DE60126269T2

DE60126269T2 - Isolierte beta-galactosidase von bifidobacterium

Info

Publication number: DE60126269T2
Application number: DE60126269T
Authority: DE
Inventors: Flemming JöRGENSEN; Cai Olen HANSEN; Peter Stougaard
Original assignee: Arla Foods AMBA
Current assignee: Arla Foods AMBA
Priority date: 2000-05-26
Filing date: 2001-05-25
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2021-05-26
Also published as: EP1283876A2; AU2001262068B2; AU6206801A; EP1283876B1; JP2003534007A; US7081355B2; KR100878968B1; ATE352611T1; US6555348B2; WO2001090317A3; US20020086358A1; DK1283876T3; JP5042431B2; DE60126269D1; WO2001090317A2; US20030162280A1; NZ522623A; KR20030016275A; KR20080045766A

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verbesserung von fermentierten Milchprodukten. Insbesondere betrifft die Erfindung eine β-Galactosidase mit transgalactosylierender Aktivität. Insbesondere betrifft die Erfindung eine aus Bifidobacterium bifidum isolierte β-Galactosidase, wobei das C-terminale Ende des Proteins deletiert wurde und das resultierende verkürzte Enzym eine höhere transglalactosylierende Aktivität als Hydrolase-Aktivität aufweist. Wenn Lactose als Substrat verwendet wird, sind die Produkte der Transgalactosylase-Aktivität Galacto-Oligosaccharide. Galacto-Oligosaccharide steigern das Wachstum des gesundheitsfördernden Bifidobacterium, das in der Milchindustrie in verschiedenen Anwendungen eingesetzt werden kann.
Stand der Technik
Die Gattung Bifidobacterium zählt zu den Typen von Bakterienkulturen, die am häufigsten in der Milchindustrie zum Fermentieren der verschiedensten Milchprodukte verwendet werden. Außerdem hat die Einnahme von Bifidobacterium-enthaltenden Produkten eine gesundheitsfördernde Wirkung. Diese Wirkung wird nicht nur durch einen erniedrigten pH-Wert der Darminhalte erreicht, sondern auch durch die Fähigkeit von Bifidobacterium, die Darmflora in solchen Individuen wieder zu besiedeln, bei denen die Darmflora zerstört worden war, z.B. durch die Einnahme von Antibiotika. Weiterhin hat Bifidobacterium die Fähigkeit, mögliche schädliche Darmmikroorganismen zu verdrängen.
Galacto-Oligosaccharide sind dafür bekannt, dass sie das Wachstum von Bifidobacterium steigern. Diese Wirkung wird wahrscheinlich durch die einmalige Fähigkeit von Bifidobacterium erreicht, Galacto-Oligosaccharide als Kohlenstoffquelle zu nutzen. Weiterhin wird angenommen, dass eine Nahrungsergänzung mit Galacto-Oligosacchariden eine Reihe von vor Krankheit schützenden langfristigen Effekten hat. Z.B. wurde gezeigt, dass die Einnahme eines Galacto-Oligosaccharids in Ratten deutlich gegen die Entwicklung eines kolorektalen Karzinoms schützt (Wijnands et al., 1999). Deshalb besteht ein großes Interesse an der Entwicklung von billigen und effizi enten Verfahren zum Herstellen von Galacto-Oligosacchariden zur Verwendung in der Industrie zum Verbessern von Nahrungsergänzungsmitteln und Milchprodukten.
Das Enzym β-Galactosidase (EC 3.2.1.23) hydrolysiert üblicherweise Lactose zu den Monosacchariden D-Glucose und D-Galactose. In der normalen Enzymreaktion von β-Galactosidasen hydrolysiert das Enzym Lactose und bindet die Galactose-Monosaccharide vorübergehend in einem Galactose-Enzym-Komplex, der die Galactose auf die Hydroxylgruppe von Wasser überträgt, wodurch es zur Freisetzung von D-Galactose und D-Glucose kommt. Bei hohen Lactosekonzentrationen jedoch sind einige β-Galactosidasen in der Lage, Galactose in einem Transgalactosylierung genannten Prozess auf die Hydroxylgruppen von D-Galactose oder D-Glucose zu übertragen, wodurch Galacto-Oligosaccharide erzeugt werden.
Enzyme, die zur Transgalactosylierung fähig sind, wurden aus einem großen Spektrum von Mikroorganismen isoliert, einschließlich Bakterien und Hefen. Durch die Beobachtung, dass Galacto-Oligosaccharide das Wachstum des gesundheitsfördernden Bifidobacterium steigern, wurden Untersuchungen von Bifidobacterium und ihren β-Galactosidase-Enzymen angeregt. Zwei DNA-Sequenzen von β-Galactosidase-Genen von B. breve und B. longum wurden in GeneBank hinterlegt (Hinterlegungsnummern E5040 bzw. AJ242596). Dumortier et al., (1994) haben berichtet, dass B. bifidum DSM 20215 drei β-Galactosidasen enthält und dass eines dieser Enzyme transgalactosylierende Eigenschaften besitzt. Jedoch wurde keine Identifizierung des Enzyms, das diese Aktivität besitzt, oder einer beliebigen Sequenz des Enzyms oder des entsprechenden Gens von B. bifidum DSM 20215 veröffentlicht.
Die Herstellung von Galacto-Oligosacchariden durch die Verwendung von β-Galactosidasen wurde in mehreren Veröffentlichungen beschrieben. Z.B. wurde gezeigt, dass β-Galactosidase aus E. coli bei hohen Lactosekonzentrationen Oligosaccharide produziert (0,5 M oder etwa 20% Lactose; Huber et al., 1976). Für verschiedene thermophile Mikroorganismen wurde gezeigt, dass sie bei hohen Temperaturen und hohen Lactosekonzentrationen Oligosaccharide produzieren, z.B. kann Sterigmatomyces elviae aus 20% Lactose bei 60°C 39% Oligosaccharide produzieren (Onishi und Tanaka, 1995), und Saccharopolyspora rectivirgula kann in 1,75 M Lactose bei 70°C 41% Oligosaccharide synthetisieren (Nako et al., 1994).
Jedoch haben die vorstehend beschriebenen Enzyme alle den Nachteil, dass sie entweder hohe Temperaturen oder hohe Lactosekonzentrationen oder beides benötigen, um eine signifikante Transgalactosylase-Aktivität zu zeigen. Somit besteht ein Bedarf für die Entwicklung von billigeren und effizienteren Verfahren zum Herstellen von Galacto-Oligosacchariden zur Verwendung in der Industrie.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt eine neue β-Galactosidase aus Bifidobacterium bifidum. Eine verkürzte Version des Enzyms hat erstaunlicherweise gezeigt, dass sie eine hohe transgalactosylierende Aktivität aufweist. Wenn das verkürzte Enzym oder eine Wirtszelle, die das rekombinante verkürzte Enzym exprimiert, mit Lactose unter geeigneten Bedingungen inkubiert wird, werden Galacto-Oligosaccharide mit hoher Effizienz produziert. Das Vorliegen von Galacto-Oligosacchariden in Milchprodukten oder anderen essbaren Produkten hat den Vorteil, dass das Wachstum des gesundheitsfördernden Bifidobacterium in dem Produkt oder in der Darmflora des Konsumenten nach der Einnahme des Produkts oder beides gesteigert wird.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz bereit, die ein Enzym codiert, wobei das Enzym ein Verhältnis von Transgalactosylase-Aktivität zu β-Galactosyase-Aktivität von mehr als 1:1 aufweist, wobei die Sequenz ein Fragment von SEQ ID NO: 1 ist, welches einen Bereich von Position 212–308 bis Position 3734 überspannt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: OLGA5-Sequenz. DNA- und Proteinsequenz der OLGA5-β-Galactosidase aus Bifidobacterium bifidum. Die Signalsequenz ist in fetter Schrift dargestellt, und der Teil des OLGA5-Gens, der in OLGA347 deletiert ist, ist kursiv dargestellt. Die BglII-Stelle, die zum Erzeugen der Deletion verwendet wird, ist hervorgehoben.
2: Vergleich von Wirkstelle-Regionen der β-Galactosidase. Alignment von Regionen im Bereich des katalytischen Glu461-Restes (hervorgehoben) aus E. coli. Die Sequenzen sind mit ihren Datenbank-Hinterlegungsnummern bezeichnet. 6-Phospho-β-galactosidase-Sequenzen sind mit einem (P) markiert.
3: Neighbour-Joining-Analysen des Alignment in 1, wobei die Sulfolobus-Sequenzen als eine Außengruppe verwendet wurden. Die Ergebnisse aus einer Bootstrap-Analyse (n = 100) sind für die Verzweigungen („junctions") mit einem Wert über 80 dargestellt.
4: Transgalactosylase-Aktivität von OLGA5. Ein Gesamt-Zelllysat von E. coli-Zellen, die das OLGA5-Gen in einem Plasmid enthalten, wurde mit 0,4 M Lactose 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Ein Gesamt-Reaktionsvolumen von 50 μl enthielt die angegebenen Mengen des Gesamt-Zelllysats. Die Reaktionsproben wurden auf einer Kieselgel-DC-Platte analysiert. Die Platte wurde mit Orcinol-Reagenz besprüht, um die Zucker sichtbar zu machen.
5: C-terminale Deletionen der OLGA5-β-Galactosidase. Ein aus 1752 Aminosäuren bestehendes offenes Leseraster codiert die OLGA5-β-Galactosidase, wobei die an Anfang stehenden 32 Aminosäuren wahrscheinlich ein Signalpeptid darstellen (weißes Kästchen). Deletionsmutanten von OLGA5 wurden unter Verwendung der angegebenen Restriktionsstellen konstruiert. Lysate, die aus über Nacht gezüchteten Bakterienkulturen hergestellt worden waren, wurden für die Messung der β-Galactosidase-Aktivität eingesetzt, und die relativen Ergebnisse sind rechts der jeweiligen Konstrukte angegeben. Die verwendeten Symbole von Restriktionsenzymen sind: BglII (B), EcoRI (E), EcoRV (V), HindIII (H), KpnI (K), NruI (N), PstI (P).
6: DC-Analyse der Transgalactosylase-Aktivität. Für die zwei getesteten Deletionsmutanten OLGA347 und OLGA345 wurden Gesamt-Zelllysate in den angegebenen Mengen eingesetzt, die man mit 0,4 M Lactose in einem Gesamtvolumen von 50 μl reagieren ließ. Die Reaktionsgemische wurden 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden auf einer Kieselgel-DC-Platte analysiert. Die Platte wurde mit Orcinol-Reagens besprüht, um die Zucker sichtbar zu machen.
7: Oligosaccharide, produziert durch OLGA347. Die angegebenen Mengen von Gesamt-Zelllysat von OLGA347 wurden mit 15% Lactose in einem Gesamtvolumen von μl 21 Stunden bei 37°C inkubiert. Radioaktive Lactose wurde verwendet, die in der C1-Position von Glucose mit ¹⁴C markiert war. Die Proben wurden auf einer DC-Platte aufgetrennt und durch die Verwendung eines Phospho-Imagers quantitativ bestimmt. A: Abbildung, die für die Messung von ¹⁴C-Signalen aus den Flecken von Lactose, Glucose und Galacto-Oligosacchariden (GOS) verwendet wurde. B: Gemessene ¹⁴C-Signale nach Subtraktion von Hintergrund (Grundlinie, reblind line").
8: HPLC-Messung von Reaktionsprodukten des OLGA347-Enzyms. Umsetzungen in 10%, 20% und 40% Lactose wurden unter Verwendung der angegebenen Mengen von OLGA347-Gesamt-Zelllysat durchgeführt. Ein Gesamtvolumen von 200 μl wurde verwendet, und die Reaktionsgemische wurden 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Verdünnte Proben wurden einer HPLC-Analyse unterworfen, und die festgestellten Peakflächen wurden anhand von Standardkurven in Konzentrationen (mg/ml) umgerechnet. A: Erhaltene mg/ml Saccharid nach OLGA347-Umsetzung mit 10% Lactose. B: Erhaltene mg/ml Saccharid nach OLGA347-Umsetzung mit 20% Lactose. C: Erhaltene mg/ml Saccharid nach OLGA347-Umsetzung mit 40% Lactose. D: Grafische Darstellung der Ergebnisse aus der 10-%-Umsetzung. Die resultierende Menge von Galacto-Oligosacchariden wird als die Menge von Lactose berechnet, die nicht als Glucose oder Galactose ("GOS") gewonnen wird.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Der erste Aspekt der Erfindung betrifft eine neue β-Galactosidase, OLGA5 (SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2), aus Bifidobacterium bifidum, die isoliert und charakterisiert wurde. E. coli-Zellen wurden mit einem Plasmid transformiert, das Insertionen enthielt, die aus PstI-gespaltener chromosomaler DNA von B. bifidum bestanden. Clone mit β-Galactosidase-Aktivität wurden auf Platten ausgewählt, die ein chromogenes β- Galactosidase-Substrat enthielten. Eine der positiven Kolonien enthielt ein Plasmid mit einem Insert von etwa 20 kb, pOLGA5 (SEQ ID NO: 1). Die Sequenzierung der DNA-Sequenz machte deutlich, dass die hergeleitete Aminosäuresequenz der OLGA5-β-Galactosidase (SEQ ID NO: 2) etwa zweimal so lange ist wie die zurzeit bekannten β-Galactosidasen, und sie zeigt außerdem ein erstaunlich niedriges Ausmaß an Sequenzhomologie mit bekannten β-Galactosidasen. Die Expression eines rekombinanten OLGA5 in E. coli zeigte, dass das Enzym zusätzlich zur Lactose-hydrolysierenden Aktivität auch eine transgalactosylierende Aktivität aufwies. Der C-terminale Teil des OLGA5-Enzyms zeigte keine Homologie mit bekannten β-Galactosidasen. Anschließend wurden verschiedene C-terminale Deletionsmutanten von OLGA5 konstruiert und die resultierenden Enzyme auf ihre hydrolytische und transgalactosylierende Aktivität getestet.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung betrifft Deletionsmutanten von OLGA5, z.B. OLGA347. Von verschiedenen C-terminalen Deletionsmutanten zeigte OLGA347, die eine C-terminale Deletion von 578 Aminosäuren aufweist, den am stärksten erhöhten Spiegel von Oligosacchariden, die bei Inkubation mit Lactose, auch bei relativ niedrigen Lactosekonzentrationen, produzierte wurden. Das Enzym überführte offensichtlich im Wesentlichen alle Galactose-Moleküle auf Galactose oder Glucose. Somit wandelte die Deletion des C-terminalen Endes von OLGA5 das Enzym von einer hydrolytischen OLGA5-β-Galactosidase zu einer transgalactosylierenden OLGA347-Transgalactosidase um. Anders als andere transgalactosylierende β-Galactosidasen, einschließlich des nativen OLGA5-Enzyms, überführt die verkürzte β-Galactosidase OLGA347 Galactose bei allen getesteten Lactosekonzentrationen mit einer hohen Frequenz auf Akzeptor-Zuckermoleküle.
Die vorliegende Erfindung stellt eine DNA-Sequenz bereit, die ein Enzym codiert, wobei das Enzym ein Verhältnis von Transgalactosylase-Aktivität zu β-Galactosylase-Aktivität von mehr als 1:1 aufweist, wobei die Sequenz ein Fragment von SEQ ID NO: 1 ist, welches einen Bereich von Position 212–308 bis Position 3734 überspannt.
In einer Ausführungsform umfasst die DNA-Sequenz Nucleotid-Substitutionen, Additionen oder Deletionen, die zu einer Änderung von weniger als 25% in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 führen.
In einer anderen Ausführungsform umfasst die DNA-Sequenz Nucleotidsubstitutionen, die zu konservativen Aminosäuresubstitutionen führen.
In einer weiteren Ausführungsform wird die DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1 zum Herstellen einer mutierten DNA-Sequenz verwendet.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Enzym bereit, das durch die DNA-Sequenzen codiert ist.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein transgalactosylierendes Enzym bereit, in dem die Aminosäuresequenz des Enzyms ein Fragment von SEQ ID NO: 2 ist, welches einen Bereich von Position 1–33 bis Position 1174 überspannt, wobei das Enzym eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften besitzt:

(a) das Verhältnis von transgalactosylierender Aktivität zu β-Galactosidase-Aktivität beträgt in einer Lösung von 100 mg/l Lactose bei 37°C mehr als 1:1;
(b) es katalysiert die Produktion von mindestens 25% Galacto-Oligosacchariden in einer Batch-Reaktion mit einer Lösung von 100 g/l Lactose bei 37°C;
(c) es katalysiert die Produktion von Galacto-Oligosacchariden in einer Batch-Reaktion mit einer Lösung von 100 g/l Lactose bei 37°C, wobei weniger als 15 der Galactose aus der Lactose zum Zeitpunkt der Umsetzung mit einer maximalen Konzentration von Galacto-Oligosacchariden in freier Form vorliegt.

In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz, die ein/das transgalactosylierende/s Enzym codiert.
In einer Ausführungsform wird ein Expressionsvektor mit einem Insert verwendet, das OLGA5, OLGA342, OLGA345, OLGA347, OLGA344 oder eine andere OLGA5-Variante codiert. Dieser Expressionsvektor kann in eine Wirtszelle transformiert werden, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torula, Torulopsis und Aspergillus besteht. Eine Zelle der Gattung Bifidobacterium ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum und Lactococcus lactis besteht. Danach wird die Zelle in einem geeigneten Kulturmedium unter Bedingungen gezüchtet, welche die Expression von z.B. einer OLGA5- oder einer OLGA347-Variante erlauben, und danach wird das resultierende Enzym aus der Kultur gewonnen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist eine OLGA5-Variante Teil eines Expressionsvektors, der in eine beliebige der vorstehend erwähnten Wirtszellen transformiert werden kann. Danach wird die Zelle in einem geeigneten Kulturmedium unter Bedingungen gezüchtet, welche die Expression einer OLGA5-Variante erlauben, und anschließend wird das resultierende Enzym aus der Kultur gewonnen. Die OLGA5-Variante kann eine beliebige Zufallsmutation oder eine beliebige Mutation enthalten, die durch herkömmliche Verfahren der Molekularbiologie erzeugt wird. Ein beliebiges Fragment eines mutierten oder eines Wildtyp-OLGA5-DNA-Moleküls kann in den Expressionsvektor eingefügt werden. Das Fragment kann durch PCR (Polymerasekettenreaktion) oder mit Hilfe von beliebigen, in der Sequenz vorliegenden Restriktionsstellen oder durch eine Kombination von beiden Verfahren erzeugt werden. Die Verfahren zum Herstellen von OLGA5-Varianten sind dem Fachmann bekannt. Somit ist es für die vorliegende Erfindung nicht kritisch, auf welche Weise die Variante erhalten wird. Die im vorliegenden Text offenbarten Varianten werden durch Subclonieren unter Verwendung von in der Sequenz vorliegenden Restriktionsstellen erhalten.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung von einem oder mehreren der vorstehend erwähnten Zelltypen zum Herstellen eines Produkts, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Joghurt, Käse, fermentierten Milchprodukten, Nahrungsergänzungsmitteln und probiotischen essbaren Produkten besteht. In diesem Aspekt wird der technische Effekt des gesteigerten Wachstums von Bifidobacterium genutzt, um die Qualität der industriellen Produkte zu verbessern. Die Zugabe von Galacto-Oligosacchariden steigert das Wachstum des gesundheitsfördernden Bifidobacterium. Somit sind die durch OLGA347 produzierten Galacto-Oligosaccharide viel billiger und einfacher zu erhalten, wenn man dies mit der Verwendung nativer β-Galactosidasen zum Herstellen von Oligosacchariden vergleicht.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung von OLGA5, OLGA342, OLGA345, OLGA347, OLGA344 oder einer beliebigen anderen OLGA5-Variante oder die Verwendung eines beliebigen oder mehrerer der vorstehend erwähnten Zelltypen zum Herstellen von Oligosacchariden. Die Oligosaccharide umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Fructo-Oligosaccharide, Galacto-Oligosaccharide, Isomalto-Oligosaccharide, Malto-Oligosaccharide, Lacto-Saccharose und Xylo-Oligosaccharide.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Oligosaccharide hergestellt, indem die Zelle, welche die OLGA5-Variante exprimiert, in einem Medium inkubiert wird, das ein Disaccharid-Substrat umfasst, wie z.B. Lactulose, Trehalose, Rhamnose, Maltose, Saccharose, Lactose oder Cellobiose. Die Inkubation wird unter Bedingungen durchgeführt, bei denen Oligosaccharide produziert werden. Die Zellen können Teil eines Produkts sein, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Joghurt, Käse, fermentierten Milchprodukten, Nahrungsergänzungsmitteln und probiotischen essbaren Produkten besteht. Alternativ können die Oligosaccharide gewonnen und anschließend zu dem Produkt von Interesse vor oder nach seiner Herstellung zugegeben werden. Die Zugabe von Oligosacchariden steigert das Wachstum entweder von Bifidobacterium alleine oder von Bifidobacterium in einer gemischten Kultur.
In einer anderen Ausführungsform werden die Oligosaccharide hergestellt, indem die OLGA5-Variante in einem Medium inkubiert wird, das ein Disaccharid-Substrat umfasst, wie z.B. Lactulose, Trehalose, Rhamnose, Maltose, Saccharose, Lactose oder Cellobiose. Die Inkubation wird unter Bedingungen durchgeführt, bei denen Oligosaccharide hergestellt werden. Das Medium, das eine OLGA5-Variante und Lactose umfasst, kann Teil eines Produkts sein, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Jo ghurt, Käse, fermentierten Milchprodukten, Nahrungsergänzungsmitteln und probiotischen essbaren Produkten besteht. Alternativ können die Oligosaccharide gewonnen und anschließend zu dem Produkt von Interesse vor oder nach seiner Herstellung zugegeben werden. Die Zugabe von Oligosacchariden steigert das Wachstum entweder von Bifidobacterium alleine oder von Bifidobacterium in einer gemischten Kultur.
Definitionen
„β-Galactosidase oder ein Fragment davon": β-Galactosidase ist als ein Enzym definiert, das in der Lage ist, Lactose zu den Monosacchariden D-Glucose und D-Galactose zu hydrolysieren. Ein Fragment der β-Galactosidase umfasst 5 bis 98%, vorzugsweise 40 bis 95% und am stärksten bevorzugt 55 bis 75% des Proteins, und die Deletion betrifft vorzugsweise das C-terminale Ende.
Eine „Wirtszelle" ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus Pilzen, Hefen und Prokaryoten besteht. Der Mikroorganismus ist stärker bevorzugt ein Prokaryot und am stärksten bevorzugt ein Bakterium der Gattung Bifidobacterium oder der Art E. coli.
Mit „Oligosacchariden" ist ein Oligosaccharid gemeint, das aus mindestens drei Zuckermolekülen besteht. Ein Beispiel eines Oligosaccharids, das jedoch keine Einschränkung darstellen soll, ist Galacto-Oligosaccharid. Die Bindungen zwischen den Zuckerresten des Oligosaccharids umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf 1-4- und 1-6-Bindungen.
Die Inkubation von β-Galactosidase mit Lactose findet in Gegenwart von 0,5 bis 60% Lactose, vorzugsweise von 2 bis 30% Lactose und am stärksten bevorzugt von 2 bis 15% Lactose statt.
Bedingungen zum Inkubieren von β-Galactosidase mit Lactose sind definiert, wobei die Inkubation bei einer Temperatur zwischen 5 und 75°C, vorzugsweise bei 15 bis 45°C und am stärksten bevorzugt bei 37°C durchgeführt wird. Die für die Inkubation erforderliche Zeit beträgt 1 bis 50 Stunden, vorzugsweise 5 bis 40 Stunden und am stärksten bevorzugt 15 bis 25 Stunden.
Ein „essbares Produkt" umfasst ein Produkt, das für die Einnahme vorgesehen ist, wie Lebensmittel, Getränke, Tabletten oder Pulver.
Beispiele
Beispiel 1:
Isolierung und Charakterisierung einer transgalactosylierenden β-Galactosidase aus B. bifidum
PstI-gespaltene chromosomale DNA aus B. bifidum DSM 20215 wurde unter Verwendung von Standardverfahren in das Plasmid pKS (Stratagene) ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde in den E. coli-Stamm MT102 transformiert, der in LacZ und β-Galactosidase defekt ist. β-Galactosidase-produzierende Clone wurden auf Platten, die das chromogene β-Galactosidase-Substrat X-Gal enthielten, als blaue Kolonien identifiziert.
Eine der blauen Kolonien enthielt ein Plasmid mit einem Insert von etwa 20 kb, pOLGA5. Das Insert wurde noch weiter subcloniert und teilweise sequenziert, und ein offenes Leseraster wurde identifiziert, welches eine mutmaßliche β-Galactosidase (OLGA5-β-Galactosidase) codiert (1). Die BLAST-Suche zeigte, dass OLGA5-β-Galactosidase das höchste Ausmaß an Homologie mit der β-Galactosidase von Streptomyces coelicolor (AL133171) und Thermoanaerobacter ethanolicus (YO8557) mit einer Identität von 38% bzw. 30% zeigte. 3 zeigt einen „Identitätsbaum" von OLGA5 und verwandten Aminosäuresequenzen.
Eine genaue Analyse der Aminosäuresequenz der OLGA5-β-Galactosidase machte deutlich, dass das Enzym an seinem N-Terminus eine mutmaßliche Signalsequenz enthält und dass das offene Leseraster ein Polypeptid von 185 kDa codiert, welches etwa zweimal so groß wie irgendeine der zurzeit bekannten β-Galactosidasen ist. Ein in E. coli hergestelltes rekombinantes OLGA5-Enzym wurde gereinigt, und eine N-terminale Aminosäuresequenzierung bestätigte, dass die Signalsequenz während der Expression in E. coli abgespalten wurde. Die SDS-PAGE bestätigte das Molekulargewicht des OLGA5-Polypeptids.
Zellextrakte von rekombinanten E. coli MT102, welche pOLGA5 enthielten, wurden hergestellt und auf transgalactosylierende Aktivität analysiert. 4 zeigt, dass OLGA5, zusätzlich zur Lactose-hydrolysierenden Aktivität, auch eine transgalactosylierende Aktivität aufwies.
Beispiel 2
Konstruktion einer verkürzten OLGA5-β-Galactosidase mit einer hohen Transgalactosylase-Aktivität
Die Region von OLGA5, die zu anderen β-Galactosidasen homolog ist, liegt im N-terminalen Ende des Proteins. Die C-terminale Hälfte zeigte keine Homologie zu irgendeiner bekannten β-Galactosidase. Jedoch wurde im C-terminalen Teil eine Sialidase-ähnliche Galactose-bindende Domäne festgestellt. Die Rolle dieses C-terminalen Teils der OLGA5-β-Galactosidase wurde untersucht, indem verkürzte Deletionsmutanten konstruiert wurden. Die hydrolytischen und transgalactosylierenden Aktivitäten der resultierenden rekombinanten β-Galactosidasen wurden analysiert. 5 zeigt, dass es möglich war, annähernd ein Drittel des OLGA5-Enzyms zu deletieren und immer noch hydrolytische Aktivität beizubehalten.
Wenn die transgalactosylierende Aktivität analysiert wurde, wurden ähnliche Ergebnisse mit Extrakten aus E. coli, welche die Plasmide pOLGA5, pOLGA342 und pOLGA345 enthielten, erhalten. Jedoch zeigten Extrakte von Zellen, welche pOLGA347 enthielten, einen gesteigerten Spiegel von produzierten Oligosacchariden und fast keine Galactose. Wie in 5 dargestellt hydrolysierte ein Extrakt, welcher die verkürzte OLGA347-β-Galactosidase enthielt, Lactose, jedoch anstatt Galactose auf Hydroxylgruppen in Wasser zu überführen, überführte das Enzym im Wesentlichen alle Galactosemoleküle auf Galactose oder Glucose (oder Glycerin; durch NMR wurde gezeigt, dass der Fleck, der auf DC etwas langsamer als Glucose wanderte, Galacto-Glycerin war – Ergebnisse nicht dargestellt). Folglich ist OLGA347 eine echte „Transgalactosylase".
Beispiel 3
Charakterisieren der transgalactosylierenden Aktivität von OLGA347
Zwei Verfahren wurden verwendet, um die transgalactosylierende Aktivität von OLGA347-β-Galactosidase quantitativ zu bestimmen: die DC-Analyse von Reaktionsgemischen, enthaltend radioaktiv markierte Lactose, und die HPLC-Analyse nach enzymatischer Umwandlung von nicht-markierter Lactose.
Die Experimente mit Radioaktivität wurden mit einer Lactose durchgeführt, welche die ¹⁴C-Markierung an der Position C-1 der Glucose enthielt. Da die Markierung im Glucoseteil des Disaccharids vorlag, wurden nur Reaktionsprodukte, die Glucose enthielten, nachgewiesen. 7 zeigt das Ergebnis eines Transgalactosylierungs-Experiments mit 15% Lactose und verschiedenen Mengen des Enzyms OLGA347. Nach dem Auftrennen des Reaktionsgemisches durch DC wurde die Platte gescannt und die radioaktiven Flecken in einem Phospho-Imager quantitativ bestimmt. Bei niedrigen Enzymkonzentrationen (zwischen 0 und 0,2 μl des Extrakts) waren die Glucose- und Oligosaccharid-Spiegel fast identisch, dies zeigt, dass alle Glucosemoleküle als Substrat in Transgalactosylierungs-Reaktionen genutzt wurden. Freie" hydrolysierte Glucose trat nur bei sehr hohen Enzymkonzentrationen auf.
In Experimenten mit nicht-markierter Lactose wurden verschiedene Substrat- und Enzymkonzentrationen untersucht. 8 zeigt ein Experiment, in dem 10%, 20% und 40% Lactose als Substrat in Enzymreaktionen mit variierenden Konzentrationen des Enzyms OLGA347 verwendet wurden. Die Reaktionsgemische wurden mit HPLC analysiert und die Konzentrationen von Lactose, Glucose, Galactose und Galacto-Oligosacchariden berechnet. 8 zeigt, dass mit dem Anstieg der Enzymkonzentrationen die Lactosekonzentration abnimmt und die Glucosekonzentration zunimmt, dass jedoch im Wesentlichen keine freie" Galactose produziert wird, dies zeigt, dass fast alle Galactosemoleküle in Lactose auf einen anderen Zucker überführt werden. Berechnungen von Kohlenhydratkonzentrationen, die in Reaktionen mit niedrigen Enzymkonzentrationen gemessen wurden, zeigten, dass das Verhältnis zwischen Glucose und Galactose etwa 0,1 beträgt, dies bedeutet, dass für jedes Lactosemolekül, das zu freier Galactose und Glucose hydrolysiert wird, neun Lactosemoleküle in der Transgalactosylierung eingesetzt werden. Wie in 8 zu sehen ist, ist die Transgalactosylie rungs-Reaktion im Bereich von 10% bis 40% Lactose von der Lactosekonzentration unabhängig. Die maximale Ausbeute von in Transgalactosylierungs-Reaktionen mit 10%, 20% oder 40% Lactose als Substrat produzierten Galacto-Oligosacchariden war 39%, 44% bzw. 37% (mg Oligosaccharide, produziert pro mg zugegebene Lactose).
Referenzen

Dumortier, V., Brassart, C., und Bouquelet, S. (1994) Purification and properties of a β-D-galactosidase from Bifidobacterium bifidum exhibiting a transgalactosylation reaction. Biotechnol. Appl. Biochem. 19, 341–354.
Huber, R. E., Kurz, G., und Wallenfels, K. (1976) A quantitation of the factors which affect the hydrolase and transgalactosylase acticities of β-galactosidase (E. coli) on lactose. Biochemistry, 15, 1994-
Nakao, M., Harada, M., Kodama, Y., Nakayama, T., Shibano, Y., und Amachi, T. (1994) Purification and haracterization of a thermostable β-galactosidase with high transgalactosylation activity from Saccharopolyspora rectivirgula. Appl. Microbiol. Biotechnol. 40, 657–663.
Onishi, N., und Tanaka, T. (1995) Purification and properties of a novel thermostable galactooligosaccharide – producing β-galactosidase from Sterigmatomyces elviae CBS8119. Appl. Environ. Microbiol. 61, 4026–4030.
Wijnands, M. V., Appel M. J., Hollanders, V. M., und Woutersen, R. A. (1999) A comparison of the effects of diatary cellulose and fermentable galacto-oligosaccharide in a rat model of colorrectal carcinogenesis: fermentable fibre confers greater protection than non-fermentable fibre in both high and low fat backgrounds. Carcinogenesis. 20, 651–556.

Sequenzprotokoll

Claims

DNA-Sequenz, die ein Enzym codiert, wobei das Enzym ein Verhältnis von Transgalactosylase-Aktivität zu β-Galactosylase-Aktivität von mehr als 1:1 aufweist, wobei die Sequenz ein Fragment von SEQ ID NO: 1 ist, welches einen Bereich von Position 212–308 bis Position 3734 überspannt.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die Sequenz Nucleotid-Substitutionen, Additionen oder Deletionen umfasst, die zu einer Änderung von weniger als 25% in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 führen.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 und 2, wobei die Sequenz Nucleotid-Substitutionen umfasst, die zu konservativen Aminosäure-Substitutionen führen.
Verwendung der DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1 zum Herstellen einer mutierten DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Enzym, das durch eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert ist.
Transgalactosylierendes Enzym, wobei die Aminosäuresequenz des Enzyms ein Fragment von SEQ ID NO: 2 ist, welches einen Bereich von Position 1–33 bis Position 1174 überspannt, wobei das Enzym eines oder mehrere der folgenden Merkmale aufweist: (a) das Verhältnis von transgalactosylierender Aktivität zu β-Galactosidase-Aktivität beträgt in einer Lösung von 100 mg/l Lactose bei 37°C mehr als 1:1; (b) es katalysiert die Produktion von mindestens 25% Galacto-Oligosacchariden in einer Batch-Reaktion mit einer Lösung von 100 g/l Lactose bei 37°C; (c) es katalysiert die Produktion von Galacto-Oligosacchariden in einer Batch-Reaktion mit einer Lösung von 100 g/l Lactose bei 37°C, wobei weniger als 15% der Galactose aus der Lactose zum Zeitpunkt der Umsetzung mit einer maximalen Konzentration von Galacto-Oligosaccharid in freier Form vorliegt.
DNA-Sequenz, die ein Enzym nach Anspruch 6 codiert.
Vektor, der eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 7 umfasst, wobei der Vektor ein Expressionsvektor ist.
Wirtszelle, die den Vektor nach Anspruch 8 umfasst.
Zelle nach Anspruch 9, wobei die Zelle eine Bakterienzelle, eine Hefezelle oder eine Pilzzelle ist.
Zelle nach Anspruch 10, wobei die Zelle aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torula, Torulopsis und Aspergillus besteht.
Zelle nach Anspruch 11, wobei die Zelle aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum und Lactococcus lactis besteht.
Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 9 bis 12 zum Herstellen eines Produkts, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Joghurt, Käse, einem fermentierten Milchprodukt, einem Nahrungsergänzungsmittel und einem probiotischen essbaren Produkt besteht.
Milchprodukt, das eine Zelle nach einem der Ansprüche 9 bis 12 umfasst.
Verwendung eines transgalactosylierenden Enzyms nach einem der Ansprüche 5 bis 6 oder einer Zelle nach einem der Ansprüche 9 bis 12 zum Herstellen von Galacto-Oligosacchariden.
Verwendung eines transgalactosylierenden Enzyms nach einem der Ansprüche 5 bis 6 oder einer Zelle nach einem der Ansprüche 9 bis 12 zum Herstellen von Galacto-Oligosacchariden, die Teil eines Produkts sein sollen, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Joghurt, Käse, fermentierten Milchprodukten, Nahrungsergänzungsmitteln und probiotischen essbaren Produkten besteht.
Verwendung eines transgalactosylierenden Enzyms nach einem der Ansprüche 5 bis 6 oder einer Zelle nach einem der Ansprüche 9 bis 12 zum Herstellen von Galacto-Oligosacchariden zum Steigern des Wachstums von Bifidobacterium.
Verwendung eines transgalactosylierenden Enzyms nach einem der Ansprüche 5 bis 6 oder einer Zelle nach einem der Ansprüche 9 bis 12 zum Herstellen von Galacto-Oligosacchariden zum Steigern des Wachstums von Bifidobacterium in einer Mischkultur-Fermentation.
Verfahren zum Herstellen eines transgalactosylierenden Enzyms nach einem der Ansprüche 5 bis 6, umfassend Züchten einer Zelle nach einem der Ansprüche 9 bis 12 in einem geeigneten Kulturmedium unter Bedingungen, welche die Expression des Enzyms erlauben und Gewinnen des resultierenden Enzyms aus der Kultur.
Verfahren zum Herstellen von Galacto-Oligosacchariden, umfassend Inkontaktbringen eines Enzyms nach einem der Ansprüche 5 bis 6 oder einer Zelle nach einem der Ansprüche 9 bis 12 mit einer Lösung von Lactose.