cobre, fluoreto, iodeto, ferro, manganês, molibdênio, iodo, selênio e zinco.

[0216] Exemplos não limitantes de macrominerais incluem cálcio, magnésio, fósforo, potássio e sódio.

[0217] Na presente invenção, a quantidade de vitaminas pode ser 0,001 % a 10 % em peso da composição ou da ração animal. De preferência, a quantidade de minerais é 0,001 % a 10 % em peso da composição ou da ração animal.

[0218] Os requisitos nutricionais desses componentes (exemplificados com aves e leitões/porcos) são listados na Tabela A do documento WO 01/58275. Requisitos nutricionais significa que esses componentes devem ser fornecidos na dieta nas concentrações indicadas.

[0219] Alternativamente, a composição ou a ração animal da invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados na Tabela A do documento WO 01/58275. Pelo menos um significa qualquer um dentre, um ou mais de, um, ou dois, ou três, ou quatro e assim por diante até todos os treze ou até todos os quinze componentes individuais. Mais especificamente, esse pelo menos um componente individual está incluído no aditivo da invenção em tal quantidade de modo a fornecer uma concentração em ração dentro da faixa indicada na coluna quatro, ou coluna cinco, ou coluna seis da Tabela A.

[0220] De preferência, a composição ou a ração animal da invenção compreende pelo menos uma das vitaminas abaixo, de preferência, para fornecer uma concentração em ração dentro das faixas especificadas na Tabela 1 abaixo (para dietas de leitão e dietas de frango de corte, respectivamente). Tabela 1: Recomendações de vitamina típicas Dieta de frango Vitamina Dieta de leitão de corte

10.000-15.000 8-12.500 IU/kg Vitamina A IU/kg de ração de ração 1800-2000 IU/kg 3000-5000 IU/kg Vitamina D3 de ração de ração 60-100 mg/kg de 150-240 mg/kg Vitamina E ração de ração 2-4 mg/kg de 2-4 mg/kg de Vitamina K3 ração ração 2-4 mg/kg de 2-3 mg/kg de Vitamina B1 ração ração 6-10 mg/kg de 7-9 mg/kg de Vitamina B2 ração ração 4-8 mg/kg de 3-6 mg/kg de Vitamina B6 ração ração 0,03-0,05 mg/kg 0,015-0,04 Vitamina B12 de ração mg/kg de ração Niacina (Vitamina 30-50 mg/kg de 50-80 mg/kg de B3) ração ração 20-40 mg/kg de 10-18 mg/kg de Ácido Pantotênico ração ração 1-2 mg/kg de 1-2 mg/kg de Ácido fólico ração ração 0,15-0,4 mg/kg de 0,15-0,3 mg/kg Biotina ração de ração 200-400 mg/kg de 300-600 mg/kg Cloreto de colina ração de ração

Outros ingredientes de ração

[0221] A composição ou a ração animal da invenção pode compreender adicionalmente agentes colorantes, estabilizadores, aditivos de melhora de crescimento e compostos de aroma/saborizantes, ácidos graxos poli- insaturados (PUFAs); espécies geradoras de oxigênio reativo, antioxidantes, peptídeos antimicrobianos, polipeptídeos antifúngicos e compostos de gerenciamento de micotoxina.

[0222] Exemplos de agentes de coloração são carotenoides como beta-caroteno, astaxantina e luteína.

[0223] Exemplos de compostos de aroma/saborizantes são creosol, anetol, deca-, undeca- e/ou dodeca-lactonas, iononas, irona, gingerol, piperidina, ftaleto de propilideno, ftaleto de butilideno fataleto, capsaicina e tanina.

[0224] Exemplos de peptídeos antimicrobianos (AMP’s) são CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina e Ovispirina como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), Plectasinas e Estatinas, incluindo os compostos e polipeptídeos revelados nos documentos WO 03/044049 e WO 03/048148, assim como variantes ou fragmentos dos expostos acima que retêm atividade antimicrobiana.

[0225] Exemplos de polipeptídeos antifúngicos (AFP’s) são os peptídeos Aspergillus giganteus, e Aspergillus niger, assim como variantes e fragmento dos mesmos que retêm atividade antifúngica, conforme revelado nos documentos WO 94/01459 e WO 02/090384.

[0226] Exemplos de ácidos graxos poli-insaturados são ácidos graxos poli-insaturados C18, C20 e C22, tais como ácido araquidônico, ácido docoso-hexaenoico, ácido eicosapentaenoico e ácido gama-linoleico.

[0227] Exemplos de espécies geradoras de oxigênio reativo são produtos químicos como perborato, persulfato ou percarbonato; e enzimas como uma oxidase, uma oxigenase ou uma sintetase.

[0228] Os antioxidantes podem ser usados para limitar o número de espécies de oxigênio reativo que podem ser geradas de modo que o nível de espécies de oxigênio reativo esteja em equilíbrio com os antioxidantes.

[0229] Micotoxinas, como desoxinivalenol, aflatoxina, zearalenona e fumonisina podem ser encontradas em ração animal e podem resultar em desempenho negativo ou doença animal. Os compostos que podem gerenciar os níveis de micotoxina, como por meio de desativação da micotoxina ou por meio de ligação da micotoxina, podem ser adicionados à ração para melhorar esses efeitos negativos. Exemplos de compostos de gerenciamento de micotoxina são Vitafix®, Vitafix Ultra (Nuscience), Mycofix®, Mycofix® Secure, FUMzyme®, Biomin® BBSH, Biomin® MTV (Biomin), Mold-Nil®, Toxy-Nil® e Unike® Plus (Nutriad). Métodos de Aprimoramento de Desempenho Animal

[0230] No terceiro aspecto, a invenção se refere adicionalmente a um método de aprimoramento de taxa de conversão de ração (FCR), digestibilidade e/ou imunidade, e/ou de redução de Clostridium Perfringens do intestino em um animal monogástrico que compreende administrar ao animal a composição ou a ração animal que compreende um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais carotenoides conforme definido acima.

[0231] Na presente invenção, o aprimoramento é comparado à mesma ração, mas exclui a muramidase.

[0232] Na presente invenção, a FCR pode ser aprimorada em pelo menos 1 %, como em pelo menos 1,25 %, pelo menos 1,5 % ou pelo menos 1,75 %.

[0233] Na presente invenção, a digestibilidade de pelo menos um dentre a energia, matéria seca, matéria orgânica, TFA, MUFA, PUFA e Zn pode ser aprimorada em pelo menos 1 %, como em pelo menos 1,25 %, pelo menos 1,5 % ou pelo menos 1,75 %.

[0234] Na presente invenção, um ou mais parâmetros de imunidade pode ser aprimorado em 1 %, como em pelo menos 1,5 %, pelo menos 2,0 %, pelo menos 2,5 %, pelo menos 3 %, pelo menos 3,5 %, pelo menos 4 % ou pelo menos 5 %.

[0235] Na presente invenção, a Clostridium Perfringens do intestino pode ser reduzida em pelo menos 1 %, como em pelo menos 1,5 %, pelo menos 2,0 %, pelo menos 2,5 %, pelo menos 3 %, pelo menos 3,5 %, pelo menos 4 % ou pelo menos 5 %.

[0236] Na presente invenção, o carotenoide pode ser dosado em um nível de 20 a 200 mg por kg de ração animal, como 30 a 150 mg, 50 a 120 mg, 60 a 100 mg por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.

[0237] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase pode ser dosado em um nível de 100 a 1000 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, como 200 a 900 mg, 300 a 800 mg, 400 a 700 mg ou 500 a 600 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.

[0238] Na presente invenção, o animal é um animal monogástrico, por exemplo, porcos ou suínos (incluindo, mas sem limitação, leitões, porcos em crescimento e porcas gestantes); aves (incluindo, mas sem limitação, ave, peru, pato, codorna, galinha-da-angola, ganso, pombo, pombo jovem, galinha, frango de corte, poedeira, franga e pinto); animais de estimação, como gatos e cachorros, peixe (incluindo, mas sem limitação, seriola, pirarucu, barbo, achigã, anchova, bocachico, brema, peixe-gato, cachama, carpa, bagre, catla, chanos, truta-de-lago, acará-grande, bijupirá, bacalhau, tipo de peixe branco, dourada, corvina, moreia, góbio, peixe- dourado, gourami, garoupa, guapote, linguado, java, labeo, lai, botia, cavala, peixe-leite, carapeba, salamandra, tainha, paco, peixe-mexerica, peixe-rei, perca, pike, pampo- galhudo, rutilis, salmão, sampa, sauger, robalo, dourada, shiner, góbio-dorminhoco, peixe cabeça-de-cobra, pargo, robalo comum, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, curimatã, peixe-médico, peixe terror, tilápia, truta, atum, rodovalho, cisco europeia, picão-verde e peixe-branco); e crustáceos (incluindo, mas sem limitação, camarões e pitus). Em uma modalidade mais preferencial, o animal é selecionado a partir do grupo que consiste em suíno, ave, crustáceos e peixe. Em uma modalidade ainda mais preferencial, o animal é selecionado a partir do grupo que consiste em suíno, leitão, porco em crescimento, porca gestante, galinha, frango de corte, poedeira, franga e pinto. Uso no Aprimoramento de Desempenho Animal

[0239] No quinto aspecto, a invenção se refere adicionalmente ao uso de uma composição ou uma ração animal no aprimoramento de taxa de conversão de ração (FCR), digestibilidade e/ou imunidade, e/ou na redução de Clostridium Perfringens do intestino em um animal monogástrico, em que a composição e a ração animal compreendem um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais carotenoides como definido acima.

[0240] Na presente invenção, o aprimoramento é comparado à mesma ração, mas exclui a muramidase.

[0241] Na presente invenção, a FCR pode ser aprimorada em pelo menos 1 %, como em pelo menos 1,25 %, pelo menos 1,5 % ou pelo menos 1,75 %.

[0242] Na presente invenção, a digestibilidade de pelo menos um dentre a energia, matéria seca, matéria orgânica, TFA, MUFA, PUFA e Zn pode ser aprimorada em pelo menos 1 %, como em pelo menos 1,25 %, pelo menos 1,5 % ou pelo menos 1,75 %.

[0243] Na presente invenção, um ou mais parâmetros de imunidade pode ser aprimorado em 1 %, como em pelo menos 1,5 %, pelo menos 2,0 %, pelo menos 2,5 %, pelo menos 3 %, pelo menos 3,5 %, pelo menos 4 % ou pelo menos 5 %.

[0244] Na presente invenção, a Clostridium Perfringens do intestino pode ser reduzida em pelo menos 1 %, como em pelo menos 1,5 %, pelo menos 2,0 %, pelo menos 2,5 %, pelo menos 3 %, pelo menos 3,5 %, pelo menos 4 % ou pelo menos 5 %.

[0245] Na presente invenção, o carotenoide pode ser dosado em um nível de 20 a 200 mg por kg de ração animal, como 30 a 150 mg, 50 a 120 mg, 60 a 100 mg por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.

[0246] Na presente invenção, o polipeptídeo que tem atividade de muramidase pode ser dosado em um nível de 100 a 1000 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, como 200 a 900 mg, 300 a 800 mg, 400 a 700 mg ou 500 a 600 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.

[0247] Na presente invenção, o animal é um animal monogástrico, por exemplo, porcos ou suínos (incluindo, mas sem limitação, leitões, porcos em crescimento e porcas gestantes); aves (incluindo, mas sem limitação, ave, peru, pato, codorna, galinha-da-angola, ganso, pombo, pombo jovem, galinha, frango de corte, poedeira, franga e pinto); peixe (incluindo, mas sem limitação, seriola, pirarucu, barbo, achigã, anchova, bocachico, brema, peixe-gato, cachama, carpa, bagre, catla, chanos, truta-de-lago, acará-grande, bijupirá, bacalhau, tipo de peixe branco, dourada, corvina, moreia, góbio, peixe-dourado, gourami, garoupa, guapote, linguado, java, labeo, lai, botia, cavala, peixe-leite, carapeba, salamandra, tainha, paco, peixe-mexerica, peixe- rei, perca, pike, pampo-galhudo, rutilis, salmão, sampa, sauger, robalo, dourada, shiner, góbio-dorminhoco, peixe cabeça-de-cobra, pargo, robalo comum, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, curimatã, peixe-médico, peixe terror, tilápia, truta, atum, rodovalho, cisco europeia, picão-verde e peixe-branco); e crustáceos (incluindo, mas sem limitação, camarões e pitus). Em uma modalidade mais preferencial, o animal é selecionado a partir do grupo que consiste em suíno, ave, crustáceos e peixe. Em uma modalidade ainda mais preferencial, o animal é selecionado a partir do grupo que consiste em suíno, leitão, porco em crescimento, porca gestante, galinha, frango de corte, poedeira, franga e pinto.

[0248] A presente invenção será adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos.

EXEMPLOS Exemplo 1: Determinação de Atividade de Muramidase

[0249] A atividade de muramidase foi determinada medindo- se a diminuição (queda) na absorvância/densidade óptica de uma solução de Micrococcus lisodeikticus suspenso ATTC nº 4698 (Sigma-Aldrich M3770) medida em um leitor de microplaca (Tecan Infinite M200) a 450 nm. Preparação de substrato de Micrococcus Iysodeikticus

[0250] Antes do uso as células foram suspensas em água desionizada para uma concentração de 10 mg de células/ml e a absorvância/densidade óptica (OD) a 450 nm foi medida. A suspensão celular foi, então, ajustada para que a concentração celular no ensaio de turbidez (180 µl de tampão + 20 µl de amostra + 20 µl de substrato) se igualasse a um OD450 = 1,0. A suspensão celular ajustada foi, então, armazenada à temperatura ambiente antes do uso. As células suspensas foram usadas em 3 horas. Preparação de tampão de ácido cítrico-fosfato pH 4

[0251] 61,45 ml de ácido cítrico a 0,1 M foi medido com 38,55 ml de hidrogenofosfato dissódico a 0,2 M, e o pH foi ajustado com ácido clorídrico ou hidróxido de sódio para pH

4. Medição de atividade antimicrobiana de muramidase no ensaio de turbidez

[0252] A amostra de muramidase a ser medida foi diluída para uma concentração de 50 mg de proteína enzimática/l em água desionizada, e mantida em gelo até o uso. Em uma placa de microtitulação de 96 poços (Nunc) 180 µl de tampão de ácido cítrico-fosfato pH 4 e 20 µl da amostra de muramidase diluída foram adicionados e mantidos frios (5 °C). Para começar a medição de atividade 20 µl do substrato (Micrococcus Iysodeikticus) foram adicionados a cada poço,

e a medição cinética de absorvância a 450 nm foi iniciada por 1 hora a 37 °C em um leitor de microplaca. A absorvância medida a 450 nm foi monitorada para cada poço e ao longo do tempo, uma queda na absorvância foi vista se a muramidase tiver atividade de muramidase.

[0253] Seguindo a incubação, a atividade de muramidase contra Micrococcus Iysodeikticus foi determinada como Δ de absorvância a 450 nm (valor de partida - valor final) de cada poço após 1 hora. A significância foi calculada com o uso de Dunnett’s com nível de teste de controle de 0,05 em JMP® versão 12.1.0 de pacote de software estatístico do SAS Institute Inc. Exemplo 2: Teste de frango de corte in vivo Localização e alojamento

[0254] O experimento foi realizado no Servei de Granges i Camps Experimentals da Universitat Autònoma de Barcelona (UAB).

[0255] Os animais foram alojados em uma única sala com 16 gaiolas de chão (8 gaiolas (1,5 m x 1 m) em cada lado da sala). As condições ambientais (temperatura, umidade relativa e taxas de ventilação) foram controladas de acordo com as diretrizes de gerenciamento de frangos de corte de Ross. Os animais foram receberam bebedores do tipo chupeta (3 bebedores/gaiola) e alimentadores por calha manuais (1 calha/gaiola). Animais Experimentais

[0256] 408 frangos de corte machos de um dia de idade (Ross 308) foram usados (30/gaiola). Os mesmos foram obtidos a partir de um incubatório local, pesados, individualmente marcados nas asas e alocados para tratamentos dietéticos em um projeto completamente randomizado. Os animais foram vacinados em ovo contra Gumboro e Marek e também contra cocidiose (Hypracox, aspersão grossa em 1 dia) e bronquite (aspersão fina) após o nascimento. Grupos Experimentais

[0257] Cada gaiola foi alocada para um de dois tratamentos experimentais: Uma dieta de controle que inclui carotenoides (T1) ou a mesma dieta que inclui muramidase e carotenoides (T2). Programa de Alimentação

[0258] As dietas experimentais basais foram formuladas para satisfazer ou exceder os requisitos de nutrientes recomendados para frangos de corte Ross. Os ingredientes, pré-mistura de mineral-vitamina, as análises calculadas e reais das dietas são apresentadas na Tabela 2. As dietas basais não continham quaisquer enzimas ou aditivos de ração (além de Muramidase), cocidiostatos, antibióticos veterinários ou quaisquer outros promotores de crescimento. Todas as dietas incluíram Carophyll Yellow (10 %) a 60 mg/kg como catenoides. Tabela 2: Composição e teores de nutrientes das dietas experimentais basais Ingredientes (%) Partida Crescimento Farinha de soja 48 34,97 27,23 % Maís/Milho 23,71 31,30 Trigo 20,00 20,00 Centeio 12,00 12,00 Óleo de soja 4,86 Fosfato dicálcico 1,79 1,47 Carbonato de 0,92 0,80 cálcio Cloreto de sódio 0,40 0,36

Ingredientes (%) Partida Crescimento Pré-mistura de 0,30 0,30 mineral-vitamina DL-metionina 0,27 0,23 L-lisina 0,17 0,19 Cloreto de Colina 0,04 L-treonina 0,04 0,05 Etoxiquina 66 % 0,02 0,02 Gordura 5 FYSFEED 5,54 Carophyll Yellow 0,006 0,006 TiO2 0,5 0,5 Teor calculado Proteína bruta 221,8 190,3 (g/kg) Energia metabolizável (MJ/kg)2 1 Pré-mistura de vitamina-mineral fornecida por quilograma de dieta: Vitamina A: 10 000 I.U.; vitamina E: 40 I.U.; vitamina K3: 3,0 mg; vitamina C: 100 mg; vitamina B1: 2,50 mg; vitamina B2: 8,00 mg; vitamina B6: 5,00 mg; vitamina B12: 0,03 mg; niacina: 50,0 mg; pantotenato cálcico: 12,0 mg; ácido fólico: 1,50 mg; biotina 0,15 mg; colina: 450 mg; etoxiquina: 54 mg; Na: 1,17 g; Mg: 0,8 g; Mn: 80 mg; Fe: 60 mg; Cu: 30 mg; Zn: 54 mg; I: 1,24 mg; Co: 0,6 mg; Se: 0,3 mg

[0259] Os animais foram aleatoriamente alocados em dois tratamentos experimentais que consistem em uma dieta equilibrada suplementada ou não com muramidase a 35.000 LSU(F)/kg de ração. Durante o período experimental os animais receberam duas dietas (de partida de 0-21 dias e de crescimento de 21-35 dias) a dieta de partida foi na forma esmigalhada e a de crescimento está na forma de pélete. Todas as dietas incluíram dióxido de titânio (0,5 %) como marcador de digestibilidade.

Projeto experimental

[0260] As aves foram individualmente marcadas nas asas no dia de chegada. O peso individual dos animais e resíduos de ração (por galinheiro) foram registrados no dia 0, 9 (primeiro sacrifício), 21 (mudança de dieta) e 36 (dia final- segundo sacrifício) a fim de monitorar BW individual assim como o consumo do grupo ao longo do estudo. A partir desses valores, um consumo de ração diário médio (ADFI), ganho de peso diário médio (ADG), e taxa de conversão de ração (FCR) foram calculados.

[0261] No dia 9, 21 aves por gaiola (aleatoriamente selecionadas) foram sacrificadas e os 9 restantes foram sacrificados no fim do experimento (quinta semana) (pela decapitação ambos os dias). Em cada dia de abate, uma ave por gaiola foi amostrada para expressão genética (imunidade) e histomorfologia, uma outra ave por gaiola foi amostrada para microbiologia tradicional. Outros três animais por gaiola foram amostrados individualmente por análise microbiológica molecular, SCFA e também raspas para imunoglobulina secretora (Ig) A. Essas três aves e o resto dos animais (um total de 19 animais no primeiro abate e 7 no último) foram amostradas para análise de digestibilidade ileal, agrupando todas as amostras de digesta ileal por galinheiro.

[0262] Nos dias 9 e 36, foram tiradas amostras de sangue. No dia 9, uma amostra de sangue agrupada (de 2-3 animais) até alcançar 5 ml de volume total foi tirada (em tubos heparinizados) de cada galinheiro entre esses animais destinados para digestibilidade. No dia 36, um animal individual de cada galinheiro (animais de digestibilidade)

teve o sangue colocado em tubos heparinizados e um outro (daqueles animais amostrados para SCFA) foi amostrado para soro.

[0263] Adicionalmente, no dia 36, três animais por grupo (aqueles destinados ou raspas de mucosa) também tiraram sangue para análise de Ig em soro. Análise Digestibilidade.

[0264] Efeitos na digestibilidade: Nos dias 9 e 36, a digesta ileal foi agrupada a partir de 19 e 7 animais, respectivamente, para determinar a digestibilidade ileal com o uso do marcador de índice para uma recuperação de 100 %. Digesta foi coletada e homogeneizada, mantida congelada a - 20 °C até a análise. Então, as amostras de digesta foram secas por congelamento, moídas e mantidas a 5 °C até análise.

[0265] As determinações analíticas de ração e digesta foram realizadas de acordo com os métodos da AOAC International (2005): dry matter (Method 934.01), ash (Method 942.05), e gross energy content (IKA-Kalorimeter system C4000; Staufen, Alemanha). O teor de ácido graxo foi determinado por meio de cromatografia a gás seguindo a metodologia descrita por Sukhija e Palmquist (1988). O teor de ácidos graxos totais (TFA) foi calculado como a soma de ácidos graxos individuais. O nitrogênio foi analisado por DUMAS. A análise de Ti do Dióxido de titânio (TiO2) e Zn foi realizada por meio de Espectroscopia de absorção atômica (AAS). Então, a digestibilidade ileal aparente de matéria seca (DM), matéria orgânica (OM), nitrogênio (N), ácidos graxos totais (TF) e zinco (Zn) foi determinada e a energia digerível ileal aparente das dietas foi calculada.

Microbiologia tradicional

[0266] A enumeração de enterobactérias, lactobacilos e clostrídios, foi realizada em meio de crescimento seletivo. As seções analisadas incluíram conteúdo da cultura, ileal e cecal de um animal por gaiola (selecionado aleatoriamente). As enterobactérias foram contadas após 24-48h de incubação em ágar de MacKONKEY, as bactérias de ácido láctico foram determinadas em ágar de MRS e Clostridium em ágar seletivo para esse gênero. Microbiologia molecular

[0267] A digesta cecal (de um ceco) foi amostrada de 3 aves/gaiola (aleatoriamente selecionadas) em cada dia de amostragem (dia 9 e dia 36) e congelada (separadamente) até sua análise. O DNA foi extraído com o uso do QIAamps DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Canadá) de acordo com as instruções do fabricante. A estrutura global, dinâmica e funcionalidade das populações microbianas cecais foram analisadas por meio de sequenciamento de alto rendimento da região hipervariável V3 de 16S rRNA (MiSeq da Illumina). Histomorfologia

[0268] As amostras de tecido do jejuno foram tiradas e analisadas para estudos histomorfológicos. Os parâmetros analisados incluíram: linfócitos intraepiteliais (IEL) (células por vilos e células/100 µm), e Células Caliciformes (células por vilos e células/100 µm). Resposta imune inata - Expressão genética

[0269] Pequenas amostras de tecido (cubos de 0,5 cm) de jejuno (aves de peso médio de cada gaiola) foram armazenadas com solução RNAlater® e mantidas a -80 °C para extração de RNA e estudos de expressão genética.

[0270] O RNA de jejuno foi purificado e traduzido para cDNA para estudos de expressão genética com o uso do RNeasy Mini Kit (Qiagen, Alemanha) e o QuantiTect Reverse TranscriptionKit (Qiagen, Alemanha). As reações de qPCR foram realizadas com o uso de ensaios de expressão Taqman Gene comercialmente disponível (Applied Biosystems, EUA). Os iniciadores e sondas incluídos nesse estudo foram fator TNF- alfa induzido por LPS (LITAF), interleucina-10 (IL10) e receptor similar a toll 5 (TLR5). LITAF é considerada citocinas pró-inflamatórias; IL-10 é considerada como uma citocina anti-inflamatória; e TLR-5 reconhece a flagelina bacteriana. Os limites de ciclo médio (Ct) dos genes relacionados à imunidade inata foram normalizados para o gene housekeeping (ACTβ) e comparados aos animais controle por meio do método 2-ΔΔCT. Os resultados também foram representados como pontos de dados individuais seguindo Schmittgen e Livak (2008). Títulos de Gumboro de resposta imune adaptativa

[0271] O efeito de tratamentos dietéticos em resposta imune humoral foi examinado medindo-se os títulos de anticorpo contra Gumboro (vírus da doença Bursite infecciosa, IBDV) no dia 36 e também a produção de s-IgA mucosal nos dias 9 e 36.

[0272] Os títulos de anticorpo contra IBDV foram determinados em amostras de soro com o uso de um kit ELISA comercial (IDEXX Europe B.V, 2132 PV Hoofddorp, Países Baixos). Seguindo as instruções do fabricante, os animais foram considerados positivos para a vacinação quando os valores de títulos estavam acima de 396. Os animais foram vacinados in ovo contra o Gumboro.

Análise Estatística

[0273] Os resultados foram expressos como meios com seus erros padrão a menos que seja definido de outro modo. Os dados foram analisados com ANOVA com o uso do procedimento de GLM que leva em consideração as dietas experimentais como efeito principal. Quando as frequências foram analisadas, o teste exato de Fisher foi usado. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o uso do Software de Análise Estatística SAS versão 9.2 (SAS Institute Inc.). O nível α usado para a determinação de significância para toda a análise foi P=0,05. A tendência estatística também foi considerada para valores P >0,05 e <0,10. Resultados e Discussão Desempenho do Animal

[0274] A Tabela 3 mostra resultados para a avaliação de peso corporal (BW), ganho diário médio (ADG), consumo de ração diário médio (ADFI) e taxa de conversão de ração (FCR) ao longo do estudo.

[0275] Não havia diferenças significativas entre tratamentos no BW ou no ADG embora o BW final tenha mostrado valores numéricos mais altos (P=0,17) com a adição de muramidase e carotenoides. No entanto, os animais que recebem muramidase e carotenoides na dieta mostraram uma taxa de conversão de ração significativa baixa (P=0,05) quando todo o período experimental foi considerado. Tabela 3. Resultado do desempenho Parâmetros Tratamento SEM Valor P T1 T2 Dia 0 BW (g) 41,5 41,5 0,04 0,438 Dia 9 BW (g) 258,5 258,5 2,66 1 Dia 21 BW (g) 1004,8 1029,7 11,06 0,134

Parâmetros Tratamento SEM Valor P T1 T2 Dia 36 BW (g) 2787,4 2844,2 27,92 0,172 ADG 0-9 d 24,1 24,1 0,29 0,969 ADG 9-21 d 62,1 63,6 0,93 0,259 ADG 21-36 d 118,8 119,4 1,60 0,820 ADG 0-21 d 45,7 47,1 0,61 0,137 ADG 0-36 d 76,2 77,1 0,75 0,415 ADFI 0-9 d 28,8 28,4 0,72 0,720 ADFI 9-21 d 90,2 87,4 1,83 0,299 ADFI 21-36 d 172 165,3 3,22 0,162 ADFI 0-21 d 63,9 62,1 1,09 0,277 ADFI 0-36 d 108,9 105,1 1,34 0,063 FCR 0-9 d 1,19 1,18 0,03 0,775 FCR 9-21 d 1,46 1,38 0,05 0,213 FCR 21-36 d 1,45 1,39 0,03 0,207 FCR 0-21 d 1,4 1,32 0,04 0,128 FCR 0-36 d 1,43 1,36 0,02 0,045 Digestibilidade ileal de nutrientes

[0276] A digestibilidade ileal aparente (%) de energia (E), matéria seca (DM), matéria orgânica (OM), N, ácidos graxos totais (TFA), ácidos graxos saturados (SFA); ácidos graxos monoinsaturados, (MUFA), ácidos graxos poli- insaturados (PUFA) e Zn, e a energia digestível ileal aparente (AIDE) foram estimados com o uso de TiO2 como marcador de digestibilidade (Tabela 4).

[0277] A inclusão de muramidase nas dietas aumentou significativamente a digestibilidade de E no dia 36 (P < 0,001) e mostrou uma tendência no dia 9 (P = 0,12). Esse aprimoramento foi traduzido em um aumento no valor de energia digerível ileal aparente da ração de 2941 para 3093 Kcal/kg no dia 36 (P < 0,001). Tabela 4. Digestibilidade ileal aparente de nutrientes (%) e teor de energia digerível ileal aparente (AIDE) da ração (Kcal/kg FM).

Parâmetros Tratamento SEM Valor P T1 T2 E % d09 71,2 72,4 0,52 0,1233 E % d36 71,8 75,6 0,5 0,0001 AIDE 2960 2971 21,4 0,7327 Kcal/Kg d09 AIDE 2941 3093 21,0 0,0002 Kcal/Kg d36 DM % d09 68,4 69,6 0,45 0,0846 DM % d36 68,1 72,3 0,49 0,0001 OM % d09 69,7 70,9 0,44 0,0766 OM % d36 69,8 74,0 0,47 0,0001 N % d09 82,2 82,9 0,40 0,2641 N % d36 75,2 77,5 0,91 0,0945 TFA % d09 86,5 89,1 0,85 0,0488 TFA % d36 88,9 90,3 0,98 0,3240 SFA % d09 61,5 67,6 2,29 0,0796 SFA % d36 83,9 85,1 1,37 0,5297 MUFA % d09 82,4 86,3 1,29 0,0479 MUFA % d36 91,3 92,5 0,96 0,4069 PUFA % d09 95,6 96,7 0,26 0,0120 PUFA % d36 0,2083 0,85 92,2 90,6 Zn % d09 22,3 15,0 1,32 0,0017 Zn % d36 0,0001 2,16 18,8 -7,3

[0278] A quantidade aumentada de energia digerida seria um resultado do aumento observado na digestibilidade de DM e de OM no dia 36 (mais que 4 unidades percentuais (P < 0,001)).

[0279] A digestibilidade de N mostrou um aumento de mais de 2 unidades percentuais no dia 36.

[0280] Em relação à digestibilidade de TFA, a mesma também foi aprimorada pela muramidase e carotenoide, mas nesse momento os efeitos foram apenas significativos no dia 9 (P = 0,05). Esse aumento na digestibilidade foi visto em todas as frações estuadas; SFA (uma tendência), MUPA e PUFA. Esses resultados sugerem que frangos que recebem muramidase e carotenoides poderiam ter desenvolvido uma capacidade anterior do intestino de digerir gordura.

[0281] Os efeitos de muramidase e carotenoides na digestibilidade aparente de Zn foram diferentes ao longo dos dias de amostragem. Enquanto no dia 9 a combinação promoveu uma diminuição na digestibilidade ileal aparente de 22 a 15 % (P = 0,002) no dia 36, a digestibilidade ileal aparente se tornou negativa na dieta de controle, mas manteve os valores semelhantes para o dia 9 naqueles animais que receberam muramidase e carotenoides. Esses resultados sugerem que no dia 36 os animais que receberam muramidase e carotenoides tiveram uma excreção ileal endógena de Zn mais baixa e/ou uma diminuição na biodisponibilidade de Zn dietária. Arquitetura intestinal

[0282] A histomorfometria de amostras jejunais é mostrada na Tabela 5. Tabela 5: Histomorfometria de jejuno Parâmetros Dia Tratamento SEM Valor

P T1 T2 IEL (Células) 9 15,4 18,0 2,59 0,495 36 46,0 59,6 2,49 0,002 GC (Células) 9 22,1 23,6 1,61 0,500 36 57,6 72,7 2,96 0,003 IEL (Células/100 9 1,8 2,0 0,24 0,439 µm) 36 2,3 3,0 0,12 0,001 GC (Células/100 9 2,5 2,7 0,15 0,458 µm) 36 2,8 3,7 0,13 0,001

[0283] Aumentos significativos foram detectados com Muramidase e carotenoides no dia 36 nos linfócitos intraepiteliais (IEL) e células caliciformes (GC)

independentemente do fato de serem expressos em termos absolutos ou relativos.

[0284] Os aumentos observados no IEL estavam dentro dos níveis fisiológicos e podem refletir um aumento na resposta imune dos animais sem significar inflamação. IEL são considerados parte do tecido linfoide associado ao intestino e fornecem uma primeira linha de defesa contra a invasão microbiana intestinal. Esses linfócitos da linha de frente que residem dentro da camada epitelial são incrivelmente heterogêneos em relação à sua função e fenótipo. Os subconjuntos de IEL podem fornecer vigilância imunológica na barreira epitelial para prevenir ou prejudicar a infecção no intestino por meio de mecanismos inatos ou como efetores específicos de antígeno ou células T CD8αβ+ de memória.

[0285] De modo similar, as células caliciformes contribuem para a proteção do epitélio intestinal pela produção e manutenção da manta protetora de muco por meio da síntese e da secreção de glicoproteínas de alto peso molecular conhecidas como mucinas. Alterações em funções da célula caliciforme e na composição química de muco intestinal foram descritas em resposta a uma ampla gama de insultos luminais, incluindo alterações da microbiota normal. Os dados disponíveis indicam que os micróbios intestinais podem afetar a dinâmica da célula caliciforme e a camada de muco diretamente por meio da liberação local de fatores bioativos ou indiretamente por meio de ativação de células imune hospedeiras (Deplancke e Gaskins, 2001). As alterações promovidas por Muramidase e carotenoides no ecossistema intestinal ou na liberação de fatores bioativos poderiam, portanto, estar por trás dos efeitos observados.

Análises de grupos microbianos

[0286] A Tabela 6 mostra as contagens de placa (log cfu/g de FM) para o grupo Clostridium analisado. Para Clostridium, constatou-se uma tendência por uma diminuição no ceco no dia 9 nos animais alimentados com muramidase e carotenoides. Tabela 6. Contagens em placas (log cfu/g de FM) para diferentes grupos microbianos na colheita, íleo e digestão de ceco. Órgão Dia Tratamento SEM Valor P T1 T2 Íleo 9 4,1 2,4 0,76 0,126 36 3,4 3,3 0,85 0,919 Ceco 9 4,1 2,3 0,68 0,073 36 3,5 4,4 1,20 0,615

[0287] As contagens em placa de Clostridium estavam em alguns animais abaixo do nível mínimo de detecção do método. Devido ao fato de que foi visto um número superior de animais abaixo do nível de detecção com o tratamento com muramidase e carotenoides, os valores também foram submetidos a uma análise de frequência que é mostrada na Tabela 7. Desse modo, deve-se observar também que muramidase e carotenoides diminuíram o número de animais com Clostridim detectável no ceco no dia 9. Tabela 7. Número de animais com mais de 10 CFU/g (nível mínimo de detecção para o método). Clostridium (+) Dia Tratamento Valor P T1 T2 íleo 9 7 3 0,056 36 6 6 0,0431 Ceco 9 7 5 0,246 36 5 4 0,343 Expressão genética de citocina e TLR em jejuno

[0288] A Tabela 8 mostra a alteração da expressão de diferentes genes estudados (LITAF, IL-10 e TLR5) em grupo de muramidase e carotenoides comparado ao grupo de controle. Uma maior expressão de LITAF, IL-10 e TLR5 foi observada. Tabela 8. Mudança de dobra de citocinas estudadas no jejuno no dia 9 Mudança de dobra entre o grupo de muramidase e de controle (1) LITAF 1,37 IL-10 1,20 TLR5 1,09 1) Valores maiores que 1 indicam aumento da expressão no grupo BOND, ao contrário, valores menores que 1 indicam diminuição da expressão.

Anticorpos de Gumboro

[0289] A Tabela 9 mostra como muramidase e carotenoide reduziram a resposta humoral contra vacinação contra Gumboro no dia 36. Tabela 9: Número de animais positivos para a vacinação contra Gumboro e valores de título médio ± S.D. no dia 36. Anticorpos de Gumboro Tratamento valor p T1 T2 Número de aves 14 6 0,016 positivas Títulos de anticorpos 1124±1417 331±507 0,013 (média±SD) N = 24

[0290] Os animais nesse ensaio foram vacinados in ovo com uma vacina imunocomplexa Gumboro. A ação dessa vacina se correlaciona com o nível de anticorpos derivados maternalmente de IBDV (MDA) na galinha jovem, isto é,

galinhas com maior nível de IBDV MDA na incubação têm uma resposta imune tardia à vacina do que as galinhas com IBDV MDA baixo. A resposta inferior contra a vacina em muramidase poderia ser explicada por um nível de IBDV MDA maior na incubação nesse grupo específico. Conclusão

[0291] Os resultados obtidos no estudo mostraram que a inclusão de muramidase e carotenoides foi eficaz no aprimoramento de FCR, aprimoramento de digestibilidade de energia, AIDE, DM, OM, N, TFA, MUFA, PUFA e Zn, aumento de IEL e GC, redução de Clostridium, aumento da expressão de Citocinas LITAF, IL-10 e TLR5, e redução de resposta humoral contra vacinação contra Gumboro em frangos de corte. Consequentemente, a muramidase e carotenoide têm efeito no aprimoramento de FCR, digestibilidade e imunidade, e redução de Clostridium Perfringens nos intestinos em frangos de corte.

[0292] A invenção descrita e reivindicada no presente documento não deve ter o escopo limitado pelos aspectos específicos revelados no presente documento, visto que esses aspectos se destinam a ser ilustrações de vários aspectos da presente invenção. Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da presente invenção além daquelas mostradas e descritas no presente documento ficarão claras para os indivíduos versados na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações também se destinam a estar dentro do escopo das reivindicações anexas. No caso de conflito, a presente revelação que inclui definições prevalecerá.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição caracterizada por compreender um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais carotenoides.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que tem atividade de muramidase é uma muramidase GH24 ou muramidase fúngica GH25.

3. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de que o carotenoide é selecionado a partir do grupo que consiste em luteína, cantaxantina, zeaxantina, astaxantina e derivados das mesmas.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que tem atividade de muramidase é selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1; (b) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3;

(d) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4; (e) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5; (f) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 6; (g) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 7; (h) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8; (i) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 9; (j) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 10; (k) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 11; (l) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 12; (m) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 13; (n) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 14; (o) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 15; (p) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 16; (q) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 17; (r) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 18;

(s) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 19; (t) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 20; (u) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 21; (v) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 22; (w) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 23; (x) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 24; (y) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 25; (z) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 26; (aa) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 27; (ab) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 28; (ac) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 29; (ad) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 30; (ae) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 31; (af) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 32; (ag) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 33;

(ah) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 34; (ai) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 35; (aj) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 36; (ak) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 37; (al) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 38; (am) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 39; (an) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 40; (ao) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 41; (ap) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 42; (aq) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 43; (ar) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 44; (as) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 45; (at) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 46; (au) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 47; (av) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 48;

(aw) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 49; (ax) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 50; (ay) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 51; (az) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 52; (ba) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 53; (bb) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 54; (bc) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 55; (bd) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 56; (be) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 57; (bf) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 58; (bg) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 59; (bh) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 60; (bi) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 61; (bj) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 62; (bk) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 63;

(bl) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 64; (bm) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 65; (bn) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 66; (bo) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 67; (bp) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 68; (bq) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 69; (br) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 70; (bs) um polipeptídeo que tem pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 71; (bt) uma variante de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 ou SEQ ID NO: 71 que compreende uma ou mais substituições de aminoácido (de preferência, substituições conservativas), e/ou uma ou mais deleções de aminoácido, e/ou uma ou mais inserções de aminoácido ou qualquer combinação dos mesmos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10;

(bu) um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (at), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc), (bd), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (bm), (bn), (bo), (bp), (bq), (br), (bs) ou (bt) e uma extensão N-terminal e/ou C-terminal entre 1 e 10 aminoácidos; e (bv) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x), (y), (z), (aa), (ab), (ac), (ad), (ae), (af), (ag), (ah), (ai), (aj), (ak), (al), (am), (an), (ao), (ap), (aq), (ar), (as), (at), (au), (av), (aw), (ax), (ay), (az), (ba), (bb), (bc), (bd), (be), (bf), (bg), (bh), (bi), (bj), (bk), (bl), (bm), (bn), (bo), (bp), (bq), (br), (bs) ou (bt) que tem atividade de muramidase e que tem pelo menos 90 % do comprimento do polipeptídeo maduro.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o carotenoide é selecionado a partir do grupo que consiste em α- ou β--caroteno, 8'-apo-β-carotenal, ésteres de ácido 8'- apo-β-carotenoico como o éster etílico, cantaxantina, astaxantina, ésters de astaxantina, licopeno, luteína, zeaxantina ou crocetina e derivados dos mesmos.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizada por compreender a muramidase da SEQ ID NO: 1, e luteína, cantaxantina, zeaxantina e/ou astaxantina.

7. Ração animal que compreende um aditivo de ração animal, uma ou mais fontes de proteína e uma ou mais fontes de energia, sendo a ração animal caracterizada por compreender adicionalmente um ou mais polipeptídeos que têm atividade de muramidase e um ou mais carotenoides.

8. Ração animal, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a fonte de proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em soja, soja selvagem, feijão, tremoço, feijão Tepary, feijão-da-Espanha, feijão slimjim, feijão-de-lima, vagem francesa, fava comum (feijão-fava), grão de bico, lentilha, amendoim, amendoim Spanish, canola, semente de girassol, semente de algodão, colza (semente oleaginosa de colza) ou ervilha ou em uma forma processada como farinha de soja, farinha de soja integral, concentrado de proteína de soja (SPC), farinha de soja fermentada (FSBM), farinha de girassol, farinha de semente de algodão, farinha de colza, farinha de peixe, farinha de osso, farinha de pena, soro ou qualquer combinação dos mesmos.

9. Ração animal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizada pelo fato de que a fonte de energia é selecionada a partir do grupo que consiste em maís, milho, sorgo, trigo, cevada, aveia, arroz, triticale, centeio, beterraba, beterraba sacarina, espinafre, batata, mandioca, quinoa, repolho, switchgrass, painço, milheto, milho-da-Itália ou em uma forma processada como milho moído,

maís moído, amido de batata, amido de mandioca, sorgo moído, switchgrass moído, painço moído, milho-da-Itália moído, milheto moído, ou qualquer combinação dos mesmos.

10. Ração animal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que o carotenoide é selecionado a partir do grupo que consiste em α- ou β--caroteno, 8'-apo-β-carotenal, ésteres de ácido 8'- apo-β-carotenoico como o éster etílico, cantaxantina, astaxantina, ésters de astaxantina, licopeno, luteína, zeaxantina ou crocetina e derivados dos mesmos.

11. Ração animal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizada por compreender a muramidase da SEQ ID NO: 1, e luteína, cantaxantina, zeaxantina e/ou astaxantina.

12. Método de aprimoramento de taxa de conversão de ração (FCR), digestibilidade e/ou imunidade, e/ou redução de Clostridium Perfringens do intestino em um animal monogástrico caracterizado por compreender administrar ao animal uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-6 ou a ração animal conforme definida em qualquer uma das reivindicações 7-11.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a composição ou ração animal é dosada de modo que o carotenoide esteja em um nível de 20 a 200 mg por kg de ração animal, como 30 a 150 mg, 50 a 120 mg, 60 a 100 mg por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a composição ou ração animal é dosada de modo que o polipeptídeo que tem atividade de muramidase esteja em um nível de 100 a 1000 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, como 200 a 900 mg, 300 a 800 mg, 400 a 700 mg ou 500 a 600 mg de proteína enzimática por kg de ração animal, ou qualquer combinação desses intervalos.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12-14, caracterizado pelo fato de que o animal é um animal monogástrico, por exemplo, porcos ou suínos (incluindo, mas sem limitação, leitões, porcos em crescimento e porcas gestantes); aves (incluindo, mas sem limitação, ave, peru, pato, codorna, galinha-da-angola, ganso, pombo, pombo jovem, galinha, frango de corte, poedeira, franga e pinto); animais de estimação, como gatos e cachorros, peixe (incluindo, mas sem limitação, seriola, pirarucu, barbo, achigã, anchova, bocachico, brema, peixe- gato, cachama, carpa, bagre, catla, chanos, truta-de-lago, acará-grande, bijupirá, bacalhau, tipo de peixe branco, dourada, corvina, moreia, góbio, peixe-dourado, gourami, garoupa, guapote, linguado, java, labeo, lai, botia, cavala, peixe-leite, carapeba, salamandra, tainha, paco, peixe- mexerica, peixe-rei, perca, pike, pampo-galhudo, rutilis, salmão, sampa, sauger, robalo, dourada, shiner, góbio- dorminhoco, peixe cabeça-de-cobra, pargo, robalo comum, linguado, spinefoot, esturjão, peixe-lua, curimatã, peixe- médico, peixe terror, tilápia, truta, atum, rodovalho, cisco europeia, picão-verde e peixe-branco); e crustáceos (incluindo, mas sem limitação, camarões e pitus).

16. Uso caracterizado por ser da composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-6, ou a ração animal conforme definida em qualquer uma das reivindicações

7-11, no aprimoramento da taxa de conversão de ração (FCR), digestibilidade e/ou imunidade, e/ou redução de Clostridium Perfringens do intestino em um animal monogástrico.