JP6590332B2 - ノロウイルス不活化剤及びその製法 - Google Patents
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Description
一方、リゾチームはグラム陽性菌の細胞壁を分解する酵素として知られていた(非特許文献1)が、加熱を行うことによってタンパクの立体構造が変化し、細胞壁の薄いグラム陰性菌に対しても殺菌効果を有することが明らかとなった(非特許文献2)。これは、酵素として細胞壁を分解するというメカニズムではなく、構造の変化により特定のアミノ酸残基が露出、細胞膜に作用することに起因することが示されている。
発明者らは、このような新規のノロウイルス不活化剤を開発するための一連の研究の成果として、加熱変性した卵白リゾチームが、ノロウイルスの代替ウイルスであるMNV-1に不活化効果を持つことを明らかにした(特許文献1、非特許文献3)。
本発明は、卵白リゾチームを利用して、ノロウイルスを不活化する手段を提供することを目的とする。
その一つとして、発明者らは、既に、加熱変性した卵白リゾチームが、ノロウイルスの代替ウイルスであるMNV-1に不活化効果を持つことを明らかにしている(特許文献1、非特許文献1)。
二つ目として、卵白リゾチームの全長ペプチドのうちLzP1と名付けた部分のみを合成したペプチドがMNV-1に不活化効果を持つことを見出した(後記の実施例)。
卵白リゾチームは、高次構造において、その活性部分(即ち、ノロウイルスを不活化する部分)はその内部に隠蔽され外部に表出していないと推測されるところ、前者は、加熱されることによる卵白リゾチーム高次構造の変化により、その活性部分が表出したものと考えられ、後者は、その活性部分を取り囲んで活性部分を表出させなかった部分を除去することにより得られたペプチドがノロウイルス不活化活性を示したものと考えられた。
本願は、この二つめの発明に関するものである。
(a)' 配列番号1のアミノ酸配列において、配列番号1の23〜51番目のアミノ酸配列を含み、配列番号1のアミノ酸配列における19〜63番目のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含まないアミノ酸配列から成るペプチド
(b) (a)'のペプチドを構成するアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つノロウイルス不活化活性を有するペプチド
また、本発明は、上記(a)'又は(b)のペプチドを合成することから成るノロウイルス不活化剤の有効成分の製法である。
本願発明のペプチドは、容易に合成でき、量産も容易である。
鶏卵や卵白には食物アレルギーを引き起こすアレルゲンが含まれているが、本願発明のペプチドは鶏卵又はその卵白の全体ではないため、このペプチドは食物アレルギーを引き起こすアレルゲンを含まない可能性がある。
(a) 配列番号1の19〜63番目のアミノ酸配列(KV FGRCELAAAM KRHGLDNYRG YSLGNWVCAA KFESNFNTQA TNR)において少なくとも23〜51番目のアミノ酸配列(RCELAAAM KRHGLDNYRG YSLGNWVCAA K)を含むアミノ酸配列から成るペプチド
このペプチドは、配列番号1の23〜51番目のアミノ酸配列を含んだ配列番号1の19〜63番目のアミノ酸配列の全体又はその部分配列であり、配列番号1の23〜51番目のアミノ酸配列を含み、配列番号1のアミノ酸配列における19〜63番目のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含まないところに特徴がある。このペプチドは、配列番号1の23〜51番目のアミノ酸配列であってもよく、配列番号1の23〜57番目のアミノ酸配列(Lz-P1)等であってもよい。
必須のアミノ酸配列である配列番号1の23〜51番目のアミノ酸配列は、強い抗菌活性を有する正電荷に帯電しているペプチド部分を多く含み(即ち、配列番号1の23、32及び39番目のR(アルギニン)、同31及び51番目のK(リシン)並びに33番目のH(ヒスチジン))、αへリックスを二つ含む特徴的な配列である。そのためこのペプチドは、負に帯電していると考えられるウイルスのキャプシドタンパクの特定の部位に吸着するため、ノロウイルス不活化活性を有すると考えられる。
これらから、後記の実施例において効果を確認した範囲(即ち、配列番号1の23〜57番目のアミノ酸配列)からN末端方向には4残基、C末端方向には6残基を含む部分まで(即ち、配列番号1の19〜63番目のアミノ酸配列)が、ノロウイルス不活化活性を有しうる領域であると考えられる。
本発明においては、上記(a)のペプチドの代わりに機能的等価なペプチドである上記(b)のペプチドを使用することができる。
(c) (a)のペプチドを構成するアミノ酸配列に対して、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つノロウイルス不活化活性を有するペプチド
本発明においては、(a)のペプチドを構成するアミノ酸配列に対して、80%以上、好ましくは90% 以上、特に好ましくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つノロウイルス不活化活性を有するペプチドを使用してもよい。
このノロウイルス不活化活性は、ネズミマクロファージ細胞を用いた細胞アッセイによる感染価測定や、リアルタイムPCRによるウイルスRNAの残存を測定することによる粒子数の測定により評価することができる。
これらの中で、水、低級アルコール及び多価アルコールの少なくなくとも1種を使用することが好ましい。特に、本発明のノロウィルス不活化剤が殺菌効果を併せ持つことができるため、低級アルコール及び多価アルコールの少なくなくとも1種を含有するアルコール製剤を使用することがより好ましい。
液剤とする場合、その粘度は使用方法に応じて適宜定めることができる。例えば、噴霧可能な粘度の液剤とし、トリガースプレーヤー、スクイズ容器、エアゾル容器等のスプレー容器に充填することにより、手指、食品、調理器具、住居環境、嘔吐物、排泄物等へ該ノロウィルス不活化剤を含む液滴を噴霧することにより、ノロウィルスの不活化を手軽に行うことができ、ノロウィルス不活化剤を含む液剤に、不活化の対象物(例えば、手指、食品、医療機器、医療器具、調理器具、住居環境)を浸すことにより、ノロウィルスの不活化を手軽に行うこともできる。また、ノロウィルス不活化剤を含む液剤を湿潤させたシートとして使用することができる。さらに、ローション、クリーム等とすることにより皮膚外用剤として使用することができ、これにより、ノロウィルスが手指に付着してもその場で不活化し、ノロウィルスが経口感染することを防止する感染予防薬として使用することができる。
実施例1
卵白リゾチームを構成するアミノ酸配列(配列番号1)を、Lz-P1(配列番号1の23〜57番目のアミノ酸配列)、Lz-P2(配列番号1の58〜81番目のアミノ酸配列)、Lz-P3(配列番号1の98〜132番目のアミノ酸配列)の三領域に分け、それぞれのペプチドを人工合成した。それぞれが同じモル濃度になるよう水溶液を調整し、評価用サンプルとした。調整した濃度は卵白リゾチームを終濃度1%に調整した時と同じモル濃度になるよう調整した。
比較のため、卵白リゾチーム(非変性)の同濃度の溶液も用意した。
ノロウィルスとして、MNV-1(ワシントン大学(Washington University)のハーバート.W.ヴァージン博士(Dr. Herbert W. Virgin)より供与)を使用し、培地成分を除去したノロウィルス液(MNV-1溶液)を作製した。
上記の評価用サンプル(ペプチド溶液)とMNV-1溶液とを等量で混和し、1分間曝露した。
6ウェルプレートに、マウスマクロファージ株化細胞(RAW264.7細胞)をコンフルエントの60〜80%まで培養した。
曝露後の各評価用サンプルを希釈し、反応を停止したのち、この培養細胞へ500μL/wellになるよう接種した。
評価用サンプルを接種した細胞は、室温で1時間インキュベートし、ノロウィルスを感染させた。その後、プレート上の接種液を全量除去し、1.5% Sea Plaque Agarose-DMEM(37℃)を2ml/wellで重層し、37℃、5%CO2条件下で2日間培養した。
培養後、プレートに0.03%ニュートラルレッド溶液を加えることで細胞を染色し、プラーク数をカウントした。得られたプラーク数と希釈倍率から感染価(PFU/mL)を算出した。
ペプチドを加えないMNV-1溶液の感染価(106〜107 PFU/mL程度)から、MNV-1溶液を加えた評価用サンプルの感染価を引いた値を、感染価の減少量(PFU/mL)とした。
卵白リゾチーム(図中、「全長」で示す。)では、感染価の実質的な減少は見られなかったが(0.23 log)、Lz-P1は、MNVの感染価の顕著な減少を示した(1.49 log)。一方、Lz-P2とLz-P3の感染価の減少は、それぞれ0.21 log及び0.17 logであり、感染価の実質的な減少は見られなかった。
この結果から、卵白リゾチームのアミノ酸配列領域のうち、Lz-P1とした領域は、高いノロウィルス不活化効果を持っていることが分かる。
2%の卵白リゾチーム溶液及び上記Lz-P1、Lz-P2及びLz-P3の同濃度溶液をそれぞれ100℃で30分間加熱した。
これらの溶液について、実施例1と同様に、MNV-1溶液と等量で混和して1分間曝露し、MNV-1の感染価を、プラークアッセイにより確認した。
結果を図3に示す。
卵白リゾチーム(図中、「全長」で示す。)とLz-P1は、感染価の顕著な減少を示したが(5.24 log、2.56 log)、Lz-P2とLz-P3は感染価の実質的減少を示さなかった(0.18 log及び0.29 log)。
加熱処理後も、Lz-P1はノロウイルス不活化活性を有していることが分かる。
Claims (3)
- 以下(a)'又は(b)のペプチドを有効成分として含有するノロウイルス不活化剤。
(a)' 配列番号1のアミノ酸配列において、配列番号1の23〜51番目のアミノ酸配列を含み、配列番号1のアミノ酸配列における19〜63番目のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含まないアミノ酸配列から成るペプチド
(b) (a)'のペプチドを構成するアミノ酸配列において、1又は2個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つノロウイルス不活化活性を有するペプチド
- 前記ぺプチドが合成されたぺプチドである請求項1に記載のノロウイルス不活化剤。
- 下記(a)'又は(b)のペプチドを合成することから成るノロウイルス不活化剤の有効成分の製法。
(a)' 配列番号1のアミノ酸配列において、配列番号1の23〜51番目のアミノ酸配列を含み、配列番号1のアミノ酸配列における19〜63番目のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含まないアミノ酸配列から成るペプチド
(b) (a)'のペプチドを構成するアミノ酸配列において、1又は2個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つノロウイルス不活化活性を有するペプチド
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