JP4891220B2 - 菌類細胞壁分解酵素 - Google Patents
菌類細胞壁分解酵素 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4891220B2 JP4891220B2 JP2007500047A JP2007500047A JP4891220B2 JP 4891220 B2 JP4891220 B2 JP 4891220B2 JP 2007500047 A JP2007500047 A JP 2007500047A JP 2007500047 A JP2007500047 A JP 2007500047A JP 4891220 B2 JP4891220 B2 JP 4891220B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- seq
- nucleotide sequence
- polynucleotide
- lysozyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
- A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/189—Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
- C11D3/38636—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing enzymes other than protease, amylase, lipase, cellulase, oxidase or reductase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
本発明は、リゾチーム活性を有する菌類酵素、リゾチームをコードするヌクレオチド配列、前記ヌクレオチド配列を含んで成る核酸構造体、リゾチームの生成方法、及びリゾチームの使用に関する。
リゾチームは、多くの生成物により細菌に対する防御機構として生成されるO−グルコシルヒドロラーゼである。前記酵素は、ペプチドグリカン、すなわち細菌における重要な構造分子のグリコシル結合を分解することにより細菌細胞壁の加水分解を引き起こす。それらの細菌壁をリゾチーム作用により弱くした後、細菌細胞は、浸透圧に起因して溶解する。
卵白リゾチームタンパク質の溶解作用は、現在、2つの市場において開発されている。
市販の主要製品である卵白リゾチームは、例えばストレプトコーカス・アウレウス(Streptoroccus aureus)細胞壁におけるN, 6-O−ジアセチルムラミナーゼを分解せず、そして従って、他の中でも、この重要なヒト病原体を溶解できない。
従って、リゾチーム活性を有する新規ポリペプチドが所望される。
本発明者は、リゾチーム活性を有する酵素をコードする菌類遺伝子/cDNAを単離した。前記酵素コードするそのような遺伝子/cDNAは、これまで記載されていない知識である。
従って第1の観点においては、本発明はリゾチーム活性を有し、そしてGH25 ファミリーに属する菌類ポリペプチドに関する。
本発明の詳細な態様の論議の前、本発明の主要観点に関連する特定の用語の定義が提供される。
実質的に純粋なポリペプチド:本明細書においては、用語“実質的に純粋なポリペプチド”とは、多くても10重量%の天然に関連する他のポリペプチド材料を含むポリペプチド調製物(低い%、例えば多くても8重量%、多くても6重量%、多くても5重量%、多くても4重量%、多くても3重量%、多くても2重量%、多くても1重量%及び多くても0.5重量%の他のポリペプチド材料が好ましい)を意味する。従って、実質的に純粋なポリペプチドは少なくとも92%純粋であり、すなわちポリペプチドは、調製物に存在する合計のポリペプチド材料の少なくとも92重要%を構成し、そしてより高い%、例えば少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%及び多くても99.5%の純度が好ましい。
作用可能に連結された:用語“作用可能に連結される”とは、本明細書においては、制御配列が、本発明のポリペプチドの発現を方向づけるよう、ヌクレオチド配列のコード配列に対する位置に適切に配置される形状として定義される。
用語“ポリヌクレオチドプローブ”、“ハイブリダイゼーション”、及び種々の緊縮条件とは、“リゾチーム活性を有するポリペプチド”の標題セクションにおける定義される。
リゾチーム活性を有するポリペプチド:
本発明のポリペプチドは、菌類、より正確にはピクノポラス・シンナバリナス(Pycnoporus cinnabarinus)から単離された。別名は、高く分泌されたポリペプチド及び決定されるポリペプチドの機能についてのスクリーニングにおいて、トラメテス・シンナバリナ(Trametes cinnabarina)である。
好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列;その対立遺伝子変異体;又はリゾチーム活性を有するそのフラグメントを含んで成る。もう1つの好ましい態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸1〜233を含んで成る。さらに好ましい態様においては、前記ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸1〜233から成る。
興味ある態様においては、ポリヌクレオチドプローブは、配列番号1のヌクレオチド84〜782の相補的鎖である。
いくつかのアッセイが、リゾチーム活性の測定のために記載されている。J. Biochem. (H. Maeda, 1980, vol. 88 (4): 1185-1191)に記載される1つのアッセイは、ミクロコーカス・リソデイキチカス(Micrococcus lysodeikticus)から得られる、基質としてのフルオレセイン−ラベルされたペプチドグリカンを用いての蛍光極性化又は蛍光強度のいずれかに基づかれている。
本発明のポリペプチドは、菌類ポリペプチドである。“菌類”とは、本明細書において使用される場合、門アスコミコタ(Ascomycota)、バシジオミコタ(Basidiomycota)、キトリジオミコタ(Chytridiomycota)及びヅイゴミコタ(Zygomycota)(Hawksworth など., Ainsworth and Bisby’s Dictionary of the Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKにより定義される)、及びオーミコタ(Oomycota)(Hawksworth など., 1995, 前記、171ページに引用される)、並びに栄養胞子菌(Hawksworh など., 1995, 前記)を包含する。
それらの種の株は、次の多くの培養物寄託所から容易に入手できる:American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcaltures (CBS), 及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL)。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにも関する。特に、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチドに関する。特定の態様においては、ヌクレオチド配列は、配列番号1で示される。さらに特定の態様においては、ヌクレオチド配列139−724は、配列番号1の成熟ポリペプチドコード領域である。
本発明はまた、遺伝子コードの宿重により配列番号1とは異なる、配列番号2のアミノ酸配列から成るポリペプチド、又はその成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有し、好ましくはそれらから成るポリヌクレオチドを包含する。
本発明はまた、配列番号1の成熟ポリペプチドコード配列に少なくとも1つの修飾を含んで成る修飾されたヌクレオチド配列を有し、好ましくはそれらか成るポリヌクレオチドに関し、ここで前記修飾されたヌクレオチド配列は、配列番号2のアミノ酸19〜233から成るポリペプチドをコードする。
本発明はまた、適切な宿主細胞におけるコード配列の発現を、制御配列と適合できる条件下で指図する、1又は複数の制御配列に作用可能に結合される本発明のヌクレオチド配列を含んで成る核酸構造体に関する。
糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランストリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子から得られる。
糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギキラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、フサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼ及びアスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼについての遺伝子から得られる。
本発明はまた、本発明の核酸構造体を含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記の種々のヌクレオチド及び制御配列は、1又は複数の便利な制限部位でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入又は置換を可能にするためにそれらの部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。他方では、本発明のヌクレオチド配列は、前記配列又は前記配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、そのコード配列はベクターに位置し、その結果、コード配列は発現のための適切な制御配列により作用可能に連結される。
本発明のベクターは好ましくは、宿主細胞ゲノム中へのベクターの安定した組み込み、又は細胞のゲノムに無関係に細胞におけるベクターの自律的複製を可能にする要素を含む。
本発明の組換え発現ベクターを構成するために上記要素を連結するために使用される方法は、当業者に良く知られている(例えば、Sambrookなど., 1989, 前記を参照のこと)。
本発明はまた、ポリペプチドの組換え生成において都合良く使用される、本発明の核酸配列を含んで成る組換え宿主にも関する。本発明のヌクレオチド配列を含んで成るベクターは、そのベクターが染色体組み込み体として、又は前記のような自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入される。
宿主細胞は、真核細胞、例えば哺乳類、昆虫、植物又は菌類細胞であり得る。クローニング目的のためには、宿主細胞は細菌細胞、例えばE. コリ細胞であり得る。
本発明はまた、(a)ポリペプチドを生成できる菌株を培養し;そして(b)ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成するための方法にも関する。好ましくは、前記菌株は、アスペルギラス属の株、及び好ましくは、アスペルギラス・オリザエである。
得られるポリペプチドは、当業界において知られている方法により回収され得る。例えば、ポリペプチドは、従来の方法、例えば遠心分離、濾過、抽出、噴霧−乾燥、蒸発又は沈殿(但し、それらだけには限定されない)により、栄養培地から回収され得る。
更なる追加の観点においては、本発明は、本発明のポリペプチドを含んでなる組成物に関する。
本発明のポリペプチド組成物の好ましい使用の例は下記に与えられる。本発明のポリペプチド組成物の用量、及び組成物が使用される他の条件は、当業界において知られている方法に基づいて決定され得る。
生物フィルムにおいて増殖する微生物は、従来の懸濁培養において増殖する同じ微生物よりも、すべてのタイプの抗微生物剤に対して低い感受性である。飢餓細菌が種々の抗微生物攻撃に対して低い感受性であることは良く知られている。例えば、多くの種類の抗生物質、例えばペニシリンは、遅いか又は非分裂性の細菌においては良好には遂行しない。リゾチームは、細菌の増殖状態にもかかわらず、ペプチドグリカン層を攻撃し、そして破壊するので、それは有効のまま存続する。
歯科用水素系内に構築する生物フィルムは、列挙するには、少数であるが、シュードモナス・アエロギノサ、プロテウス・ミラピリス、レイブネラsp.から成る生物フィルムを含むことができる。システム内の抗収縮弁の故障の結果として口内に一般的に見出される種のコロニー化の可能性がまた存在する。クロス感染の危険性は、免疫無防備状態の患者が関与し、そしてこの日及びこの年齢において、このカテゴリー内の患者の数が定常的に上昇し続ける場合、もちろん、より可能性ある危険性になる。歯科用水系における細菌生物フィルム蓄積の効果的な制御のための必要性がある。生物フィルムの再考は次の文献に見出され得る:Watnick P and Kolter R. (2000) Biofilm, city of microbes. J ; 182 (10): 2675-9。
バシトラシン200U.I. (65iu/mgまで)
パパイン2mg〜30NK/mg
リゾチームクロロヒドレート5mg〜26000U FIP/mg:ユニットは緩衝液に懸濁された細菌の溶解のOD動力学を測定することにより決定された。ユニット決定は、緩衝液に懸濁された細菌培養物の濁り度の溶解誘発性変化により測定された。
サッカリン賦形剤
ステアリン酸マグネシウム賦形剤
メンソール芳香剤
ソルビトール賦形剤
ポイント感染の局部処理に関しては、咽頭部の頬側膜に制限される。一般的な細菌感染の臨床学的徴候が明白な場合、抗生物質療法が推薦されることを注意すること。
リゾチームは、単独で、又は他の酵素又はさらに抗菌ペプチドと組合して使用され得る。他の酵素の例:グルコースオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ。
リゾチームを含む典型的な歯磨き組成物は、Laclede Inc. 2030 East University Drive, Rancho Domiguez, CA 90220, USAによる“Biotene”である。
活性成分:
ラクトペルオキシダーゼ(100mg)。
不活性成分:
グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、一フルオロリン酸ナトリウム、ソルビトール、グリセリン、ピロリン酸カルシウム、水和化されたシリカ、ジリトール(Zylitol)、セルロースガム、風味剤、安息香酸ナトリウム、β−d−グルコース、チオシアン酸カリウム。
本発明のリゾチームは、洗剤組成物、特に7又はそれ以下のpHを有する液体洗剤に添加され得、そして従って、洗剤組成物の成分になることができる。
本発明の洗剤組成物は、手動又は機械洗濯用洗剤組成物、例えば染色された布の前処理のために適切な洗濯用添加剤組成物及びすすぎ用布ソフトナー組成物として配合され得、又は一般的な家庭用硬質表面洗浄操作における使用のための洗剤組成物として配合され得、又は手動又は機械皿洗い操作のために配合され得る。
一般的に、選択された酵素の性質は、選択された洗剤と適合できるべきであり(すなわち、他の酵素及び非酵素の成分、等とのpH−最適適合性)、そして酵素は効果的な量で存在すべきである。
配列番号1のヌクレオチド配列は、DNAの組換え(又はシャフリング)工程において使用され得る。そのような工程において得られる新規ポリヌクレオチド配列は、改良された性質、例えば改良された安定性(貯蔵安定性、熱安定性)、改良された比活性、改良されたpH最適性及び/又は特定の化合物に対する改良された耐性と共にセロビアーゼ活性を有する新規ポリペプチドをコードすることができる。
DNA組換え又はシャフリングは、キメラ遺伝子のライブラリーが複数の出発遺伝子から生成される(部分的に)ランダム工程であり得る。多くの既知形式が、このシャフリング又は組換え工程を行うために使用され得る。
特定のシャフリング方法は、Crameriなど, 1998, Nature, 391: 288-291及びNassなど、Nature Biotechnology 17:893-896に記載される方法に従う。もう1つの型式は、アメリカ特許第6,159,687号:例1及び2に記載される方法である。
本発明は、次の例によりさらに説明されるが、但しそれらの例は本発明を制限するものではない。
トラメテス・シンナバリナ(Trametes cinnabarina)、すなわちトラメテス・シンナバリナ(=ピクノポラス・シンナバリナス(Pycnoporus cinnabarinus))CBS114004、ポリポラセアエ(Polyporaceae)、ポリポラレス(Polyporales)、アグリコミセチダエ(Agricomycetidae)、バシジオミセテス(Basidiomycetes)、バシジオミコタ(Basidiomycota)からのGH25リゾチームのクローニング:
前記株は、2002年9月、Wen Ping WuによりHuairou群、ペキン、中国から集められたカスタンナ・モリシマ(Castannna mollissima)の枯れ枝から単離された。株は、Wenping Wuにより2002年10月11日、トラメテス・シンナブラリナ(ピクノポラス・シンナバリナス)として最終的に同定された。その菌株は、Centraal Bureau voor Schimmelcultures, 8, P. O. Box 85167, 3508 AD Utrecht, The Netherlands, under the accession number CBS114004で、11月17日に寄託された。
菌株CBS114004を、次の2種の培地において25℃で160rpmで6日間、発酵した:FG4及びMEX−1培地。培養流体を、標準の酵素フィンガープリントアッセイにより酵素活性アッセイについて試験した:培養流体の酵素フィンガープリント。酵素フィンガープリント:酵素活性プロフィールを、広い範囲の酵素アッセイに基づいて培養ブイヨンをアッセイすることにより得た。96ウェルマイクロタイター(MT)プレートを、基質により調製し、そして使用まで、+10℃で貯蔵された。2種の異なった次のpH変化を調製した:pH3及びpH7。
改良されたFenozol全RNA抽出方法(Active Motif, Inc,)を使用した。
材料:
Actve Motifカタログ番号2100からのFenozol
RNアーゼフリーのエペンドーフ管、先端
RNアーゼフリーのクロロホルム
RNアーゼフリーのイソプロパノール
RNアーゼフリーの96%及び70%エタノール
RNアーゼフリーの3MのNAOAc、pH5.2
フェノール−クロロホルムミックス
CIA(クロロホルム:イソアミルアルコール、24:1)
石英砂
金属スプーン
乳鉢及び乳棒
150mlのガラスビーカー
Active MotifからのmTrap Midi mRNA単離キットを使用した(Active Motif, Europe)。ポリA富化されたRNAを、次の変性を用いて、製造業者の説明書に従って精製した:上記のようにして単離された全RNA懸濁液を、出発材料として使用した。プロテアーゼを含まない、溶解緩衝液15mlを、約20μgの全RNAに添加した。mRNA画分を、前記プロトコールに記載のようにしてカラムクロマトグラフィーにより溶出し、そして0.5kb及びそれ以上を表すプールをcDNA合成のために選択した。
Smart cDNA構成キット(K1051-1, BD Biosciences)を、次の変性を伴って使用した:第2鎖cDNA合成段階の後、材料を、製造業者の説明書(AP Pharma)に従ってGFX回転クロマトグラフィーにより精製し、そして材料85μlの脱イオン水に溶出した。Sfil消化の後、処理されたcDNAを、下記方法に従って、EtBrゲル精製によりサイズ分別した:
3)電気泳動ユニットの極性を逆にし、そして1.5%アガロースゲル中に短い距離、DNAを走行する。
サンプルを、製造業者の説明書に従って、T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs, Inc.)を用いて、標準の連結反応においてベクターpMHas5中に連結した。pMhas5 プラスミド、及びそのプラスミドにおいて生成される菌類cDNAライブラリーの使用は、特許出願WO2003/044049号に記載されている。同じ方法を用いて、WO2003/044049号に記載のようにして、SigA4トランスポゾン処理されたライブラリーからトラメテスGH25リゾチームを同定した。
本発明のトラメテスからのGH25酵素の発明:
配列番号1を、発現ベクターへのクローニングを促進する制限酵素部位を端に有する、本発明の酵素をコードする挿入体を生成するためにPCR反応への使用のための特注オリゴヌクレオチドプライマーを企画するために使用した。
プライマー1(配列番号3)、NP1276 EcoRI:
5’-GCGGAATTCAACATGAAGCTCTCTACCACAGCTC-3’
プライマー2(配列番号4)、NP1276 NotI:
5’-ATATGCGGCCGCAAAGTTACGAAGCTGCGAATTGTC-3’
下線部分は、クローニングに使用される制限される制限酵素部位を組込むためにプライマーに付加される追加のDNA配列である。
NP1276EcoRI: 5’-GCGGAATTCAACATGAAGCTCTCTACCACAGCTC-3’(配列番号3)
NP1276NotI:5’-ATATGCGGCCGCAAAGTTACGAAGCTGCGAATTGTC-3’(配列番号4)
cDNAクローン、すなわちNP001276-4を用いて、アスペルギラス・オリザエ株Jal355(国際特許出願WO2003/070956号に開示される)を形質転換した。30の形質転換体を、炭素源としてスクロースを含むCove硝酸塩最少プレート上で、選択的及び非誘発性条件下で2度、再単離した。NP1276の発現を試験するために、形質転換体を、10mlのYPM(2%のペプトン、1%の酵母抽出物、2%のマルトース)を含む管において30℃で4日間、増殖した。上清液を、NuPage 10% Bis-Tris SDSゲル(Invitrogen)上で、その製造業者により推薦されるようにして実施した。
精製の記載:
1.7Lの酵素ブイヨンを、細菌濾過し、そして50mMのNaAc、pH5/50mMのNaAc、1MのNaCl、pH5の溶液を用いてSP-セファロースカラム上で精製した。プールされた画分を、10kDaをカットオフするAmiconセル(Millipore)上で濃縮した。N−末端アミノ酸配列(EKRANPKGID)は、精製されたタンパク質が成熟GH25酵素であることを確めた。
ミクロコーカス・リソデイキチカス(Micrococcus lysodeikticus)の凍結乾燥された細胞(Sigma)を、基質として使用した。その基質を、Britton & Robinson緩衝液(0.08Mのリン酸、0.08Mの硼酸及び0.08Mの酢酸;1MのNaOHにより2〜12に調節されたpH)に、適切なpHで、0.3mg/mlの最終濃度に懸濁した。96ウェルマクロタイタープレートにおける個々のウェルに、100μlの基質懸濁液及び約1mg/mlの濃度での30μlの酵素溶液を添加した。濁り度の変化を、酵素の添加の後、5分間、450nmでマイクロプレートリーダーにより測定した。曲線の傾斜を計算し、そして酵素活性の相対的測定として使用した。
次の生物学的材料を、Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Germanyに、ブダペスト条件に基づいて寄託し、そして次に受託番号が付与された:
寄託物 E.coli DH10B
受託番号 DSM16084
寄託日 2003年12月5日
寄託物 Trametes cinnabarina
受託番号 CBS114004
寄託日 2003年11月17日
Claims (23)
- リゾチーム活性を有し、そしてGH25ファミリーに属する菌類ポリペプチドであって、
(a)配列番号2のアミノ酸1〜233と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るリゾチーム活性を有するポリペプチド;
(b)DSM16084株に存在するプラスミド中に挿入されるヌクレオチド配列のリゾチームコード部分によりコードされるポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るリゾチーム活性を有するポリペプチド;又は
(c)配列番号1のヌクレオチド84〜782の相補的鎖から成るポリヌクレオチドプローブに、非常に高い緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるリゾチーム活性を有するポリペプチド;
から成る群から選択されるポリペプチド。 - 配列番号2のアミノ酸1〜233と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸1〜233と少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る請求項2に記載のポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸1〜233を含んで成る請求項3に記載のポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸1〜233から成る請求項4に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
- 適切な宿主におけるポリペプチドの生成を方向づける1又は複数の制御配列に作用可能に連結される請求項6に記載のヌクレオチド配列を含んで成る核酸構造体。
- 請求項7に記載の核酸構造体を含んで成る組換え発現ベクター。
- 請求項7に記載の核酸構造体又は請求項8に記載の発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチドの生成方法であって、
(a)前記ポリペプチドを生成するために、その野生型において、前記ポリペプチドを生成できる株を培養し;そして
(b)前記ポリペプチドを回収する;
ことを含んで成る方法。 - 請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチドの生成方法であって、
(a)前記ポリペプチドの生成の助けになる条件下で、請求項9に記載の組換え宿主細胞を培養し;そして
(b)前記ポリペプチドを回収する;
ことを含んで成る方法。 - 配列番号1のヌクレオチド84〜782と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を有し、リゾチーム活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号1のヌクレオチド84〜782に対して、少なくとも95%の同一性を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号1のヌクレオチド84〜782に対して、少なくとも99%の同一性を有する請求項13に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号1に記載のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド。
- 配列番号1に記載のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド。
- DSM16084株に存在するプラスミド中に挿入されるヌクレオチド配列のリゾチームコード部分と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を有する、リゾチーム活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- リゾチーム活性を有するポリペプチドをコードし、そして配列番号1のヌクレオチド84〜782の相補的鎖から成るポリヌクレオチドプローブに、非常に高い緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
- 配列番号1の成熟ポリペプチドコード配列に少なくとも1つの修飾を含んで成り、そして配列番号2のアミノ酸1〜233から成るポリペプチドをコードする修飾されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
- バイオ−フィルム形成のインヒビターとしての請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチドの使用。
- 歯科用組成物の製造への請求項1〜5のいずれか1項記載のポリペプチドの使用。
- 洗剤組成物への請求項1〜5のいずれか1項記載のポリペプチドの使用。
- 動物飼料への請求項1〜5のいずれか1項記載のポリペプチドの使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DKPA200400300 | 2004-02-25 | ||
DKPA200400300 | 2004-02-25 | ||
PCT/DK2005/000099 WO2005080559A1 (en) | 2004-02-25 | 2005-02-16 | Fungall cell wall degrading enzyme |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007527715A JP2007527715A (ja) | 2007-10-04 |
JP4891220B2 true JP4891220B2 (ja) | 2012-03-07 |
Family
ID=34878015
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007500047A Expired - Fee Related JP4891220B2 (ja) | 2004-02-25 | 2005-02-16 | 菌類細胞壁分解酵素 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7635470B2 (ja) |
EP (1) | EP1718742B1 (ja) |
JP (1) | JP4891220B2 (ja) |
CN (1) | CN1922314B (ja) |
AU (1) | AU2005215852B2 (ja) |
ES (1) | ES2531753T3 (ja) |
NZ (1) | NZ549198A (ja) |
WO (1) | WO2005080559A1 (ja) |
Families Citing this family (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009037253A2 (en) | 2007-09-18 | 2009-03-26 | Novozymes A/S | Polypeptides having tyrosinase activity and polynucleotides encoding same |
FR2925521B1 (fr) * | 2007-12-20 | 2009-12-18 | Inst Francais Du Petrole | Complementation du secretome de trichoderma reesei limitant les contaminations microbiologiques dans le cadre de procedes industriels. |
CN101945996A (zh) * | 2008-02-11 | 2011-01-12 | 丹尼斯科美国公司 | 来自里氏木霉的具有微生物裂解活性的酶 |
BRPI0922773B1 (pt) | 2008-12-04 | 2018-10-09 | Novozymes As | célula microbiana hospedeira transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica e para degradar ou converter um material celulósico, construção de ácido nucleico, vetor de expressão, e, composição detergente. |
EP2408314A1 (en) | 2009-03-17 | 2012-01-25 | Novozymes A/S | Polypeptides having tyrosinase activity and polynucleotides encoding same |
EP2494042A1 (en) | 2009-10-29 | 2012-09-05 | Novozymes Inc. | Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same |
DK3222716T3 (da) | 2009-11-06 | 2020-11-16 | Novozymes Inc | Sammensætninger til saccharificering af cellulosemateriale |
US20120220513A1 (en) | 2009-12-29 | 2012-08-30 | Novozymes A/S | Polypeptides Having Detergency Enhancing Effect |
JP5833576B2 (ja) * | 2010-02-25 | 2015-12-16 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | リゾチームの変異体及びそれをコードするポリヌクレオチド |
WO2012035103A1 (en) | 2010-09-16 | 2012-03-22 | Novozymes A/S | Lysozymes |
US9409958B2 (en) | 2011-03-10 | 2016-08-09 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
WO2013076259A2 (en) * | 2011-11-25 | 2013-05-30 | Novozymes A/S | Polypeptides having lysozyme activity and polynucleotides encoding same |
KR20140122729A (ko) | 2012-01-23 | 2014-10-20 | 모르포시스 아게 | 태그로서 리소자임의 용도 |
CN105567714A (zh) * | 2014-11-07 | 2016-05-11 | 西南民族大学 | 一种重组牦牛溶菌酶及其制备方法和用途 |
US10959942B2 (en) | 2015-07-02 | 2021-03-30 | Novozymes A/S | Animal feed compositions and uses thereof |
EP3317293A4 (en) * | 2015-07-02 | 2019-03-20 | Novozymes A/S | ANIMAL FOOD COMPOSITIONS AND USES THEREOF |
WO2017140807A1 (en) | 2016-02-16 | 2017-08-24 | Monaghan Mushrooms Group | Fungal polypeptides having lysozyme activity |
WO2018113745A1 (en) * | 2016-12-21 | 2018-06-28 | Novozymes A/S | Polypeptides having lysozyme activity, polynucleotides encoding same and uses and compositions thereof |
AU2017380488B2 (en) | 2016-12-21 | 2023-09-14 | Novozymes A/S | Polypeptides having lysozyme activity, polynucleotides encoding same and uses and compositions thereof |
US11950569B2 (en) | 2017-05-09 | 2024-04-09 | Novozymes A/S | Animal chew toy with dental care composition |
US11859170B2 (en) | 2017-05-12 | 2024-01-02 | Novozymes A/S | Polypeptides having lysozyme activity, polynucleotides encoding same and uses and compositions thereof |
CN111491519A (zh) * | 2017-12-20 | 2020-08-04 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 包含胞壁质酶的动物饲料组合物及其用途 |
WO2019121930A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Dsm Ip Assets B.V. | Animal feed compositions and uses thereof |
US20210112827A1 (en) | 2018-04-25 | 2021-04-22 | Novozymes A/S | Animal Feed Compositions and Uses Thereof |
CN110403848A (zh) * | 2018-04-28 | 2019-11-05 | 好维股份有限公司 | 一种具有抗菌作用的口腔护理产品 |
EP3852548A1 (en) | 2018-09-17 | 2021-07-28 | DSM IP Assets B.V. | Animal feed composition and use thereof |
MX2021003040A (es) | 2018-09-17 | 2021-07-15 | Dsm Ip Assets Bv | Composiciones de alimentos animales y usos de las mismas. |
US20220040271A1 (en) | 2018-09-17 | 2022-02-10 | Dsm Ip Assets B.V. | Animal feed compositions and uses thereof |
WO2020058228A1 (en) | 2018-09-17 | 2020-03-26 | Dsm Ip Assets B.V. | Animal feed compositions and uses thereof |
WO2020058226A1 (en) | 2018-09-17 | 2020-03-26 | Dsm Ip Assets B.V. | Animal feed compositions and uses thereof |
WO2020099491A1 (en) | 2018-11-14 | 2020-05-22 | Novozymes A/S | Oral care composition comprising a polypeptide having dnase activity |
CN111870687A (zh) * | 2020-08-12 | 2020-11-03 | 好易康生物科技(广州)有限公司 | 一种口腔抑菌组合物及其制备的口腔护理液和应用 |
KR20230057391A (ko) | 2020-08-24 | 2023-04-28 | 노보자임스 에이/에스 | 프럭타나제를 포함하는 구강 관리 조성물 |
WO2022047149A1 (en) * | 2020-08-27 | 2022-03-03 | Danisco Us Inc | Enzymes and enzyme compositions for cleaning |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4693888A (en) * | 1983-08-11 | 1987-09-15 | Lion Corporation | Caries-preventive composition |
DK122686D0 (da) | 1986-03-17 | 1986-03-17 | Novo Industri As | Fremstilling af proteiner |
EP0448688A4 (en) * | 1989-10-16 | 1993-07-28 | Amgen Inc. | N-acetylmuramidase m1 |
DE69024323T2 (de) * | 1989-10-27 | 1996-10-17 | Procter & Gamble | Antimikrobielles Verfahren und Formulierung unter Verwendung von Endoglycosidase vom Typ II und antimikrobielles Mittel |
US5041236A (en) * | 1989-10-27 | 1991-08-20 | The Procter & Gamble Company | Antimicrobial methods and compositions employing certain lysozymes and endoglycosidases |
US6117679A (en) | 1994-02-17 | 2000-09-12 | Maxygen, Inc. | Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination |
US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
CN1151762A (zh) | 1994-06-30 | 1997-06-11 | 诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司 | 非毒性、非产毒性、非致病性镰孢属表达系统及所用启动子和终止子 |
CN1128875C (zh) | 1995-08-11 | 2003-11-26 | 诺沃奇梅兹有限公司 | 制备多肽变异体的方法 |
US5965408A (en) | 1996-07-09 | 1999-10-12 | Diversa Corporation | Method of DNA reassembly by interrupting synthesis |
CN1208456C (zh) | 1996-12-20 | 2005-06-29 | 诺维信公司 | 体内重组 |
JPH10242147A (ja) | 1997-02-27 | 1998-09-11 | Toshiba Corp | 半導体装置およびその製造方法ならびに半導体記憶装置およびその製造方法 |
US6159688A (en) | 1997-03-18 | 2000-12-12 | Novo Nordisk A/S | Methods of producing polynucleotide variants |
CA2284097A1 (en) | 1997-03-18 | 1998-09-24 | Novo Nordisk A/S | Shuffling of heterologous dna sequences |
US6159687A (en) | 1997-03-18 | 2000-12-12 | Novo Nordisk A/S | Methods for generating recombined polynucleotides |
JP2997800B2 (ja) * | 1997-12-01 | 2000-01-11 | 農林水産省食品総合研究所長 | 細胞壁溶解酵素遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体 |
EP1068871A1 (en) * | 1999-07-07 | 2001-01-17 | Jean-Paul Perraudin | Novel methods and medicament for treating infections diseases involving microbial biofilms |
DK1448595T3 (da) | 2001-11-20 | 2007-02-19 | Novozymes As | Antimikrobielle polypeptider |
US20050170350A1 (en) | 2002-02-16 | 2005-08-04 | Stringer Mary A. | Expression cloning methods in filamentous fungi |
JP4270798B2 (ja) * | 2002-03-18 | 2009-06-03 | 太陽化学株式会社 | 抗菌性ペプチド組成物 |
-
2005
- 2005-02-16 AU AU2005215852A patent/AU2005215852B2/en not_active Ceased
- 2005-02-16 NZ NZ549198A patent/NZ549198A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-02-16 CN CN2005800061004A patent/CN1922314B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-02-16 WO PCT/DK2005/000099 patent/WO2005080559A1/en active Application Filing
- 2005-02-16 ES ES05700649.6T patent/ES2531753T3/es active Active
- 2005-02-16 EP EP05700649.6A patent/EP1718742B1/en active Active
- 2005-02-16 JP JP2007500047A patent/JP4891220B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-02-16 US US10/586,026 patent/US7635470B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2005080559A1 (en) | 2005-09-01 |
WO2005080559B1 (en) | 2005-09-29 |
EP1718742A1 (en) | 2006-11-08 |
ES2531753T3 (es) | 2015-03-18 |
NZ549198A (en) | 2009-05-31 |
CN1922314A (zh) | 2007-02-28 |
US7635470B2 (en) | 2009-12-22 |
EP1718742B1 (en) | 2014-12-24 |
US20080227147A1 (en) | 2008-09-18 |
CN1922314B (zh) | 2010-05-05 |
JP2007527715A (ja) | 2007-10-04 |
AU2005215852A1 (en) | 2005-09-01 |
AU2005215852B2 (en) | 2010-04-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4891220B2 (ja) | 菌類細胞壁分解酵素 | |
EP2539447B1 (en) | Variants of a lysozyme and polynucleotides encoding same | |
EP2782593B1 (en) | Polypeptides having lysozyme activity and polynucleotides encoding same | |
US7244605B2 (en) | Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same | |
JP2004527261A (ja) | セロビアーゼ活性を有するポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド | |
US20220340842A1 (en) | Glycosyl Hydrolases | |
JP2008508868A (ja) | ボトリオスファエリア・ロジナのポリペプチド | |
US20150023945A1 (en) | Lysozymes | |
US20210163852A1 (en) | Polypeptides | |
CN113366103A (zh) | 具有肽聚糖降解活性的多肽以及编码其的多核苷酸 | |
US20180000076A1 (en) | Polypeptides Having N-Acetyl Glucosamine Oxidase Activity | |
AU720045B2 (en) | Polypeptides having mutanase activity and nucleic acids encoding same | |
US11685911B2 (en) | Fungal polypeptides having lysozyme activity |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080213 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101005 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110105 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110215 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110512 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110802 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111024 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20111115 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20111215 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141222 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |