JP2997800B2 - 細胞壁溶解酵素遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体 - Google Patents

細胞壁溶解酵素遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体

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JP2997800B2 JP9343630A JP34363097A JP2997800B2 JP 2997800 B2 JP2997800 B2 JP 2997800B2 JP 9343630 A JP9343630 A JP 9343630A JP 34363097 A JP34363097 A JP 34363097A JP 2997800 B2 JP2997800 B2 JP 2997800B2
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哲 金子
悟 韮澤
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和朋 原口
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞壁溶解酵素遺
伝子、該遺伝子を含むプラスミドベクター及び形質転換
体に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞壁溶解酵素は、放線菌を含む細菌の
細胞壁を分解する酵素であり、本酵素を作用させると、
細菌の細胞壁は溶解し、細菌は死滅する。細菌の外層
は、細胞壁により覆われているが、この細胞壁の主要構
成成分は、糖鎖とペプチドとからなるペプチドグリカン
である。細胞壁溶解酵素は、このペプチドグリカンに作
用する。本酵素をペプチドグリカンに作用させると、ペ
プチドグリカンの糖鎖部分に作用し、還元末端の糖質と
してＮ−アセチルムラミン酸を生ずる。そのため、本酵
素はＮ−アセチルムラミダーゼに分類される。
【０００３】Ｎ−アセチルムラミダーゼに分類される主
要な酵素としては、鶏卵白由来のリゾチーム等が挙げら
れる。しかし、細胞壁溶解酵素は、これらの酵素とは、
酵素化学的な性質、溶菌対象となる微生物が異なってお
り（Hayashi K.ら, Agric. Biol. Chem.（日本農芸化学
会欧文誌）45巻, 2289−2300頁, 1981年）、新たな特異
性を有する酵素である。
【０００４】細胞壁溶解酵素は、先に述べたように、細
菌の細胞壁を分解するので、この性質を利用して、細菌
の内部に存在する酵素やＤＮＡの抽出のために用いられ
る。また、細菌によっては、本酵素の作用により死滅す
るものもあるため、本酵素は食品の保存料としての利用
も可能である(Hayashi K. ら，Agric. Biol. Chem.（日
本農芸化学会欧文誌）53巻, 3173-3177 頁, 1989年）。
【０００５】従来、この細胞壁溶解酵素を得る方法とし
ては、ストレプトマイセス（Streptomyces) 属に属する
放線菌、アクロモバクター (Achromobacter)属、アエロ
モナス (Aeromonas)属、バチルス (Bacillus) 属、クロ
ストリジウム (Clostridium)属、フラボバクテリウム
(Flavobacterium) 属、ミキソバクター (Myxobacter)
属、ミキソコッカス (Myxococcus) 属、シュードモナス
(Pseudomonas)属、スタフィロコッカス (Staphylococc
us) 属、ストレプトコッカス(Streptococcus) 属などに
属する細菌等の微生物を培養し、その培養濾液あるいは
培養菌体から目的酵素を調製する方法がある。また、細
胞壁溶解酵素が卵白リゾチームの場合は、卵白から等電
点沈殿等の手法を活用して調製する方法が用いられてい
る。これらの方法により得られる酵素は、粗酵素あるい
は精製酵素として市販されている。しかしながら、これ
らの方法は、該酵素を安定的に生産する方法としては十
分とは言えない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、細胞
壁溶解酵素の一層の活用を図るため、該酵素の遺伝子を
クローニングすることにより、遺伝子の構造を解明し、
遺伝子を発現させて該酵素の工業的な生産に寄与するこ
とである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために研究を重ねた結果、該酵素生産能を有
するストレプトマイセス属微生物からの細胞壁溶解酵素
遺伝子のクローニングを計画した。その結果、本遺伝子
をクローニングすることに成功し、本発明を完成した。
【０００８】請求項１記載の本発明は、配列表の配列番
号１記載の塩基配列を有するストレプトマイセス属微生
物由来の細胞壁溶解酵素前駆体の遺伝子である。請求項
２記載の本発明は、請求項１記載の細胞壁溶解酵素前駆
体の遺伝子を含むプラスミドである。請求項３記載の本
発明は、請求項２記載のプラスミドで形質転換された大
腸菌（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１６６）である。
【０００９】請求項４記載の本発明は、配列表の配列番
号２記載の塩基配列を有するストレプトマイセス属微生
物由来の細胞壁溶解酵素の遺伝子である。請求項５記載
の本発明は、請求項４記載の細胞壁溶解酵素の遺伝子を
含むプラスミドである。請求項６記載の本発明は、請求
項５記載のプラスミドで形質転換された大腸菌である。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明者らは、細胞壁溶解酵素生
産能を有するストレプトマイセス属由来の細菌から抽出
した細胞壁溶解酵素を高度に精製し、そのＮ末端のアミ
ノ酸配列を決定した（配列表の配列番号３参照）。さら
に、この解読できたアミノ酸配列を基にして１対のプラ
イマーを作製した（配列表の配列番号４および５参
照）。これを用いて、ストレプトマイセス属菌株から抽
出したゲノムＤＮＡを鋳型として行ったポリメラーゼ連
鎖反応法（ＰＣＲ法）により、１４０ｂｐの明瞭なバン
ドを得た。
【００１１】得られたバンド（ＰＣＲ産物）をクローニ
ングし、ＤＮＡシークエンサーで分析して、ＤＮＡ塩基
配列を解読した（配列表の配列番号６参照）。このＤＮ
Ａ塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、先に得られた
Ｎ末端のアミノ酸配列（配列表の配列番号３参照）に相
当する配列が認められた。このことから、該ＰＣＲ産物
は、細胞壁溶解酵素遺伝子の一部であることが判明し
た。そこで、このＰＣＲ産物をプローブとして、まず細
胞壁溶解酵素の遺伝子のクローニングを実施した。
【００１２】一方、ストレプトマイセス属の細菌から抽
出したゲノムＤＮＡを酵素分解し、得られたＤＮＡ断片
についてサザンハイブリダイゼーションを行った。その
結果、この２．８ｋｂｐのＤＮＡ断片に、目的とする細
胞壁溶解酵素遺伝子が存在することを確認できた。上記
の細胞壁溶解酵素遺伝子を有する断片をサブクローニン
グして、プラスミドを調製した。このプラスミドを用い
て、大腸菌に形質転換し、形質転換体を得た。
【００１３】以下に、本発明を詳しく説明する。前記し
たように、本発明の細胞壁溶解酵素遺伝子は、細胞壁溶
解酵素生産能を有する微生物に由来するものである。こ
のような細胞壁溶解酵素生産能を有する微生物として
は、ストレプトマイセス（Streptomyces) 属に属する放
線菌、アクロモバクター (Achromobacter)属、アエロモ
ナス (Aeromonas)属、バチルス (Bacillus) 属、クロス
トリジウム (Clostridium)属、フラボバクテリウム (Fl
avobacterium) 属、ミキソバクター (Myxobacter) 属、
ミキソコッカス (Myxococcus) 属、シュードモナス(Pse
udomonas) 属、スタフィロコッカス (Staphylococcus)
属、ストレプトコッカス(Streptococcus) 属などに属す
る細菌等がある。これらのうち、ストレプトマイセス属
に属する細菌を用いることがが好ましい。ストレプトマ
イセス属に属する細菌の菌株としては、ストレプトマイ
セス・ルトゲルセンシス（Streptomyces rutgersensi
s) Ｈ−４６株等がある。
【００１４】細胞壁溶解酵素は、上記微生物菌体から取
得することができる。すなわち、上記の菌株を常法に従
い培養する。培地としては、特に制限はないが、脱脂ダ
イズ抽出物を含有する培地が好ましい。培養は、例えば
Hayashi K.らの手法（J. Ferment Technol.(日本醗酵工
学会欧文誌）59巻, 319-323 頁, 1981年）によって行う
ことができる。
【００１５】培養物を遠心分離して菌体を除去する。得
られる培養上清から、イオン交換クロマトグラフィー、
カラムクロマトグラフィー、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ等の通
常の精製手段を用いることにより、高度に精製した細胞
壁溶解酵素を得ることができる。精製手段の１例として
は、Hayashi K.らの手法（Agric. Biol. Chem., （日本
農芸化学会欧文誌）45巻, 2289-2300 頁, 1981年）を挙
げることができる。すなわち、陽イオン交換樹脂を使用
したカラムクロマトグラフィーを活用することにより精
製することができる。
【００１６】次に、この精製した細胞壁溶解酵素のＮ末
端のアミノ酸配列を決定した。配列の決定には、プロテ
インシーケンサーＧ１００５Ａ型（ヒューレットパッカ
ード社製）を用いることができる。決定したＮ末端のア
ミノ酸配列は、配列表の配列番号３に示す通りである。
【００１７】解読できたアミノ酸配列から塩基配列を解
読し、これをもとに作製したプライマー（配列表の配列
番号４および５参照）を用いて、ストレプトマイセス属
菌株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応
を行う。その結果、１４０ｂｐの明瞭なバンドを得た。
【００１８】得られたバンドのＤＮＡ塩基配列を解読す
るため、該バンドをクローニングし、ＤＮＡシークエン
サーで分析した。分析により得られた塩基配列（配列表
の配列番号６参照）をアミノ酸に翻訳した。その結果、
先に得られたＮ末端のアミノ酸配列（配列表の配列番号
３参照）に相当する配列が認められた。このことから、
ＰＣＲ法により得られた産物は、細胞壁溶解酵素遺伝子
の一部であることが判明した。
【００１９】そこで、このＰＣＲ産物をプローブとし
て、細胞壁溶解酵素の成熟体酵素遺伝子を含む前駆体遺
伝子のクローニングを実施した。まず、ストレプトマイ
セス属の細菌からＤＮＡを抽出する。抽出は、例えば斉
藤の方法（蛋白質核酸酵素、１１巻、４４６頁）によっ
て行うことができる。すなわち、本菌の細胞壁を酵素分
解し、抽出されたＤＮＡをガラス棒に巻き取る方法によ
り、ゲノムＤＮＡを精製することができる。
【００２０】本発明の細胞壁溶解酵素の前駆体の塩基配
列及びアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示すとお
りである。さらに、該遺伝子の前駆体遺伝子のアミノ酸
配列から、先に判明している細胞壁溶解酵素のＮ末端の
アミノ酸配列（配列表の配列番号３参照）をもとに、細
胞壁溶解酵素の遺伝子のアミノ酸配列を構築した。該遺
伝子のアミノ酸配列を塩基配列と共に配列表の配列番号
２に示す。本発明の細胞壁溶解酵素遺伝子は、新規なア
ミノ酸配列を有する酵素であり、これと５５％以上の相
同性が認められる蛋白質は見当たらなかった。
【００２１】次に、この２．８ｋｂｐのフラグメント
を、アガロースゲル電気泳動により調製し、ＤＮＡライ
ゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて、予め
脱リン酸処理しておいたプラスミドにサブクローニング
して、プラスミド pUC 18-SR1を調製した。
【００２２】さらに、このプラスミドを常法により大腸
菌に形質転換した。形質転換された大腸菌は、工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託されている。その受託
番号はＦＥＲＭ ＢＰ−６１６６である。なお、プラス
ミド pUC 18-SR1 は細胞壁溶解酵素遺伝子を含んでい
る。
【００２３】細胞壁溶解酵素遺伝子の発現は、以上のよ
うにして得た形質転換体である大腸菌を培養し、その大
腸菌及び培養上清中の細胞壁溶解酵素を測定して確認す
ることができる。また、この形質転換体を栄養培地に２
０〜３７℃で３〜４８時間培養し、得られた菌体を破砕
したあと、固液分離して得られた上清を常法に従い精製
して、細胞壁溶解酵素を得ることができる。
【００２４】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１ ストレプトマイセス・ルトゲルセンシス（Streptomyces
rutgersensis）Ｈ−４６株を、０．５％グルコース、
２％脱脂ダイズ熱水抽出物からなる培地にてHayashi K.
らの手法（J. Ferment Technol. （日本醗酵工学会欧文
誌）５９巻、３１９−３２３頁、１９８１年）により培
養した。
【００２５】培養物から菌体を除去して得られた培養上
清から、イオン交換クロマトグラフィーを活用し、Haya
shi K.らの手法（Agric. Biol. Chem.（日本農芸化学会
欧文誌）45巻,2289-2300頁, 1981年）により、高度に精
製した細胞壁溶解酵素を得た。
【００２６】この精製酵素を用いて、プロテインシーケ
ンサーＧ１００５Ａ型（ヒューレットパッカード社製）
により、そのＮ末端のアミノ酸配列を決定した。決定し
た配列を配列表の配列番号３に示す。解読できたアミノ
酸配列のなかから、コドンの縮重の少ない領域を２個所
選び出し、フォーワードプライマー（配列表の配列番号
４に記載）及びリバースプライマー（配列表の配列番号
５に記載）を化学合成した。これらのプライマーを用い
て、ストレプトマイセス・ルトゲルセンシス Ｈ−４６
株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ反応により増幅さ
せた。その結果、１４０ｂｐの明瞭なバンドが得られ
た。
【００２７】得られたバンドをクローニングし、ＤＮＡ
シークエンサーで分析したところ、配列表の配列番号６
に記載のＤＮＡ塩基配列が得られた。このＤＮＡ塩基配
列をアミノ酸に翻訳したところ、先に得られた配列表の
配列番号３に記載のＮ末端のアミノ酸配列に相当する配
列が認められた。このことから、ＰＣＲ法により得られ
た産物は細胞壁溶解酵素遺伝子の一部であることが判明
した。そこで、このＰＣＲ産物を Gene Image 化学発光
核酸検出システム（アマーシャム社製）で標識し、これ
をプローブとして用いることにより、細胞壁溶解酵素の
前駆体遺伝子のクローニングを実施した。
【００２８】一方、ストレプトマイセス・ルトゲルセン
シス Ｈ−４６株から、斉藤の方法（蛋白質核酸酵素、
１１巻、４４６頁）によりゲノムＤＮＡを抽出した。こ
のゲノムＤＮＡを制限酵素 Sac Iで完全分解した。得ら
れた制限酵素分解物をアガロースゲル電気泳動で分離
後、サザンハイブリダイゼーション（「クローニングと
シーケンス」渡辺監修、農村文化社、１９８９年、１５
７頁）を行った。その結果、２．８ｋｂｐのＤＮＡ断片
に目的とする細胞壁溶解酵素遺伝子があることが確認で
きた。
【００２９】次に、Sambrook, J., Fritsch, E. F. and
Maniatis, T. "Molecular Cloning, A Laboratory Man
ual 第２版" 6.３章 Vol. 1 (1989)に記載された方法に
従い、この２．８ｋｂｐのフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動により調製した。一方、プラスミドpUC-18を
制限酵素 Sac Iで分解し、アルカリフォスファターゼを
用いて脱リン酸処理した。この脱リン酸処理プラスミド
にＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を
用いて、先の２．８ｋｂｐのフラグメントを「クローニ
ングとシーケンス」渡辺監修、農村文化社、１９８９
年、１３４頁に記載の方法によりサブクローニングし
て、プラスミド pUC 18-SR1 を調製した。
【００３０】さらに、このプラスミドを用いて、Sambro
ok, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. "Molecular
Cloning, A Laboratory Manual 第２版" 1.７４章 Vo
l. 1(1989)に記載された方法に従い、大腸菌に形質転換
した。形質転換された大腸菌は、工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されており、その受託番号はＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−６１６６である。なお、プラスミド pUC 18-
SR1 は細胞壁溶解酵素遺伝子を含んでいる。請求項６記
載の形質転換体も同様の方法で得ることができる。
【００３１】形質転換体から多量にプラスミド pUC 18-
SR1 を調製し、ｄローダミン・ターミネーター・サイク
ルシークエンシング・キット（パーキンエルマー社製）
を用いて解読した。解読した塩基配列の情報をつなぎ合
わせて、細胞壁溶解酵素の前駆体の遺伝子を構成した。
該前駆体遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は、配列表
の配列番号１に示すとおりである。
【００３２】この配列表の配列番号１に示した細胞壁溶
解酵素の前駆体遺伝子のアミノ酸配列を、先に判明して
いる細胞壁溶解酵素のＮ末端のアミノ酸配列（配列表の
配列番号３参照）と比較した。その結果、細胞壁溶解酵
素のＮ末端のアミノ酸配列（配列表の配列番号３参照）
は配列番号１に示したアミノ酸配列中の２１〜１００番
目の配列と一致した。このことから、前駆体遺伝子の塩
基配列中の２４１番目以降に細胞壁溶解酵素遺伝子を見
出した。活性型細胞壁溶解酵素の遺伝子は、細胞壁溶解
酵素のＮ末端アミノ酸配列を基に、細胞壁溶解酵素前駆
体遺伝子から構成し、配列表の配列番号２に示した。
【００３３】さらに、活性型細胞壁溶解酵素の分子量
は、島津製作所製、レーザーイオン化TOF-MS KOMPACT M
ALDI III 型で測定したところ、２３，０００ダルトン
であり、本遺伝子でコードされる蛋白質が分子量２３，
０５６ダルトンであるのと良く一致していた。
【００３４】
【発明の効果】本発明によれば、細菌細胞壁に作用して
細菌を溶解する酵素の遺伝子が提供される。この遺伝子
を発現させて得られる酵素は、食品産業等の分野におい
て有用である。
【００３５】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：１０８８ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：ストレプトマイセス・ルトゲルセンシス (Stre
ptomyces rutgersensis) 株名：Ｈ−４６株 直接の起源 プラスミド名：ｐＵＣ１８−ＳＲ１ 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１８１．．８７０ 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 TCAGGCACCC CCCGTCACGC TCGCCCACCG CCTTCGGAGG CCCCCATGCG CGTACCCAGA 60 TCCGGAGCCC GCCCCTCTCG CCGCACCGCG GCCGGAGTTC TCCTCGCCGC CCTCTCCCTG 120 CTCTTCACCC TGCCCTCGGG GGCGCACGCC GCCGACCGTC CCGAGCGGGG CGAGGCCCAC 180 ATG GGC ATG GGC GTC GTG GAG CAC GAC GGC CGG AGC GGG GCG CCC GGT 228 Met Gly Met Gly Val Val Glu His Asp Gly Arg Ser Gly Ala Pro Gly 5 10 15 ATC TCG CCG CGC GCC GTG CAG ACG GAG GGC GTG GAC GTC TCC AGC CAT 276 Ile Ser Pro Arg Ala Val Gln Thr Glu Gly Val Asp Val Ser Ser His 20 25 30 CAG GGG AAC GTC GAC TGG GCC GCG CTG TGG AAC AGC GGC GTC AAG TGG 324 Gln Gly Asn Val Asp Trp Ala Ala Leu Trp Asn Ser Gly Val Lys Trp 35 40 45 TCG TAC GTG AAG GCC ACC GAG GGC ACG TAC TAC AAG AAC CCG TAC TTC 372 Ser Tyr Val Lys Ala Thr Glu Gly Thr Tyr Tyr Lys Asn Pro Tyr Phe 50 55 60 GCG CAG CAG TAC AAC GGC AGT TAC AAC GTG GGG ATG ATC CGC GGC GCC 420 Ala Gln Gln Tyr Asn Gly Ser Tyr Asn Val Gly Met Ile Arg Gly Ala 65 70 75 80 TAC CAC TTC GCG ACG CCC AAC ACG ACG AGC GGC GCC GCC CAG GCC AAC 468 Tyr His Phe Ala Thr Pro Asn Thr Thr Ser Gly Ala Ala Gln Ala Asn 85 90 95 TAC TTC GTG GAC AAC GGC GGC GGC TGG TCC CGC GAC GGC AAG ACC CTG 516 Tyr Phe Val Asp Asn Gly Gly Gly Trp Ser Arg Asp Gly Lys Thr Leu 100 105 110 CCG GGT GTC CTG GAC ATC GAG TGG AAC CCG TAC GGC GAC CAG TGC TAC 564 Pro Gly Val Leu Asp Ile Glu Trp Asn Pro Tyr Gly Asp Gln Cys Tyr 115 120 125 GGC CTG AGC CAG TCC GCG ATG GTC AAC TGG ATC CGC GAC TTC ACC AAC 612 Gly Leu Ser Gln Ser Ala Met Val Asn Trp Ile Arg Asp Phe Thr Asn 130 135 140 ACC TAC AAG GCC CGC ACC GGC CGG GAC GCG GTC ATC TAC ACC GCG ACC 660 Thr Tyr Lys Ala Arg Thr Gly Arg Asp Ala Val Ile Tyr Thr Ala Thr 145 150 155 160 AGC TGG TGG ACC TCC TGC ACC GGC AAC TAC GCG GGC TTC GGC ACC ACC 708 Ser Trp Trp Thr Ser Cys Thr Gly Asn Tyr Ala Gly Phe Gly Thr Thr 165 170 175 AAC CCG CTC TGG GTC GCC CGG TAC GCC GCC TCG GTG GGC GAA CTC CCG 756 Asn Pro Leu Trp Val Ala Arg Tyr Ala Ala Ser Val Gly Glu Leu Pro 180 185 190 GCC GGC TGG GGC TTC TAC ACG ATG TGG CAG TAC ACC TCC ACC GGC CCG 804 Ala Gly Trp Gly Phe Tyr Thr Met Trp Gln Tyr Thr Ser Thr Gly Pro 195 200 205 ATC GTC GGC GAC CAC AAC CGC TTC AAC GGC GCG TAC GAC CGG CTC CAG 852 Ile Val Gly Asp His Asn Arg Phe Asn Gly Ala Tyr Asp Arg Leu Gln 210 215 220 GCG CTC GCC AAC GGC TGAGCCCGAG CCGTCGGACG CCCCGGCGAC CGCGCACGCC 907 Ala Leu Ala Asn Gly 225 GAAGAGGCCC GGTGACCTGT TCACCGGGCC TTTTCCGGGT CCGGAGCGGG GTGCGGAAAT 967 CCTTCCGGGG GCGGGGCAAC CGTTCGACTA TCCACTCCAT CTATACACGG CGTGAACACT 1027 CTGACGCACG CCGAGCCCCG CACCCGCCGC CGCCCGCACC GCATCCGCCG TACAGCCGTC 1087 G 1088
【００３６】配列番号：２ 配列の長さ：６３０ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：ストレプトマイセス・ルトゲルセンシス (Stre
ptomyces rutgersensis) 株名：Ｈ−４６株 直接の起源 プラスミド名：ｐＵＣ１８−ＳＲ１ 配列の特徴 特徴を示す記号：mat peptide 存在位置：１．．６３０ 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 GCC GTG CAG ACG GAG GGC GTG GAC GTC TCC AGC CAT CAG GGG AAC GTC 48 Ala Val Gln Thr Glu Gly Val Asp Val Ser Ser His Gln Gly Asn Val 5 10 15 GAC TGG GCC GCG CTG TGG AAC AGC GGC GTC AAG TGG TCG TAC GTG AAG 96 Asp Trp Ala Ala Leu Trp Asn Ser Gly Val Lys Trp Ser Tyr Val Lys 20 25 30 GCC ACC GAG GGC ACG TAC TAC AAG AAC CCG TAC TTC GCG CAG CAG TAC 144 Ala Thr Glu Gly Thr Tyr Tyr Lys Asn Pro Tyr Phe Ala Gln Gln Tyr 35 40 45 AAC GGC AGT TAC AAC GTG GGG ATG ATC CGC GGC GCC TAC CAC TTC GCG 192 Asn Gly Ser Tyr Asn Val Gly Met Ile Arg Gly Ala Tyr His Phe Ala 50 55 60 ACG CCC AAC ACG ACG AGC GGC GCC GCC CAG GCC AAC TAC TTC GTG GAC 240 Thr Pro Asn Thr Thr Ser Gly Ala Ala Gln Ala Asn Tyr Phe Val Asp 65 70 75 80 AAC GGC GGC GGC TGG TCC CGC GAC GGC AAG ACC CTG CCG GGT GTC CTG 288 Asn Gly Gly Gly Trp Ser Arg Asp Gly Lys Thr Leu Pro Gly Val Leu 85 90 95 GAC ATC GAG TGG AAC CCG TAC GGC GAC CAG TGC TAC GGC CTG AGC CAG 336 Asp Ile Glu Trp Asn Pro Tyr Gly Asp Gln Cys Tyr Gly Leu Ser Gln 100 105 110 TCC GCG ATG GTC AAC TGG ATC CGC GAC TTC ACC AAC ACC TAC AAG GCC 384 Ser Ala Met Val Asn Trp Ile Arg Asp Phe Thr Asn Thr Tyr Lys Ala 115 120 125 CGC ACC GGC CGG GAC GCG GTC ATC TAC ACC GCG ACC AGC TGG TGG ACC 432 Arg Thr Gly Arg Asp Ala Val Ile Tyr Thr Ala Thr Ser Trp Trp Thr 130 135 140 TCC TGC ACC GGC AAC TAC GCG GGC TTC GGC ACC ACC AAC CCG CTC TGG 480 Ser Cys Thr Gly Asn Tyr Ala Gly Phe Gly Thr Thr Asn Pro Leu Trp 145 150 155 160 GTC GCC CGG TAC GCC GCC TCG GTG GGC GAA CTC CCG GCC GGC TGG GGC 528 Val Ala Arg Tyr Ala Ala Ser Val Gly Glu Leu Pro Ala Gly Trp Gly 165 170 175 TTC TAC ACG ATG TGG CAG TAC ACC TCC ACC GGC CCG ATC GTC GGC GAC 576 Phe Tyr Thr Met Trp Gln Tyr Thr Ser Thr Gly Pro Ile Val Gly Asp 180 185 190 CAC AAC CGC TTC AAC GGC GCG TAC GAC CGG CTC CAG GCG CTC GCC AAC 624 His Asn Arg Phe Asn Gly Ala Tyr Asp Arg Leu Gln Ala Leu Ala Asn 195 200 205 GGC TGA 630 Gly 209
【００３７】配列番号：３ 配列の長さ：８０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源： 生物名：ストレプトマイセス・ルトゲルセンシス（Stre
ptomyces rutgersensis) 株名：Ｈ−４６株 直接の起源 ストレプトマイセス・ルトゲルセンシスが生産した酵素 配列 Ala Val Gln Thr Glu Gly Val Asp Val Ser Ser His Gln Gly Asn Val 1 5 10 15 Asp Trp Ala Ala Leu Trp Asn Ser Gly Val Lys Trp Ser Tyr Val Lys 20 25 30 Ala Thr Glu Gly Thr Tyr Tyr Lys Asn Pro Tyr Phe Ala Gln Gln Tyr 35 40 45 Asn Gly Ser Tyr Asn Val Gly Met Ile Arg Gly Ala Tyr His Phe Ala 50 55 60 Thr Pro Asn Thr Thr Ser Gly Ala Ala Gln Ala Asn Tyr Phe Val Asp 65 70 75 80
【００３８】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（アミノ酸配列から作成） 起源： 生物名：ストレプトマイセス・ルトゲルセンシス (Stre
ptomyces rutgersensis) 株名：Ｈ−４６株 直接の起源 ストレプトマイセス・ルトゲルセンシスが生産した酵素 配列 ＣＡＲＧＧＳＡＡＹＧ ＴＳＧＡＹＴＧＧＧＣ ２０
【００３９】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（アミノ酸配列から作成） 起源： 生物名：ストレプトマイセス・ルトゲルセンシス (Stre
ptomyces rutgersensis) 株名：Ｈ−４６株 直接の起源 ストレプトマイセス・ルトゲルセンシスが生産した酵素 配列 ＣＧＧＡＴＣＡＴＳＣ ＣＳＡＣＲＴＴＲＴＡ ２０
【００４０】配列番号：６ 配列の長さ：１３７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 起源： 生物名：ストレプトマイセス・ルトゲルセンシス (Stre
ptomyces rutgersensis) 株名：Ｈ−４６株 直接の起源 ＰＣＲ反応物 配列 CAG GGG AAC GTC GAC TGG GCC GCG CTG TGG AAC AGC GGC GTC AAG TGG 48 Gln Gly Asn Val Asp Trp Ala Ala Leu Trp Asn Ser Gly Val Lys Trp 1 5 10 15 TCG TAC GTG AAG GCC ACC GAG GGC ACG TAC TAC AAG AAC CCG TAC TTC 96 Ser Tyr Val Lys Ala Thr Glu Gly Thr Tyr Tyr Lys Asn Pro Tyr Phe 20 25 30 GCG CAG CAG TAC AAC GGC AGT TAC AAC GTG GGG ATG ATC CG 137 Ala Gln Gln Tyr Asn Gly Ser Tyr Asn Val Gly Met Ile 35 40 45
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 韮澤 悟 茨城県つくば市天久保１丁目８−15 タ カノＧパレス404 (72)発明者 林 清 茨城県土浦市乙戸南１丁目５−３ (72)発明者 原口 和朋 茨城県つくば市吾妻１丁目１−１−603 −417 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 1/38 C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列表の配列番号１記載の塩基配列を有
    するストレプトマイセス属微生物由来の細胞壁溶解酵素
    前駆体の遺伝子。
  2. 【請求項２】 請求項１記載の細胞壁溶解酵素前駆体の
    遺伝子を含むプラスミド。
  3. 【請求項３】 請求項２記載のプラスミドで形質転換さ
    れた大腸菌（ＦＥＲＭＢＰ−６１６６）。
  4. 【請求項４】 配列表の配列番号２記載の塩基配列を有
    するストレプトマイセス属微生物由来の細胞壁溶解酵素
    の遺伝子。
  5. 【請求項５】 請求項４記載の細胞壁溶解酵素の遺伝子
    を含むプラスミド。
  6. 【請求項６】 請求項５記載のプラスミドで形質転換さ
    れた大腸菌。
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EP0368224A3 (de) * 1988-11-10 1991-12-27 Hoechst Aktiengesellschaft Lysozymgen aus Streptomyceten, Verfahren zu seiner Gewinnung und seine Verwendung
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