JP5199995B2 - ガラクトース転移活性を有するβ−ガラクトシダーゼ - Google Patents

Description

本発明は、ラクトースをガラクトオリゴ糖混合物へと変換することが可能な、ガラクトース転移活性を有する新規なβ−ガラクトシダーゼに関する。特に、本発明は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）の最近発見された系統株から単離されたβ−ガラクトシダーゼに関する。

本発明は特に、単離された新規β−ガラクトシダーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列、このようなＤＮＡ配列にコードされる酵素、及び前記ＤＮＡ配列または前記ＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターを含む宿主細胞に関する。また、本発明は、ガラクトオリゴ糖を生産するための、ＤＮＡ配列にコードされた酵素、またはＤＮＡ配列もしくは組換えベクターを含む宿主細胞の使用に関する。

ビフィズス菌は、天然状態では下部消化管にコロニーを形成し、そこは、宿主及び上部消化管に存在する微生物が単糖及び二糖を優先的に消費するため、単糖及び二糖が少ない環境である。下部腸管で生存するために、ビフィズス菌は、細胞表面結合型、及び／又は細胞外型の種々のエキソグリコシダーゼ及びエンドグリコシダーゼを生産し、これによって、多様な炭水化物を利用することができる。

加水分解酵素活性に加え、ビフィズス菌由来のいくつかの酵素は、トランスフェラーゼ活性も示す。グリコシダーゼのこの糖鎖転移活性は、種々のオリゴ糖の酵素合成に広範囲に使用されており、該オリゴ糖がビフィズス菌増殖促進因子として作用することが証明されている。

ビフィズス菌類は、ラクトースの細菌代謝に関与するβ−ガラクトシダーゼ酵素を作り出すことが知られている。Ｍφｌｌｅｒ、 Ｐ．Ｌ．らは、Ａｐｐｌ＆Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．、（２００１）、６２、（５）、２２７６〜２２８３において、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの一系統株由来の３種類のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の単離と特性決定について記載している。彼らは、これら３種類のβ−ガラクトシダーゼ全てが、ガラクトース転移によって、β結合したガラクトオリゴ糖の形成を触媒できることを見出した。

Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒらは、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１、（１９９０）、１１５−１２３において、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＤＳＭ ２０４５６によるラクトース加水分解におけるガラクトース転移反応によるβ結合したオリゴ糖の形成について記載した。産生されたオリゴ糖混合物の構造についての分析により、β−（１→３）、β−（１→６）及びβ−（１→４）−Ｄ−ガラクトシル結合であることが示された。Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒは、ビフィドバクテリウム・ビフィダムによって産生される化合物が、大腸における細菌の接着に関与していることを示唆した。

ＷＯ０１／９０３１７は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム由来の新規なβ−ガラクトシダーゼ、特にガラクトース転移活性を有する該酵素の短縮型について記載している。

ラクトースをガラクトオリゴ糖の新規混合物へと変換するガラクトシダーゼ酵素活性を産生できるビフィドバクテリウム・ビフィダムの一系統株が発見され、該混合物は、予期せぬことに、ガラビオース（Ｇａｌ（α１−６）−Ｇａｌ）等の二糖類を最大３５％まで含む。該二糖は、志賀毒素のような毒素や大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの病原体が腸壁へ接着することを防ぎ得る、接着防止剤として知られている（Ｐａｔｏｎ、Ｊ Ｃ ａｎｄ Ｐａｔｏｎ、Ａ Ｗ（１９９８）、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｓ．、１１、４５０〜４７９；Ｃａｒｌｓｓｏｎ、Ｋ Ａ（１９８９）、Ａｎｎ．Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５８、３０９〜３５０を参照）。

前記Ｂ．ビフィダム株は、２００３年３月３１日に、受託番号ＮＣＩＭＢ ４１１７１として、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ＆Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ（アバディーン、英国）に寄託されている。該株については、英国特許第２ ４１２ ３８０号にも記載されている。

このたび、該Ｂ．ビフィダム株が、新規なβ−ガラクトシダーゼを含む、数種類のβ−ガラクトシダーゼを産生することが発見された。この酵素は、β結合した数多くの異なるオリゴ糖を作り出す。
国際出願公開第０１／９０３１７号パンフレット 英国特許第２ ４１２ ３８０号明細書 Ｍφｌｌｅｒ、 Ｐ．Ｌ．他、Ａｐｐｌ＆Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．、（２００１)、６２、（５）、２２７６〜２２８３ Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒ他、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、 ２０１、（１９９０）、 １１５−１２３ Ｐａｔｏｎ、 Ｊ Ｃ ａｎｄ Ｐａｔｏｎ、Ａ Ｗ（１９９８）、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｓ．、１１、４５０〜４７９ Ｃａｒｌｓｓｏｎ、Ｋ Ａ（１９８９）、Ａｎｎ．Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５８、３０９〜３５０

本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、または該タンパク質をコードする該ＤＮＡ配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を提供する。該ＤＮＡ配列は、配列番号１に示される配列であるか、あるいはその断片もしくは縮重配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）を含むものでもよい。

「縮重配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）」という用語は、配列番号１に対して少なくとも５０％の相同性、好ましくは、５０〜９８％の相同性、最も好ましくは７５〜９５％の相同性を示すＤＮＡ配列を意味するものとして解釈される。

このようなＤＮＡ配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列に、６０％未満、好ましくは４５％未満、より好ましくは２５％未満の変化を生じさせるような、ヌクレオチドの置換、付加または欠失を含んでいてもよい。ヌクレオチドの置換は保存的アミノ酸置換を引き起こしてもよい。

本発明の第２の態様によれば、上記ＤＮＡ配列によりコードされる酵素が提供される。該酵素は、配列番号２に示すアミノ酸配列またはその断片を含んでいてもよい。

本発明の第３の態様によれば、上記ＤＮＡ配列を含む組換えベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。該ベクターは、細菌、酵母または真菌細胞等の宿主細胞内に取り込まれてもよい。もしくは、該ＤＮＡ配列が、このような宿主細胞内に取り込まれてもよい。適切な宿主細胞は、ビフィドバクテリウム属、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ）又はバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）等のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）等のアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）から成る群から選択され得る。

上記ＤＮＡ配列によりコードされる酵素は、ラクトースを基質として用いて、Ｇａｌ（β１−３）Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）Ｇａｌ、Ｇａｌ（β１−６）Ｇａｌ及びＧａｌ（α１−６）Ｇａｌのような二糖、及び、Ｇａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ、及びＧａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃのような三糖及び四糖、を含むオリゴ糖混合物を産生する。

上記の酵素または宿主細胞は、腸内の健康を向上するための製品の一部を構成しうる、ガラクトオリゴ糖混合物の産生に用いることができる。このような製品は、乳製品（例えば、液乳、全脂粉乳、脱脂粉乳、脂肪補充粉乳（ｆａｔ ｆｉｌｌｅｄ ｍｉｌｋ ｐｏｗｄｅｒ）、ホエイパウダー等の乾燥粉乳、乳幼児用ミルク、粉ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品等）、フルーツジュース等の飲料、乳児食、シリアル、パン、ビスケット、菓子類、ケーキ、食品サプリメント、栄養サプリメント、動物飼料、家禽飼料または他のあらゆる食料もしくは飲料から選択され得る。上記製品中にガラクトオリゴ糖が存在することは、該製品中、もしくは該製品の摂取後の消費者の腸内腸内細菌叢中、もしくはそれら両方において、健康増進性ビフィドバクテリウム属の増殖を促進するという利点を有する。

もしくは、産生されたオリゴ糖を、病原体または病原体によって生産される毒素の腸壁への接着を防ぐための、錠剤またはカプセルの形態を有する薬剤の調製に用いることもできる。このような薬剤は、例えば、しばしば通常の健康な腸内細菌叢を変化もしくは破壊してしまう場合がある一連の抗生物質療法に続いて、患者に投与される。

本発明の更なる態様によれば、上記酵素を発現させる条件下で、上記宿主細胞を適切な培養培地中で培養すること、および、該培養で産生された酵素あるいは酵素産物を該培養物から回収することを含む、該酵素の製造方法が提供される。

本発明は、ガラクトオリゴ糖混合物を形成させる条件下で、上記酵素または上記宿主細胞をラクトース含有物質と接触させることを含む、ガラクトオリゴ糖混合物の製造方法にも関する。

適切なラクトース含有物質は、市販のラクトース、全乳、セミスキムミルク、スキムミルク、ホエイミルク、脂肪補充乳（ｆａｔ ｆｉｌｌｅｄ ｍｉｌｋ）、ホエイ透過物から選択することができる。このような乳製品は、乳牛、水牛、ヒツジまたはヤギから得ることができる。脂肪補充乳は、全乳を脱脂して乳脂肪を取り除き、次いで、乳脂肪の代わりに植物脂肪または植物油を添加したものとして定義される。

ゲノムＤＮＡは、Ｌａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｆｅｍｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔｅｒｒｓ、６５、（１−２）、４１〜４５に記載の方法を用いて前記ビフィドバクテリウム・ビフィダム株（ＮＣＩＭＢ ４１１７１）から単離した。ＤＮＡを制限酵素で処理し、最長で１５ ｋｂｐのサイズを有する断片を、同一の制限酵素で処理したｐＳＰ７２ベクターにライゲーションした。ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで処理したＢ．ビフィダム由来の染色体ＤＮＡから成るインサートを含むベクターを用いて、大腸菌細胞を形質転換した。β−ガラクトシダーゼ活性を有するクローンは、ｐ−ニトロフェニル、Ｘ−β−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）及びイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉアガープレート上でセレクションされた。ＰｓｔＩ処理した染色体ＤＮＡを含むライゲーションミックスからは、１３個のβ−ガラクトシダーゼ陽性クローンが得られ、これらのうち１つをｐＰ２とした。

ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖ．３．０ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いて、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシチェーンターミネーション法（Ｒｕｓｓｅｌ Ｐ．、２００２ ｉＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｐｅａｒｓｏｎ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１８７〜１８９）により、挿入したＤＮＡ断片Ｐ２のＤＮＡ配列決定を行った。Ｐ２のＤＮＡ配列を図１に示す（配列番号１）。

オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＯＲＦ ｆｉｎｄｅｒを用いて位置を特定した。図１に示されるヌクレオチド配列を、可能な６種類の全てのリーディングフレームについて翻訳し、β−ガラクトシダーゼと推定される配列をコードする７３８残基のアミノ酸からなる１種類のオープンリーディングフレームを同定した。翻訳配列を図２に示す（配列番号２）。

以下の実施例を参照し、本発明を更に説明する。

実施例１
材料及び方法
本試験において使用した全ての試薬および培地はＳｉｇｍａ（ドーセット、英国）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ペーズリー、英国）、Ｏｘｏｉｄ（ベージングストーク、英国）、Ｑｉａｇｅｎ（ウェストサセックス、英国）及びＰｒｏｍｅｇａ（サウサンプトン、英国）から入手した。

菌株
ビフィドバクテリウム・ビフィダム株（ＮＣＩＭＢ ４１１７１）は、Ｍｉｃｒｏｂａｎｋチューブ中の低温ビーズ上で−７０℃にて維持した。後の実験のため、該株を、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ Ｃｈａｌｇｒｅｎ（ＷＣ）アガー（Ｏｘｏｉｄ、英国）及びＴＰＹ培地（トリプチケースファイトン酵母エキス培地）上で回復させ、嫌気的条件下（ＣＯ₂およびＮ₂がそれぞれ８０％および２０％）にて３７℃で４８時間増殖させた。グラム染色によりコロニーの形態、およびコンタミネーションがないことを確認した。

大腸菌株
本試験で用いた大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ株は、常法に従い、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）アガーまたはＬＢブロス中で３７℃の好気的条件下でインキュベートし（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｗ．Ｄ．（２００１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、必要な場合には、抗生物質（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び／または１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール）及び４０μｌの２％ Ｘ−β−Ｇａｌ、７μｌの２０％ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を、事前に作製した９０ｍｍアガープレート表面上に塗付することにより補充した。

大腸菌ＤＨ５ａ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ペイズリー、英国）（遺伝子型：Ｆ^- φ８０ｌａｃＺΔＭΔ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒ_k ^-、 ｍ_k ^-）ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４ ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１λ^-）は、α−ガラクトシダーゼ陽性株であり、発現実験及びその他の遺伝子操作に用いた。

ビフィドバクテリウム・ビフィダムからのゲノムＤＮＡ抽出
以下の方法により、ビフィドバクテリウム・ビフィダム株（ＮＣＩＭＢ ４１１７１）からゲノムＤＮＡを単離した。当該方法において、染色体ＤＮＡは、１００ｍｌのＷＣ嫌気性菌培養液から回収した細胞ペレットより調製した。細胞を１０ｍｌのＴＥＳバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）に再懸濁し、２００μｌのリゾチーム／ムタノリシン混合液（４：１、リゾチーム１０ ｍｇ／ｍｌ、ムタノリシン１ ｍｇ／ｍｌ）で３７℃にて３０分間処理した。次いで、該細胞を、２００μｌのプロテイナーゼＫ（２０ ｍｇ／ｍｌ）および２００μｌのＲＮａｓｅ（いずれも１０ ｍｇ／ｍｌ）で処理し、６５℃で１時間インキュベートした。最後に該細胞を、２ｍｌの１０％ＳＤＳで処理して、６５℃で１５分間インキュベートした。１２ｍｌのフェノール／クロロホルムを添加し、水相が中間相から容易に分離できるようになるまで抽出を繰り返した。イソプロパノールを用いてゲノムＤＮＡを沈殿させ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）に再懸濁した。次いで、該ゲノムＤＮＡを制限酵素で処理し、同一の酵素で処理しアルカリホスファターゼ処理を施したｐＳＰ７２にライゲーションした。Ｂ．ビフィダムのゲノムＤＮＡの制限酵素処理は、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ及びＫｐｎＩを用いて行った。ライゲーションミックスを用いて大腸菌 ＤＨ５ａを形質転換し、β−ガラクトシダーゼ陽性クローンを、Ｘ−Ｇａｌ含有プレート上の青色のコロニーとして同定した。

ベクターＤＮＡの調製
本試験において、クローニングと発現にはｐＳＰ７２ベクターを用いた（Ｐｒｏｍｅｇａ、英国）（Ｋｒｉｅｇ、Ｐ．Ａ．ａｎｄ Ｍｅｌｔｏｎ、 Ｄ．Ａ．（１９８７）． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ＳＰ６ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１５５：３９７−４１５）。

ｐＳＰ７２には、β−ガラクトシダーゼのα断片がコードされておらず、これを補完する活性が欠けていることから、該ベクターが選択された。該ベクターは、β−ガラクトシダーゼの調節配列および最初の１４６残基のアミノ酸のコーディング情報を含む大腸菌ＤＮＡの短いセグメントを保持していない。該セグメントは、β−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端部分を発現する大腸菌株（即ち、ＤＨ５ａ）と組み合わせた場合に活性なβ−ガラクトシダーゼを生じさせる（α相補）。

上記ベクターは、以下の制限酵素を用いて処理した：ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ。製造元の説明書に従い、ＤＮＡに対して１０倍過剰量の酵素を用いた（酵素のユニット数：ＤＮＡのμｇは、プラスミドＤＮＡ１μｇあたり酵素１０ユニット、すなわち、プラスミドＤＮＡ０．５ｐｍｏｌあたり酵素１０ユニットである）。酵素を熱で不活性化（６５℃で２０分間）した後に、水平ゲル電気泳動解析により制限酵素処理パターンを解析した。ゲル中の単一断片の存在は、ベクターの完全消化、及びベクターの制限酵素消化が一箇所で起こったことを示した。

ベクターの制限酵素処理が十分であることは、ライゲーションを行っていない分子で大腸菌ＤＨ５ａのコンピテント細胞を形質転換することによってもテストした。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢアガープレート上に形成されたコロニー数は、未消化分子及び後の実験において予想されるバックグラウンドの指標である。

更に、仔牛腸管アルカリホスファターゼＣＩＡＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ、サウザンプトン、英国）を製造元の説明書に従って用いてベクターを脱リン酸化した。処理の効率は、ライゲーション（バクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼを製造元の説明書に従って用いた）後に、ＤＨ５ａ細胞を形質転換することにより試験した。形成されたコロニーの数は、再び環状化された分子（非クローン化ベクター）の数を示すので、ＣＩＡＰによるベクター処理無しで形成されたコロニーの数から上記の数を引くと脱リン酸化されていないベクターの数が示される。

ゲノムＤＮＡライブラリーの構築
原核生物のＤＮＡ内に高頻度に現れる６個のヌクレオチドから成る配列を認識する６種類の制限酵素を用いて、ゲノムＤＮＡを部分的に消化した。ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩは、それぞれ５’Ｇ／ＡＡＴＴＣ’３、５’Ｇ／ＧＡＴＣＣ’３、５’ＣＴＧＣＡ／Ｇ’３ 、５’ＧＧＴＡＣ／Ｃ３’、５’ＣＣＣ／ＧＧＧ３’及び５’Ａ／ＡＧＣＴＴ３’の配列を特異的に認識するタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼであり、これらの配列内で２本鎖を切断し、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩについては、それぞれ、４個のヌクレオチドＡＡＴＴ、ＧＡＴＣ、ＡＧＣＴから成る５’突出を生じさせ、ＰｓｔＩ及びＫｐｎＩは、それぞれＡＣＧＴ、ＧＴＡＣから成る３’突出を生じさせ、ＳｍａＩは、平滑末端を生じさせる。

これらの酵素は、全て、２価のマグネシウムイオンの存在下でのみ活性を有しており、ＤＮＡを切断することができる。これらのイオンは、唯一必要とされる補因子であった。

ＤＮＡの制限酵素処理
ゲノムＤＮＡサンプルの制限酵素処理は全てを３７℃で２時間インキュベートし、最後に６５℃で２０分間インキュベートして熱により不活性化させた。次いで、反応物を室温にて冷まし、適当量のローディングバッファーを加え、密封ガラスキャピラリーを用いて穏やかに混和した。次いで、この溶液を０．８％アガロースゲルのウェルにローディングし（４〜５ボルト／ｃｍの電力供給で１４〜１６時間）、消化したＤＮＡのサイズを、１ｋｂｐのＤＮＡスタンダード（Ｐｒｏｍｅｇａ、英国）のサイズを用いて推計した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００２））。

制限酵素処理後に生じた断片の精製
前記反応混合物及びアガロースゲルからの断片の精製は、Ｑｉａｇｅｎ製（ウェストサセックス、英国）のＱＩＡＥＸ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて行った。プロトコルは、製造元のマニュアルに詳細に記載されている。

ＤＮＡのライゲーション及び形質転換
Ｑｉａｅｘ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を精製した後、これらの断片をＣＩＡＰ処理したｐＳＰ７２ベクターにライゲーションした。ライゲーションの際には、表１に示すように、適切量のＤＮＡを滅菌した０.５ ｍｌマイクロチューブに移した。

表１：ライゲーション混合物。チューブＡは、セルフライゲーションを起こしたベクターＤＮＡの数を表し、この数を、形質転換後の形質転換体の総数から引かなければならない。チューブＢは、ＤＮＡ断片とのベクターのライゲーションを表し、チューブＣは、形質転換効率を計算するための対照区を表す。

各ライゲーションの前に、断片精製過程で再アニーリングした粘着末端を融解するために、ＤＮＡ断片を４５℃で５分間温めた。全てのライゲーション反応において、ベクター：インサートＤＮＡモル比を１：１とし、反応アセンブリは、Ｐｒｏｍｅｇａの説明書に従って行った。

チューブＡおよびＢに、１．０μｌの１０×ライゲーションバッファーと０．５ ＷｅｉｓｓユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、英国）を添加し、分子生物学用グレード水でライゲーション体積を１０μｌに調節した。チューブＣには１．０μｌの１０×ライゲーションバッファーを添加し、分子生物学グレードの水でライゲーション体積を１０μｌに調節した。

水と共にＤＮＡ断片をチューブに加え、次いで、調製過程で再アニーリングした粘着末端を融解するために、ＤＮＡ断片を４５℃で５分間温めた。残りのライゲーション試薬を添加する前に、該ＤＮＡを０℃に冷却し、その後、反応混合液を１６℃で一晩インキュベートした（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、２００１）。

（形質転換効率を低下させる原因となるライゲーション混合物を取り除くため）ライゲーションした断片のエタノール沈殿および精製を行った後、Ｈａｎａｈａｎの説明書に従って形質転換を行った。５μｌ中に約５０ｎｇのラーゲーションされたＤＮＡを含む溶液を１００μｌの大腸菌ＤＨ５ａコンピテント細胞に加えた。熱処理およびアンピシリン耐性遺伝子を発現させた後に、細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、Ｘ−β−Ｇａｌ（４０μｌの２％ Ｘ−β−Ｇａｌ）及びＩＰＴＧ（７μｌの２０％ ＩＰＴＧ）を含むＬＢプレート表面に播種した。

各ライゲーション反応系による形質転換体の数を測定した。チューブＣから通常得られる形質転換体の数は、２×１０⁵〜１×１０⁶ｃｆｕ／μｇであり、一方でチューブＡから通常得られる形質転換体の数は、５００〜６００ｃｆｕ／μｇであった。チューブＡにおける形質転換体の数は、ベクターＤＮＡの効率的な処理を示すものであった。チューブＢでの形質転換体の数は、２〜４×１０⁴ｃｆｕ／μｇの範囲内にあった。

形質転換体の数
ＰｓｔＩ処理した染色体ＤＮＡのライゲーション混合液からは、スクリーニングを行った約２５００個の形質転換体の中から１３個のβ−ガラクトシダーゼ陽性クローンが得られ、ＢａｍＨＩ処理の場合には（スクリーニングを行った約１５００個の形質転換体の中から）７個の陽性クローン、ＥｃｏＲＩの場合には（スクリーニングを行った約１３００個の形質転換体の中から）３個の陽性クローン、ＫｐｎＩの場合には（スクリーニングを行った約２０００個の形質転換体の中から）７個の陽性クローン、ＳｍａＩの場合には（スクリーニングを行った約１６００個の形質転換体の中から）３個の陽性クローン、そしてＨｉｎｄＩＩＩの場合には（スクリーニングを行った約１２００個の形質転換体の中から）２個の陽性クローンが得られた。

陽性クローンの制限酵素処理
異なる種類のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を同定するため、以下の表に従って、陽性クローンから単離したプラスミドを消化した。

消化後に生じた断片のゲル電気泳動解析により、ｐＢ１、ｐＰ１、ｐＰ２及びｐＰ１１の各プラスミドが、異なるβ−ガラクトシダーゼをコードするインサートを有していることが示された。Ｐ２を含むクローンを更なる解析に用いた。

ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列決定は、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ．３．０ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いて、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシチェーンターミネーション法により行い、キャピラリー電気泳動が組み込まれた、蛍光に基づくＤＮＡ解析システムであるＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００を用いて解析を行った。

インサートされたＤＮＡ断片の５’末端及び３’末端は、ベクターに特異的なプライマーを用いて配列決定された。インサートは、Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｉｍｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＰＳ−１）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、英国）を用いて更に配列決定された。ＧＰＳ−１は、ＴＮ７トランスポゾンに基づくｉｎ ｖｉｔｒｏシステムであり、ＴｎｓＡＢＣトランスポゼースを用いて、ＤＮＡ標的内にランダムにトランスポゾンを挿入する。製造元の説明書に従い、ドナー：標的ＤＮＡを１：４の質量比で用いた。標的プラスミドにトランスプライマーを挿入した後に配列決定用に単離されたプラスミドの数は、２５個であった。この数は、製造元の説明書に従って計算したものであり、５倍のカバー率であると推測される。

Ｐ２タンパク質がコードされているｐＰ２プラスミドのヌクレオチド配列が長いので、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含んでいる部分だけを選択して配列決定した。配列決定された断片の１７２ｂｐの相対的位置にトランスポゼースが挿入されることより、酵素が不活性化したことから、開始コドンがこの位置の上流に存在することが示唆された。同様に、２８８２ｂｐの位置への挿入により酵素活性が完全に失われたことから、終止コドンがこの位置より下流にあることを示唆された。更に、配列が読まれた最初のヌクレオチドから２６２ｂｐ、３３１ｂｐ、３７５ｂｐ、６２１ｂｐ、８６６ｂｐ、１３４８ｂｐ、１３５８ｂｐ、１３９４ｂｐ、１５１３ｂｐ、１７０４ｂｐ、２１２８ｂｐ、２５１９ｂｐの位置への挿入によっても、完全に酵素活性が失われた。

Ｎ末端ドメインをＳｉｇｎａｌＩＰ及びＰＳＰＯＲＴソフトウエアで解析したが、シグナルペプチドは示されず、Ｐ２は細胞外に分泌されないことが示唆された。

配列決定反応混合液は、約４００〜６００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、３．２ｐｍｏｌのプライマー溶液及び４μｌのＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ溶液を含む。

オープンリーディングフレームの同定
Ｐ２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の位置は、ＮＣＢＩ（ウェブアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌ）のＯＲＦ ｆｉｎｄｅｒを用いて特定された。細菌の遺伝暗号を用い、フレームの長さを１００ｂｐと定めた。ヌクレオチド配列を、可能な６種類のフレーム全てについて翻訳し、β−ガラクトシダーゼと推定される配列をコードする７３８個のアミノ酸から成るオープンリーディングフレームを同定した（翻訳結果を図２に示す）。

実施例２
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１から単離してクローニングしたβ−ガラクトシダーゼ酵素を用いた、大腸菌宿主（ＤＨ５ａ株）内における合成
他に記載のない限り、以下に記載する合成は、細胞透過性を増加させ、その細胞膜を破壊することにより細胞を生存不能にするために、大腸菌試料（１０、０００ｇの遠心により回収）を２０００ｐｐｍの濃度のトルエンで処理した大腸菌ＤＨ５ａ宿主細胞を用いて行った。該大腸菌試料は、実施例１「大腸菌株」に記載の通りに調製した。

クローニングした酵素を用いた合成
β−ガラクトシダーゼを用いた合成は、初期ラクトース濃度を４０％（ｗ／ｗ）とした基質で行った。合成溶液は、１ｇ／ｌのＴｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）を添加したｐＨ６．０の０．１Ｍリン酸バッファー中に調整した。合成は、１５０ｒｐｍの振とう水浴中で４０℃にて行った。特定の酵素試料の異なるｐＨ値での活性測定（基質としてｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを使用）に基づいて、特定の酵素の最適ｐＨを選択した。

ガラクトオリゴ糖の合成には、最終基質濃度が４０％（ｗ／ｗ）となるよう、８ｇの５０％（ｗ／ｗ）ラクトースに対して、（加圧型細胞破砕装置で大腸菌を破砕後の）２ｍｌの細胞溶解上清を用いた。該酵素調製液は、７３５ Ｕ／ｍｌの活性を有していた。

合成において、混合物中に存在した種々の糖の濃度を図３に示す。Ｂ．ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１からクローニングされたβ−ガラクトシダーゼにより合成されたガラクトオリゴ糖混合物の、パルスアンペロメトリック検出クロマトグラムと連結した高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）のクロマトグラムを図４に示す。最適な合成時点におけるガラクトオリゴ糖混合物の糖濃度を表１に示す。

表１．４０％（ｗ／ｗ）の初期ラクトース濃度でのガラクトオリゴ糖合成における、最高のオリゴ糖濃度が観察された時点における炭水化物組成。

Ｌａｃ：ラクトース、Ｇｌｃ：グルコース、Ｇａｌ：ガラクトース、ＤＰ：重合度

図１は、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムβ−ガラクトシダーゼのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。 図２は、図１のヌクレオチド配列に対応するアミノ酸配列（配列番号２）を示す。 図３は、β−ガラクトシダーゼおよび基質としてｐＨ６．０の０．１Ｍリン酸バッファー中の４０％（ｗ／ｗ）のラクトースを用いたガラクトオリゴ糖合成における経時的反応を示すグラフである。 図４は、基質としてｐＨ６．０の０．１Ｍリン酸バッファー中の４０％（ｗ／ｗ）のラクトースを用いて、Ｂ．ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１由来のβ−ガラクトシダーゼによって合成したガラクトオリゴ糖混合物の高速陰イオン交換クロマトグラムである。（Ｇｌｃ＝グルコース、Ｇａｌ＝ガラクトース、Ｌａｃ＝ラクトース、α（１−６）＝ガラクトビオース、ＤＰ＝重合度）。

Claims (15)

1. 配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列を有するＤＮＡ。
2. 配列番号１に示される配列を有する、請求項１に記載のＤＮＡ。
3. 請求項１または請求項２に記載のＤＮＡによってコードされるβ−ガラクトシダーゼ酵素。
4. 配列番号２に定められる配列を有するβ−ガラクトシダーゼ。
5. 請求項１または請求項２に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
6. 発現ベクターである、請求項５に記載のベクター。
7. 請求項１または請求項２に記載のＤＮＡを含む宿主細胞。
8. 請求項５または請求項６に記載のベクターを含む宿主細胞。
9. 細菌細胞、酵母細胞または真菌細胞である、請求項７または請求項８に記載の宿主細胞。
10. ビフィドバクテリウム属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属、エシェリキア属、バチルス属、及びアスペルギルス属から成る群より選択される微生物の細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
11. ビフィドバクテリウム・ビフィダムの細胞、バチルス・スブチリスの細胞、バチルス・サーキュランスの細胞及びアスペルギルス・ニガーの細胞から成る群から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
12. オリゴ糖混合物の製造のための、請求項３または請求項４に記載の酵素、または請求項７〜請求項１１のうちいずれか１項に記載の細胞、の使用。
13. 液乳、乾燥粉乳、乳幼児用ミルク、粉ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品、乳製品、フルーツジュース、飲料、乳児食、シリアル、パン、ビスケット、菓子類、ケーキ、食品サプリメント、栄養サプリメント、プロバイオティック食品、プレバイオティック食品、動物飼料、家禽飼料及び薬物から成る群より選択される製品の一部となるオリゴ糖混合物の製造のための、請求項３または請求項４に記載の酵素、または請求項７〜請求項１１のうちいずれか１項に記載の細胞、の使用。
14. 液乳、乾燥粉乳、乳幼児用ミルク、粉ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品、乳製品、フルーツジュース、飲料、乳児食、シリアル、パン、ビスケット、菓子類、ケーキ、食品サプリメント、栄養サプリメント、プロバイオティック食品、プレバイオティック食品、動物飼料、家禽飼料及び薬物から成る群より選択される製品の製造のための、請求項７〜請求項１１のうちいずれか１項に記載の細胞、の使用。
15. 請求項７〜請求項１１のうちいずれか１項に記載の宿主細胞を、請求項３または請求項４に記載の酵素を発現させる条件下で、適切な培養培地中で培養すること、および、生じた酵素を前記培養物から回収することを含む、請求項３または請求項４に記載の酵素の製造方法。

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