WO2023038057A1 - ラクターゼ、ラクターゼ製剤、遺伝子、組み換えベクターおよび形質転換体 - Google Patents

ラクターゼ、ラクターゼ製剤、遺伝子、組み換えベクターおよび形質転換体 Download PDF

Info

Publication number
WO2023038057A1
WO2023038057A1 PCT/JP2022/033563 JP2022033563W WO2023038057A1 WO 2023038057 A1 WO2023038057 A1 WO 2023038057A1 JP 2022033563 W JP2022033563 W JP 2022033563W WO 2023038057 A1 WO2023038057 A1 WO 2023038057A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lactase
milk
protein
less
lactose
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/033563
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
伶 尾▲高▼
涼子 佐野
卓己 岩崎
将弘 馬場
亘 佐分利
春英 森
Original Assignee
合同酒精株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 合同酒精株式会社 filed Critical 合同酒精株式会社
Priority to CN202280059879.XA priority Critical patent/CN117980483A/zh
Priority to JP2023546967A priority patent/JPWO2023038057A1/ja
Publication of WO2023038057A1 publication Critical patent/WO2023038057A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C21/00—Whey; Whey preparations
    • A23C21/02—Whey; Whey preparations containing, or treated with, microorganisms or enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C23/00—Other dairy products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C7/00—Other dairy technology
    • A23C7/04—Removing unwanted substances other than lactose or milk proteins from milk
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)

Definitions

  • the present invention relates to lactase, lactase preparations, genes, recombinant vectors and transformants.
  • milk Since ancient times, milk has long been used as a nutritious and useful food. Milk contains lactose, a type of sugar. Lactose is degraded in the intestine by lactase, but in some humans, the amount of lactase secreted into the intestine decreases as they grow, so milk and processed milk products (hereinafter collectively referred to as "dairy products”) ) causes so-called lactose intolerance, such as abdominal pain and diarrhea. This has been one of the factors preventing widespread consumption of this nutrient-rich food.
  • dairy products with pre-reduced lactose have become available. Such dairy products can be consumed by people who are lactose intolerant without any problem.
  • lactose is implemented in various ways. For example, there is a method of treating milk before milk production with a lactase preparation to hydrolyze lactose in the milk (see, for example, Patent Document 1).
  • lactose-degrading action stopped as the lactose-degradation progressed in the milk. Therefore, in order to achieve lactose-free milk (lactose concentration of 0.1 mass % or 0.01 mass %), it is necessary to enhance the lactose decomposition activity.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and aims to provide lactase and lactase preparations that have excellent lactose-degrading action in milk (especially in cow's milk).
  • the lactase has any one or a combination of the following activities (1) to (6) as the lactase activity.
  • the lactase When the lactase is added to milk, the residual lactose concentration reaches 0.1% or less after 24 hours at 10° C.
  • the added amount of the lactase protein is 10.1 mg/L or less.
  • the residual lactose concentration reaches 0.01% or less after 24 hours at 10° C.
  • the added amount of the lactase protein is 15.1 mg/L or less.
  • the concentration of residual lactose reaches 0.1% or less after 24 hours at 10°C when adding an amount that gives a final concentration of 1.4 LYU/ml to milk.
  • the concentration of residual lactose reaches 0.01% or less after 24 hours at 10°C when adding an amount that gives a final concentration of 2.1 LYU/ml to milk.
  • the lactase of the above aspect may be selected from any one of (i) to (iii) below.
  • (i) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; and a protein having lactase activity (iii) a protein consisting of an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having lactase activity May satisfy one or more of the following: (A) The amount of solids contained in milk is 0.1% by mass or more and 30% by mass or less (B) The amount of lactose contained in milk is 0.1% by mass or more and 30% by mass or less (C) Contained in milk Protein content is 0.1% by mass or more and 30% by mass or less (D) Fat content in milk is 0.1% by mass or more and 30% by mass or less
  • lactase preparation comprises the lactase described above, At least one selected from water, salts, excipients, suspending agents, buffering agents, stabilizing agents, preservatives and saline.
  • the salt may be one or more selected from the group consisting of magnesium chloride, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride and manganese chloride.
  • the lactase preparation may contain the lactase described above and a second lactase derived from or having different properties from the lactase.
  • Yet another aspect of the present invention is a gene encoding the following protein (i), (ii) or (iii). (i) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; and a protein having lactase activity (iii) a protein consisting of an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having lactase activity It may consist of any DNA of d).
  • (a) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) a DNA comprising a base sequence in which one to several bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encoding the protein having lactase activity; (c) a DNA comprising a nucleotide sequence having a sequence identity of 70% or more to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encoding the protein having lactase activity; (d) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and that encodes the protein having lactase activity; SEQ ID NO: 2 is a base sequence containing a termination codon.
  • Yet another aspect of the present invention is a recombinant vector having the above gene.
  • Yet another aspect of the present invention is a transformant transformed with the above-described recombinant vector.
  • Yet another aspect of the present invention is a method for producing lactose-decomposed milk.
  • the method for producing the lactose-decomposed milk includes the step of adding the above-described lactase or lactase preparation to raw milk, and a step of reacting the raw material milk with the lactase or the lactase contained in the lactase preparation for a predetermined period of time.
  • FIG. 1 is a graph showing changes in residual lactose concentration at 10° C. when BL105A — 1453 and other lactase preparations were added to 1 mL of milk so that the amount of protein was about 15.1 ⁇ g.
  • FIG. 2 is a graph in which the horizontal axis (10 to 50 hours) and vertical axis (0 to 0.20% lactose concentration in milk) of FIG. 1 are enlarged.
  • FIG. 3 is a graph showing the lactose decomposition rate (reaction rate) when various salts with different concentrations were added to the BL105A_1453 purified enzyme solution.
  • FIG. 4 is a graph showing the optimum pH of BL105A_1453 purified enzyme solution.
  • FIG. 1 is a graph showing changes in residual lactose concentration at 10° C. when BL105A — 1453 and other lactase preparations were added to 1 mL of milk so that the amount of protein was about 15.1 ⁇ g.
  • FIG. 2 is
  • FIG. 5 is a graph showing pH stability of BL105A — 1453 purified enzyme solution.
  • FIG. 6 is a graph showing the optimum temperature of BL105A_1453 purified enzyme solution.
  • FIG. 7 is a graph showing the temperature stability of BL105A — 1453 purified enzyme solution.
  • FIG. 8 is a graph showing analysis of the main structure of the product by HPAEC-PAD.
  • FIG. 9 is a graph showing changes in lactose concentration during the fermentation stage and storage when each lactase and starter were simultaneously added to milk.
  • FIG. 10 is a graph showing changes in lactose concentration when YNL and BL105A_1453 were added singly or in combination to milk.
  • the lactase according to the embodiment preferably has any one or a combination of two or more of the following activities (1) to (6) as the lactase activity, and has three or more. is more preferable, it is further preferable to have 4 or more, and it is particularly preferable to have 5 or more. Most preferably, it satisfies all of (1) to (6).
  • the amount of the lactase protein added is 15.1 mg/L or less at which the concentration of residual lactose reaches 0.1% after 16 hours at 10°C.
  • the amount of the lactase protein added is 30.2 mg/L or less so that the residual lactose concentration reaches 0.01% after 16 hours at 10°C.
  • the amount of the lactase protein added is 10.1 mg/L or less so that the residual lactose concentration reaches 0.1% after 24 hours at 10°C.
  • the amount of the lactase protein added is 15.1 mg/L or less so that the residual lactose concentration reaches 0.01% after 24 hours at 10°C.
  • the concentration of residual lactose after 24 hours at 10°C is 0.01% or less when added to milk at a final concentration of 2.1 LYU/ml.
  • the amounts of lactase in (1) to (4) are values calculated by the Bradford method.
  • the lactase according to the embodiment is selected from any one of (i) to (iii) below.
  • (iii) a protein consisting of an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having lactase activity is a protein having
  • lactase activity can be measured by the method described below. Having lactase activity means that when the amount of protein contained in the measurement object is 1 mg, the lactase activity is 1 LYU/mg by the method described later. - refers to those that are more than protein.
  • a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (hereinafter sometimes referred to as BL105A_1453 or 1453) is a lactase derived from Bifidobacterium longum 105-A strain.
  • the lactase is a preferred example because it has an extremely high lactose-degrading activity.
  • the number of deletions, substitutions, or insertions of amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in which one to several amino acid residues are deleted, substituted, or inserted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, even more preferably 1 to 8. It is preferable that the number of deletions of amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 exhibit enzyme activity equivalent to that of lactase consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 85% or more, particularly preferably 90% or more, and 95% or more. % or more is particularly preferred, and 99% or more is most preferred.
  • sequence identity percentages can be calculated using published or commercially available software whose algorithms compare a reference sequence as a query sequence. For example, BLAST, FASTA, GENETYX (manufactured by Genetics), or the like can be used.
  • the lactase it is preferable to use a protein having an amino acid sequence having any of the above sequence identities and having lactase activity.
  • a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 exhibits lactase activity in the pH range of 5.0 to 8.5, with an optimum pH range of 5.5 to 6.5.
  • the optimum pH is 6.0.
  • a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a lactase that is stable in the pH range of 5.0 to 9.0.
  • a pH of 5.2 to 8.4 is more stable and preferred.
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has lactase activity in the range of over 0°C to 60°C, higher lactase activity in the range of 20°C to 60°C, and an optimum temperature range of 40°C to 40°C. 55°C and the optimum temperature is 50°C.
  • a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a lactase that exhibits thermostability up to 50°C.
  • the protein shows 100% residual lactase activity even after being kept at 50°C for 1 hour.
  • the gene according to the embodiment is a gene that encodes the above-described protein having lactase activity, preferably a gene that encodes the amino acid sequence of any one of (i) to (iii) above, more preferably the following (a ) to (d).
  • DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) a DNA encoding a protein having lactase activity, consisting of a base sequence in which one to several bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO:2; (c) DNA consisting of a nucleotide sequence having 70% or more sequence identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 and encoding a protein having lactase activity (d) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and that encodes a protein having lactase activity;
  • 1 to several bases are preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5.
  • base deletion means the absence or disappearance of a base
  • base substitution means that a base is replaced with another base
  • base addition means that a base is added.
  • “Addition” includes addition of bases to one or both ends of a sequence, and insertion of another base between bases in a sequence.
  • sequence identity of the base sequences is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 85% or more, particularly preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and 99%. % or more is most preferable.
  • Sequence identity of nucleotide sequences can be determined using the algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877). Based on this algorithm BLAST, programs called BLASTN and BLASTX have been developed (J.Mol.Biol., 1990, 215, p.403-410). Alternatively, a homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx may be used. Specific techniques for these analysis methods are known (see www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • stringent conditions refer to conditions under which nucleotide sequences with high identity hybridize with each other and nucleotide sequences with lower identity do not hybridize with each other. "Stringent conditions" can be appropriately changed depending on the degree of identity desired. The more stringent the conditions, the more identical sequences will hybridize. For example, stringent conditions include conditions described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition, J. Sambrook et al., 1989).
  • 6 x SSC composition of 1 x SSC: 0.15 M sodium chloride solution, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 x Denhardt and 100 mg / mL solution containing herring sperm DNA and the conditions for hybridization by incubating at 65° C. for 8 to 16 hours together with the probe.
  • a protein having lactase activity (lactase) of the present embodiment can be obtained from a transformant obtained by introducing a vector containing the above-described gene encoding lactase into a microorganism according to a known method.
  • the transformant may be maintained in the form of a vector, or the gene may be maintained in the genome. That is, when the transformant is cultured in an appropriate medium, the gene encoded on the vector or genome contained in the transformant is expressed, and the protein (lactase) having lactase activity of the present embodiment is produced.
  • Lactase can be obtained by isolating and purifying the produced lactase from the culture.
  • the gene encoding the lactase of this embodiment can be isolated from Bifidobacterium longum strain 105-A using any method used in the art. For example, after extracting the whole genome DNA of Bifidobacterium longum 105-A strain, the gene is obtained using primers designed based on the gene sequences upstream and downstream of the base sequence of SEQ ID NO: 2. It can be obtained by selectively amplifying the target gene by PCR and purifying the amplified gene.
  • the type of vector containing the gene encoding the lactase of this embodiment is not particularly limited, and includes vectors commonly used for protein production, such as plasmids, cosmids, phages, viruses, YACs, and BACs. Among them, plasmid vectors are preferred, and commercially available protein expression plasmid vectors such as pET and pBIC can be preferably used. Procedures for introducing genes into plasmid vectors are well known in the art.
  • microorganisms for introducing the constructed vector include Streptomyces, Brevibacillus, Staphylococcus, Enterococcus, Listeria, Bacillus ( Bacillus, Escherichia, Saccharomyces, Shizosaccharomyces, Kluyveromyces, Aspergillus, Penicillium, Trichoderma and eukaryotes microorganisms.
  • Bacillus Bacillus, Escherichia, Saccharomyces, Shizosaccharomyces, Kluyveromyces, Aspergillus, Penicillium, Trichoderma and eukaryotes microorganisms.
  • a method of introduction a method commonly used in the art can be used.
  • the gene introduced into the transformant is expressed to produce the lactase of the present embodiment.
  • the medium used for culture can be appropriately selected by those skilled in the art according to the type of transformant.
  • the produced lactase of interest can be isolated from the culture by a conventional method and purified by a known purification method.
  • Lactase derived from Bifidobacterium longum strain 105-A has a high lactase-degrading action in milk, as shown in the examples below.
  • the lactase formulation (lactase composition) of the present embodiment contains, in addition to the active ingredient (lactase), for example, water, salt, excipients, suspending agents, buffers, stabilizers, preservatives, physiological saline, and the like. may contain. Only one type of lactase may be used, or multiple types may be mixed and used. By using a mixture of lactases with different lactose-degrading actions for subjects containing lactose, it becomes easier to enjoy the benefits of each lactase.
  • the initial lactose decomposition rate is fast, but the final lactose decomposition rate is 99%.
  • a lactase that does not reach up to 9% and a lactase that does not have a high initial decomposition rate of lactose but has a final decomposition rate of 99.9% or more of lactose are used in combination.
  • a first lactase and a second lactase derived from or having different properties from the first lactase can be combined according to desired properties and used as a lactase preparation. There is no limit to the number of third lactase, fourth lactase, etc. to be mixed.
  • this lactase originates from Bifidobacterium longum 105-A, and the final lactose decomposition rate reaches 99.9% or more.
  • a lactase having a different origin or a lactase having a high initial decomposition rate such as milk can be used as the second lactase.
  • yeast-derived lactase, mold-derived lactase, and lactic acid lactase-derived lactase can be used. More specifically, lactase derived from Kluyveromyces lactis and Kluyveromyces marxianus, lactase derived from Aspergillus oryzae, and lactase derived from Lactobacillus delbrueckii.
  • the mass of the lactase protein may be used as a reference.
  • the mass ratio may be in the range of 1:99 to 99:1, preferably in the range of 10:90 to 90:10, and 20:80. It is more preferably in the range of ⁇ 80:20 and most preferably in the range of 25:75 to 50:50. These ranges make it easier to provide a lactase preparation having multiple properties.
  • the lactase preparation of this embodiment improves the lactase activity by having a salt or its ion.
  • Such salts include magnesium chloride, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, manganese chloride and the like.
  • Examples of ions include monovalent cations such as sodium and potassium and divalent cations such as magnesium, manganese and calcium.
  • the lactase preparation of the present embodiment has two or more salts or ions thereof selected from the group consisting of magnesium chloride, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, and manganese chloride, thereby significantly improving lactase activity.
  • a lactase preparation containing a salt or its ion may be used as long as it promotes the decomposition of lactose, and may be added to or contained in an aqueous solution of lactose in addition to raw milk such as cow's milk. Even if the lactase formulation does not contain the above-described salts or ions thereof, the lactose decomposition rate in the reaction system can be increased if the above-described salts or ions thereof are included in the reaction system. For example, the lactose decomposition rate can be accelerated by further adding the above-described salt to the reaction system in which the active ingredient (lactase) is added to an aqueous lactose solution to contain the salt as ions.
  • the lower limit of the salt content in the lactase formulation is preferably 0.1 mM or more, more preferably 0.5 mM or more, may be 1 mM or more, or may be 10 mM or more. Well, 40 mM or more is more preferable.
  • the upper limit of the salt content is preferably 1000M or less, more preferably 500M or less, may be 100M or less, and more preferably 50M or less.
  • the upper limit and lower limit of the content of the salt contained in the lactase formulation can be appropriately combined from the above ranges.
  • the lower limit of the monovalent cation contained in the lactase preparation is preferably 0.1 mM or more, more preferably 1 mM or more, may be 10 mM or more, may be 100 mM or more, and is more preferably 500 mM or more.
  • the upper limit of the monovalent cation is preferably 1000M or less, more preferably 500M or less, may be 100M or less, and more preferably 50M or less.
  • the upper and lower limits of the monovalent cation contained in the lactase formulation can be appropriately combined from the above ranges.
  • the lower limit of the divalent cation contained in the lactase preparation is preferably 0.1 mM or higher, more preferably 1 mM or higher, may be 10 mM or higher, and is further preferably 40 mM or higher.
  • the upper limit of the divalent cation is preferably 100M or less, more preferably 20M or less, may be 10M or less, and more preferably 2M or less.
  • the upper and lower limits of the divalent cations contained in the lactase formulation can be appropriately combined from the above ranges.
  • the pH of the aqueous lactose solution is typically 4.5 to 9.0 from the viewpoint of obtaining a sufficient rate of lactose decomposition by salt.
  • the shape of the lactase preparation is not limited. It may be solid or liquid at room temperature. It is preferred that the lactase formulation be in solid form when used in solids, and in liquid form when used in liquids (eg, milk).
  • the lower limit of the protein content in the lactase preparation of the present embodiment is preferably 0.072 mg/mL or more for a liquid lactase preparation, and 0.72 mg/mL for a solid lactase preparation. g or more is preferable.
  • the upper limit of the protein content is not particularly limited, it is preferably 720 mg/mL or less, for example. When the content of the protein is equal to or higher than the lower limit, desired activity can be ensured even if the storage time is prolonged.
  • the amount of protein contained in the lactase preparation of this embodiment can be measured by the Bradford method.
  • the lactase preparation of the present embodiment preferably has a lactase activity of 10 to 100,000 LYU/mL, more preferably 100 to 90,000 LYU/mL, and 1,000 to 80,000 LYU/mL. It is even more desirable to have activity.
  • the activity measurement method is as follows. A lactose preparation (enzyme solution) to be measured was added to a lactose solution (final concentration of 10%) dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.1 mM manganese chloride solution, and the pH was 6.5 and 37. °C for 10 minutes. The reaction is terminated by the addition of 1.5N sodium hydroxide solution.
  • Glucose CII Test Wako manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of glucose per minute under these conditions is defined as 1 LYU.
  • the stabilizer content is preferably 10 to 90% by mass, more preferably 20 to 80% by mass, and even more preferably 30 to 70% by mass.
  • stabilizers include sorbitol and glycerin.
  • Milk for which the lactase or lactase preparation of the present embodiment is used is not particularly limited as long as it contains lactose.
  • Milk is derived from, for example, cows, goats, sheep, and the like. Among these, it is preferable to use bovine milk. These milks may be used as they are, and water, whole milk powder, skimmed milk powder, cream powder, whey powder, protein-concentrated whey powder, buttermilk powder, sweetened milk powder, prepared milk powder, etc. may be added as necessary. It is also possible to adjust the solid content, the amount of lactose, etc., which will be described later.
  • the above-mentioned milk to which substances other than enzymes have been added is referred to as raw material milk.
  • the amount of solids contained in the raw milk is 0.1% by mass or more and 30% by mass or less, 0.5% by mass or more and 20% by mass or less, 1% by mass or more and 10% by mass or less, 2% by mass or more and 8% by mass or less. 4.0% by mass or more is preferable, 6.0% by mass or more is more preferable, and 8.0% by mass or more is even more preferable.
  • the upper limit of the solid content contained in the raw material milk is not particularly limited, it is, for example, 30% by mass.
  • the amount of lactose contained in the raw milk is 0.1% by mass or more and 30% by mass or less, 0.5% by mass or more and 20% by mass or less, 1% by mass or more and 10% by mass or less, 2% by mass or more and 8% by mass or less. 4.0% by mass or more and 5.8% by mass or less is preferable, 4.4% by mass or more and 5.4% by mass or less is preferable, and 4.8% by mass or more and 5.0% by mass or less is more preferable.
  • the amount of protein contained in the raw milk is 0.1% by mass or more and 30% by mass or less, 0.5% by mass or more and 20% by mass or less, 1% by mass or more and 10% by mass or less, 2% by mass or more and 8% by mass or less. 2.0% by mass or more and 4.8% by mass or less is preferable, 2.6% by mass or more and 4.2% by mass or less is more preferable, and 3.2% by mass or more and 3.6% by mass or less is even more preferable. .
  • the amount of fat contained in the raw milk is 0.1% by mass or more and 30% by mass or less, 0.5% by mass or more and 20% by mass or less, 1% by mass or more and 10% by mass or less, 2% by mass or more and 8% by mass or less. 1.5% by mass or more is preferable, 2.5% by mass or more is more preferable, and 3.5% by mass or more is even more preferable.
  • the sterilization method of the raw milk is not particularly limited, but low temperature sterilization (LTLT), high temperature sterilization (HTLT), and ultra high temperature flash sterilization (UHT) are listed in order of low heat history.
  • LTLT low temperature sterilization
  • HTLT high temperature sterilization
  • UHT ultra high temperature flash sterilization
  • Raw milk may be unpasteurized raw milk.
  • the mixture After adding the lactase or lactase preparation of the present embodiment to the raw material milk described above at a predetermined concentration, the mixture is reacted at a predetermined temperature for a predetermined time to produce lactose-decomposed milk having a high lactose decomposition rate. It is preferable to use cow's milk as raw material milk.
  • the reaction time is, for example, 1 hour to 48 hours, preferably 12 hours to 24 hours.
  • the reaction temperature is, for example, above 0°C to 40°C, preferably 1°C to 25°C, 1°C to 10°C.
  • the lactose concentration contained in milk is about 4.7% by mass.
  • lactose contained in lactose-decomposed milk is preferably 0.1% by mass or less (lactose decomposition rate of 97.87% or more), more preferably 0.01% by mass or less (lactose decomposition rate of 99.79% or more). This allows it to be marketed as lactose-free milk. If the lactase in raw material milk is 1.4 LYU/mL or more, lactose-decomposed milk having a lactose content of 0.1% by mass or less (lactose decomposition rate of 97.87% or more) can be easily obtained, which is preferable.
  • lactase in raw material milk is 2.1 LYU/mL or more
  • lactose-decomposed milk having a lactose content of 0.01% by mass or less lactose decomposition rate of 99.79% or more
  • BL105A_1453 [derived from Bifidobacterium longum 105-A strain, E. coli recombinant expressed and purified enzyme]
  • YNL 2 [derived from Kluyveromyces lactis, Godo Shusei Co., Ltd., #21006]
  • YNL 2LS [derived from Kluyveromyces lactis, Godo Shusei Co., Ltd., #21002]
  • Lactase A [derived from Kluyveromyces lactis]
  • Lactase B [derived from Bifidobacterium bifidum]
  • Lactase C [derived from Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus]
  • BL105A_1453 crude enzyme solution E. coli into which the BL105A_1453 expression plasmid pET23a-BL105A_1453 was introduced.
  • E. coli BL21(DE3) transformant was inoculated into a test tube containing 5 mL of LB Amp medium (50 ⁇ g/mL) and cultured at 18° C. overnight. 250 ⁇ L of the culture solution was inoculated into a 100 mL Erlenmeyer flask containing 25 mL of TB Amp medium (50 ⁇ g/mL) and cultured with shaking at 18°C. This was done for 10 pieces.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • a final concentration of 0.5 mM when the absorbance A 610 reached 0.5, and production of the recombinant protein was initiated. induced. Induction culture was carried out at 18°C for 24 hours. Cells were recovered from the culture medium by centrifugation (8,000 rpm, 10 minutes, 4° C.) and suspended in 10 mL of binding buffer for Ni column chromatography (20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5, 500 mM sodium chloride). , and sonication (URTRA SONIC DISRUPTOR UR-200P, Tomy Seiko Co., Ltd.) to disrupt the cells. The supernatant obtained by centrifugation (8,000 rpm, 10 minutes, 4° C.) was used as a crude enzyme solution containing BL105A_1453.
  • ⁇ Production of BL105A_1453 purified enzyme solution The crude enzyme solution obtained above was applied to a Ni-NTA Agarose column ( ⁇ 1.0 cm ⁇ 4.0 cm; QIAGEN) equilibrated with a binding buffer. After removing non-adsorbed proteins with a washing buffer (20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5, 500 mM sodium chloride, 50 mM imidazole), the adsorbed proteins were eluted with a 20-500 mM imidazole linear gradient (elution buffer A, 20 mM Sodium phosphate buffer, pH 7.5, 20 mM imidazole; Elution buffer B, 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5, 500 mM imidazole; 60 mL each).
  • a washing buffer (20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5, 500 mM sodium chloride, 50 mM imidazole
  • Elution buffer B 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5, 500
  • the fraction volume was 8 mL for washing and 3 mL for elution.
  • the collected fraction was dialysed with a dialysis membrane (cellulose tube 36/32; Viskase Companies, Inc.) once per 1 L of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5) and twice per 5 L of the same buffer. dialyzed twice. After dialysis, it was concentrated to 1.5 mL using Amicon Ultra-15 (MWCO, 100,000; Merck Millipore). This was used as BL105A_1453 purified enzyme solution. Glycerol was added to the resulting purified enzyme solution to a final concentration of 50% and stored at -80°C. The purified enzyme solution was subjected to SDS-PAGE and confirmed to be a single band.
  • a blank was prepared by adding 20 ⁇ L of buffer solution to 1 mL of milk.
  • BL105A_1453 a product (built-in) activity of 3500 LYU/mL was assumed. The reaction was stopped by adding 1/20 amount of 20% sulfosalicylic acid.
  • a 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.1 mM manganese chloride was used as the buffer.
  • HPLC analysis>> A sample diluted 5-fold with ultrapure water was filtered through a filter with a pore size of 0.22 ⁇ m, and the filtrate was analyzed using HPLC.
  • the conditions for HPLC analysis are as follows.
  • the conditions for HPAEC-PAD analysis are as follows. Body: Dionex, ICS-6000 + , AS-Ap Autosampler Column: Dionex, CarboPac PA1 ( ⁇ 4.0 mm ⁇ 250 mm), 20 ° C.
  • lactose decomposition rate was calculated by comparing the residual lactose concentration of each sample with the lactose concentration of milk analyzed under the same conditions.
  • Figures 1 and 2 show changes in residual lactose concentration at 10°C when BL105A_1453 and other lactase proteins were added in an amount of about 15.1 ⁇ g to 1 mL of milk.
  • Condition 2 Mixed salts (NaCl, KCl, MgCl 2 ) containing 139 mM lactose (Na + : 18.4 mM, K + : 39.6 mM, Mg 2+ : 4.25 mM)
  • Condition 3 Milk Condition 4: Fractionated milk Condition 5: Desalted fractionated milk-1 (Electrodialysis removes charged components with a molecular weight ⁇ 100 in Condition 4)
  • Condition 6 Desalted fractionated milk-2 (remove the charged component of 4 with an ion exchange resin) The lactose decomposition rate was calculated by the following procedure.
  • Glucose concentration was calculated from A 505 based on a calibration curve (0-600 ⁇ M glucose and A 505 ).
  • One unit was defined as the amount of enzyme that hydrolyzes 1 ⁇ mol of lactose per minute under these conditions. The results obtained are shown in Tables 3 and 4.
  • Electrodialysis of fractionated milk reduced the activity of YNL 2 to a level of approximately 139 mM lactose, and addition of mixed salts increased the activity to a level exceeding the level in milk, suggesting that the salt in the milk inhibited the activity of the enzyme. considered to have made a significant contribution to The activity of BL105A_1453 decreased to the level of 139 mM lactose when fractionated milk was desalted with an ion-exchange resin, but the activity decreased moderately when desalted by electrodialysis. Since the addition of mixed salts results in the level of activity in milk, it is thought that the salt in the milk acts on the activation, but it is also possible that components that cannot be removed by electrodialysis act as a substitute for salt.
  • Reaction system 1 (Na + ) (50 ⁇ L) 2 mM ONPG, 10 mM MES-NaOH (pH 6.0, containing 5.3 mM Na + ), 0-50 mM NaCl
  • enzyme reaction system 2 (K + , Mg 2+ , Mn 2+ , Ca 2+ ) (50 ⁇ L) 2 mM ONPG, 10 mM MES-NaOH (pH 6.0, containing 6 mM K + ), 0-50 mM KCl, 0-10 mM MgCl 2 , 0-0.1 mM MnCl 2 or 0-50 mM CaCl 2
  • the enzyme ONPG degradation rate is It was calculated according to the following procedure.
  • substrate 100 mg of ONPG/100 mL of distilled water
  • the lactase activity value was calculated from the absorbance of OD 420 of the reaction solution.
  • One unit of lactase activity was defined as the amount of enzyme required to change the measured value by 1 in 10 minutes. The results obtained are shown in FIG.
  • the optimum pH of BL105A_1453 was 6.0.
  • the pH stability of lactase was measured by the following method.
  • the BL105A_1453 enzyme solution was diluted 10-fold with each buffer (pH 3.0-10.5) and incubated at 37° C. for 30 minutes. After cooling on ice for 3 minutes, it was further diluted 200-fold with pH 6.0 buffer. 300 ⁇ L of the diluted enzyme solution was placed in a 1.5 mL tube, mixed with 300 ⁇ L of buffer solution, and pre-incubated at 37°C for 3 minutes. It was reacted with 600 ⁇ L of substrate (100 mg of ONPG/100 mL of distilled water) at 37° C. for 1 minute, and 1200 ⁇ L of 0.2 M sodium carbonate was added to terminate the reaction.
  • the lactase activity value was calculated from the absorbance of OD 420 of the reaction solution.
  • One unit of lactase activity was defined as the amount of enzyme required to change the measured value by 1 in 10 minutes.
  • the pH stability of lactase can be measured by the same method as shown for the optimum pH of lactase, except that the buffer solution used is incubated at 37° C. for 30 minutes. The following buffer solutions were used at each pH, and the pH was plotted with the measured values when the enzyme was diluted.
  • ⁇ Optimum Temperature>> The optimum temperature of lactase was measured by the following method. Take 300 ⁇ L of BL105A_1453 enzyme solution diluted 2000 times with pH 6.0 sodium phosphate buffer, mix with 300 ⁇ L of buffer, Pre-incubated at 50, 55, 60°C for 3 minutes. After that, the activity was measured at each temperature in the same manner as the pH stability test. The results obtained are shown in FIG. In FIG. 6, the activity at 37° C. was used as the reference (relative activity 100%). The optimum temperature for BL105A_1453 was 50°C.
  • the BL105A_1453 enzyme solution was diluted 10-fold with pH 6.0 buffer and incubated at 37, 50, 55, 60, 65 and 70°C for 0, 5, 10, 30 and 60 minutes. After cooling on ice for 3 minutes, it was further diluted 200-fold with pH 6.0 buffer. 300 ⁇ L of the diluted enzyme solution was placed in a test tube, mixed with 300 ⁇ L of buffer solution, and pre-incubated at 37° C. for 3 minutes. After that, the activity was measured in the same manner as the pH stability test. The results obtained are shown in FIG. BL105A_1453 showed 100% residual lactase activity even after reacting at 50°C for 1 hour.
  • the theoretical yield of galacto-oligosaccharides at this time is about 74% by mass.
  • three molecules of lactose yield two molecules of glucose and one molecule of a tetrasaccharide galactooligosaccharide.
  • the theoretical yield of galacto-oligosaccharides at this time is about 65% by mass. Therefore, when galacto-oligosaccharides are produced from lactose, it is most efficient in terms of yield to produce only trisaccharide galacto-oligosaccharides.
  • the galacto-oligosaccharide yield (% by mass) means the percentage obtained by dividing the "production amount of galacto-oligosaccharide” by the “consumption amount of lactose".
  • Galacto-oligosaccharides produced can be measured by HPLC. Specifically, the method described in WO2019/194062 may be adopted.
  • a starter (lactic acid bacteria YF-L812 strain 10 mg/100 g, Bifidobacterium BB-12 strain 5 mg/100 g) is added to commercially available milk (manufactured by Meiji Co., Ltd.), stirred, and after dispensing, the BL105A_1453 enzyme solution is adjusted to 0 with a product activity of 5200 LYU/mL. .02 and 0.06%.
  • a group with 0.02% YNL 2 addition and a group with 0.02% lactase B (enzyme derived from Bifidobacterium bifidum) were provided.
  • FIG. 9 shows changes in lactose concentration in the fermented milk obtained as described above.
  • BL105A_1453 had a decomposition rate equivalent to lactase B at the end of fermentation (4 hours later), and the lactose concentration in the sample was 0.4%.
  • 0.06% BL105A_1453 was added, the lactose concentration reached 0.1% or less after 2 hours of fermentation. Only lactase B reacted even under conditions of 10° C. and low pH after completion of fermentation, and the lactose concentration reached 0.1% or less 48 hours after the start of fermentation.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Dairy Products (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

乳中における乳糖分解作用に優れたラクターゼ製剤を提供する。本発明のある態様のラクターゼは、ラクターゼ活性として、以下の（１）～（６）に記載の活性のうち、いずれか１つ、または複数の組み合わせを有する。　（１）牛乳に前記ラクターゼを添加したとき、１０℃、１６時間後における残存乳糖濃度が０．１％以下に達する前記ラクターゼのタンパク質の添加量が１５．１ｍｇ／Ｌ以下である。　（２）牛乳に前記ラクターゼを添加したとき、１０℃、１６時間後における残存乳糖濃度が０．０１％以下に達する前記ラクターゼのタンパク質の添加量が３０．２ｍｇ／Ｌ以下である。　（３）牛乳に前記ラクターゼを添加したとき、１０℃、２４時間後における残存乳糖濃度が０．１％以下に達する前記ラクターゼのタンパク質の添加量が１０．１ｍｇ／Ｌ以下である。　（４）牛乳に前記ラクターゼを添加したとき、１０℃、２４時間後における残存乳糖濃度が０．０１％以下に達する前記ラクターゼのタンパク質の添加量が１５．１ｍｇ／Ｌ以下である。　（５）牛乳に対して、終濃度１．４ＬＹＵ／ｍｌとなる量を添加したときの、１０℃、２４時間後における残存乳糖濃度が０．１％以下に達する。　（６）牛乳に対して、終濃度２．１ＬＹＵ／ｍｌとなる量を添加したときの、１０℃、２４時間後における残存乳糖濃度が０．０１％以下に達する。

Description

ラクターゼ、ラクターゼ製剤、遺伝子、組み換えベクターおよび形質転換体
　本発明は、ラクターゼ、ラクターゼ製剤、遺伝子、組み換えベクターおよび形質転換体に関する。
　古来より、牛乳は栄養豊かな有用食品として長く利用されてきた。牛乳には、糖の一種である乳糖が含まれている。乳糖はラクターゼによって腸内で分解されるが、ヒトの一部においては、成長するに従ってラクターゼの腸内への分泌量が減少するため、牛乳や乳加工製品（以下、まとめて「乳製品」という）を多量に摂取したときに、腹痛や下痢などのいわゆる乳糖不耐症を引き起こす。このことが、この栄養豊かな食品の幅広い摂取を妨げる一因となっていた。
　近年になり、乳糖が前もって低減された乳製品が提供されるようになってきた。このような乳製品であれば、乳糖不耐症のヒトでも問題なく摂取できる。
　乳糖の低減は種々の方法で実施されている。例えば、牛乳製造前の乳をラクターゼ製剤で処理して、牛乳中の乳糖を加水分解する方法である（例えば、特許文献１参照）。
特表２００４－５３４５２７号公報
　従来のラクターゼ製剤は、乳中での乳糖分解が進むにつれ、乳糖分解作用が止まってしまうことが課題であった。そのため、ラクトースフリー（乳糖濃度０．１質量％または０．０１質量％）の乳を達成するには、乳糖分解作用を高めることが必要となっている。
　本発明は上述のような課題を鑑みたものであり、乳中（特に牛乳中）における乳糖分解作用に優れたラクターゼおよびラクターゼ製剤を提供することを目的とする。
　本発明のある態様は、ラクターゼである。当該ラクターゼは、ラクターゼ活性として、以下の（１）～（６）に記載の活性のうち、いずれか１つ、または複数の組み合わせを有する。
　（１）牛乳に前記ラクターゼを添加したとき、１０℃、１６時間後における残存乳糖濃度が０．１％以下に達する前記ラクターゼのタンパク質の添加量が１５．１ｍｇ／Ｌ以下である。
　（２）牛乳に前記ラクターゼを添加したとき、１０℃、１６時間後における残存乳糖濃度が０．０１％以下に達する前記ラクターゼのタンパク質の添加量が３０．２ｍｇ／Ｌ以下である。
　（３）牛乳に前記ラクターゼを添加したとき、１０℃、２４時間後における残存乳糖濃度が０．１％以下に達する前記ラクターゼのタンパク質の添加量が１０．１ｍｇ／Ｌ以下である。
　（４）牛乳に前記ラクターゼを添加したとき、１０℃、２４時間後における残存乳糖濃度が０．０１％以下に達する前記ラクターゼのタンパク質の添加量が１５．１ｍｇ／Ｌ以下である。
　（５）牛乳に対して、終濃度１．４ＬＹＵ／ｍｌとなる量を添加したときの、１０℃、２４時間後における残存乳糖濃度が０．１％以下に達する。
　（６）牛乳に対して、終濃度２．１ＬＹＵ／ｍｌとなる量を添加したときの、１０℃、２４時間後における残存乳糖濃度が０．０１％以下に達する。
　上記態様のラクターゼにおいて、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか一つから選択されてもよい。
　（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
　（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつラクターゼ活性を有するタンパク質
　（ｉｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつラクターゼ活性を有するタンパク質
　また、上記態様のラクターゼにおいて、上述の牛乳が下記の一つ以上を充足してもよい。
　（Ａ）牛乳中に含まれる固形分量は０．１質量％以上３０質量％以下
　（Ｂ）牛乳中に含まれる乳糖量は０．１質量％以上３０質量％以下
　（Ｃ）牛乳中に含まれるタンパク量は０．１質量％以上３０質量％以下
　（Ｄ）牛乳中に含まれる脂肪分量は０．１質量％以上３０質量％以下
　本発明の他の態様は、ラクターゼ製剤である。当該ラクターゼ製剤は、上述したラクターゼと、
　水、塩、賦形剤、懸濁剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤および生理食塩水から選択される少なくとも一つと、を含有する。前記塩が塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び塩化マンガンからなる群より選ばれる１種以上であってもよい。また、当該ラクターゼ製剤は、上述したラクターゼと、当該ラクターゼと由来または性質の異なる第二のラクターゼと、を含有してもよい。
　本発明のさらに他の態様は、以下の（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
　（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
　（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつラクターゼ活性を有するタンパク質
　（ｉｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつラクターゼ活性を有するタンパク質
　上記態様の遺伝子は、下記（ａ）～（ｄ）のいずれかのＤＮＡからなっていてもよい。
（ａ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列において１～数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつラクターゼ活性を有する前記タンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつラクターゼ活性を有する前記タンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクターゼ活性を有する前記タンパク質をコードするＤＮＡ
　なお、配列番号２は終止コドンを含んだ塩基配列である。
　本発明のさらに他の態様は、上述の遺伝子を有する組み換えベクターである。
　本発明のさらに他の態様は、上述の組み換えベクターで形質転換した形質転換体である。
　本発明のさらに他の態様は、乳糖分解乳の製造方法である。当該乳糖分解乳の製造方法は、原料乳に、上述したラクターゼまたはラクターゼ製剤を添加する工程と、
　前記原料乳に、前記ラクターゼまたは前記ラクターゼ製剤に含まれるラクターゼを所定の時間だけ反応させる工程と、を備える。
　本発明によれば、乳中（特に牛乳中）における乳糖分解作用に優れたラクターゼおよびラクターゼ製剤に関する技術を提供することができる。
図１は、牛乳１ｍＬに対して、ＢＬ１０５Ａ＿１４５３、および他のラクターゼ製剤をタンパク質量が約１５．１μｇとなる量を添加したときの、１０℃における残存乳糖濃度の推移を示すグラフである。 図２は、図１の横軸（１０～５０時間）および縦軸（牛乳中の乳糖濃度０～０．２０％）の範囲を拡大したグラフである。 図３は、ＢＬ１０５Ａ＿１４５３精製酵素液に濃度の異なる各種塩を添加したときの乳糖分解速度（反応速度）を示すグラフである。 図４は、ＢＬ１０５Ａ＿１４５３精製酵素液の至適ｐＨを示すグラフである。 図５は、ＢＬ１０５Ａ＿１４５３精製酵素液のｐＨ安定性を示すグラフである。 図６は、ＢＬ１０５Ａ＿１４５３精製酵素液の至適温度を示すグラフである。 図７は、ＢＬ１０５Ａ＿１４５３精製酵素液の温度安定性を示すグラフである。 図８は、ＨＰＡＥＣ―ＰＡＤによる生成物の主要構造の解析を示すグラフである。 図９は、乳に各ラクターゼとスターターを同時添加したときの発酵段階及び保管中の乳糖濃度の推移を示したグラフである。 図１０は、ＹＮＬとＢＬ１０５Ａ＿１４５３を単独または混合して乳に添加したときの乳糖濃度の推移を示したグラフである。
　以下、本発明の実施形態について、詳細に説明する。なお、本明細書中、数値範囲の説明における「ａ～ｂ」との表記は、特に断らない限り、ａ以上ｂ以下であることを表す。
＜ラクターゼ＞
　実施形態に係るラクターゼは、ラクターゼ活性として、以下の（１）～（６）に記載の活性のうち、いずれか１つ、または複数の組み合わせを２つ以上有することが好ましく、３つ以上有することがより好ましく、４つ以上有することがさらに好ましく、５つ以上有することが特に好ましい。（１）～（６）を全て充足するものであることが最も好ましい。
（１）牛乳に前記ラクターゼを添加したとき、１０℃、１６時間後における残存乳糖濃度が０．１％に達する前記ラクターゼのタンパク質の添加量が１５．１ｍｇ／Ｌ以下である。
（２）牛乳に前記ラクターゼを添加したとき、１０℃、１６時間後における残存乳糖濃度が０．０１％に達する前記ラクターゼのタンパク質の添加量が３０．２ｍｇ／Ｌ以下である。
（３）牛乳に前記ラクターゼを添加したとき、１０℃、２４時間後における残存乳糖濃度が０．１％に達する前記ラクターゼのタンパク質の添加量が１０．１ｍｇ／Ｌ以下である。
（４）牛乳に前記ラクターゼを添加したとき、１０℃、２４時間後における残存乳糖濃度が０．０１％に達する前記ラクターゼのタンパク質の添加量が１５．１ｍｇ／Ｌ以下である。
（５）牛乳に対して、終濃度１．４ＬＹＵ／ｍｌとなる量を添加したときの、１０℃、２４時間後における残存乳糖濃度が０．１％以下である。
（６）牛乳に対して、終濃度２．１ＬＹＵ／ｍｌとなる量を添加したときの、１０℃、２４時間後における残存乳糖濃度が０．０１％以下である。
　なお、（１）から（４）のラクターゼ量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により算出される値である。
　また、実施形態に係るラクターゼは、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか一つから選択される。
　（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
　（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつラクターゼ活性を有するタンパク質
　（ｉｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつラクターゼ活性を有するタンパク質
　上記（ｉ）は、後述するようにラクターゼ活性を有するタンパク質である。
　ラクターゼ活性の測定方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して行うことができる。たとえば、後述する方法によって、ラクターゼ活性を測定することができる本実施形態においてラクターゼ活性を有するとは、測定対象物に含まれるタンパク質量が１ｍｇのとき、後述する方法でのラクターゼ活性が１ＬＹＵ／ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ以上であるものをいう。
　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（以下、ＢＬ１０５Ａ＿１４５３または１４５３と呼ぶ場合がある）は、Bifidobacterium longum（ビフィドバクテリウム・ロングム）１０５－Ａ株由来のラクターゼである。当該ラクターゼは乳糖分解作用が極めて高いことから、好ましい例として挙げられる。
　配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されたアミノ酸配列における、アミノ酸残基の欠失、置換または挿入の数（以下、欠失等の数、という場合がある）は、１～２０個が好ましく、１～１０個がさらに好ましく、１～８個がさらに好ましい。配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失等の数は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるラクターゼと同等の酵素活性を示すものであることが好ましい。
　また、本実施形態において、配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性は７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がさらに好ましく、９０％以上が特に好ましく、９５％以上がとりわけ好ましく、９９％以上が最も好ましい。このような配列の同一性パーセンテージは、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開または市販されているソフトウエアを用いて計算することができる。例として、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡまたはＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社製）等を用いることができる。
　本実施形態に係るラクターゼは、上記いずれかの配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ラクターゼ活性を有するタンパク質を使用することが好ましい。
＜ｐＨ活性＞
　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ｐＨ５．０～８．５の範囲でラクターゼ活性を示し、至適ｐＨ範囲は５．５～６．５である。至適ｐＨは６．０である。
＜ｐＨ安定性＞
　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ｐＨ５．０～９．０の範囲で安定であるラクターゼである。ｐＨ５．２～８．４がより安定であり好ましい。
＜至適温度＞
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、０℃超～６０℃の範囲でラクターゼ活性があり、２０℃～６０℃の範囲でよりラクターゼ活性が高く、至適温度範囲は４０℃～５５℃であり、至適温度は５０℃である。
＜温度安定性＞
　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、５０℃まで熱安定性を示すラクターゼである。当該タンパク質を５０℃にて１時間保持後も１００％のラクターゼ残存活性を示す。
（ラクターゼをコードする遺伝子）
　実施形態に係る遺伝子は、ラクターゼ活性を有する上述のタンパク質をコードする遺伝子であり、好ましくは上記（ｉ）～(ｉｉｉ)のいずれかのアミノ酸配列をコードする遺伝子であり、より好ましくは下記（ａ）～（ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である。
（ａ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列において１～数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつラクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつラクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
　配列番号２で示される塩基配列において１～数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列における、１～数個の塩基とは、１～１０個が好ましく、１～５個がより好ましく、１～３個がさらに好ましく、１または２個がさらに好ましい。また、塩基の欠失とは塩基の欠落または消失を意味し、塩基の置換とは塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、塩基の付加とは塩基が付け加えられていることを意味する。「付加」には、配列の一端または両端への塩基の付加、及び配列中の塩基の間に別の塩基が挿入されることが含まれる。
　本実施形態の遺伝子において、塩基配列の配列同一性は、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がさらに好ましく、９０％以上が特に好ましく、９５％以上がとりわけ好ましく、９９％以上が最も好ましい。
　塩基配列の配列同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90:5873-5877)を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている(J.Mol.Biol.,1990,215,p.403-410)。また、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyxのホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(www.ncbi.nlm.nih.gov参照）。
　なお、ストリンジェントな条件とは、同一性が高い塩基配列同士がハイブリダイズし、それより同一性が低い塩基配列同士がハイブリダイズしない条件をいう。「ストリンジェントな条件」とは、求める同一性の高低によって、適宜条件を変えることができる。より高ストリンジェントな条件であるほど、より同一性の高い配列のみがハイブリダイズすることになる。例えば、ストリンジェントな条件として、Molecular Cloning:A Laboratory Manual (Second Edition,J.Sambrook et.al,1989)に記載の条件等が挙げられる。すなわち、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８～１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。
　本実施形態のラクターゼ活性を有するタンパク質（ラクターゼ）は、公知の方法に従って、ラクターゼをコードする上述の遺伝子を含むベクターを微生物に導入して得られた形質転換体により得ることができる。なお、当該形質転換体はベクターの状態で保持させてもよいし、当該遺伝子をゲノム内に保持させてもよい。すなわち、当該形質転換体を適切な培地で培養すれば、形質転換体が含有するベクターまたはゲノム上にコードされた遺伝子が発現して、本実施形態のラクターゼ活性を有するタンパク質（ラクターゼ）が産生される。産生されたラクターゼを該培養物から単離、精製することにより、ラクターゼを取得することができる。
　本実施形態のラクターゼをコードする遺伝子は、Bifidobacterium longum（ビフィドバクテリウム・ロングム）１０５－Ａ株から当該分野で用いられる任意の方法を用いて単離することができる。例えば、当該遺伝子は、Bifidobacterium longum（ビフィドバクテリウム・ロングム）１０５－Ａ株の全ゲノムＤＮＡを抽出した後、配列番号２の塩基配列の上流および下流の遺伝子配列を元に設計したプライマーを用いたＰＣＲにより標的遺伝子を選択的に増幅し、増幅した遺伝子を精製することで得ることができる。
　本実施形態のラクターゼをコードする遺伝子を含むベクターの種類としては、特に限定されず、タンパク質生産に通常用いられるベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ等が挙げられる。なかでも、プラスミドベクターが好ましく、市販のタンパク質発現用プラスミドベクター、例えば、ｐＥＴやｐＢＩＣ等を好適に用いることができる。プラスミドベクターへの遺伝子の導入手順は、当該分野で周知である。
　また、構築された上記ベクターを導入するための微生物としては、ストレプトマイセス属、ブレビバチルス（Brevibacillus）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、リステリア（Listeria）属、バチルス（Bacillus）属、エシェリキア（Escherichia）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロマイセス（Shizosaccharomyces）属、クリベロマイセス属、アスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属、トリコデルマ（Trichoderma）属に属する細菌ならびに真核微生物が挙げられる。導入の方法としては、当該分野で通常使用される方法を用いることができる。
　得られた形質転換体を適切な培地で培養すれば、形質転換体に導入された遺伝子が発現して、本実施形態のラクターゼが生産される。培養に使用する培地は、形質転換体の種類にあわせて当業者が適宜選択することができる。生成された目的のラクターゼは該培養物から通常の方法により単離、公知の精製方法を用いて精製することができる。
　Bifidobacterium longum（ビフィドバクテリウム・ロングム）１０５－Ａ株に由来するラクターゼは、後述の実施例に示すように、牛乳中の乳糖分解作用が高い。
＜ラクターゼ製剤＞
　本実施形態のラクターゼ製剤（ラクターゼ組成物）は、有効成分（ラクターゼ）の他、例えば、水、塩、賦形剤、懸濁剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤、生理食塩水等を含有してもよい。
　ラクターゼは１種類だけ使用してもよいし、複数種類を混合して使用してもよい。乳糖を含む対象に対し、乳糖分解作用の異なるラクターゼを混合して使用することで、それぞれのラクターゼが有するメリットを享受しやすくなる。例えば、由来の異なるラクターゼを複数組み合わせる場合、中性領域で乳糖分解作用を有するラクターゼと酸性領域で乳糖分解作用を有するラクターゼを併用する場合、乳糖の初期分解速度が早いが乳糖最終分解率が９９．９％までには達しないラクターゼと乳糖の初期分解速度は早くないが乳糖最終分解率が９９．９％以上のラクターゼを併用する場合等である。
　第一のラクターゼと前記第一のラクターゼと由来または性質の異なる第二のラクターゼを所望の特性に応じて組み合わせ、ラクターゼ製剤として使用することができる。第三のラクターゼ、第四のラクターゼ等、混合する数に制限は無い。第一のラクターゼとしてＢＬ１０５Ａ＿１４５３を使用する場合、このラクターゼの由来はBifidobacterium longum 105-Aであり、乳糖最終分解率が９９．９％以上に達する。この酵素に、由来が異なるラクターゼや、乳等の初期分解速度の速いラクターゼを第二のラクターゼとして使用することができる。例えば、酵母由来のラクターゼやカビ由来のラクターゼ、乳酸菌由来のラクターゼを使用することができる。より具体的には、Kluyveromyces lactisやKluyveromyces marxianus由来のラクターゼ、Aspergillus oryzae由来のラクターゼ、Lactobacillus delbrueckii由来のラクターゼである。
　ラクターゼ製剤中に複数のラクターゼを含有させる場合、ラクターゼタンパクの質量を基準にすればよい。第一のラクターゼと第二のラクターゼを含有させる場合、質量比は、１：９９～９９：１の範囲にすればよく、１０：９０～９０：１０の範囲にすることが好ましく、２０：８０～８０：２０の範囲にすることがより好ましく、２５：７５～５０：５０の範囲にすることが最も好ましい。これらの範囲にすることによって、複数の特性を兼ね備えたラクターゼ製剤を提供しやすくなる。
　本実施形態のラクターゼ製剤は塩またはそのイオンを有することにより、ラクターゼ活性が向上する。当該塩としては、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マンガンなどが挙げられる。イオンとしては、ナトリウム、カリウム等の一価の陽イオンやマグネシウム、マンガン、カルシウム等の二価の陽イオン等が挙げられる。特に、本実施形態のラクターゼ製剤は塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マンガンからなる群より選ばれる２種類以上の塩またはそのイオンを有することにより、ラクターゼ活性が顕著に向上する。
　塩またはそのイオンを有するラクターゼ製剤の用途としては、乳糖分解を促進させるものであればよく、牛乳等の原料乳の他、ラクトース水溶液に添加するまたは含有させることが挙げられる。ラクターゼ製剤に上述した塩またはそのイオンを含まない場合であっても、反応系に上述した塩またはそのイオンを含んでいれば、反応系における乳糖分解速度を速めることができる。例えば、ラクトース水溶液に有効成分（ラクターゼ）を加えた反応系に、上述した塩をさらに添加しイオンとして含ませることにより、乳糖分解速度を早めることができる。
　乳糖分解速度を早める観点から、ラクターゼ製剤に含まれる塩の含有量の下限は、０．１ｍＭ以上が好ましく、０．５ｍＭ以上がより好ましく、１ｍＭ以上であってもよく、１０ｍＭ以上であってもよく、４０ｍＭ以上がさらに好ましい。
　塩の含有量の上限は、１０００Ｍ以下が好ましく、５００Ｍ以下がより好ましく、１００Ｍ以下であっても良く、５０Ｍ以下がさらに好ましい。ラクターゼ製剤に含まれる塩の含有量の上限値及び下限値は、上記の範囲を適宜組み合わせることができる。
　ラクターゼ製剤に含まれる一価の陽イオンの下限は、０．１ｍＭ以上が好ましく、１ｍＭ以上がより好ましく、１０ｍＭ以上であっても良く、１００ｍＭ以上であってもよく、５００ ｍＭ以上がさらに好ましい。一価の陽イオンの上限は、１０００Ｍ以下が好ましく、５００Ｍ以下がより好ましく、１００Ｍ以下であってもよく、５０Ｍ以下がさらに好ましい。ラクターゼ製剤に含まれる一価の陽イオンの上限値及び下限値は、上記の範囲を適宜組み合わせることができる。
　ラクターゼ製剤に含まれる二価の陽イオンの下限は、０．１ｍＭ以上が好ましく、１ｍＭ以上がより好ましく、１０ｍＭ以上であってもよく、４０ｍＭ以上がさらに好ましい。二価の陽イオンの上限は、１００Ｍ以下が好ましく、２０Ｍ以下がより好ましく、１０Ｍ以下であっても良く、２Ｍ以下がさらに好ましい。ラクターゼ製剤に含まれる二価の陽イオンの上限値及び下限値は、上記の範囲を適宜組み合わせることができる。
　塩による乳糖分解速度を十分に得る観点から、ラクトース水溶液のｐＨは、典型的には、４．５～９．０である。
　ラクターゼ製剤の形状は限定されない。室温で固体状であっても良く、液体状であってもよい。固体状の物に使用する場合はラクターゼ製剤が固体状であることが好ましく、液体（例えば、牛乳）に使用する場合はラクターゼ製剤が液体状であることが好ましい。
（タンパク質量）
　本実施形態のラクターゼ製剤に含まれるタンパク質の含有量の下限値は、液体状のラクターゼ製剤であれば０．０７２ｍｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、固体状のラクターゼ製剤であれば０．７２ｍｇ／ｇ以上であることが好ましい。一方、当該タンパク質の含有量の上限値は特に制限されないが、たとえば、７２０ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましい。
　当該タンパク質の含有量が下限値以上であることにより、保存時間が長期化しても、所望の活性を確保することができる。
　本実施形態のラクターゼ製剤に含まれるタンパク質量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で測定することができる。
（活性値）
　本実施形態のラクターゼ製剤は、１０～１００，０００ＬＹＵ／ｍＬのラクターゼ活性を有することが望ましく、１００～９０，０００ＬＹＵ／ｍＬの活性を有することがより望ましく、１，０００～８０，０００ＬＹＵ／ｍＬの活性を有することがさらに望ましい。
　活性の測定方法は、以下のとおりである。０．１ｍＭ塩化マンガン溶液を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した乳糖溶液（終濃度１０％）に測定対象のラクターゼ製剤（酵素液）を添加し、ｐＨ６．５、３７℃で、１０分間保持する。反応を、１．５Ｎの水酸化ナトリウム溶液の添加によって終了させる。反応液を常温まで冷まし、１．５Ｎの塩酸を添加することにより溶液を中和する。反応液中の遊離グルコース量の定量に、グルコースＣＩＩテストワコー（和光純薬工業製）を用いる。本条件下で１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量を１ＬＹＵと定義する。
（安定化剤）
　本実施形態のラクターゼ製剤は、安定化剤の含有量が１０～９０質量％であることが好ましく、２０～８０質量％であることがより好ましく、３０～７０質量％であることがさらに好ましい。
　安定化剤としては、ソルビトールやグリセリン等が挙げられる。
＜乳糖分解乳の製造方法＞
（原料乳）
　本実施形態のラクターゼまたはラクターゼ製剤が使用される乳は、乳糖を含んでいるものであれば特に制限はない。乳の由来としては、例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ等がある。これらの中でもウシ由来の乳を使用することが好ましい。
　これらの乳をそのまま使用してもよく、必要に応じて水、全粉乳、脱脂粉乳、クリームパウダー、ホエイパウダー、たんぱく質濃縮ホエイパウダー、バターミルクパウダー、加糖粉乳、調製粉乳等を加えてもよい。後述する固形分量、乳糖量等を調整することも可能である。本実施形態においては、上記の乳に酵素以外のものを添加したものを原料乳という。
　原料乳中に含まれる固形分量は０．１質量％以上３０質量％以下、０．５質量％以上２０質量％以下、１質量％以上１０質量％以下、２質量％以上８質量％以下であってもよく、４．０質量％以上が好ましく、６．０質量％以上がより好ましく、８．０質量％以上がさらに好ましい。原料乳中に含まれる固形分量の上限値は特に限定されないが、例えば、３０質量％である。
　原料乳中に含まれる乳糖量は０．１質量％以上３０質量％以下、０．５質量％以上２０質量％以下、１質量％以上１０質量％以下、２質量％以上８質量％以下であってもよく、４．０質量％以上５．８％質量以下が好ましく、４．４質量％以上５．４質量％以下が好ましく、４．８質量％以上５．０質量％以下がさらに好ましい。
　原料乳中に含まれるタンパク量は０．１質量％以上３０質量％以下、０．５質量％以上２０質量％以下、１質量％以上１０質量％以下、２質量％以上８質量％以下であってもよく、２．０質量％以上４．８質量％以下が好ましく、２．６質量％以上４．２質量％以下がより好ましく、３．２質量％以上３．６質量％以下がさらに好ましい。
　原料乳中に含まれる脂肪分量は０．１質量％以上３０質量％以下、０．５質量％以上２０質量％以下、１質量％以上１０質量％以下、２質量％以上８質量％以下であってもよく、１．５質量％以上が好ましく、２．５質量％以上がより好ましく、３．５質量％以上がさらに好ましい。
　原料乳の殺菌方法は特に制限されないが、熱履歴の低い順に、低温保持殺菌（ＬＴＬＴ）、高温保持殺菌（ＨＴＬＴ）、超高温瞬間殺菌（ＵＨＴ）が挙げられる。これらの殺菌方法のうち、ＵＨＴを乳の殺菌に適用することが好ましい。なお、原料乳は、無殺菌の生乳でもよい。
　上記の原料乳に、本実施形態のラクターゼまたはラクターゼ製剤を所定濃度で添加した後、所定の時間、所定の温度で反応させることによって、乳糖分解率の高い乳糖分解乳を製造することができる。原料乳として牛乳を使用することが好ましい。
　反応時間としては、例えば、１時間～４８時間であり、好ましくは１２時間～２４時間である。
　反応温度は、例えば、０℃超～４０℃であり、好ましくは１℃～２５℃、１℃～１０℃である。
　牛乳中に含まれる乳糖濃度は約４．７質量％である。乳糖分解乳に含まれる乳糖量は、０．１質量％以下（乳糖分解率９７．８７％以上）が好ましく、０．０１質量％以下（乳糖分解率９９．７９％以上）がより好ましい。これによって、ラクトースフリーミルクとして売ることが可能となる。
　原料乳中のラクターゼが１．４ＬＹＵ／ｍＬ以上であれば、乳糖量が０．１質量％以下（乳糖分解率９７．８７％以上）の乳糖分解乳を得やすくなるため好ましい。
　原料乳中のラクターゼが２．１ＬＹＵ／ｍＬ以上であれば、乳糖量が０．０１質量％以下（乳糖分解率９９．７９％以上）の乳糖分解乳を得やすくなるため好ましい。
　以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
　以下、本発明を実施例および比較例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜使用酵素＞
　評価に用いたラクターゼを以下に示す。
ＢＬ１０５Ａ＿１４５３：〔Bifidobacterium longum 105-A株由来、E.coli組換え発現精製酵素〕
ＹＮＬ　２：〔Kluyveromyces lactis由来、合同酒精株式会社製剤、#21006〕
ＹＮＬ　２ＬＳ：〔Kluyveromyces lactis由来、合同酒精株式会社製剤、#21002〕
ラクターゼＡ：〔Kluyveromyces lactis由来〕
ラクターゼＢ：〔Bifidobacterium bifidum由来〕
ラクターゼＣ：〔 Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus由来〕
＜ＢＬ１０５Ａ＿１４５３粗酵素液の製造＞
　ＢＬ１０５Ａ＿１４５３の発現プラスミドｐＥＴ２３ａ－ＢＬ１０５Ａ＿１４５３を導入したＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体を５ｍＬのＬＢ　Ａｍｐ培地（５０μｇ／ｍＬ）を含む試験管に植菌して１８℃で一晩培養した。培養液２５０μＬを２５ｍＬのＴＢ　Ａｍｐ培地（５０μｇ／ｍＬ）を含む１００ｍＬ容三角フラスコに接種し、１８℃にて振盪培養した。これを１０本分行った。吸光光度計を用いて、吸光度Ａ６１０が０．５に達した時点で終濃度０．５ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）を添加し、組換えタンパク質の生産を誘導した。誘導培養を１８℃にて２４時間行った。遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により培養液から菌体を回収し、Ｎｉカラムクロマトグラフィーの結合バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５、５００ｍＭ塩化ナトリウム）１０ｍＬに懸濁し、ソニケーション（ＵＲＴＲＡ　ＳＯＮＩＣ　ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ　ＵＲ－２００Ｐ、トミー精工社製）により菌体を破砕した。遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）して得られた上清を、ＢＬ１０５Ａ＿１４５３を含む粗酵素液とした。
＜ＢＬ１０５Ａ＿１４５３精製酵素液の製造＞
　上記で得られた粗酵素液を結合バッファーで平衡化したＮｉ－ＮＴＡ　Ａｇａｒｏｓｅカラム(Φ１．０ｃｍ×４．０ｃｍ；ＱＩＡＧＥＮ)に供した。非吸着タンパク質を洗浄バッファー(２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭイミダゾール)により除去した後、２０－５００ｍＭのイミダゾール直線濃度勾配により吸着タンパク質を溶出した(溶出バッファーＡ、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５、２０ｍＭイミダゾール；溶出バッファーＢ、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５、５００ｍＭ　イミダゾール；各６０ｍＬ)。画分液量を洗浄では８ｍＬ、溶出では３ｍＬとした。ＯＮＰＧ分解活性プレートアッセイにて活性が確認された画分（溶出ｆｒａ．７－１４）を回収した。回収した画分を透析膜(セルロースチューブ　３６／３２；Ｖｉｓｋａｓｅ　Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．)を用いて１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）１Ｌに対して１回、さらに同緩衝液５Ｌに対して２回透析した。透析後、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５（ＭＷＣＯ，１００，０００；Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて１．５ｍＬまで濃縮した。これをＢＬ１０５Ａ＿１４５３精製酵素液とした。得られた精製酵素液に、終濃度５０％となるようにグリセロールを添加し、－８０℃にて保存した。精製酵素液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、単一のバンドであることを確認した。
＜牛乳中での乳糖分解の経時変化＞
　上記で調製したＢＬ１０５Ａ＿１４５３精製酵素液および他のラクターゼ製剤（酵素液）について、乳糖分解試験を行った。市販の牛乳(明治社製、乳糖含有量は４．７質量％）１ｍＬを１．５ｍＬエッペンチューブに分注し、１０℃にて１０分間プレインキュベートした。これに各ラクターゼを終濃度０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０６、０．０８、０．１２および０．１６ｖ／ｖ％となるように緩衝液を用いて調整した各酵素液２０μＬを添加し、１０℃にて４８時間保持した。ブランクには、牛乳１ｍＬに緩衝液２０μＬを添加したものを用いた。ＢＬ１０５Ａ＿１４５３については、製品（作り込み）活性を３５００ＬＹＵ／ｍＬと想定した。反応停止は、２０％スルホサリチル酸を１／２０量添加することにより行った。なお、緩衝液には０．１ｍＭ塩化マンガンを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた。
＜乳糖分解率の算出方法＞
　ＨＰＬＣおよびＨＰＡＥＣ－ＰＡＤを用いた各サンプルの糖分析を以下に従って行った。
＜＜ＨＰＬＣ分析＞＞
　超純水で５倍希釈したサンプルを孔径０．２２μｍのフィルターで濾過し、濾液をＨＰＬＣを用いて分析した。ＨＰＬＣ分析時の条件は以下のとおりである。
本体：高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）Ｗａｔｅｒｓ２６９６
カラム：ＴＲＡＮＳＧＥＮＯＭＩＣ社製、ＣＡＲＢＯＳｅｐ　ＣＨＯ－６２０ＣＡ（φ６．５ｍｍ×３００ｍｍ）、８５℃
移動相：水
流速：０．４ｍＬ／分
検出器：ＲＩ
サンプル注入量：５μＬ
＜＜ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ分析＞＞
　超純水で２５０倍希釈したサンプルを０．２２μｍのフィルターで濾過し、濾液をＨＰＡＥＣ－ＰＡＤを用いて分析した。ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ分析時の条件は以下のとおりである。
本体：Ｄｉｏｎｅｘ社製、ＩＣＳ－６０００＋、ＡＳ－Ａｐ　オートサンプラー
カラム：Ｄｉｏｎｅｘ社製、ＣａｒｂｏＰａｃ　ＰＡ１（φ４．０ｍｍ×２５０ｍｍ）、２０℃
移動相：下記４液のグラジエント
Ａ：１００ｍＭ　水酸化ナトリウム溶液
Ｂ：１００ｍＭ　水酸化ナトリウム含有６００ｍＭ酢酸ナトリウム溶液
Ｃ：水
Ｄ：５０ｍＭ　酢酸ナトリウム溶液
流速：１．０ｍＬ／分
検出器：パルスドアンペロメトリ、３０℃
サンプル注入量：２５μＬ
　ＨＰＬＣ分析により、おおよそ５０％以上の乳糖の分解が確認されたサンプルについては、ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ分析によって得られた分析値を乳糖分解率の算出に用いた。乳糖分解率を、同条件で分析した牛乳の乳糖濃度に対する各サンプルの残存乳糖濃度を比較することにより算出した。
＜牛乳中の乳糖濃度が０．１質量％または０．０１質量％に達するラクターゼ活性（ＬＹＵ／ｍＬ）＞
　１０℃において、各反応時間における牛乳中の乳糖濃度が０．１質量％または０．０１質量％に達するラクターゼ活性（ＬＹＵ／ｍＬ）を表１に示す。このラクターゼ活性は牛乳中の終濃度を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜１０℃における測定対象物に含まれるタンパク質量当たりの乳糖分解能＞
　測定対象物に含まれるタンパク質量当たりの乳糖分解能を比較するため、ＬＹＵ活性を指標とした比活性を算出した。ＢＬ１０５Ａ＿１４５３酵素液および他のラクターゼ製剤のタンパク質の定量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に従った。
　得られた比活性の値と表１の結果とを合わせて、乳糖濃度を０．１％および０．０１％にする場合に必要なタンパク質量を算出した。ＢＬ１０５Ａ＿１４５３は今回比較したラクターゼの中では反応１６～４８時間において最も優位性が高いことが確認された（表２参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　図１および図２（図１の部分拡大図）は、牛乳１ｍＬに対して、ＢＬ１０５Ａ＿１４５３、および他のラクターゼタンパク質を約１５．１μｇとなる量を添加したときの、１０℃における残存乳糖濃度の推移を示すグラフである。図１および図２に示すように、牛乳に対して、ＢＬ１０５Ａ＿１４５３精製酵素液は、１０℃、１６または２４時間後における残存乳糖濃度がそれぞれ、０．１％以下、０．０１％以下であり、用意した他のラクターゼ製剤に比べてより高い乳糖分解率を示した。
＜＜牛乳中における活性化因子の解析＞＞
　ＹＮＬ　２精製酵素液およびＢＬ１０５Ａ＿１４５３精製酵素液について、牛乳中における活性化因子を解析した。
　具体的には、酵素液１０μＬを以下の各条件で得られる溶液１９０μＬに加えた後、１０℃または３７℃で１０分間保持した反応系において乳糖分解速度（反応速度）を算出した。
条件１：１３９ｍＭ　乳糖、０．５ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ＝６．５）
条件２：混合塩類（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２）含有１３９ｍＭ　乳糖（Ｎａ＋：１８．４ｍＭ、Ｋ＋：３９．６ｍＭ、Ｍｇ２＋：４．２５ｍＭ）
条件３：牛乳
条件４：分画牛乳
条件５：脱塩分画牛乳－１（電気透析により条件４の分子量＜１００の荷電成分を除去）
条件６：脱塩分画牛乳－２（イオン交換樹脂により４の荷電成分を除去）
　乳糖分解速度は以下の手順で算出した。
酵素液１０μＬを上記の各条件で得られる溶液１９０μＬに加えた後、１０℃または３７℃で１０分間反応後、２１％スルホサリチル酸を１０μＬ加え、反応を停止した。遠心分離により回収したサンプル上清を超純水で１０倍希釈した溶液５０μＬに、２Ｍ　トリス塩酸緩衝液１００μＬ（ｐＨ７．０）およびグルコース定量試薬 (グルコースCIIテストワコー)２０μＬを添加し、３７°Ｃに１時間保持してＡ５０５を測定した。検量線（０－６００μＭ　グルコースとＡ５０５）に基づきＡ５０５からグルコース濃度を算出した。なお、検量線にはグルコース水溶液：牛乳上清＝９：１の混合溶液を用いた。本条件下で１分間に１μｍｏｌの乳糖を加水分解する酵素量を１単位と定義した。得られた結果を表３および表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＹＮＬ　２は分画牛乳の電気透析により、ほぼ１３９ｍＭ　乳糖のレベルまで活性が低下し、混合塩類の添加により牛乳中のレベルを超えるほどの活性となったことにより、牛乳中の塩が酵素の活性化に大きく寄与したと判断された。
　ＢＬ１０５Ａ＿１４５３では分画牛乳のイオン交換樹脂による脱塩では１３９ｍＭ　乳糖のレベルまで活性が低下するが、電気透析による脱塩では活性の低下が穏やかであった。混合塩類の添加により、牛乳中の活性のレベルとなることから牛乳中の塩が活性化に働くと考えられるが、電気透析では除かれない成分が塩の代替として働く可能性も考えられる。
＜＜ＢＬ１０５Ａ＿１４５３への金属塩の影響評価＞＞
　以下の各反応系において３７℃でのｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）　分解速度（反応速度）を算出した。
反応系１：（Ｎａ＋）（５０μＬ）
２ｍＭ　ＯＮＰＧ、１０ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ　６．０、５．３ｍＭ　Ｎａ＋を含む）、０－５０ｍＭ　ＮａＣｌ、酵素
反応系２：（Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋）（５０μＬ）
２ｍＭ　ＯＮＰＧ、１０ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ　６．０、６ｍＭ　Ｋ＋を含む）、０－５０ｍＭ　ＫＣｌ、０－１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０－０．１ｍＭ　ＭｎＣｌ２または０－５０ｍＭ　ＣａＣｌ２、酵素
　ＯＮＰＧ分解速度は以下の手順で算出した。
　上記反応系１または２を３７℃で１０分間反応後、１Ｍ 炭酸ナトリウム溶液１００μＬを添加し、Ａ４００を測定した。本条件下で１分間に１μｍｏｌのＯＮＰＧを分解する酵素量を１単位と定義した。得られた結果を図３に示す。
＜ＢＬ１０５Ａ＿１４５３の酵素学的諸性質＞
＜＜至適ｐＨ＞＞
　ラクターゼの至適ｐＨは以下の方法で測定した。
　各ｐＨに調整した緩衝液　（０．１ｍＭ　塩化マンガンを含む０．１Ｍ　リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５－９．５）により希釈したＢＬ１０５Ａ＿１４５３酵素液を１．５ｍＬチューブに１５０μＬ採り、緩衝液１５０μＬと混和させた後、３７℃で３分間プレインキュベートした。基質（ＯＮＰＧ　１００ｍｇ／蒸留水１００ｍＬ）３００μＬと３７℃で１分間反応させ、０．２Ｍ　炭酸ナトリウム６００μＬを加えて反応を停止させた。反応液のＯＤ４２０の吸光度から、ラクターゼ活性の値を算出した。ラクターゼ活性１単位は、１０分間に測定値を１変化させるのに必要な酵素量と定義した。
　得られた結果を図４に示した。ＢＬ１０５Ａ＿１４５３の至適ｐＨは６．０であった。
＜＜ｐＨ安定性＞＞
　ラクターゼのｐＨ安定性は以下の方法で測定した。
　ＢＬ１０５Ａ＿１４５３酵素液を各緩衝液（ｐＨ３．０－１０．５）で１０倍希釈し、３７℃で３０分間インキュベートした。３分間氷上で冷却した後、ｐＨ６．０の緩衝液でさらに２００倍希釈した。希釈した酵素液を１．５ｍＬチューブに３００μＬ採り、緩衝液３００μＬと混和させた後、３７℃で３分間プレインキュベートした。基質（ＯＮＰＧ１００ｍｇ／蒸留水１００ｍＬ）６００μＬと３７℃で１分間反応させ、０．２Ｍ　炭酸ナトリウム１２００μＬを加えて反応を停止させた。反応液のＯＤ４２０の吸光度から、ラクターゼ活性の値を算出した。ラクターゼ活性１単位は、１０分間に測定値を１変化させるのに必要な酵素量と定義した。
　ラクターゼのｐＨ安定性は、ラクターゼの至適ｐＨにおいて示した方法のうち、使用する緩衝液と、３７℃で３０分間インキュベートさせた以外は同様の方法で測定することができる。
　各ｐＨにおける緩衝液は以下のものを用い、ｐＨは酵素希釈時の実測値でプロットした。
・ｐＨ３．５～５．５
：０．１ｍＭ　塩化マンガンを含む０．１Ｍ　酢酸ナトリウム緩衝液
・ｐＨ５．５～９．０
：０．１ｍＭ　塩化マンガンを含む０．１Ｍ　リン酸ナトリウム緩衝液
・ｐＨ８～１０．５
：０．１ｍＭ　塩化マンガンを含む０．１Ｍ　グリシン・水酸化ナトリウム緩衝液
　得られた結果を図５に示した。ＢＬ１０５Ａ＿１４５３の安定域はｐＨ５．２－８．４であった。
＜＜至適温度＞＞
　ラクターゼの至適温度は以下の方法で測定した。
　ｐＨ６．０のリン酸ナトリウム緩衝液で２０００倍希釈したＢＬ１０５Ａ＿１４５３酵素液を３００μＬ採り、緩衝液３００μＬと混和させた後、４、１０、１５、２０、２５、３０、３５、３７、４０、４５、５０、５５、６０℃で３分間プレインキュベートした。その後、各温度にてｐＨ安定性試験と同様にして活性測定を行った。
　得られた結果を図６に示した。図６では、３７℃における活性を基準（相対活性１００％）とした。ＢＬ１０５Ａ＿１４５３の至適温度は５０℃であった。
＜＜温度安定性＞＞
　ラクターゼの温度安定性は以下の方法で測定した。
　ＢＬ１０５Ａ＿１４５３酵素液をｐＨ６．０の緩衝液で１０倍希釈し、３７、５０、５５、６０、６５、７０℃で０、５、１０、３０、６０分間インキュベートした。３分間氷上で冷却した後、ｐＨ６．０の緩衝液でさらに２００倍希釈した。希釈した酵素液を試験管に３００μＬ採り、緩衝液３００μＬと混和させた後、３７℃で３分間プレインキュベートした。その後、ｐＨ安定性試験と同様にして活性測定を行った。
　得られた結果を図７に示した。ＢＬ１０５Ａ＿１４５３は５０℃にて１時間反応後も１００％のラクターゼ残存活性を示した。
＜ガラクトオリゴ糖生成＞
　３０または５０ｗ／ｖ％　乳糖存在下でＢＬ１０５Ａ＿１４５３をそれぞれ作用させたところ、３糖以上のガラクトオリゴ糖を最大２０％生成することを確認した（ガラクトオリゴ糖の収率として）。ＢＬ１０５Ａ＿１４５３によって生成したガラクトオリゴ糖の主要構造は３’－ガラクトシルラクトースであった（図８下段）。図８上段に示すように、Bacillus circulans由来のガラクトオリゴ糖生成酵素（製品名：ビオラクタ）の主要構造は４’－ガラクトシルラクトースであることから、生成するガラクトオリゴ糖の種類が異なることを確認した。
　なお、３’－ガラクトシルラクトースは４’－ガラクトシルラクトースと同様、ヒトの腸内におけるビフィズス菌増殖効果が期待されている物質である。
　ここで、３糖のガラクトオリゴ糖を製造する場合、２分子の乳糖から１分子のグルコース及び１分子の３糖のガラクトオリゴ糖が生じる。この時のガラクトオリゴ糖の理論収率は約７４質量％である。４糖のガラクトオリゴ糖を製造する場合、３分子の乳糖から２分子のグルコース及び１分子の４糖のガラクトオリゴ糖が生じる。この時のガラクトオリゴ糖の理論収率は約６５質量％である。したがって乳糖からガラクトオリゴ糖を製造する場合、３糖のガラクトオリゴ糖のみを製造することが収率の点で最も効率的である。ここでガラクトオリゴ糖の収率（質量％）とは、「ガラクトオリゴ糖の生成量」を「乳糖の消費量」で除した百分率を意味する。生成したガラクトオリゴ糖は、ＨＰＬＣにより測定することができる。具体的には、ＷＯ２０１９／１９４０６２記載の方法を採用すればよい。
＜発酵乳の製造＞
　市販の牛乳（明治社製）にスターター（乳酸菌　ＹＦ－Ｌ８１２株　１０ｍｇ／１００ｇ、ビフィズス菌　ＢＢ－１２株　５ｍｇ／１００ｇ）を入れて撹拌、分注後、ＢＬ１０５Ａ＿１４５３酵素液を製品活性　５２００ＬＹＵ／ｍＬとして０．０２、０．０６％となるように添加した。対照として、ＹＮＬ　２　０．０２％添加区とラクターゼＢ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｉｆｉｄｕｍ由来酵素）０．０２％添加区を設けた。発酵開始から０，２，４時間後にサンプリングを行い、糖分析により残存乳糖濃度（質量％）を算出した。ただし、ＢＬ１０５Ａ＿１４５３添加区は発酵が早く進んだため、３時間経過時にもサンプリングを行った。発酵終了後、サンプルを１０℃に移し、２４、４８、７２時間後の残存乳糖濃度を算出した。糖分析に供するサンプルは全て水で３倍希釈し、スルホサリチル酸により除タンパク質処理をした。その他の糖分析の条件は上述した＜＜ＨＰＬＣ分析＞＞に従った。
　上記によって得られた発酵乳中の乳糖濃度の推移を図９に示した。同添加量（０．０２％添加区）で比較した場合、ＢＬ１０５Ａ＿１４５３は発酵終了時点（４時間後）でラクターゼＢと同等の分解率となり、サンプル中の乳糖濃度は０．４％を示した。一方、ＢＬ１０５Ａ＿１４５３を０．０６％添加した場合、発酵２時間目で乳糖濃度が０．１％以下に達した。ラクターゼＢのみが発酵終了後の１０℃、低ｐＨ条件下でも反応し、発酵開始から４８時間後に乳糖濃度が０．１％以下に達した。ＢＬ１０５Ａ＿１４５３は、上述したｐＨ安定性試験でｐＨ４．７以下で活性が低下したことから、発酵終了時点で失活し始めている可能性が考えられた。
　以上の結果から、ＢＬ１０５Ａ＿１４５３をスターターと同時に添加し発酵乳を得る方法によって、発酵段階において、効率的に乳糖を分解することができる。これによって、発酵乳製造段階において別途の工程を必要とせず、ラクトースフリーの発酵乳を安定的に製造することができる。
＜ＹＮＬ　２およびＢＬ１０５Ａ＿１４５３を組み合わせた牛乳中（１０℃）の乳糖分解試験＞
　ＢＬ１０５Ａ＿１４５３およびＹＮＬ　２製剤を組み合わせて牛乳中の乳糖分解試験を行った。終濃度０．０４％（ＹＮＬ　２と１４５３を合わせて０．０４％）となるように各酵素２０μＬを牛乳に添加し、１０℃にて４８時間保持した。このとき、ＢＬ１０５Ａ＿１４５３の製品活性を５，２００ＬＹＵ／ｍＬと想定した。その他の条件および糖分析は上述した＜牛乳中での乳糖分解の経時変化＞、＜乳糖分解率の算出方法＞、＜＜ＨＰＬＣ分析＞＞及び＜＜ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ分析＞＞に従った。
　得られた結果を図１０に示した。乳糖分解における初速度はＹＮＬ　２濃度依存的に速くなった一方、最終分解率はＢＬ１０５Ａ＿１４５３濃度依存的に高くなった。なお、図１０のうち、乳糖濃度０．０１％未満がラクトースフリーの領域である。
　上記の結果から、ラクターゼとして複数の酵素を使用することで、所望の結果を得やすくなることを確認した。

Claims (11)

  1. 　ラクターゼ活性として、以下の（１）～（６）に記載の活性のうち、いずれか１つ、または複数の組み合わせを有する、ラクターゼ。
    　（１）牛乳に前記ラクターゼを添加したとき、１０℃、１６時間後における残存乳糖濃度が０．１％以下に達する前記ラクターゼのタンパク質の添加量が１５．１ｍｇ／Ｌ以下である。
    　（２）牛乳に前記ラクターゼを添加したとき、１０℃、１６時間後における残存乳糖濃度が０．０１％以下に達する前記ラクターゼのタンパク質の添加量が３０．２ｍｇ／Ｌ以下である。
    　（３）牛乳に前記ラクターゼを添加したとき、１０℃、２４時間後における残存乳糖濃度が０．１％以下に達する前記ラクターゼのタンパク質の添加量が１０．１ｍｇ／Ｌ以下である。
    　（４）牛乳に前記ラクターゼを添加したとき、１０℃、２４時間後における残存乳糖濃度が０．０１％以下に達する前記ラクターゼのタンパク質の添加量が１５．１ｍｇ／Ｌ以下である。
    　（５）牛乳に対して、終濃度１．４ＬＹＵ／ｍｌとなる量を添加したときの、１０℃、２４時間後における残存乳糖濃度が０．１％以下に達する。
    　（６）牛乳に対して、終濃度２．１ＬＹＵ／ｍｌとなる量を添加したときの、１０℃、２４時間後における残存乳糖濃度が０．０１％以下に達する。
  2. 　以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか一つから選択される請求項１に記載のラクターゼ。
    　（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    　（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつラクターゼ活性を有するタンパク質
    　（ｉｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつラクターゼ活性を有するタンパク質
  3. 　請求項１に記載の牛乳が下記の一つ以上を充足する、請求項１または２に記載のラクターゼ。
    　（Ａ）牛乳中に含まれる固形分量は０．１質量％以上３０質量％以下
    　（Ｂ）牛乳中に含まれる乳糖量は０．１質量％以上３０質量％以下
    　（Ｃ）牛乳中に含まれるタンパク量は０．１質量％以上３０質量％以下
    　（Ｄ）牛乳中に含まれる脂肪分量は０．１質量％以上３０質量％以下
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のラクターゼと、
    　水、塩、賦形剤、懸濁剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤および生理食塩水から選択される少なくとも一つと、
    　を含有するラクターゼ製剤。
  5. 　前記塩が塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化カルシウムからなる群より選ばれる１種以上である、請求項４に記載のラクターゼ製剤。
  6. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のラクターゼと、当該ラクターゼと由来または性質の異なる第二のラクターゼと、
    　を含有するラクターゼ製剤。
  7. 　以下の（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のタンパク質をコードする遺伝子。
    　（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    　（ｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつラクターゼ活性を有するタンパク質
    　（ｉｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつラクターゼ活性を有するタンパク質
  8. 　下記（ａ）～（ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である請求項７に記載の遺伝子。
    （ａ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ
    （ｂ）配列番号２で示される塩基配列において１～数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつラクターゼ活性を有する前記タンパク質をコードするＤＮＡ
    （ｃ）配列番号２で示される塩基配列に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつラクターゼ活性を有する前記タンパク質をコードするＤＮＡ
    （ｄ）配列番号２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクターゼ活性を有する前記タンパク質をコードするＤＮＡ
  9. 　請求項７または８に記載の遺伝子を有する組み換えベクター。
  10. 　請求項９に記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体。
  11. 　原料乳に、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の前記ラクターゼまたは請求項４または５に記載の前記ラクターゼ製剤を添加する工程と、
    　前記原料乳に、前記ラクターゼまたは前記ラクターゼ製剤に含まれるラクターゼを所定の時間だけ反応させる工程と、
    を備える、乳糖分解乳の製造方法。
PCT/JP2022/033563 2021-09-07 2022-09-07 ラクターゼ、ラクターゼ製剤、遺伝子、組み換えベクターおよび形質転換体 WO2023038057A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202280059879.XA CN117980483A (zh) 2021-09-07 2022-09-07 乳糖酶、乳糖酶制剂、基因、重组载体和转化体
JP2023546967A JPWO2023038057A1 (ja) 2021-09-07 2022-09-07

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021145630 2021-09-07
JP2021-145630 2021-09-07
JP2022-033806 2022-03-04
JP2022033806 2022-03-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023038057A1 true WO2023038057A1 (ja) 2023-03-16

Family

ID=85506366

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/033563 WO2023038057A1 (ja) 2021-09-07 2022-09-07 ラクターゼ、ラクターゼ製剤、遺伝子、組み換えベクターおよび形質転換体

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2023038057A1 (ja)
WO (1) WO2023038057A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004534527A (ja) 2001-04-04 2004-11-18 デーエスエム イーペー アセッツ ベスローテン フェンノートシャップ 精製ラクターゼ
JP2016208998A (ja) * 2011-03-14 2016-12-15 合同酒精株式会社 ラクターゼ製剤
WO2019194062A1 (ja) 2018-04-05 2019-10-10 合同酒精株式会社 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｂｕｌｉ由来のガラクトオリゴ糖を製造可能な酵素、およびガラクトオリゴ糖を製造する方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004534527A (ja) 2001-04-04 2004-11-18 デーエスエム イーペー アセッツ ベスローテン フェンノートシャップ 精製ラクターゼ
JP2016208998A (ja) * 2011-03-14 2016-12-15 合同酒精株式会社 ラクターゼ製剤
WO2019194062A1 (ja) 2018-04-05 2019-10-10 合同酒精株式会社 Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｂｕｌｉ由来のガラクトオリゴ糖を製造可能な酵素、およびガラクトオリゴ糖を製造する方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 410
J. SAMBROOK: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989
KARLINALTSCHUL, PRO. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873 - 5877
KEISUKE MATSUMOTO ET.AL.: "Characterization and utilization of β-galactosidase from Lactobacillus and Bifidobacterium", RAKUNO KAGAKU, SHOKUHIN NO KENKYU - JAPANESE JOURNAL OF DAIRY AND FOOD SCIENCE, NIHON RAKUNO KAGAKKAI, SENDAI, JP, vol. 39, no. 6, 1 January 1990 (1990-01-01), JP , pages A - A-248, XP009544334, ISSN: 0385-0218 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2023038057A1 (ja) 2023-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK202000111Y3 (da) Polypeptider med transgalactosyleringsaktivitet
JP5643756B2 (ja) バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼ
AU2018251957B2 (en) Lactase enzymes with improved properties
JP4931914B2 (ja) 非リン酸化性ラクトースパーミアーゼを有する乳酸菌の変異株
WO2014084340A1 (ja) ヨーグルトおよびその製造方法、乳酸菌体外機能性産生物製造方法、ならびに乳酸菌体外機能性産生物増産剤
JP2022504684A (ja) 酸性ｐｈで改善された特性を持つラクトース分解酵素
WO2019194062A1 (ja) Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｂｕｌｉ由来のガラクトオリゴ糖を製造可能な酵素、およびガラクトオリゴ糖を製造する方法
AU2022205242A1 (en) Lactase enzymes with improved properties
KR101121161B1 (ko) 고당전이 활성의 신규한 베타-갈락토시다제 및 그 용도
CA2808817A1 (en) Fermented milk having little lactose and method for producing same
WO2023038057A1 (ja) ラクターゼ、ラクターゼ製剤、遺伝子、組み換えベクターおよび形質転換体
US20210032615A1 (en) Lactase enzymes with improved properties
AU2018250886C1 (en) Lactase enzymes with improved activity at low temperatures
JP5738561B2 (ja) 新規環状バクテリオシン
CN117980483A (zh) 乳糖酶、乳糖酶制剂、基因、重组载体和转化体
US10526592B2 (en) Beta-galactosidase variant having high transglycosylation activity, and use thereof
RU2806709C2 (ru) Ферменты лактазы с улучшенными свойствами
RU2814542C2 (ru) Ферменты лактазы с улучшенными свойствами при кислом pH
WO2021210539A1 (ja) 発酵乳及びその製造方法、並びに脱リン酸乳
RU2788608C2 (ru) Ферменты лактазы с улучшенными свойствами
WO2018228966A1 (en) Frozen enzyme pellets
RU2800427C2 (ru) Ферменты лактазы с улучшенной активностью при низких температурах
JP2021093954A (ja) ガラクトオリゴ糖を製造可能な酵素、およびガラクトオリゴ糖を製造する方法
CN114514317A (zh) 使用调控改变的菌株生产乳糖酶

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22867379

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023546967

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022867379

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022867379

Country of ref document: EP

Effective date: 20240408