ES2342125T3 - Beta-galactosidasa con actividad de transgalactosilacion. - Google Patents

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Abstract

Una secuencia de ADN que codifica una β-galactosidasa, donde la secuencia se selecciona entre la secuencia dada en SEQ. ID NO: 1 o de un fragmento o una degeneración de la misma, teniendo dicha degeneración una homología de 75% a 95%.

Description

\beta-galactosidasa con actividad de transgalactosilación.
La presente invención se refiere a una nueva \beta-galactosidasa con actividad de trans-galactosilación capaz de convertir lactosa en una mezcla de galacto-oligosacáridos. En particular se refiere a una \beta-galactosidasa aislada a partir de una cepa recientemente descubierta de Bifidobacterium bifidum.
La invención se refiere particularmente a secuencias de ADN que codifican la nueva enzima \beta-galactosidasa aislada, a la enzima codificada por dicha secuencia de ADN y a la célula hospedadora que comprende la secuencia de ADN o que contiene un vector recombinante que incorpora la secuencia de ADN. La invención se refiere también al uso de la enzima codificada por una secuencia de ADN, o la célula hospedadora que contiene una secuencia de ADN o el vector recombinante, para producir los galacto-oligosacáridos.
La bifidobacterias colonizan de forma natural el tracto intestinal inferior, un medio que es pobre en mono y disacáridos ya que tales azucares se consumen con preferencia por los huéspedes y microbios presentes en el tracto intestinal superior. Para sobrevivir en el tracto intestinal inferior las bifidobacterias producen varios tipos de exo y endoglicosidasas unidas a la superficie y/o en formas extracelulares, mediante las cuales pueden utilizar diversos hidratos de carbono.
Además de la actividad hidrolasa, algunas enzimas de las bifidobaterias muestran actividad transferasa. Esta actividad de trans-galactosilación de las glicosidasas se usa ampliamente para la síntesis enzimática de diversos oligosacáridos, que han demostrado que actúan como factores que promueven el crecimiento de las bifidobacterias.
Se sabe que algunas bifidobacterias producen enzimas \beta-galactosidasas que están involucradas en el metabolismo bacteriano de la lactosa. En Møller, P. L. et al in Appl & Environ. Microbial., (2001), 62, (5), 2276-2283 se describe el aislamiento y caracterización de tres genes de \beta-galactosidasa de una cepa de Bifidobacterium bifidum. Se encontró que los tres tipos de \beta-galactosidasas eran capaces de catalizar la formación de beta galacto-oligosacáridos por trans-galactosilación.
En Durmortier et al en Carbohydrate Research, 201, (1990), 115-123 se describió la formación de beta oligosacáridos por una reacción de trans-galactosilación durante la hidrólisis de lactosa con Bifidobacterium bifidum DSM 20456. Su análisis de la estructura de la mezcla de los oligosacáridos producidos mostró que las uniones eran enlaces \beta-(1\rightarrow3), \beta-(1\rightarrow6) y \beta-(1\rightarrow4)-D-galactosil. Durmortier sugirió que los compuestos producidos por Bifidobacterium bifidum están involucrados en las adherencia de la bacteria en el intestino grueso.
La patente WO01/90317 describe una nueva \beta-galactosidasa de Bifidobacterium bifidum, en particular una versión truncada de la enzima que tiene una actividad de trans-galactosilación alta.
Se ha encontrado una cepa de Bifidobacterium bifidum que es capaz de producir una actividad de enzima galactosidasa que convierte la lactosa en una nueva mezcla de galacto-oligosacáridos que contiene inesperadamente hasta un 35% de disacáridos que incluyen galabiosa (Gal (\alpha 1-6)- Gal). Este disacárido es conocido (véase Paton, J C. Paton, A W (1998), Clin. Microbiol. Revs., 11, 450-479; Carlsson, K A (1989), Ann. Reviews Biochem., 58, 309-350) por ser un antiadhesivo capaz de evitar la adhesión de toxinas como la toxina Shiga y patógenos como E. coli, a la pared del intestino.
La cepa de B bifidum fue depositada con el numero de acceso NCIMB 41171 en la Colección Nacional de Bacterias Industriales y Marinas (Nacional Collection of Industrial & and Marine Bacteria), Aberdeen, Reino Unido el 31 de Marzo de 2003. También está descrita en la patente de Reino Unido GB2412380.
Actualmente se ha encontrado que esta cepa de B bifidum produce varias \beta-galactosidasas, incluyendo una \beta-galactosidasa nueva. Esta enzima produce una serie de oligosacáridos diferentes que tienen uniones \beta.
Según la invención se proporciona una secuencia de ADN que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos según la secuencia SEQ.ID NO: 2. La secuencia de ADN viene dada por la SEQ. ID NO: 1 o puede comprender un fragmento o degeneración de la misma.
Por "degeneración" se entiende una secuencia de ADN que presenta de 75 a 95% de homología.
Esta secuencia de ADN puede comprender substituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos que den como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos según la SEQ. ID NO: 2 inferior a un 25%. Las substituciones de nucleótidos pueden producir como resultado sustituciones de aminoácidos conservadoras.
Según un segundo aspecto de la invención se proporciona una enzima codificada por una secuencia de ADN definida anteriormente. Tal enzima puede comprender la secuencia de aminoácidos dada en SEQ. ID NO: 2 o un fragmento de la misma.
\newpage
Según un tercer aspecto de la invención se proporciona un vector recombinante, preferiblemente un vector de expresión, que comprende una secuencia de ADN definida anteriormente. Este vector se puede incorporar en una célula hospedadora, tal como una célula bacteriana, levadura u hongo. Alternativamente, la secuencia de ADN puede ser incorporada en dicha célula hospedadora. Se puede seleccionar una célula hospedadora adecuada del grupo que comprende Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Bacillus por ejemplo Bacillus subtilus o Bacillus circulans, Escherichia y Aspergillus por ejemplo Aspergillus níger.
Utilizando lactosa como substrato, la enzima codificada por la secuencia de ADN definida anteriormente produce una mezcla de oligosacáridos, que comprende disacáridos, como Gal (\beta1-3) Glc, Gal (\beta1-3) Gal, Gal (\beta1-6) Gal y Gal (\alpha1-6) Gal, trisacáridos y tetrasacáridos como Gal (\beta1-6) Gal (\beta1-4) Glc, Gal (\beta1-3) Gal (\beta1-4) Glc y Gal (\beta1-6) Gal (\beta1-6) Gal (\beta1-4) Glc.
La enzima o la célula hospedadora descrita anteriormente puede usarse para producir una mezcla de galacto-oligosacáridos que puede formar parte de un producto para mejorar la salud intestinal. Dicho producto puede seleccionarse del grupo que consiste en productos lácteos (por ejemplo leche líquida, leche en polvo seca tal como la leche entera en polvo, leche desnatada en polvo, leche desnatada enriquecida en grasa en polvo, suero de leche en polvo, leches infantiles, leche maternizada, helados, yogur, queso, productos de leche fermentada), bebidas tales como el zumo de fruta, los alimentos infantiles, cereales, pan, galletas, dulces, pasteles, suplementos alimenticios, suplementos dietéticos, alimentos para animales, alimentos para aves o por supuesto cualquier otro alimento o bebida. La presencia de galacto-oligosacáridos en dichos productos tiene la ventaja de incrementar el crecimiento de las Bifidobacterium promotoras de la salud en el producto o en la flora intestinal del consumidor después de la ingesta del producto o en ambos.
Alternativamente, los oligosacáridos producidos así pueden utilizarse para la preparación de un medicamento, por ejemplo en forma de comprimido o de cápsula, para evitar la adhesión de los patógenos o de las toxinas producidas por los patógenos a la pared del intestino. El medicamento puede ser administrado al paciente, por ejemplo después de un tratamiento con antibióticos, que a menudo altera o destruye la flora intestinal normal sana.
Según aún otro aspecto de la invención se proporciona un proceso para producir una enzima tal y como se define anteriormente que comprende cultivar una célula hospedadora definida anteriormente en un medio de cultivo adecuado en condiciones que permitan la expresión de la enzima y recuperar la enzima resultante o los productos enzimáticos del cultivo.
La invención también esta dirigida a un proceso para producir la mezcla de galacto-oligosacáridos que comprende poner en contacto la enzima definida anteriormente con un material que contenga lactosa en condiciones que conduzcan a la formación de la mezcla de galacto-oligosacáridos.
El material adecuado que contenga lactosa puede seleccionarse entre lactosa comercial, leche entera, leche semidesnatada, leche desnatada, suero de leche, leche desnatada enriquecida en grasa y suero de leche filtrado. Estos productos lácteos pueden obtenerse de vacas, búfalas, ovejas o cabras. La leche desnatada enriquecida en grasa se define como la leche entera que ha sido desnatada para eliminar la grasa de la leche, la cual se reemplaza posteriormente añadiendo aceite o grasa vegetal.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ. ID NO: 1) de \beta-galactosidasa de Bifidobacterium bifidum de la invención; y
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ. ID NO: 2) correspondiente a la secuencia de nucleótidos de la Figura 1.
La Figura 3 es un gráfico que muestra el proceso temporal de la reacción durante la síntesis del galacto-oligosacárido con \beta-galactosidasa y lactosa al 40% (porcentaje en peso) en tampón fosfato 0,1 M a pH 6,0 como substrato; y
La Figura 4 muestra un cromatograma de intercambio aniónico de alto rendimiento de la mezcla de galacto-oligosacáridos sintetizada por \beta-galactosidasa de B. Bifidum NCIMB 41171 utilizando lactosa al 40% (porcentaje en peso) en tampón fosfato 0,1 M a pH 6,0 como substrato (Glc = Glucosa, Gal = Galactosa, Lac = Lactosa, \alpha (1-6) = galactobiosa, DP = grado de polimerización del inglés "Degree of polymerization").
El ADN genómico fue aislado de la cepa (NCIMB 41171) de Bifidobacterium bifidum utilizando el método de Lawson et al. (1989) Fems Microbiol Letters, 65, (1-2), 41-45. El ADN fue digerido con enzimas de restricción y los fragmentos con un tamaño de 15 kbp máximo se unieron con el vector pSP72 que había sido digerido con las mismas enzimas de restricción. Las células de E. coli se transformaron con un vector que contenía las inserciones del ADN cromosómico digerido de B. bifidum PstI, EcoRI, Bam HI, KpnI, SmaI o HindIII. Se seleccionaron los clones con actividad \beta-galactosidasa en placas de agar Luria Bertani que contienen p-nitrofenil, X- \beta-Gal (5-bromo-4-cloro-indol-3-indolil-\beta-D-galactósido) e isopropil- \beta-D- tiogalactósido (IPTG). Las mezclas de ligación con el ADN cromosómico Pst I dio lugar a trece clones positivos de \beta-galactosidasa, uno de los cuales se identificó como pP2.
La secuenciación de ADN del fragmento de ADN insertado P2 se llevó a cabo utilizando el método de Sanger de terminación de cadenas por dideoxinucleótidos (Russel P., 2002 iGenetics, Pearson Education, Inc. San Francisco, 187-189) utilizando el kit de secuenciación por ciclo BigDye Terminador V.3.O (Applied Biosystems EE.UU). La secuencia de ADN de P2 se muestra en la Figura 1 (SEQ.ID NO: 1) .
El marco de lectura abierto (ORF del inglés Open Reading Frame) se localizó utilizando un buscador de ORF del NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica). La secuencia de nucleótidos de la Figura 1 se tradujo en todos los seis posibles marcos de lectura y se identificó un marco de lectura abierto de 738 aminoácidos que codifica una posible \beta-galactosidasa. La traducción se muestra en la Figura 2 (SEQ.ID NO: 2).
La presente invención se describirá con más detalle en referencia al siguiente ejemplo.
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Ejemplo 1 Materiales y métodos
Todos los productos químicos y medios de preparación utilizados a lo largo de este estudio se obtuvieron de Sigma (Dorset, Reino Unido), Invitrogen (Paisley, Reino Unido), Oxoid (Basingstoke, Reino Unido), Qiagen (West Sussex, Reino Unido) y Promega (Southampton, Reino Unido).
Cepas bacterianas
La cepa de Bifidobacterium bifidum (NCIMN 41171) se mantuvo en perlas criogénicas en tubos Microbank a
-70ºC. Para experimentos posteriores, la cepa se revivió en un agar de Wilkinson Chalgren (WC) (Oxoid, Reino Unido) y en un medio TPY (medio de extracto de levadura tripticasa phytona del inglés Trypticase Phytone Yeast) y se cultivó anaeróbicamente (composición de CO_{2} y N_{2} al 80% y 20% respectivamente) a 37ºC durante 48 horas. La morfología de la colonia y la ausencia de contaminación se probaron con tinción de gram.
Cepas de E. coli
La cepa de Escherichia coli DH5a utilizada en este estudio se incubó en la forma habitual en condiciones aeróbicas a 37ºC en un agar de Luria Bertani (LB) o en un caldo (Sambrook J. And Russell W. D) (2001). Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York) y cuando era necesario se suplementó con antibióticos (100 \mug/ml ampicilina y/o 15 \mug/ml cloranfenicol) y 40 \mul de X-\beta- Gal al 2%, 7 \mul IPTG (isopropil-\beta- D-tiogalctosido) al 20% que se aplicaron en la superficie de una placa de agar de 90 mm previamente preparada.
La cepa DH5a de E. coli (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) (genotipo: F \varphi80lacZ\DeltaM \Delta(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(r_{k}^{-}, m_{k}^{-}) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1\lambda) es una cepa \alpha-galactosidasa positiva y fue utilizada en experimentos de expresión y para otras manipulaciones genéticas.
Extracción del ADN genómico de Bifidobacterium bifidum
Se aisló el ADN genómico de la cepa (NCIMB 41171) de Bifidobacterium bifidum utilizando el siguiente método en el que se preparó el ADN cromosómico a partir de gránulos de células recogidos de 100 ml de caldo anaeróbico de WC. La células se volvieron a suspender en 10 ml de tampón TES (Tris-HCl 10 mM, EDTA 10 mM, NaCl 10 mM, pH=8) y se trataron con 200 \mul de una mezcla de lisozima/mutanolisina (4:1, lisozima 10 mg/ml mutanolisina 1 mg/ml) durante 30 minutos a 37ºC. A continuación las células se trataron con 200 \mul de proteinasa K (a 20 mg/ml) y 200 \mul de ARNasa (ambos 10 mg/ml) y se incubaron durante una hora a 65ºC. Finalmente las células se trataron con 2 ml de SDS al 10% y se incubaron durante 15 minutos a 65ºC. Se añadieron 12 ml de fenol/cloroformo y se repitió la extracción hasta que la fase acuosa se pudo separar fácilmente de la interfase. El ADN genómico se precipitó con isopropanol y se volvió a suspender en Tris-HCl 10 mM- EDTA 1 mM (pH=8). El ADN genómico fue digerido con enzimas de restricción, se unió a pSP72 digerido después con las mismas enzimas y se trató con fosfatasa alcalina. La digestión del ADN genómico de B. Bifidum se llevó a cabo utilizando EcoRI, PstI, BamHI, SmaI y KpnI. Las mezclas de ligación se utilizaron para transformar E. coli DH5a y se identificaron clones positivos de \beta-galactosidasa como colonias azules en las placas que contenían X-Gal.
Preparación del Vector de ADN
El vector utilizado en este estudio para el clonado y la expresión fue pSP72 (Promega, Reino Unido) (Krieg, P.A. y Melton, D.A. 1978). In vitro RNA synthesis with SP6 RNA polymerase. (Methods in Enzymology, 155: 397-415).
Se eligió este vector por la falta de actividad de complementación del fragmento \alpha de \beta-galactosidasa que no esta codificado en pSP72. Este vector no lleva el segmento corto del ADN de E. coli que contiene la secuencia reguladora y la información codificante para los 146 aminoácidos primeros de la \beta-galactosidasa que en combinación con las cepas de E. coli (por ejemplo DH5a) que expresan el extremo carboxi-terminal de esta \beta-galactosidasa dan una \beta-galactosidasa activa (complementación \alpha).
El vector fue digerido con las enzimas de restricción siguientes: PstI, Bam HI, HindIII, SmaI, KpnI, y, EcoRI según las instrucciones del fabricante utilizando diez veces mas de enzima que de ADN (unidades enzimáticas: \mugr ADN igual a diez unidades de enzima por un \mugr de plásmido de ADN o diez unidades enzimáticas por 0,5 pmol de plásmido de ADN). Después de la inactivación por calor de la enzima (20 min a 65ºC) se analizaron los patrones de restricción por análisis de electroforesis en gel horizontal. La presencia de un solo fragmento en el gel indicaba la digestión completa del vector y únicamente la digestión de restricción del mismo.
Se comprobó también la digestión suficiente del vector mediante la transformación de moléculas no ligadas a células E. coli DH5a competentes. El número de colonias formadas en las placas de agar LB suplementadas con ampicilina (100 \mug/ml) fue un indicador de las moléculas no digeridas y del fondo esperado durante los experimentos siguientes.
A continuación los vectores se defosforilaron con fosfatasa alcalina de intestino de ternera CIAP (Promega, Southampton, Reino Unido) siguiendo las instrucciones del fabricante. La eficacia del tratamiento se comprobó por ligación (con ligasa de ADN del Bacteriófago T4 siguiendo las instrucciones del fabricante) después de la transformación en las células DH5a. El número de colonias formado representaba el número de moléculas recircularizadas (vectores no clonados) y al restar de las mismas las colonias formadas sin tratamiento con el vector CIAP se obtuvo el número de vectores no defosforilados.
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Construcción de la Biblioteca de ADN Genómico
El ADN genómico se digirió parcialmente con seis enzimas de restricción que reconocen las secuencias de hexanucleotidos frecuentes en los ADN procariotas. EcoRI, BamHI , PstI, KpnI, SmaI y HindIII son endonucleasas de restricción de tipo II que reconocen específicamente las secuencias 5'G/AATTC'3, 5'G/GATCC'3, 5'CTGCA/G'3, 5'GGTAC/C3', 5'CCC/GGG3' y 5'A/AGCTT3' respectivamente, y realizan rupturas en la doble hebra dentro de estas secuencias generando protuberancias 5' de cuatro nucleótidos, AATT, GATC, AGCT en el caso de EcoRI, BamHI y Hind III respectivamente, y protuberancias 3', ACGT, GTAC en el caso de PstI y KpnI respectivamente y extremos romos en el caso de SmaI.
Todas estas enzimas eran activas y capaces de escindir ADN solamente en presencia de iones de magnesio divalentes. Estos iones fueron el único cofactor requerido.
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Digestión de restricción del ADN
Todas las digestiones de restricción de las muestras de ADN genómico se incubaron durante 2 horas a 37ºC y finalmente se inactivaron por calor a 65ºC durante 20 minutos. Después las reacciones se enfriaron a temperatura ambiente y se añadió la cantidad adecuada de tampón de carga, seguido de mezclado suave en un capilar de vidrio sellado. A continuación se cargaron las disoluciones en pocillos de un gel de agarosa al 0,8% (fuente de alimentación 4-5 volts/cm durante 14-16 horas) y el tamaño del ADN digerido se estimó con el de estándares de ADN de 1kb (Promega, Reino Unido) (Sambrook J, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002)).
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Purificación de los fragmentos generados después de la digestión de restricción
La purificación de los fragmentos de las mezclas de reacción y de los geles de agarosa se realizó utilizando el kit de extracción en gel QIAEX de Qiagen (West Sussex, Reino Unido). Los protocolos están descritos detalladamente en el manual del fabricante.
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Transformación y ligación del ADN
Después de la purificación de los fragmentos de ADN con el kit de extracción en gel QIAEX, se ligaron con el vector pSP72 tratado con CIAP. Para la ligación, se transfectaron las cantidades adecuadas de ADN a tubos de microfuga estériles de 0,5 ml como se muestra en la Tabla 1.
TABLA 1 Mezclas de ligación
1
El tubo A muestra el número de vectores de ADN auto-ligados que deben ser sustraídos del número total de transformantes después de la transformación. El tubo B muestra la ligación del vector con los fragmentos de ADN y el tubo C muestra el control para poder calcular la eficacia de la transformación.
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Antes de cada ligación los fragmentos de ADN se calentaron a 45ºC durante 5 minutos para fundir cualquier extremo cohesivo que anillarse durante la preparación de los fragmentos. Se eligió una proporción molar vector: inserto de ADN de 1:1 para todas las reacciones de ligación y la reacción de ensamblado se realizó según las instrucciones de Promega.
Se añadió a los tubos A y B 1,0 \mul de tampón de ligación x 10 y 0,5 unidades Weiss de ligasa de ADN T4 (Pormega, Reino Unido) y el volumen de ligación se ajustó a 10 \mul con agua grado para biología molecular. Se añadió a los tubos C 1,0 \mul de tampón de ligación x 10 y el volumen de ligación se ajustó a 10 \mul con agua grado para biología molecular.
Se añadieron los fragmentos de ADN a los tubos junto con el agua y después se calentaron a 45ºC durante 5 minutos para fundir cualquier extremo cohesivo que anillase durante la preparación. El ADN se enfrió a 0ºC antes de añadir el resto de los reactivos de ligación y las mezclas de reacción se incubaron durante la noche a 16ºC (Sambrook and Russell, 2001).
Después de la precipitación con etanol y la purificación de los fragmentos ligados (para eliminar la mezcla de ligación que causa una reducción de la eficacia de la transformación) se llevaron a cabo las transformaciones según las instrucciones de Hanahan. Se añadieron \sim50 ng de ADN ligado en 5 \mul de disolución a 100 \mul de células DH5a competentes. Después del tratamiento de calentamiento y de la expresión del gen de resistencia a la ampicilina las células se extendieron sobre la superficie de las placas LB que contenían ampicilina (100 \mug/ml), X-\beta-Gal (40 \mul de X-\beta-Gal al 2%) y IPTG (7 \mul de IPTG al 20%).
Se midió el número de transformantes de cada reacción de ligación. El número de transformantes obtenido normalmente en el tubo C fue de 2x10^{5} - 1x10^{6} cfu/\mug mientras que en el tubo A fue de 500-600 cfu/\mug. El número de transformantes del tubo A era una indicación de la eficacia del tratamiento del vector de ADN. El número de transformantes del tubo B estaba en un intervalo a partir de 2-4x10^{4} cfu/\mug.
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Número de transformantes
Las mezclas de ligación con ADN cromosómico de PstI dieron lugar a 13 clones positivos de \beta-galactosidasa de entre los \sim2500 transformantes analizados mientras que con BamHI dieron lugar a 3 clones positivos (\sim1300 transformantes analizados), con KpnI dieron lugar a 7 clones positivos (\sim2000 transformantes analizados), con SmaI dieron lugar a 3 clones positivos (\sim1600 transformantes analizados) y con HinIII dieron lugar a 2 clones positivos (\sim1200 transformantes analizados).
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Digestión de clones positivos
Para identificar los genes de las diferentes \beta-galactosidasas, los plásmidos aislados de los clones positivos fueron digeridos según la siguiente tabla.
2
Los análisis de la electroforesis en gel de los fragmentos generados después de la digestión mostraron que cada uno de los plásmidos pB1, pP1, pP2 y Pp11 tiene un inserto que codifica una \beta-galactosidasa diferente. Los clones que contienen P2 se utilizaron para análisis posteriores.
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Secuenciación de ADN
La secuenciación del ADN se efectúo con el método de Sanger de terminación de cadenas por dideoxinucleótidos utilizando el kit de secuenciación por ciclo BigDye Terminador v.3.0 (Applied Biosystems EE.UU) y se analizó con el ABI Prism 3100, un sistema de análisis de ADN basado en la fluorescencia que incorpora electrofóresis capilar.
Los extremos 5' y 3' de los fragmentos de insertos de ADN se secuenciaron con cebadores específicos de los vectores. A continuación los insertos se secuenciaron utilizando el Sistema de Cebadores Genómico (GPS-1) (New England Biolabs, Reino Unido). GPS-1 es un sistema in vitro basado en el transposón TN7 que utiliza la Transposasa TnsABC para insertar el Transposón aleatoriamente en el ADN diana. Se utilizó una proporción de masa donante: ADN diana de 1:4 siguiendo las instrucciones del fabricante. El número de plásmidos aislados para la secuenciación después de la inserción del Transcebador en el plásmido diana fue de 25. Este número se calculó siguiendo las instrucciones del fabricante y supone una profundidad de cobertura de cinco veces.
Debido a la larga secuencia de nucleótidos del plásmido pP2 que codifica la proteína P2, se seleccionó para ser secuenciada únicamente la parte que contiene el gen de la \beta-galactosidasa. La enzima inactivada después de la inserción del inserto de transposasa en una posición aproximada de 172 pb del fragmento secuenciado indicaba que el codón de iniciación se encontraba aguas arriba de esta posición. De manera similar, la inserción del inserto en la posición 2882bp eliminó completamente la actividad de la enzima indicando que el codón de finalización se encontraba aguas abajo de esta posición. Además la actividad de la enzima se eliminó completamente con la inserción de los insertos en las posiciones 262pb, 331pb, 375pb, 621pb, 866pb,1348pb, 1358pb, 1394pb, 1513pb, 1704pb, 2128pb, 2519pb en relación con el primer nucleótido que había sido secuenciado.
El análisis del dominio N-terminal con el software SignaIIP y PSORT. No mostró la señal de ningún péptido, indicando que P2 no se secretaba extracelularmente.
La mezcla de reacción de secuenciación contenía aproximadamente 400-600 ng de plásmido de ADN, 3,2 pmol de disolución de cebador y 4 \mul de disolución Terminator BigDye.
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Identificación del marco de lectura abierto
El marco de lectura abierto (ORF) de P2 se localizó utilizando el buscador ORF de NCBI en la dirección web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.html). Se utilizó el código genético de la bacteria y se determino que la longitud del marco era de 100bp. La secuencia del nucleótido se tradujo en todos los seis posibles marcos de lectura y se identificó un marco de lectura abierto de 738 aminoácidos que codifica una posible \beta-galactosidasa (la traducción se muestra en la figura 2).
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Ejemplo 2 Síntesis con la enzima \beta-galactosidasa clonada aislada de Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 en el hospedador E. coli (cepa DH5a)
La síntesis descrita a continuación, a no ser que indique lo contrario, se efectúo con la totalidad de las células hospedadores de E. coli DH5a después del tratamiento de la biomasa de E. coli (recogida por centrifugación a 10.000 g) con tolueno a una concentración de 2000 ppm para incrementar la permeabilidad celular y también para hacer las células no viables destruyendo la membrana citoplásmica. La biomasa de E. coli se preparo como se ha descrito en ejemplo 1 bajo la denominación de "Cepas de E. coli".
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Síntesis con la enzima clonada
La síntesis con la \beta-galactosidasa se efectúo con una concentración de substrato del 40% (proporción en peso) de concentración inicial de lactosa. La disolución de síntesis se preparo con un tampón fosfato 0,1 M a pH = 6,0 que contiene 1 g/l de Tween 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitán) adicional. La síntesis se efectúo a 40ºC en un baño de agua con agitación a 150 rpm. El pH óptimo para la enzima específica se eligió en base a las medidas de actividad (utilizando como substrato O-nitrofenil-\beta-D-galactopiranosido) de una preparación enzimática específica a varios valores de pH.
Para la síntesis de galacto-oligosacáridos se utilizaron 2 ml del sobrenadante del lisado celular (después de la ruptura de las células de E. coli con una Prensa Francesa) con 8 g de lactosa al 50% (porcentaje en peso) para obtener una concentración de substrato final del 40% (porcentaje en peso). Esta preparación enzimática tenia una actividad de 735 U/ml.
Las concentraciones de los distintos azucares presentes en la mezcla durante la síntesis se muestran en la Figura 3. En la Figura 4 se muestra la cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento acoplada a un cromatogramas de detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) de las mezclas de galacto-oligosacaridos sintetizados por la \beta-galactosidasa clonada de B. Bifidum NCIMB 41171. Las concentraciones de azúcar de la mezcla de galacto-oligosacáridos en el momento óptimo de síntesis se muestran en la Tabla 1.
TABLA 1 Composición de hidratos de carbono de la síntesis de galacto-oligosacáridos a una concentración de lactosa inicial del 40% (proporción en peso) en el momento en el que se observó la concentración máxima de oligosacáridos
3
Lac: Lactosa, Glc: Glucosa, Gal: galactosa, DP: grado de polimerización
<110> MCDONALD, Sarah C
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<120> Producto y proceso
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<130> 14011:KG
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 0606112.1
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2006-03-28
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<160> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.4
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 4395
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<212> ADN
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<213> Bifidobacterium bifidum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> Beta-galactosidasa
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<222> (1)..(4395)
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<400> 1
4
5
6 
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<210> 2
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<211> 738
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<212> PRT
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<213> Bifidobacterium bifidum 
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<220>
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<221> Beta-galactosidasa
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<222> (1)..(738)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
7
8
9
10

Claims (14)

1. Una secuencia de ADN que codifica una \beta-galactosidasa, donde la secuencia se selecciona entre la secuencia dada en SEQ. ID NO: 1 o de un fragmento o una degeneración de la misma, teniendo dicha degeneración una homología de 75% a 95%.
2. La secuencia de ADN según la reivindicación 1, donde dicha secuencia comprende sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos que tienen como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos según la SEQ. ID NO: 2 inferior al 25%.
3. Una secuencia de ADN según la reivindicación 1 o reivindicación 2, donde dicha secuencia comprende sustituciones de nucleótidos que tienen como resultado substituciones de aminoácidos conservadoras.
4. Una enzima \beta-galactosidasa codificada por una secuencia de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Una enzima \beta-galactosidasa que comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ. ID NO:2.
6. Un vector recombinante que comprende una secuencia de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
7. El vector según la reivindicación 6, donde dicho vector es un vector de expresión.
8. Una célula hospedadora que es una célula de levadura, una célula de hongo o una célula bacteriana seleccionada del grupo que consiste en Lactococcus, Lactobacillus, Escherichia, Bacillus y Aspergillus que comprende una secuencia de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
9. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7.
10. La célula hospedadora según la reivindicación 8 o reivindicación 9, donde la célula se selecciona del grupo que consiste en Bacillus subtilis, Bacillus circulans y Aspergillus Níger.
11. Uso de una enzima de la reivindicación 4 o reivindicación 5, o de una célula de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, para producir una mezcla de oligosacáridos.
12. Uso de una enzima de la reivindicación 4 o reivindicación 5, o una célula de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, para producir una mezcla de oligosacáridos que sea parte de un producto seleccionado del grupo que consiste en productos lácteos, tales como leche líquida, leche en polvo seca, leches infantiles, leche maternizada, helado, yogur, queso, productos de leche fermentada, bebidas tales como zumo de fruta, alimentos infantiles, cereales, pan, galletas, dulces, pasteles, suplementos alimenticios, suplementos dietéticos, productos comestibles probióticos, productos comestibles prebióticos, alimentos para animales, alimentos para aves y medicamentos.
13. Uso de una célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, para producir un producto seleccionado del grupo que consiste en productos lácteos, tales como leche líquida, leche en polvo seca, leches infantiles, leche maternizada, helado, yogur, queso, productos de leche fermentada, bebidas tales como zumos de fruta, alimentos infantiles, cereales, pan, galletas, dulces, pasteles, suplementos alimenticios, suplementos dietéticos, productos comestibles probióticos, productos comestibles prebióticos, alimentos para animales, alimentos para aves y medicamentos.
14. Un proceso para producir una enzima de la reivindicación 4 o reivindicación 5, que comprende cultivar una célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 en un medio de cultivo adecuado en condiciones que permita la expresión de dicha enzima y recuperar la enzima resultante del cultivo.
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0525857D0 (en) * 2005-12-20 2006-02-01 Product and process
EP2376619A4 (en) 2008-12-15 2012-07-04 Greenlight Biosciences Inc METHODS FOR CONTROLLING FLOWS IN METABOLIC PATHWAYS
AU2009347008B2 (en) 2009-05-27 2013-08-15 Clasado Limited Method of preventing diarrhoea
RU2011150421A (ru) * 2009-06-05 2013-07-20 Амано Энзайм Инк. β-ГАЛАКТОЗИДАЗА, ПОЛУЧЕННАЯ ИЗ Bacillus circulans
CA2797786C (en) * 2010-05-07 2020-09-22 Greenlight Biosciences, Inc. Methods for control of flux in metabolic pathways through enzyme relocation
DK3219796T3 (da) 2010-08-31 2020-12-21 Greenlight Biosciences Inc Fremgangsmåder til kontrol af strømningen i metaboliske reaktionsveje ved hjælp af proteasemanipulation
RU2523581C2 (ru) * 2012-10-12 2014-07-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук ПРИМЕНЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ БЕТА-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ AsBgl 1390 ИЗ АРХЕИ SACCHAROVORANS В КАЧЕСТВЕ БЕТА-ГЛЮКОЗИДАЗЫ, БЕТА-КСИЛОЗИДАЗЫ И БЕТА-МАННОЗИДАЗЫ
HK1216547A1 (zh) 2012-12-21 2016-11-18 Greenlight Biosciences Inc. 用於將甲烷轉化成燃料、丙酮酸或異丁醇的無細胞系統
BR112016002494A2 (pt) 2013-08-05 2017-09-05 Greenlight Biosciences Inc Proteí-nas construídas com um sítio de clivagem de protease, ácido nucléico, vetor, célula e processo de engenharia de uma proteína recombinante e de um grande número de variantes de ácidos nucleicos que codificam proteínas recombinantes
SG11201707370WA (en) 2015-03-30 2017-10-30 Greenlight Biosciences Inc Cell-free production of ribonucleic acid
RU2609646C2 (ru) * 2015-04-30 2017-02-02 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Курский государственный университет" (ФГБОУ ВПО "КГУ") Модифицированный вариант гена LacZ из E. coli, кодирующий стабилизированный вариант белка, для использования в качестве транскрипционного репортера в Yarrowia lipolytica
KR102563261B1 (ko) * 2015-12-31 2023-08-07 엘지디스플레이 주식회사 전도성 코팅액 조성물, 이를 이용한 정전기 방지막 및 표시장치
MY195729A (en) 2016-04-06 2023-02-07 Greenlight Biosciences Inc Cell-Free Production of Ribonucleic Acid
WO2018129275A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Greenlight Biosciences, Inc. Cell-free production of sugars
EP3609909B1 (en) 2017-04-11 2025-07-02 Kerry Group Services International Ltd Lactase enzymes with improved activity at low temperatures
AU2018251957C9 (en) 2017-04-11 2025-03-20 Kerry Group Services International Ltd Lactase enzymes with improved properties
WO2018189238A1 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Chr. Hansen A/S Lactase enzymes with improved properties
AR113764A1 (es) 2017-10-11 2020-06-10 Greenlight Biosciences Inc Métodos y composiciones para la producción de nucleósido trifosfato y ácido ribonucleico
CN112654251A (zh) * 2018-10-17 2021-04-13 科·汉森有限公司 在酸性pH下具有改善的特性的乳糖酶
RU2698460C1 (ru) * 2019-03-28 2019-08-27 Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" Способ получения рекомбинантной в-1,4-галактозидазы bgaa из streptococcus pneumoniae
EP4022048A1 (en) 2019-08-30 2022-07-06 Chr. Hansen A/S Production of lactase enzymes using altered regulation strains

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2723618A1 (de) * 1977-05-25 1978-11-30 Wolfgang Dockhorn Verfahren und vorrichtung zur bestimmung der dichte einer beschwerten spuelfluessigkeit einer tief-, insbesondere einer oelbohrung
US4435389A (en) * 1980-07-07 1984-03-06 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Composition for promoting growth of bifidobacteria
EP0089940A1 (en) 1982-03-23 1983-09-28 BioCarp AB Compositions for therapeutic or diagnostic use containing oligosaccharides
JPS6259290A (ja) 1985-09-09 1987-03-14 Riyoushiyoku Kenkyukai イソラフイノ−ス及びその製造方法
JP2711095B2 (ja) * 1986-09-27 1998-02-10 ユニチカ株式会社 ビフイドバクテリウム菌の増殖促進剤の製造法
DK199887D0 (da) 1987-04-15 1987-04-15 Danisco Bioteknologi As Gaerstamme
JP2518663B2 (ja) * 1987-12-24 1996-07-24 株式会社ヤクルト本社 ガラクトオリゴ糖含有加工乳の製造法
US5149640A (en) * 1988-12-22 1992-09-22 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing galactose transfer products
JP2819312B2 (ja) 1989-07-18 1998-10-30 焼津水産化学工業株式会社 Ｎ―アセチルラクトサミンの製造法
JP2819313B2 (ja) 1989-07-18 1998-10-30 焼津水産化学工業株式会社 Ｎ―アセチルラクトサミンの製造方法
CA2027835A1 (en) 1990-01-19 1991-07-20 William D. Prevatt Strains of phaffia rhodozyma containing high levels of astaxanthin
JP2750767B2 (ja) 1990-02-21 1998-05-13 雪印乳業株式会社 新規糖アルコール
JP2952439B2 (ja) 1991-11-26 1999-09-27 株式会社ホーネンコーポレーション 新規飲食品素材
JPH05146296A (ja) 1991-11-27 1993-06-15 Yakult Honsha Co Ltd β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミド
FI95319C (fi) * 1993-05-12 1996-01-10 Borealis Polymers Oy Menetelmä ja laitteisto näytteen ottamiseksi
JP2904687B2 (ja) 1993-09-17 1999-06-14 雪印乳業株式会社 新規オリゴ糖
FR2723963B1 (fr) 1994-08-31 1997-01-17 Gervais Danone Co Preparation de produits fermentes par streptococcus thermophilus, enrichis en galacto-oligosaccharides et en beta-galactosidase
JP3037576B2 (ja) * 1995-01-26 2000-04-24 コーエイ工業株式会社 濾液測定方法およびその装置
JP3246296B2 (ja) 1995-11-09 2002-01-15 宇部興産株式会社 半溶融金属の成形方法
JPH1023898A (ja) 1996-07-10 1998-01-27 Meiji Milk Prod Co Ltd Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体の新規な製造法
KR100245383B1 (ko) 1996-09-13 2000-03-02 정훈보 교차홈 형성 전열관 및 그 제조 방법
JP2894293B2 (ja) 1996-09-17 1999-05-24 不二製油株式会社 ガラクタナーゼｓ−３９及びこれを産生するバチルスエスピーｓ−３９
EP1084228A1 (en) * 1998-06-09 2001-03-21 U.S. Department of Agriculture GENES CODING FOR TOMATO beta-GALACTOSIDASE POLYPEPTIDES
NL1010770C2 (nl) 1998-12-09 2000-06-13 Nutricia Nv Preparaat dat oligosacchariden en probiotica bevat.
JP3049693B1 (ja) 1998-12-10 2000-06-05 ソフィアインターナショナル株式会社 端末ターミナル
FR2789086B1 (fr) 1999-02-03 2003-01-31 Alain Rambach Procede de detection de bacteries cultivees en condition anaerobie
DE60126269T2 (de) 2000-05-26 2007-06-21 Arla Foods Amba Isolierte beta-galactosidase von bifidobacterium
EP1227152A1 (en) 2001-01-30 2002-07-31 Société des Produits Nestlé S.A. Bacterial strain and genome of bifidobacterium
US6905594B2 (en) * 2002-10-11 2005-06-14 G6 Science Corp. Filter apparatus and methods to capture a desired amount of material from a sample suspension for monolayer deposition, analysis or other uses
GB0229015D0 (en) 2002-12-12 2003-01-15 Novartis Nutrition Ag New Compound
GB0303716D0 (en) 2003-02-18 2003-03-19 Mars Uk Ltd Food product and process
NZ542482A (en) 2003-06-30 2008-05-30 Clasado Inc Novel galactooligosaccharide composition from Bifidobacterium bifidum and the preparation thereof
US7111503B2 (en) * 2004-01-22 2006-09-26 Datalog Technology Inc. Sheet-form membrane sample probe, method and apparatus for fluid concentration analysis
GB0522740D0 (en) 2005-11-08 2005-12-14 Clasado Inc Process for the production of oligosaccharides
CN101095698B (zh) * 2006-06-26 2010-12-01 青岛东海药业有限公司 酪酸梭菌防治便臭毒素引起的相关症状和疾病的用途
GB0809921D0 (en) 2008-05-30 2008-07-09 Clasado Inc Product and process therefor

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