MX2008009709A - Galactosidasa con actividad alfa-galactosil-transferasa - Google Patents

Abstract

La presente invención concierne a una (-galactosidasa con actividad transgalactosiladora aislada a partir de Bifidobacteriun bifidum. La (-galactosidasa es capaz de convertir lactosa a una mezcla de oligosacáridos que están (-ligados e inesperadamente produce el disacárido (-ligado galactobiosa. La mezcla puede ser incorporada en numerosos productos alimenticios o alimentos para animales para mejorar la salud intestinal al promover el crecimiento de bifidobactarias en el intestino, y reprimir el crecimiento de la microflora patógena.

Description

GALACTOSIDASA CON ACTIVIDAD ALFA-GALACTOSIL- TRANSFERASA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención concierne a una ß-galactosidasa con actividad trans-galactosiladora capaz de convertir lactosa a una mezcla de oligosacáridos que está ß-ligados e inesperadamente producen el disacárido a- ligado al-6-galactobiosa. En particular concierne a una ß-galactosidasa aislada a partir de una cepa recientemente descubierta de Bifidobacteriu bifidum. La invención particularmente concierne a secuencias de ADN que codifican a la enzima ß-galactosidasa aislada, a la enzima codificada por una secuencia de ADN tal y a una célula huésped que comprende la secuencia de ADN o un vector recombinante que incorpora la secuencia de ADN. La invención también concierne al uso de la enzima codificada por una secuencia de ADN, o de la célula huésped que contenga una secuencia de ADN o vector recombinante, para producir oligosacáridos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las bifidobacterias colonizan de manera natural el tracto intestinal inferior, un medio que es pobre en mono y disacáridos ya que dichos azúcares son consumidos preferentemente por el huésped y microbios presentes en el tracto intestinal superior. A fin de sobrevivir en el tracto intestinal inferior las bifidobacterias producen varias clases de exo- y endo- glicosidasas en formas extracelulares y/o de enlace superficial, por lo cual pueden utilizar diversos carbohidratos. Junto a la actividad hidrolasa, algunas enzimas de bifidobacterias muestran actividad transferasa. Esta actividad de transglicosilación de glicosidasas es usada extensivamente para la síntesis enzimática de varios oligosacáridos , los cuales han probado actuar como factores promotores del crecimiento de bifidobacterias . Es sabido que elementos de bifidobacterias producen enzimas ß-galactosidasa que están involucrados en el metabolismo bacteriano de la lactosa. M<j)ller, P. L. Y colaboradores en Appl & Environ. Microbial., (2001), 62 (5), 2276-2283 describe el aislamiento y la caracterización de tres genes de ß-galactosidasa a partir de cepas de Bifidobacterium bifidum. Se encontró que las tres ß-galactosidasas fueron capaces de catalizar la formación de galactooligosacáridos beta-ligados por transgalactosilación .

Dumortier y colaboradores en Carbohydrate Research, 201, (1990), 115-123 describe la formación de oligosacáridos ß-ligados por medio de una reacción de transgalactosilación durante la hidrólisis de lactosa con Bifidobacterium bifidum DS 20456. El análisis de la estructura de la mezcla de oligosacáridos producidos mostró que las ligaduras fueron ligaduras ß-(1-»3), ß- (l- 6) y ß- ( 1—»4 ) -D-galactosil . Dumortier sugirió que compuestos producidos por Bifidobacterium bifidum están involucrados en la adherencia de bacterias en el intestino grueso. Se ha encontrado que una cepa de Bifidobacterium bifidum es capaz de producir una actividad de enzima galactosidasa que convierte lactosa a una nueva mezcla de galactooligosacáridos que inesperadamente contienen hasta 35 % de disacáridos incluyendo galabiosa (Gal (a 1-6)-Gal) . Este disacárido es conocido (ver Patón, J. C. Y Patón, A. W. (1998), Clin. Microbiol. Revs . , 11, 450-479; Carlsson, K. A. (1989), Ann. Reviews Biochem. , 58, 309-350) por ser un antiadhesivo capaz de prevenir la adhesión de toxinas, por ejemplo, la toxina de Shiga y patógenos tales como E. Colí a la pared del intestino. Esta cepa de B. Bifidum fue depositada bajo el número de acceso NCIMB 41171 en el National Collection of Industrial & Marine Bacteria, Aberdeen, UK el 31 de Marzo de 2003. Se describió también en la Patente U.K. No. 2 412 380. Ahora se encontró que esta cepa de B. Bifidum produce varias ß-galactosidasas, una de las cuales exhibe actividad a-galactosidasa . Esta enzima produce un número de diferentes oligosacáridos que son ß-ligadas, pero también produce el disacárido galabiosa a-ligada.

SUMARIO DE LA INVENCION De conformidad con la invención se proporciona una secuencia de ADN que codifica a una proteina con una secuencia de aminoácidos como se da en la SEC ID NO: 2 o hibridiza bajo condiciones de severidad a la secuencia de ADN que codifica a esta proteina. La secuencia de ADN se da en la SEC ID NO: l o puede comprender un fragmento o degenerativo de ésta. La frase "degenerativa" es construida para significar una secuencia de ADN que es al menos 50 % homologa a la SEC ID NO: 1, preferiblemente desde 50 a 98 % homologas, más preferiblemente desde 75 a 95 % homologas . Una secuencia de ADN tal puede comprender sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos que dan como resultado menos de 60 %, preferiblemente menos de 45 %, más preferiblemente menos de 25 % de cambio en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2. Sustituciones de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones de aminoácidos conservadoras. De acuerdo a un segundo aspecto de la invención se proporciona una enzima codificada por una secuencia de ADN como se definió anteriormente. Una enzima tal puede comprender la secuencia de aminoácidos dada en la SEC ID NO: 2 o un fragmento de la misma. Conforme a un tercer aspecto de la invención se proporciona un vector recombinante, preferiblemente, un vector de expresión, que comprende una secuencia de ADN como se definió anteriormente. Un vector tal puede ser incorporado en una célula huésped tal como una célula bacteriana, de levadura o fúngica. Alternativamente, la secuencia de ADN puede ser incorporada en una célula huésped tal. Alternativamente, la secuencia de ADN puede ser incorporada una célula huésped tal. Una célula huésped adecuada puede ser seleccionada a partir de Bifidobacteríum, Lactococcus , Lactobacillus , Bacillus por ejemplo, Bacillus subtilus o Bacillus circulans , Escherichia y Aspergilus por ejemplo Aspergillus niger. Usando lactosa como un sustrato, la enzima codificada por una secuencia de ADN como se definió anteriormente produce una mezcla de disacáridos que comprenden Gal (ß1-3) Glc, Gal ( ß1-3 ) Gal , Gal( l-6) y Gal (al-6) . También están presentes en la mezcla de oligosacáridos, trisacáridos Gal (ß1-6) Gal (ß1- ) Glc, Gal(Pl-3)Gal(pi-3)Gal(l-4)Glc, Tetrasacáridos Gal(pi-6) Gal (Pl-6) Gal (ß1-4) Glc y pentasacárido Gal (ß1-6) Gal (ß?- 6) Gal (pi-6)Gal (pl-4)Glc. La enzima o la célula huésped como se describieron anteriormente puede ser usada para producir una mezcla de disacáridos, incluyendo Gal (al-6) Gal (galabiosa) la cual puede formar parte de un producto para mejorar la salud intestinal. Un producto tal puede ser seleccionado a partir del grupo que consiste de productos lácteos (por ejemplo leche liquida, leche en polvo seca tal como leche entera en polvo, leche descremada en polvo, polvo de leche rellena de grasa, polvos de suero, leches para bebé, fórmula para bebé, helados, yogurt, quesos, productos lácteos fermentados), bebidas tales como jugo de frutas, alimentos para niños, cereales, pan, pastelillos, confitería, tortas, suplementos alimenticios, suplementos dietéticos, productos comestibles simbióticos, productos comestibles prebióticos, alimentos animales, alimentos para aves o realmente cualquier alimento o bebida.

Alternativamente, los oligosacáridos asi producidos pueden ser usados para la preparación de un medicamento por ejemplo, en forma de tableta o cápsula para prevenir la adhesión de patógenos o toxinas producidas por patógenos a la pared intestinal. El medicamento puede ser administrado a un paciente, por ejemplo siguiendo una corrida de tratamiento antibiótico, la cual a menudo altera o aún destruye la flora intestinal saludable normal . De conformidad a aún un aspecto adicional de la invención se proporciona un proceso para producir una enzima como se definió anteriormente el cual comprende cultivar una célula huésped como se definió anteriormente en un medio de cultivo adecuado bajo condiciones que permiten la expresión de la enzima y recuperando la enzima resultante del cultivo. La invención se dirige también a un proceso para producir una mezcla de oligosacáridos, que incluye el disacárido Gal (al-6-Gal (galabiosa) , el cual comprende poner en contacto a la enzima como se definió anteriormente o una célula huésped como se definió anteriormente con un material que contiene lactosa bajo condiciones que conducen a la formación de la mezcla de oligosacáridos .

El material que contiene lactosa adecuado puede ser seleccionado de lactosa disponible comercialmente, leche entera, leche semi-descremada, leche descremada, suero y leche rellena de grasa, suero permeado. Dichos productos de leche pueden ser obtenidos de vacas, búfalos, ovejas o cabras. Leche rellena de grasa se define como leche entera que ha sido descremada para retirar la leche láctea, la cual es subsecuentemente reemplazada por la adición de aceite o grasa vegetal.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1, es una gráfica que muestra el tiempo en el que transcurre la reacción durante la síntesis del galactooligosacárido con la ß-galactosidasa y 40 % (en peso) de lactosa en regulador de fosfato 0.1 M a pH de 6.0 como sustrato; y La Figura 2, muestra un cromatograma de intercambio aniónico de alta resolución de la mezcla de galactooligosacáridos sintetizada por la ß-galactosidasa a partir de B. Bifidum NCIMB 41171 usando lactosa al 40 % (en peso) en regulador de fosfato 0.1 M a pH de 6.0 como sustrato. (Glc = glucosa, Gal = galactosa, Lac = lactosa, a(l-6) galactobiosa, DP = grado de polimerización).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se aisló ADN genómico a partir de la cepa de Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) usando el método de Lawson y colaboradores (1989) Fems Microbiol Letters, 65, (1-2), 41-45. El ADN fue digerido con enzimas de restricción y fragmentos que tengan un tamaño máximo de 15 kpb fueron ligados con el vector pSP72, el cual ha sido digerido con las mismas enzimas de restricción. Células E. Coli fueron transformadas con un vector que contenia inserciones que consisten de ADN cromosómico digerido con PstI, EcoRI, Kpnl, Smal o HindIII a partir del B. bifidum. Se seleccionaron clones con actividad ß-galactosidasa sobre placas de agar Luria-Bertani que contenían p-nitrofenil , X-p-Gal(5- bromo- 4- cloro- 3-indolil- -D-galactosida) e isopropil-p-D- tiogalactosida (IPTG) . Mezclas de ligación con ADN cromosómico de Ba/nHI dieron origen a siete clones positivos a ß-galactosidasa, uno de los cuales es identificado como pBl. La formación de secuencias de ADN del fragmento de ADN insertado Bl se efectuó usando el método de terminación en cadena didesoxi de Sanger (Russel P., 2002 Genetics, Pearson Education, Inc., San Francisco, 187-189) usando el equipo para formación de secuencias en ciclos BigDye Terminator V.3.0 (Applied Biosystems, USA).

La secuencia de ADN de Bl se muestra en la (SEC ID NO: 1) · El marco de lectura abierto (ORF, siglas del inglés) se localizó usando el buscador de ORF de NCBI (National Center of Biotechnology Information) . La secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 1 fue trasladada en los seis posibles marcos de lectura y se identificó un macro de lectura abierto de 1052 aminoácidos que codifican a una ß-galactosidasa putativa. La traslación se muestra en la (SEC ID NO: 2) . La presente invención será descrita adicionalmente a manera de referencia al siguiente ejemplo. Ejemplo 1 Materiales y Métodos Todas las preparaciones de medios y los productos químicos usados en el transcurso de este estudio fueron obtenidos de Sigma (Dorset, UK) , Invitrogen (Paisley, UK) , Oxoid (Basingstoke, UK) , Qiagen (West Sussex, UK) y Promega (Southhampton, UK) . Cepas Bacterianas La cepa de Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) se mantuvo sobre perlas criogénicas en tubos Microbank a -70 °C. Para estos experimentos, la cepa fue recibida sobre agar de Wilkinson Chalgren (WC) (Oxoid, UK) y medio TPY (medio de extracto de levadura fitosa tripticasa) y crecieron anaeróbicamente (Composición de C02 y N2, 80 % y 20 %, respectivamente) a 37 °C por 48 horas. La morfología de la colonia y la ausencia de contaminación se probaron por medio de la tinción de Gram. Cepas de E. coli La cepa de Escherichia coli, DH5a usada en este estudio fue incubada comúnmente bajo condiciones aeróbicas a 37 °C en agar o caldo de Luria-Bertani (LB) (Sambrook J. y Russell W. D. (2001) . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) y cuando fue necesario se suplemento con antibióticos (100 µg/ml de ampicilina y/o 15 µg/ml de cloramfenicol) y 40 µ? de ?-ß-Gal al 2 %, 7 µ? de ( isopropil-p-D-tiogalactosida) IPTG al 20 %, los cuales fuero aplicados sobre la superficie de una placa de agar de 90 MI pre-elaboradas . La cepa DH5a de E. coli (Invitrogen, Paisley, UK) (genotipo: F-<|)801acZAMA ( lacZYA-argF) Ul 69recAlendAlhsdR17 (rk~, mk~)p oAsupE44 thi-1 gyrA96 Gß1??)?) es una cepa positiva a-galactosidasa y se usó en experimentos de expresión y para otras manipulaciones genéticas. Extracción de ADN genómico a partir de Bifidobacterium bifidum Se aisló el ADN genómico a partir de la cepa de Bifidobacteriun bifidum (NCIMB 41171) usando el método siguiente en el cual se preparó el ADN cromosómico a partir de compactado celular cosechado de 199 mi de caldo anaerobio WC. Las células fueron re-suspensidas en 10 mi de regulador TES (10 mM de Tris-HCl, 10 mM de EDTA, 10 mM de NaCl, pH = 8) y tratada con 200 1 de mezcla de lisozima/mutanolisina (4:1, lisozima de 10 mg/ml mutanolisina de 1 mg/ml) por 30 minutos a 37 °C . Las células fueron entonces tratadas con 200 µ? de proteinasa K (a 20 mg/ml) y 200 µ? de ARNasa (ambas de 10 mg/ml) mezcladas e incubadas por una hora a 65 °C . Finalmente las células fueron tratadas con 2 mi de SDS al 10 % y se incubó por 15 minutos a 5 °C . Se añadieron 12 mi de fenol/cloroformo y se repitió la extracción hasta que la fase acuosa pudo ser separada fácilmente de la inferíase . Se precipitó el ADN genómico con isopropanol y se resuspendieron en 10 mM de Tris-HCl - 1 mM de EDTA (pH = 8) . Se digirió entonces el ADN genómico con enzimas de restricción, se ligó en pSP72 digerido con las mismas enzimas y se trató con fosfatasa alcalina. La digestión del ADN genómico de B. bifidum, se efectuó usando EcoRI, PstI, BamHI y Kpnl. Las mezclas de ligación fueron usadas para transformar DH5a de E. coli y clones positivos a ß- galactosidasa se identificaron como colonias azules sobre placas que contenían X-Gal. Preparación de ADN vector. El vector usado para clonación y expresión en el transcurso de este estudio fue pS72 (Promega, UK) (Krieg, P. A. y Melton, D.A. (1987) . La síntesis de ARN in vitro con ARN polimerasa de SP6. Methods in Enzymology, 155: 397-415) . Este vector fue seleccionado a causa de la falta de actividad complementadora fragmento a el cual no es codificado en pSP72. Este vector no porta el segmento corto del ADN de E. coli que contiene la secuencia reguladora y que codifica la información para los primeros 146 aminoácidos de ß-galactosidasa el cual en combinación con cepas de E. coli (es decir DH5a) que expresan a la porción carboxi-terminal de esta ß-galactosidasa es dar una ß-galactosidasa activa (complementación-a) . El vector fue digerido con las siguientes enzimas de restricción: Psfl, Ba/nHI, HindIII, Smal, Kpnl y EcoRI conforme a las instrucciones del fabricante usando un exceso de diez veces de enzima sobre el ADN (unidad enzimática. µgr ADN igual a diez unidades de enzima por una ugr de ADN plásmido o diez unidades enzimáticas por 0.5 pmoles de ADN plásmido) . Después de inactivación térmica de la enzima (20 min a 65 °C) los patrones de restricción fueron analizados por análisis por eletroforesis sobre gel horizontal. La presencia de un fragmento individual en el gel indicó la digestión completa del vector u la digestión de restricción individual de éste. La digestión suficiente del vector fue probada también por transformación de moléculas no ligada en células DH5a de E. coli competentes. El número de colonias formadas sobre placas de agar LB suplementado con ampicilina (100 µg/ml fue un indicador de las moléculas sin digerir y el fondo esperado durante los experimentos subsecuentes. Los vectores fueron adicionalmente desfosforilados con fosfatasa alcalina intestinal de ternera CIAP (Promega, South Hampton, UK) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se probó la eficiencia del tratamiento por auto-ligación (con ADN ligasa del bacteriófago T4 de acuerdo a las instrucciones del fabricante) siguiendo la transformación en células DH5a. El número de colonias formadas mostró el número de moléculas recirculisadas (vector no clonado) y una sustracción del anterior con las colonias formadas sin tratamiento del vector CIAP mostró el número de vectores no desfosforilados . Construcción de la Biblioteca de ADN genómico El ADN genómico fue parcialmente digerido con seis enzimas de restricción que reconocen frecuentemente la ocurrencia de las secuencias hexa-nucleótidos en ADN procariótico . EcoRI, BamHI, PstI, Kp.nl, Smal y HindIII son endonucleasas de restricción de tipo II que reconocen específicamente a las secuencias 5' G/AATTC-3' , 5' /GATCC-3', 5' -CTGCA/G-3' , 5'GGTAC/C-3, 5'-CCC/GG-3' y 5 ' A/AGCTT-3' respectivamente, y hace rupturas de dobles hebras en estas secuencias que generan suspensiones 5' de cuatro nucleótidos, AATT, GATC, AGCT para EcoRI, BamHI, y Hind III respectivamente, y suspensiones 3' , ACGT, GTAC para PstI y Kp.nl respectivamente y extremos romos para Smal. Todas estas enzimas fueron activas y capaces de fragmentar ADN solamente en la presencia de iones magnesio divalentes. Estos iones fueron los únicos co-factores requeridos. Digestión de ADN de Restricción Todas las digestiones de restricción de las muestras de ADN genómico fueron incubadas por 2 horas a 37 °C y finalmente se inactivaron térmicamente a 65 °C por 20 minutos. Las reacciones fueron luego enfriadas a temperatura ambiente y se añadió la cantidad apropiada de regulador de carga, seguido por mezcla suave con un capilar de vidrio sellado. Las soluciones fueron entonces cargadas en pocilios de un gel de agarosa al 0.8 % (suministro de energía de 4-5 voltios/cm por 14 - 16 horas) y el tamaño del ADN digerido se estimó con ADN estándares de 1 kpb (Promega, U.K.) (Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002)). Purificación de los Fragmentos Generados después de Digestión de Restricción Se hizo la purificación de 1 fragmento a partir de mezclas de reacción y los geles de agarosa usando el equipo para extracción sobre gel QIAEX de Qiagen (West Sussex, UK) . Se describieron los protocolos con detalle en el manual del fabricante. Transformación y Ligación de ADN Después de purificación de los fragmentos de ADN con el equipo para extracción sobre gel Qiaex, fueron ligados con el vector pSP72 tratado con CIAP. Para ligación se transfirieron cantidades apropiadas de ADN a tubos de microcentrífuga de 0.5 mi como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1: Mezclas de ligación. El Tubo A muestra el número de ADN vectorial auto-ligado que puede ser sustraído del número total de transformantes después de transformación. El Tubo B muestra la ligación del vector con los fragmentos de ADN y el Tubo C muestra el control a fin de que sea calculada la transformación de la transformación . Tubo ADN A Vector (15 fmoles [~ 29.7 ng] B Vector (15 fmoles ~ 29.7 ng de ADN) más inserto (extraño 15 fmoles ~ 69.3 ng) .

C control pUC (0.056 fmoles [-100 pg]) La proporción molar del vector ADN plásmido a fragmento de ADN inserto deberá de ser ~ 1:1 en la reacción de ligación. La concentración de ADN final deberá de ser ~ 10 ng/µ?. Antes de cada ligación se calentaron los fragmentos de ADN a 45 °C por 5 minutos para fundir cualquier termini cohesivo que se fortaleció durante la preparación del fragmento. Una proporción molar de vector: ADN inserto de 1:1 fue seleccionada para todas las reacciones de ligación y el montaje de la reacción se hizo de conformidad con las instrucciones de Promega.

A los Tubos A y B se añadieron 1.0 µ? de regulador de ligación lOx y 0.5 unidades Weiss de ADN de T4 ligasa (Promega, U.K.) y el volumen de las ligaciones se ajustó a 10 µ? con agua de grado para biología molecular. Al Tubo C se añadieron 1.0 µ? de regulador de ligación lOx y el volumen de la ligación se ajustó a 10 µ? con agua de grado para biología molecular. Se añadieron fragmentos de ADN a los tubos junto con agua y luego se calentaron a 45 °C por 5 minutos para fundir cualquier termini cohesivo que fuera refortalecido durante la preparación. El ADN fue enfriado a 0 °C antes de que el remanente de los reactivos de ligación fueran añadidos y las mezclas de reacción se incubaron toda la noche a 16 °C (Sambrook y Russell, 2001) . Después de precipitación con etanol y purificación de los fragmentos ligados (a fin de retirar la mezcla de ligación que ocasiona la reducción de la eficiencia de transformación) , se efectuaron las transformaciones de conformidad con las instrucciones de Hanahan. Se añadieron ~ 50 ng de ADN ligado en 5 µ? de solución a 100 µ? de células DH5a de E. coli competentes. Después de expresión y tratamiento térmico del gen resistente a la ampicilina las células fueron extendidas sobre la superficie de placas de LB que contenían ampicilina (100 µ?t/ta?) . ?-ß-Gal (40 µ? de ?-ß-Gal al 2 %) e IPTG (7 µ? de IPTG al 20 %) . Se midió el número de transformantes de cada reacción de ligación. El número de transformantes comúnmente obtenido del Tubo C fue de 2 x 105 -lxlO6 cfu^g mientras que del Tubo A fue 500 - 600 cfu/^g. El número de transformantes en el Tubo A fue un indicio del tratamiento eficiente del ADN vector. El número de transformantes en el Tubo B estuvo en el intervalo de 2 - 4 x 104 cfu/µq. Número de Transformantes Mezclas de ligación con ADN cromosómico de PstI dieron origen a 13 clones positivos de ß-galactosidasa además de ~ 2500 transformantes cribados, mientras que con Bamtil dieron origen a 7 clones positivos (~ 1500 transformantes cribados) , EcoRI dio origen a 3 clones positivos (~ 1300 transformantes cribados), Kpnl dio origen a 7 clones positivos (~ 2000 transformantes cribados) , Smal dio origen a 3 clones positivos (~ 1600 transformantes cribados) y HindIII dio origen a 2 clones positivos (~ 1200 transformantes cribados). Digestión de Clones Positivos A fin de identificar los genes de ß-galactosidas diferentes, los plásmidos aislados de los clones positivos fueron digeridos de conformidad con la tabla siguiente El análisis por electroforesis sobre gel de los fragmentos generados después de digestión mostró que los plásmidos pBl, pPl, pP2 y pPll tienen cada uno un inserto que codifica a una ß-galactosidasa diferente. Los clones que contuvieron pBl se usaron para análisis adicional. Formación de Secuencias de ADN Se efectuó la formación de secuencias de ADN con el método de la terminación en cadena didesoxi de Sanger usando el equipo para formación de secuencias en ciclo BigDye Terminator v.3.0 (Applied Biosystems, USA) y se analizaron con el ABI Prism 3100, un sistema de análisis de ADN basado en fluorescencia incorporando electroforesis capilar. Los extremos 5'- y 3'- de los fragmentos de ADN insertados fueron secuenciados con cebadores específicos del vector. Los insertos fueron secuenciados adicionalmente usando el Genome Priming System (GPS-1) (New England Biolabs, U.K.). GPS-1 es sistema in vitro basado en el transposón TN7, el cual usa la TnsABC Transposasa para insertar el Transposón aleatoriamente en el ADN objetivo. La proporción en masa del donador :SDN objetivo de 1:4 se usó de conformidad con las instrucciones del fabricante. El número de plásmidos aislados para formación de secuencias después de inserción del Transcebador en el plásmido objetivo fue 25. Este número fue calculado de conformidad con las instrucciones del fabricante y se supone 5 veces de profundidad de cobertura. Para el plásmido de inserción pBl de un inserto de transposón de = 1699 pb en la posición 973pb en la dirección de 3' a 5' del sitio de clonación múltiple- del vector usado, eliminó completamente la actividad ß-galactosidasa, indicando que el codón de inicio fue posicionado entre el vector MCS sitio de clonación múltiple) y el sitio del transposón, mientras que la inserción del inserto en la posición de 841 pb hacia la dirección de 3' a 5' del MCS condujo a la formación de una ß-galactosidasa activa indicando que el codón de inicio existe entre 841 pb y 973 pb hacia la dirección de 3' a 5' del MCS. La actividad enzimática fue eliminada completamente con la inserción del inserto en una posición 3565 pb hacia la dirección de 3' a 5' del MCS indicando que el codón de detención está hacia la dirección de 3' a 5' de esta posición. Además las inserciones en las posiciones 1239 pb, 1548 pb, 1683 pb, 2108 pb, 2189 pb, 2270 pb, 2340 pb, 2414 pb, 2574 pb, 2648 pb, 2734 pb, 2807 pb y 3410 pb, eliminan completamente la actividad enzimática.

La mezcla de reacción para formación de secuencias contuvo aproximadamente 400 a 600 ng del ADN plásmido, 3,2 pmoles de solución de cebador y 4 µ? de solución BigDye Terminator. Identificación del Marco de Lectura Abierto El marco de lectura abierto (ORF, de las siglas del inglés) de Bl se localizó usando el buscador de ORF de NCB1. Se usó el código genético bacteriano y se determinó la longitud del marco de 100 pb. La secuencia de nucleótidos se trasladó en los seis marcos posibles y se identificó un marco de lectura abierto de 1052 aminoácidos que codifica a una ß-galactosidasa putativa (La translación se muestra en la SEC ID NO: 2). Ejemplo 2 Síntesis con la enzima ß-galactosidasa clonada aislada a partir de Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 en el huésped E. coli (cepa DH5a) . La síntesis descrita a continuación, a menos que se establezca de otra manera, se efectuó con las células huéspedes DH5a de E. coli enteras después de tratamiento de la biomasa de E. coli (colectada por centrifugación a 10, 000 g) con tolueno a una concentración de 2000 ppm a fin de incrementar la permeabilidad celular y también volver las células no viables por destrucción de su membrana citoplásmica . La biomasa de E. coli fue preparada como se describió en el Ejemplo 1 bajo "Cepas de E. coli". Síntesis con la Enzima Clonada Se efectuó la síntesis con ß-galactosidasa a una concentración de sustrato de 40 % (en peso) de concentración inicial de lactosa. La solución de síntesis se preparó en regulador de fosfato 0.1 M al 40 % a pH de 6.8 (o regulador de citrato 0.1 M a pH de 6.2 o regulador de fosfato de potasio a pH de 6.8). Se efectuó la síntesis a 40 °C en baño de agua con agitación a 150 rpm. El pH óptimo para la enzima específica fue seleccionado con base en las mediciones de actividad (usando o-nitrofenol-p-D-galactosidasa como sustrato) de una preparación enzimática específica a valores de pH variables . Para la síntesis del galactooligosacárido, se centrifugaron 5 mi de una suspensión de DH5a de E. coli (con una actividad de 2.2 U/ml) (a 10,000 g) para colectar la biomasa y se descartó el sobrenadante. Esta biomasa se resuspendió con 10 g de solución de sustrato al 40 % a fin de efectuar la síntesis. Las concentraciones de los diferentes azúcares presentes en la mezla durante la síntesis se muestran en la Figura 1. Los cromatogramas por cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución acoplada con detección amperométrica por impulsos (HPAEC-PAD) de mezclas del galacooligosacárido sintetizados por la ß-galactosidasa clonada a partir de B. bifidum NCIMB 41171 se muestran en la Figura 2. Las concentraciones de azúcares de la mezcla de galactooligosacáridos en el punto de tiempo de la síntesis óptima se muestran en la Tabla 1. Tabla 1. Composición de carbohidratos de síntesis del oligosacárido al 40 % de concentración de lactosa inicial en el punto de tiempo donde se observó la concentración máxima de oligosacárido. Substancias GOS GOS Lac Glc Gal Iniciales DP>3 DP=2 de Síntesis % (en peso Concentración (% de azúcares totales ) 40 20.45 27.64 112. 73 25. 90 13.28 Lac: Lactosa, Glc: Glucosa, Gal: Galactosa, grado de polimerización.

Claims (22)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:
2. REIVINDICACIONES 1. - Una secuencia de ADN caracterizada porque a) codifica a una proteina con una secuencia de aminoácidos como la dada en la SEC ID NO: 2, o b) hibridiza bajo condiciones de hibridización severas a la secuencia de a) , o c) es una degenerativa de la secuencia de a) o b) . 2. - La secuencia de ADN de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia es dada en la SEC ID NO: 1 o un fragmento de la misma.
3. 3. - La secuencia de ADN de conformidad con la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, caracterizada porque dicha secuencia comprende sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos que dan como resultado menos de 60 %, preferiblemente menos de 45 %, más preferiblemente menos de 25 % de cambio en la secuencia de aminoácidos de conformidad con la SEC ID NO: 2 o un fragmento de la misma.
4. 4. - Una secuencia de ADN de conformidad con la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, caracterizada porque dicha secuencia comprende sustituciones de nucleótidos que dan como resultado sustituciones conservadoras de aminoácidos.
5. 5. - Una enzima caracterizada porque es codificada por una secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4.
6. 6. - Una enzima caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la SEC ID NO: 2 o un fragmento de la misma.
7. 7.- Una ß-galactosidasa caracterizada porque tiene la secuencia como se definió en la SEC ID NO: 2.
8. 8.- Un vector recombinante caracterizado porque comprende una secuencia de ADN de conformidad con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4.
9. 9.- El vector de conformidad con la Reivindicación 8, caracterizado porque dicho vector es un vector de expresión .
10. 10. - Una célula huésped caracterizada porque comprende una secuencia de ADN de conformidad con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a .
11. 11. - Una célula huésped caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la Reivindicación 8 o la Reivindicación 9.
12. 12.- La célula huésped de conformidad con la Reivindicación 10 o la Reivindicación 11, caracterizada porque dicha célula es una célula bacteriana, una célula de levadura o una célula fúngica.
13. 13.- La célula huésped de conformidad con la Reivindicación 12, caracterizada porque dicha célula es seleccionada del grupo que consiste de Bifidobacterium , Lactococcus , Lactobacillus , Escherichia , Bacillus y Aspergillus .
14. 14.- La célula huésped de conformidad con la Reivindicación 13, caracterizada porque la célula es seleccionada del grupo que consiste de Bifidobacterium bifidum, Bacillus subtilis , Bacillus circulans y Aspergillus niger.
15. 15.- Uso de una enzima de conformidad con una cualquiera de las Reivindicaciones 5 a 7, o una célula de conformidad con una cualquiera de las Reivindicaciones 10 a 14, para producir una mezcla de oligosacáridos .
16. 16. - Uso de conformidad con la Reivindicación 15, caracterizado porque la mezcla comprende los disacáridos Gal(p-l-3) Glc, Gal (p-l-3)Gal, Gal (ß-1-ß) Gal y Gal (a-1-6) Gal.
17. 17. - Uso de conformidad con la Reivindicación 15 o la Reivindicación 16, caracterizado porque la mezcla comprende los trisacáridos Gal (ß-1-6) Gal (ß-1- ) Glc, Gal (ß-1-3) Gal (ß-1-4) Glc, el tetrasacárido Gal(p-1- 6)Gal(p-l-6)Gal(p-l-4)Glc, y el pentasacárido Gal(P-l- 6) Gal (p-l-6)Gal (P-l-6)Gal (p-l-4)Glc.
18. 18.- Uso de una enzima de conformidad con una cualquiera de las Reivindicaciones 5 a 7, o una célula de conformidad con una cualquiera de las Reivindicaciones 10 a 14, para producir una mezcla de oligosacáridos para ser parte de un producto seleccionado del grupo que consiste de productos lácteos, tales como leche liquida, leche secada en polvo, leches para bebés, fórmula para bebé, helados, yogurt, queso, productos lácteos fermentados, bebidas tales como jugo de frutas, alimentos para niños, cereales, pan, pastelillos, confitería, tortas, suplementos alimenticios, suplementos dietéticos, productos comestibles probióticos, productos comestibles prebióticos, alimentos para animales, alimentos y medicamentos para aves.
19. 19.- Uso de conformidad con la Reivindicación 18, caracterizado porque la mezcla comprende los disacáridos Gal (P-l-3) Glc, Gal (ß-1-3) Gal, Gal (ß-1-6) Gal y Gal (ct-1-6)Gal, los trisacáridos Gal (P-l-6) Gal (p-1-4 ) Glc, Gal (P~l-3) Gal (ß-1-4) Glc, el tetrasacárido Gal (p-l-6) Gal (p-1- 6)Gal(p-l-4)Glc, y el pentasacárido Gal (ß-1-6) Gal (ß-1-6) Gal (p-l-6)Gal (p-l-4)Glc.
20. 20.- Uso de una célula huésped de conformidad con una cualquiera de las Reivindicaciones 10 a 14, para producir un producto seleccionado del grupo que consiste de productos lácteos, tales como leche liquida, leche secada en polvo, leches para bebés, fórmula para bebé, helados, yogurt, queso, productos lácteos fermentados, bebidas tales como jugo de frutas, alimentos para niños, cereales, pan, pastelillos, confitería, tortas, suplementos alimenticios, suplementos dietéticos, productos comestibles probióticos, productos comestibles prebióticos, alimentos para animales, alimentos y medicamentos para aves.
21. 21.- Un proceso para producir una enzima de conformidad con una cualquiera de las Reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque comprende cultivar una célula huésped de conformidad con una cualquiera de las Reivindicaciones 10 a 14 en un medio de cultivo adecuado bajo condiciones que permitan la expresión de dicha enzima y recuperar la enzima resultante del cultivo.
22. 22.- Un proceso para producir una mezcla de oligosacáridos caracterizado porque comprende los disacáridos Gal (ß-1-3 ) Glc, Gal (ß-1-3) Gal, Gal (ß-1-6) Gal y Gal (a-1-6) Gal, los trisacáridos Gal (ß-1-ß) Gal (ß-1-4 ) Gac, Gal(P-l-3)Gal(p-l-4)Glc, el tetrasacárido Gal(P-l-6)Gal(P-l-6)Gal(P-l-4)Glc, y el pentasacárido Gal(p-1-6)Gal(p-l-6)Gal(p-l-6)Gal(p-l-4)Glc, dicho proceso se caracteriza porque comprende poner en contacto a una enzima de conformidad con una cualquiera de las Reivindicaciones 5 a 7 o una célula huésped de conformidad con una cualquiera de las Reivindicaciones 10 a 14 con un material que contenga lactosa.