CN112351990B - 来自饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)的能够制造低聚半乳糖的酶及制造低聚半乳糖的方法 - Google Patents

来自饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)的能够制造低聚半乳糖的酶及制造低聚半乳糖的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112351990B
CN112351990B CN201980024686.9A CN201980024686A CN112351990B CN 112351990 B CN112351990 B CN 112351990B CN 201980024686 A CN201980024686 A CN 201980024686A CN 112351990 B CN112351990 B CN 112351990B
Authority
CN
China
Prior art keywords
enzyme
paenibacillus
amino acid
acid sequence
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201980024686.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112351990A (zh
Inventor
尾高伶
马场康浩
小笠原准季
吉川润
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Godo Shusei KK
Original Assignee
Godo Shusei KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Godo Shusei KK filed Critical Godo Shusei KK
Publication of CN112351990A publication Critical patent/CN112351990A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112351990B publication Critical patent/CN112351990B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase

Abstract

本发明提供一种来自环状芽孢杆菌以外的微生物的、3糖低聚半乳糖的制造选择性高且能够高效地制造低聚半乳糖的新型的酶及能够制造低聚半乳糖的新型的方法。所述低聚半乳糖的制造方法包括使具有选自以下的(a)～(f)中的氨基酸序列的酶和属于类芽孢杆菌属的细菌的菌体和/或上述细菌的低聚半乳糖生产酶与乳糖接触。(a)序列号1所示的氨基酸序列，(b)序列号2所示的氨基酸序列，(c)在序列号1所示的氨基酸序列中置换、删除、插入1～10个氨基酸的氨基酸序列，该氨基酸序列是具有低聚半乳糖生产活性的酶的氨基酸序列，(d)在序列号2所示的氨基酸序列中置换、删除、插入1～10个氨基酸的氨基酸序列，该氨基酸序列是具有低聚半乳糖生产活性的酶的氨基酸序列，(e)相对于序列号1所示的氨基酸序列的同源性为80％以上且小于100％的氨基酸序列，该氨基酸序列是具有低聚半乳糖生产活性的酶的氨基酸序列，(f)相对于序列号2所示的氨基酸序列的同源性为80％以上且小于100％的氨基酸序列，该氨基酸序列是具有低聚半乳糖生产活性的酶的氨基酸序列。

Description

来自饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)的能够制造低 聚半乳糖的酶及制造低聚半乳糖的方法
技术领域
本发明涉及能够制造低聚半乳糖的酶。另外，本发明还涉及编码该酶的DNA及使用该酶的低聚半乳糖的制造方法。另外，本发明还涉及制造低聚半乳糖的方法。
背景技术
低聚半乳糖作为生存于人肠道内细菌菌群的双歧杆菌等有用细菌的营养源而得到重视。因此，作为低聚半乳糖的制造方法，提出了各种方法(例如专利文献1～6)。其中使用的酶是乳糖酶，其中使用的微生物是产生乳糖酶的微生物。乳糖酶(β-半乳糖苷酶)将乳糖水解成β-半乳糖和葡萄糖。在此，通过乳糖酶，能够引起使分解乳糖分子而得到的β-半乳糖基转移到其他乳糖分子等的反应，通过该反应能够生产低聚半乳糖。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特许第2652049号
专利文献2：日本特许第2739335号
专利文献3：日本特许第5643756号
专利文献4：日本特开平5-236981号公报
专利文献5：日本特表2011-517553号公报
专利文献6：日本特表2013-501504号公报
非专利文献
非专利文献1：Z.Mozaffar,K.Nakanishi,R.Matsuno and T.Kamikubo,Purification and Properties ofβ-Galactosidases from Bacillus circulans(来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶的纯化及性质),Agric.biol.chem.,48,3053-3061(1986)
非专利文献2：Sotoya et al.,Identification of genes involved ingalactooligosaccharide utilization in Bifidobacterium breve strain YIT 4014T.(短双歧杆菌YIT 4014T中参与低聚半乳糖利用的基因的鉴定),Microbiology,163,1420-1428.(2017)
非专利文献3：Van Leeuwen,S.S.,1H NMR analysis of the lactose/β-galactosidase-derived galacto-oligosaccharide components of Vivinal(R)GOS upto DP5.(乳糖/β-半乳糖苷酶衍生的Vivinal(R)GOS至DP5的半乳糖-低聚糖成分的1H NMR分析),Carbohydrates.Res.,400,59-73.(2014)
非专利文献4：T.Moriya,N.Nagahata,R.Odaka,H.Nakamura,J.Yoshikawa,K.Kurashima,T.Saito,Synthesis of an allergy inducing tetrasaccharide"4P-X".(诱导过敏的4糖“4P-X”的合成),Carbohydrates.Res.,439,44-49.(2017)。
发明内容
发明要解决的问题
目前，商业上实用的用于制造低聚半乳糖的乳糖酶主要是来自环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的乳糖酶。来自环状芽孢杆菌的乳糖酶具有低聚半乳糖的制造效率比较高的优点。然而，该乳糖酶存在容易制造4糖以上的低聚半乳糖的缺点。与3糖的低聚半乳糖相比，4糖以上的低聚半乳糖的收率低。
基于这样的背景，本申请的第一目的在于提供一种酶及使用该酶的低聚半乳糖的制造方法，该酶来自环状芽孢杆菌以外的微生物，3糖的低聚半乳糖的制造选择性高，能够高效地制造低聚半乳糖。
另外，低聚半乳糖的制造方法中存在使用产生乳糖酶的微生物的方法和使用从该微生物中纯化的乳糖酶的方法。与使用纯化乳糖酶的情况相比，使用产生乳糖酶的微生物的制造方法具有省去酶纯化的工序这一点、能够通过微生物同化而除去作为副反应产物的葡萄糖等单糖这一点等优点。但是，其研究依然不充分。
此外，作为产生低聚半乳糖的微生物，芽孢杆菌属广为人知，但是在芽孢杆菌属中，炭疽菌、蜡样芽孢杆菌等显示病原性的种也广为人知，正在寻求更安全的低聚半乳糖产生菌。
基于这样的背景，本申请的第二目的在于鉴定适于制造低聚半乳糖的微生物，提供利用该微生物的低聚半乳糖的制造方法。
解决问题的方案
本发明人等对上述第一目的进行了深入研究，结果完成了本发明。
即，根据本发明1，提供具有选自以下的(a)～(f)中的氨基酸序列的酶。
(a)序列号1所示的氨基酸序列，
(b)序列号2所示的氨基酸序列，
(c)在序列号1所示的氨基酸序列中置换、删除、插入1～10个氨基酸的氨基酸序列，该氨基酸序列是具有低聚半乳糖生产活性的酶的氨基酸序列，
(d)在序列号2所示的氨基酸序列中置换、删除、插入1～10个氨基酸的氨基酸序列，该氨基酸序列是具有低聚半乳糖生产活性的酶的氨基酸序列，
(e)相对于序列号1所示的氨基酸序列的同源性为80％以上且小于100％的氨基酸序列，该氨基酸序列是具有低聚半乳糖生产活性的酶的氨基酸序列，
(f)相对于序列号2所示的氨基酸序列的同源性为80％以上且小于100％的氨基酸序列，该氨基酸序列是具有低聚半乳糖生产活性的酶的氨基酸序列。
另外，根据本发明，还提供编码上述酶的DNA。
根据本发明，提供具有选自以下的(A)～(G)中的碱基序列的DNA。
(A)序列号5所示的碱基序列，
(B)序列号6所示的碱基序列，
(C)相对于序列号5所示的碱基序列的同源性为80％以上且小于100％的碱基序列，该碱基序列所编码的酶具有低聚半乳糖生产活性，
(D)相对于序列号6所示的碱基序列的同源性为80％以上且小于100％的碱基序列，该碱基序列所编码的酶具有低聚半乳糖生产活性，
(E)和与序列号5所示的碱基序列互补的碱基序列在严格的条件下杂交的碱基序列，该碱基序列所编码的酶具有低聚半乳糖生产活性，
(F)和与序列号6所示的碱基序列互补的碱基序列在严格的条件下杂交的碱基序列，该碱基序列所编码的酶具有低聚半乳糖生产活性，
(G)相对于上述(A)～(F)的DNA中的任一个的碱基序列进行了保守的碱基置换的碱基序列。
在此，严格的条件可以是在相当于60℃、1×SSC、0.1％SDS的盐浓度和温度下进行洗涤的条件。
另外，根据本发明，还提供具有低聚半乳糖生产活性的酶，其由上述DNA所编码。
此外，根据本发明，还提供重组载体，其包含上述DNA。还提供转化体，其具有上述DNA或该重组载体。
此外，根据本发明，提供具有低聚半乳糖生产活性的酶的制备方法，其包括培养上述转化体的工序以及从培养出的转化体中回收具有低聚半乳糖生产活性的酶的工序。
此外，根据本发明，提供含酶组合物，其包含上述酶作为有效成分。
此外，根据本发明，提供低聚半乳糖的制造方法，其包括使乳糖与饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)所生产的具有低聚半乳糖生产活性的酶接触。
此外，根据本发明，提供低聚半乳糖的制造方法，其包括使乳糖与上述酶接触。
另外，本发明人等针对上述第二目的进行了深入研究，结果鉴定了迄今为止尚不被知道生产低聚半乳糖的微生物，进而发现在该微生物所属的整个属中生产低聚半乳糖这一情况，从而完成了本发明。
即，本发明2是一种低聚半乳糖的制造方法，其包括使属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌的菌体和/或上述细菌的低聚半乳糖生产酶与乳糖接触。
属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌可以是嗜热类芽孢杆菌(Paenibacillus thermophilus)、日本甲虫类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)、解硫胺素类芽孢杆菌(Paenibacillus thiaminolyticus)、饲料类芽孢杆菌(Paenibacilluspabuli)、蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)、解藻酸类芽孢杆菌(Paenibacillusalginolyticus)、千叶类芽孢杆菌(Paenibacillus chibensis)、嗜几丁质类芽孢杆菌(Paenibacillus chitinolyticus)、软骨素类芽孢杆菌(Paenibacillus chondroitinus)、解葡聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus glucanolyticus)、灿烂类芽孢杆菌(Paenibacilluslautus)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、皮氏类芽孢杆菌(Paenibacilluspeoriae)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、强壮类芽孢杆菌(Paenibacillusvalidus)、蜜蜂类芽孢杆菌(Paenibacillus apiarius)、杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus jamilae)、胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)、土地类芽孢杆菌(Paenibacillus terrae)。
属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌可以是嗜热类芽孢杆菌(Paenibacillus thermophilus)、日本甲虫类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)、解硫胺素类芽孢杆菌(Paenibacillus thiaminolyticus)、饲料类芽孢杆菌(Paenibacilluspabuli)、蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)。
发明效果
根据本发明1，使用来自饲料类芽孢杆菌的具有低聚半乳糖生产活性的酶，3糖的低聚半乳糖的制造选择性高，能够高效地制造低聚半乳糖。
通过本发明2，能够提供利用可制造低聚半乳糖的微生物的低聚半乳糖的制造方法。
附图说明
图1(A)是由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)的结果。左泳道为标记物。图1(B)是由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶的SDS-PAGE的结果。左泳道为标记物。
图2是表示由比较例的乳糖酶和实施例2的乳糖酶生成的GOS(低聚半乳糖，Galactooligosaccharides)的比较的图表。
图3是表示确认由比较例的乳糖酶和实施例2的乳糖酶生成的GOS中的变应原性4糖的存在的图表。
图4是基于类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)和芽孢杆菌属(Bacillus属)的16SrDNA部分碱基序列的简易分子系统树。
具体实施方式
《本发明1》
以下，对本发明1进行详述。
在本发明中，低聚糖是指3糖至10糖的多糖化合物。
在本发明中，低聚半乳糖(也记为GOS)主要是指由下述通式表示的低聚糖。
(Gal)n-Gal-Glc
在此，Gal表示半乳糖残基，Glc表示葡萄糖残基，n为1～8的整数，特别是1～3的整数。对于糖间的各键的键合方式，没有特别限制，但典型的是β-1,4-糖苷键。糖间(特别是Gal-Gal间)的键合方式可以为β-1,3-糖苷键。
乳糖酶是能够将乳糖水解成β-半乳糖和葡萄糖的酶。在该分解时，可以使β-半乳糖基转移到其他分子。若转移到水中，则产生β-半乳糖，但是若转移到乳糖(Gal-Glc)，则产生3糖(上述式的n为1)的低聚半乳糖(Gal-Gal-Glc)。
若对3糖(上述式的n为1)的低聚半乳糖(Gal-Gal-Glc)发生该β-半乳糖基的转移反应，则产生4糖(上述式的n为2)的低聚半乳糖((Gal)2-Gal-Glc)。同样地，若对4糖(上述式的n为2)的低聚半乳糖发生该β-半乳糖基的转移反应，则产生5糖(上述式的n为3)的低聚半乳糖。
在制造3糖的低聚半乳糖的情况下，由2分子的乳糖生成1分子的葡萄糖和1分子的3糖的低聚半乳糖。此时的低聚半乳糖的理论收率为约74质量％。
在制造4糖的低聚半乳糖的情况下，由3分子的乳糖生成2分子的葡萄糖和1分子的4糖的低聚半乳糖。此时的低聚半乳糖的理论收率为约65质量％。
因此，在由乳糖制造低聚半乳糖的情况下，仅制造3糖的低聚半乳糖在收率方面是最有效的。在此，低聚半乳糖的收率(质量％)是指“低聚半乳糖的生成量”除以“乳糖的消耗量”而得到的百分率。
在本发明中，酶的乳糖酶活性通过以下列举的2种方法中的任一种来定义。
在乳糖溶液(乳糖浓度为10％)中添加测定对象的酶，测定pH6.5、40℃的条件下的葡萄糖生成量并进行定量。将每1分钟产生1μmol的葡萄糖的酶活性定义为1LU。
在邻硝基苯基-β-吡喃半乳糖苷(ONPG)溶液(ONPG浓度为1.65mM)中添加测定对象的酶，测定pH6.5、40℃的条件下的邻硝基苯基生成量并进行定量。将每1分钟生成1μmol的邻硝基苯基的酶活性定义为1OU。
若能够利用这2种方法中的至少一种来测定活性，则可以判断该酶为乳糖酶。更具体而言，若为0.2LU/mL以上或0.5OU/mL以上，则可以判断为乳糖酶。
然而，即使酶具有乳糖酶活性，也不一定具有低聚半乳糖生产活性(也记为GOS生产活性)。酶的低聚半乳糖生产活性通过以下说明的方法进行评价。
在乳糖溶液(乳糖浓度为60％)中添加测定对象的酶，在pH6.5、50℃的条件下静置或振摇规定时间。在酶具有GOS生产活性的情况下，在此期间由乳糖生产GOS。在经过规定时间后，通过HPLC(高效液相色谱法，High Performance Liquid Chromatography)分析反应溶液。
HPLC中使用的柱可列举美国环球基因有限公司(Transgenomic)制CARBOSep CHO-620 6.5φ×300mm等。在流动相为水、流速为0.4mL/min、温度为85℃、检测为RI(示差折光检测器,refractive index detector)的条件下进行分析。
若GOS的HPLC峰面积的总计值相对于单糖和2糖以及GOS(3糖以上，主要为3～5糖)的峰面积的总计值所占的比例为基准值以上，则可以判断为有低聚半乳糖生产活性。该基准值通常为1％。当然，该比例越大，该酶具有越高的低聚半乳糖生产活性。在想要获得具有高的低聚半乳糖生成活性的酶的情况下，可以设定高的基准值。因此，可以将该基准值设定为1％、3％、5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％。
(BgaD)
BgaD是目前商业上利用最多的GOS制造用乳糖酶，是来自环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)的乳糖酶。根据迄今为止的研究，已知BgaD由分子量不同的4种酶，即分子量195kDa的乳糖酶(BgaD-A，序列号3，GenBank code(核酸序列数据库代码)：BAJ61032)、分子量160kDa的乳糖酶(BgaD-B)、分子量135kDa的乳糖酶(BgaD-C)和分子量86kDa的乳糖酶(BgaD-D，序列号4)构成(专利文献3)。已知其中最小尺寸的BgaD-D的GOS生产活性最高，天野酶制品株式会社销售的GOS制造用乳糖酶制剂“β-半乳糖苷酶(Biolacta)”中也较多地含有BgaD-D。
在下述的本发明的GOS制造方法中，使用BgaD-D作为GOS制造用乳糖酶时的GOS收率为约60～70％。
GOS收率(％)是指GOS生成量/乳糖消耗量的百分率。GOS生成量和乳糖消耗量可以通过HPLC分析求出。
在下述的本发明的GOS制造方法中，使用BgaD-D作为GOS制造用乳糖酶时的3糖GOS的制造选择性最大为约60％。
3糖GOS的制造选择性(％)是指3糖GOS的生成量相对于GOS的总生成量的百分率。该数值越高，表示越主要生成3糖GOS。GOS的总生成量和3糖GOS的生成量可以通过HPLC分析求出。3糖GOS的制造选择性优选为60％以上，更优选为70％以上，进一步优选为75％以上，特别优选为80％以上。
在使用BgaD-D制造GOS的情况下，也会较多地制造4糖以上的GOS。
＜具有GOS生产活性的酶及编码其的DNA＞
根据本发明的第1方式，提供具有低聚半乳糖生产活性的新型的酶及编码该酶的DNA。
本发明人等发现了与作为来自环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的GOS生产酶的BgaD同源性低的酶，该酶发挥高收率且高GOS制造选择性。该酶是指由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶和由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶及它们的同源物。
由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶和由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶均为饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)所产生的酶。任一氨基酸序列均为本发明人等首次确定并报告的氨基酸序列。
(由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶)
由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶的分子量为约114kDa(参照图1A)。与BgaD-D的同源性为约15％。可知该酶是作为乳糖酶发挥功能的酶，可以在以乳糖为原料的GOS制造中使用。
在下述的本发明的GOS制造方法中，使用由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶作为GOS制造用乳糖酶时的GOS收率为约45～约60％。但是，所制造的GOS中的3糖GOS的制造选择性为约75％以上。此外，该酶的表示酶的性能的Km值(米氏常数)比BgaD-D优异。
(由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶)
由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶的分子量为约50kDa(参照图1B)。与BgaD-D的同源性为约8％。可知该酶是作为乳糖酶发挥功能的酶，可以在以乳糖为原料的GOS制造中使用。
在下述的本发明的GOS制造方法中，使用由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶作为GOS制造用乳糖酶时的GOS收率为约60～约70％。另外，所制造的GOS中的3糖GOS的制造选择性为约80％以上。
由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶以形成β-1,3-糖苷键的方式使β-半乳糖基(β-半乳糖残基)高度选择性地转移至糖(例如乳糖)。即，利用由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶制造的GOS大多为β-半乳糖基间形成了β-1,3-糖苷键的3糖GOS。在常见的肠道内细菌中，只有双歧杆菌能够分解β-1,3-糖苷键。因此，在摄取这种含有大量糖的GOS的情况下，可设想在肠道内双歧杆菌能够优先同化该GOS并增殖。此外，在以往的大多数GOS中，半乳糖基与乳糖形成β-1,4-糖苷键或β-1,6-糖苷键而键合。
这样，在由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶和由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶实现高GOS收率的同时，还兼顾高的酶化学性质、高的3糖GOS选择性。通过使用来自于饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)的这些酶，从而与以往相比，能够减少导致收率变差的4糖以上的GOS的产生。
当然，可推断由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶的家族酶和由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶的家族酶也发挥同样的效果。
此外，当然，只要不损害该功能，上述酶也可以具有附加区域。作为这样的附加区域，例如可列举标签结构域等区域。附加它们的位置可以为N末端、C末端中的一者或两者中的任意一种情况。
因此，作为本发明的第1方式，提供以下的酶(1)～(5)。
(1)由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶，
(2)由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶，
(3)由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶的家族酶(或同源物)，
(4)由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶的家族酶(或同源物)，
(5)在上述(1)～(4)的酶中附加肽等而得到的酶，该酶具有低聚半乳糖生产活性。
某一酶E1为另一酶E2的家族(或同源物)是指E1和E2的基于氨基酸序列的同源性(或者也可以表述为同一性、相似性)具有80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上。上限值没有特别限制，但是小于100％。即，存在至少1个以上的氨基酸残基的置换、删除、插入。对于氨基酸序列同源性，可以使用利用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，基于局部比对搜索工具)算法和BLAST2.0算法的公知的软件等容易地计算。
某一酶E1为另一酶E2的家族(或同源物)特别是指酶E1的氨基酸序列可以通过针对酶E2的氨基酸序列进行1个以上且10个以下的氨基酸的置换、删除、插入来实现。置换是指特定部位的氨基酸被置换为其他氨基酸。删除是指缺失了特定部位的氨基酸。插入是指不存在的氨基酸被追加到氨基酸序列的内部。
此外，某一酶E1和另一酶E2为家族(或同源物)是指酶E1和酶E2能够发挥相同的功能。对于该功能中的活性比，没有特别限制。例如，将活性更高的酶设为E1，将其活性设为100％时，活性更低的酶E2的活性为1％以上、5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上或90％以上。
由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶的家族酶是指相对于序列号1所示的氨基酸序列具有80％以上且小于100％的同源性，并且具有低聚半乳糖生产活性的酶。特别是指由在序列号1所示的氨基酸序列中置换、删除、插入1～10个氨基酸的氨基酸序列构成，且具有低聚半乳糖生产活性的酶。由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶的家族酶相对于序列号1所示的氨基酸序列的同源性的下限值可以为85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上。即使在同源性的下限值为这些的情况下，上限值也均小于100％。
同样地，由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶的家族酶是指相对于序列号2所示的氨基酸序列具有80％以上且小于100％的同源性，并且具有低聚半乳糖生产活性的酶。特别是指由在序列号2所示的氨基酸序列中置换、删除、插入1～10个氨基酸的氨基酸序列构成，且具有低聚半乳糖生产活性的酶。由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶的家族酶相对于序列号2所示的氨基酸序列的同源性的下限值可以为85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上。即使在同源性的下限值为这些的情况下，上限值也均小于100％。
因此，更具体而言，作为本发明的第1方式，提供以下的酶(1)～(7)。
(1)由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶，
(2)由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶，
(3)由在序列号1所示的氨基酸序列中置换、删除、插入1～10个氨基酸的氨基酸序列构成的酶，该酶具有低聚半乳糖生产活性，
(4)由在序列号2所示的氨基酸序列中置换、删除、插入1～10个氨基酸的氨基酸序列构成的酶，该酶具有低聚半乳糖生产活性，
(5)由相对于序列号1所示的氨基酸序列的同源性为80％以上且小于100％的氨基酸序列构成的酶，该酶具有低聚半乳糖生产活性，
(6)由相对于序列号2所示的氨基酸序列的同源性为80％以上且小于100％的氨基酸序列构成的酶，该酶具有低聚半乳糖生产活性，
(7)在上述(1)～(6)的酶中附加肽等而得到的酶，该酶具有低聚半乳糖生产活性。
换言之，作为本发明的第1方式，提供具有以下的氨基酸序列(a)～(f)或由氨基酸序列(a)～(f)构成的酶。
(a)序列号1所示的氨基酸序列，
(b)序列号2所示的氨基酸序列，
(c)在序列号1所示的氨基酸序列中置换、删除、插入1～10个氨基酸的氨基酸序列，该氨基酸序列是具有低聚半乳糖生产活性的酶的氨基酸序列，
(d)在序列号2所示的氨基酸序列中置换、删除、插入1～10个氨基酸的氨基酸序列，该氨基酸序列是具有低聚半乳糖生产活性的酶的氨基酸序列，
(e)相对于序列号1所示的氨基酸序列的同源性为80％以上且小于100％的氨基酸序列，该氨基酸序列是具有低聚半乳糖生产活性的酶的氨基酸序列，
(f)相对于序列号2所示的氨基酸序列的同源性为80％以上且小于100％的氨基酸序列，该氨基酸序列是具有低聚半乳糖生产活性的酶的氨基酸序列。
另外，本发明的第1方式还提供编码如上所述的酶的DNA。只要编码上述的酶，则由任何碱基序列构成的DNA均在本发明的范围内。特别是，由以下详细说明的碱基序列构成的DNA是这样的DNA的典型例。
由序列号5所示的碱基序列构成的DNA编码由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶(包含3’末端的终止密码子)。由序列号6所示的碱基序列构成的DNA编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶(包含3’末端的终止密码子)。如上所述，由序列号1和序列号2所示的氨基酸序列构成的酶均具有良好的低聚半乳糖生产活性。因此，由与这些碱基序列同源性高的碱基序列构成的DNA所编码的酶是高概率地具有低聚半乳糖生产活性的酶。
另外，由相对于上述DNA进行了保守的碱基置换的碱基序列构成的DNA也包含在本发明中。碱基序列的保守的碱基置换是指碱基序列中的碱基的置换中的、进行编码的酶的氨基酸序列不发生变化的置换。即，是指2个以上的DNA处于各自的碱基序列相互不同但编码同一氨基酸序列的酶的关系。
此外，当然，只要不损害自身或所编码的酶的功能，上述DNA也可以具有附加区域。作为这样的附加区域，例如可列举该DNA自身的重复结构、终止密码子、操纵序列、与标签肽对应的区域等。附加了这些的位置可以为5’末端、3’末端中的一者或两者中的任意一种情况。
因此，作为本发明的第1方式，提供以下的DNA(1)～(6)。
(1)由序列号5所示的碱基序列构成的DNA，
(2)由序列号6所示的碱基序列构成的DNA，
(3)由与序列号5所示的碱基序列具有高同源性的碱基序列构成的DNA，该DNA所编码的酶具有低聚半乳糖生产活性，
(4)由与序列号6所示的碱基序列具有高同源性的碱基序列构成的DNA，该DNA所编码的酶具有低聚半乳糖生产活性，
(5)由相对于上述(1)～(4)的DNA中的任一碱基序列进行了保守的碱基置换的碱基序列构成的DNA，
(6)在上述(1)～(5)的DNA中附加了上述(1)～(5)的DNA、终止密码子、操纵序列等的DNA，该DNA所编码的酶具有低聚半乳糖生产活性。
由与某一DNA的碱基序列具有高同源性(或者也可以表述为同一性、相似性)的碱基序列构成的DNA是指由相对于某一DNA的碱基序列的同源性为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的碱基序列构成的DNA。上限值没有特别限制，小于100％。对于DNA的碱基序列同源性，可以使用利用BLAST算法和BLAST2.0算法的公知的软件等容易地计算。
与此不同/在此基础上，由与某一DNA的碱基序列具有高同源性的碱基序列构成的DNA是指在严格的条件下与由与该某一DNA的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA杂交或能够杂交的DNA。
在此，“严格的条件”是指形成所谓的特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。杂交的严格性主要由温度、离子强度和变性剂的条件决定。作为严格的条件，例如可列举在相当于60℃、1×SSC、0.1％SDS的盐浓度和温度下进行洗涤的条件。也可以设为在相当于60℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度和温度下进行洗涤的条件、在相当于68℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度和温度下进行洗涤的条件。
因此，更具体而言，作为本发明的第1方式，提供以下的DNA(1)～(8)。
(1)由序列号5所示的碱基序列构成的DNA，
(2)由序列号6所示的碱基序列构成的DNA，
(3)由相对于序列号5所示的碱基序列的同源性为80％以上且小于100％的碱基序列构成的DNA，该DNA所编码的酶具有低聚半乳糖生产活性，
(4)由相对于序列号6所示的碱基序列的同源性为80％以上且小于100％的碱基序列构成的DNA，该DNA所编码的酶具有低聚半乳糖生产活性，
(5)由和与序列号5所示的碱基序列互补的碱基序列在严格的条件下杂交的碱基序列构成的DNA，该DNA所编码的酶具有低聚半乳糖生产活性，
(6)由和与序列号6所示的碱基序列互补的碱基序列在严格的条件下杂交的碱基序列构成的DNA，该DNA所编码的酶具有低聚半乳糖生产活性，
(7)由相对于上述(1)～(6)的DNA中的任一个的碱基序列进行了保守的碱基置换的碱基序列构成的DNA，
(8)在上述(1)～(7)的DNA中附加了上述(1)～(7)的DNA的重复结构、终止密码子、操纵序列等的DNA，该DNA所编码的酶具有低聚半乳糖生产活性。
换言之，作为本发明的第1方式，提供具有以下的碱基序列(A)～(G)或由碱基序列(A)～(G)构成的DNA。
(A)序列号5所示的碱基序列，
(B)序列号6所示的碱基序列，
(C)相对于序列号5所示的碱基序列的同源性为80％以上且小于100％的碱基序列，该碱基序列所编码的酶具有低聚半乳糖生产活性，
(D)相对于序列号6所示的碱基序列的同源性为80％以上且小于100％的碱基序列，该碱基序列所编码的酶具有低聚半乳糖生产活性，
(E)和与序列号5所示的碱基序列互补的碱基序列在严格的条件下杂交的碱基序列，该碱基序列所编码的酶具有低聚半乳糖生产活性，
(F)和与序列号6所示的碱基序列互补的碱基序列在严格的条件下杂交的碱基序列，该碱基序列所编码的酶具有低聚半乳糖生产活性，
(G)相对于(A)～(F)的DNA中的任一个的碱基序列进行了保守的碱基置换的碱基序列。
此外，如上所述的DNA例如可以在从类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌(特别是饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli))中回收基因组DNA后，通过以其为模板的PCR(聚合酶链式反应，polymerase chain reaction)而得到。
作为用于扩增编码由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶或其同源物的结构基因的引物对，例如可列举引物1和引物2。
引物1：5’-GAACACAAGGTCATGAAAGCAGCAAAGGCAGAT-3’
引物2：5’-CATCCTGTTAAGCTTTTACAATGCCCGAATGAC-3’
作为用于扩增编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶或其同源物的结构基因的引物对，例如可列举引物3和引物4。
引物3：5’-GAACACAAGGTCATGACCATTTTTCAATTTCCG-3’
引物4：5’-CATCCTGTTAAGCTTTTAACGGATTTCCAGCCAATTG-3’
这样，可以获得编码由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶或其同源物的结构基因(例如由序列号5所示的碱基序列构成的DNA)、编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶或其同源物的结构基因(例如由序列号6所示的碱基序列构成的DNA)。
＜载体＞
作为本发明的第2方式，提供含有第1方式的DNA的重组载体。通过该重组载体能够进行转化体的制作和酶的大量表达。
作为载体，没有特别限制，可以使用通常使用的载体。例如可列举质粒、细菌噬菌体、粘粒、噬菌粒等。
作为质粒，例如可列举pK4、pRK401、pRF31、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pBIC、pUB110、pTP5、YEp13、YEp24、YCp50等。
作为噬菌体，可列举λ噬菌体(λgt10、λgt11、λZAP等)。此外，还可以使用逆转录病毒或牛痘病毒等动物病毒、杆状病毒等昆虫病毒载体。
载体中可以连结启动子、增强子等顺式元件、剪接信号、多聚A附加信号、选择标记、核糖体结合序列(SD序列)、起始密码子、终止密码子等。另外，也可以连结用于使所制造的酶的纯化变得容易的标签序列。作为标签，可以利用His标签(多聚组氨酸标签)、GST(谷胱甘肽巯基转移酶，Glutathione S-transferase)标签、MBP(麦芽糖结合蛋白，maltosebinding protein)标签等公知的标签。另外，载体还可以包含用于选择的抗生素抗性基因等。
对于向载体插入DNA的方法，没有特别限制，可以使用通常使用的方法。通常通过以下的方法进行。首先，将纯化的DNA用适当的限制酶切断，插入到载体DNA的限制酶部位或多克隆位点，与载体连结。
＜转化体＞
根据本发明的第3方式，提供包含(或导入有)第1方式的DNA和/或第2方式的重组载体的转化体。
对于作为转化体的宿主的生物，没有特别限制，可以使用通常使用的生物。原核生物、古细菌、真核生物均可以使用，例如可列举真细菌(大肠杆菌等)、酵母、植物细胞、动物细胞(COS细胞、CHO细胞等)、昆虫细胞。
作为宿主，特别是可列举芽孢杆菌属(Bacillus属)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus属)(例如桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)、埃希氏菌属(Escherichia属)(例如大肠杆菌(Escherichia coli)、棒杆菌属(Corynebacterium属)、酵母属(Saccharomyces属)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces属)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces属)、毕赤酵母属(Pichia属)、曲霉属(Aspergillus属)、青霉属(Penicillium属)、辽宁木霉属(Trichoderma属)的微生物。另外，还可列举乳酸菌、醋酸菌之类的有食用经验的微生物。
对于将DNA和/或重组载体导入到这些宿主中的方法，没有特别限制。例如可列举电穿孔法、原生质球法、醋酸锂法、磷酸钙法、脂质转染法等。也可以利用同源重组等插入或附加到宿主的基因组中。
此外，对于DNA、重组载体是否被导入到宿主中的确认方法，可以使用任意的方法。例如，可以通过PCR法、萨瑟思杂交(Southern hybridization)、诺瑟杂交(Northernhybridization)等进行。
可以利用上述转化体，通过以往公知的方法来制备本发明的酶及含有该酶的组合物。例如，可以通过以下说明的方法来制备。
将导入了对象基因的上述转化体在液体培养基中大量培养。大量培养后，可以将规定的诱导剂给予至转化体而诱导对象基因的表达。例如，在载体使用Lac(乳糖)操纵子的情况下，可以给予IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)而诱导对象基因的表达。
在大量表达后，回收培养上清或通过超声波或细胞壁溶解酶等将细胞破碎而得到的破碎液。在该上清、破碎液中大量含有本发明的酶。可以将该上清、破碎液作为含酶的液体组合物直接使用，也可以对该液体组合物实施纯化处理而作为纯化酶回收。
该纯化处理例如可以通过盐析、膜分离、柱色谱来执行。这些操作可以是一种或组合多种。对于柱色谱的种类，没有限制，但是，可以使用包含特异性地作用于这些酶的抗体等的柱，也可以使用能够与预先附加于酶的His标签等标签结构域相互作用的柱。
通过这样的方法，能够大量制备由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶或其同源物或者由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶或其同源物。这些酶可以用于制造低聚半乳糖。
＜GOS的制造方法＞
根据本发明的第4方式，提供使用了上述的酶等来自饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)的乳糖酶的GOS的制造方法。
由于本发明的第1方式中详述的酶等来自饲料类芽孢杆菌(Paenibacilluspabuli)的乳糖酶具有低聚半乳糖生产活性，所以能够使用其由乳糖制造GOS。对于GOS制造的方法、条件，没有限制。以下列举1例进行说明，但本发明不限于此。
本发明的GOS的制造方法包括使酶与乳糖接触的工序、通过该接触来制造GOS的工序。也可以包括将任意制造的GOS分离纯化的工序。
本发明的GOS制造方法包括使上述的酶与乳糖接触。与乳糖接触的酶可以是从产生该酶的微生物中纯化的状态(纯化酶)。或者，可以使该微生物自身与乳糖接触，也可以使也混合存在微生物的破碎物、提取物等其他因子的混合物与乳糖接触。从预防副反应的观点考虑，优选使纯化酶与乳糖接触。
纯化酶是指通过经过规定的纯化处理而得到的酶溶液或酶固体成分。主要是指实质上不含有该酶以外的酶，或者其他酶被减少。
通过在含有乳糖的溶液中混合酶等，或者在含有酶等的溶液中混合乳糖，从而形成用于制造低聚半乳糖的反应体系(含有溶剂、乳糖、本发明的酶的混合物)。溶剂是任意的，但是通常为水或以水为主成分的水性溶剂。
对于反应体系的乳糖的含有率，没有特别限制，可以任意设定。以反应体系总量基准计，例如可以设为1～80质量％、2～70质量％或4～60质量％。
在某一实施方式中，还可以设为4～50质量％、4～40质量％、4～30质量％、4～20质量％、4～10质量％。在这样的较低底物浓度的区域中，优选使用由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶、其家族酶。这是因为它们的Km值优异，即使在低底物浓度下也具有充分的活性。
在另一实施方式中，可以设为5～60质量％、10～60质量％、20～60质量％、30～60质量％、40～60质量％。在这样的较高底物浓度的区域中，优选使用由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶或其家族酶。它们兼具良好的GOS生产活性和3糖GOS选择活性，能够在短时间内制造大量的3糖GOS。
对于反应体系的本发明的酶的含量，没有特别限制，可以任意设定。在反应体系中，例如可以设为0.1～10LU/mL或0.1～10OU/mL。
GOS生产活性根据反应体系而不同。如下决定本发明的酶的含量即可。
作为第一工序，在特定的反应体系(乳糖的含有率、本发明的酶的含量、反应pH、反应温度、反应时间等)中，确认相对于本发明的酶的含量的GOS生产量。
作为第二工序，测定先前的反应体系中所含的本发明的酶的乳糖酶活性(LU/mL或OU/mL中的至少一个)。
作为第三工序，以第二工序中测定的乳糖酶活性为指标，调整反应体系中所含的本发明的酶量(增加或降低本发明的酶的含量)。
作为第四工序，以使反应体系中所含的本发明的酶的含量达到调整后的值的方式含有本发明的酶。
此外，上述的第一工序和第二工序可以相反地进行。
对于反应体系的pH，没有特别限制，可以任意设定。例如可以设为3～9、4～8或5～7。当然，pH可以是恒定的，也可以是变化的。
对于反应体系的温度，没有特别限制，可以任意设定。例如可以设为20～75℃、30～75℃、40～75℃、50～70℃或60～70℃。当然，温度可以是恒定的，也可以是变化的。优选选择反应体系中所含的乳糖溶解的温度。
对于反应时间，没有特别限制，可以任意设定。例如可以设为1～100小时、12～60小时或24～48小时。
这一系列的制造方法可以是分批式，也可以是连续式。在分批式中，向反应器中投入规定量的酶和原料乳糖，在以规定时间生成GOS之后，从反应器中回收含有GOS的混合物。在连续式中，向反应器中连续或间歇地投入酶和/或原料乳糖。然后，一边生成GOS，一边从反应器中回收含有GOS的混合物。
在本发明中，对于作为原料的乳糖的状态，没有特别限制。可以是溶解于任意溶剂的乳糖溶液。另外，也可以使用作为凝乳后的上清的乳清及其浓缩物、脱脂粉乳等含有乳糖的混合物作为乳糖原料。
在上述工序的结束时刻，在反应体系中混合存在单糖、二糖、GOS。可以直接作为GOS溶液使用，也可以从中纯化GOS。对于纯化GOS的方法，没有特别限制，可以采用任意的方法。例如，可以通过使用活性炭或配位有金属离子的阳离子交换树脂、凝胶过滤用树脂的柱色谱分离成各个组分。
柱色谱中的柱的尺寸、溶剂的种类、溶剂的流量等条件也可以任意调整。
《本发明2》
以下，对本发明2进行详述。
在本发明中，低聚糖是指3糖至10糖的多糖化合物。
在本发明中，低聚半乳糖(也记为GOS)主要是指由下述通式表示的低聚糖。
(Gal)n-Gal-Glc
在此，Gal表示半乳糖残基，Glc表示葡萄糖残基，n为1～8的整数，特别是1～3的整数。对于糖间的各键的键合方式，没有特别限制，但典型地为β-1,4-糖苷键。
乳糖酶是能够将乳糖水解成β-半乳糖和葡萄糖的酶。在该分解时，可以使β-半乳糖基转移到其他分子。若转移到水中，则产生β-半乳糖，但是若转移到乳糖(Gal-Glc)中，则产生3糖(上述式的n为1)的低聚半乳糖(Gal-Gal-Glc)。
若对3糖(上述式的n为1)的低聚半乳糖(Gal-Gal-Glc)发生该β-半乳糖基的转移反应，则产生4糖(上述式的n为2)的低聚半乳糖((Gal)2-Gal-Glc)。同样地，若对4糖(上述式的n为2)的低聚半乳糖发生该β-半乳糖基的转移反应，则产生5糖(上述式的n为3)的低聚半乳糖。
本发明的低聚半乳糖的制造方法使用类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌作为产生乳糖酶的微生物。类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌通常产生低聚半乳糖的情况迄今为止还没有被报告。
作为类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌，例如可列举以下的细菌。下述的细菌均可以从土壤等中分离，或者保藏于公共机构，只要是本领域技术人员就能够容易地获得。
·嗜热类芽孢杆菌(Paenibacillus thermophilus)(例如，保藏号DSM 24746)
·日本甲虫类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)(例如，保藏号DSM 22700)
·解硫胺素类芽孢杆菌(Paenibacillus thiaminolyticus)(例如，保藏号NBRC15656)
·饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)(例如，保藏号NBRC 13638)
·蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)(例如，保藏号NBRC 3343)
·解藻酸类芽孢杆菌(Paenibacillus alginolyticus)(例如，保藏号NBRC15375)
·千叶类芽孢杆菌(Paenibacillus chibensis)(例如，保藏号NBRC 15958)
·嗜几丁质类芽孢杆菌(Paenibacillus chitinolyticus)(例如，保藏号NBRC15660)
·软骨素类芽孢杆菌(Paenibacillus chondroitinus)(例如，保藏号NBRC15376)
·解葡聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus glucanolyticus)(例如，保藏号NBRC15330)
·灿烂类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)(例如，保藏号NBRC 15380)
·浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)(例如，保藏号NBRC 15307)
·皮氏类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)(例如，保藏号NBRC 15541)
·多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)(例如，保藏号NBRC 15309和保藏号JCM 2507)
·强壮类芽孢杆菌(Paenibacillus validus)(例如，保藏号NBRC 15382)
·蜜蜂类芽孢杆菌(Paenibacillus apiarius)(例如，保藏号DSM 5581)
·杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus jamilae)(例如，保藏号DSM 13815)
·胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)(例如，保藏号JCM 11465)
·土地类芽孢杆菌(Paenibacillus terrae)(例如，保藏号JCM11466)
可知上述类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌能够以乳糖为原料制造低聚半乳糖。通常，即使有乳糖酶活性，也不一定生产低聚半乳糖。无法根据基因序列确认低聚半乳糖的生成性，因此为了确认低聚半乳糖的生成性，需要实际进行试验来确认低聚半乳糖的生成性。在上述的大多的类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)中，能够确认低聚半乳糖的生成性。另外，微生物生产低聚糖的理由可以认为是，通过将糖转化为低聚糖，使糖难以被异种微生物同化，在富营养时将低聚糖作为储藏物质储藏，在贫营养时将该低聚糖同化，预防/降低伴随着乳糖分解而引起的渗透压变化。由于附近种类的微生物可以通过同样的基因进行同样的生存战略，所以可以认为附近种类的微生物具有生产同样的低聚糖的能力。由此可推测，在属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的所有微生物中，均生产低聚半乳糖。另外，也可以使用这些类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)细菌的突变株和/或通过基因重组技术制造的重组体等。
类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌通常生长速度快。另外，对多种微生物具有抗菌性。因此，在制造低聚半乳糖时，比酵母等更容易大量培养这些细菌。
另一方面，与芽孢杆菌属(Bacillus属)的细菌不同，还未知晓显示对人体的病原性的类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌，可以认为操作中的安全性也高。
对这些类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌和芽孢杆菌属(Bacillus属)的细菌进行分析的系统树为图4。由图4可知，类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)是与芽孢杆菌属(Bacillus属)明显分歧的属。
在本发明的低聚半乳糖的制造方法中，使这些类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌的菌体和/或上述细菌的低聚半乳糖生产酶与乳糖接触来制造低聚半乳糖。对于低聚半乳糖生产酶，也可以使用经纯化的酶。另外，也可以使用含有该酶的混合物(含酶的混合物)。作为含酶的混合物，可列举菌体的破碎物、提取物等菌体的处理物。处理物可以为固态，也可以为液态。在细菌将该酶分泌到菌体外的情况下，除去了菌体的培养基也可以作为含酶的混合物使用。
更具体而言，在本发明的低聚半乳糖的制造方法的典型的实施方式中，执行以下工序：
培养类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌的任意的工序(培养工序)；
使类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌的菌体和/或其低聚半乳糖生产酶与原料乳糖接触的工序(混合工序)；
由原料乳糖制造低聚半乳糖，得到低聚半乳糖混合物的工序(低聚半乳糖生成工序)；和
从上述GOS混合物中纯化低聚半乳糖的任意的工序(低聚半乳糖纯化工序)。
这一系列制造方法可以是分批式，也可以是连续式。在分批式中，向反应器中投入规定量的类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌和原料乳糖，在以规定时间生成GOS之后，从反应器中回收含有GOS的混合物。在连续式中，向反应器中连续或间歇地投入类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌或其酶、和/或原料乳糖。然后，一边生成GOS，一边从反应器中回收含有GOS的混合物。
在本发明中，对于作为原料的乳糖的状态，没有特别限制。可以是溶解于任意溶剂的乳糖溶液。另外，也可以使用作为凝乳后的上清的乳清及其浓缩物、脱脂粉乳等含有乳糖的混合物作为乳糖原料。
在进行接触时，为了操作的便利性，优选利用适当的溶剂将乳糖或类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌和/或其低聚半乳糖生产酶制成流体。溶剂是任意的，但典型的是水或以水为主成分的水性溶剂。
通常，对于类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌，在使其与乳糖接触之前进行培养。对于类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌的培养条件，没有任何限制，是任意的。例如，可以在厌氧或需氧条件下在液体培养基中在约30℃下培养约3天。对于液体培养基的种类，没有任何限制，可以使用任意的液体培养基。例如可列举大豆酪蛋白消化物(SCD)培养基、脑心浸液(BHI)培养基等。
对于通过培养得到的类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌，无论生死，均可以有利地使用培养物或其处理物。也可以浓缩培养物。能够通过离心分离将液体培养基与菌体分离，用生理盐水、蒸馏水等进行洗涤得到湿菌体。此外，作为培养物的处理物，可列举超声波处理物、溶菌酶处理物、表面活性剂处理物、机械磨碎处理物等。可以使它们悬浮于适当的溶剂，制成包含类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌的菌体和/或酶的流体。
通过将乳糖与类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌混合而形成用于制造低聚半乳糖的反应体系(含有溶剂、乳糖、类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌的菌体和/或酶的混合物)。
对于反应体系的类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌的菌体的含量，没有特别限制，可以适当设定。例如以湿菌体计可以为10～200g/L、30～150g/L、50～100g/L。在使用破碎物、提取物、培养基等含酶的混合物来含有酶的情况下，将其含量调整为使原来的菌株成为上述范围的量即可。
对于反应体系的乳糖的含量，没有特别限制，可以适当设定。例如以反应体系总量基准计，可以为5～60质量％或30～60质量％。随着乳糖的消耗，可以适当补充乳糖。
对于反应体系的类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌的含量相对于乳糖的含量的比率(kg/kg)，没有特别限制，可以适当设定。例如，相对于乳糖量，以湿菌体计可以为1/30～1/1、1/20～1/2、1/10～1/5。在使用破碎物、提取物、培养基等含酶的混合物来含有酶的情况下，将其含量调整为使原来的菌株成为上述范围的量即可。
对于反应体系的温度，没有特别限制，可以适当设定。例如可以设为10～75℃、20～60℃或30～50℃。当然，温度可以是恒定的，也可以是变化的。
对于反应体系的pH，没有特别限制，可以适当设定。例如可以设为3～9、5～8、6～8、6～7.5或6～7。当然，pH可以是恒定的，也可以是变化的。
对于反应体系的反应时间，没有特别限制，可以适当设定。例如可以设为1～50小时、5～30小时或12～24小时。
为了有效地进行低聚半乳糖的制造，反应体系也可以含有无机盐类等。无机盐类等的含量例如以反应体系总量基准计为0.00001～10质量％、0.0001～1质量％。作为包含无机盐类的溶剂，也可以使用SCD培养基和BHI培养基等液体培养基。
在上述工序的结束时刻，在反应体系中混合存在单糖、二糖、GOS。可以直接作为含有菌体的GOS溶液使用，也可以除去菌体后作为GOS溶液使用，还可以从中纯化GOS。从含有菌体的GOS溶液中除去菌体的方法是任意的。例如可列举利用离心分离、过滤、加热等的灭菌处理等。对于纯化GOS的方法，没有特别限制，可以采用任意的方法。可以通过使用活性炭或配位有金属离子的阳离子交换树脂、凝胶过滤用树脂的柱色谱分离成各个组分。
柱色谱中的柱的尺寸、溶剂的种类、溶剂的流量等条件也可以任意调整。
实施例
《本发明1》
以下，列举实施例具体地说明本发明1，但本发明不限于这些实施例。
(实施例1～2：由序列号1和序列号2所示的氨基酸序列构成的酶)
从饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)采集基因组DNA，将其作为模板，通过PCR分别扩增编码由序列号1和序列号2所示的氨基酸序列构成的酶的DNA(结构基因)。
为了扩增编码由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶的结构基因(即，由序列号5所示的碱基序列构成的DNA)而使用的引物对为引物1和2。
引物1：5’-GAACACAAGGTCATGAAAGCAGCAAAGGCAGAT-3’
引物2：5’-CATCCTGTTAAGCTTTTACAATGCCCGAATGAC-3’
为了扩增编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶的结构基因(即，由序列号6所示的碱基序列构成的DNA)而使用的引物对为引物3和4。
引物3：5’-GAACACAAGGTCATGACCATTTTTCAATTTCCG-3’
引物4：5’-CATCCTGTTAAGCTTTTAACGGATTTCCAGCCAATTG-3’
使用BIC系统(宝日医TaKaRa)，通过同源重组将扩增后的各个结构基因插入到质粒pBIC中。将各个质粒导入到桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)中，使酶大量表达。
在产生各酶后，对该转化体进行超声波破碎，得到细胞破碎液。将该破碎液的SDS-PAGE的结果示于图1。图1A是具有序列号1所示的氨基酸序列的酶的SDS-PAGE的结果，图1B是由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶的SDS-PAGE的结果。根据需要对所制备的细胞破碎液进行超滤，将酶进行了浓缩。将由序列号1所示的氨基酸序列构成的酶的浓缩破碎液作为实施例1，将由序列号2所示的氨基酸序列构成的酶的浓缩破碎液作为实施例2。
对于实施例1的乳糖酶活性，乳糖分解活性为0.4LU/mL，ONPG分解活性为11.7OU/mL。
对于实施例2的乳糖酶活性，乳糖分解活性为51.7LU/mL，ONPG分解活性为240OU/mL。
(验证1：反应速度参数的分析)
通过以下的方法求出以实施例1的酶的ONPG为底物时的反应速度参数。计算在0.075～7.5mM的底物浓度下在40℃反应10分钟时的比活性(μmol/mg protein(蛋白质)/min(分钟))，针对各底物浓度绘制比活性。此时，缓冲液使用100mM的磷酸钠(pH6.5)。根据通过上述方法测定的底物饱和曲线，按照米氏-门氏公式，计算出表示酶和底物的亲和性的Km(米氏-门氏常数)和表示每1mg酶在1分钟催化几μmol的底物的Vmax(最大反应速度)。其与β-galII的性能进行了比较的结果为表1。β-galII是从环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)的培养液中仅纯化低分子的乳糖酶而得到的酶，是β-半乳糖苷酶(Biolacta)(天野酶制品株式会社制)的主要酶(非专利文献1)。
[表1]
*引用自非专利文献1
由表1可知，实施例1的酶的最大反应速度与Biolacta所含的酶相同，但表示对底物ONPG的亲和性的Km显著低。因此，可以认为，若使用本发明的酶，则即使在比Biolacta低的底物浓度下，也能够高效地制造GOS。
(比较例)
作为比较例，使用由序列号4所示的氨基酸序列构成的酶(来自环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的乳糖酶BgaD-D)。为了获得本酶，从Bacillus sp(芽孢杆菌).ATCC31382株(旧名环状芽孢杆菌(Bacillus circulans))中采集基因组DNA，将其作为模板，通过PCR扩增编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的酶的结构基因。在本基因的N末端侧附加起始密码子，在C末端侧附加终止密码子，将其导入到桥石短芽孢杆菌(Brevibacilluschoshinensis)中，使酶大量表达。在产生酶后，对该转化体进行超声波破碎而得到细胞破碎液。
(验证2：GOS制造能力的分析)
评价实施例1、实施例2和比较例的各样品的GOS生成能力。对于实施例1的酶，在含有1mM的硫酸镁和0.064mM的EDTA(乙二胺四乙酸)的0.1M的磷酸钾缓冲液(pH6.5)中，以最终浓度以体系总量基准计成为30质量％的方式配合乳糖，以活性成为1.5LU/mL的方式添加酶。对于实施例2的酶和比较例的各酶，在0.1M的磷酸钠缓冲液(pH6.5)中以最终浓度以体系总量基准计成为60质量％的方式配合乳糖，以活性成为5.0LU/mL的方式添加酶。
将反应温度对于实施例1的酶设为30℃，对于实施例2和比较例的酶设为50℃，进行24小时GOS制造反应。在经过规定时间后，添加反应液的1/20量的20wt％的磺基水杨酸溶液，使反应停止。
对实施例1～2和比较例的各样品进行HPLC，分析所制造的GOS的量。柱使用美国环球基因有限公司(Transgenomic)制CARBOSep CHO-620 6.5φ×300mm，在流动相为水、流速为0.4mL/min、温度为85℃、检测为RI的条件下进行分析。将各样品的HPLC的结果示于表2。
表2中的“GOS”是指GOS含有比例。更具体而言，是GOS的HPLC面积相对于GOS(5糖、4糖、3糖)、2糖(未反应乳糖、转移2糖)、单糖(葡萄糖、半乳糖)的总计HPLC面积的百分率。
“收率”是指GOS的生成效率。更具体而言，是GOS生成量/乳糖消耗量的百分率(由HPLC计算GOS生成量和乳糖消耗量)。
此外，6糖以上的糖在实施例1～2和比较例中无法确认。
[表2]
由表2可知，实施例1～2的酶与比较例的酶相比，3糖GOS的选择性高。明确了本发明的酶在这一点上具有良好的功能。
特别是实施例2的酶的GOS的收率与比较例的酶为相同的程度，能够兼顾高GOS制造收率和3糖选择性。
(验证3：GOS的糖构成)
人母乳中的GOS由于键合方式的不同而存在4’-GL(Galβ1-4Galβ1-4Glc)、3’-GL(Galβ1-3Galβ1-4Glc)和6’-GL(Galβ1-6Galβ1-4Glc)这3种结构，已知市售的GOS制造用乳糖酶大多主要生成4’-GL和6’-GL。另一方面，双歧杆菌大多恒定地表达将3’-GL摄入菌体内的转运蛋白(非专利文献2)。即，含有3’-GL的GOS的优点在于双歧杆菌容易增殖。
基于此，用HPAEC-PAD(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)；ICS-3000+,Dionex CarboPac PA1柱)对比较例的BgaD-D和实施例2的基于乳糖酶的GOS进行分析(图2)。此外，糖组成的分析条件如下所述。
·分析条件：在HPAEC-PAD(high performance anion exchangechromatography-pulsed amperometric detection：高效阴离子交换色谱脉冲安培检测法)中，装置使用离子色谱仪ICS-3000(赛默飞世尔科技Thermo Scientific公司制)，柱使用CarboPac PA1(φ4mm x 250mm,赛默飞世尔科技Thermo Scientific公司制)。流动相使用100mM的氢氧化钠溶液(A)、含有100mM的氢氧化钠的600mM的乙酸钠溶液(B)、水(C)、50mM的乙酸钠溶液(D)，以梯度分离糖。将条件示于表3。将反应液的糖浓度制备成0.5mg/mL，作为分析用样品。将其在流速1.0mL/min、注入量25μL、柱温度20℃、检测器PAD(光电二极管阵列检测器)的条件下进行分析。
[表3]
时间(分钟) ％A ％B ％C ％D
0.0 10 0 85 5
25.0 40 0 10 50
60.0 75 25 0 0
60.1 0 100 0 0
65.0 0 100 0 0
65.1 10 0 85 5
72.0 10 0 85 5
其结果可知，实施例2的乳糖酶生成的主要的GOS与由4’-GL为主要糖的比较例的乳糖酶生成的GOS不同，根据其峰位置，为3’-GL的可能性高(表4)。另外，在由实施例2的乳糖酶生成的GOS中，将3糖分离并进行了结构分析，结果1H-NMR谱和13C-NMR谱与3’-GL的图谱一致(非专利文献3)。由此，可以认为由本酶生成的主要GOS为3’-GL。
[表4]
接下来，针对由比较例的乳糖酶生成的GOS和由实施例2的酶生成的GOS，实施了变应原性高的、通称为4P-X的4糖([Galβ1-4(Galβ1-4Galβ1-6)Glc]的含有确认试验。具体而言，通过使用了Bio-Gel P2 Gel(Bio-Rad)的凝胶过滤色谱分离由这些酶生成的GOS中的4糖，并使用HPAEC-PAD对其进行了分析。此时，与本公司合成的大量含有4P-X的标准品进行比较(非专利文献4)。其结果，仅在由实施例2的酶生成的GOS中在4P-X的位置未确认到峰(图3)。由此可知，由实施例2的酶生成的GOS不含有4P-X。
《本发明2》
以下，列举实施例具体说明本发明2，但本发明不限于这些实施例。
(具有GOS转移能力的微生物的筛选)
将任意的土壤加入到含有1％的乳糖的SCD培养基中，在30℃、250spm下振摇培养7天。将该培养液0.1mL移植到相同组成的培养基10mL中，在30℃、250spm下振摇培养7天。接下来，将培养液涂布于相同组成的琼脂培养基上，在30℃下进行5天左右的培养。
另外，将任意的土壤涂布于含有0.1％的乳糖的SCD琼脂培养基上，在30℃下同样地进行7天左右的培养。
对于得到的各菌落，在0.5mL的加入到48孔板中的含有2％的乳糖的SCD培养基中接种1铂耳，在30℃、500rpm(振幅2mm)下振摇培养4天，由此回收各菌株的培养液。
对于各菌株的培养液，以乳糖的最终浓度成为25～30质量％的方式加入使用0.2M的乙酸缓冲液(pH6.0)溶解而成的乳糖溶液。其后，在30℃、500rpm下进行24小时转移反应。
反应结束后，将反应液离心分离，回收上清液。将其用纯水适当稀释后作为分析用试样。通过HPLC分析法(柱为美国环球基因有限公司(Transgenomic)制CARBOSep CHO-6206.5φ×300mm，流动相为水，流速为0.5mL/min，温度为85℃，检测为RI)来测定各试样的GOS量。试样中存在GOS是指该试样的菌株具有GOS转移能力。如此筛选出具有GOS转移能力的菌株。
其结果得到的菌株的一部分为日本甲虫类芽孢杆菌(Paenibacilluspopilliae)、嗜热类芽孢杆菌(Paenibacillus thermophilus)、饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)、蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)、解硫胺素类芽孢杆菌(Paenibacillus thiaminolyticus)。即，暗示了属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌具有由乳糖制造GOS的能力。
对于各菌株，在10mL的放入到24φ×200mm试验管中的含有2％的乳糖的SCD培养基和含有2％的乳糖的BHI培养基各自的培养基中接种1铂耳，在30℃、250spm下振摇培养4天。作为对照，利用属于芽孢杆菌属(Bacillus属)的细菌(保藏号ATCC31382株：旧名环状芽孢杆菌(Bacillus circulans))在同一条件下进行培养。
培养结束后，将0.5mL的培养液转移到48孔板。向其中加入0.5mL的在0.2M的乙酸缓冲液(pH6.0)中以乳糖浓度成为30质量％的方式溶解了乳糖的乳糖溶液，在30℃、500rpm下进行24小时转移反应。
反应结束后，对于反应液中的GOS、乳糖的含量，通过HPLC分析各成分的峰面积，评价各菌株的GOS制造能力。将其结果示于表5。
[表5]
/>
表5中的“GOS”是指GOS含有比例。更具体而言，是GOS的HPLC面积相对于GOS(3糖以上，主要为5糖、4糖、3糖)、乳糖、葡萄糖、半乳糖的总计HPLC面积的百分率。
表5中的“收率”是指GOS的生成效率。更具体而言，是GOS生成量/乳糖消耗量的百分率(由HPLC计算GOS生成量和乳糖消耗量)。
表5中的“同源性检索(BLAST)”一栏中的同源率是指利用DNA Data Bank ofJapan的网站等对各菌株(strain)的16S rDNA碱基序列进行BLAST检索时与同源性最高的种(对应菌株)的同源性。在显示出99.5％以上的同源性的情况下鉴定为该物种。
使用表5中的各菌株(strain)和对应菌株、所鉴定的种的基准株、具有GOS转移能力的类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)、代表性的芽孢杆菌属(Bacillus属)，指定解硫胺素硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillus aneurinilyticus)DSM 5562作为外群，利用DNA DataBank of Japan的网站等对这些16S rDNA碱基序列进行比对，制作系统树。系统树的制作使用作为遗传信息处理软件的GENETYX(Genetics公司制)。将基于类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)和芽孢杆菌属(Bacillus属)的16S rDNA部分碱基序列的简易分子系统树示于图4。
由表5可知，这些类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌能够以高的生成比例和收率制造GOS。另外，可知这些类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌比作为对照的芽孢杆菌属(Bacillus属)的细菌能够以更好的效率制造GOS。
根据该见解，对类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的其他细菌也在同样的条件下评价GOS的制造能力。将使用的菌株及其结果示于表6。
[表6]
/>
表6中的“GOS”栏中的数值表示GOS生成比例，“++”表示GOS生成比例为1％以上，“+”表示GOS生成比例小于1％，“-”表示未实施。表6中的“收率”是与表5相同的含义。
由表6的结果可知，类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌具有制造GOS的能力。另外，环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)在2种培养基中GOS制造能力没有产生大的差异，但类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌在2种培养基中GOS制造能力有时产生大的差异。其结果表明，类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的细菌通过改变培养基等条件，GOS的制造能力受到大的影响。由此表明，通过对类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)的各细菌设定最佳的条件，可能得到比以往更好的GOS制造量和/或GOS收率。类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)能够用于制造GOS、其收率能够比以往更好，这并不是显而易见的，这令人惊讶。

Claims (11)

1.一种由选自以下的(a)～(b)中的氨基酸序列组成的酶，
(a)序列号1所示的氨基酸序列，
(b)序列号2所示的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述的酶的DNA。
3.一种由选自以下的(A)～(B)中的碱基序列组成的DNA，
(A)序列号5所示的碱基序列，
(B)序列号6所示的碱基序列。
4.一种具有低聚半乳糖生产活性的酶，其特征在于，其由权利要求3所述的DNA所编码。
5.一种重组载体，其特征在于，其包含权利要求2或3所述的DNA。
6.一种转化体，其特征在于，其具有权利要求2或3所述的DNA或权利要求5所述的重组载体。
7.一种具有低聚半乳糖生产活性的酶的制备方法，其特征在于，其包括培养权利要求6所述的转化体的工序以及从培养出的转化体中回收具有低聚半乳糖生产活性的酶的工序。
8.一种含酶组合物，其特征在于，其包含权利要求1或4所述的酶作为有效成分。
9.一种低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，其包括使乳糖与饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)所生产的具有低聚半乳糖生产活性的权利要求1所述的酶接触。
10.一种低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，其包括使乳糖与权利要求1或4所述的酶接触。
11.一种低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，其包括使属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的细菌的菌体和/或低聚半乳糖生产酶与乳糖接触，其中，所述属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的细菌是选自日本甲虫类芽孢杆菌(Paenibacilluspopilliae)、嗜热类芽孢杆菌(Paenibacillus thermophilus)、饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)、蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)中的1种以上的细菌，所述低聚半乳糖生产酶为权利要求1所述的酶。
CN201980024686.9A 2018-04-05 2019-03-28 来自饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)的能够制造低聚半乳糖的酶及制造低聚半乳糖的方法 Active CN112351990B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018073180 2018-04-05
JP2018-073180 2018-04-05
JP2018073181 2018-04-05
JP2018-073181 2018-04-05
PCT/JP2019/013549 WO2019194062A1 (ja) 2018-04-05 2019-03-28 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｂｕｌｉ由来のガラクトオリゴ糖を製造可能な酵素、およびガラクトオリゴ糖を製造する方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112351990A CN112351990A (zh) 2021-02-09
CN112351990B true CN112351990B (zh) 2024-04-26

Family

ID=68100501

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980024686.9A Active CN112351990B (zh) 2018-04-05 2019-03-28 来自饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)的能够制造低聚半乳糖的酶及制造低聚半乳糖的方法

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP3778625A4 (zh)
JP (1) JP7344195B2 (zh)
CN (1) CN112351990B (zh)
WO (1) WO2019194062A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112574977B (zh) * 2020-09-29 2022-07-19 天津科技大学 一种低聚半乳糖生产专用酶及其制备与应用
CN113667661B (zh) * 2021-07-26 2023-11-07 青岛大学 一种β-葡萄糖苷酶及其在制备葡萄糖和昆布寡糖中的应用
WO2023038057A1 (ja) 2021-09-07 2023-03-16 合同酒精株式会社 ラクターゼ、ラクターゼ製剤、遺伝子、組み換えベクターおよび形質転換体
CN114574409B (zh) * 2022-05-07 2022-07-26 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 一株假芽孢杆菌和其发酵产物及其在溶藻中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008199963A (ja) * 2007-02-20 2008-09-04 Nippon Shokubai Co Ltd ネガティブ選択マーカー遺伝子およびその利用
CN102449148A (zh) * 2009-06-05 2012-05-09 天野酶株式会社 来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶
CN104877942A (zh) * 2015-06-11 2015-09-02 上海大学 类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用
JPWO2013168438A1 (ja) * 2012-05-10 2016-01-07 国立大学法人岩手大学 ラクターゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、形質転換体、及びその製造方法並びに用途
CN106957832A (zh) * 2016-01-08 2017-07-18 中国农业大学 一种细菌β-半乳糖苷酶及其编码基因与应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5643756B2 (zh) 1973-12-22 1981-10-14
JP2652049B2 (ja) 1988-10-06 1997-09-10 株式会社ヤクルト本社 ガラクトオリゴ糖の製造法
JP2739335B2 (ja) 1989-02-17 1998-04-15 株式会社ヤクルト本社 ガラクトオリゴ糖の製造法
JP3072670B2 (ja) 1992-02-28 2000-07-31 味の素株式会社 ガラクトオリゴ糖の製造方法
DK3037528T3 (en) * 2008-12-23 2018-12-10 Dupont Nutrition Biosci Aps POLYPEPTIDES
US8288143B2 (en) * 2009-02-10 2012-10-16 Kobenhavns Universitet Cold-active beta-galactosidase, a method of producing same and use of such enzyme
JP2013168438A (ja) * 2012-02-14 2013-08-29 Elpida Memory Inc 半導体装置の製造方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008199963A (ja) * 2007-02-20 2008-09-04 Nippon Shokubai Co Ltd ネガティブ選択マーカー遺伝子およびその利用
CN102449148A (zh) * 2009-06-05 2012-05-09 天野酶株式会社 来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶
JPWO2013168438A1 (ja) * 2012-05-10 2016-01-07 国立大学法人岩手大学 ラクターゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、形質転換体、及びその製造方法並びに用途
CN104877942A (zh) * 2015-06-11 2015-09-02 上海大学 类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用
CN106957832A (zh) * 2016-01-08 2017-07-18 中国农业大学 一种细菌β-半乳糖苷酶及其编码基因与应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
beta-D-Galactosidase from Paenibacillus thiaminolyticus catalyzing transfucosylation reactions;Benesová E等;Glycobiology;第20卷(第04期);第442-451页 *
Biochemical characterization of a novel β-galactosidase from Paenibacillus barengoltzii suitable for lactose hydrolysis and galactooligosaccharides synthesis;Liu Y等;Int J Biol Macromol;第104卷;第1055-1063页 *
Liu Y等. Biochemical characterization of a novel β-galactosidase from Paenibacillus barengoltzii suitable for lactose hydrolysis and galactooligosaccharides synthesis. Int J Biol Macromol.2017,第104卷第1055-1063页. *
Paenibacillus woosongensis sp. nov., a xylanolytic bacterium isolated from forest soil;Lee JC等;Int J Syst Evol Microbiol;第58卷(第03期);第612-616页 *
Paenibacillus xylanilyticus sp. nov., an airborne xylanolytic bacterium;Rivas R等;Int J Syst Evol Microbiol;第55卷(第01期);第405-408页 *
类芽孢杆菌(Paenibacillus spp．)研究进展;袁树忠等;江苏省植物病理学会.江苏省植物病理学会第十一次会员代表大会暨学术研讨会论文集;第41-45页 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3778625A1 (en) 2021-02-17
CN112351990A (zh) 2021-02-09
EP3778625A4 (en) 2022-02-09
JPWO2019194062A1 (ja) 2021-07-01
WO2019194062A1 (ja) 2019-10-10
JP7344195B2 (ja) 2023-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112351990B (zh) 来自饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)的能够制造低聚半乳糖的酶及制造低聚半乳糖的方法
DK202000111Y3 (da) Polypeptider med transgalactosyleringsaktivitet
US8802393B2 (en) Arabinose isomerase expressed from Corynebacterium genus and tagatose manufacturing method by using it
JP5643756B2 (ja) バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼ
CN101410512B (zh) 具有半乳糖基转移活性的β-半乳糖苷酶
CN108699549B (zh) β-半乳糖苷酶
EP3890499A1 (en) Use of lactase to provide high gos fiber level and low lactose level
CN109337846A (zh) 深海来源的菌株及其编码的β-半乳糖苷酶基因和应用
US20210040522A1 (en) Novel beta-glucosidase for producing glucose and laminarioligosaccharide from sea weed
JP2022524312A (ja) 高温でラクトースを減少させる方法
TW200846472A (en) Novel a-galactosidase
NO341882B1 (no) DNA sekvens, β galaktosidase, rekombinant vektor, vertscelle og enzym samt anvendelse derav, samt fremgangsmåte for fremstilling av en blanding av oligosakkarider og enzym.
JP2023093593A (ja) ガラクトオリゴ糖の製造方法
EP2725098B1 (en) Kluyveromyces lactis yeast strain and methods for the production of sugars, ethanol, beta-galactosidase and biomass
US9974318B2 (en) Method for producing a low-lactose milk, medicine, supplement, or galacto-oligosaccharide
JP4259169B2 (ja) 新規α−１，２−マンノシダーゼおよびその遺伝子、ならびに該酵素を用いたα−マンノシル糖化合物の製造方法
NO341747B1 (no) DNA sekvens, vertcelle, rekombinant vektor, α-galaktosidase, enzym, fremgangsmåte for fremstilling av et enzym og disakkarid samt anvendelse av enzym og vertcelle
CN116802286A (zh) 一种产生dfl的菌株
JP2021093954A (ja) ガラクトオリゴ糖を製造可能な酵素、およびガラクトオリゴ糖を製造する方法
Aurilia et al. Organisation and variable incidence of genes concerned with the utilization of xylans in the rumen cellulolytic bacterium Ruminococcus flavefaciens
JP2997800B2 (ja) 細胞壁溶解酵素遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体
WO2005003343A1 (ja) 新規微生物、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ並びにその製造方法
WO2024043297A1 (ja) 組成物の製造方法、それにより得られるオリゴ糖含有組成物、及びそれらの利用
KR102141174B1 (ko) 아밀로수크라제의 발현 시스템 및 이를 이용한 투라노스의 생산
Le et al. Properties of β-Galactosidase from Lactobacillus zymae GU240, an Isolate from Kimchi, and Its Gene Cloning

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant