KR101121161B1

KR101121161B1 - 고당전이 활성의 신규한 베타-갈락토시다제 및 그 용도

Info

Publication number: KR101121161B1
Application number: KR1020090015491A
Authority: KR
Inventors: 최재열; 반재구; 박승환; 김의중
Original assignee: 주식회사 제노포커스
Priority date: 2009-02-24
Filing date: 2009-02-24
Publication date: 2012-03-19
Also published as: WO2010098561A3; WO2010098561A2; KR20100096569A

Abstract

본 발명은 고당전이 활성의 신규한 베타-갈락토시다제 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 베타-갈락토시다제 II, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 상기 유전자 또는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 베타갈락토시다제의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 유전자를 이용하여 베타-갈락토시다제 중 당 전이 활성이 우수한 베타-갈락토시다제 II를 생산함으로써, 갈락토올리고당의 효율적인 대량 생산에 유용하다.

베타-갈락토시다제, 갈락토올리고당, 바실러스 서큘란스

Description

고당전이 활성의 신규한 베타-갈락토시다제 및 그 용도{Novel Beta-galactosidase Having High-transglycosylation Activity and Use thereof}

본 발명은 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans) 유래 베타갈락토시다제 II, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 상기 유전자 또는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제 II의 제조방법 및 상기 베타-갈락토시다제 II를 이용한 갈락토올리고당의 제조방법에 관한 것이다.

베타-갈락토시다제(β-galactosidase)는 유당과 같은 베타-D-갈락토피라노사이드(β-D-galactopyranoside)에서 비환원 말단 베타-D-갈락토스(β-D-galactose)를 가수분해하거나, 갈락토스(Galactose)의 전이반응을 촉매한다. 일반적으로 이 효소는 가수분해 활성과 당 전이 활성의 두 가지 특성을 가지고 있는데, 모두 산업적으로 응용성이 있다. 가수분해 활성은 우유와 유제품의 유당을 가수분해하여 유당 불내증을 막아주며 감미도를 높여 주고, 당 전이 활성은 인간의 장내 유용미생 물인 유산균의 성장을 증진시키는 갈락토올리고당(Galactooligosaccharide)의 제조에 이용된다.

베타-갈락토시다제는 여러 종류의 미생물, 식물, 그리고 동물에서 발견되나, 현재 산업적으로 이용되는 대다수의 베타-갈락토시다제는 미생물에서 분리된 것이다. 당 전이 반응의 특이성이 다른 베타-갈락토시다제가 바실러스 속(Bacillus sp), 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp), 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp) 등에서 분리되었으며, 그 외의 고온성 미생물에서 분리된 내열성 효소에 관한 연구도 다양하게 진행되었다.

현재 전세계적으로 갈락토올리고당 생산에 사용되는 베타-갈락토시다제는 바실러스 또는 아스퍼질러스 유래의 것이 대다수이며, 특히 바실러스 유래, 구체적으로, 바실러스 서큘란스 유래의 베타-갈락토시다제는 50~60℃의 활성온도와 높은 당 전이 활성 때문에 상업적으로 가장 많이 사용되는 것 중의 하나이며, 특히, 바실러스 서큘란스 ATCC 31382 유래의 베타-갈락토시다제는 BIOLACTA(Daiwa Kasei사)라는 제품명으로 판매되고 있다. 상기 효소는 적절한 배양배지에 바실러스 서큘란스를 배양시킨 후, 세포파쇄 또는 배양배지로부터 회수하는 방법으로 생산된다고 알려져 있다.

또한, 바실러스 서큘란스 ATCC 31382 유래의 베타-갈락토시다제의 특성은 여러 문헌에 보고되어 있다. 상기 미생물에는 3개의 구조적 아형(Isoform)의 베타-갈락토시다제가 존재한다고 보고 하였으며, 단백질 크기에 따라 212 kDa의 베타-갈락토시다제 I, 145 kDa의 베타-갈락토시다제 II, 그리고 86 kDa의 베타-갈락토시다제 III로 명명된다. 상기 3가지 아형 중에서 베타-갈락토시다제 II가 당 전이 활성이 가장 우수한 것으로 판명되고 있다(Amedeo V., et al., Biochim Biophys Acta., 10;1380(2):223-31., 1998). 또한, 상기 3가지 아형 중 베타-갈락토시다제 III의 유전자 염기 서열은 밝혀졌다(Ito Y., et al., Biosci Biotechnol Biochem., 61(8):1270-6., 1997)으나, 베타-갈락토시다제 I과 II의 유전자의 염기 서열은 아직까지 보고된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 락토스로부터 갈락토올리고당 생산능이 우수한 베타-갈락토시다제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 바실러스 서큘란스 ATCC 31382에서 당 전이 활성이 매우 뛰어난 베타-갈락토시다제 II의 유전자 염기 서열을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 베타-갈락토시다제 II, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제 II의 제조방법 및 갈락토올리고당의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 베타-갈락토시다제 II 및 이를 코딩하는 유전자 또는 그 단편을 제공한다.

본 발명은 상기 베타-갈락토시다제 II를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 삽입된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 베타-갈락토시다제 II를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-갈락토시다제 II를 회수하는 단계를 포함하는 베타갈락토시다제의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 베타-갈락토시다제 II를 락토스 함유 기질과 반응시켜 갈락토올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 갈락토올리고당을 회수하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 바실러스 서큘란스 유래 베타-갈락토시다제 II 및 이를 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명에 따르면, 상기 유전자를 이용하여 베타-갈락토시다제 중 당 전이 활성이 우수한 베타-갈락토시다제 II를 생산함으로써, 갈락토올리고당의 효율적인 대량 생산에 이용가능하다.

본 발명은, 일 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 베타-갈락토시다제 II 및 이를 코딩하는 유전자, 바람직하게는, 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans) 유래의 베타-갈락토시다제 II 및 이를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

바실러스 서큘란스 (구체적으로, 바실러스 서큘란스 ATCC 31382)에는 3개의 구조적 아형(Isoform), 베타-갈락토시다제 I, 베타-갈락토시다제 II, 베타-갈락토시다제 III가 존재하는 것으로 보고되어 있고, 이들 아형 중 베타-갈락토시다제 II가 당 전이 활성이 가장 우수한 것으로 알려져있다.

본 발명에서는, 상기 바실러스 서큘란스(ATCC 31382)로부터 베타-갈락토시다제 II로 추측되는 단백질의 전기 영동 밴드를 얻어, ESI (electrospray ionization) 분석으로부터 아미노산 서열을 수득하고, 상기 아미노산 서열을 이용하여 디제너레이트(degenerate) 프라이머를 제작한 다음, 상기 프라이머를 이용하여 PCR 함으로써 유전자 단편을 얻는다. 이렇게 얻어진 유전자 단편의 염기서열을 유전자 은행 (GenBank)에 등록된 베타-갈락토시다제의 염기서열과 비교함으로써 기존에 알려진 베타-갈락토시다제와 상이한 유전자를 선별하고, 인버스(inverse) PCR법을 이용해 상기 베타-갈락토시다제 II 단편으로부터 전체 염기서열을 얻음으로써, 본 발명에 따른 베타-갈락토시다제 II를 코딩하는 유전자를 획득한다.

구체적으로, 본 발명에 따른 베타 갈락토시다제 II 유전자의 아미노산 서열이 기존에 보고된 것과 다른 신규한 아미노산 서열임을 확인하기 위해, 본 발명에서 분리된 베타-갈락토시다제II 유전자와 다른 종의 베타-갈락토시다제 유전자와의 아미노산 서열 상동성(homology) 비교분석을 BLASTN 프로그램을 이용하여 수행한 결과, 상기의 베타-갈락토시다제라고 유추되는 첫 번째 ORF의 아미노산 서열을 비교한 결과, 100여개의 상동성을 가지는 서열이 검색되었다. 그 중 상동성이 가장 높은 것은 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)와 47%, 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii)와 47%, 스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor)와 46% 정도였으며, 기존에 보고된 베타-갈락토시다제와의 상동성이 47%를 나타내는 것으로 보아, 본 발명에 따른 바실러스 서큘란스 ATCC 31382의 베타-갈락토시다제 II 유전자는 기존에 보고된 베타-갈락토시다제 유전자와 아주 상이한 아미노산 서열을 가지는 신규한 서열임을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명에 따른 베타-갈락토시다제 II는, 서열번호 1의 아미노산 서 열과 이를 코딩하는 유전자인 서열번호 2의 염기서열을 가질 수 있는 것 뿐만 아니라, 상기 살펴본 바와 같이, 다른 미생물 유래의 베타-갈락토시다제와 상동성이 낮은 신규한 서열로써, 이들 서열 중 어느 하나의 아미노산 또는 염기 서열이 치환, 결실, 삽입 및 부가되어 돌연변이가 일어남으로써, 상기 본 발명에 따른 아미노산 서열 또는 염기서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열 또는 염기서열 또한 본 발명에 포함될 수 있다.

상기 "서열 동일성"이란, 2개의 폴리뉴클레오티드간 잔기의 서열 유사성을 말한다. 상기 "서열 동일성"은 비교대상의 염기서열의 영역에 걸쳐, 최적한 상태로 얼라인먼트된 2개의 염기서열을 비교함으로써 결정될 수 있다. 여기에서, 비교대상의 폴리뉴클레오티드는, 2개의 서열의 최적한 얼라인먼트를 위한 참고서열 (예컨대 컨센서스 서열 등)과 비교하여, 부가 또는 결실 (예컨대, 갭, 오버행 등)을 갖고 있어도 된다. 서열 동일성의 수치는 양방의 서열에 존재하는 동일한 핵산염기를 결정하여, 적합부위의 수를 결정하고, 이어서, 비교대상의 서열영역 내의 염기의 총수로, 상기 적합부위의 수를 나누어, 얻어진 수치에 100을 곱함으로써, 산출될 수 있다. 핵산 사이의 서열 동일성은, 예컨대, 서열 해석 소프트, 구체적으로는 BLASTN, FASTA 등을 사용하여 측정된다. 상기 BLASTN은,http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/에서 일반적으로 이용할 수 있다.

본 발명은, 다른 관점에서, 상기 베타갈락토시다제 II를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서, "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현 시킬 수 있 는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물 일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백개의 플라스미드벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있도록 하는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation) 할 수 있다.

아울러, 상기 유전자는 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)" 된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들) 일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인 핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션 (연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본 발명은, 다른 관점에서, 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 삽입된, 다시말해, 상기 베타-갈락토시다제 II를 코딩하는 유전자가 염색체 상에 삽입되거나, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다.

상기 형질전환된 재조합 미생물은, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 통상 사용되며, 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 모든 미생물로서, 박테리아, 효모, 곰팡이 등이 이용가능하고, 본 발명의 실시예에서는 E. coli를 사용하였으나, 이에 한정되지 않고, 상기 베타-갈락토시다제 II가 충분히 발현될 수 있는 것이라면 어떠한 종류의 미생물이라도 무방하다.

상기 형질전환된 재조합 미생물은 임의의 형질전환 방법에 따라 제조할 수 있다. 본 발명의 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 일반적으로 형질전환방법에는 전기천공법(electroporaton), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂)침전, 미세주입법(microinjection), 초산 리튬-DMSO법 등이 있다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않고, 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 상태에서, 다른 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택하여 적용할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이고, 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

또한, 본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.

본 발명은, 또 다른 관점에서, 상기 형질전환된 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제 II의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로, 상기 재조합 미생물을 배양하여 베타-갈락토시다제 II를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-갈락토시다 제 II를 회수하는 단계를 포함하는 베타-갈락토시다제 II의 제조방법에 관한 것이다.

상기 형질전환된 재조합 미생물의 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행되고, 배양 온도 및 시간, 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다.

상기 배양된 재조합 미생물로부터의 베타-갈락토시다제 II의 회수는 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.

본 발명은, 또 다른 관점에서, 상기 제조된 베타-갈락토시다제 II를 락토스 함유 기질과 반응시켜 갈락토올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 갈락토올리고당을 회수하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법에 관한 것이다.

베타-갈락토시다제는 이에 제한되는 것은 아니나, 바실러스(Bacillus)속, 비피도박테리움(Bifidobacterium)속, 스트렙토코커스(Streptococus)속, 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 페니실리움(Penicillium)속, 싸카로마이세스(Saccharomyces)속, 크립토코커스(Cryptococus)속, 클로이베로마이세스(kluyveromyces)속 등의 미생물을 락토스를 탄소원으로하여 배양할 경우 생성, 분비되는 세포내 또는 세포의 효소로서, 통상 락토스에 작용하여 갈락토스를 1-3개 결합시켜 갈락토올리고당을 생성하고, 부수적을 포도당과 소량의 갈락토스를 생성한다.

본 발명의 일 실시예에서 갈락토올리고당은 락토스 기질로부터의 생성물에서 단당인 글루코스, 갈락토스와 이당류의 락토스를 제외한 이당류 이상의 당류를 갈락토올리고당으로 정의한다.

베타-갈락토시다제의 활성 결정하는 일 예로, 다양한 완충액 중에 4-니트로페닐-베타-D-갈락토피라노사이드(4-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside)를 용해시켜 기질로 사용할 수 있고, 기질로써 이것 이외에도, 락토스, 셀로비오스(cellobiose) 등을 기질로 사용할 수 있으나, 상기 4-니트로페닐-베타-D-갈락토피라노사이드의 경우, 대부분의 베타 갈락토시다제가 기질 특이성을 나타내고 있어 쉽고 빠르게 결정할 수 있는 장점이 있다. 또한, 효소의 활성은 420 nm에서의 흡광도에서 유리된 O-니트로페놀의 농도를 확인할 수 있으며, 베타-갈락토시다제 1 unit는 상기 조건에서 1분당 1 μmol의 O-니트로페놀을 유리시키는 효소의 양으로 결정한다. 본 발명에서 갈락토올리고당 합성을 위한 베타-갈락토시다제 II의 투여량은 락토스 기질 대비 O-니트로페놀(O-nitrophenol)을 이용한 활성으로, 베타-갈락토시다제 II가 기질과 혼합시 최종 농도 1~3U/ml이 되도록한다.

상기 락토스 함유 기질은 30~60%(w/v), 바람직하게는 45~55%, 가장 바람직하게는 50%농도의 락토스 용액을 의미한다. 락토스는 함량이 높아질수록 용해도가 떨어지므로, 50% 락토스 용액의 제조는 고온하에 이루어지며, 갈락토올리고당 합성 온도 또한 고농도 락토스 용액 이용시에 50℃ 이상, 바람직하게는 60 내지 70℃가 바람직하다.

또한, 상기 갈락토올리고당은 액상유, 건조분말우유, 유아 우유, 유아 조제 식 (baby formula), 아이스크림, 요거트, 치즈, 유제품, 음료, 유아 식품, 시리얼, 빵, 비스켓, 제과류, 케이크, 식품보조제, 식이보충제, 프로바이오틱 식료품, 프리바이오틱 식료품, 동물 사료, 가축 사료 및 약제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 구성성분일 수 있다.

여기서, 프로바이오틱(probiotic)이란 대부분 가장 흔한 병원균이 사용하는 젖산균을 가지고 있으며 잠재적으로 이익이 있는 박테리아 또는 효모를 포함한 식이 보충제를 의미한다. 프로바이오틱스는 젖산으로 다른 탄수화물과 설탕으로 전환할 수 있기 때문에 오랫동안 식품산업에서 사용되어져 왔다. 프로바이오틱스는 요구르트와 같은 발효 유제품의 신맛을 제공할 뿐만 아니라, 성장을 위해 손상된 조직을 재건하기도 하며 pH를 낮추어 부식방지제로서 작용한다. 프로바이오틱스의 가장 흔한 형태는 발효된 유제품과 프로바이오틱스가 강화된 식품이며, Kefir (우유 발효 음료), 요구르트, Sauerkraut (발효된 독일식 김치), 한국김치 등의 젖산균도 프로바이오틱스의 건강효과와 유사한 것으로 나타났다.

또한, 프리바이오틱스(prebiotics)란 결장에 있는 박테리아의 수를 한정하며 선택적으로 박테리아의 성장을 자극하여 인체에 유리한 영향을 주는 물질로 인체 내에서 소화되지 않는 소당류로 구성되어 있다. 프리바이오틱스는 항암작용, 항균작용, Hypolipidemic 및 포도당 변조를 일으키는 활동을 한다. 프리바이오틱스는 결장에 있는 박테리아의 수를 한정하며 선택적으로 박테리아의 성장을 자극하여 인체에 유리한 영향을 주는 물질이며 인체 내에서 소화되지 않는 식품 구성요소로서 정의할 수 있다. 주로 소당류(oligosaccharides)이며, 프락토 올리고당(Fructo- oligosaccharides), 이눌린, Isomalto-oligosaccharides, Lactilol, 유과올리고당(Lactosucrose), 락툴로스(Lactulose), Pyrodextrins, Soy oligosaccharides, Xylo-oligosaccharides을 포함하고 있다. 이들은 주로 bifidogenic 요인으로서 불리워지며, bifidobacteria의 성장을 자극한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예에는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 본 발명에 따른 베타- 갈락토시다제 II 유전자 염기서열의 확보

단백질 전기영동 단편으로부터 아미노산 서열의 일부를 획득하기 위하여, 상업적으로 판매되는 바실러스 서큘란스 ATCC 31382 유래의 베타-갈락토시다제인 BIOLACTA FN5(Daiwa Kasei사)를 적정량 0.01g/ml로 희석하여 단백질 전기영동의 시료로 사용하였다.

SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)는 세퍼레이팅 젤이 아크릴아미드 (acrylamide)의 농도가 10%가 되도록 만들었고, 스태킹 젤은 아크릴아미드의 농도가 8%가 되도록 만들었다. SDS-PAGE 완충액은 25 mM Tris-base, 192 mM 글리신, 0.1% SDS, pH 8.3을 사용하였다. 희석 시료는 5×샘플 버퍼 (60mM Tris-HCl pH 6.8, 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4mM 2-머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)와 혼합하여 100℃, 5분간 열처리하여 사용하였다. 전기영동장치는 Bio-Rad, Mini-ProteanⅡ apparatus를 이용하였다. 아크릴아미드 겔에서 전개된 시료는 CBB(Coomassie Brilliant Blue) 염색 수행 후, 탈색하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 아메데오(Amedeo V., et al., Biochim Biophys Acta., 10;1380(2):223-31., 1998) 등의 보고에서 제시한 145 kDa 부근에 위치한 단백질 밴드를 베타-갈락토시다제 II라고 예상하고, ESI(Electrospray ionization) 분석을 위해 이 단편을 오려내어 한국기초과학지원연구소에 분석 의뢰하였다. 분석 결과로, 하기와 같은 서열번호 3과 서열번호 4의 일부 아미노산 서열을 획득하였다.

서열번호 4: YSDESAAAK

서열번호 5: FGAVDTAG

상기의 아미노산 서열들을 NCBI의 블라스트 프로그램(NCBI Blast search) 검색을 통하여 유전자은행(GenBank)에 저장된 다양한 베타-갈락토시다제와 일부 유사함을 확인하였고, 상기에 획득한 2개의 일부 아미노산 서열을 토대로 디제너레이트(degenerate) PCR 프라이머를 제작하였다.

디제너레이트 PCR 프라이머
명칭	서열
전방향프라이머(서열번호 6)	TAYWSIGAYGARWSIGC
역방향프라이머(서열번호 7)	CCNGCNGTRTCNACIGCICCRAA
주) Mixed base code : N(A, C, G, T); R(A, G); S(G, C); Y(C, T); W(A, T); I(Inosine)

바실러스 서큘란스 ATCC 31382는 기본 배지인 LB(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% NaCl)배지에서 배양하였으며, 배양된 세포로부터 게놈 DNA 500㎍을 분리(Genomic DNA extraction kit; RBC사)하였다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 6과 서열번호 7의 디제너레이트 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 대략 1600 bp와 300 bp의 PCR 산물이 확인되었다.이 PCR 산물들을 TOPcloner TA (Enzynomics사) 벡터에 라이게이션(Ligation)한 후, 42℃에서 열충격(Heat shock) 방법으로 E. coli JM109 균주에 형질전환하였다. 1600 bp와 300 bp의 유전자 단편의 염기서열을 결정하고, 이 염기서열을 유전자 은행의 것들과 NCBI의 블라스트 프로그램(NCBI Blast search)을 통해 비교하여 기존에 알려진 베타-갈락토시다제 유전자와 비교하여 1600 bp 유전자 단편이 베타-갈락토시다제의 일부인 것을 확인하였다.

인버스(inverse) PCR은 유전자 단편의 염기서열을 기반으로 간단한 과정과 빠른 시간 내에 목적 유전자의 전체 염기서열을 결정할 수 있는 PCR 기법으로, 바실러스 서큘란스 ATCC 31382의 게놈 DNA를 MluI, NotI, SacI, XmaI, XhoI, SpeI, AflII, AgeI, ApaI, ApaLI, AscI, BamHI, BclI, MfeI, PvuI, SphI의 제한효소(Restriction enzyme; New England Biolab사)로 각각 자르고, 정제한 후(Gel/PCR DNA Extraction Kit; RBC사) 라이게이션(Self ligation)함으로써, 상기 DNA 단편들은 선형 DNA에서 원형 DNA로 변화된다. 라이게이션 혼합물은 정제한 후(Gel/PCR DNA Extraction Kit; RBC사) 인버스 PCR의 주형(Template)으로 사용되었다.

상기에서 확보된 바실러스 서큘란스 ATCC 31382 유래의 베타-갈락토시다제 II의 1600 bp 유전자 염기서열을 기준으로 하기와 같은 서열번호 8과 서열번호 9의 인버스 PCR 프라이머를 제작하였고, 상기 인버스 PCR 주형을 이용하여 PCR을 수행하였다.

서열번호 8: GGCAGCTGCAAATCATGAAA

서열번호 9: TTTCCACAGCCCGTGCATTA

상기 PCR 과정을 통해 얻은 산물은 아가로스 전기영동을 통해 확인하였다. 총 16종의 제한 효소 처리군 중에서 SpeI과 ApaLI의 제한효소 처리군에서만 대략 6000 bp와 2000 bp의 인버스 PCR 산물이 나타났다 (도 3). 바실러스 서큘란스 ATCC 31382 유래의 베타-갈락토시다제 II의 145 kDa의 단백질 크기로 유추해 보았을 때 DNA 크기는 4000 bp 이상으로 생각할 수 있다. 따라서, SpeI 제한효소 처리로부터 생성된 6000 bp의 인버스 PCR 산물을 TOPcloner TA (Enzynomics사) 벡터에 클로닝하여 염기서열을 결정하였다. 그 결과로, 바실러스 서큘란스 ATCC 31382 유래의 베타-갈락토시다제 II의 전체 염기서열을 결정하였고, 서열번호 2에 제시한 바와 같이, 베타-갈락토시다제 II 유전자로 추정되는 DNA의 전체크기는 5,897 bp이고, 도 4의 모식도에 나타난 바와 같이, 2개의 ORFs(Open Reading Frames)가 발견되었다. 그 중 첫번째 ORF가 4189 bp의 DNA 크기(서열번호 3)와 1396개의 아미노산(서열번호 1)으로 이루어진 것으로 확인되어, 목적한 145 kDa 정도의 단백질 크기와 일치하는 것으로 판명하였다. 따라서, 이것을 바실러스 서큘란스 ATCC 31382 유래의 베타-갈락토시다제 II라고 판명하였다.

실시예 2: 베타- 갈락토시다제 II 유전자를 함유한 재조합 벡터 및 재조합 미생물의 제조

상기 실시예 1에서 확보된 바실러스 서큘란스 ATCC 31382의 베타-갈락토시다제 II 유전자 염기서열을 이용하여 재조합 벡터 및 재조합 미생물을 제조하였다. 상기 베타-갈락토시다제 II 유전자의 염기서열을 토대로 하기와 같은 서열번호 10와 서열번호 11의 프라미어를 제작하였다.

서열번호 10: AACCCGGGATGAGACGAATTAATTTTAA

서열번호 11: AAGGTACCTCATTCTGTAAAACGAATGT

바실러스 서큘란스 ATCC 31382의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 10와 서열번호 11의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 정제 후, 각각의 프라이머에 삽입한 제한효소 서열 XmaI과 KpnI을 이용하여, pACE(GenoFocus사) 벡터에 동일 제한효소 부위에 삽입하여 pACE-BgaII로 명명한 벡터를 제조하였고, 상기 제조된 벡터를 E. coli JM109 균주에 형질전환시켰다.

실시예 3: 재조합 미생물을 이용한 베타- 갈락토시다제 II 제조

실시예 2에서 형질전환된 재조합 균주(E. coli JM109/pACE-BgaII)를 이용하여 재조합 베타-갈락토사다제 II를 제조하였다. pACE(GenoFocus사) 벡터는 단백질 발현을 위해 별도의 유도제(Inducer) 첨가가 필요 없이 미생물 배양만으로 세포성장과 단백질 발현이 분리된 상태로 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 따라서, 멸균된 100 ml LB(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% NaCl)배지가 들어있는 1 L의 삼각플라스크에 전날 충분히 종 배양한 상기 형질전환된 재조합 균주 배양물 5 ml을 접종하였고, 30℃에서 교반속도 200 rpm으로 24시간 배양하였다. 배양이 완료된 상기 형질전환된 재조합 균주는 원심분리에 의해 배양액과 분리되었으며, 멸균 증류수에 적정 농도로 다시 희석하였다. 초음파분쇄기(VibraCell사)로 형질전환된 재조합 균주를 파쇄하고 원심분리로 세포 찌꺼기와 베타-갈락토시다제 II를 최종적으로 분리하였다. 이를 실시예 1에서 기술한 방법으로 단백질 전기영동을 실시한 결과, 도 5에서 표시된 화살표가 가리키는 바와 같이, 약 145kDa 정도의 베타-갈락토시다제 II의 밴드를 확인하였다. 3번 레인에 biolacate fn5를 걸어준 것은 대조군(1번레인)에서 보이지 않았던 145kDa 위치의 밴드가 베타-갈락토시다제 II의 밴드임을 입증하기 위해 함께 걸어준 것이다.

실시예 4: 재조합 베타- 갈락토시다제 II 의 특성 확인

상기 실시예 3에서 얻어진 베타-갈락토시다제 II를 이용해 최적 온도와 pH를 확인하였다. 베타-갈락토시다제의 활성 결정은 다양한 완충액 중에 4-니트로페닐-베타-D-갈락토피라노사이드(4-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside)를 용해시켜 기질로 사용하였으며, 30~80℃에서 반응후 10% (w/v) 소디움 카보네이트(Na₂CO₃)를 이용하여 효소 반응을 중지시키고 발색시켰다.

상기 효소의 활성은 420 nm에서의 흡광도에서 유리된 O-니트로페놀의 농도를 확인하였다. 베타-갈락토시다제 1 unit는 상기 조건에서 1분당 1 μmol의 O-니트로페놀을 유리시키는 효소의 양으로 결정하였다. 최적 pH 확인을 위해 각각의 기질과 시료는 pH 3, 4, 5의 조건은 0.1 M 시트르산 완충액으로 제조하였고, pH 6, 7, 8의 조건은 0.1 M 인산 완충액으로 제조하였으며, pH 9, 10의 조건은 트리스(Tris) 완충액으로 제조하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 실시예 3에서 제조된 베타-갈락토시다제 II의 최적온도는 30~80℃ 중 최적 활성 온도는 50℃에서 나타났고, 도 7에 나타난 바와 같이, pH는 6.0으로 나타났다 (도 6 및 도 7).

실시예 5: 베타- 갈락토시다제 II 를 이용한 올리고당의 합성

상기 실시예 3에서 얻어진 베타-갈락토시다제 II를 이용해 갈락토올리고당을 합성하였다. 갈락토올리고당의 기질로서 락토스는 500 g/L의 농도로 50 mM 인산 완충액(pH 6.0)에 고온을 가해 용해시켰다. 1 L 용량의 반응기에 500 g/L 농도의 락토스 용액 500 ml을 첨가하였으며, 반응온도는 60℃로 고정하고, 교반속도는 100 rpm을 유지하였다. 베타-갈락토시다제 II의 투입양은 최종 농도가 2 units(U/락토스 g)가 되도록 투여하였다. 합성시간은 24시간을 수행하였다.

갈락토올리고당의 분석은 폴리아민 II(Polyamine II; YMC사) 컬럼을 사용하여 RI 검출기가 부착된 HPLC(Agilent사)로 측정하였다. 이때 이동상은 아세토니트릴(Acetonitrile)과 정제수의 비율이 65%/35%(v/v)가 되도록 사용하였다. 이때 이동상의 흐름속도는 1.0 ml/min이었다. 상기 반응 완료 후의 갈락토올리고당의 분석결과는 표 1에 나타내었으며, HPLC 크로마토그램은 도 8에 나타난 바와 같았다.

갈락토올리고당의 전환율은 다음과 같이 계산하였다. 이하에 표현하는 양은 HPLC에 측정된 피크(peak) 면적을 나타내며, 락토스 기질로부터의 생성물에서 단당류인 글루코스, 갈락토스와 이당류의 락토스를 제외한 이당류 이상의 당류를 갈락토올리고당으로 정의한다.

갈락토올리고당 전환율(%)

=[전체 당의 양]-[글루코스 양]-[갈락토스 양]-[락토스 양]

당 조성	GOS 4 및 GOS 5	GOS 2	GOS 2	락토스	글루코스+갈락토스	총 GOS
함량(%)	8.4	22.1	32.9	7.6	29	63.4

총 GOS: 전체 갈락토올리고당

GOS5: 5 당류 갈락토올리고당

GOS4: 4 당류 갈락토올리고당

GOS3: 3 당류 갈락토올리고당

GOS2: 2 당류 갈락토올리고당

전환율이란, 투입된 락토스 농도에 대한 생성된 올리고당 농도의 비율을 말하는 것이다. 상기 함량(%)은 전체 당 (글루코스, 갈락토스, 락토스 및 올리고당)의 합에서 각각의 당에 대한 비율이다. 따라서, 본 발명에 따른 베타-갈락토시다제 II에 의한 갈락토올리고당 전환율은 63.4%으로 우수한 것으로 나타났다.

바실러스 서큘란스 (ATCC 31382)으로부터의 3개의 베타 갈락토시다제 중, I과 III의 경우는 전환율이 아주 약하므로, 이에 비해 우수한 전환율을 나타내고 있는 것이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따 정의된다고 할 것이다.

도 1은 베타-갈락토시다제 II 단백질 단편을 확인하기 위하여, BIOLACTA FN5(Daiwa Kasei사)의 SDS-PAGE 수행 결과이다 (B: BIOLACTA FN5(Daiwa Kasei사), M: 단백질 사이즈 마커, 화살표: 추정상의 145kDa 위치).

도 2는 디제너레이트 프라이머로 PCR을 수행한 전기영동 사진이다 (M: DNA 1kb 플러스 래더, 1: 디제너레이트된 PCR 산물).

도 3은 베타-갈락토시다제 II 유전자 확보를 위한 인버스 PCR 후 전기영동 사진이다. (M: DNA 1kb 플러스 래더(ladder), 1: MluI, 2: NotI, 3: SacI, 4: XmaI, 5: XhoI, 6: SpeI, 7: AflII, 8: AgeI, 9: ApaI, 10: ApaLI, 11: AscI, 12: BamHI, 13: BclI, 14: MfeI, 15: PvuI, 16: SphI, 화살표: 인버스 PCR 산물).

도 4는 인버스 PCR로 확인된 본 발명에 따른 베타-갈락토시다제 II 유전자 염기서열 내 ORF의 크기 및 위치를 나타낸 모식도이다.

도 5는 형질전환된 재조합 균주 E. coli JM109/pACE-BgaII에서 생산된 재조합 베타-갈락토시다제 II의 단백질 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다 (M: 단백질 사이즈 마커, 1: E. coli JM109/None 2: E. coli JM109/pACE-BgaII, 3: BIOLACTA FN5(Daiwa Kasei사), 화살표: 베타-갈락토시다제 II).

도 6은 형질전환된 재조합 균주 E. coli JM109/pACE-BgaII에서 생산된 재조합 베타-갈락토시다제 II의 최적 온도를 나타낸 것이다.

도 7은 형질전환된 재조합 균주 E. coli JM109/pACE-BgaII에서 생산된 재조합 베타-갈락토시다제 II의 최적 pH를 나타낸 것이다.

도 8은 형질전환된 재조합 균주 E. coli JM109/pACE-BgaII에서 생산된 재조합 베타-갈락토시다제 II를 이용하여 갈락토올리고당의 합성후, HPLC로 분석한 크로마토그램이다.

<110> GenoFocus <120> Beta-galactosidase II derived from Bacillus circulans and Use thereof <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1396 <212> PRT <213> amino acid sequence of beta-galactosidase II <400> 1 Met Arg Arg Ile Asn Phe Asn Asp Asn Trp Arg Phe Gln Arg Glu Ile 1 5 10 15 Ser Thr Ser Leu Arg Glu Ala Gln Lys Pro Ser Phe Asn Asp His Ser 20 25 30 Trp Arg Gln Leu Ser Leu Pro His Asp Trp Ser Ile Glu Leu Asp Phe 35 40 45 Asn Lys Asp Ser Leu Ala Thr His Glu Gly Gly Tyr Leu Asp Gly Gly 50 55 60 Val Gly Trp Tyr Arg Lys Thr Phe Thr Val Pro Ser Ala Met Glu Gly 65 70 75 80 Lys Arg Ile Ser Leu Asp Phe Asp Gly Val Tyr Met Asn Ser Thr Thr 85 90 95 Tyr Leu Asn Gly Glu Glu Leu Gly Thr Tyr Pro Phe Gly Tyr Asn Ala 100 105 110 Phe Ser Tyr Asp Ile Thr Asp Lys Leu Phe Met Asp Gly Arg Glu Asn 115 120 125 Val Leu Ala Val Lys Val Asp Asn Thr Gln Pro Ser Ser Arg Trp Tyr 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Ile Tyr Arg Asn Val Tyr Leu Thr Val Thr Asn Pro 145 150 155 160 Val His Val Ala Arg Tyr Gly Thr Phe Val Thr Thr Pro Asp Leu Glu 165 170 175 Ser Ala Tyr Ala Ala Arg Lys Ala Glu Val Asn Ile Lys Thr Lys Ile 180 185 190 Asn Asn Asp Ser Asp Ala Ala Val Gln Val Lys Val Lys Ser Thr Ile 195 200 205 Tyr Asp Thr Asp Gly Lys Glu Val Ala Ser Val Val Ser Gln Glu Lys 210 215 220 Thr Ala Ala Ala Gly Thr Thr Ala His Phe Glu Asp Asn Thr Val Ile 225 230 235 240 Glu Asn Pro Glu Leu Trp Ser Leu Asp Asn Pro Tyr Arg Tyr Lys Leu 245 250 255 Val Thr Asp Val Leu Ile Gly Gly Glu Thr Val Asp Thr Tyr Glu Thr 260 265 270 Arg Phe Gly Ala Arg Phe Phe Lys Phe Asp Ala Asn Glu Gly Phe Ser 275 280 285 Leu Asn Gly Lys Pro Met Lys Leu Tyr Gly Val Ser Met His His Asp 290 295 300 Leu Gly Ala Leu Gly Ala Ala Thr Asn Ala Arg Ala Val Glu Arg Gln 305 310 315 320 Leu Gln Ile Met Lys Asp Met Gly Val Asn Ala Ile Arg Gly Thr His 325 330 335 Asn Pro Val Ser Pro Glu Phe Leu Glu Ala Val Asn Asn Leu Gly Leu 340 345 350 Leu Leu Ile Glu Glu Ala Phe Asp Cys Trp Ser Gln Ser Lys Lys Thr 355 360 365 Tyr Asp Tyr Gly Arg Phe Phe Thr Arg Trp Ala Glu His Asp Val Lys 370 375 380 Glu Met Val Asp Arg Gly Lys Asn Glu Pro Ser Ile Ile Met Trp Ser 385 390 395 400 Ile Gly Asn Glu Ile Tyr Asp Thr Thr Ser Pro Ser Gly Val Glu Thr 405 410 415 Ala Arg Asn Leu Val Arg Trp Ile Lys Glu Ile Asp Thr Thr Arg Pro 420 425 430 Thr Thr Ile Gly Glu Asp Lys Thr Arg Gly Asp Lys Val Asn Val Thr 435 440 445 Pro Ile Asp Pro Asn Ile Leu Glu Ile Phe His Thr Val Asp Val Val 450 455 460 Gly Leu Asn Tyr Ser Glu Asn Asn Tyr Val Gly Tyr His Glu Gln His 465 470 475 480 Pro Asn Trp Lys Leu Tyr Gly Ser Glu Thr Ser Ser Ala Thr Arg Ser 485 490 495 Arg Gly Val Tyr Thr His Pro Tyr Glu Tyr Asn Leu Gly Thr Lys Tyr 500 505 510 Asp Asp Leu Gln Gln Ser Ser Tyr Asp Asn Asp Tyr Val Pro Trp Gly 515 520 525 Arg Thr Ala Glu Asp Ala Trp Lys Ser Asp Arg Asp Leu Lys His Phe 530 535 540 Ala Gly Gln Phe Ile Trp Thr Gly Phe Asp Tyr Ile Gly Glu Pro Thr 545 550 555 560 Pro Tyr Tyr Asp Ser Tyr Pro Ala Lys Ser Ser Tyr Phe Gly Ala Val 565 570 575 Asp Thr Ala Gly Phe Pro Lys Asp Ile Phe Tyr Tyr Tyr Gln Ser Gln 580 585 590 Trp Lys Lys Glu Pro Met Val His Leu Leu Pro His Trp Asn Trp Thr 595 600 605 Glu Gly Glu Pro Val Arg Val Leu Ala Tyr Thr Asn Ala His Gln Val 610 615 620 Glu Leu Phe Leu Asn Gly Lys Ser Leu Gly Val Arg Gly Tyr Glu Asn 625 630 635 640 Lys Lys Thr Ser Trp Gly Ala Pro Tyr Lys Glu Thr Lys Asp Gly Lys 645 650 655 Thr Tyr Leu Glu Trp Ala Val Pro Phe Lys Ala Gly Thr Leu Glu Ala 660 665 670 Val Ala Met Asp Glu Asn Gly Lys Glu Ile Ala Arg Asp Gln Val Thr 675 680 685 Thr Ala Gly Ala Pro Ala Ala Val Lys Leu Thr Ala Asp Arg Lys Val 690 695 700 Ile Lys Ala Asp Gly Thr Asp Leu Ser Phe Ile Thr Ala Glu Ile Val 705 710 715 720 Asp Ser Lys Gly Asn Val Val Pro Asn Ala Asp His Leu Ile Gln Phe 725 730 735 His Leu Ser Gly His Gly Glu Leu Ala Gly Val Asp Asn Gly Asp Ala 740 745 750 Ala Ser Val Glu Arg Tyr Lys Asp Asn Lys Arg Lys Ala Phe Ser Gly 755 760 765 Lys Ala Leu Ala Ile Val Gln Ser Asn Lys Leu Asp Gly Asn Ile Thr 770 775 780 Leu His Ala Ser Ala Glu Gly Leu Ser Ser Gly Asn Val Thr Ile Phe 785 790 795 800 Thr Thr Ala Ser Ala Asp Gln Asn Ser Ile Thr Ile Ala Gly Ile Asp 805 810 815 Glu Val Asn Val Leu Val Asp Phe Asn Val Val Pro Glu Leu Pro Ser 820 825 830 Gln Ile Lys Val Tyr Tyr Ser Asp Ser Thr Val Glu Met Lys Pro Val 835 840 845 Thr Trp Asp Ala Val Asp Pro Asn Leu Leu Asn Thr Ala Gly Lys Ile 850 855 860 Ile Val Glu Gly Thr Val Glu Gly Thr Asp Lys Lys Ala Lys Ala Leu 865 870 875 880 Leu Ile Val Lys Gly Asn Gly Gln Glu Asn Ser Glu Tyr Arg Ile Asp 885 890 895 Leu Phe Ser Pro Asp Pro Lys Leu Ile Ser Thr Glu Leu Thr Val Glu 900 905 910 Lys Thr Asn Ile Met Glu Asp Asp Phe Ile Asp Ile Lys Val Ile Gly 915 920 925 Gln Leu Glu Asn Lys Glu Val Val Asp Leu Ser Asn Phe Met Pro Ile 930 935 940 Tyr Glu Phe Asp Cys Asp Ile Ile Lys Ile Glu Gly Asn Lys Leu Tyr 945 950 955 960 Ala Leu Glu Glu Gly Leu Val Lys Val Thr Ala Ala Val Thr Tyr Lys 965 970 975 Gly Arg Thr Val Thr Ser Pro Glu Met Met Leu Lys Ile Thr Lys Asn 980 985 990 Pro Val Pro Lys Thr Ile Thr His Ile Asp Ser Ile Thr Val Val Ala 995 1000 1005 Gly Lys Gly Glu Ala Pro Val Leu Pro Ala Thr Ala Val Ala His Phe 1010 1015 1020 Asp Arg Gly Met Pro Arg Asp Val Lys Val Lys Trp Glu Ile Val Asn 1025 1030 1035 1040 Pro Ala Leu Tyr Gln Asn Leu Gly Glu Phe Thr Val Ser Gly Asp Val 1045 1050 1055 Glu Gly Thr Glu Ile Lys Ala Gln Ala Lys Val Met Val Arg Ser Ala 1060 1065 1070 Leu Ala Ile Glu Thr Ile Ser Met Ala Val Leu Pro Asn Gln Lys Pro 1075 1080 1085 Glu Leu Pro Gln Lys Val Thr Val Tyr Tyr Ser Asp Gly Thr Glu Glu 1090 1095 1100 Gln Ala Asp Val Asp Trp Asp Ala Met Pro Ser Ala Glu Leu Lys Ser 1105 1110 1115 1120 Glu Gly Val Val Lys Val Lys Gly Ser Val Lys Gly Val Asp Leu Lys 1125 1130 1135 Ala Thr Ala Gln Ile Arg Val Thr Ser Glu Val Gly Gly Val Gln Asn 1140 1145 1150 Ile Ser Arg Ala Lys Asn Gly Tyr Glu Tyr Pro Lys Ala Glu Ala Ser 1155 1160 1165 Phe Thr Asn Thr Gly Pro Gly Ser Asn Asp Arg Ile Glu Ala Ile Asn 1170 1175 1180 Asp Asp Val Ile Ser Tyr Asp Ala Glu Pro His Asn Arg Trp Thr Asn 1185 1190 1195 1200 Trp Gln Pro Thr Pro Arg Pro Gly Asp Trp Val Ser Ile Thr Phe Gly 1205 1210 1215 Asp Ser Lys Pro Arg Lys Tyr Asp Ile Asp Ser Met Glu Ile His Trp 1220 1225 1230 Tyr Glu Asp Leu Gly Thr Ser Ser Pro Ala Tyr Phe Arg Ile Gln Tyr 1235 1240 1245 Lys Ser Gly Asp Glu Trp Lys Asp Val Ser Gly Leu Lys Thr Asn Pro 1250 1255 1260 Ser Asn Thr Val Leu Arg Gln Ala Asn Val Tyr Thr Phe Asp Lys Val 1265 1270 1275 1280 Arg Thr Ser Ala Ile Arg Val Asp Met Thr Ala Lys Thr Gly Lys Ser 1285 1290 1295 Leu Ala Ile Thr Glu Ile Lys Val Phe Ser Lys Trp Ala Lys Ala His 1300 1305 1310 Thr His Pro Met Val Thr Asp Ile Lys Leu Gly Asp Leu Ser Ile Leu 1315 1320 1325 Asp Asp Phe Ser Lys Lys Gly Asp Asn Asn Glu Leu Thr Phe Gln Val 1330 1335 1340 Lys Asp Pro Arg Asp Ile Pro Glu Ile Lys Val Lys Ala Glu Asp Asn 1345 1350 1355 1360 Thr Ser Ile Thr Ile Ile Pro Thr Phe Thr Ala Pro Ser Thr Ala Lys 1365 1370 1375 Ile Ile Ala Lys Ser Glu Asp Gly Met Lys Val Glu Ile Tyr Asn Ile 1380 1385 1390 Arg Phe Thr Glu 1395 <210> 2 <211> 5897 <212> DNA <213> putative gene sequence of beta-galactosidase II (ORFI+ORF2) <400> 2 actagttttt ctgtactttc ggacggcgct cttttttcat gtaatgaaac agaagaacgt 60 cccttcatct aacaattgtc atttcatacc ccgctatgtt ttttttgaaa gcctatgaaa 120 ataccaaata ttgtggatat accaagtgag tattttgagt aatcatggta gcatatttac 180 gaggcagtga gtaatataga aaacgaaaat caccacggga aacggagttg ttcaggacag 240 gatgagacga attaatttta atgacaattg gcgctttcaa cgggagataa gcaccagttt 300 aagagaagca cagaaaccta gttttaacga tcattcctgg cggcaattga gtctgccgca 360 tgactggagt attgaattag attttaacaa agattcactt gcaacacatg aaggcggcta 420 tttggacggc ggtgtcggct ggtatcgaaa aacctttacc gtgccatctg cgatggaggg 480 gaagcggatc tcccttgatt ttgatggggt ttatatgaac agcaccacct atttaaatgg 540 cgaagagctg gggacctatc cttttggtta taatgctttt tcctatgata ttacggacaa 600 gctttttatg gacggcagag agaatgttct cgctgtgaaa gtcgataaca cccagccgag 660 cagccgctgg tattcaggaa gcggaatcta cagaaatgtc tatttaaccg tgaccaatcc 720 ggttcatgta gcaagatacg ggacgtttgt cacaacgcct gatttggaaa gcgcttatgc 780 tgcaagaaaa gcggaggtaa acatcaaaac caaaatcaac aatgactcag atgctgcggt 840 acaggtgaag gtgaagtcca cgatctacga tacagacggc aaagaggtgg ctagcgtagt 900 gtcgcaggaa aaaactgctg ctgcgggtac gacagcacat tttgaagaca acacagtgat 960 cgaaaatccg gagctatgga gcttggataa tccttatcga tacaagcttg tcacagatgt 1020 tctaattggc ggcgaaacgg tagatacata tgaaactcgc tttggtgcga ggtttttcaa 1080 atttgatgca aacgaagggt tttcactaaa cggaaagcca atgaagctgt atggtgtttc 1140 catgcaccat gatttaggtg cgttaggagc tgcaactaat gcacgggctg tggaaaggca 1200 gctgcaaatc atgaaagata tgggtgttaa tgccataagg ggcacccaca atcctgtttc 1260 tccagagttt cttgaggccg tcaataacct agggctgctt ttgattgagg aagcctttga 1320 ctgctggagc cagtcaaaga agacctatga ctatgggaga ttcttcacca gatgggcgga 1380 gcatgacgta aaagaaatgg tcgaccgcgg aaagaatgaa ccttcgatta tcatgtggtc 1440 gattggaaat gaaatttatg acacaacaag cccttctgga gtagaaacgg cacgtaattt 1500 agttcgctgg atcaaagaaa tagacacaac aagaccgact acgattggcg aggataaaac 1560 caggggcgat aaggtaaatg tcacaccaat cgaccctaat attctagaaa tattccatac 1620 tgtcgatgtg gtcggattga actacagcga gaacaattat gtaggatatc atgagcagca 1680 tccaaactgg aagctgtatg gctcggaaac atcttccgct acacgttcgc ggggagtcta 1740 cacccaccca tatgaatata atcttggtac aaagtatgat gatctgcagc aatcctccta 1800 tgataatgat tatgtaccat ggggacggac ggctgaggac gcctggaaat ctgaccgcga 1860 tttgaagcat tttgcaggac aatttatttg gacaggcttt gattatattg gcgagccgac 1920 accttattat gattcttatc cggcaaaaag ttcatacttt ggggctgttg atacagctgg 1980 ttttccaaag gacatttttt actactacca aagccagtgg aaaaaagagc cgatggtcca 2040 tctgctgccg cattggaatt ggaccgaagg ggaaccggtc cgcgtactcg cttatacgaa 2100 cgcccatcag gttgaacttt ttcttaatgg aaaatcatta ggggtacgag gctatgaaaa 2160 taagaaaacc tcttggggcg caccatataa agaaactaaa gacggaaaaa cctatctaga 2220 gtgggcagtg ccttttaaag ccgggacatt agaagccgta gccatggacg aaaacggcaa 2280 ggaaattgcc cgtgatcagg tgacaactgc gggtgcacca gccgctgtca aattaacggc 2340 cgatcgtaag gtaataaaag cagacggaac agatttatcg tttattaccg cagaaattgt 2400 ggacagtaaa gggaatgtgg ttccaaatgc ggatcacctg atccagtttc acctgtctgg 2460 ccatggtgaa cttgccggcg ttgataatgg agacgcagct agtgttgaac gatacaagga 2520 taataagcgc aaggctttta gcggcaaagc gttagcgatc gttcaatcta ataagcttga 2580 cggaaatatt acattgcatg cgtctgcaga agggctctca agcggcaacg tgaccatttt 2640 caccacggcc tctgccgacc agaacagcat caccattgca gggatagatg aggtaaatgt 2700 tttggtcgat ttcaatgtgg tgccagagct gccttcgcag attaaagtgt attacagtga 2760 ttccactgtt gaaatgaaac ctgtgacatg ggatgcggtc gaccccaatc ttcttaacac 2820 tgccggaaaa attattgtcg agggtactgt ggaaggaact gacaaaaagg caaaggcact 2880 attgattgtt aaaggcaatg ggcaggaaaa ctctgagtac aggattgatc ttttctcgcc 2940 agatccaaag ctaatttcta ctgagctgac agtagagaag acgaatatca tggaagacga 3000 tttcatcgat ataaaggtaa tcggacagct agaaaacaag gaagttgtgg atttatctaa 3060 cttcatgcca atctatgaat tcgactgcga tattattaag attgaaggaa ataagctgta 3120 tgcgcttgaa gaaggcctgg tcaaggtaac agctgcggtt acttataaag ggaggaccgt 3180 tacctcacct gaaatgatgt tgaagataac gaaaaaccct gtccctaaaa ccattacgca 3240 catcgattca attacagtgg tagctggcaa aggggaagca ccggttcttc ctgcaacggc 3300 agtggctcat tttgacaggg gaatgccgcg agatgtcaag gttaagtggg aaatagtaaa 3360 tccggctctt tatcaaaatc taggtgaatt tacggtatca ggtgatgtcg aagggacaga 3420 aatcaaggcc caggcaaagg tgatggttag atctgcatta gcgattgaaa caatctcaat 3480 ggctgtattg ccaaatcaaa aacctgaact gcctcaaaaa gtaacggtgt attatagtga 3540 tggaacggaa gaacaggctg atgtggattg ggacgctatg ccatcagcgg aattgaaaag 3600 tgagggagta gttaaggtaa aaggctctgt aaagggtgtg gacctgaaag caacggcaca 3660 gattagggtg acctcagaag ttggcggggt acagaatatc agccgggcga aaaatggcta 3720 cgaatatccg aaagcggaag catccttcac aaacacaggc ccaggatcaa atgaccggat 3780 tgaagcaatc aacgatgatg ttatctccta tgatgccgag ccgcataatc gctggacgaa 3840 ttggcagcct acaccgcggc caggagattg ggtttccatt acctttggcg acagcaagcc 3900 tagaaaatat gatatagaca gtatggagat tcactggtat gaggatcttg gtacatcgtc 3960 tccagcttat tttaggattc aatataaatc aggcgatgaa tggaaggatg tctctggatt 4020 aaagactaat ccatcgaata cggtattacg tcaagctaac gtctatacct ttgataaggt 4080 gagaacctca gcgatcagag tcgatatgac agctaaaact ggaaagagct tagccatcac 4140 cgagatcaaa gtattttcca agtgggcgaa ggcgcacaca catccaatgg tgacggacat 4200 taagctaggc gatctaagca ttctcgatga ttttagtaaa aaaggtgaca acaacgaatt 4260 aactttccag gtcaaagacc caagagacat accagaaatt aaggtaaagg cagaagacaa 4320 cacaagcata acaataatac caacattcac ggccccatcc accgcaaaaa taatcgctaa 4380 atcggaggat ggcatgaaag tggagattta caacattcgt tttacagaat gaaacacaga 4440 aacggtgctg ctgtttcata agaggaaata gtaatgcttg tacgtttcgg gtatagaaaa 4500 ggaatcattt gccccaaact aaaaaaaaaa gtcagcttag ttaatggggt tatgaagatg 4560 aatgcatact ttcaatttca ttcaaaactg gattcgtttc gtcttttttc aatggaacat 4620 cttgtgacta tagcgattat tatcattctt tgcattcttc cgtttgtcac acgtaatcaa 4680 tataagaagg atgggaaacg aaggttattt cgtttccctc ttgcttttct tttactgatt 4740 tctgatgttt tgcaacatct ttggctggta gaggagaatg cttggtccat aaaacgcgat 4800 ttgcctctgc atttgagtga tctagttgtc atactggcga ttatcatgct gctcaccaaa 4860 agtaataaac tttttcaatt catgtatttt gcagggattg gcagttccat tcaggcgatc 4920 ttaacgccca atcttggcag gtattcattc ccgcactttc aatatattga attttttata 4980 tcacatggag gagtaattct cgcttgtatg ttcatgattg cggcctttaa ctaccggcca 5040 accattcgag ccctatgggt aaccgtcctt attgtgaacc tgtatgcggc atgtgtcttt 5100 ttcctaaata agttactggg atccaattac ctctacatca tgaaaaaacc aaaaacccct 5160 tcgcttctgg attatcttgg cccatggcca tggtatcttc tttcgatgga gatcgtgatg 5220 atagtgagtt tttatatact ttatattccg ttttggagga aaattaggga tagttcaggt 5280 gtttcatgat gaatgggaat tgtacgatct caattgttaa ttgcggaaag ctatatctgc 5340 aattatgaac aggatatctg caatttacga aaatggctga gttttgaaaa aggatattag 5400 cagttttctg aagccgagat ttcagttagg acgattctct tgcatcctat atggcggaag 5460 tacaagaatc gtccccaagt tttatttaaa gccctttaca ttgtcctgtg agcgagcctt 5520 ctattttatt tggtgctccg aagtcgttgg ctgttgagct gtttccctca cattgtattt 5580 ttccattgac tgagtttccg gacataattg gtccgtattc gccgaattgt ttattggcag 5640 atacttggct gttgtcagcg agtgtgagtc cgccatttaa ggtgtttcca gctaatgtca 5700 cgttgctcgc ggtaccagta atgttagttt tgccgtttac agttgtacca aaaagctgga 5760 tgttctttgc cttgtcagct ttcaagccgc cattaatcgt actattaaag ataaccaagg 5820 atgccccttt tttgaccgta acacctccgg aaaccattgc attttctaag caggtgactc 5880 cctctgtaac aactagt 5897 <210> 3 <211> 4191 <212> DNA <213> gene sequence of beta-galactosidase II <400> 3 atgagacgaa ttaattttaa tgacaattgg cgctttcaac gggagataag caccagttta 60 agagaagcac agaaacctag ttttaacgat cattcctggc ggcaattgag tctgccgcat 120 gactggagta ttgaattaga ttttaacaaa gattcacttg caacacatga aggcggctat 180 ttggacggcg gtgtcggctg gtatcgaaaa acctttaccg tgccatctgc gatggagggg 240 aagcggatct cccttgattt tgatggggtt tatatgaaca gcaccaccta tttaaatggc 300 gaagagctgg ggacctatcc ttttggttat aatgcttttt cctatgatat tacggacaag 360 ctttttatgg acggcagaga gaatgttctc gctgtgaaag tcgataacac ccagccgagc 420 agccgctggt attcaggaag cggaatctac agaaatgtct atttaaccgt gaccaatccg 480 gttcatgtag caagatacgg gacgtttgtc acaacgcctg atttggaaag cgcttatgct 540 gcaagaaaag cggaggtaaa catcaaaacc aaaatcaaca atgactcaga tgctgcggta 600 caggtgaagg tgaagtccac gatctacgat acagacggca aagaggtggc tagcgtagtg 660 tcgcaggaaa aaactgctgc tgcgggtacg acagcacatt ttgaagacaa cacagtgatc 720 gaaaatccgg agctatggag cttggataat ccttatcgat acaagcttgt cacagatgtt 780 ctaattggcg gcgaaacggt agatacatat gaaactcgct ttggtgcgag gtttttcaaa 840 tttgatgcaa acgaagggtt ttcactaaac ggaaagccaa tgaagctgta tggtgtttcc 900 atgcaccatg atttaggtgc gttaggagct gcaactaatg cacgggctgt ggaaaggcag 960 ctgcaaatca tgaaagatat gggtgttaat gccataaggg gcacccacaa tcctgtttct 1020 ccagagtttc ttgaggccgt caataaccta gggctgcttt tgattgagga agcctttgac 1080 tgctggagcc agtcaaagaa gacctatgac tatgggagat tcttcaccag atgggcggag 1140 catgacgtaa aagaaatggt cgaccgcgga aagaatgaac cttcgattat catgtggtcg 1200 attggaaatg aaatttatga cacaacaagc ccttctggag tagaaacggc acgtaattta 1260 gttcgctgga tcaaagaaat agacacaaca agaccgacta cgattggcga ggataaaacc 1320 aggggcgata aggtaaatgt cacaccaatc gaccctaata ttctagaaat attccatact 1380 gtcgatgtgg tcggattgaa ctacagcgag aacaattatg taggatatca tgagcagcat 1440 ccaaactgga agctgtatgg ctcggaaaca tcttccgcta cacgttcgcg gggagtctac 1500 acccacccat atgaatataa tcttggtaca aagtatgatg atctgcagca atcctcctat 1560 gataatgatt atgtaccatg gggacggacg gctgaggacg cctggaaatc tgaccgcgat 1620 ttgaagcatt ttgcaggaca atttatttgg acaggctttg attatattgg cgagccgaca 1680 ccttattatg attcttatcc ggcaaaaagt tcatactttg gggctgttga tacagctggt 1740 tttccaaagg acatttttta ctactaccaa agccagtgga aaaaagagcc gatggtccat 1800 ctgctgccgc attggaattg gaccgaaggg gaaccggtcc gcgtactcgc ttatacgaac 1860 gcccatcagg ttgaactttt tcttaatgga aaatcattag gggtacgagg ctatgaaaat 1920 aagaaaacct cttggggcgc accatataaa gaaactaaag acggaaaaac ctatctagag 1980 tgggcagtgc cttttaaagc cgggacatta gaagccgtag ccatggacga aaacggcaag 2040 gaaattgccc gtgatcaggt gacaactgcg ggtgcaccag ccgctgtcaa attaacggcc 2100 gatcgtaagg taataaaagc agacggaaca gatttatcgt ttattaccgc agaaattgtg 2160 gacagtaaag ggaatgtggt tccaaatgcg gatcacctga tccagtttca cctgtctggc 2220 catggtgaac ttgccggcgt tgataatgga gacgcagcta gtgttgaacg atacaaggat 2280 aataagcgca aggcttttag cggcaaagcg ttagcgatcg ttcaatctaa taagcttgac 2340 ggaaatatta cattgcatgc gtctgcagaa gggctctcaa gcggcaacgt gaccattttc 2400 accacggcct ctgccgacca gaacagcatc accattgcag ggatagatga ggtaaatgtt 2460 ttggtcgatt tcaatgtggt gccagagctg ccttcgcaga ttaaagtgta ttacagtgat 2520 tccactgttg aaatgaaacc tgtgacatgg gatgcggtcg accccaatct tcttaacact 2580 gccggaaaaa ttattgtcga gggtactgtg gaaggaactg acaaaaaggc aaaggcacta 2640 ttgattgtta aaggcaatgg gcaggaaaac tctgagtaca ggattgatct tttctcgcca 2700 gatccaaagc taatttctac tgagctgaca gtagagaaga cgaatatcat ggaagacgat 2760 ttcatcgata taaaggtaat cggacagcta gaaaacaagg aagttgtgga tttatctaac 2820 ttcatgccaa tctatgaatt cgactgcgat attattaaga ttgaaggaaa taagctgtat 2880 gcgcttgaag aaggcctggt caaggtaaca gctgcggtta cttataaagg gaggaccgtt 2940 acctcacctg aaatgatgtt gaagataacg aaaaaccctg tccctaaaac cattacgcac 3000 atcgattcaa ttacagtggt agctggcaaa ggggaagcac cggttcttcc tgcaacggca 3060 gtggctcatt ttgacagggg aatgccgcga gatgtcaagg ttaagtggga aatagtaaat 3120 ccggctcttt atcaaaatct aggtgaattt acggtatcag gtgatgtcga agggacagaa 3180 atcaaggccc aggcaaaggt gatggttaga tctgcattag cgattgaaac aatctcaatg 3240 gctgtattgc caaatcaaaa acctgaactg cctcaaaaag taacggtgta ttatagtgat 3300 ggaacggaag aacaggctga tgtggattgg gacgctatgc catcagcgga attgaaaagt 3360 gagggagtag ttaaggtaaa aggctctgta aagggtgtgg acctgaaagc aacggcacag 3420 attagggtga cctcagaagt tggcggggta cagaatatca gccgggcgaa aaatggctac 3480 gaatatccga aagcggaagc atccttcaca aacacaggcc caggatcaaa tgaccggatt 3540 gaagcaatca acgatgatgt tatctcctat gatgccgagc cgcataatcg ctggacgaat 3600 tggcagccta caccgcggcc aggagattgg gtttccatta cctttggcga cagcaagcct 3660 agaaaatatg atatagacag tatggagatt cactggtatg aggatcttgg tacatcgtct 3720 ccagcttatt ttaggattca atataaatca ggcgatgaat ggaaggatgt ctctggatta 3780 aagactaatc catcgaatac ggtattacgt caagctaacg tctatacctt tgataaggtg 3840 agaacctcag cgatcagagt cgatatgaca gctaaaactg gaaagagctt agccatcacc 3900 gagatcaaag tattttccaa gtgggcgaag gcgcacacac atccaatggt gacggacatt 3960 aagctaggcg atctaagcat tctcgatgat tttagtaaaa aaggtgacaa caacgaatta 4020 actttccagg tcaaagaccc aagagacata ccagaaatta aggtaaaggc agaagacaac 4080 acaagcataa caataatacc aacattcacg gccccatcca ccgcaaaaat aatcgctaaa 4140 tcggaggatg gcatgaaagt ggagatttac aacattcgtt ttacagaatg a 4191 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> putative amino acid sequence of beta-galactosidase II <400> 4 Tyr Ser Asp Glu Ser Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> putative amino acid sequence of beta-galactosidase II <400> 5 Phe Gly Ala Val Asp Thr Ala Gly 1 5 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> forward primer for degenerate PCR <220> <221> modified_base <222> (6) <223> i <220> <221> modified_base <222> (15) <223> i <400> 6 taywsngayg arwsngc 17 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> reverse primer for degenerate PCR <220> <221> modified_base <222> (15) <223> i <220> <221> modified_base <222> (18) <223> i <400> 7 ccngcngtrt cnacngcncc raa 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> forward primer for inverse PCR <400> 8 ggcagctgca aatcatgaaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> reverse primer for inverse PCR <400> 9 tttccacagc ccgtgcatta 20 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> forward primer for beta-galactosidase II gene cloning <400> 10 aacccgggat gagacgaatt aattttaa 28 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> reverse primer for beta-galactosidase II gene cloning <400> 11 aaggtacctc attctgtaaa acgaatgt 28

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 베타-갈락토시다제 II.
제1항의 베타-갈락토시다제 II를 코딩하는 유전자.
제2항에 있어서, 상기 베타-갈락토시다제 II를 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제2항의 유전자 및 제4항의 재조합 벡터가 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물.
제5항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제5항의 재조합 미생물을 배양하여 베타-갈락토시다제 II를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-갈락토시다제 II를 회수하는 단계를 포함하는 베타-갈락토시다제 II의 제조방법.
제1항의 베타-갈락토시다제 II를 락토스 함유 기질과 반응시켜 갈락토올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 갈락토올리고당을 회수하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 갈락토올리고당은 액상유, 건조분말우유, 유아 우유, 유아 조제식 (baby formula), 아이스크림, 요거트, 치즈, 유제품, 음료, 유아 식품, 시리얼, 빵, 비스켓, 제과류, 케이크, 식품보조제, 식이보충제, 프로바이오틱 식료품, 프리바이오틱 식료품, 동물 사료, 가축 사료 및 약제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 구성성분인 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조방법.