JP4270798B2 - 抗菌性ペプチド組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リゾチームをプロテアーゼで分解して得られるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物に関する。さらに詳しくは、リゾチームをペプシン及び／又はトリプシンで分解して得られるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リゾチームはムラミダーゼまたはムコペプチドグリコヒドロラーゼとも呼ばれ、細菌の細胞壁のペプチドグリカン層等に存在するＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミン間のβ−１，４−ムラミド結合を加水分解する酵素蛋白質である。リゾチームは動植物界に広く分布し、現在、哺乳動物の涙、唾液、尿、乳、鳥類の卵中の卵白、魚類の体表粘液、微生物、バクテリオファージＴ４等に由来するリゾチームが知られている。
【０００３】
リゾチームは、古くから抗菌活性を有することが知られているが、この抗菌作用はリゾチームの酵素作用により細菌の細胞壁が切断され、細菌が溶菌することによるものである。なかでも鶏卵の卵白由来のリゾチームは大量製造が可能であり、その抗菌活性を利用して医薬、化粧品、食品、飼料分野等において、抗炎症剤、防腐剤、鮮度保持剤、抗菌剤、殺菌剤等として利用されている。
【０００４】
リゾチームの抗菌活性は、特にグラム陽性菌に対して活性を示し、グラム陰性菌に対しては、ほとんど抗菌活性がないことが知られている。グラム陽性菌はグラム染色により、紫色に染色される細菌で、球菌（ミクロコッカス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属等）、胞子形成桿菌（バチルス属、クロストリジウム属等）、乳酸菌（ラクトバチルス属等）、コリネフォーム細菌（コリネバクテリウム属、ノカルディア属等）、放線菌（ストレプトマイセス属等）、等が知られている。その細胞壁は２０〜８０ｎｍの厚いペプチドグリカン層より構成され、リゾチームに対する感受性が高い。即ち、リゾチームは容易にペプチドグリカン層を加水分解し、グラム陽性菌を溶菌させる作用を示す。
【０００５】
一方、グラム陰性菌はグラム染色で染色されない細菌で、光合成細菌（ロドシュードモナス属等）、シュードモナス属細菌、腸内細菌群（エシェリヒア属、サルモネラ属等）、化学無機栄養細菌（ニトロバクター属、チオバチルス属等）、メタン生成細菌、および一部の球菌（ニセリア属等）等が知られている。その細胞の表層は細胞膜（内膜）の外側に２〜３ｎｍ程度の薄いペプチドグリカン層があり、さらにその外側にリポ多糖を含む外膜を有する。このためリゾチームは、容易にペプチドグリカン層を切断することができず、エチレンジアミン四酢酸等を用いて外膜に損傷を与えない限りリゾチーム感受性にはならない。
【０００６】
このようにリゾチームは、グラム陽性菌に対しては抗菌活性を示すものの、グラム陰性菌に対しては、ほとんど抗菌活性がないため、その用途はグラム陽性菌の増殖抑制を目的とした食品の日持ち向上剤、化粧品の防腐剤、抗炎症医薬品等に限定されている。しかし、これらの用途においては、グラム陽性菌よりもむしろ人や動物の生活や健康により悪影響を及ぼす大腸菌、サルモネラ菌などのグラム陰性菌の増殖を抑制することの方がより重要であるといわれている。
【０００７】
また、リゾチームのグラム陰性菌に対する抗菌活性に関しても医薬、化粧品、食品、飼料分野等では、添加量の低減等が実施できる等の理由により、さらに強い活性を発現させることが望まれている。
【０００８】
ところで、リゾチームの有する抗菌活性を、グラム陽性菌のみならずグラム陰性菌にも作用するようにする試み、即ちリゾチームの抗菌スペクトルを拡大する試みがいくつか報告されている。たとえば、メイラード反応を利用しデキストラン等の多糖類を結合させた修飾リゾチームが、５０℃、３０分間の加熱条件下でグラム陰性菌に対して抗菌活性を持つことが開示されている（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４巻，３０５７−３０５９頁，１９９０年）。また、パルミチン酸（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，３９巻，２０７７−２０８２頁，１９９１年）、ステアリン酸、ミリスチン酸（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．，４１巻，１１６４−１１６８頁，１９９３年）等の脂肪酸を結合させた修飾リゾチームや、遺伝子操作技術によりリゾチームのＣ末端に疎水性ペプチドを導入して得られた修飾リゾチーム（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６巻，１３６１−１３６３頁，１９９２年）が、グラム陰性菌に対して強い抗菌活性を持つことが開示されている。特開平８−２７０２７号には、加熱処理、高圧力処理、酸処理、アルカリ処理、有機溶剤処理、界面活性剤処理、酸化処理及び酵素処理を単独あるいは併用することでリゾチームの立体構造を変化させてグラム陽性菌及びグラム陰性菌に対して抗菌活性を持たせることを特徴とする抗菌性組成物の製造方法、並びに当該変性リゾチームを有効成分とする抗菌剤、及び当該抗菌剤を含有する医薬、化粧品、食品及び飼料に関する技術が開示されている。
【０００９】
しかしながら、これら従来法は、グラム陰性菌に対して、有効な抗菌活性を示すためには、グラム陰性菌に対して５０℃の加熱処理を必要とする、脂肪酸の結合や立体構造の変性によりリゾチームの溶解性が著しく悪くなる、非常に煩雑な遺伝子操作技術や化学合成法を用いる等の問題点があり、実用的なものではなかった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、リゾチームをプロテアーゼで処理して得られるペプチド類を有効成分とするグラム陰性菌およびグラム陽性菌に対して優れた抗菌活性を有する抗菌性ペプチド組成物を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、リゾチームのグラム陽性菌に対する抗菌活性を増加させること、並びにグラム陰性菌に対しても抗菌活性を発現させることについて、鋭意検討した結果、リゾチームをトリプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２〜６ｋＤａの範囲であるペプチド類がグラム陽性菌に対する抗菌活性を示すこと、ペプシンで分解して得られるＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２．５ｋＤａ以下の範囲であるペプチド類がグラム陰性菌に対してリゾチームより強い抗菌活性を示すこと、トリプシン及びペプシンを併用することで、それぞれのタンパク質分解酵素単独で処理することよりも抗菌活性が増加することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
また、本発明によって得られた抗菌性ペプチド組成物にはリゾチームの抗菌作用であるムラミダーゼまたはムコペプチドヒドロラーゼ活性は消失し、リゾチームのプロテアーゼ分解により得られたペプチド類による抗菌活性、つまり、リゾチームと異なる新しい機構で抗菌活性を示すことを見出した。
【００１３】
すなわち本発明は、（１）リゾチームをトリプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２〜６ｋＤａの範囲であるペプチド類を有効成分とするグラム陽性菌に対する抗菌性ペプチド組成物、（２）リゾチームをペプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２．５ｋＤａ以下の範囲であるペプチド類を有効成分とするグラム陰性菌に対する抗菌性ペプチド組成物、（３）リゾチームをトリプシン及びペプシンで同時に分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２．５ｋＤａ以下の範囲であるペプチド類を有効成分とするグラム陽性菌及び陰性菌に対する抗菌性ペプチド組成物の前記（１）〜（３）いずれかの抗菌性ペプチド組成物に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明におけるリゾチームとは、Ｎ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミン間のβ−１，４−ムラミド結合を加水分解する酵素蛋白質をいい、人由来、卵白由来、魚類の体表粘液由来、微生物由来、バクテリオファージ由来等の各種由来の精製リゾチーム、またリゾチーム遺伝子を利用して遺伝子操作技術により調製されたリゾチームが知られている。また、鶏卵卵白由来のリゾチームの平均分子量は１４．３〜１４．６ｋＤａであることが知られている。
【００１５】
従来技術にある変性リゾチームとは、リゾチームの酵素蛋白質の活性は失活していないが、リゾチームの蛋白質としての立体構造が変化したものを指す。リゾチーム蛋白質の立体構造の変化とは、本来、リゾチーム蛋白質が有する立体構造が変化することを指す。特開平８−２７０２７号記載の蛋白質の立体構造が変化した変性リゾチーム含有抗菌剤では、加熱処理、高圧力処理、酸処理、アルカリ処理、有機溶剤処理、界面活性剤処理、酸化処理及び酵素処理を単独あるいは併用することでリゾチームの立体構造を変化させることで、グラム陽性菌、陰性菌、特にグラム陰性菌の細胞膜に対してリゾチームより強い親和性を示し、容易に結合することにより、細胞膜の物質の能動輸送などに障害を与えることにより抗菌性を示すことが開示されている。また、特開平８−２７０２７号では、リゾチームの立体構造を変化させるために酵素処理を利用する場合には、トリプシン、キモトリプシン、プロナーゼ及びパパインなどの蛋白分解酵素を添加してリゾチームを変性させるが、これはリゾチームの酵素活性を維持しながら、立体構造のみを変化させる技術が開示されているにすぎない。つまり、酵素処理の時間は極めて短時間であり、本発明の抗菌性ペプチド組成物と比較して平均分子量や抗菌活性の機構が全く異なる。すなわち、変性リゾチームはリゾチームの酵素活性を有し、平均分子量は本発明の抗菌性ペプチド組成物と比較して大きいものであり、本発明の抗菌性ペプチド組成物とは全く異なる技術である。
【００１６】
本発明におけるペプチド類とはトリプシン及び／又はペプシンにより分解されて得られるペプチドの混合物を意味する。
【００１７】
本発明における抗菌性ペプチド組成物とは、リゾチームをトリプシンで分解することにより得られるペプチド類を有効成分とするグラム陽性菌に対する抗菌性ペプチド組成物、（２）リゾチームをペプシンで分解することで得られたペプチド類を有効成分とするグラム陰性菌に対する抗菌性ペプチド組成物、（３）リゾチームをトリプシン及びペプシンで同時に分解することにより得られたペプチド類を有効成分とするグラム陽性菌及び陰性菌に対する抗菌性ペプチド組成物の前記（１）〜（３）いずれかの抗菌性ペプチド組成物を指す。
【００１８】
本発明の抗菌性ペプチド組成物は、リゾチーム及び変性リゾチームが有するＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミン間のβ−１，４−ムラミド結合を加水分解する酵素蛋白質としての活性（溶菌活性）が消失し、いわゆるリゾチームの溶菌作用とは別の作用により抗菌活性が発現されたものを指す。従って、本発明の抗菌性ペプチド組成物の抗菌活性は、従来のリゾチームの細菌に対する作用機序とは異なる技術である。
【００１９】
本発明におけるトリプシンとは、酵素番号（ＥＣ Ｎｕｍｂｅｒ）がＥＣ３．４．２１．４のプロテアーゼを指し、ウシ膵臓、ブタ膵臓、遺伝子組換え技術により生産されたもの等を用いることができ、その由来は限定されない。
【００２０】
本発明におけるペプシンとは、酵素番号（ＥＣ Ｎｕｍｂｅｒ）がＥＣ３．４．２３．１のプロテアーゼを指し、ウシ胃、ブタ胃、遺伝子組換え技術により生産されたもの等を用いることができ、その由来は限定されない。
【００２１】
本発明における抗菌性ペプチド組成物を得るためのトリプシンでの分解、ペプシンでの分解及びトリプシンとペプシンの同時分解における温度及びｐＨは使用される酵素の至適作用範囲内であれば特に問題はない。また、処理時間及び酵素の量は使用される酵素の比活性の強さに合わせて適宜選択できる。例えば、比活性が６０００〜１５０００ ＢＡＥＥ ｕｎｉｔｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎのウシ膵臓由来のトリプシンで分解する場合、１／２０〜１／３０の酵素量でｐＨ７．０〜９．０、好ましくはｐＨ７．５〜８．５で、温度２０〜５０℃、好ましくは温度３０〜４５℃、処理時間５〜３０時間、好ましくは１０〜２０時間の処理により得ることができる。また、比活性が６００〜４５００ ｕｎｉｔｓ／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎのブタ胃粘膜由来のペプシンで分解する場合、１／２０〜１／３０の酵素量でｐＨ０．５〜２．０、好ましくはｐＨ０．８〜１．５、温度２０〜５０℃、好ましくは温度３０〜４５℃、処理時間２０〜９０分、好ましくは、４５〜８５分の処理により得ることができる。トリプシン及びペプシンの同時に分解する場合は、例えば上述のペプシンでの分解を行い、中和後にトリプシンで分解することにより得ることができるが、ペプシンでの分解とトリプシンでの分解の順序は特に限定されない。
【００２２】
本発明における抗菌性ペプチド組成物の平均分子量は、トリプシンで分解して得られるペプチド類では２．０〜６．０ｋＤａ、好ましくは３．５〜５．５ｋＤａ、さらに好ましくは４．０〜５．２ｋＤａであり、ペプシンで分解して得られるペプチド類及びトリプシンとペプシンの同時分解で得られるペプチド類では２．５ｋＤａ以下、好ましくは２．０ｋＤａ以下、さらに好ましくは１．８ｋＤａ以下である。
【００２３】
本発明における抗菌性ペプチド組成物の平均分子量の測定方法は、特に限定されないが、ゲルロ過法、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法及び超遠心法等があげられるが、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法が好ましい。
【００２４】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法での測定方法は特に限定されないが、例えば、０．１％ＳＤＳを含む１０％アクリルアミド分離ゲルと３％固定ゲルを用いたＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０，１９７０年）等があげられる。
【００２５】
本発明の抗菌性ペプチド組成物、リゾチーム及び変性リゾチームの相違は、上記に記載したリゾチームの有する酵素活性及び平均分子量以外に逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析からも確認することができる。例えば、展開溶媒をＡ溶媒に０．０９％ トリフロオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液、Ｂ溶媒に０．０８５％ ＴＦＡ−アセトリトリル溶液を用いてＡ溶媒の０〜４０％の直線グラジエントによるＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣの分析が例示できる。
【００２６】
本発明の抗菌性ペプチド組成物は、単独で使用、または他の成分と併用して使用しても問題はない。その形態については、溶液、粉末のいずれでもよい。粉末化の方法としては、熱風乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥等、通常の公知の粉末化方法を用いればよい。
【００２７】
本発明の抗菌性ペプチド組成物は、医薬、化粧品、食品、飼料等に添加して抗菌、防腐等を目的として使用することができる。例えば、抗炎症や抗菌を目的とした医薬品、虫歯の原因菌の抑制を目的とした洗口液や歯磨き剤等の医薬部外品として、フケの原因菌の抑制を目的としたシャンプーやリンス等の化粧品として、腐敗防止や殺菌を目的とした生鮮野菜、鮮魚、蒲鉾、カスタードクリーム、漬物、ソーセージ、ハム、炊飯米、鶏卵加工品等の食品の日持ち向上剤として、家畜や水産動物の疾病予防を目的とした飼料添加剤や動物医薬品としての利用が可能である。また、食品用の機械、器具、包丁、まな板などの調理器具の殺菌及び手指の消毒、室内殺菌などに、噴霧または浸漬することにより使用することができる。
【００２８】
これらの目的に使用する本発明の抗菌性ペプチド組成物の配合量は、特に限定されるものではないが、通常０．００５重量％以上、好ましくは０．０１重量％以上となるように、各種用途に応じてその使用量を適宜変える事ができる。
以下本願発明の実施例について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２９】
【実施例】
実施例１
１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１リットルに卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）を０．５％の濃度となるよう５ｇを溶解し、リゾチーム溶液１リットルを調製した。このリゾチーム溶液にトリプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ウシ膵臓由来、Ｔｙｐｅ Ｉ）を０．０２％になるように０．２ｇ添加し、３７℃で１５時間放置し、トリプシンで分解した。そして９５℃で１０分間放置してトリプシンを失活させた。速やかに冷却後、卓上型遠心分離機で遠心分離（３０００ｇ、１０分間）し、上清９９５ｍｌを集め、本発明の抗菌性ペプチド組成物（本発明品１）９９０ｇを得た。
【００３０】
実施例２
０．１５Ｎ塩酸１リットルに卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）５ｇを０．５％の濃度となるよう溶解し、リゾチーム溶液１リットルを調製した。このリゾチーム溶液にペプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ブタ胃粘膜由来）を０．０２％になるように０．２ｇ添加し、３７℃で１時間放置し、ペプシンで分解した。そして、０．１Ｎ水酸化ナトリウムで中和（ｐＨ７．０に調整）後、９５℃で１０分間放置してペプシンを失活させた。速やかに冷却後、卓上型遠心分離機で遠心分離（３０００ｇ、１０分間）し、上清９９５ｍｌを集め、本発明の抗菌性ペプチド組成物（本発明品２）９９０ｇを得た。
【００３１】
実施例３
０．１５Ｎ塩酸１リットルに卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）を０．５％の濃度となるよう５ｇ溶解し、リゾチーム溶液１リットルを調製した。このリゾチーム溶液にペプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ブタ胃粘膜由来）を０．０２％になるように０．２ｇ添加し、３７℃で１時間放置し、ペプシンで分解した。そして、０．１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整した後、トリプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ウシ膵臓由来、Ｔｙｐｅ Ｉ）を０．０２％になるように０．２ｇ添加し、３７℃で１５時間放置し、トリプシンで分解した。そして９５℃で１０分間放置してペプシン及びトリプシンを失活させた。速やかに冷却後、卓上型遠心分離機で遠心分離（３０００ｇ、１０分間）し、上清９９７ｍｌを集め、本発明の抗菌性ペプチド組成物（本発明品３）９９１ｇを得た。
【００３２】
実施例４
卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）１ｋｇを１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００リットルに溶解した後、トリプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ウシ膵臓由来、Ｔｙｐｅ Ｉ）４０ｇを添加した。その溶液を攪拌しながら液温を３７±２℃で１５時間放置し、トリプシンで分解した。その後、９０℃で１０分間放置してトリプシンを失活させた。速やかに冷却した後、ロ過してロ液を得た。得られたロ液をスプレードライ法（熱風温度１５０℃、排風温度８０℃）で粉末化し、本発明の抗菌性ペプチド組成物（本発明品４）を９６０ｇ得た。
【００３３】
実施例５
卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）１ｋｇを０．１５Ｎ塩酸１００リットルに溶解した後、ペプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ブタ胃粘膜由来）４０ｇを添加した。その溶液を攪拌しながら液温を３７±２℃で１時間放置し、ペプシンで分解した。そして、０．１Ｎ水酸化ナトリウムで中和後、９０℃で１０分間放置してトリプシンを失活させた。速やかに冷却した後、ロ過してロ液を得た。得られたロ液をスプレードライ法（熱風温度１５０℃、排風温度８０℃）で粉末化し、本発明の抗菌性ペプチド組成物（本発明品５）を９６５ｇ得た。
【００３４】
実施例６
卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）１ｋｇを０．１５Ｎ塩酸１００リットルに溶解した後、ペプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ブタ胃粘膜由来）４０ｇを添加した。その溶液を攪拌しながら液温を３７±２℃で１時間放置し、ペプシンで分解した。そして、０．１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整した後、トリプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ウシ膵臓由来、Ｔｙｐｅ Ｉ）４０ｇを添加した。その溶液を攪拌しながら液温を３７±２℃で１５時間放置し、トリプシンで分解した。その後、９０℃で１０分間放置してペプシン及びトリプシンを失活させた。速やかに冷却した後、ロ過してロ液を得た。得られたロ液をスプレードライ法（熱風温度１５０℃、排風温度８０℃）で粉末化し、本発明の抗菌性ペプチド組成物（本発明品６）を９７８ｇ得た。
【００３５】
比較例１
１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１リットルに卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）を０．５％の濃度となるよう５ｇ溶解し、リゾチーム溶液１リットルを調製した。このリゾチーム溶液にトリプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ウシ膵臓由来、Ｔｙｐｅ Ｉ）を０．０２％になるように０．２ｇ添加し、３７℃で３時間放置し、トリプシンでリゾチームを変性させた。ゲルロ過によりトリプシン画分を除去して変性リゾチーム（比較品１）３．４ｇを得た。
【００３６】
比較例２
０．１５Ｎ塩酸１リットルに卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）５ｇを０．５％の濃度となるよう溶解し、リゾチーム溶液１リットルを調製した。このリゾチーム溶液にペプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ブタ胃粘膜由来）０．２ｇを０．０２％になるように添加し、３７℃で０．５時間放置し、ペプシンでリゾチームを変性させた。ゲルロ過によりペプシン画分を除去して変性リゾチーム（比較品２）３．０ｇを得た。
【００３７】
比較例３
イオン交換水１リットルに卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）５ｇを０．５％の濃度となるよう溶解し、リゾチーム溶液１リットルを調製した。５０ｍｇのキモトリプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ウシ膵臓由来、Ｔｙｐｅ Ｉ−ｓ）を添加後、水酸化ナトリウムでｐＨ１０に調整後、２０℃で２時間放置し、キモトリプシンでリゾチームを変性させた。ゲルロ過によりキモトリプシン画分を除去して変性リゾチーム（比較品３）３．８ｇを得た。
【００３８】
比較例４
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１リットルに卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）５ｇを０．０５％の濃度となるよう溶解した。このリゾチーム溶液を９０℃で２０分間放置した後、氷冷水中で冷却することによりリゾチームを変性させ、変性リゾチーム（比較品４）４．２ｇを得た。
【００３９】
試験例１．抗菌性ペプチド組成物の酵素活性の測定
実施例１〜３で得られた本発明品１〜３の抗菌性ペプチド組成物、比較例１〜４で得られた比較品１〜４の変性リゾチーム及び卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）の酵素活性の比較を行った。リゾチームの酵素活性はミクロコッカス・リゾデイクティカス（Ｍ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）菌体に対する溶菌活性で比較した。それぞれの試料をＬｏｗｒｙ法（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３巻，２６５（１９５１））で測定して最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）に懸濁した菌体液（初期濁度Ａ６００ｎｍ＝０．７５〜０．８０）に添加し、２５℃でその濁度変化を測定した。卵白リゾチームの濁度変化量を１００％とした場合、実施例１〜３で得られた抗菌性ペプチド組成物（本発明品１〜３）のそれは、いずれも０％であった。一方、比較例１〜４で得られた変性リゾチーム（比較品１〜４）のそれはそれぞれ７３％、７０％、６９％及び１４％であった。これらのことから、本発明の抗菌性ペプチド組成物は、リゾチームの酵素活性が認められないことが明らかとなった。このことから、本発明の抗菌性ペプチド組成物は変性リゾチーム及び卵白リゾチームと異なっていた。
【００４０】
試験例２．抗菌性ペプチド組成物の平均分子量測定
実施例１〜３で得られた本発明品１〜３の抗菌性ペプチド組成物、比較例１〜４で得られた比較品１〜４の変性リゾチーム及び卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）の平均分子量を測定した。平均分子量は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した（０．１％ＳＤＳを含む１０％アクリルアミド分離ゲルと３％固定ゲルを用いてＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０，１９７０年）に準じて行った）。その結果、本発明品１、本発明品２及び本発明品３の平均分子量は、それぞれ４．７ｋＤａ、１．１ｋＤａ及び１．１ｋＤａであった。一方、卵白リゾチーム、比較品１、比較品２、比較品３及び比較品４のそれは、それぞれ１４．４ｋＤａ、１０．２ｋＤａ、１２．３ｋＤａ及び１４．３ｋＤａであった。これらのことから、卵白リゾチーム及び変性リゾチームと比較して、本発明の抗菌性ペプチド組成物は、低分子化されたペプチド断片であることがわかった。このことから、本発明の抗菌性ペプチド組成物は変性リゾチーム及び卵白リゾチームと異なっていた。
【００４１】
試験例３．抗菌性ペプチド組成物のＨＰＬＣ分析
実施例１〜３で得られた本発明品１〜３の抗菌性ペプチド組成物、比較例１で得られた比較品１の変性リゾチーム及び卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）の逆相カラムによるＨＰＬＣ分析を行った。この時の分析条件は表１に示した。
【００４２】
【表１】
【００４３】
実施例１で得られた本発明品１の抗菌性ペプチド組成物、実施例２で得られた本発明品２の抗菌性ペプチド組成物、実施例３で得られた本発明品３の抗菌性ペプチド組成物、比較例１で得られた比較品１の変性リゾチーム及び卵白リゾチームのＨＰＬＣ分析結果を図１、図２、図３、図４及び図５にそれぞれ示した。
【００４４】
図１〜図５から明らかなように実施例１〜３で得られた本発明品１〜３の抗菌性ペプチド組成物は、比較品１の変性リゾチーム及び卵白リゾチームと比較して、保持時間３０分以内の早い時間にペプチドに由来する複数のピークが検出された。このことから、本発明の抗菌性ペプチド組成物は変性リゾチーム及び卵白リゾチームと異なっていた。
【００４５】
以上、試験例１〜３より、本発明の抗菌性ペプチド組成物と比較品である変性リゾチームでは、酵素活性、平均分子量及び表面の立体構造が異なる結果が得られた。このことから、本発明の抗菌性ペプチド組成物と変性リゾチームはその性質がまったく異なるものであることが明らかとなった。
【００４６】
試験例４．グラム陽性菌に対する抗菌性ペプチド組成物の抗菌活性
実施例１〜３で得られた本発明品１〜３の抗菌性ペプチド組成物、比較例１〜４で得られた比較品１〜４の変性リゾチーム及び卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）のグラム陽性菌に対する抗菌活性を比較した。グラム陽性菌としてはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＩＦＯ１４４６２株を用いた。対数増殖期のＳ．ａｕｒｅｕｓ ＩＦＯ１４４６２を１×１０９細胞／ｍｌとなるように生理的食塩水に懸濁させた。ＢＨＩ液体培地が入っている９６穴マイクロプレートに懸濁液の１００μｌを添加後に各試料を添加した。試料の添加量は、Ｌｏｗｒｙ法（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３巻，２６５（１９５１））で測定したタンパク質濃度として、培地中の終濃度で０．４２ｍｇ／ｍｌになるように添加した。３７℃で１８時間培養後の５７５ｎｍの濁度を測定することで細菌の増殖を調べた。卵白リゾチームの濁度を１００％として、それぞれの濁度を比較した結果、本発明品１、本発明品２及び本発明品３のそれは、それぞれ４３．４％、９８．１％及び２３．４％であった。一方、比較品１、比較品２、比較品３及び比較品４のそれは、それぞれ６２．９％、６３．８％、６６．７％及び６５．５％であった。
【００４７】
これらのことから、本発明品の抗菌性ペプチド組成物のうちでトリプシン分解で得られた本発明品１、ペプシンとトリプシン同時分解で得られた本発明品３の抗菌性ペプチド組成物は、比較品１〜４の変性リゾチーム及び卵白リゾチームと比較して、グラム陽性菌に対して強い抗菌活性を発現した。
【００４８】
試験例５．グラム陰性菌に対する抗菌性ペプチド組成物の抗菌活性
実施例１〜３で得られた本発明品１〜３の抗菌性ペプチド組成物、比較例１〜４で得られた比較品１〜４の変性リゾチーム及び卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）のグラム陰性菌に対する抗菌活性を比較した。グラム陰性菌としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株）を用いた。対数増殖期の大腸菌を１×１０８細胞／ｍｌとなるように生理的食塩水に懸濁させた。マッコンキー液体培地が入っている９６穴マイクロプレートに懸濁液の１００μｌを添加後に各試料を添加した。試料の添加量は、Ｌｏｗｒｙ法（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３巻，２６５（１９５１））で測定したタンパク質濃度として、培地中の終濃度で０．４２ｍｇ／ｍｌになるように添加した。３７℃で１８時間培養後の５７５ｎｍの濁度を測定することで細菌の増殖を調べた。卵白リゾチームの濁度を１００％として、それぞれの濁度を比較した結果、本発明品１、本発明品２及び本発明品３のそれは、それぞれ０％、９５％及び０％であった。一方、比較品１、比較品２、比較品３及び比較品４のそれは、それぞれ４９．５％、５１．３％、５０．９％及び４９．８％であった。
【００４９】
これらのことから、本発明品の抗菌性ペプチド組成物のうちでペプシン分解で得られた本発明品２及びペプシンとトリプシン同時分解で得られた本発明品３の抗菌性ペプチド組成物は、グラム陰性菌に対して抗菌活性を発現し、その強さは比較品１〜４の変性リゾチームよりも強いものであった。また、卵白リゾチームは抗菌活性を全く示さなかった。
【００５０】
実施例７．カスタードクリームへの利用
【００５１】
【表２】
【００５２】
表２に示した処方のカスタードクリームに実施例４で調製した本発明品４、実施例５で調製した本発明品５及び実施例６で調製した本発明品６の抗菌性ペプチド組成物を０．２％添加して、無添加カスタードクリーム、卵白リゾチーム、比較例１で調製した比較品１である変性リゾチームを０．２％添加したカスタードクリームと保存性を比較した。保存温度は室温で行った。保存性は試料中の一般細菌数により評価した。即ち、各試料１ｇを標準寒天培地を用いて３５℃、４８時間インキュベートし、形成されたコロニー数より細菌数を算出した。細菌数は１ｇ当たりのＣＦＵ（コロニー形成単位）で表した。保存試験の結果を表３に示した。
【００５３】
【表３】
【００５４】
表３から、無添加区、卵白リゾチーム添加区、変性リゾチーム添加区と比べ、本発明の抗菌性ペプチド組成物添加区である本発明品４〜５は一般細菌数の増加が抑制されており、日持ち延長効果が認められた。
【００５５】
実施例８．ポテトサラダへの利用
【００５６】
【表４】
【００５７】
実施例４で調製した本発明品４、実施例５で調製した本発明品５及び実施例６で調製した本発明品６の抗菌性ペプチド組成物を０．１５％添加した表４で示したポテトサラダを２８℃で保存した結果、一般細菌数が２日後には本発明の抗菌性ペプチド組成物無添加区では２．５×１０６ＣＦＵ／ｇであったが、本発明の抗菌性ペプチド組成物である本発明品４、本発明品５及び本発明品６を添加したものは、それぞれ６．８×１０４ＣＦＵ／ｇ、４．５×１０３ＣＦＵ／ｇ及び３．２×１０３ＣＦＵ／ｇに菌数が抑えられ、日持ち延長効果が認められた。日持ち延長効果は一般細菌数を測定することにより評価した。具体的には、各試料１ｇを標準寒天培地を用いて３５℃、４８時間インキュベートし、形成されたコロニー数より一般細菌数を算出した。
【００５８】
実施例９．一夜漬けへの利用
野菜（きゅうり、きゃべつ）１ｋｇに対して食塩３０ｇを加え、これに実施例４で調製した本発明品４、実施例５で調製した本発明品５及び実施例６で調製した本発明品６の抗菌性ペプチド組成物を、それぞれ２ｇを添加し、一夜漬けを製造した。冷蔵庫、又は２５℃で４日間保存した後の品質を無添加品と比較し調べた結果、冷蔵庫、２５℃保存品共に本発明の抗菌性ペプチド組成物を添加したものの方が、臭い、外観の劣化はみられず、保存性が向上した。
【００５９】
実施例１０．カット野菜への利用
カット野菜（きゃべつ、にんじん、ごぼう）１０ｋｇを実施例４で調製した本発明品４、実施例５で調製した本発明品５及び実施例６で調製した本発明品６の抗菌性ペプチド組成物０．２％液に１０分間浸漬処理した後、充分に水切りし、ビニール袋に小袋充填した。４℃の冷蔵庫に保存し、２日後に大腸菌群の検出率を調べた結果、検出率は浸漬未処理品に比べ、本発明品４、本発明品５及び本発明品６で処理すると、それぞれ６５％、９４％及び９８％の減少が認められた。大腸菌群はＢＧＬＢ培地法により、３５℃、４８時間培養後判定し、浸漬処理品、未処理品各々２０袋における検出率を比較した。
【００６０】
実施例１１．エビむき身への利用
新鮮なエビむき身５００ｇを実施例６で調製した実施例４で調製した本発明品４、実施例５で調製した本発明品５及び実施例６で調製した本発明品６の抗菌性ペプチド組成物１０％液に５分間浸漬処理した後、充分に水切りし、４℃の冷蔵庫に保存し経時的に品質を検査した。浸漬処理のしなかったものは３日後から官能検査で明らかな異臭と外観の光沢の消失がみられたが、浸漬処理をしたものでは官能検査でも異臭はみられず、新鮮な状態を維持していた。
【００６１】
実施例１２．チューインガムへの利用
ガムベース２０．０ｋｇ、砂糖６０．０ｋｇ、結晶ブドウ糖１８．９ｋｇ、香料１．０ｋｇ、実施例４で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物抗菌剤０．１ｋｇからなるチューインガムを常法により作成した。
【００６２】
実施例１３．養豚用飼料への利用
脱脂粉乳３２．１ｋｇ、小麦粉２９．９ｋｇ、パン粉７．０ｋｇ、大豆粕５．０ｋｇ、魚粉５．０ｋｇ、砂糖４．０ｋｇ、ブドウ糖９．０ｋｇ、油脂２．０ｋｇ、ビタミン・ミネラル類３．０ｋｇ、実施例５で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物１．０ｋｇを混合し、常法により養豚用飼料９８ｋｇを得た。
【００６３】
実施例１４．ブロイラー用飼料への利用
トウモロコシ５８．０ｋｇ、大豆粕１５．９ｋｇ、ふすま５．０ｋｇ、魚粉６．０ｋｇ、アルファルファ３．０ｋｇ、炭酸カルシウム７．０ｋｇ、リン酸カルシウム１．６ｋｇ、食塩０．４ｋｇ、ビタミン・ミネラル類０．１ｋｇ、大豆油２．０ｋｇ、実施例６で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物１．０ｋｇを混合し、常法によりブロイラー用飼料１００ｋｇを得た。
【００６４】
実施例１５．養殖魚用飼料への利用
魚粉６．４ｋｇ、小麦グルテン１．０ｋｇ、デキストリン０．８ｋｇ、ビタミン・ミネラル類０．５ｋｇ、セルロース０．３ｋｇ、タラ肝油０．５ｋｇ、実施例４で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物０．１ｋｇを混合し、湿式造粒後、乾燥し養殖魚用飼料１０．０ｋｇを得た。
【００６５】
実施例１６．美白クリームへの利用
ミツロウ６．０ｋｇ、セタノール５．０ｋｇ、還元ラノリン８．０ｋｇ、スクワラン３７．５ｋｇ、グリセリン脂肪酸エステル６．０ｋｇ、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル２．０ｋｇ、プロピレングリコール５．０ｋｇ、ビタミンＫ０．５ｋｇ、実施例１で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物０．２ｋｇ、香料適量、酸化防止剤適量、精製水を加え全量を１００ｋｇとし、常法により美白クリーム９８ｋｇを得た。
【００６６】
実施例１７．トローチ剤への利用
アラビアガム６．０ｋｇ、ブドウ糖７２．０ｋｇ、モノフルオロリン酸ナトリウム０．７ｋｇ、ゼラチン１．０ｋｇ、乳糖１９．０ｋｇ、香料１．０ｋｇ、実施例２で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物１．５ｋｇ、ステアリン酸マグネシウム適量を混合し、常法によりトローチ剤９９．７ｋｇを得た。
【００６７】
実施例１８．シャンプーへの利用
ラウリル硫酸ナトリウム１０．０ｋｇ、ラウリルスルホコハク酸ナトリウム２０．０ｋｇ、ラウリルジエタノールアミド４．０ｋｇ、加水分解コラーゲン１．０ｋｇ、ジステアリン酸エチレングリコール１．０ｋｇ、エデト酸四ナトリウム四水塩０．１ｋｇ、プロピレングリコール５．０ｋｇ、実施例３で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物０．５ｋｇ、クエン酸、香料適量、精製水を加え全量を１００ｋｇとし、常法によりシャンプー９８．７ｋｇを得た。
【００６８】
実施例１９．飲料への利用
果糖ぶどう糖液糖１５．０ｋｇ、クエン酸０．２ｋｇ、香料、着色料適量、実施例４で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物０．１ｋｇを混合し、常法により飲料１５ｋｇを得た。
【００６９】
実施例２０．かまぼこへの利用
冷凍ヘイクすり身１ｋｇに実施例５で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物５ｇを混合し、空ずりした後、食塩３０ｇを加え塩ずりし、澱粉３０ｇ及び水１００ｇを加えてねり上げ、成型して９０℃、３０分間加熱し、冷却してかまぼこ０．９ｋｇを得た。
【００７０】
実施例２１．魚肉ソーセージへの利用
冷凍スケソウダラすり身１５０ｇ、マグロ挽肉６０ｇ、バレイショ澱粉３５ｇ、食塩２０ｇ、砂糖５ｇ、亜硝酸ナトリウム０．２ｇ、リン酸ナトリウム３ｇ、香辛料を適量加え、サイレントカッターで２分間混合した。これに実施例６で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物１５ｇを加え、さらに３分間混合した。得られた混合物をフィルムケーシングに充填し、８５℃、６０分間の加熱を行い、魚肉ソーセージ２５２ｇを得た。
【００７１】
実施例２２．鶏卵加工品への利用
コーンサラダ油７４．０ｋｇ、全卵液１５．０ｋｇ、リンゴ酢５．０ｋｇ、水２．３ｋｇ、食塩２．０ｋｇ、辛子粉０．５ｋｇ、キサンタンガム０．２ｋｇ、実施例４で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物１．０ｋｇの配合割合で常法により、水中油型のドレッシングを得た。
【００７２】
本発明の他の各種態様を以下に例示する。
（１）リゾチームをトリプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２〜６ｋＤａの範囲であるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物。
（２）リゾチームをトリプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が３．５〜５．５ｋＤａの範囲であるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物。
（３）リゾチームをトリプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が４．５〜５．２ｋＤａの範囲であるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物。
（４）前記（１）〜（３）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物がグラム陽性菌に対するものである抗菌性ペプチド組成物。
（５）リゾチームをペプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２．５ｋＤａ以下の範囲であるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物。
【００７３】
（６）リゾチームをペプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２．０ｋＤａ以下の範囲であるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物。
（７）リゾチームをペプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が１．８ｋＤａ以下の範囲であるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物。
（８）前記（５）〜（７）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物がグラム陰性菌に対するものである抗菌性ペプチド組成物。
（９）リゾチームをペプシン及びトリプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２．５ｋＤａ以下の範囲であるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物。
（１０）リゾチームをペプシン及びトリプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２．０ｋＤａ以下の範囲であるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物。
【００７４】
（１１）リゾチームをペプシン及びトリプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が１．８ｋＤａ以下の範囲であるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物。
（１２）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する医薬。
（１３）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する化粧品。
（１４）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する食品。
（１５）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する飼料。
（１６）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有するシャンプー。
（１７）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有するリンス。
（１８）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する洗口液。
（１９）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する歯磨き剤。
（２０）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する蒲鉾。
【００７５】
（２１）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する麺。
（２２）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有するカスタードクリーム。
（２３）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する漬物。
（２４）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有するソーセージ。
（２５）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有するハム。
【００７６】
（２６）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有するパン。
（２７）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する炊飯米。
（２８）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する鶏卵加工品。
（２９）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する飲料。
【００７７】
【発明の効果】
従来、リゾチームの抗菌活性はグラム陽性菌に対するものとして限定され、その用途目的が限定されていた。本発明における抗菌性ペプチド組成物は、従来のリゾチームが有するグラム陽性菌に対する抗菌活性を増強する効果を有する。また、従来のリゾチームの抗菌スペクトルはグラム陽性菌に限定されていたが、本発明における抗菌性ペプチド組成物はその抗菌スペクトルを拡大する効果を有し、グラム陰性菌に対しても強い抗菌活性を示す。本発明の抗菌性ペプチド組成物は、このような抗菌活性を有する抗菌性ペプチドを有効成分とするものであり、医薬、化粧品、食品、飼料分野等において効果が期待される。
【００７８】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で調製した抗菌性ペプチド組成物のＨＰＬＣ分析結果を示した図である。
【図２】実施例２で調製した抗菌性ペプチド組成物のＨＰＬＣ分析結果を示した図である。
【図３】実施例３で調製した抗菌性ペプチド組成物のＨＰＬＣ分析結果を示した図である。
【図４】変性リゾチームのＨＰＬＣ分析結果を示した図である。
【図５】卵白リゾチームのＨＰＬＣ分析結果を示した図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、リゾチームをプロテアーゼで分解して得られるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物に関する。さらに詳しくは、リゾチームをペプシン及び／又はトリプシンで分解して得られるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リゾチームはムラミダーゼまたはムコペプチドグリコヒドロラーゼとも呼ばれ、細菌の細胞壁のペプチドグリカン層等に存在するＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミン間のβ−１，４−ムラミド結合を加水分解する酵素蛋白質である。リゾチームは動植物界に広く分布し、現在、哺乳動物の涙、唾液、尿、乳、鳥類の卵中の卵白、魚類の体表粘液、微生物、バクテリオファージＴ４等に由来するリゾチームが知られている。
【０００３】
リゾチームは、古くから抗菌活性を有することが知られているが、この抗菌作用はリゾチームの酵素作用により細菌の細胞壁が切断され、細菌が溶菌することによるものである。なかでも鶏卵の卵白由来のリゾチームは大量製造が可能であり、その抗菌活性を利用して医薬、化粧品、食品、飼料分野等において、抗炎症剤、防腐剤、鮮度保持剤、抗菌剤、殺菌剤等として利用されている。
【０００４】
リゾチームの抗菌活性は、特にグラム陽性菌に対して活性を示し、グラム陰性菌に対しては、ほとんど抗菌活性がないことが知られている。グラム陽性菌はグラム染色により、紫色に染色される細菌で、球菌（ミクロコッカス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属等）、胞子形成桿菌（バチルス属、クロストリジウム属等）、乳酸菌（ラクトバチルス属等）、コリネフォーム細菌（コリネバクテリウム属、ノカルディア属等）、放線菌（ストレプトマイセス属等）、等が知られている。その細胞壁は２０〜８０ｎｍの厚いペプチドグリカン層より構成され、リゾチームに対する感受性が高い。即ち、リゾチームは容易にペプチドグリカン層を加水分解し、グラム陽性菌を溶菌させる作用を示す。
【０００５】
一方、グラム陰性菌はグラム染色で染色されない細菌で、光合成細菌（ロドシュードモナス属等）、シュードモナス属細菌、腸内細菌群（エシェリヒア属、サルモネラ属等）、化学無機栄養細菌（ニトロバクター属、チオバチルス属等）、メタン生成細菌、および一部の球菌（ニセリア属等）等が知られている。その細胞の表層は細胞膜（内膜）の外側に２〜３ｎｍ程度の薄いペプチドグリカン層があり、さらにその外側にリポ多糖を含む外膜を有する。このためリゾチームは、容易にペプチドグリカン層を切断することができず、エチレンジアミン四酢酸等を用いて外膜に損傷を与えない限りリゾチーム感受性にはならない。
【０００６】
このようにリゾチームは、グラム陽性菌に対しては抗菌活性を示すものの、グラム陰性菌に対しては、ほとんど抗菌活性がないため、その用途はグラム陽性菌の増殖抑制を目的とした食品の日持ち向上剤、化粧品の防腐剤、抗炎症医薬品等に限定されている。しかし、これらの用途においては、グラム陽性菌よりもむしろ人や動物の生活や健康により悪影響を及ぼす大腸菌、サルモネラ菌などのグラム陰性菌の増殖を抑制することの方がより重要であるといわれている。
【０００７】
また、リゾチームのグラム陰性菌に対する抗菌活性に関しても医薬、化粧品、食品、飼料分野等では、添加量の低減等が実施できる等の理由により、さらに強い活性を発現させることが望まれている。
【０００８】
ところで、リゾチームの有する抗菌活性を、グラム陽性菌のみならずグラム陰性菌にも作用するようにする試み、即ちリゾチームの抗菌スペクトルを拡大する試みがいくつか報告されている。たとえば、メイラード反応を利用しデキストラン等の多糖類を結合させた修飾リゾチームが、５０℃、３０分間の加熱条件下でグラム陰性菌に対して抗菌活性を持つことが開示されている（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４巻，３０５７−３０５９頁，１９９０年）。また、パルミチン酸（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，３９巻，２０７７−２０８２頁，１９９１年）、ステアリン酸、ミリスチン酸（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．，４１巻，１１６４−１１６８頁，１９９３年）等の脂肪酸を結合させた修飾リゾチームや、遺伝子操作技術によりリゾチームのＣ末端に疎水性ペプチドを導入して得られた修飾リゾチーム（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６巻，１３６１−１３６３頁，１９９２年）が、グラム陰性菌に対して強い抗菌活性を持つことが開示されている。特開平８−２７０２７号には、加熱処理、高圧力処理、酸処理、アルカリ処理、有機溶剤処理、界面活性剤処理、酸化処理及び酵素処理を単独あるいは併用することでリゾチームの立体構造を変化させてグラム陽性菌及びグラム陰性菌に対して抗菌活性を持たせることを特徴とする抗菌性組成物の製造方法、並びに当該変性リゾチームを有効成分とする抗菌剤、及び当該抗菌剤を含有する医薬、化粧品、食品及び飼料に関する技術が開示されている。
【０００９】
しかしながら、これら従来法は、グラム陰性菌に対して、有効な抗菌活性を示すためには、グラム陰性菌に対して５０℃の加熱処理を必要とする、脂肪酸の結合や立体構造の変性によりリゾチームの溶解性が著しく悪くなる、非常に煩雑な遺伝子操作技術や化学合成法を用いる等の問題点があり、実用的なものではなかった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、リゾチームをプロテアーゼで処理して得られるペプチド類を有効成分とするグラム陰性菌およびグラム陽性菌に対して優れた抗菌活性を有する抗菌性ペプチド組成物を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、リゾチームのグラム陽性菌に対する抗菌活性を増加させること、並びにグラム陰性菌に対しても抗菌活性を発現させることについて、鋭意検討した結果、リゾチームをトリプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２〜６ｋＤａの範囲であるペプチド類がグラム陽性菌に対する抗菌活性を示すこと、ペプシンで分解して得られるＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２．５ｋＤａ以下の範囲であるペプチド類がグラム陰性菌に対してリゾチームより強い抗菌活性を示すこと、トリプシン及びペプシンを併用することで、それぞれのタンパク質分解酵素単独で処理することよりも抗菌活性が増加することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
また、本発明によって得られた抗菌性ペプチド組成物にはリゾチームの抗菌作用であるムラミダーゼまたはムコペプチドヒドロラーゼ活性は消失し、リゾチームのプロテアーゼ分解により得られたペプチド類による抗菌活性、つまり、リゾチームと異なる新しい機構で抗菌活性を示すことを見出した。
【００１３】
すなわち本発明は、（１）リゾチームをトリプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２〜６ｋＤａの範囲であるペプチド類を有効成分とするグラム陽性菌に対する抗菌性ペプチド組成物、（２）リゾチームをペプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２．５ｋＤａ以下の範囲であるペプチド類を有効成分とするグラム陰性菌に対する抗菌性ペプチド組成物、（３）リゾチームをトリプシン及びペプシンで同時に分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２．５ｋＤａ以下の範囲であるペプチド類を有効成分とするグラム陽性菌及び陰性菌に対する抗菌性ペプチド組成物の前記（１）〜（３）いずれかの抗菌性ペプチド組成物に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明におけるリゾチームとは、Ｎ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミン間のβ−１，４−ムラミド結合を加水分解する酵素蛋白質をいい、人由来、卵白由来、魚類の体表粘液由来、微生物由来、バクテリオファージ由来等の各種由来の精製リゾチーム、またリゾチーム遺伝子を利用して遺伝子操作技術により調製されたリゾチームが知られている。また、鶏卵卵白由来のリゾチームの平均分子量は１４．３〜１４．６ｋＤａであることが知られている。
【００１５】
従来技術にある変性リゾチームとは、リゾチームの酵素蛋白質の活性は失活していないが、リゾチームの蛋白質としての立体構造が変化したものを指す。リゾチーム蛋白質の立体構造の変化とは、本来、リゾチーム蛋白質が有する立体構造が変化することを指す。特開平８−２７０２７号記載の蛋白質の立体構造が変化した変性リゾチーム含有抗菌剤では、加熱処理、高圧力処理、酸処理、アルカリ処理、有機溶剤処理、界面活性剤処理、酸化処理及び酵素処理を単独あるいは併用することでリゾチームの立体構造を変化させることで、グラム陽性菌、陰性菌、特にグラム陰性菌の細胞膜に対してリゾチームより強い親和性を示し、容易に結合することにより、細胞膜の物質の能動輸送などに障害を与えることにより抗菌性を示すことが開示されている。また、特開平８−２７０２７号では、リゾチームの立体構造を変化させるために酵素処理を利用する場合には、トリプシン、キモトリプシン、プロナーゼ及びパパインなどの蛋白分解酵素を添加してリゾチームを変性させるが、これはリゾチームの酵素活性を維持しながら、立体構造のみを変化させる技術が開示されているにすぎない。つまり、酵素処理の時間は極めて短時間であり、本発明の抗菌性ペプチド組成物と比較して平均分子量や抗菌活性の機構が全く異なる。すなわち、変性リゾチームはリゾチームの酵素活性を有し、平均分子量は本発明の抗菌性ペプチド組成物と比較して大きいものであり、本発明の抗菌性ペプチド組成物とは全く異なる技術である。
【００１６】
本発明におけるペプチド類とはトリプシン及び／又はペプシンにより分解されて得られるペプチドの混合物を意味する。
【００１７】
本発明における抗菌性ペプチド組成物とは、リゾチームをトリプシンで分解することにより得られるペプチド類を有効成分とするグラム陽性菌に対する抗菌性ペプチド組成物、（２）リゾチームをペプシンで分解することで得られたペプチド類を有効成分とするグラム陰性菌に対する抗菌性ペプチド組成物、（３）リゾチームをトリプシン及びペプシンで同時に分解することにより得られたペプチド類を有効成分とするグラム陽性菌及び陰性菌に対する抗菌性ペプチド組成物の前記（１）〜（３）いずれかの抗菌性ペプチド組成物を指す。
【００１８】
本発明の抗菌性ペプチド組成物は、リゾチーム及び変性リゾチームが有するＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミン間のβ−１，４−ムラミド結合を加水分解する酵素蛋白質としての活性（溶菌活性）が消失し、いわゆるリゾチームの溶菌作用とは別の作用により抗菌活性が発現されたものを指す。従って、本発明の抗菌性ペプチド組成物の抗菌活性は、従来のリゾチームの細菌に対する作用機序とは異なる技術である。
【００１９】
本発明におけるトリプシンとは、酵素番号（ＥＣ Ｎｕｍｂｅｒ）がＥＣ３．４．２１．４のプロテアーゼを指し、ウシ膵臓、ブタ膵臓、遺伝子組換え技術により生産されたもの等を用いることができ、その由来は限定されない。
【００２０】
本発明におけるペプシンとは、酵素番号（ＥＣ Ｎｕｍｂｅｒ）がＥＣ３．４．２３．１のプロテアーゼを指し、ウシ胃、ブタ胃、遺伝子組換え技術により生産されたもの等を用いることができ、その由来は限定されない。
【００２１】
本発明における抗菌性ペプチド組成物を得るためのトリプシンでの分解、ペプシンでの分解及びトリプシンとペプシンの同時分解における温度及びｐＨは使用される酵素の至適作用範囲内であれば特に問題はない。また、処理時間及び酵素の量は使用される酵素の比活性の強さに合わせて適宜選択できる。例えば、比活性が６０００〜１５０００ ＢＡＥＥ ｕｎｉｔｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎのウシ膵臓由来のトリプシンで分解する場合、１／２０〜１／３０の酵素量でｐＨ７．０〜９．０、好ましくはｐＨ７．５〜８．５で、温度２０〜５０℃、好ましくは温度３０〜４５℃、処理時間５〜３０時間、好ましくは１０〜２０時間の処理により得ることができる。また、比活性が６００〜４５００ ｕｎｉｔｓ／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎのブタ胃粘膜由来のペプシンで分解する場合、１／２０〜１／３０の酵素量でｐＨ０．５〜２．０、好ましくはｐＨ０．８〜１．５、温度２０〜５０℃、好ましくは温度３０〜４５℃、処理時間２０〜９０分、好ましくは、４５〜８５分の処理により得ることができる。トリプシン及びペプシンの同時に分解する場合は、例えば上述のペプシンでの分解を行い、中和後にトリプシンで分解することにより得ることができるが、ペプシンでの分解とトリプシンでの分解の順序は特に限定されない。
【００２２】
本発明における抗菌性ペプチド組成物の平均分子量は、トリプシンで分解して得られるペプチド類では２．０〜６．０ｋＤａ、好ましくは３．５〜５．５ｋＤａ、さらに好ましくは４．０〜５．２ｋＤａであり、ペプシンで分解して得られるペプチド類及びトリプシンとペプシンの同時分解で得られるペプチド類では２．５ｋＤａ以下、好ましくは２．０ｋＤａ以下、さらに好ましくは１．８ｋＤａ以下である。
【００２３】
本発明における抗菌性ペプチド組成物の平均分子量の測定方法は、特に限定されないが、ゲルロ過法、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法及び超遠心法等があげられるが、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法が好ましい。
【００２４】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法での測定方法は特に限定されないが、例えば、０．１％ＳＤＳを含む１０％アクリルアミド分離ゲルと３％固定ゲルを用いたＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０，１９７０年）等があげられる。
【００２５】
本発明の抗菌性ペプチド組成物、リゾチーム及び変性リゾチームの相違は、上記に記載したリゾチームの有する酵素活性及び平均分子量以外に逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析からも確認することができる。例えば、展開溶媒をＡ溶媒に０．０９％ トリフロオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液、Ｂ溶媒に０．０８５％ ＴＦＡ−アセトリトリル溶液を用いてＡ溶媒の０〜４０％の直線グラジエントによるＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣの分析が例示できる。
【００２６】
本発明の抗菌性ペプチド組成物は、単独で使用、または他の成分と併用して使用しても問題はない。その形態については、溶液、粉末のいずれでもよい。粉末化の方法としては、熱風乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥等、通常の公知の粉末化方法を用いればよい。
【００２７】
本発明の抗菌性ペプチド組成物は、医薬、化粧品、食品、飼料等に添加して抗菌、防腐等を目的として使用することができる。例えば、抗炎症や抗菌を目的とした医薬品、虫歯の原因菌の抑制を目的とした洗口液や歯磨き剤等の医薬部外品として、フケの原因菌の抑制を目的としたシャンプーやリンス等の化粧品として、腐敗防止や殺菌を目的とした生鮮野菜、鮮魚、蒲鉾、カスタードクリーム、漬物、ソーセージ、ハム、炊飯米、鶏卵加工品等の食品の日持ち向上剤として、家畜や水産動物の疾病予防を目的とした飼料添加剤や動物医薬品としての利用が可能である。また、食品用の機械、器具、包丁、まな板などの調理器具の殺菌及び手指の消毒、室内殺菌などに、噴霧または浸漬することにより使用することができる。
【００２８】
これらの目的に使用する本発明の抗菌性ペプチド組成物の配合量は、特に限定されるものではないが、通常０．００５重量％以上、好ましくは０．０１重量％以上となるように、各種用途に応じてその使用量を適宜変える事ができる。
以下本願発明の実施例について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２９】
【実施例】
実施例１
１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１リットルに卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）を０．５％の濃度となるよう５ｇを溶解し、リゾチーム溶液１リットルを調製した。このリゾチーム溶液にトリプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ウシ膵臓由来、Ｔｙｐｅ Ｉ）を０．０２％になるように０．２ｇ添加し、３７℃で１５時間放置し、トリプシンで分解した。そして９５℃で１０分間放置してトリプシンを失活させた。速やかに冷却後、卓上型遠心分離機で遠心分離（３０００ｇ、１０分間）し、上清９９５ｍｌを集め、本発明の抗菌性ペプチド組成物（本発明品１）９９０ｇを得た。
【００３０】
実施例２
０．１５Ｎ塩酸１リットルに卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）５ｇを０．５％の濃度となるよう溶解し、リゾチーム溶液１リットルを調製した。このリゾチーム溶液にペプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ブタ胃粘膜由来）を０．０２％になるように０．２ｇ添加し、３７℃で１時間放置し、ペプシンで分解した。そして、０．１Ｎ水酸化ナトリウムで中和（ｐＨ７．０に調整）後、９５℃で１０分間放置してペプシンを失活させた。速やかに冷却後、卓上型遠心分離機で遠心分離（３０００ｇ、１０分間）し、上清９９５ｍｌを集め、本発明の抗菌性ペプチド組成物（本発明品２）９９０ｇを得た。
【００３１】
実施例３
０．１５Ｎ塩酸１リットルに卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）を０．５％の濃度となるよう５ｇ溶解し、リゾチーム溶液１リットルを調製した。このリゾチーム溶液にペプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ブタ胃粘膜由来）を０．０２％になるように０．２ｇ添加し、３７℃で１時間放置し、ペプシンで分解した。そして、０．１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整した後、トリプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ウシ膵臓由来、Ｔｙｐｅ Ｉ）を０．０２％になるように０．２ｇ添加し、３７℃で１５時間放置し、トリプシンで分解した。そして９５℃で１０分間放置してペプシン及びトリプシンを失活させた。速やかに冷却後、卓上型遠心分離機で遠心分離（３０００ｇ、１０分間）し、上清９９７ｍｌを集め、本発明の抗菌性ペプチド組成物（本発明品３）９９１ｇを得た。
【００３２】
実施例４
卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）１ｋｇを１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００リットルに溶解した後、トリプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ウシ膵臓由来、Ｔｙｐｅ Ｉ）４０ｇを添加した。その溶液を攪拌しながら液温を３７±２℃で１５時間放置し、トリプシンで分解した。その後、９０℃で１０分間放置してトリプシンを失活させた。速やかに冷却した後、ロ過してロ液を得た。得られたロ液をスプレードライ法（熱風温度１５０℃、排風温度８０℃）で粉末化し、本発明の抗菌性ペプチド組成物（本発明品４）を９６０ｇ得た。
【００３３】
実施例５
卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）１ｋｇを０．１５Ｎ塩酸１００リットルに溶解した後、ペプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ブタ胃粘膜由来）４０ｇを添加した。その溶液を攪拌しながら液温を３７±２℃で１時間放置し、ペプシンで分解した。そして、０．１Ｎ水酸化ナトリウムで中和後、９０℃で１０分間放置してトリプシンを失活させた。速やかに冷却した後、ロ過してロ液を得た。得られたロ液をスプレードライ法（熱風温度１５０℃、排風温度８０℃）で粉末化し、本発明の抗菌性ペプチド組成物（本発明品５）を９６５ｇ得た。
【００３４】
実施例６
卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）１ｋｇを０．１５Ｎ塩酸１００リットルに溶解した後、ペプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ブタ胃粘膜由来）４０ｇを添加した。その溶液を攪拌しながら液温を３７±２℃で１時間放置し、ペプシンで分解した。そして、０．１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整した後、トリプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ウシ膵臓由来、Ｔｙｐｅ Ｉ）４０ｇを添加した。その溶液を攪拌しながら液温を３７±２℃で１５時間放置し、トリプシンで分解した。その後、９０℃で１０分間放置してペプシン及びトリプシンを失活させた。速やかに冷却した後、ロ過してロ液を得た。得られたロ液をスプレードライ法（熱風温度１５０℃、排風温度８０℃）で粉末化し、本発明の抗菌性ペプチド組成物（本発明品６）を９７８ｇ得た。
【００３５】
比較例１
１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１リットルに卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）を０．５％の濃度となるよう５ｇ溶解し、リゾチーム溶液１リットルを調製した。このリゾチーム溶液にトリプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ウシ膵臓由来、Ｔｙｐｅ Ｉ）を０．０２％になるように０．２ｇ添加し、３７℃で３時間放置し、トリプシンでリゾチームを変性させた。ゲルロ過によりトリプシン画分を除去して変性リゾチーム（比較品１）３．４ｇを得た。
【００３６】
比較例２
０．１５Ｎ塩酸１リットルに卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）５ｇを０．５％の濃度となるよう溶解し、リゾチーム溶液１リットルを調製した。このリゾチーム溶液にペプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ブタ胃粘膜由来）０．２ｇを０．０２％になるように添加し、３７℃で０．５時間放置し、ペプシンでリゾチームを変性させた。ゲルロ過によりペプシン画分を除去して変性リゾチーム（比較品２）３．０ｇを得た。
【００３７】
比較例３
イオン交換水１リットルに卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）５ｇを０．５％の濃度となるよう溶解し、リゾチーム溶液１リットルを調製した。５０ｍｇのキモトリプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ウシ膵臓由来、Ｔｙｐｅ Ｉ−ｓ）を添加後、水酸化ナトリウムでｐＨ１０に調整後、２０℃で２時間放置し、キモトリプシンでリゾチームを変性させた。ゲルロ過によりキモトリプシン画分を除去して変性リゾチーム（比較品３）３．８ｇを得た。
【００３８】
比較例４
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１リットルに卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）５ｇを０．０５％の濃度となるよう溶解した。このリゾチーム溶液を９０℃で２０分間放置した後、氷冷水中で冷却することによりリゾチームを変性させ、変性リゾチーム（比較品４）４．２ｇを得た。
【００３９】
試験例１．抗菌性ペプチド組成物の酵素活性の測定
実施例１〜３で得られた本発明品１〜３の抗菌性ペプチド組成物、比較例１〜４で得られた比較品１〜４の変性リゾチーム及び卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）の酵素活性の比較を行った。リゾチームの酵素活性はミクロコッカス・リゾデイクティカス（Ｍ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）菌体に対する溶菌活性で比較した。それぞれの試料をＬｏｗｒｙ法（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３巻，２６５（１９５１））で測定して最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）に懸濁した菌体液（初期濁度Ａ６００ｎｍ＝０．７５〜０．８０）に添加し、２５℃でその濁度変化を測定した。卵白リゾチームの濁度変化量を１００％とした場合、実施例１〜３で得られた抗菌性ペプチド組成物（本発明品１〜３）のそれは、いずれも０％であった。一方、比較例１〜４で得られた変性リゾチーム（比較品１〜４）のそれはそれぞれ７３％、７０％、６９％及び１４％であった。これらのことから、本発明の抗菌性ペプチド組成物は、リゾチームの酵素活性が認められないことが明らかとなった。このことから、本発明の抗菌性ペプチド組成物は変性リゾチーム及び卵白リゾチームと異なっていた。
【００４０】
試験例２．抗菌性ペプチド組成物の平均分子量測定
実施例１〜３で得られた本発明品１〜３の抗菌性ペプチド組成物、比較例１〜４で得られた比較品１〜４の変性リゾチーム及び卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）の平均分子量を測定した。平均分子量は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した（０．１％ＳＤＳを含む１０％アクリルアミド分離ゲルと３％固定ゲルを用いてＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０，１９７０年）に準じて行った）。その結果、本発明品１、本発明品２及び本発明品３の平均分子量は、それぞれ４．７ｋＤａ、１．１ｋＤａ及び１．１ｋＤａであった。一方、卵白リゾチーム、比較品１、比較品２、比較品３及び比較品４のそれは、それぞれ１４．４ｋＤａ、１０．２ｋＤａ、１２．３ｋＤａ及び１４．３ｋＤａであった。これらのことから、卵白リゾチーム及び変性リゾチームと比較して、本発明の抗菌性ペプチド組成物は、低分子化されたペプチド断片であることがわかった。このことから、本発明の抗菌性ペプチド組成物は変性リゾチーム及び卵白リゾチームと異なっていた。
【００４１】
試験例３．抗菌性ペプチド組成物のＨＰＬＣ分析
実施例１〜３で得られた本発明品１〜３の抗菌性ペプチド組成物、比較例１で得られた比較品１の変性リゾチーム及び卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）の逆相カラムによるＨＰＬＣ分析を行った。この時の分析条件は表１に示した。
【００４２】
【表１】
実施例１で得られた本発明品１の抗菌性ペプチド組成物、実施例２で得られた本発明品２の抗菌性ペプチド組成物、実施例３で得られた本発明品３の抗菌性ペプチド組成物、比較例１で得られた比較品１の変性リゾチーム及び卵白リゾチームのＨＰＬＣ分析結果を図１、図２、図３、図４及び図５にそれぞれ示した。
【００４４】
図１〜図５から明らかなように実施例１〜３で得られた本発明品１〜３の抗菌性ペプチド組成物は、比較品１の変性リゾチーム及び卵白リゾチームと比較して、保持時間３０分以内の早い時間にペプチドに由来する複数のピークが検出された。このことから、本発明の抗菌性ペプチド組成物は変性リゾチーム及び卵白リゾチームと異なっていた。
【００４５】
以上、試験例１〜３より、本発明の抗菌性ペプチド組成物と比較品である変性リゾチームでは、酵素活性、平均分子量及び表面の立体構造が異なる結果が得られた。このことから、本発明の抗菌性ペプチド組成物と変性リゾチームはその性質がまったく異なるものであることが明らかとなった。
【００４６】
試験例４．グラム陽性菌に対する抗菌性ペプチド組成物の抗菌活性
実施例１〜３で得られた本発明品１〜３の抗菌性ペプチド組成物、比較例１〜４で得られた比較品１〜４の変性リゾチーム及び卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）のグラム陽性菌に対する抗菌活性を比較した。グラム陽性菌としてはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＩＦＯ１４４６２株を用いた。対数増殖期のＳ．ａｕｒｅｕｓ ＩＦＯ１４４６２を１×１０９細胞／ｍｌとなるように生理的食塩水に懸濁させた。ＢＨＩ液体培地が入っている９６穴マイクロプレートに懸濁液の１００μｌを添加後に各試料を添加した。試料の添加量は、Ｌｏｗｒｙ法（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３巻，２６５（１９５１））で測定したタンパク質濃度として、培地中の終濃度で０．４２ｍｇ／ｍｌになるように添加した。３７℃で１８時間培養後の５７５ｎｍの濁度を測定することで細菌の増殖を調べた。卵白リゾチームの濁度を１００％として、それぞれの濁度を比較した結果、本発明品１、本発明品２及び本発明品３のそれは、それぞれ４３．４％、９８．１％及び２３．４％であった。一方、比較品１、比較品２、比較品３及び比較品４のそれは、それぞれ６２．９％、６３．８％、６６．７％及び６５．５％であった。
【００４７】
これらのことから、本発明品の抗菌性ペプチド組成物のうちでトリプシン分解で得られた本発明品１、ペプシンとトリプシン同時分解で得られた本発明品３の抗菌性ペプチド組成物は、比較品１〜４の変性リゾチーム及び卵白リゾチームと比較して、グラム陽性菌に対して強い抗菌活性を発現した。
【００４８】
試験例５．グラム陰性菌に対する抗菌性ペプチド組成物の抗菌活性
実施例１〜３で得られた本発明品１〜３の抗菌性ペプチド組成物、比較例１〜４で得られた比較品１〜４の変性リゾチーム及び卵白リゾチーム（太陽化学（株）製、リゾチーム太陽）のグラム陰性菌に対する抗菌活性を比較した。グラム陰性菌としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株）を用いた。対数増殖期の大腸菌を１×１０８細胞／ｍｌとなるように生理的食塩水に懸濁させた。マッコンキー液体培地が入っている９６穴マイクロプレートに懸濁液の１００μｌを添加後に各試料を添加した。試料の添加量は、Ｌｏｗｒｙ法（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３巻，２６５（１９５１））で測定したタンパク質濃度として、培地中の終濃度で０．４２ｍｇ／ｍｌになるように添加した。３７℃で１８時間培養後の５７５ｎｍの濁度を測定することで細菌の増殖を調べた。卵白リゾチームの濁度を１００％として、それぞれの濁度を比較した結果、本発明品１、本発明品２及び本発明品３のそれは、それぞれ０％、９５％及び０％であった。一方、比較品１、比較品２、比較品３及び比較品４のそれは、それぞれ４９．５％、５１．３％、５０．９％及び４９．８％であった。
【００４９】
これらのことから、本発明品の抗菌性ペプチド組成物のうちでペプシン分解で得られた本発明品２及びペプシンとトリプシン同時分解で得られた本発明品３の抗菌性ペプチド組成物は、グラム陰性菌に対して抗菌活性を発現し、その強さは比較品１〜４の変性リゾチームよりも強いものであった。また、卵白リゾチームは抗菌活性を全く示さなかった。
【００５０】
実施例７．カスタードクリームへの利用
【００５１】
【表２】
表２に示した処方のカスタードクリームに実施例４で調製した本発明品４、実施例５で調製した本発明品５及び実施例６で調製した本発明品６の抗菌性ペプチド組成物を０．２％添加して、無添加カスタードクリーム、卵白リゾチーム、比較例１で調製した比較品１である変性リゾチームを０．２％添加したカスタードクリームと保存性を比較した。保存温度は室温で行った。保存性は試料中の一般細菌数により評価した。即ち、各試料１ｇを標準寒天培地を用いて３５℃、４８時間インキュベートし、形成されたコロニー数より細菌数を算出した。細菌数は１ｇ当たりのＣＦＵ（コロニー形成単位）で表した。保存試験の結果を表３に示した。
【００５３】
【表３】
表３から、無添加区、卵白リゾチーム添加区、変性リゾチーム添加区と比べ、本発明の抗菌性ペプチド組成物添加区である本発明品４〜５は一般細菌数の増加が抑制されており、日持ち延長効果が認められた。
【００５５】
実施例８．ポテトサラダへの利用
【００５６】
【表４】
実施例４で調製した本発明品４、実施例５で調製した本発明品５及び実施例６で調製した本発明品６の抗菌性ペプチド組成物を０．１５％添加した表４で示したポテトサラダを２８℃で保存した結果、一般細菌数が２日後には本発明の抗菌性ペプチド組成物無添加区では２．５×１０６ＣＦＵ／ｇであったが、本発明の抗菌性ペプチド組成物である本発明品４、本発明品５及び本発明品６を添加したものは、それぞれ６．８×１０４ＣＦＵ／ｇ、４．５×１０３ＣＦＵ／ｇ及び３．２×１０３ＣＦＵ／ｇに菌数が抑えられ、日持ち延長効果が認められた。日持ち延長効果は一般細菌数を測定することにより評価した。具体的には、各試料１ｇを標準寒天培地を用いて３５℃、４８時間インキュベートし、形成されたコロニー数より一般細菌数を算出した。
【００５８】
実施例９．一夜漬けへの利用
野菜（きゅうり、きゃべつ）１ｋｇに対して食塩３０ｇを加え、これに実施例４で調製した本発明品４、実施例５で調製した本発明品５及び実施例６で調製した本発明品６の抗菌性ペプチド組成物を、それぞれ２ｇを添加し、一夜漬けを製造した。冷蔵庫、又は２５℃で４日間保存した後の品質を無添加品と比較し調べた結果、冷蔵庫、２５℃保存品共に本発明の抗菌性ペプチド組成物を添加したものの方が、臭い、外観の劣化はみられず、保存性が向上した。
【００５９】
実施例１０．カット野菜への利用
カット野菜（きゃべつ、にんじん、ごぼう）１０ｋｇを実施例４で調製した本発明品４、実施例５で調製した本発明品５及び実施例６で調製した本発明品６の抗菌性ペプチド組成物０．２％液に１０分間浸漬処理した後、充分に水切りし、ビニール袋に小袋充填した。４℃の冷蔵庫に保存し、２日後に大腸菌群の検出率を調べた結果、検出率は浸漬未処理品に比べ、本発明品４、本発明品５及び本発明品６で処理すると、それぞれ６５％、９４％及び９８％の減少が認められた。大腸菌群はＢＧＬＢ培地法により、３５℃、４８時間培養後判定し、浸漬処理品、未処理品各々２０袋における検出率を比較した。
【００６０】
実施例１１．エビむき身への利用
新鮮なエビむき身５００ｇを実施例６で調製した実施例４で調製した本発明品４、実施例５で調製した本発明品５及び実施例６で調製した本発明品６の抗菌性ペプチド組成物１０％液に５分間浸漬処理した後、充分に水切りし、４℃の冷蔵庫に保存し経時的に品質を検査した。浸漬処理のしなかったものは３日後から官能検査で明らかな異臭と外観の光沢の消失がみられたが、浸漬処理をしたものでは官能検査でも異臭はみられず、新鮮な状態を維持していた。
【００６１】
実施例１２．チューインガムへの利用
ガムベース２０．０ｋｇ、砂糖６０．０ｋｇ、結晶ブドウ糖１８．９ｋｇ、香料１．０ｋｇ、実施例４で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物抗菌剤０．１ｋｇからなるチューインガムを常法により作成した。
【００６２】
実施例１３．養豚用飼料への利用
脱脂粉乳３２．１ｋｇ、小麦粉２９．９ｋｇ、パン粉７．０ｋｇ、大豆粕５．０ｋｇ、魚粉５．０ｋｇ、砂糖４．０ｋｇ、ブドウ糖９．０ｋｇ、油脂２．０ｋｇ、ビタミン・ミネラル類３．０ｋｇ、実施例５で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物１．０ｋｇを混合し、常法により養豚用飼料９８ｋｇを得た。
【００６３】
実施例１４．ブロイラー用飼料への利用
トウモロコシ５８．０ｋｇ、大豆粕１５．９ｋｇ、ふすま５．０ｋｇ、魚粉６．０ｋｇ、アルファルファ３．０ｋｇ、炭酸カルシウム７．０ｋｇ、リン酸カルシウム１．６ｋｇ、食塩０．４ｋｇ、ビタミン・ミネラル類０．１ｋｇ、大豆油２．０ｋｇ、実施例６で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物１．０ｋｇを混合し、常法によりブロイラー用飼料１００ｋｇを得た。
【００６４】
実施例１５．養殖魚用飼料への利用
魚粉６．４ｋｇ、小麦グルテン１．０ｋｇ、デキストリン０．８ｋｇ、ビタミン・ミネラル類０．５ｋｇ、セルロース０．３ｋｇ、タラ肝油０．５ｋｇ、実施例４で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物０．１ｋｇを混合し、湿式造粒後、乾燥し養殖魚用飼料１０．０ｋｇを得た。
【００６５】
実施例１６．美白クリームへの利用
ミツロウ６．０ｋｇ、セタノール５．０ｋｇ、還元ラノリン８．０ｋｇ、スクワラン３７．５ｋｇ、グリセリン脂肪酸エステル６．０ｋｇ、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル２．０ｋｇ、プロピレングリコール５．０ｋｇ、ビタミンＫ０．５ｋｇ、実施例１で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物０．２ｋｇ、香料適量、酸化防止剤適量、精製水を加え全量を１００ｋｇとし、常法により美白クリーム９８ｋｇを得た。
【００６６】
実施例１７．トローチ剤への利用
アラビアガム６．０ｋｇ、ブドウ糖７２．０ｋｇ、モノフルオロリン酸ナトリウム０．７ｋｇ、ゼラチン１．０ｋｇ、乳糖１９．０ｋｇ、香料１．０ｋｇ、実施例２で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物１．５ｋｇ、ステアリン酸マグネシウム適量を混合し、常法によりトローチ剤９９．７ｋｇを得た。
【００６７】
実施例１８．シャンプーへの利用
ラウリル硫酸ナトリウム１０．０ｋｇ、ラウリルスルホコハク酸ナトリウム２０．０ｋｇ、ラウリルジエタノールアミド４．０ｋｇ、加水分解コラーゲン１．０ｋｇ、ジステアリン酸エチレングリコール１．０ｋｇ、エデト酸四ナトリウム四水塩０．１ｋｇ、プロピレングリコール５．０ｋｇ、実施例３で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物０．５ｋｇ、クエン酸、香料適量、精製水を加え全量を１００ｋｇとし、常法によりシャンプー９８．７ｋｇを得た。
【００６８】
実施例１９．飲料への利用
果糖ぶどう糖液糖１５．０ｋｇ、クエン酸０．２ｋｇ、香料、着色料適量、実施例４で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物０．１ｋｇを混合し、常法により飲料１５ｋｇを得た。
【００６９】
実施例２０．かまぼこへの利用
冷凍ヘイクすり身１ｋｇに実施例５で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物５ｇを混合し、空ずりした後、食塩３０ｇを加え塩ずりし、澱粉３０ｇ及び水１００ｇを加えてねり上げ、成型して９０℃、３０分間加熱し、冷却してかまぼこ０．９ｋｇを得た。
【００７０】
実施例２１．魚肉ソーセージへの利用
冷凍スケソウダラすり身１５０ｇ、マグロ挽肉６０ｇ、バレイショ澱粉３５ｇ、食塩２０ｇ、砂糖５ｇ、亜硝酸ナトリウム０．２ｇ、リン酸ナトリウム３ｇ、香辛料を適量加え、サイレントカッターで２分間混合した。これに実施例６で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物１５ｇを加え、さらに３分間混合した。得られた混合物をフィルムケーシングに充填し、８５℃、６０分間の加熱を行い、魚肉ソーセージ２５２ｇを得た。
【００７１】
実施例２２．鶏卵加工品への利用
コーンサラダ油７４．０ｋｇ、全卵液１５．０ｋｇ、リンゴ酢５．０ｋｇ、水２．３ｋｇ、食塩２．０ｋｇ、辛子粉０．５ｋｇ、キサンタンガム０．２ｋｇ、実施例４で調製した本発明の抗菌性ペプチド組成物１．０ｋｇの配合割合で常法により、水中油型のドレッシングを得た。
【００７２】
本発明の他の各種態様を以下に例示する。
（１）リゾチームをトリプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２〜６ｋＤａの範囲であるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物。
（２）リゾチームをトリプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が３．５〜５．５ｋＤａの範囲であるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物。
（３）リゾチームをトリプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が４．５〜５．２ｋＤａの範囲であるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物。
（４）前記（１）〜（３）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物がグラム陽性菌に対するものである抗菌性ペプチド組成物。
（５）リゾチームをペプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２．５ｋＤａ以下の範囲であるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物。
【００７３】
（６）リゾチームをペプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２．０ｋＤａ以下の範囲であるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物。
（７）リゾチームをペプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が１．８ｋＤａ以下の範囲であるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物。
（８）前記（５）〜（７）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物がグラム陰性菌に対するものである抗菌性ペプチド組成物。
（９）リゾチームをペプシン及びトリプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２．５ｋＤａ以下の範囲であるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物。
（１０）リゾチームをペプシン及びトリプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２．０ｋＤａ以下の範囲であるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物。
【００７４】
（１１）リゾチームをペプシン及びトリプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が１．８ｋＤａ以下の範囲であるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物。
（１２）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する医薬。
（１３）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する化粧品。
（１４）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する食品。
（１５）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する飼料。
（１６）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有するシャンプー。
（１７）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有するリンス。
（１８）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する洗口液。
（１９）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する歯磨き剤。
（２０）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する蒲鉾。
【００７５】
（２１）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する麺。
（２２）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有するカスタードクリーム。
（２３）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する漬物。
（２４）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有するソーセージ。
（２５）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有するハム。
【００７６】
（２６）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有するパン。
（２７）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する炊飯米。
（２８）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する鶏卵加工品。
（２９）前記（１）〜（１１）いずれか記載の抗菌性ペプチド組成物を含有する飲料。
【００７７】
【発明の効果】
従来、リゾチームの抗菌活性はグラム陽性菌に対するものとして限定され、その用途目的が限定されていた。本発明における抗菌性ペプチド組成物は、従来のリゾチームが有するグラム陽性菌に対する抗菌活性を増強する効果を有する。また、従来のリゾチームの抗菌スペクトルはグラム陽性菌に限定されていたが、本発明における抗菌性ペプチド組成物はその抗菌スペクトルを拡大する効果を有し、グラム陰性菌に対しても強い抗菌活性を示す。本発明の抗菌性ペプチド組成物は、このような抗菌活性を有する抗菌性ペプチドを有効成分とするものであり、医薬、化粧品、食品、飼料分野等において効果が期待される。
【００７８】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で調製した抗菌性ペプチド組成物のＨＰＬＣ分析結果を示した図である。
【図２】実施例２で調製した抗菌性ペプチド組成物のＨＰＬＣ分析結果を示した図である。
【図３】実施例３で調製した抗菌性ペプチド組成物のＨＰＬＣ分析結果を示した図である。
【図４】変性リゾチームのＨＰＬＣ分析結果を示した図である。
【図５】卵白リゾチームのＨＰＬＣ分析結果を示した図である。
Claims (4)
- リゾチームをトリプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２〜６ｋＤａの範囲であるペプチド類を有効成分とするペプチド組成物を飲食品に添加することを特徴とする飲食品の菌増殖抑制方法。
- リゾチームをぺプシン及びトリプシンで分解して得られるペプチド類であって、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した平均分子量が２．５ｋＤａ以下の範囲であるペプチド類を有効成分とするペプチド組成物を飲食品に添加することを特徴とする飲食品の菌増殖抑制方法。
- 請求項２記載の菌がグラム陰性菌である飲食品の菌増殖抑制方法。
- 請求項１〜３いずれか記載の菌増殖抑制方法により得られた飲食品。
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