WO2016190613A1 - 고당전이 활성의 베타-갈락토시다제 변이체 및 그 용도 - Google Patents

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WO2016190613A1
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galactosidase
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carboxy terminus
cleaved
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유영재
양택호
반재구
김의중
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    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase

Definitions

  • the present invention relates to novel beta-galactosidase variants, and more particularly, novel beta-galactosidase variants derived from Bacillus circulans , genes encoding them, recombinant vectors containing the genes and recombinants
  • the present invention relates to a microorganism, a method for producing beta-galactosidase variant using the recombinant microorganism, and a method for producing galactooligosaccharide using the beta-galactosidase variant.
  • Beta-galactosidase hydrolyzes terminal non-reducing beta-D-galactose in lactose-like beta-D-galactopyranoside To produce galactose and glucose, or catalyze galactose transfer reactions that transfer non-reducing galactose to other compounds.
  • enzymes of this class have two functions, hydrolysis activity and sugar transfer activity, but the ratio of the two reactions differs depending on the type of beta-galactosidase.
  • the hydrolytic activity of beta-galactosidase prevents lactose intolerance by hydrolyzing the lactose of milk and dairy products, and is used to increase the sugar content of milk or to prepare sweet syrup from milk by-products. It is an industrially useful enzyme, such as the production of galactooligosaccharides, which promote the growth of lactic acid bacteria, which are useful intestinal organisms.
  • Beta-galactosidase is widely found in bacteria, fungi, yeast, as well as in mammalian organs and plant seeds. Kluyveromyces lactis and Kluyveromyces lacgilles in the food industry fragilis ) yeast, Aspergillus niger and Aspergillus oryzae fungi, and beta-galactosidase derived from Bacillus circulans have. Among them, beta-galactosidase derived from Bacillus Circus ATCC 31382 is sold under the name Biolacta (Daiwa Kasei, US Patent 4237230 (1980)).
  • Beta-galactosidase binds to lactose and the reaction begins with the carboxyl group of the glutamate moiety at the center of the beta-galactosidase reaction acting as an acid catalyst (Juers et al., Biochemistry, 40, 14781-14794, 2001).
  • the nucleophile glutamate moiety temporarily covalently binds to galactose, attacking the first carbon of galactose bound to glucose to release glucose.
  • the hydroxyl group attached to carbon number 4 of the falling glucose is stabilized with the help of another glutamate, which acts as an acidic catalyst, and is released from the enzyme as it receives protons and becomes free glucose.
  • Galactose which is temporarily covalently attached to the glutamate residues of the enzyme, reacts with water to break off from the enzyme (hydrolysis), or binds to new lactose or other compounds that enter the enzyme's reaction center (galactose transfer reaction).
  • a substance having one or more galactosides resulting from such a galactose transfer reaction is called galactooligosaccharide (GOS).
  • GOS reaches the large intestine without digestion and absorption, acting as a prebiotic that promotes the growth and activity of useful microorganisms that coexist in the large intestine, such as Bifidobacteria and Lactobacilli.
  • GOS has been shown to be effective in promoting health, including cancer prevention, mineral absorption, lipid metabolism, anti-inflammatory and atopic dermatitis (Macfarlane et al., J. Appl. Mcriobiol., 104, 305-344, 2008).
  • studies have shown that a person suffering from irritable bowel syndrome increases the amount of beneficial intestinal bacteria, Bifidobacteria, and alleviates symptoms when ingesting GOS (Silk et al., Aliment. Pharmacol. Ther., 29, 508-518, 2009)
  • beta-galactosidase derived from Bacillus or Aspergillus is used for GOS production.
  • beta-galactosidase derived from Bacillus circulans has an optimal reaction temperature of 50-60 degrees Celsius. It is most commonly used because it has high galactose transfer reaction efficiency.
  • 240 kDa, 160 kDa (Mozafar et al., Agric. Biol. Chem., 48, 3053-3061, 1984) from Bacillus circulans ; 212 kDa, 145 kDa, 86 kDa (Vetere and Paoletti, Biochim. Biophys.
  • beta-galactosidases include 195 kDa, 160 kDa, 135 kDa, 86 kDa (Song et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 75, 268-278, 2011).
  • a size of 145 kDa but a new type beta-galactosidase, BgaII has been found and reported in Bacillus circulans (Korean Patent No. 1,121,161).
  • An object of the present invention is to provide a beta-galactosidase variant, a gene encoding the same, a recombinant vector comprising the gene and a recombinant microorganism transformed with the recombinant vector.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing beta-galactosidase variants using the recombinant microorganisms and a method for producing galactooligosaccharides.
  • the present invention is a beta-galactosidase represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, beta- improved biochemical properties such as thermostable or enzymatic activity through the mutation of the carboxy terminal cleavage Galactosidase variants are provided.
  • the present invention also provides a beta-galactosidase represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, comprising amino acids 1-798 and comprising a mutation in which the carboxy terminus of any of the 799-1396 amino acid residues is cleaved Provided beta-galactosidase variants having a sequence.
  • the present invention also provides a gene encoding the beta-galactosidase variant and a recombinant vector comprising the gene.
  • the present invention also provides a recombinant microorganism in which the gene or the recombinant vector is inserted into a host cell selected from the group consisting of bacteria, fungi and yeasts.
  • the present invention also comprises culturing the recombinant microorganism to express the beta-galactosidase variant; And it provides a method for producing beta-galactosidase comprising the step of recovering the expressed beta-galactosidase variant.
  • the present invention also provides a method for preparing galactoligosaccharide by reacting the beta-galactosidase variant with a lactose-containing substrate; And it provides a method for producing galactoligosaccharides comprising the step of recovering the prepared galactoligosaccharides.
  • Figure 1 depicts the conserved domains of the amino acid sequences constituting beta-galactosidase and variants thereof.
  • Figure 2 shows the results of staining with Coomassie brilliant blue after performing beta-galactosidase and its variants (SDS-PAGE) (MW: protein size marker, WT: wild type, 799-1350: variant) .
  • Figure 3 shows the results of staining with X-gal after SDS-PAGE of beta-galactosidase and its variants (MW: marker, WT: wild type, 799-1350: variant).
  • Figure 4 is a result of measuring the enzyme activity of beta-galactosidase and its variants (WT: wild type, 873 ⁇ 1350: variant).
  • FIG 6 shows the results of HPLC analysis of carbohydrates produced by beta-galactosidase and its variants (BgaII: wild type, BgaII-950: variant).
  • Figure 7 is a result of measuring the thermal stability of beta-galactosidase and its variants (WT: wild type, 873 ⁇ 1350: variant).
  • the beta-galactosidase domain discovered in the prior patent has a multi-domain structure as shown in FIG. 1.
  • the LacZ domain consisting of GH2_SB, GH2 and GH2_TIM of beta-galactosidase is a part having enzymatic activity. It has one BIG1, three BIG4 and bacteria Ig-like domains towards the carboxy terminus of beta-galactosidase, and the most carboxy terminus has an F5 / 8_C domain, also called a discoidin domain.
  • Polypeptide chains having no specific structure connect between domains and are about 10, 50, and 130 amino acid residues in length.
  • the present invention in the beta-galactosidase represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, beta-gal improved biochemical properties such as thermostability or enzyme activity through the mutation of the carboxy terminal cleavage It relates to lactosidase variants.
  • Variations in which the carboxy terminus is cleaved in the present invention may include all of the variants in which the carboxy terminus of the amino acid residue is cleaved within a range that does not reduce the enzymatic activity of the beta-galactosidase represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the present invention is a beta-galactosidase represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, comprising a 1-798 amino acid, the carboxy terminal of any one of the 799 to 1396 amino acid residues truncated mutation It relates to a beta-galactosidase variant having an amino acid sequence comprising.
  • the mutation comprises a) cleavage at the 799th amino acid residue carboxy terminus; b) the 873 th amino acid residue carboxy terminus is cleaved; c) the 900th amino acid residue carboxy terminus is cleaved; d) cleavage of the 950th amino acid residue carboxy terminus; e) the 1000th amino acid residue carboxy terminus is cleaved; f) the 1059th amino acid residue carboxy terminus is cleaved; g) the 1066th amino acid residue carboxy terminus is cleaved; h) the 1115th amino acid residue carboxy terminus is cleaved; i) the 1164th amino acid residue carboxy terminus is cleaved; j) the 1200th amino acid residue carboxy terminus is cleaved; k) the 1302th amino acid residue carboxy terminus is cleaved; And l) cleavage at the 1350th amino acid residue carboxy
  • amino acid sequence of the variant may be characterized in that SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 or 26.
  • the present invention relates to a gene encoding the beta-galactosidase variant.
  • the present invention provides a recombinant vector containing a gene encoding another beta-galactosidase variant and a gene encoding the beta-galactosidase variant or the recombinant vector is selected from the group consisting of bacteria, fungi and yeast
  • the present invention relates to a recombinant microorganism inserted into a host cell.
  • the term "vector” refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing the DNA in a suitable host.
  • the vector may be a plasmid, phage particles, or simply a potential genomic insert. Once transformed into the appropriate host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are the most commonly used form of current vectors, "plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably in the context of the present invention. However, the present invention includes other forms of vectors having functions equivalent to those known or known in the art. Protein expression vectors used in E.
  • coli include the pET family of Novagen (USA); PBAD family of Invitrogen (United States); PHCE or pCOLD from Takara (Japan); PACE family of GenoFocus (Korea); Etc. can be used.
  • Bacillus subtilis the target gene can be inserted into a specific part of the genome to implement protein expression, or MoBiTech (Germany) pHT family vector can be used.
  • Fungi and yeast can also express proteins using genomic insertions or self-replicating vectors.
  • Plant protein expression vectors can be used using T-DNA systems such as Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes. Typical expression vectors for mammalian cell culture expression are based on, for example, pRK5 (EP 307,247), pSV16B (WO 91/08291) and pVL1392 (Pharmingen).
  • expression control sequence refers to a DNA sequence essential for the expression of a coding sequence operably linked in a particular host organism.
  • regulatory sequences include promoters for performing transcription, any operator sequence for regulating such transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosomal binding sites, and sequences that control termination of transcription and translation.
  • suitable control sequences for prokaryotes include promoters, optionally operator sequences, and ribosomal binding sites.
  • Eukaryotic cells include promoters, polyadenylation signals, and enhancers. The factor that most influences the amount of gene expression in the plasmid is the promoter.
  • an SR ⁇ promoter a promoter derived from cytomegalovirus, and the like are preferably used.
  • any of a wide variety of expression control sequences can be used in the vector.
  • useful expression control sequences include, for example, early and late promoters of SV40 or adenovirus, lac system, trp system, TAC or TRC system, T3 and T7 promoters, major operator and promoter region of phage lambda, fd Regulatory regions of the code protein, promoters for 3-phosphoglycerate kinase or other glycolysis enzymes, promoters of the phosphatase such as Pho5, promoters of the yeast alpha-crossing system and prokaryotic or eukaryotic cells or viruses thereof And other sequences of constitution and induction known to modulate the expression of the genes, and various combinations thereof.
  • the T7 RNA polymerase promoter ⁇ 10 is two. It can be usefully used to express proteins in E. coli.
  • Nucleic acids are "operably linked” when placed in a functional relationship with other nucleic acid sequences. This may be genes and regulatory sequence (s) linked in such a way as to allow gene expression when appropriate molecules (eg, transcriptional activating proteins) bind to regulatory sequence (s).
  • the DNA for a pre-sequence or secretion leader is operably linked to the DNA for the polypeptide when expressed as a shear protein that participates in the secretion of the polypeptide;
  • a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when positioned to facilitate translation.
  • "operably linked” means that the linked DNA sequence is in contact, and in the case of a secretory leader, is in contact and present within the reading frame.
  • enhancers do not need to touch. Linking of these sequences is performed by ligation (linking) at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods are used.
  • expression vector generally refers to a fragment of DNA that is generally double stranded as a recombinant carrier into which fragments of heterologous DNA have been inserted.
  • heterologous DNA refers to heterologous DNA, which is DNA not naturally found in host cells.
  • the gene must be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that function in the selected expression host.
  • the expression control sequence and the gene of interest are included in one expression vector including the bacterial selection marker and the replication origin. If the expression host is a eukaryotic cell, the expression vector must further comprise an expression marker useful in the eukaryotic expression host.
  • Host cells transformed or transfected with the expression vectors described above constitute another aspect of the present invention.
  • transformation means introducing DNA into a host so that the DNA is replicable as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration.
  • transfection means that the expression vector is accepted by the host cell whether or not any coding sequence is actually expressed.
  • vectors and expression control sequences function equally in expressing the DNA sequences of the present invention.
  • hosts function equally for the same expression system.
  • those skilled in the art can make appropriate choices among various vectors, expression control sequences and hosts without departing from the scope of the present invention without undue experimental burden. For example, in selecting a vector, the host must be considered, since the vector must be replicated in it. The number of copies of the vector, the ability to control the number of copies, and the expression of other proteins encoded by the vector, such as antibiotic markers, must also be considered. In selecting expression control sequences, several factors must be considered.
  • the relative strength of the sequence, the controllability, and the compatibility with the DNA sequences of the present invention should be considered, particularly with regard to possible secondary structures.
  • Single cell hosts may be selected from a host for the selected vector, the toxicity of the product encoded by the DNA sequence of the invention, the secretory properties, the ability to accurately fold the protein, culture and fermentation requirements, the product encoded by the DNA sequence of the invention from the host. It should be selected in consideration of factors such as the ease of purification.
  • one skilled in the art can select a variety of vector / expression control sequence / host combinations capable of expressing the DNA sequences of the invention in fermentation or large scale animal culture.
  • a binding method binding method
  • a panning method a panning method
  • a film emulsion method and the like can be applied.
  • substantially pure in the definition of the present invention is meant that the polypeptide according to the present invention and the DAN sequence encoding the polypeptide are substantially free of other proteins derived from bacteria.
  • Host cells for expressing recombinant proteins are widely used by prokaryotic cells, such as Escherichia coli and Bacillus subtillis , which are capable of culturing high concentrations of cells in a short time, are easily genetically engineered, and whose genetic and physiological characteristics are well known. Has been.
  • the recent single cell eukaryotic yeast line Pichia) pastoris , Saccharomyces cerevisiae , Hansenula polymorpha Etc.
  • filamentous fungi insect cells
  • plant cells mammalian cells, etc.
  • mammalian cells etc.
  • the present invention in another aspect, relates to a method for producing a beta-galactosidase variant using the transformed recombinant microorganism, specifically, to express the beta-galactosidase variant by culturing the recombinant microorganism step; And it relates to a method for producing a beta-galactosidase variant comprising recovering the expressed beta-galactosidase variant.
  • Cultivation of the transformed recombinant microorganism is carried out according to well-known methods, conditions such as the culture temperature and time, the pH of the medium can be appropriately adjusted.
  • Beta-galactosidase variants from the cultured recombinant microorganisms can be accomplished by conventional biochemical separation techniques such as treatment with protein precipitants (salting), centrifugation, ultrasonic disruption, ultrafiltration, dialysis, molecular sieves.
  • Various chromatography such as chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. can be used, and these are usually used in combination to separate proteins of high purity.
  • recombinant beta-galactosidase wild type and variant were prepared using the transformed recombinant Bacillus subtilis, and the pD92 (Korean Patent Publication No. 10-2011-0102862) vector was separately prepared for protein expression. Recombinant protein is possible with cell growth and protein expression separated by microbial culture without the need for the addition of an inducer. Beta-galactosidase wild type and variant produced by the above method was confirmed to show the activity of beta-galactosidase as a result of X-gal staining with the expected size as confirmed by SDS-PAGE (Fig. 2, Fig. 3). ).
  • the recombinant beta-galactosidase wild-type and the variants obtained by using o-nitrophenyl-galactopyranoside (oNPG) as a substrate the enzyme activity is measured
  • oNPG o-nitrophenyl-galactopyranoside
  • the enzyme activity is measured as a result, it was confirmed that the activity of the beta-galactosidase variant was superior to the wild type (Fig. 4), and analysis of the degradation characteristics using lactose and oNPG, the result that the variant was superior to the lactose compared to the wild type
  • Fig. 5 the analysis of the produced carbohydrate by HPLC, the galactoligosaccharides are produced in both wild type and mutant, it was confirmed that the amount of the variants is much higher than wild type (Fig. 6).
  • the recombinant beta-galactosidase wild type and variant were heat treated at 60 ° C. higher than the optimum reaction temperature of 50 ° C. for 1 hour, followed by residual enzyme activity using oNPG as a substrate. As a result of the measurement, it was confirmed that the residual enzyme activity of the variant was superior to that of the wild type (FIG. 7).
  • the present invention comprises the steps of reacting the beta-galactosidase variant with a lactose-containing substrate to produce galactoligosaccharides; And it relates to a method for producing galacto-oligosaccharides comprising the step of recovering the prepared galacto-oligosaccharides.
  • the lactose-containing substrate means a lactose solution of 30 to 60% (w / v), preferably 45 to 55%, most preferably 50% concentration.
  • the galactooligosaccharide is liquid milk, dry powder milk, infant milk, baby formula, ice cream, yogurt, cheese, dairy products, beverages, infant food, cereals, bread, biscuits, confectionery, cakes, It may be one component selected from the group consisting of food supplements, dietary supplements, probiotic foodstuffs, prebiotic foodstuffs, animal feeds, livestock feeds and pharmaceuticals.
  • probiotic means a dietary supplement containing lactic acid bacteria, which are most commonly used by the most common pathogens, and which contain potentially beneficial bacteria or yeasts.
  • Probiotics have long been used in the food industry because they can convert other carbohydrates and sugars into lactic acid.
  • Probiotics not only provide the sour taste of fermented dairy products such as yogurt, but also rebuild damaged tissue for growth and lower the pH to act as a preservative.
  • the most common forms of probiotics are fermented dairy products and foods fortified with probiotics. Lactic acid bacteria such as Kefir (milk fermented beverages), yogurt, Sauerkraut (fermented German kimchi), and Korean kimchi have been shown to be similar to the health effects of probiotics.
  • Prebiotics also limit the number of bacteria in the colon and selectively stimulate the growth of bacteria, which are beneficial to the human body and are composed of small sugars that are not digested in the body.
  • Prebiotics are anticancer, antimicrobial, hypolipidemic and glucose-modulating.
  • Prebiotics limit the number of bacteria in the colon and can optionally be defined as food components that are beneficial to the human body by stimulating the growth of bacteria and are not digested by the body.
  • oligosaccharides contains fructo-oligosaccharides, inulin, Isomalto-oligosaccharides, Lactilol, Lactosucrose, Lactulose, Pyrodextrins, Soy oligosaccharides, Xylo-oligosaccharides. They are mainly called bifidogenic factors and promote the growth of bifidobacteria.
  • Plasmids were prepared or isolated using E. coli DH5a (Enzynomics, Korea). Bacteria were grown in LB medium, and antibiotics, such as 100 ⁇ g / mL ampicillin and 5 ⁇ g / mL chloramphenicol, were used as needed.
  • Bacillus subtilis DB104 transformed with the prepared plasmid.
  • Bacillus subtilis DB104 was incubated for 12 hours in LB medium, and the cells were precipitated by centrifugation at 3500 rpm for 10 minutes.
  • the cell precipitate was dissolved in cell lysis buffer (100 mM sodium phosphate pH 7.0, Triton X-100 1%, lysozyme 1 mg / mL, DNAseI 1 U / mL) and left at room temperature for 30 minutes. It was centrifuged at 13,000 rpm for 5 minutes to remove cell residues.
  • Restriction enzymes for DNA cleavage were purchased from Enzynomics (Korea) and used according to the manufacturer's instructions. Plasmid mini-prep kit and DNA gel purification kit of ELPIS Biotech (Republic of Korea) were used to purify the plasmid from E. coli and DNA band after electrophoresis. Genotech (Republic of Korea) confirmed the DNA sequence, oligonucleotide was synthesized. NanoDrop (Thermo Scientific, USA) was used to confirm DNA concentration. In order to amplify DNA, PCR-2000 (Bioneer, Korea) machine and pfu DNA polymerase (Surgietics, Korea) were used.
  • Bacillus subtilis Plasmids were prepared for insertion into chromosomes.
  • the polymerase chain reaction (PCR) was carried out using pACE-BgaII (Korean Patent No. 1,121,161) as an original and oligonucleotides of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 as primers.
  • PCR was performed by mixing 1 ng of pACE-BgaII, 5 ⁇ L of 10-fold pfu DNA polymerase reaction buffer, 5 units of pfu DNA polymerase, 2 mM dNTP, 50 pmol SEQ ID NO: 1 oligo nucleic acid, 50 pmol SEQ ID NO: 2 oligo nucleic acid Volume to 50 ⁇ L.
  • DNA was denatured for 1 minute at 94 ° C., and DNA amplification was performed 35 times at 94 ° C. for 30 seconds, 57 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 4 minutes. The reaction was terminated by further incubation at 72 ° C. for 7 minutes.
  • the amplified DNA was electrophoresed in 1% agar to purify the amplified DNA band at about 4 kb.
  • Bacillus subtilis chromosome insertion vector pD92 (Korean Patent Publication No. 10-2011-0102862) having a cry3Aa promoter variant was used.
  • PD92 isolated from E. coli was double-cut and purified by restriction enzymes BamHI and PvuII. 100 ng of the cut plasmid and 100 ng of the amplified DNA fragment were attached using 2.5 U of T4 DNA polymerase (ELPIS Biotech), and were subjected to the thermal shock method to E. coli DH5a. A colony of transformed E.
  • Bacillus subtilis grown on solid LB containing antibiotic ampicillin was selected and grown in 5 mL of liquid LB medium, followed by plasmid purification using a plasmid mini-prep kit.
  • the plasmid was cut with restriction enzyme Hind III, and a suitable plasmid was selected and inserted into Bacillus subtilis DB104 by natural introduction.
  • Bacillus subtilis grown in solid LB medium containing 5 ⁇ g / mL of the antibiotic chloramphenicol The colonies were grown again in solid LB medium containing 1% starch. When starch was stained with 1% KI and 1% I2 solution, the non-stained Bacillus subtilis population was selected and used as the wild type beta-galactosidase producing strain of SEQ ID NO: 3.
  • PCR was performed by mixing 1 ng of pACE-BgaII, 5 ⁇ L of 10-fold pfu DNA polymerase reaction buffer, 5 units of pfu DNA polymerase, 2 mM dNTP, 50 pmol SEQ ID NO: 1 oligo nucleic acid, 50 pmol forward / reverse primer oligo nucleic acid. Volume to ⁇ L.
  • DNA was denatured for 1 minute at 94 ° C., and DNA amplification was performed 35 times at 94 ° C. for 30 seconds, 57 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 4 minutes. The reaction was terminated by further incubation at 72 ° C. for 7 minutes.
  • the amplified DNA band was purified by electrophoresis on 1% agar.
  • pD92 Korean Patent Publication No. 10-2011-0102862 having a cry3Aa promoter variant
  • PD92 isolated from E. coli was double-cut and purified by BamHI and PvuII. 100 ng of the cut plasmid and 100 ng of the amplified DNA fragment were attached using 2.5 U of T4 DNA polymerase (ELPIS Biotech), and E. coli DH5a was thermally shocked. Transformed coli colonies growing in solid LB containing antibiotic ampicillin were selected and grown in 5 mL of liquid LB medium, and plasmids were purified using a plasmid mini-prep kit.
  • Plasmids cut with restriction enzyme Hind III were selected and inserted into Bacillus subtilis DB104 by natural introduction.
  • Bacillus subtilis grown in solid LB medium containing 5 ⁇ g / mL of the antibiotic chloramphenicol The colonies were grown again in solid LB medium containing 1% starch. When starch was stained with 1% KI and 1% I 2 solution, the non-stained Bacillus subtilis population was selected and used as the wild type beta-galactosidase producing strain of SEQ ID NO: 3.
  • Bacillus subtilis DB104 bacteria which produce variant beta-galactosidase with wild type and carboxy terminus truncated, were plated in solid LB medium containing 5 ⁇ g / mL of the antibiotic chloramphenicol and grown in a single bacterial colony at 37 ° C. In each case, one colony was inoculated in 5 mL of liquid medium and cultured in a 37 ° C. incubator. 50 mL of the liquid cultured LB medium containing 5 ⁇ g / mL of the antibiotic chloramphenicol was inoculated with 0.5 mL of the seed culture solution and cultured in a 37 ° C. agitator.
  • the culture was centrifuged at 3,500 rpm for 10 minutes to separate cells from the culture.
  • the cell precipitate was dissolved in cell lysis buffer (100 mM sodium phosphate pH 7.0, Triton X-100 1%, lysozyme 1 mg / mL, DNaseI 1 U / mL) and left at room temperature for 30 minutes. It was centrifuged at 13,000 rpm for 5 minutes to remove cell residues.
  • To confirm the protein composition in the cell lysate mix 5 times gel loading buffer and the sample 1: 4, boil for 5 minutes, and then perform SDS-PAGE on a 4-20% gradient acrylamide gel (Bio-Rad, USA). Was performed. Gel was stained with colloidal blue. Stained protein molecular weight standards from Elpis Biotech (South Korea) were used to determine the relative size of the variant beta-galactosidase (BgaII) protein with truncated wild type and C-terminus.
  • BgaII beta-gal
  • wild type beta-galactosidase II can be identified as a thick protein band at about 150 kD.
  • Variant beta-galactosidase (BgaII) proteins with truncated carboxy termini, BgaII-873, BgaII-900, BgaII-950, BgaII-1000, BgaII-1059, BgaII-1066, BgaII-1115, BgaII-1064, BgaII-1200, BgaII-1302 and BgaII-1350 were also identified by the thick protein bands forming a step on the gels stained. It was confirmed that BgaII-799 is weakly expressed.
  • the thick protein band is a variant beta-galactosidase (BgaII) protein with cleaved wild type and carboxy terminus on a gel stained with colloidal blue
  • the protein gel is developed after beta-galactosidase after SDS-PAGE.
  • the solution was immersed in a reagent x-gal solution (Sigma Alrich, USA).
  • the cell lysate was mixed with a gel loading buffer containing 0.5% sodium dodecyl sulfate at a ratio of 4: 1, and then SDS-PAGE was performed on a 4-20% gradient acrylamide gel (Bio-Rad, USA). Electrophoresis was performed at 50 V to minimize protein denaturation due to heat generation.
  • the gel was washed three times with physiological saline, followed by the reaction of beta-galactosidase in physiological saline containing 1 mg / mL x-gal, and the enzyme product blue on the protein electrophoresis gel. I made a belt.
  • C-terminal truncated variant beta-galactosidase (BgaII) proteins BgaII-873, BgaII-900, BgaII-950, BgaII-1000, BgaII-1059, BgaII-1066, BgaII-1115, BgaII-1064, BgaII-1200, BgaII-1302, BgaII-1350 and wild-type beta-galactosidase were identified by blue bands forming a stepped shape from low to high. A faint blue band was found in the cell lysate sample of BgaII-799.
  • test tube containing 1.5 mL of 100 mM Phosphate acetate buffer containing 1 mM o-nitrophenol galactopyranoside (oNPG) was preheated in a 50 ° C. water bath. 50 ⁇ L sample was added thereto and the reaction was allowed to proceed for 10 minutes. 10% sodium carbonate was added again to terminate the reaction, and the mixture was cooled to room temperature. Absorbance was measured at 420 nm. Various concentrations of o-nitrophenol solution were prepared, and a concentration standard curve was drawn. Using the slope of the graph, the concentration of the beta-galactosidase reaction product was determined. Beta-galactosidase 1 U was defined as the activity to make 1 ⁇ mol o-nitrophenol for 1 minute.
  • oNPG o-nitrophenol galactopyranoside
  • the cell volume and enzyme activity of the beta-galactosidase producing strains were measured in LB medium.
  • Bacillus subtilis DB104 bacteria were plated on solid LB medium containing 5 ⁇ g / mL of the antibiotic chloramphenicol and placed in a 37 ° C. incubator to grow into a single colony. In each case, one colony was inoculated in 5 mL of liquid medium and cultured in a 37 ° C. incubator.
  • the liquid cultured LB medium containing 5 ⁇ g / mL of the antibiotic chloramphenicol was inoculated with 0.5 mL of the seed culture solution and cultured in a 37 ° C. agitator.
  • the culture medium was taken, diluted 10-fold, and the absorbance was measured at an optical wavelength of 600 nm to determine the cell volume.
  • the culture was centrifuged at 3,500 rpm for 10 minutes to separate cells from the culture.
  • the cell precipitate was dissolved in cell lysis buffer (100 mM sodium phosphate pH 7.0, Triton X-100 1%, lysozyme 1 mg / mL, DNaseI 1 U / mL) and left at room temperature for 30 minutes.
  • BgaII-1066, BgaII-1200, BgaII-1302 and wild type beta-galactosidase had similar enzyme productivity at about 4 U / mL / OD.
  • BgaII-900 showed about 10% less productivity than wild type beta-galactosidase.
  • BgaII-870, BgaII-950, BgaII-950, BgaII-1000, BgaII-1059, BgaII-1115, BgaII-1064 and BgaII-1305 are approximately 20% more beta-gal compared to wild type beta-galactosidase It was confirmed that lactosidase activity appeared.
  • Example 5 Determination of substrate specificity of variant beta-galactosidase (BgaII) protein with truncated wild type carboxy terminus
  • lactose-degrading activity was determined by measuring the concentration of glucose produced when beta-galactosidase decomposed lactose.
  • the activity of making 1 ⁇ mol of glucose for 1 minute was defined as 1 U.
  • a 5% lactose solution was prepared with buffer 100 mM Phosphate acetate.
  • a test tube containing 1.5 mL of lactose solution was placed in a 50 ° C. water bath and preheated. 50 ⁇ L sample was added thereto and the reaction was allowed to proceed for 10 minutes. The test tube was soaked in boiling water for 5 minutes to stop the enzyme reaction.
  • 50 ⁇ L of the glucose measuring solution was mixed with 50 ⁇ L of the glucose measuring solution and placed in a 37 ° C. incubator for 1 hour.
  • the glucose measurement reaction solution was prepared by mixing glucose oxidase, dianisidine and hydrogen peroxidase in 100 mM potassium phosphate buffer pH 6.0.
  • the reaction was stopped by adding 100 ⁇ L of 10 N sulfuric acid solution.
  • the absorbance of the glucose measurement reaction solution was measured at an optical wavelength of 540 nm. From the slope of the concentration standard curve made with the glucose solution of various concentrations, the concentration of glucose produced in the lactose decomposition reaction of beta-galactosidase was calculated.
  • variant beta-galactosidase cleaved at the carboxy terminus BgaII-873, BgaII-900, BgaII-950, BgaII-1000, BgaII-1059, BgaII-1066, BgaII-1115, BgaII- 1064, BgaII-1200, BgaII-1302 and BgaII-1350 all showed higher values than wild type BgaII, and it was confirmed that lactose was used as an enzyme substrate better than oNPG.
  • Variant beta-galactosidase with wild type and carboxy terminus cleavage can synthesize galactooligosaccharides from lactose.
  • a 50% lactose solution was prepared in 100 mM of Potassium phosphate buffer solution, and 2 U of beta-galactosidase was added per 1 g of lactose, and galactoligosaccharide synthesis reaction was performed at 50 ° C. for 24 hours. The reaction solution was treated with boiling water for 5 minutes to stop the enzyme reaction.
  • Carbohydrate contained in the sample was quantitatively analyzed using Shepadex column (BioRad, USA) and HPLC (Agilent, Germany). As the elution solution, 0.1% sulfuric acid solution was used, and carbohydrates were detected by using a refractometer.
  • Example 7 Determination of thermostability of variant beta-galactosidase (BgaII) protein with truncated wild type carboxy terminus
  • beta-galactosidase (BgaII)
  • the galactooligosaccharide synthesis reaction of beta-galactosidase (BgaII) proceeds at rather high temperatures of 50 ° C. Therefore, the thermal stability of the enzyme is an important characteristic for the industrial use of the enzyme.
  • Variant beta-galactosidase (BgaII) proteins with truncated wild type and carboxy termini, BgaII, BgaII-873, BgaII-900, BgaII-950, BgaII-1000, BgaII-1059, BgaII-1066, BgaII-1115 In order to confirm the thermal stability of BgaII-1064, BgaII-1200, BgaII-1302 and BgaII-1350, heat treatment was performed for 1 hour in a 60 ° C water bath, and residual enzyme activity was measured using oNPG as an enzyme substrate. The residual enzyme activity was expressed
  • beta-galactosidase lost about 70% enzymatic activity due to 1 hour of heat treatment
  • variant beta-galactosidase (BgaII) proteins with carboxy terminus cleaved BgaII-873, BgaII-900, BgaII-950, BgaII-1000, BgaII-1059, BgaII-1066, BgaII-1115, BgaII-1064, BgaII-1200, BgaII-1302, and BgaII-1350 have at least 60% enzymatic activity. It can be confirmed that the thermal stability is better than wild-type beta-galactosidase.
  • beta-galactosidase variant By using the beta-galactosidase variant according to the present invention, galactooligosaccharide can be efficiently mass-produced.

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Abstract

본 발명은 고당전이 활성을 갖으며, 카르복시 말단부가 절단된, 베타-갈라토시다제 효소의 변이체 및 그 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 카르복시 말단부가 절단된 베타-갈락토시다제 변이체, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 상기 유전자 또는 재조합 벡터로 형질 전환된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제 변이체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 카르복시 말단부가 절단된 베타-갈락토시다제 변이체의 높은 당전이 활성을 이용하여, 효율적으로 갈락토올리고당을 대량 생산할 수 있다.

Description

고당전이 활성의 베타-갈락토시다제 변이체 및 그 용도
본 발명은 신규 베타-갈락토시다제 변이체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans) 유래의 신규 베타-갈락토시다제 변이체, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제 변이체의 제조방법 및 상기 베타-갈락토시다제 변이체를 이용한 갈락토올리고당의 제조방법에 관한 것이다.
베타-갈락토시다제(β-galactosidase)는 젖당 같은 베타-D-갈락토피라노사이드(β-D-galactopyranoside)에서 말단의 비환원성 베타-D-갈락토스(β-D-galactose)를 가수분해하여 갈락토스(Galactose)와 포도당을 만들거나, 비환원성 갈락토스를 다른 화합물에 옮기는 갈락토스 전이반응을 촉매한다. 일반적으로 이 부류의 효소는 가수분해 활성과 당 전이 활성의 두 기능을 가지고 있으나, 베타-갈락토시다제의 종류에 따라 두 반응의 비율이 다르다. 베타-갈락토시다제의 가수분해 활성은 우유와 유제품의 젖당을 가수분해하여 젖당 불내증을 막아주며, 우유의 당도를 높이거나, 우유 부산물로 감미 시럽을 제조하는 데 사용되고, 당 전이 활성은 인간의 장내 유용미생물인 유산균의 성장을 증진시키는 갈락토올리고당(Glactooligosaccharide)의 제조에 사용되는 등, 산업적으로 매우 유용한 효소이다.
베타-갈락토시다제는 포유동물의 장기, 식물의 종자를 비롯하여 세균, 곰팡이, 효모로부터 널리 발견된다. 식품공업에 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)와 클루이베로마이세스 프래길리스(Kluyveromyces fragilis) 등의 효모, 아스페르길러스 나이거(Aspergillus niger)와 아스페르길러스 오리재(Aspergillus oryzae) 등의 곰팡이, 그리고 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans)유래의 베타-갈락토시다제를 사용하고 있다. 그중 바실러스 서큘란스 ATCC 31382유래의 베타-갈락토시다제는 Biolacta (Daiwa Kasei 사, US Patent 4237230 (1980)) 제품명으로 판매되고 있다.
베타-갈락토시다제가 젖당과 결합하여, 베타-갈락토시다제 반응중심부에 있는 글루타메이트 잔기의 카르복실기가 산염기 촉매로 작용하면서 반응이 시작된다(Juers et al., Biochemistry, 40, 14781-14794, 2001). 이 nucleophile 글루타메이트 잔기는 포도당에 결합된 갈락토스의 1번 탄소를 공격하여 포도당을 떼어내면서, 갈락토스에 일시적인 공유결합을 한다. 이때 떨어져 나가는 포도당의 4번 탄소에 붙은 하이드록실기는 산성촉매 역할을 하는 다른 글루타메이트의 도움으로 안정화되었다가, 양성자를 받아 자유 포도당으로 되면서 효소에서 떨어져 나간다. 효소의 글루타메이트 잔기에 일시적으로 공유결합 상태로 붙어 있던 갈락토스는 물과 반응하여 효소에서 떨어져 나가거나(가수분해반응), 효소의 반응중심에 새로 들어온 젖당이나 다른 화합물에 결합한다(갈락토스 전이반응). 이러한 갈락토스 전이반응으로 생긴 하나 이상의 갈락토스 단위체(galactoside)를 가지는 물질을 갈락토올리고당(galactooligosaccharide, GOS)라고 한다.
GOS는 소화 흡수되지 않고 대장에 도달하여, Bifidobacteria나 Lactobacilli 같은 대장에 공생하는 유용미생물의 생장과 활성을 촉진하는 프리바이오틱스로 작용한다. GOS는 암 예방, 무기질 흡수, 지질 대사, 항염증, 아토피 완화 등의 건강 증진에 효과가 있다고 알려졌다 (Macfarlane et al., J. Appl. Mcriobiol., 104, 305-344, 2008). 또한, 과민성 장 증후군을 앓고 있는 사람이 GOS를 섭취하였을 때, 이로운 장내세균인 Bifidobacteria의 양을 증가시키며, 증상도 완화된다는 연구보고가 있다(Silk et al., Aliment. Pharmacol. Ther., 29, 508-518, 2009)
현재 GOS 생산에 Bacillus 또는 Aspergillus 유래의 베타-갈락토시다제가 많이 사용되고 있으며, 특히 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans) 유래 베타-갈락토시다제는 상대적으로 높은 온도인 50~60 도씨의 최적반응온도를 가지고 있고 높은 갈락토스 전이반응 효율을 가지고 있기 때문에 상업적으로 가장 많이 사용되고 있다. 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans)로부터 240 kDa, 160 kDa (Mozafar et al., Agric. Biol. Chem., 48, 3053-3061, 1984); 212 kDa, 145 kDa, 86 kDa (Vetere 와 Paoletti, Biochim. Biophys. Acta, 1380, 223-231, 1998); 195 kDa, 160 kDa, 135 kDa, 86 kDa (Song et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 75, 268-278, 2011) 등 여러 가지 베타-갈락토시다제가 보고 되었다. 또한 145 kDa의 크기이지만, 새로운 종류인 베타-갈락토시다제, BgaII가 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans)에서 발견 보고되었다(대한민국 등록특허, 제1,121,161호).
이에 본 발명에서는 젖당에서 갈락토올리고당 생산능력이 향상된 베타-갈락토시다제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 베타-갈락토시다제 BgaII의 C-말단부를 절단하여 변이체를 제작할 경우, 갈락토올리고당의 생산능력이 향상되고, 열안정성이 획기적으로 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 베타-갈락토시다제 변이체, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제 변이체의 제조방법 및 갈락토올리고당의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 베타-갈락토시다제에서, 카르복시 말단부가 절단된 변이를 통해 열안정성 또는 효소 활성 등의 생화학적 특성이 개선된 베타-갈락토시다제 변이체를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 베타-갈락토시다제에서, 1-798번째 아미노산을 포함하고 799 내지 1396번째 아미노산 잔기 중 어느 하나의 카르복시 말단이 절단된 변이를 포함하는 아미노산 서열을 가지는 베타-갈락토시다제 변이체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 베타-갈락토시다아제 변이체를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 베타-갈락토시다제 변이체를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-갈락토시다제 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 베타-갈락토시다제의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 베타-갈락토시다제 변이체를 락토스 함유 기질과 반응시켜 갈락토올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 갈락토올리고당을 회수하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법을 제공한다.
도 1은 베타-갈락토시다제와 그 변이체를 구성하는 아미노산 서열의 보존된 도메인을 도식화 한 것이다.
도 2는 베타-갈락토시다제와 그 변이체의 SDS-PAGE 수행 후, 코마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색한 결과이다(MW: 단백질 크기 마커, WT: 야생형, 799~1350:변이체).
도 3은 베타-갈락토시다제와 그 변이체의 SDS-PAGE 수행 후, X-gal로 염색한 결과이다(MW: 마커, WT: 야생형, 799~1350:변이체).
도4는 베타-갈락토시다제와 그 변이체의 효소활성을 측정한 결과이다(WT: 야생형, 873~1350:변이체).
도 5는 베타-갈락토시다제와 그 변이체의 oNPG와 젖당을 이용한 기질특이성을 측정한 결과이다(WT: 야생형, 873~1350: 변이체).
도 6은 베타-갈락토시다제와 그 변이체에서 생산한 탄수화물의 HPLC 분석결과이다(BgaII: 야생형, BgaII-950: 변이체).
도 7은 베타-갈락토시다제와 그 변이체의 열안정성을 측정한 결과이다(WT: 야생형, 873~1350: 변이체).
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 선행특허(대한민국 등록특허, 제1,121,161호)에서 발굴한 베타-갈락토시다제의 카르복시 말단을 절단한 변이체를 제작할 경우, 당전이 활성과 열안정성이 증가하는 것을 확인하고자 하였다.
본 발명에서는, 선행특허(대한민국 등록특허, 제1,121,161호)에서 발굴한 베타-갈락토시다제의 도메인이 도 1과 같이 다중 도메인 구조를 가지고 있는 것을 알 수 있었다. 베타-갈락토시다제의 GH2_SB, GH2와 GH2_TIM으로 이루어진 LacZ 도메인은 효소활성을 갖는 부분이다. 베타-갈락토시다제의 카르복시 말단부 쪽으로 한 개의 BIG1과 세 개의 BIG4, bacteria Ig-like 도메인을 가지고 있으며, 가장 카르복시 말단부에 discoidin 도메인이라고도 불리는 F5/8_C 도메인을 가지고 있다. 특정 구조를 가지지 않는 폴리펩타이드 사슬이 도메인 사이를 연결하고 있으며, 그 길이는 약 10, 50, 130 아미노산 잔기이다. 또한, C-말단부의 F5/8_C 도메인 뒤쪽에 구조가 없는 약 100 아미노산 잔기 폴리펩타이드 사슬이 있는 것을 확인하고, 카르복시 말단의 도메인을 순차적으로 절단하는 변이체를 제작하여 그 활성 및 열안정성을 측정하였다. 그 결과 카르복시 말단이 절단된 베타 갈락토시다제의 효소활성과 열 안정성이 증가한 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 일 실시예에서는 베타-갈락토시다제의 카르복시 말단 변이체를 제작하고, 상기 제작된 변이체의 효소활성과 열 안정성을 분석한 결과, 그 효과가 매우 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 베타-갈락토시다제에서, 카르복시 말단부가 절단된 변이를 통해 열안정성 또는 효소 활성 등의 생화학적 특성이 개선된 베타-갈락토시다제 변이체에 관한 것이다.
본 발명에서 카르복시 말단부가 절단된 변이는 서열번호 3의 아미노산 서열료 표시되는 베타-갈락토시다제의 효소활성을 저하시키지 않는 범위에서 아미노산 잔기의 카르복시 말단부가 절단된 변이를 모두 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 베타-갈락토시다제에서, 1-798번째 아미노산을 포함하고, 799 내지 1396번째 아미노산 잔기 중 어느 하나의 카르복시 말단이 절단된 변이를 포함하는 아미노산 서열을 가지는 베타-갈락토시다제 변이체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 변이는 a) 799번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; b) 873번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; c) 900번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; d) 950번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; e) 1000번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; f) 1059번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; g) 1066번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; h) 1115번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; i) 1164번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; j) 1200번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; k) 1302번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; 및 l) 1350번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; 으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 또는 26인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 베타-갈락토시다제 변이체를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 상기 베타-갈락토시다아제 변이체를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 베타-갈락토시다아제 변이체를 코딩하는 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 대장균에서 사용되는 단백질 발현 벡터로는 Novagen (미국) 사의 pET 계열; Invitrogen (미국)의 pBAD 계열; Takara (일본)의 pHCE 나 pCOLD; 제노포커스 (대한미국)의 pACE 계열; 등을 사용할 수 있다. 고초균에서는 게놈의 특정부분에 목적 유전자를 삽입하여 단백질 발현을 구현하거나, MoBiTech (독일)의 pHT 계열의 벡터, 등을 사용할 수 있다. 곰팡이나 효모에서도 게놈 삽입이나 자가복제 벡터들 이용하여 단백질 발현이 가능하다. Agrobacterium tumefaciens나 Agrobacterium rhizogenes 등의 T-DNA 시스템을 이용하여 식물용 단백질 발현 벡터를 사용할 수 있다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.
"발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
본 발명의 정의상 "실질적으로 순수한"이란 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드를 코딩하는 DAN 서열이 박테리아로부터 유래된 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
재조합 단백질을 발현하기 위한 숙주세포는 짧은 시간 내 고농도 균체 배양이 가능하고 유전자 조작이 용이하고 유전학적, 생리적 특징이 잘 밝혀져 있는 대장균 (Escherichia coli), 고초균 (Bacillus subtillis) 등과 같은 원핵세포가 널리 이용되어 왔다. 그러나, 단백질의 번역 후 수식 (post-translational modification), 분비과정 및 활성형의 3차원 구조, 단백질의 활성상태의 문제점들을 해결하기 위해 최근 단세포 진핵세포인 효모 계열 (Pichia pastoris , Saccharomyces cerevisiae , Hansenula polymorpha 등), 사상성 진균류 (filamentous fungi), 곤충세포 (insect cells), 식물세포, 포유동물세포 (mammalian cells) 등 고등생물에 이르기까지 재조합 단백질 생산의 숙주세포로 활용하고 있으므로, 실시예에서 예시된 고초균 뿐만 아니라 다른 숙주세포를 이용하는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 용이하게 적용가능하다.
본 발명은, 또 다른 관점에서, 상기 형질전환된 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제 변이체의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로, 상기 재조합 미생물을 배양하여 베타-갈락토시다제 변이체를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-갈락토시다제 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 베타-갈락토시다제 변이체의 제조방법에 관한 것이다.
상기 형질전환된 재조합 미생물의 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행되고, 배양 온도 및 시간, 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다.
상기 배양된 재조합 미생물로부터의 베타-갈락토시다제 변이체의 회수는 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.
본 발명의 일실시예에서는 형질전환된 재조합 고초균을 이용하여 재조합 베타-갈락토시다제 야생형 및 변이체를 제조하였으며, 상기 pD92 (대한민국 특허, 공개번호 10-2011-0102862) 벡터는 단백질 발현을 위해 별도의 유도제(Inducer) 첨가가 필요 없이 미생물 배양만으로 세포성장과 단백질 발현이 분리된 상태로 재조합 단백질이 가능하다. 상기 방법으로 생산된 베타-갈락토시다제 야생형 및 변이체는 SDS-PAGE로 확인결과 예측된 크기를 가지고 X-gal 염색 결과 베타-갈락토시다제의 활성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 2, 도 3).
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 수득한 재조합 베타-갈락토시다제 야생형 및 변이체를 o-니트로페닐-갈락토피라노사이드(o-Nitrophenyl-Galactopyranoside, oNPG)를 기질로 하여, 효소 활성을 측정한 결과, 베타-갈락토시다제 변이체의 활성이 야생형에 비해 뛰어난 것을 확인하였고(도 4), 젖당과 oNPG를 이용한 분해특성을 분석한 결과, 야생형에 비해 변이체가 젖당에 대한 기질특이성이 뛰어난 것을 확인하였으며(도 5), 생산한 탄수화물을 HPLC로 분석한 결과, 야생형과 변이체에서 모두 갈락토올리고당이 생산되며, 그 생산량이 야생형보다 변이체가 월등히 많은 것을 확인하였다(도 6).
본 발명의 또다른 실시예에서는, 재조합 베타-갈락토시다제 야생형 및 변이체를 최적 반응온도인 50℃ 보다 더 높은 60℃에서 1 시간 동안 열처리를 한 후, oNPG를 기질로 이용하여 잔류 효소 활성을 측정한 결과, 야생형에 비해 변이체의 잔류 효소 활성이 뛰어난 것을 확인하였다(도 7).
따라서, 본 발명은 또다른 관점에서, 상기 베타-갈락토시다제 변이체를 락토스 함유 기질과 반응시켜 갈락토올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 갈락토올리고당을 회수하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 락토스 함유 기질은 30~60%(w/v), 바람직하게는 45~55%, 가장 바람직하게는 50%농도의 락토스 용액을 의미한다. 락토스는 함량이 높아질수록 용해도가 떨어지므로, 50% 락토스 용액의 제조는 고온하에 이루어지며, 갈락토올리고당 합성 온도 또한 고농도 락토스 용액 이용시에 50℃ 이상, 바람직하게는 60 내지 70℃가 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 갈락토올리고당은 액상유, 건조분말우유, 유아 우유, 유아 조제식 (baby formula), 아이스크림, 요거트, 치즈, 유제품, 음료, 유아 식품, 시리얼, 빵, 비스켓, 제과류, 케이크, 식품보조제, 식이보충제, 프로바이오틱 식료품, 프리바이오틱 식료품, 동물 사료, 가축 사료 및 약제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 구성성분일 수 있다.
여기서, 프로바이오틱(probiotic)이란 대부분 가장 흔한 병원균이 사용하는 젖산균을 가지고 있으며 잠재적으로 이익이 있는 박테리아 또는 효모를 포함한 식이 보충제를 의미한다. 프로바이오틱스는 젖산으로 다른 탄수화물과 설탕으로 전환할 수 있기 때문에 오랫동안 식품산업에서 사용되어 왔다. 프로바이오틱스는 요구르트와 같은 발효 유제품의 신맛을 제공할 뿐만 아니라, 성장을 위해 손상된 조직을 재건하기도 하며 pH를 낮추어 부식방지제로서 작용한다. 프로바이오틱스의 가장 흔한 형태는 발효된 유제품과 프로바이오틱스가 강화된 식품이며, Kefir (우유 발효 음료), 요구르트, Sauerkraut (발효된 독일식 김치), 한국김치 등의 젖산균도 프로바이오틱스의 건강효과와 유사한 것으로 나타났다.
또한, 프리바이오틱스(prebiotics)란 결장에 있는 박테리아의 수를 한정하며 선택적으로 박테리아의 성장을 자극하여 인체에 유리한 영향을 주는 물질로 인체 내에서 소화되지 않는 소당류로 구성되어 있다. 프리바이오틱스는 항암작용, 항균작용, Hypolipidemic 및 포도당 변조를 일으키는 활동을 한다. 프리바이오틱스는 결장에 있는박테리아의 수를 한정하며 선택적으로 박테리아의 성장을 자극하여 인체에 유리한 영향을 주는 물질이며 인체 내에서 소화되지 않는 식품 구성요소로서 정의할 수 있다. 주로 소당류(oligosaccharides)이며, 프락토 올리고당(Fructo-oligosaccharides), 이눌린, Isomalto-oligosaccharides, Lactilol, 유과올리고당(Lactosucrose), 락툴로스(Lactulose), Pyrodextrins, Soy oligosaccharides, Xylo-oligosaccharides을 포함하고 있다. 이들은 주로 bifidogenic 요인으로서 불리워지며, bifidobacteria의 성장을 촉진한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험방법
대장균 균주 및 성장조건
대장균 E. coli DH5a (Enzynomics, 대한민국)를 사용하여 플라스미드를 제작하거나 분리하였다. 세균은 LB 배지에서 키웠으며, 필요에 따라 100 μg/mL ampicillin, 5 μg/mL chloramphenicol 등, 적당량의 항생제를 사용하였다.
제작한 플라스미드로 형질전환한 Bacillus subtilis DB104를 사용하여 단백질을 발현하였다. Bacillus subtilis DB104를 LB 배지에서 12 시간 배양하고, 3500 rpm 에서 10 분간 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 세포 침전물을 세포 용해 완충용액 (100 mM sodium phosphate pH 7.0, Triton X-100 1%, lysozyme 1 mg/mL, DNAseI 1 U/mL)에 풀어 상온에서 30 분간 방치하였다. 이를 13,000 rpm 에서 5 분간 원심분리하여, 세포 잔유물을 제거하였다.
DNA 관련 실험조건
DNA 절단용 제한효소를 Enzynomics (대한민국)에서 구매하여 제작자의 안내서 내용에 따라 사용하였다. ELPIS Biotech (대한민국)의 Plasmid mini-prep kit와 DNA gel purification kit를 사용하여 대장균으로부터 플라스미드를 정제하고 전기영동 후 DNA 띠를 정제하였다. Genotech (대한민국)에서 DNA 염기서열을 확인하고, 올리고 핵산을 합성하였다. DNA 농도를 확인하기 위하여 NanoDrop (Thermo Scientific, USA)를 사용하였다. DNA를 증폭하기 위하여 PCR-2000 (Bioneer, 대한민국) 기계와 pfu DNA 중합효소 (Sungenetics, 대한민국)를 사용하였다.
실시예 1: 야생형 베타-갈락토시다제 (BgaII) 단백질 발현벡터와 생산균의 제작
야생형 베타-갈락토시다제 BgaII를 Bacillus subtilis DB104에서 발현하기 위하여, Bacillus subtilis 염색체에 삽입용 플라스미드 제작하였다. pACE-BgaII (대한민국 등록특허, 제1,121,161호)를 원본으로 하고, 서열변호 1과 서열번호 2의 올리고 핵산을 프라이머로 하여 중합효소사슬반응 (PCR)을 수행하였다. PCR은 pACE-BgaII 1 ng, 10배 pfu DNA 중합효소 반응 완충용액 5 μL, pfu DNA 중합효소 5 unit, 2 mM dNTP, 50 pmol 서열번호 1 올리고 핵산, 50 pmol 서열번호 2 올리고 핵산을 혼합하여 총 50 μL로 부피로 만들었다. 94℃에서 1 분간 DNA를 변성시키고, 94℃ 30 초, 57℃ 30 초, 72℃ 4 분의 반응을 35회 진행하여 DNA를 증폭하였다. 72℃에서 7 분간 더 배양하여 반응을 종결하였다. 증폭한 DNA를 1% 한천에서 전기영동하여 약 4kb 위치에 있는 증폭한 DNA 띠를 정제하였다. Bacillus subtilis 염색체 삽입용 벡터는 cry3Aa 프로모터 변이체를 가지는 pD92 (대한민국 특허, 공개번호 10-2011-0102862)를 사용하였다. 대장균에서 분리한 pD92를 제한효소 BamHI 및 PvuII로 이중절단하고 정제하였다. 100 ng의 절단한 플라스미드와 100ng의 증폭한 DNA 단편을 2.5 U의 T4 DNA polymerase (ELPIS Biotech)를 사용하여 붙이고, 대장균 DH5a에 열충격 방법으로 넣었다. 항생제 ampicillin이 들어있는 고체 LB 에서 자라는 형질전환된 대장균 군락을 골라 5 mL의 액체 LB 배지에서 키운다음, plasmid mini-prep kit를 사용하여 플라스미를 정제하였다. 플라스미드를 제한효소 Hind III로 잘라, 맞게 나오는 플라스미드를 골라 Bacillus subtilis DB104에 자연도입법으로 집어넣었다. 항생제 chloramphenicol 5 μg/mL이 들어있는 고체 LB 배지에서 자라는 Bacillus subtilis 균군락을 1% 전분이 들어있는 고체 LB 배지에서 다시 키웠다. 전분을 1% KI와 1% I2 용액으로 전분을 염색하였을 때, 염색이 되지 않는 Bacillus subtilis 균군락을 선택하여 서열번호 3의 야생형 베타-갈락토시다제 생산균주로 사용하였다.
서열번호 1
A GGAAGAAAAG GATCC ATGAGACGAA TTAATTTTAA TG
서열번호 2
GCGACCGGCG CTCAGCTGTC ATTCTGTAAA ACGAATG
실시예 2: 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII) 단백질 발현벡터와 생산균의 제작
카르복시 말단부가 절단된 베타-갈락토시다제 변이체 단백질 발현벡터를 제작하기 위하여 pACE-BgaII (대한민국 등록특허, 제1,121,161호)를 원본으로 하고, 하기의 표 1과 같은 조합을 이용하여 벡터 및 생산균주를 제작하였다(도 1).
Figure PCTKR2016005335-appb-T000001
PCR은 pACE-BgaII 1ng, 10 배 pfu DNA 중합효소 반응 완충용액 5 μL, pfu DNA 중합효소 5unit, 2 mM dNTP, 50 pmol 서열번호 1 올리고 핵산, 50 pmol 정방향/역방향 프라이머 올리고 핵산을 혼합하여 총 50 μL로 부피로 만들었다. 94℃에서 1분간 DNA를 변성시키고, 94℃ 30 초, 57℃ 30 초, 72℃ 4 분의 반응을 35 회 진행하여 DNA를 증폭하였다. 72℃에서 7 분간 더 배양하여 반응을 종결하였다. 증폭한 DNA를 1% 한천에서 전기영동하여 증폭한 DNA 띠를 정제하였다.
Bacillus subtilis 염색체 삽입용 벡터는 cry3Aa 프로모터 변이체를 가지는 pD92(대한민국 특허, 공개번호 10-2011-0102862)를 사용하였다. 대장균에서 분리한 pD92를 BamHI과 PvuII로 이중절단하고 정제하였다. 100 ng의 절단한 플라스미드와 100 ng의 증폭한 DNA 단편을 2.5 U의 T4 DNA polymerase (ELPIS Biotech)를 사용하여 붙이고, 대장균 DH5a에 열충격 방법으로 넣었다. 항생제 ampicillin이 들어있는 고체 LB 에서 자라는 형질전환된 대장균 군락을 골라 5 mL의 액체 LB 배지에서 키운 다음, plasmid mini-prep kit를 사용하여 플라스미를 정제하였다. 제한효소 Hind III로 잘라 맞는 플라스미드를 골라 Bacillus subtilis DB104에 자연도입법으로 집어넣었다. 항생제 chloramphenicol 5 μg/mL이 들어있는 고체 LB 배지에서 자라는 Bacillus subtilis 균군락을 1% 전분이 들어있는 고체 LB 배지에서 다시 키웠다. 전분을 1% KI와 1% I2 용액으로 전분을 염색하였을 때, 염색이 되지 않는 Bacillus subtilis 균군락을 선택하여 서열번호 3의 야생형 베타-갈락토시다제 생산균주로 사용하였다.
실시예 3: 야생형 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII) 단백질 발현 및 확인
야생형 및 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제를 만드는 Bacillus subtilis DB104 균을 항생제 chloramphenicol 5 μg/mL이 들어있는 고체 LB 배지에 도말하여 37℃ 배양기에 넣어 단일 균군락으로 자라도록 하였다. 각각에서 1개의 균군락 5 mL의 액체 배지에 접종하여 37℃ 교반배양기에서 배양하였다. 항생제 chloramphenicol 5 μg/mL이 들어있는 액체 LB 배지 50 mL에 종자배양액 0.5 mL을 접종하고, 37℃ 교반배양기에 넣어 배양하였다. 배양액을 3,500 rpm에서 10 분간 원심분리하여 배양액으로부터 세포를 분리하였다. 세포 침전물을 세포 용해 완충용액 (100 mM sodium phosphate pH 7.0, Triton X-100 1%, lysozyme 1 mg/mL, DNaseI 1 U/mL)에 풀어 상온에서 30 분간 방치하였다. 이를 13,000 rpm 에서 5 분간 원심분리하여, 세포 잔유물을 제거하였다. 세포 용해액내의 단백질 조성을 확인하기 위하여, 5배 gel loading buffer와 시료를 1:4로 섞어, 5 분간 끓인 다음, 4-20% 농도구배 아크릴아마이드 gel(Bio-Rad, 미국)에서 SDS-PAGE를 수행하였다. Gel은 colloidal blue로 염색하였다. ElpisBiotech(대한민국)의 염색된 단백질 분자량 표준 물질을 사용하여, 야생형 및 C-말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII) 단백질의 상대적 크기를 확인하였다.
도 2에 개시된 바와 같이, 야생형 베타-갈라토시데이즈 II를 약 150 kD에서 두꺼운 단백질 띠로 확인할 수 있다. 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII) 단백질들, BgaII-873, BgaII-900, BgaII-950, BgaII-1000, BgaII-1059, BgaII-1066, BgaII-1115, BgaII-1064, BgaII-1200, BgaII-1302 및 BgaII-1350도 염색한 gel에서 계단 모양을 이루는 두꺼운 단백질 띠로 확인할 수 있었다. BgaII-799는 약하게 발현되는 것을 확인하였다.
Colloidal blue로 염색한 gel에서 두꺼운 단백질 띠가 야생형 및 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII) 단백질임을 다시 확인하기 위하여, SDS-PAGE 후 단백질 gel을 베타-갈락토시다제의 발색 시약인 x-gal 용액(Sigma Alrich, 미국)에 담가 반응시켰다. 세포 용해액을 0.5% sodium dodecyl sulfate를 함유하는 gel loading buffer와 4:1의 비율로 섞은 다음, 4-20% 농도구배 아크릴아마이드 gel (Bio-Rad, 미국)에서 SDS-PAGE를 수행하였다. 전기영동은 50 V에서 실시하여, 열 발생으로 인한 단백질 변성을 최소화하였다. 전기영동이 끝나고 gel을 생리식염수로 3회 세척한 다음, 1 mg/mL x-gal을 함유하는 생리식염수에서 베타-갈락토시다제의 반응을 진행하여 단백질 전기영동 gel 상에 효소반응 산물인 청색 띠를 만들었다.
도 3에 개시된 바와 같이, C-말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII) 단백질들, BgaII-873, BgaII-900, BgaII-950, BgaII-1000, BgaII-1059, BgaII-1066, BgaII-1115, BgaII-1064, BgaII-1200, BgaII-1302, BgaII-1350 및 야생형 베타-갈락토시다제는 낮은 곳부터 높은 곳으로의 계단 모양을 이루는 청색 띠로 확인할 수 있었다. BgaII-799의 세포 용해액 시료에서는 희미한 청색띠를 확인할 수 있었다.
실시예 4: 야생형 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII) 단백질의 활성 측정 ― oNPG 방법
활성측정 실험 10분전에 1 mM o-nitrophenol galactopyranoside (oNPG)를 함유하는 100 mM Phosphate acetate 완충용액 1.5 mL이 들어있는 시험관을 50℃ 수조에 꽂아 미리 데웠다. 여기에 50 μL 시료를 첨가하여, 10 분간 반응을 진행시켰다. 다시 10% sodium carbonate를 첨가하여 반응을 종료하고, 상온에 방치하여 식혔다. 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 여러 농도의 o-nitrophenol용액을 만들어 농도표준 곡선을 그리고, 이 그래프의 기울기를 이용하여, 베타-갈락토시다제 반응 산물의 농도를 구하였다. 베타-갈락토시다제 1 U는 1분간 1 μmol의 o-nitrophenol을 만드는 활성으로 정의하였다.
야생형 및 카르복시-말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제의 생산성을 확인하기 위하여, LB 배지에서 베타-갈락토시다제 생산균주의 세포양과 효소 활성을 측정하였다. Bacillus subtilis DB104 균을 항생제 chloramphenicol 5 μg/mL이 들어있는 고체 LB 배지에 도말하여 37℃ 배양기에 넣어 단일 균군락으로 자라도록 하였다. 각각에서 1개의 균군락 5 mL의 액체 배지에 접종하여 37℃ 교반배양기에서 배양하였다. 항생제 chloramphenicol 5 μg/mL이 들어있는 액체 LB 배지 50 mL에 종자배양액 0.5 mL을 접종하고, 37℃ 교반배양기에 넣어 배양하였다. 배양액을 취하여 10배 희석한 다음 광파장 600 nm에서 흡광도를 측정하여 세포양을 구하였다. 배양액을 3,500 rpm에서 10 분간 원심분리하여 배양액으로부터 세포를 분리하였다. 세포 침전물을 세포 용해 완충용액 (100 mM sodium phosphate pH 7.0, Triton X-100 1%, lysozyme 1 mg/mL, DNaseI 1 U/mL)에 풀어 상온에서 30분간 방치하였다. 이를 13,000 rpm 에서 5 분간 원심분리하여, 세포 잔유물을 제거하였다. 상층액에 있는 베타-갈락토시다제의 활성을 oNPG 방법으로 측정하여 U/mL의 비활성을 구한 다음, 세포양에 해당하는 흡광도로 나누어 U/mL/OD를 계산하였다.
도 4에 개시된 바와 같이, BgaII-1066, BgaII-1200, BgaII-1302 및 야생형 베타-갈락토시다제는 효소 생산성이 약 4 U/mL/OD로 비슷하였다. BgaII-900은 야생형 베타-갈락토시다제 보다 약 10% 적은 생산성을 보였다. 야생형 베타-갈락토시다제에 비하여 BgaII-870, BgaII-950, BgaII-950, BgaII-1000, BgaII-1059, BgaII-1115, BgaII-1064 및 BgaII-1305는 약 20% 정도 더 많은 베타-갈락토시다제 활성이 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 5: 야생형 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII) 단백질의 기질 특이성 측정
먼저, 베타-갈락토시다제가 젖당을 분해할 때 생성되는 포도당의 농도를 측정하여 젖당 분해활성을 결정하였다. 1 분간 1 μmol의 포도당을 만드는 활성을 1 U로 정의하였다.
완충용액 100 mM Phosphate acetate로 5% 젖당용액을 만들었다. 젖당 용액 1.5 mL이 들어있는 시험관을 50℃ 수조에 꽂아 미리 데웠다. 여기에 50 μL 시료를 첨가하여, 10 분간 반응을 진행시켰다. 시험관을 끓는 물에 5 분간 담가, 효소반응을 멈추었다. 용액내의 포도당 농도를 측정하기 위하여, 포도당 측정 반응용액 50 μL를 포도당 측정용액 50 μL과 섞어, 1 시간 동안 37℃ 배양기에 넣었다. 포도당 측정 반응용액은 glucose oxidase, dianisidine, hydrogen peroxidase를 100 mM potassium phosphate 완충용액 pH 6.0에 혼합하여 제조하였다. 10 N 황산 용액 100 μL을 첨가하여 반응을 멈췄다. 광파장 540 nm에서 포도당 측정 반응용액의 흡광도를 측정하였다. 여러 농도의 포도당 용액으로 만든 농도표준 곡선의 기울기로부터, 베타-갈라토시데이즈의 젖당 분해 반응에서 생성된 포도당의 농도를 계산하였다.
그 뒤, 야생형 및 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제의 기질 특이성을 확인하기 위하여, 실시예 4와 상기의 방법으로 젖당과 oNPG 두 효소기질에 대한 비활성을 측정하고, 그 값을 나누어 기질 특이성을 계산하였다.
도 5에 개시된 바와 같이, 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제, BgaII-873, BgaII-900, BgaII-950, BgaII-1000, BgaII-1059, BgaII-1066, BgaII-1115, BgaII-1064, BgaII-1200, BgaII-1302 및 BgaII-1350모두 야생형 BgaII 보다 높은 값을 보여, oNPG 보다 젖당을 효소기질로 더 잘 사용함을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 야생형 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII) 단백질의 갈락토올리고당 합성능 측정
야생형 및 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제는 젖당으로부터 갈락토올리고당을 합성할 수 있다. Potassium phosphate 완충용액 100 mM에 50%의 젖당용액을 만들고, 젖당 1g 당 2 U의 베타-갈락토시다제를 첨가하여, 50℃에서 24 시간 동안 갈락토올리고당 합성 반응을 수행하였다. 반응 용액을 끓는 물에 5 분간 처리하여 효소 반응을 멈추었다. 시료에 들어있는 탄수화물을 Shepadex 칼럼(BioRad, USA)과 HPLC(Agilent, Germany)을 이용하여 정량분석 하였다. 용출 용액은 0.1% 황산용액을 사용하였으며, 굴절계수기를 이용하여 탄수화물을 감지하였다.
도 6에 개시된 바와 같이, 야생형 베타-갈락토시다제 (BgaII)와 950 번째 아미노산 잔기 뒤의 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII-950)의 HPLC 분석결과, BgaII-950은 같은 시간 동안 야생형 베타-갈락토시다제 보다 더 많은 포도당을 생산하는 것을 확인할 수 있었으며, BgaII-950이 다섯 개의 육탄당으로 이루어진 갈락토올리고당, GOS5도 야생형 베타-갈락토시다제 보다 더 많이 만드는 것을 확인하였다.
실시예 7: 야생형 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII) 단백질의 열안정성 측정
베타-갈락토시다제 (BgaII)의 갈락토올리고당 합성 반응은 50℃의 다소 높은 온도에서 진행된다. 따라서 효소의 열안정성은 효소의 산업적 이용에 중요한 특성이다. 야생형과 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII) 단백질들, BgaII, BgaII-873, BgaII-900, BgaII-950, BgaII-1000, BgaII-1059, BgaII-1066, BgaII-1115, BgaII-1064, BgaII-1200, BgaII-1302 및 BgaII-1350의 열안정성을 확인하기 위하여, 60℃의 수조에서 1 시간 동안 열처리를 하고, oNPG를 효소 기질로 이용하여 잔류 효소 활성을 측정하였다. 잔류 효소 활성 정도는 열처리를 하지 않은 베타-갈락토시다제와 열처리 한 베타-갈락토시다제의 효소 활성 비율로 표시하였다.
도 7에 개시된 바와 같이, 야생형 베타-갈락토시다제는 1시간 동안의 열처리로 인해 약 70%의 효소 활성을 잃은데 비해, 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII) 단백질들, BgaII-873, BgaII-900, BgaII-950, BgaII-1000, BgaII-1059, BgaII-1066, BgaII-1115, BgaII-1064, BgaII-1200, BgaII-1302 및 BgaII-1350은 60% 이상의 효소 활성을 가지고 있어, 야생형 베타-갈락토시다제 보다 열안정성이 우수함을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 베타-갈락토시다제 변이체를 이용하면, 갈락토올리고당을 효율적으로 대량 생산할 수 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (11)

  1. 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 베타-갈락토시다제에서,
    카르복시 말단부가 절단된 변이를 통해 열안정성 또는 효소 활성 등의 생화학적 특성이 개선된 베타-갈락토시다제 변이체.
  2. 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 베타-갈락토시다제에서,
    1-798번째 아미노산을 포함하고 799 내지 1396번째 아미노산 잔기 중 어느 하나의 카르복시 말단이 절단된 변이를 포함하는 아미노산 서열을 가지는 베타-갈락토시다제 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 변이는,
    a) 799번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단;
    b) 873번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단;
    c) 900번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단;
    d) 950번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단;
    e) 1000번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단;
    f) 1059번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단;
    g) 1066번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단;
    h) 1115번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단;
    i) 1164번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단;
    j) 1200번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단;
    k) 1302번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; 및
    l) 1350번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단;
    으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타-갈락토시다제 변이체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 또는 26인 것을 특징으로 하는 베타-갈락토시다제 변이체.
  5. 제1항의 베타-갈락토시다제 변이체를 코딩하는 유전자.
  6. 제5항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  7. 제5항의 유전자 또는 제6항의 재조합 벡터가 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 숙주세포는 고초균인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  9. 제7항의 재조합 미생물을 배양하여 베타-갈락토시다제를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-갈락토시다제 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 베타-갈락토시다제의 제조방법.
  10. 제1항의 베타-갈락토시다제 변이체를 락토스 함유 기질과 반응시켜 갈락토올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 갈락토올리고당을 회수하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 갈락토올리고당은 액상유, 건조분말우유, 유아 우유, 유아 조제식 (baby formula), 아이스크림, 요거트, 치즈, 유제품, 음료, 유아 식품, 시리얼, 빵, 비스켓, 제과류, 케이크, 식품보조제, 식이보충제, 프로바이오틱 식료품, 프리바이오틱 식료품, 동물 사료, 가축 사료 및 약제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 구성성분인 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조방법.
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