KR20150093775A - 베타 헥소실-전이효소 및 이의 이용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 β-헥소실-전이효소 (BHT)의 신규한 재조합 형태의 발견 및 갈락토 올리고당(GOS)를 생성하기 위한 이의 사용 또는 식품 첨가물로서 이의 사용에 관한 것이다.

Description

베타 헥소실-전이효소 및 이의 이용{BETA-HEXOSYL-TRANSFERASES AND USES THEREOF}
관련 기술 상호 참조
본 출원은 2012년 12월 7일에 출원된, "Beta-hexosyl-transferases and Uses Thereof" 명칭의 미국 가출원 제61/734,742 호의 이익을 주장하고, 본원에 참조로 포함되어 있다.
기술분야
본 발명은 β-헥소실-전이효소 (BHT)의 신규한 재조합 형태의 발견 및 갈락토 올리고당(GOS)를 생성하기 위한 이의 사용에 관한 것이다.
도입
식이요법, 일반적인 장내 미생물총, 및 웰빙 사이의 복합 상호작용은 인체의 위장관 내에서 이로운 미생물의 선택적 증식을 촉진하는 방법을 장려하고 있다. 프로바이오틱스는, 강력한 항독력 및 소염제 특성으로 인체 건강에 유익한 영향을 주는 미생물이다(27) (표 1).
Figure pct00001
또한, 수년 동안의 프로바이오틱 연구에 따르면, 장내 미생물총의 선택적 개질 및 이의 관련 생화학적 활성이 선택적 프리바오틱스에 의해 촉진될 수 있는 것을 나타냈다 (Osborn DA, Sinn JK. 알레르기 질환 및 식품 과민반응을 예방하기 위한 유아의 프리바이오틱. Cochrane Database of Systematic Reviews 2007). 프리바이오틱스는 이중성을 갖는 비소화성 올리고당(NDO)이다. 우선, 프리바이오틱스는, 유해한 세균의 장내 콜로니 효율을 감소시키고, 둘째, 특정 프로바이오틱 세균의 성장을 촉진시켜서 그 수를 증가시키는 선택적 기질로서 작용한다.
또한, 많은 연구에 따르면, 프로바이오틱스는 프리바이오틱스와 결합할 때 가장 잘 작용하는 것으로 나타났다(Mayer et al. 2003 Research for creation of functional foods with Bifidobacteria. Acta Alimentaria 32 27-39). 이러한 결합된 전달 형태는 신바이오틱으로 알려져 있다(Gibson GR, Roberfroid MB. 1995 Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota - Introducing the Concept of Prebiotics. Journal of Nutrition 125:1401-12).
갈락토-올리고당(GOS)은 프리바이오틱의 바람직한 선택 중 하나로 여겨지고, GOS는 위장관 내에서 효소에 대해 저항성이 있어서 소화되지 않고 소장을 통해 전달되지만, GOS는 대부분 장에서 발효되고, 장의 비피더스균, 예를 들면, 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) 및 L. casei의 성장을 활성화시켜서 프리바이오틱스로 작용할 수 있다(26, 27, 37).
GOS는 이들의 아노머 탄소원자 (C1 또는 C2)의 형태로 인해 비소화성 올리고당으로, 이들은 글리코시드 결합되어 있기 때문에 위 또는 소장 내에서 소화 효소에 의한 가수분해가 방지된다. 자유로운 올리고당는 모든 태반 동물의 우유에서 발견되고, 유아기 중에 공급되는 천연 프리바이오틱의 예이다. 최근 국제 과학 연합회(International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics, ISAPP)에 의한 정의에 따르면, 규정식 프리바이오틱은 선택적으로 발효된 성분으로, 위장관 내 미생물총의 활성 및/또는 조성물을 구체적으로 변화시켜서 숙주에게 건강상 이점을 제공한다(30). 모유의 올리고당(HMO) 조성물은 매우 복잡하고, 유사한 조성물의 올리고당을 함유하는 또 다른 소스가 발견될 가능성이 낮다. 모유로 키운 유아 중에서 개선된 결장의 건강은, 모유에 존재하는 GOS에 기인하는 것이었다(2). 실제로, GOS가 추가된 유아 유동식은, 결장 내 미생물총의 대사 활성 및 세균 수에 대해 모유의 비피더스 작용을 재현했다(6,21). 비-우유 올리고당 중에서, GOS는 구조는 HMO의 코어 분자와 유사하기 때문에 특히 흥미롭다(3). 그러나, GOS 농도 및 조성물은 이들을 생성하기 위해 사용되는 방법 및 효소에 따라 다양하고, 이들의 프리바이오틱 작용 및 결장 프리바오틱 균주의 증식에 영향을 미칠 수 있다(29). 전통적으로, GOS는 중온성 미생물로부터 β-갈락토시다아제를 사용해서 제조되었다. 중온성 β-갈락토시다아제는 락토오스를 가수분해해서 GOS를 합성하는 반응을 구동하기 위해서, 높은 초기 농도의 락토오스가 필요하다. 락토오스는 상승한 온도에서 잘 용해하기 때문에, 높은 초기 속도 및 증가한 반감기를 갖는 열안정성 β-갈락토시다제는 바람직하게 갈락토실 전환 반응과 평형에 도달한다(27,37). 그러나, 글루코오스 및/또는 갈락토오스에 의한 경쟁 억제는 또 다른 장애물로, 반응에 세포를 포함시킴으로써 해결될 수 있다(16,20,25,27,35).
담자균 효모 소포로보로미세스 신구라리스( Sporobolomyces singularis )(이전에 불레라 신그라리스 , Bullera singularis)는, β-헥소실-전이효소의 활성으로 인해, 락토오스 상에서 성장하고 증식시키기 위해 갈락토오스를 이용할 수 없었다(BHT, EC 3.2.1.21). 연구에 따르면, BHT는 낮은 락토오스 농도 및 매우 제한된 락토오스 가수분해에서도 갈락토실 전환 활성을 갖는 것을 나타냈다. 또한, 효소는 락토오스의 농도를 20% 초과해서 억제하지 못하고, 최대 이론적으로 75%에 가깝게 GOS로 전환될 가능성이 있다((1,9,10,28). β-갈락토시다제와 달리, S. 신구라 리스로부터의 BHT는 동시에 글리코실-가수분해 및 β-헥소실-전이효소 활성을 수행하고, 락토오스는, 세포 외에 갈락토오스의 축적 없이 GOS로 전환된다. 2개의 락토오스 분자는, 갈락토실 전환 이벤트 중에 필요한데, 하나의 분자는 가수분해하고, 다른 하나의 분자는 갈락토오스 수용체로 작용해서 3당 갈락토실 락토오스 (β-D-Gal(1-4)-β-D-Gal(1-4)-β-D-Glc) 및 잔류 글루코오스를 생성한다. 갈락토실 락토오스는, 4당 갈락토실갈락토실 락토오스 (β-D-Gal(1-4)-β-D-Gal(1-4)-β-D-Gal(1-4)-β-D-Glc) 를 생성하기 위한 새로운 갈락토오스의 수용체로서 작용할 수 있고, 4당 및 다음 생성물에 대해 작용할 수 있다. S. 신구라리스 내에 축적하는 3당, 4당, 5당은, 일괄적으로 GOS로 지칭되었다(9,10).
실제 관심에 대해서, 재조합 분비 BHT는, 대규모 생산 및 정제 개선을 포함하는, 천연 효소에 대해 많은 이점을 가질 수 있다. 최근, S. 신구라리스로부터의 활성 효소의 정제에는, 세포 용해 후, 다수 크로마토그래피 단계가 필요하다(1,4,16). 종래에 재조합 β-헥소실-전이효소를 대장균 BL21 내에서 발현시키기 위해 시도한 결과, 효소는 높은 수준으로 생산되지만, 비활성이며 불용성인 것이었다(16).
특히 비제한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 재조합 β-헥소실-전이효소(rBHT) 단백질을 코딩하는 분리된 DNA를 제공한다. 재조합 β-헥소실-전이효소(rBHT) 단백질을 코딩하는 분리된 DNA는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 또는 19에 나타내는 핵산 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 효소 활성의 재조합 β-헥소실-전이효소(rBHT) 단백질을 제공하고, 단백질은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20에 나타내는 아미노산 서열을 갖는다. rBHT는 결합된 막이거나 가용성 효소일 수 있다.
GOS를 생성하는 효소 활성 rBHT 는 갈락토오스에 의해 억제되거나 억제되지 않을 수 있다.
본 발명은 진핵생물의 숙주 세포 내에 효소 활성의 재조합 β-헥소실-전이효소(rBHT) 단백질을 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 진핵생물 숙주 세포를 적합한 프로모터의 제어하에서 플라스미드로 전환하는 단계로, 플라스미드는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 rBHT를 코딩하는 분리된 DNA를 포함한다.
일부 실시형태에서, 분리된 DNA는 신호 펩티드를 코딩하는 DNA에 결합된다. 신호 펩티드는 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae ) α-팩터 신호 펩티드일 수 있고, 적합한 프로모터는 알코올성 산화효소 프로모터일 수 있다.
일부 실시형태에서, 효소 활성 rBHT 단백질은 20℃에서 약 8 U.mg- 1 의 특이적 활성을 갖는다.
진핵생물 숙주 세포는 효모 세포, 예를 들면, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)일 수 있다.
본 발명은 갈락토-올리고당(GOS)를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, GOS를 생성하기 위한 적합한 조건하에서, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 효소 활성의 재조합 β-헥소실-전이효소(rBHT) 단백질과 락토오스를 반응시키는 단계를 포함한다.
효소 활성 rBHT 단백질은 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 고체 지지체는 배치식 또는 연속식 교반 탱크 반응기, 충진형 반응기(packed-bed reactor) 또는 한외여과막 반응기 내에서 제조될 수 있다. 또한, 효소 활성 rBHT 단백질은 배치식 또는 연속식 교반 탱크 반응기, 충진형 반응기 또는 한외여과막 반응기 내에서 직접 제조될 수 있다. 이 방법은, 일반적으로 안전한(generally recognized as safe, GRAS) 유기체로 인식되는 것과 같이, 경쟁 글루코오스 억제를 피하기 위해 글루코오스 제거 시스템을 더 포함할 수 있다. 글루코오스 제거 시스템은 동시에 효소 활성 rBHT 단백질로 사용될 수도 있다.
본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 재조합 β-헥소실-전이효소(rBHT) 단백질을 포함하는 개질된 락토오스 함유 식재 또는 식품 부산물에 관한 것이다. 락토오스 함유 식재 또는 식품 부산물은 유제품 또는 부산물, 예를 들면, 유청일 수 있다. 일부 실시형태에서, 식품 또는 식품 부산물은 베이비 디저트, 베이비 주스, 베이비 스낵, 베이비 요거트 음료, 에너지 음료, 피트니스 워터 또는 갈증 해소 음료, 냉동 유제품 디저트, 과일 음료(비타민/미네랄 강화), 과일 파이 필링, 과일 제제, 유아기 유동식, 유아기 식사 대용 음료, 젤리 잼, 식사 대용 음료, 우유, 우유 기반 음료, 우유 대용, 시럽 향을 첨가한 우유, 요거트, 또는 유청이다.
도 1a-1c는 P. 파스토리스 내에서 발현되는 정제된 rBHT의 겔 전기영동을 도시한다. 도 1a은 은 염색된 정제된 rBHT의 SDS-PAGE으로, 1 레인은 0.5 ㎍의 rBHT이고, 레인 2는 0.1㎍ rBHT이다. 도 1b는 항 rBHT 항혈청에 의한 웨스턴 블롯 분석이다. 레인 M은 마커 단백질의 분자량(kDa)이 패널 A의 우측에 표시되는 것을 나타낸다. 도 1c는 rBHT의 자이모그램으로, 1 레인은 정제된 rBHT-6XHIS가 대장균 BLR 배양액 내에서 발현되고, 2 레인은 전환되지 않은 메탄올의 브로스로부터 GS115를 유도하고, 3 레인은 메탄올 브로스로부터 재조합 GS115/rBHT 를 유도한다. 활성은 X-GAL의 효소 절단에 의해 청색 침전물을 형성함으로써 시각화되었다.
도 2A-D는, pH에 대한 rBHT 상대 활성 의존, 도 2B는 20℃ 내지 80℃의 온도에 대한 rBHT 상대 활성 의존, 도 2C는 갈락토스(채워진 원) 및 글루코오스(채워진 사각형)의 농도에 대한 rBHT 상대 활성 의존, 도 2D는 20℃ 내지 50℃의 열 안정성에 대한 rBHT 상대 활성 의존을 도시한다. 시료는 12 시간마다 제거되고 20℃의 활성에 대해 분석했다. 효소 활성 분석은, 20℃에서 1.3 mM ONP-Glu를 함유하는 50 mM 소디움 포스페이트(pH 5.0)에서 수행했다. 그 중 도 2A는 소디움 포스페이트(pH 5-11) 또는 시트레이트(pH 2-5) 버퍼를 사용했다. 효소 활성은 시간 0에서 취한 값(100%)에 대해 산출했다. 시험된 효소의 초기 농도는 20℃에서 0.2 U.ml-1 이었다(Km=0.37 mM 및 Vmax=0.09 mM.min-1). 데이터에 따르면, 2개 실험의 평균은 ±5%의 신뢰성을 갖는 것으로 나타난다.
도 3은 42℃에서 배양된 5 mM 소디움 포스페이트 버퍼 pH 5.0에서 부분적으로 정제된 rBHT(0.5 U.g-1 락토오스)를 사용해서 락토오스(2%)로부터 갈락토실 락토오스를 합성하는 것을 도시한다. 락토오스, 글루코오스, 갈락토오스 및 갈락토실 락토오스의 농도는 g.l-1단위로 나타낸다. 잔류 비-정량화 GOS 종은 굴절률 검출기로부터 신호 강도 측정값으로 표시된다. 데이터에 따르면, 2개의 실험은 ±5%의 신뢰성을 갖는 것으로 나타난다.
도 4a-4b는 42℃(도 4a) 또는 30℃(도 4b)에서 배향된 5mM 소디움 포스페이트 버퍼 pH 5.0에서 P. 파스토리스 휴지 세포(0.5 U.g-1 락토오스에서 막-결합 rBHT에서 서식)를 사용해서 락토오스(20%)로부터 갈락토-올리고당의 합성을 도시한다. 락토오스, 글루코오스, 갈락토오스 및 갈락토실 락토오스의 농도는 g.l-1단위로 나타낸다. 잔류 비-양자화 GOS 종은 굴절률 검출기로부터 신호 강도 측정값으로 표시된다. 데이터에 따르면, 2개의 실험의 평균값은 ±5%의 신뢰성을 갖는 것으로 나타낸다.
도 5는 본원에 기재된 rBHT에 의해 생성된 GOS를 포함하는 당(GOS NCSU)과, 2개의 상업적으로 이용 가능한 효소 Vivinal GOS 및 Oligomate 55NP(30℃에서 Yakalt Pharmaceuticals, Inc로부터 생산)의 효소 활성의 비교를 도시하고, 섹션 6.3의 절차 참조한다.

도 6a-6b는 BHT에 대해 Kyte 및 Doolittle 소수성 플롯을 도시한다. 예상된 막 앵커/신호 서열에 대한 아미노산 서열이 증폭되었다. 막 관통 영역의 예상 알고리즘(www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)은, 통합 막 관통 단백질에 대해 일반적인 BHT에서 소수성 잔류물 1-17의 스트레치를 전망하고, SignalP 알고리즘(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)은, 잔류물 17과 18 사이, 잔류물 22와 23과 사이에 동일한 잔류물에 대한 가능한 신호 서열 및 가능한 절단 부위를 예상했다. 신호 서열은 천연 단백질 앵커로서 기능하기 위해 구조 1,2,3,4, 및 7에 유지되었다.
도 7a-7c는 BHT의 서열 분석을 도시한다. 도 7a는 웹 기반 스마트 프로그램(http://smart.embl-heidelberg.de)에 의해 결정된 S. 신구라리스로부터 BHT 폴리펩티드의 개략도이다. 채워진 사각형은 SignalP 프로그램에 의해 결정된 리더 펩티드를 표시한다. 채워진 원은 SEG 프로그램에(http://mendel.imp.ac.at/METHODS/seg.server.html) 의해 결정된 낮은 조성 복잡성의 세그먼트를 표시한다. BLAST에 의해 발견된 히트는, 글리코 가수분해효소 도메인에 의해 나타낸다. 채워진 삼각형은 NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ ) 에 의해 결정된 3개의 추정 N-글리코실화 부위의 위치를 나타낸다. 도 7b는 RHYTHM 막 관통 예측법에 의해 산출된 리더 펩티드의 개략도이다. 예상된 막 앵커 서열에 대한 아미노산 서열이 증폭되었다. 막 접촉 아미노산은 큰 볼드체로 표시되고, 나선형 접촉 아미노산은 크게 밑줄로 표시되어 있다. 또한, 예측된 세포질 및 세포 외 영역의 위치를 나타낸다. 화살표는 가능한 절단 부위를 나타낸다. 도 7c는 소수성 플롯이다. 플롯은 9개의 아미노산의 윈도우 길이에 친수성을 산출하는 Kyte-Doolittle 법을 사용해서 만들었다. 아미노산의 수는 X축 아래에 표시되고, Y축 상의 제로에서 소수성 및 친수성 아미노산이 분리된다.
도 8A-D는 각각의 재조합 P. 파스토리스 균주에 의해 분비 단백질의 농도를 도시한다. rBht 및 scFv13R4 을 함유하는 재조합 균주의 그래프는 플롯의 좌측(8a) 및 우측(8d)에 표시된다. 도 8B는 rBHT-HIS 분비, 도 8C는 scFv13R4-HIS 분비. 분비 단백질의 값은 OD600에 대해 정규화되고 평균±SE로 나타낸다. 분비 단백질은 다음의 재조합 균주로부터 분석되었다: 도 8A 및 B는, 1 열, GS115::αMF-rBht ((23-594)-HIS; 2 열, GS115::rBht-HIS; 3 열, GS115::rBht (23-594)-HIS; 4 열, GS115::αMF-rBht-HIS. 도 8C 및 8D는, 1 열, GS115::αMF-scFv13R4-HIS; 2 열, GS115::rBht (1-110)-scFv13R4-HIS; 3 열, GS115::rBht (23-110)-scFv13R4-HIS; 4 열, GS115::scFv13R4-HIS.
도 9a-9c는, SDS-PAGE(8%) 분리 및 웨스턴 블롯은, 상이한 P. 파스토리스 GS115 재조합에 의해 발현되는, 분비된, 세포 결합된, 또는 정제된 rBHT-HIS 를 나타내는 항히스 항혈청을 밝혀냈다. 도 9a는 모든 재조합에 의해 발생하는 단백질 세포 부재 추출물(분비 단백질)을 20배 농축시켰다. 도 9b는 세포 결합 단백질이 1X Laemmli 버퍼 중에서 유리 비드에 의해 파괴되는 재조합 세포 중 5개의 OD600 으로부터 얻어졌다. 1 레인, GS115::αMF-rBht-HIS; 2 레인, GS115::αM-rBht (23-594)-HIS; 3 레인, GS115::rBht-HIS; 4 레인, GS115::rBht (23-594)-HIS이고; 5 레인은 GS115 대조군이다. 도 9c는, GS115::αMF-rBht (23-594)-에 의해 발현되는 rBHT-HIS 의 은 염색으로, 니켈 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제되고, SDS-PAGE(8%)에서 분리한다(resolve). M은 마커 레인을 나타낸다. 마커 단백질의 분자량(kDa)은 패널의 좌측에 표시된다.
도 10a-10b는, 막에 결합된 rBHT을 함유하는, 가용성 rBHT 또는 P. 파스토리 스 휴지 세포를 사용하여 갈락토실-락토오스 합성을 시간 경과에 따라 도시한다. 도 10a 는, GS115::αMF-rBht (23-594)-HIS (실선)에 의해 발현되는 분비된 rBHT-HIS 및 GS115::αMF-rBht (23-594) (점선)에 의해 발현되는 rBHT의 합성을 도시한다. 도 10b는, 휴지 세포 GS115::αMF-rBht (23-594)-HIS (채워진 사각형) 및 GS115::αMF-rBht (23-594) (빈 사각형)에 의해 갈락토실-락토오스 합성 속도를 도시한다. 분석에 따르면, 200 g.L-1 락토오스, 및 5 mM 소디움 포스페이트 버퍼 pH 5.0중에서 P. 파스토리스 정제된 효소 또는 휴지 세포를 함유하고, 30℃에서 배양했다. 시료는 주기적으로 제거하고 HPLC에 의해 분석했다. 락토오스, 글루코오스, 갈락토오스 및 갈락토실-락토오스의 농도는 g.L-1단위로 표시한다. 잔류하는 비 정량화된 GOS 종은 굴절률 검출기로부터 신호 강도 측정값으로서 표시된다. 데이터에 따르면, 2개의 독립적 실험에 의해서 나타낸다.
본 발명은 피키아 파스토리스에서 발현되는, 코돈 최적화되고, 합성된 rBht 유전자(세포은행 기탁번호 JF29828)를 사용하는 방법을 포함하는(이들로 한정되지 않음) S. 신구라리스 BHT의 발현에 대한 다양한 방법이 보고되고 있다. 본 발명자들은, 막-결합 rBHT에서 서식하는 P. 파스토리스 휴지 세포과 비교해서, 분비 재조합 β-헥소실-전이효소(rBHT)에 의해 락토오스로부터 GOS 생성의 키네틱을 조사했다.
본원에서 의미하는 "rBHT 단백질"은, 충분한 길이 rBHT 단백질 및 그 단편 및/또는 변형을 포함하고, 이러한 단백질은 rBHT 유전자의 자연 발생 알레르기 변형에 의해 코딩되는 단백질, 또한 재조합해서 생성되는 rBHT 단백질을 포함하고, 이는 자연 발생 rBHT 단백질에 대해 일부 서열 변화를 포함할 수 있다.
"재조합" 단백질은 유전자 엔지니어링의 공정에 의해 얻은 것이다. "유전자 엔지니어링"이란 유전자를 낮은 레벨 또는 높은 레벨로 발현하거나 또는 유전자의 돌연변이 형태를 발현하는 세포를 형성하기 위해 사용되는 재조합 DNA 또는 핵산 방법을 의미한다. 즉, 세포는 재조합 폴리뉴클레오티드 분자로 감염되거나, 변형되거나, 변환됨으로써, 이러한 세포에 의해 소망의 폴리펩티드의 발현을 변화시킨다.
"갈락토 올리고당" 또는 "GOS"는 예를 들면, Gal-Gal 또는 [Gal]n-Glc (1 = n = 8)과 같은 2개 이상의 당 유닛을 갖는 갈락토오스 함유 다당을 의미하고, 당 유닛으로는 β-D-Gal(1>4)-β-D-Gal(1>4)-β-D-Glc, β-D-Gal(1>4)-β-D-Gal(1>4)-β-D-Gal(1>4)-β-D-Glc, 및 β-D-Gal(1>4)-β-D-Gal(1>4)-β-D-Gal(1>4)-β-D-Gal(1>4)-β-D-Glc를 포함하는 Gal-Gal 또는 [Gal]n-Glc (1 = n = 8)이다.
신호 서열
가용성 분비 단백질 및 세포 표면 상에 발현되는 단백질은 N-말단 "신호 서열"을 포함하고, 이는 진핵동물 세포 내에서 소포체(ER)에 결합되는 막을 통해 단백질의 삽입을 매개하는 소수성 서열이다. 타입 1 막 관통 단백질은 신호 서열을 포함한다. 본원에서 사용되는 "신호 서열"은 아미노 말단 소수성 서열로, 일반적으로 이러한 서열은 ER 막을 통해 단백질의 일부 또는 모든 삽입물을 ER 루멘에 삽입한 후 효소로 제거하는 서열을 의미한다. 따라서, 신호 서열은 분비 또는 막 관통 단백질의 전구체 형태의 일부로서 나타낼 수 있지만, 단백질의 성숙한 형태를 형성하지 않는 것이 해당기술 분야에서 공지되어 있다. 단백질이 신호 서열을 포함하면, 단백질의 전구체 형태는 신호 서열을 포함하더라도, 성숙한 단백질 형태는 신호 서열을 함유하지 않는 경우가 있는 것으로 이해된다. 신호 서열은 절단 부위(위치-1)에 인접한 바로 상류의 잔류물 및 위치-3의 또 다른 잔류물을 함유할 수 있고, 이는 이러한 효소 절단에 대해 중요하다(Nielsen et al. 1997 Protein Eng 10(l) l-6; von Heijne 1983 Eur J Biochem 133(1) 7-21; von Heijne 1985 J Mol Biol 184 99-105, 신호 서열 및 식별 방법이 본원에 참조로 포함되어 있다). 신호 서열은 Nielsen et al. (supra) 에 의해 기재된 바와 같이 식별될 수 있다. 포유류 숙주 세포에서 기능성이 있는 신호 펩티드 또는 서열은, 다음과 같다: 미국 특허 제4,965,195호에 기재된 인터류킨 7(IL-7)에 대해 Saccharomyces cerevisiae 프리-프로-알파-접합 인자의 신호 서열: Cosman et al. 1984 Nature 312 768-771에 기재된 인터류킨-2 수용체에 대한 신호 서열; 유럽 특허 제0 367 566호에 기재된 인터류킨-4 수용체 신호 펩티드; 미국 특허 제4,968,607호에 기재된 타입 1 인터류킨-1 수용체 신호 서열; 유럽 특허 제0 460 846호에 기재된 타입 II 인터류킨-1 수용체 신호 펩티드를 포함한다. 그 외의 많은 신호 서열이 해당기술분야에서 공지되어 있다.
2. rBHT 단백질
본 발명은 rBHT의 분비 가용성 형태, 또한 세포 표면 상에서 발현될 수 있는 막 관통 도메인을 포함하는 형태를 포함한다. 이러한 단백질은, 즉 정제된 단백질 제제의 일부로서 분리될 수 있는데, 여기서 rBHT 단백질은, 정제된 단백질 제제 내에 존재하는 단백질의 적어도 80% 또는 적어도 90%를 구성한다. 본 발명은 또한 하기 기재된 rBHT 핵산에 의해 코딩되는 rBHT 단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 rBHT 단백질은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또한 그 단편, 유도체 및 변형, 예를 들면, 융합 단백질을 포함한다. 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20의 아미노산 서열은 신호 서열을 포함한다.
3. 보존적 치환
일부 실시형태에서, 치환은 보존하는 아미노산 치환일 수 있다. 보존하는 아미노산 치환은, 생물학적 활성에 영향을 미치는 경우가 적고, 그 예로는 세린에 대한 알라닌, 이소류신에 대한 발린, 글루타메이트에 대한 아스파레이트, 세린에 대한 트레오닌, 글리신에 대한 알라닌, 트레오닌에 대한 알라닌, 아스파라긴에 대한 세린, 발린에 대한 알라닌, 글리신에 대한 세린, 페닐알라닌에 대한 티로신, 프롤린에 대한 알라닌, 알기닌에 대한 리신, 아스파라긴에 대한 아스파테이트, 이소류신에 대한 류신, 발린에 대한 류신, 글루타메이트에 대한 알라닌, 글리신에 대한 아스파테이트, 및 이들의 역변화를 들 수 있다(예를 들면, Neurath et al., The Proteins, Academic Press, New York (1979) 참조하고, 관련 부분은 본원에 참조로 포함되어 있다). 또한, 한 그룹에서 하나의 아미노산이 동일 그룹 내의 또 다른 아미노산과의 교환은 보존적인 치환으로, 이 그룹은 (1) 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 노르류신 및 페닐알라닌; (2) 히스티딘, 아르기닌, 리신, 글루타민 및 아스파라긴; (3) 아스파테이트 및 글루타메이트; (4) 세린, 트레오닌, 알라닌, 티로신, 페닐알라닌, 트렙토판 및 시스테인 및(5) 글리신, 프롤린 및 알라닌이다.
4. 글리코실화
rBHT 단백질은 다양한 정도로 글리코실화되거나 글리코실화되지 않을 수 있다. 설명에 따르면, 본 발명의 rBHT 단백질은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20을 포함하는 단백질 내에서 이미 발견된 것 이외에 하나 이상의 N- 또는 O-결합 글리코실화 부위를 포함할 수 있다. 당업자에 의해 인지된 바와 같이, 아스파라긴 잔기는 서열 Asn Xxx Ser/Thr (Xxx 는 프롤린 이외의 임의의 아미노산) 의 일부인 것으로, N-글리칸 첨가 부위로서 기능할 수 있다. 또한, 많은 세린 및 트레오닌 잔기가 있고, 이는 O-결합 글리코실화 부위로서 기능할 수 있다. 글리코실화에 의해 생체 내 반감기가 증가하거나 생물적 활성이 변경될 수 있다. rBHT 단백질의 변형체는 또한, 얻어진 단백질이 글리코실화 가수분해효소 및 β-헥소실-전이효소로서 작용할 수 있는 것이면, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20 에서 존재하기보다 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 이상의 N- 및/또는 O-결합 글리코실화 부위를 포함하는 단백질을 포함한다. 변형 rBHT 단백질은 얻어진 단백질이 글리코실화 가수분해효소 및 β-헥소실-전이효소로서 작용할 수 있는 것이면, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20에서 존재하기보다 1, 2,3, 4, 또는 5 이하의 N-및/또는 O-결합 글리코실화를 갖는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 rBHT 단백질은, 적어도 하나의 rBHT 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 이는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20 (상기 설명됨)의 변형 및/또는 단편, 및 적어도 하나의 다른 부위인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 그 외의 부위는, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부위 또는 세포독성, 세포증식억제, 발광 및/또는 방사성 부위와 같은 비단백질 부위일 수 있다. PEG가 부착되면, 적어도 일부의 단백질의 생체 내 반감기를 증가시키는 것으로 나타났다. 또한, 세포독성, 세포증식억제, 발광, 및/또는 방사성 부위는 진단 또는 치료 목적으로 항체에 융합되었다.
rBHT 이외의 다양한 폴리펩티드는 예를 들면, 단백질의 생체 내 반감기 증가, 용이한 단백질의 식별, 분리 및/또는 정제, 단백질 활성 증가, 및 단백질의 올리고머화 촉진과 같은 다양한 목적을 위해 rBHT 폴리펩티드에 융합될 수 있다.
많은 폴리펩티드는 일부의 재조합 융합 단백질을 용이하게 식별 및/또는 정제할 수 있다. 예를 들면, 폴리알기닌, 폴리히스티딘, 또는 HAT™(Clontech),를 들 수 있고, 이는 고정된 금속 이온에 대해 높은 친화성을 갖는 비인접 히스티딘 잔기의 자연 발생 서열이다. 이러한 폴리펩티드를 포함하는 rBHT 단백질은, 예를 들면, 고정된 니켈 또는 TALON™ 수지(Clontech)를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 이러한 폴리펩티드가 정제될 수 있고, 이는 고정된 코발트 톤(immobilized cobalt tons)을 포함한다 (See e.g. Knol et al. 1996 J Biol Chem 27(26) 15358-15366). 폴리아르기닌을 포함하는 폴리펩티드는, 이온 교환크로마토그래피에 의해 효과적으로 정제될 수 있다. 그 외의 유용한 폴리펩티드는, 예를 들면, 미국 특허 제5,011,912호 및 Hopp et al. 1988 Bio/Technology 6 1204에 기재된 항원 식별 펩티드를 포함한다. 이러한 펩티드는 FLAG™펩티드로서, 높은 항원성을 갖고 특이적 모노클로날 항체에 의해 가역적으로 결합된 에피토프를 제공하고, 따라서 발현된 재조합 융합 단백질의 빠른 분석 및 용이한 정제가 가능하다. 쥣과의 하이브리도마 지정 4E11은, 미국 특허 제5,011,912호에 기재된 바와 같이, 모노클로날 항체로, 특정 2가의 금속 양이온의 존재하에서 FLAG 펩티드와 결합하는 모노클로날 항체를 생성한다. 4E11 하이브리도마 세포주는 미국세포주 은행(American Type Culture Collection) 기탁번호 HB 9259의 것을 이용해서 침적되었다. FLAG 펩티드와 결합된 모노클로날 항체는 FLAG 펩티드를 포함하는 폴리펩티드 정제 시약을 회수하기 위한 친화성 시약으로서 사용될 수 있다. 다른 적합한 단백질 태그 및 친화성 시약은, 1) 고정된 글루타티온에 대해 글루타티온-S-전이효소 융합 단백질의 친화성을 이용하는 GST-Bind™ 시스템(Novagen)에 기재된 것; 2) 모노클로날 항체에 대해 T7 유전자 10 단백질의 아미노산 말단 11 아미노산의 친화성을 이용하는 T7-TAG®친화성 정제 키트에 기재된 것; 또는 3) 단백질 태그에 대해 스트렙타비딘의 공학적 형태의 친화성을 이용하는 STREP-TAG®시스템®(Novagen)에 기재된 것을 포함한다. 상기 기재된 일부 단백질 태그로 또한 그 외의 태그는 Sassenfeld 1990 TIBTECH 8: 88-93, Brewer et al., in Purification and Analysis of Recombinant Proteins, pp.239-266, Seetharam and Sharma (eds.), Marcel Dekker, Inc. (1991), and Brewer and Sassenfeld, in Protein Purification Applications, pp. 91 - 111, Harris and Angal (eds.), Press, Inc., Oxford England (1990)에 기재되어 있다. 단백질 태그를 기재하는 이러한 문헌 부분은 본원에 참조로 포함되어 있다. 또한, 상기 기재된 2개 이상의 태그의 융합, 예를 들면, FLAG 태그 및 폴리히스티딘 태그의 융합은 본 발명의 rBHT 단백질에 융합될 수 있다.
5. rBHT 핵산
본 발명은 예를 들면, 본원에 기재된 rBHT 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함하는 분리된 핵산을 포함하고, 이는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20 의 아미노산 서열 및 그 단편 및/또는 변형을 포함하는 단백질을 포함한다. 바람직하게, 단백질은 서열번호 12 또는 14의 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 핵산은, 즉 글리코실 가수분해효소 및 β-헥소실-전이효소 활성을 갖는 재조합 단백질을 제조하는 데에 유용하다. 이러한 핵산은 개질된 게놈 DNA 또는 cDNA일 수 있다. 바람직하게, 핵산은 rBHT 단백질을 코딩하는 연속적인 개구 측정 프레임을 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 단일 가닥 및 이중 가닥 형태의 DNA 및 RNA 또한 상응하는 보충 서열을 포함한다. "분리 핵산"은 올리고뉴클레오티드와 같이 화학적으로 합성된 핵산 또는 폴리머라제 사슬 반응(PCR) 산물 또는 cDNA와 같이 템플레이트로부터 효소적으로 합성된 핵산의 경우 자연 발생 소스로부터 분리된 핵산의 경우에, 핵산이 분리된 유기체의 게놈에 존재하는 인접한 유전 서열로부터 분리된 핵산으로, 이러한 공정으로부터 얻어진 핵산은 분리된 핵산으로 이해된다. 분리된 핵산 분자는 분리된 단편의 형태 또는 큰 핵산 구조의 성분으로서 핵산 분자를 의미한다.
본 발명은, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19의 서열 또는 이들의 단편을 포함하는 핵산, 또는 적당히 엄격한 조건 및 선택적으로 매우 엄격한 조건에서 하이브리다이징하는 핵산, 또는 전체 길이 rBHT cDNA의 뉴클레이티드 서열인 SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하고, 핵산은 글리코실 가수분해효소 및 β-헥소실-전이효소로 작용할 수 있는 단백질을 코딩한다. 가수분해 기술은 종래에 공지되어 있고, Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11, 1989) and Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4 1995)에 기재되어 있고, 본원에 참조로 포함되어 있다. 여과 가수분해에 대한 적당히 엄격한 조건은 약 42 내지 55℃의 온도에서 약 50% 포름아미드 6 x SSC에서 하이브리다이징 및 0.5 x SSC, 0.1 % SDS에서 약 60℃에서 세정을 포함한다. 매우 엄격한 조건은 상기 기재된 바와 같이 하이브리다이징 조건으로서 정의되지만, 0.2 x SSC, 0.1 % SDS에서 약 68℃에서 세정에 의해 정의된다. 하이브리다이징 및 세정 버퍼에서 SSPE (l xSSPE는 0.15 M NaCI, 10 mM NaH2P04, 및 1.26 mM EDTA, pH 7.4) 가 SSC(l xSSC 는 0.15 M NaCI 및 15 mM 소디움 시트레이트) 대신에 사용되고, 하이브리다이징이 종료된 후 세정, 선택적으로 적어도 2개의 세정이, 15분 동안 수행된다.
세정 온도 및 세정 염 농도는 당업자에게 공지되고 추후 기재된 바와 같이 하이브리다이징 반응 및 듀플렉스 안정성(duplex stability)을 지배하는 기본적인 원리를 적용하여 원하는 엄격한 정도를 달성하기 위해 필요에 따라 조정될 수 있다(예를 들면, Sambrook et al., supra 참조). 공지된 서열의 핵산이 하이브리다이징 되면, 하이브리드 길이는 핵산 서열(예를 들면, GAP 사용)을 배열하고 최적 서열 상보성의 영역을 식별함으로써 결정될 수 있다. 길이가 50 염기쌍 미만으로 예상되는 하이브리드의 하이브리다이징 온도는 하이브리드의 용융 온도(Tm)보다 5℃ 내지 10℃ 낮아야 하고, Tm은 다음의 식에 따라 결정된다. 18 염기쌍 길이 미만의 하이브리드에 대해, 다음과 같다:Tm (degrees C) = 2( A번호 + T 염기) + 4(G 번호+ C 염기).
상기 18 염기쌍 길이의 하이브리드에 대해서는 다음과 같다: Tm (degrees C) = 81.5 + 16.6(log10[Na+]) + 0.41 (% G + C) - (600 N), 여기서 N은 하이브리드 염기 수이고, [Na+] 는 하이브리다이징 버퍼 중의 나트륨 이온의 농도를 의미한다. 각각 이러한 하이브리다이징 핵산은 적어도 15 뉴클레오티드 (또는 적어도 18 뉴클레오티드, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 또는 적어도 100)인 길이를 갖는다(상기 Sambrook et al 참조).
rBHT 핵산은 다음의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함한다: (1)서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19의 전부 또는 단편, 여기서 단편은 글리코실 가수분해 효소 및 β-헥소실-전이효소로서 작용할 수 있는 rBHT 단백질을 코딩한다; (2)서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19과 적어도 80%. 85%, 90%. 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.7% 상동성을 갖는 뉴클레이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 배열 윈도우는 적어도 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 400, 500, 600, 800, 1000. 또는 1200 뉴클레이티드 길이를 갖고 서열은 글리코실 가수분해 효소 및 β-헥소실-전이효소로서 작용할 수 있는 rBHT 단백질을 코딩한다; (3)서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19에 대해 단일 뉴클레오티드의 1, 2, 3, 4, 6. 8, 10, 15, 20, 25, 또는 30 이하의 변경을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 변경은 단일 뉴클레오티드의 삽입, 제거, 또는 대체일 수 있고, 폴리뉴클레오티드는 글리코실 가수분해 효소 및 β-헥소실-전이효소로서 작용할 수 있는 rBHT 단백질을 코딩한다; (4) 본원에 기재된 rBHT 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 rBHT 단백질의 단편, 유도체 및 변형을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, rBHT는 리더 서열을 이종 분비 신호 펩티드로 대체함으로써 rBHT 단백질을 생성한다.
5.6. rBHT 단백질의 제조방법
rBHT 단백질은 다음과 같이 제조될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, rBHT 단백질을 코딩하는 핵산은 벡터 내에 도입되고, 숙주 세포 내에 도입될 수 있다. rBHT 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포는, 본 발명에 포함된다. rBHT 단백질을 코딩하는 핵산을 함유하는 숙주 세포는, rBHT 단백질이 발현될 수 있는 조건하에서 배양될 수 있다. rBHT 단백질은, 세포가 배양된 배지 또는 세포로부터 발현될 수 있고, 해당기술분야에서 공지된 많은 적합한 수단 중 임의의 수단에 의해 정제될 수 있다. 또한, rBHT 단백질을 생산하기 위한 유전 엔지니어링 방법은, 세포 프리 발현 시스템, 세포 숙주, 조직, 및 동물 모델 내에서 공지된 방법에 따라 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 포함한다.
벡터는 숙주 내에서 전파하기 위해 선택성 마커 및 복제 기점을 포함할 수 있다. 벡터는 적합한 전사 또는 번역조절 서열, 예를 들면, rBHT 단백질을 코딩하는 핵산에 조작 가능하게 결합되는, 예를 들면, 포유류, 미생물, 세균 또는 곤충 유전자로부터 얻어지는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 조절 서열로는 전사 프로모터, 오퍼레이터, 또는 인핸서, mRNA 리보솜 결합 부위, 및 전사 및 번역을 조절하는 적합한 서열을 포함한다. 뉴클레오티드 서열은, 조정 서열이 기능적으로 타겟 단백질을 코딩하는 DNA에 관련된 것인 경우, 작동가능하게 결합된다. 따라서, 프로모터 뉴크레오티드 서열은 프로모터 뉴클레오티드 서열이 rBHT 단백질 코딩 서열의 전사를 향하는 경우, rBHT 핵산 서열에 작동하게 결합된다. rBHT 단백질이 융합 단백질인 경우, 융합 단백질의 일부를 코딩하는 핵산 서열, 예를 들면, 신호 서열은 벡터의 일부일 수 있고, rBHT 단백질을 코딩하는 핵산은 벡터 내에 삽입되어 추가의 신호 서열 및 rBHT 단백질을 포함하는 단백질은 벡터에 의해 코딩된다.
rBHT 단백질을 발현하기 위한 적합한 숙주 세포는, 원핵생물 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 및 고차원의 진핵생물 세포를 포함한다. 벡터 내의 조정 서열은, 숙주 세포 내에서 작동할 수 있도록 선택될 것이다. 적합한 원핵생물 숙주 세포는 대장균 속, 바실러스 속 및 살모넬라균 속의 세균, 또한 슈도모나스 속, 스트렙토마세스 속, 및 스타피로코커스 속의 멤버를 포함한다. 원핵생물 세포(예를 들면, 대장균)에서 발현하기 위해, rBHT 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 재조합 폴리펩티드를 쉽게 발현하기 위해 N-말단 메티온 잔기를 포함하는 것이 바람직하다. N-말단 메티온은 선택적으로 발현된 폴리펩티드로부터 절단될 수 있다. 적합한 효모 숙주 세포는 사카로미세스, 피키아 및 클루베로미세스 속으로부터 유래된 세포를 포함한다. 바람직한 효모 숙주는 사카로미세스 세레비 지에 및 P. 파스토리스 이다. 곤충 숙주 세포 내에서 발현하기 위한 적합한 시스템은, 예를 들면, Luckow and Summers (1988 BioTechnology 6 47-55)의 검토에 의해 기재되어 있고, 그 관련 부분은 본원에 참조로 포함되어 있다. 적합한 포유류 숙주 세포는 원숭이 신장 세포의 COS-7 line(Gluzman et al. 1981 Cell 23 175-182), 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 중국 햄스터 Chinese hamster 난소(CHO) 세포 (Puck et al. 1958 PNAS USA 60 1275-1281), CV-1 (Fischer et al. 1970 Int J Cancer 5 21-27), 인간 신장으로부터 유래된 293 세포 (American Type Culture Collection (ATCC®) catalog no. CRL-10852™, 및 인간 자궁 암종 세포 (HELA) (ATCC®CCL 2)을 포함한다. 이 단락에 관련된 참조문헌 부분은 본원에 참조로 포함되어 있다.
세포 숙주 내에서 사용하기 위한 발현 벡터는 일반적으로 하나 이상의 표현형 선택성 마커 유전자를 포함한다. 이러한 유전자는, 예를 들면, 영양 요구성(auxotrophic) 요건을 제공하거나 항생물질 내성이 있는 단백질을 코딩한다. 다양한 이러한 벡터는, 상업적인 소스로부터 쉽게 이용 가능하다. 예를 들면, pGEM 벡터 (Promega), pSPORT 벡터, 및 pPROEX 벡터 (InVitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA), Bluescript 벡터 (Stratagene), 및 pQE 벡터 (Qiagen)를 포함한다. 효모 벡터는 종종 효모 플라스미드, 자동 복제 서열(ARS), 프로모터 영역, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열, 및 선택성 마커 유전자로부터 복제 서열의 기점을 함유한다. 효모 및 대장균에서 복제 가능한 벡터(셔틀 벡터로 칭함)도 사용될 수 있다. 효모 벡터의 상기 기재된 특징 이외에, 셔틀 벡터는 또한 복제 서열 및 대장균의 선택성을 포함할 것이다. 효모 숙주 내에서 발현되는 타겟 폴리펩티드의 직접적인 분비물은, rBHT 코딩 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에서 효모 a-펙터 리더 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함함으로써 달성될 수 있다(Brake 1989 Biotechnology 13 269-280).
포유류 숙주 세포에서 사용하기 위한 적합한 발현 벡터로는 pcD A3.1/Hygro (Invitrogen), pDC409 (McMahan et al. 1991 EMBO J 10: 2821 -2832), 및 pSVL (Pharmacia Biotech)를 포함한다. 포유류 숙주 세포에서 사용하기 위한 발현 벡터는 바이러스 게놈으로부터 유래된 전사 및 번역 조절 서열을 포함할 수 있다.
rBHT RNA를 발현하기 위해 사용될 수 있는 일반적으로 사용되는 프로모터 서열 및 인핸서 서열은, 인간 거대세포 바이러스(CMV), 아데노바이러스 2, 폴리오마비러스, 및 시마이안 바이러스 40(SV40)으로부터 유래된 것을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 포유류 발현 벡터를 구축하기 위한 방법은, 예를 들면, Okayama and Berg (1982 Mol Cell Biol 2: 161-170), Cosman et al. (1986 Mol Immunol 23:935-941), Cosman et al. (1984 Nature 312: 768-771), EP-A-0367566, and WO 91/18982에 개시되어 있다. 이러한 문헌의 관련 부분은 본원에 참조로 포함되어 있다.
5.7.정제 태그
본원에 기재된 6XHIS 태그 이외에, 다양한 정제 방법은, 예를 들면, 친화성 태그, 예를 들면, 항원 태그 (예를 들면, FLAG (Sigma-Aldrich, Hopp et al. 1988 Nat Biotech 6:1204-210), 헤마글루타닌(hemagluttanin)(HA) (Wilson et al., 1984 Cell 37:767), 인테인 융합 발현 시스템 (New England Biolabs, USA) Chong et al. 1997 Gene 192(2), 271-281, 또는 말토오스 결합 단백질(MBP)), 글루타티온 S 전이효소 (GST)/글루타티온, 폴리 His/Ni 또는 Co (Gentz et al., 1989 PNAS USA 86:821-824)와 같이 사용될 수 있다. 단백질의 N-말단에 GST 태그를 함유하는 융합 단백질은, U.S. Pat. No. 5,654,176 (Smith)에 기재되어 있다. 또한, 자기장 분리 기술은, 예를 들면, Strepavidin-DynaBeads®(Life Technologies, USA)와 같이 사용될 수 있다. 또한, 광 분해성 링커는, 예를 들면, U.S. Pat. No. 7,595,198 (Olejnik & Rothchild)과 같이 사용될 수 있다. 많은 그 외의 시스템은 해당 기술분야에서 공지되어 있고, 본 발명에 사용하는 데에 적합하다.
5.8. 갈락토-올리고당(GOS)의 제조방법
본 발명의 일 실시형태에서, 갈락토 올리고당(GOS)은, 예를 들면, 락토오스 또는 셀로바이오스와 같은 2당 기질을 포함하는 배지에, rBHT를 발현시키는 세포를 배양시켜서 제조된다. 일 실시형태에서, GOS는 동시에 글루코오스 제거 시스템을 이용해서 락토오스로부터 제조된다. 글루코오스 제거 시스템은 일반적으로 안전한(GRAS) 유기체일 수 있다.
5.9. 제형
본 발명의 또 다른 형태는, 갈락토 올리고당(GOS)를 함유하는 식재 또는 식이요법 보충제를 생산하기 위해 rBHT 단백질 또는 rBHT를 발현하는 세포의 이용에 관한 것이다. 식재는 요거트 치즈, 또는 발효된 유제품과 같은 유제품 식재일 수 있다. rBHT 또는 rBHT를 발현하는 세포는 식품 또는 식이요법 보충제에 부분적으로 첨가될 수 있다. rBHT는 분무 건조를 사용해서 건조되고; 분무 건조는 분말 형태의 온도 민감성 물질이 최소한으로 얻어지는 빠르고 완만한 방법이다. 건조된 rBHT는 또한 입자를 코딩하고 매트릭스 내에 고체 물질을 고정시키고 미세 캡슐을 제조하기 위한 분무 건조 능력을 사용하는 캡슐화된 형태일 수 있다(www.buchi.com/Mini_ Spray_Dryer_B-290.179.0.html). 기능성 GRAS 캡슐화제 및 기술을 사용하는 그 외의 약물 전달 적용이 사용될 수 있다. 건조된 rBHT 정제 및 분말 형태는 락토오스 함유 버퍼 및 유제품에서 수소화된 rBHT 활성 속도에 대해 분석될 수 있다.
식재로는, 유아기 유동식, 유제품, 음료, 및 식이요법 보충제를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 표 2 참조
Figure pct00002
상기 기재된 rBHT 단백질 중 임의의 단백질은 조성물 형태로 전달될 수 있고, 즉 하나 이상의 추가의 성분, 예를 들면, 생리적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 희석제로 전달될 수 있다. 예를 들면, 조성물은 본원에 기재된 가용성 rBHT 단백질, 및 버퍼, 항산화제, 예를 들면, 아스코르브산, 저분자량 폴리펩티드(예를 들면, 10 아미노산 미만의 것), 단백질, 아미노산, 탄수화물, 예를 들면, 글루코오스, 슈크로오스, 또는 덱스트린, 킬레이트제, 예를 들면, EDTA, 글루타티온, 및/또는 그 외의 안정화제, 부형제, 및/또는 보존제를 포함할 수 있다. 조성물은 액체 또는 동결 건조된 분말로 형성될 수 있다. 또한, 약학적 제형으로서 사용될 수 있는 성분의 예로는, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1980) 에 제시되어 있고, 그 관련 부분은 본원에 참조로 포함되어 있다.
상기 기재된 치료 분자를 포함하는 조성물은, 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 이는 비경구, 국소, 경구, 비강, 질, 직장, 또는 폐(흡입에 의함) 투여를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 조성물이 주사되는 경우, 조성물은 관절내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 복막내 또는 피하에 일시 주사(bolus injection) 또는 연속 주사에 의해 투여될 수 있다. 즉 질환 부위에 국소적 투여는, 임플란트, 피부 패치, 또는 좌약으로부터 경피 전달 및 지속적 방출인 것으로 고려된다. 흡입에 의한 전달은, 예를 들면, 비강 또는 구강 흡입, 네블라이저(nebulizer)의 사용, 에어로졸 형태의 흡입, 등을 포함한다. 체강 내로 삽입된 좌약을 통한 투여는, 예를 들면, 고체 조성물 형태를 선택된 체강 내에 삽입하고, 용해시킴으로써 달성될 수 있다. 그 외의 대안으로는, 안약, 구강 제제, 예를 들면, 필, 로젠지, 시럽, 및 츄잉검, 및 국소 제제, 예를 들면, 로션, 겔, 스프레이 및 연고를 포함한다. 대부분의 경우, 폴리펩티드인 치료분자는 국소적으로 또는 주사 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다.
상기 기재된 치료 분자는, 상태를 치료하기 위해 효과적일 수 있는, 임의의 투여량, 투여 빈도, 및 기간에 투여될 수 있다. 투여량은 치료 분자의 분자 성질 및 치료될 장애의 성질에 따라 다르다. 치료는, 필요에 따라 원하는 결과를 달성하도록 지속할 수 있다. 치료 주기는 치료 기간 내내 일정하거나 일정하지 않을 수 있다. 예를 들면, 치료는, 초기에는 매주, 나중에는 격주로 수행할 수 있다. 수일, 수주, 수개월, 또는 수년 동안의 치료가 발명에 포함된다. 치료가 중단된 후 다시 시작할 수 있다.
유지 투여량은 초기 투여 후 투여될 수 있다. 투여량은 체중 kg 당 밀리그램 (mg/kg) 또는 피부 표면의 제곱미터당 밀리그램(mg/m2), 또는 신장 또는 체중에 관계없이 일정 투여량으로 측정될 수 있다. 해당 기술분야에서 표준 투여량 유닛이 있다. 사람의 피부 표면적은, 표준 식을 사용해서 신장 및 체중으로부터 산출할 수 있다. 예를 들면, 치료 rBHT 단백질은 약 0.05 mg kg 내지 약 10 mg/kg 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 1.0 mg kg의 투여량으로 투여될 수 있다. 또한, 약 1mg 내지 약 500 mg의 투여량이 투여될 수 있다. 또한, 약 5 mg, 10 mg. 15 mg 20 mg, 25 mg, 30 mg. 35 mg, 40, mg, 45, mg, 50 mg, 55 mg, 60 mg, 100 mg, 200 mg, 또는 300 mg이 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 관사("a" 및 "an")는 문법적으로 관사가 붙은 물체가 하나 이상(즉, 적어도 하나) 인 것을 의미한다. 일례로, "하나의 요소"란 하나 이상의 요소를 의미한다.
명세서 전체에, "comprising" 또는 "comprises" 또는 "comprising"와 같은 변형은 기재된 요소, 정수, 또는 단계, 또는 요소, 정수, 또는 단계의 그룹을 함축하는 것으로 이해되지만, 임의의 그 외의 요소, 정수, 또는 단계가 배제되지 않는다. 본 발명은, 청구범위에 기재된 적당하게 단계, 요소, 및/또는 시약을 "포함하거나", "구성되거나 "또는 "본질적으로 구성될" 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하고 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
6. 실시예
6.1. 재료 및 방법
코돈 최적화된 β-헥소실-전이효소 유전자의 디자인
S. 신구라리스 β-헥소실-전이효소 유전자(16)(GenBank 기탁번호 AB126324; 1,782 bp)에 대한 DNA 코딩 서열은, Clone Manager software (Cary, NC)를 사용해서 엑손을 결합함으로써 제조되었다. 코딩 서열은, 최소 자유에너지 (-619.9), 특이적 제한 부위 (5' NcoI and 3' NotI), 및 GC 함량 (48.89%)에 대해 최적인 P. 파스토리스 and E. coli 바람직한 코돈에 기초해서 다시 디자인되었다. 다시 디자인된 유전자 버전은 rBht (GenBank 기탁번호 JF29828)로 라벨링하고, 합성하고 pGS21a and pUC57 에 삽입되어 각각 pJB100 및 pJB107을 생성한다(표 1). rBHt 의 DNA 서열이 확인되었다(GenScript, Piscataway, NJ).
대장균 내에서 발현하기 위해 rBht를 함유하는 플라스미드의 구조
클로닝 절차는 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다(32). rBHT의 클로닝 및 발현을 위해 사용되는 대장균 균주는 표 3에 기재되어 있다. 제한 엔도뉴클레아제 및 T4 DNA 리가아제는 New England Biolab(Beverly, MA)로부터 얻어졌다. 플라스미드 pJB100 및 pJB107는, NcoI 및 NotI를 사용해서 소화되고, rBht 유전자를 함유하는 단편은 노바겐 플라스미드에 삽입되어 발현 플라스미드 pJB101, pJB103, pJB104, pJB105, 및 pJB106 를 생성하였다 (구조 설명에 대해 표 3 참조).
대장균 BLR에서 rBHT 융합 구조의 발현
발현은 pET 시스템 TB055 8th Edition 02/99 (Novagen)에 기재된 바와 같이 수행되었다. 요약하면, 발현 플라스미드는 rBHT 활성을 위해 선별된 IPTG 도입 후 대장균 BLR 로 전환되었다. 생체내 rBHT 활성은 pH 4 및 pH 6 및 50 ㎍.ml-1 세포에서 50 mM 소디움 포스페이트 버퍼 중에서 IPTG 유도된 BLR 세포를 배양하고 색소 기판 X-GAL을 침투시킴으로써 분석되었다(표4). 배양액은 나타나는 색을 시각화하기 위해, 37℃에서 밤새 배양했다. 내인성 β-갈락토시다제 활성을 함유하는 BL21 세포는 양성대조군으로서 사용되었다.
항 rBHT 의 제조
pJB101에서 서식하는 대장균 BLR 세포로부터 발현되고 정제된 rBHT -6XHIS을 사용하여 제조되었다. 세포 없는 추출물 분획에서 존재하는 rBHT -6XHIS의 정제는 제조업자 지침(QIAGEN, Germany)에 따라 니켈 아가로스 겔 크로마토그래피에 의해 수행된 후, 제조업자 지침(Bio-Rad, Richmond, CA)에 따라 겔로부터 전자 용출에 의해 정제되었다. 순수한 단백질은 토끼 면역 감작에 사용되었다(Cocalico Biologics Reamstown, PA). 본 연구에 사용되는 추가의 항체가 표 4에 표시된다.
전기 영동 및 면역 블로팅
소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE-4-12%)은 Laemmli 시스템에서 정기적으로 수행되었다(23). 단백질은 Coomassie blue (Bio-Rad, Richmond, CA) 및 은 염색(BioRad, Richmond, CA)를 사용해서 가시화되었다. SeeBlue plus (Invitrogen, Carlsbad, CA) 는 분자량 마커로서 사용되었다. 이중 PAGE 겔 상의 면역블로팅 분석은 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다(7). 검출은, 염소 항-래빗 또는 염소 항-마우스 항체(Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA)에 콘쥬게이트된 알칼리성 포스파타제를 사용해서 수행되고, NBT (니트로-블루 테트라조륨 클로라이드) 및 BCIP (5-브로모-4-클로로-3'-인도리포스페이트 p-톨루이딘 염)가 사전 혼합된 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 을 사용해서 가시화되었다.
P. 파스토리스 재조합 균주의 구조
프라이머 JBB1 and JBB2 를 사용해서 pJB107로부터 rBht 유전자가 PCR 증폭되어, pPIC9에 함유된 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)에 프리-프로-알파- 메이팅 팩터 신호 서열로 프레임 내에 XhoI 및 NotI 제한 부위, 그 다음에 6XHIS 태그, 이어서 개질된 TEV 프로테아제 절단 부위를 첨가했다(표 2). PCR 제품은 pPIC9 XhoI 및 NotI 제한 부위 내에 결찰되어 pJB108을 생성했다(표 3). 정확한 인-프레임 결찰은 프라이머 5' AOX1 and 3' AOX1 를 사용해서 시퀀싱함으로써 (Sequatech, Mountain View, CA), 확인되었다(표 4).
P. 파스토리스 GS115 (표 1) 은 Bio-Rad Gene Pulser (Bio-Rad, Richmond, CA)을 사용해서 SacI (Invitrogen's Pichia expression kit manual, version M) 와 결찰된 pJB108에 의해 전자 변환되었다. 재조합은 30℃에서 히스티딘 결핍 재생 덱스트로스(RDB-agar plates) 상에서 선택되었다. His+ 콜로니는 무작위로 선택되고, 발현 카세트의 게놈 통합은 프라이머 5' AOX1, 3' AOX1, 및 α-Factor를 사용해서 PCR에 의해 입증되었다. 재조합 GS115/rBht 의 메탄올 이용(mut+) 표현형은, Invitrogen's Pichia expression kit manual, version M 에 요약된 절차에 따라 결정되었다.
P. 파스토리스에서 rBHT 생성
재조합 rBHT 의 높은 수준의 생산업자를 선택하기 위해, 6개의 His+ 분리는 12 시간 동안 30℃에서 250 rpm에서 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 배지(YPD)에서 성장한 후, 100 mL 완충 글리세롤 복합 배지(BMGY)를 초기 OD600=0.1로 접종하였다. 배양액이 OD600=10를 초과하는 경우, 배양액이 OD600=50 을 초과할 때까지 최종 농도 0.5% 로 메탄올을 24 시간 간격으로 첨가하였고, 그 후 메탄올 12 시간마다 첨가했다. 배지 시료는 BHT 활성 존재시 분석하고 24 시간마다 래빗 항-rBHT를 사용해서 웨스턴 블로팅에 의해 분석하여 최적 수확 시간을 결정했다. 선택된 GS115/rBht 재조합은 0.5 L BMGY 에서 일정 간격으로 성장하고 메탄올로 6일 동안 유도했다.
분비된 rBHT의 정제
배양 상청액(500 mL)은 암모늄 설페이트로 분획하였다. 60%-80% 암모늄 설페이트 사이의 침전물은 50 mM 소디움 포스페이트 버퍼(pH 6) 에서 재현탁되었다.
Amicon MWCO 15 막 (Amicon Inc., Beverly, MA) 을 사용하여 탈염 및 농축 후, 용액을 1/30 (5 ml) Mono Q pre-equilibrated column (Quarternary amino ethyl) (Amersham Biosciences)에 적용했다. 그 다음에, 칼럼을 50 ml 버퍼로 세척하고 50 mM 소디움 포스페이트 버퍼 (pH 6.0) 내에 1 ml.min-1의 유속으로 0 내지 0.2 M 의 소디움 클로라이드 선형 구배의 3 컬럼 부피로 용출했다. 용출액은 1 ml 씩 수집했다. 활성 분율을 풀로 만들고(pooled), 농축하고 10 mM 소디움 포스페이트(pH 6.8)에서 재현탁한 후, 동일한 버퍼에서 사전 평형된 바이오 겔 HT 하이드록시 아파타이트 컬럼(Bio-Rad, Richmond, CA)(1/10 2 ml) 에 적용하고, 10 mM 소디움 포스페이트(pH 6.8)로 세척하고, 50 mM 소디움 포스페이스(pH 6.8)로 용출했다. 가장 높은 특이적 활성을 갖는 분획은 특이적 활성 8.2 U.mg-1의 순수한 rBHT 를 함유했다. 효소 활성은 (하기 기재된)모든 크로마토그래피 분획 상에서 분석하고 25℃에서 정제 단계를 수행했다.
분자량 결정
초미세 여과에 의해 20배 농축된 배양액 배지를, 50 mM 소디움 퍼스페이트 버퍼(pH 6.0, 0.1 M NaCl)로 사전 평형된 크기 배제 칼럼 Superdex 200 (Amersham Biosciences) 1/30 (18 ml) 에 적용했다. 0.5 ml 분획은 0.5 ml.min- 1 의 유속으로 수집하고, 기질로서 ONP-Glu를 사용해서 rBHT 활성에 대해 하기 기재된 바와 같이 자이모그램(zymogram)에 의해서 분석하였다. rBHT 및 분자량 표준에 대한 용출은 280 nm에서 모니터링했다. 컬럼은 티로글로불린(Thyroglobulin), 669 kDa; 페리틴(Ferritin), 440 kDa; 카탈라아제(Catalase), 232 kDa; 락테이트 탈수소 효소, 140 kDa; 소혈청 알부민; 67 kDa (GE, Healthcare) 분자를 사용해서 검량했다. rBHT의 분자량은 분자량 로그값(Y축) 대 용출 부피(X축)의 검량 플롯으로부터 외삽했다. 모든 크로마토그래피 단계는 25℃에서 수행했다.
효소 활성 분석
rBHT의 초기 반응 속도는 형성 조건(established conditions)하에서 Kuby's법(13,22)의 개질에 의해 측정했다. 요약하면, 반응을 1.3 mM ONP-Glu 및 50 mM 소디움 포스페이트 버퍼 (pH 5)를 함유하는 250 ㎕ 부피 중에서 수행했다. 분석을, 형성 조건하에서 10분 동안 수행하고 1 부피의 0.25 M Na2CO3을 첨가해서 정지시켰다. 끓는 rBHT 및 기질을 함유하는 반응 혼합물은 음성 대조군으로 기능했다. 분석을, 항상 ±5%의 신뢰도로 2회 수행했다. 세포가 없는 브로스의 시료 및 단백질 농축액은 상기 기재된 바와 같이 얻어졌다. 결과적으로, 50 mM 소디움 포스페이트 버퍼(pH 5.0)로 사전 세정된 세포(막 결합 rBHT 에서 서식)는 형성 조건하에서 분석했다. X-GAL이 반응 기질로 사용되는 경우, 농도는 50 mM 소디움 포스페이트 버퍼 (pH 4) 중에서 50 ㎍.ml- 1 였다.
효소 반응의 단위 유닛(U)은 분석 조건하에서 분당 방출된 1 μmol의 o-니트로페놀이다. 특이적 활성은 Unit/mg 단백질로 정의된다. o-니트로페놀의 몰 소멸 계수는 ε0.033 mM-1cm-1, pH 4; ε=0.036 mM-1cm-1, pH 5;ε=0.038 mM-1cm-1, pH 6. 방출된 o-니트로페놀의 양은 405 nm 에서 o-니트로페놀 흡광도 (Y axis) 대 o-니트로페놀 농도 (X axis)의 검량 플롯으로부터 외삽했다.
효소 활성은 자이모그램에 의해 시각화되어 있다. 천연 PAGE는 Gallagher (8)에 의해 기재된 프로토콜의 개질을 사용해서 수행했다. 대장균 용해물 또는 P. 파스토리스 상청액의 단백질은 5% (w/v) 슈크로오스 /10 ㎍.ml-1 브로모페놀 블루 중에서 용해되고 6% 천연 폴리아크릴아미드 겔 중에서 러닝(running) 버퍼로서 50 mM 소디움 포스페이트 버퍼 (pH 6)를 이용해서 분리되었다. 겔은, 냉각수가 60 mA 에서 5h 동안 전기영동 중에서 재순환하는 Mighty Small Hoefer 전기 영동 장치에서 냉각시켰다. 전기영동 후, 겔을 세척 버퍼(50 mM 소디움 포스페이트 버퍼, pH 4.0)에서 10분 동안 2회 세정했다. 자이모그램은, 20℃에서 50 ㎍.ml-1 X-GAL을 함유하는 세척 버퍼 중에서 흡수된 여과지를 배치하고 24 시간 동안 전개했다. 청색 침전물은 효소의 위치를 정의한다.
효소 동역학
0 내지 1.2 U.ml-1 범위의 일련의 효소 희석액은 42℃에서 50 mM 소디움 포스페이트(pH 5)에서 분석했다. 효소 활성은 1.3 mM ONP-Glu를 첨가해서 개시하고, 405 nm 에서 1분 간격으로 총 20분 동안 흡광도를 모니터링했다. 실험 흡광도가 시간에 따라 플롯팅되면, 적어도 20분 동안 0.6 U.ml-까지 선형비례를 나타내고, 1.0 U.ml- 1 를 초과하는 효소 농도에서 5분 이전에 흡광도가 유지된다.
0.2 U.ml-1 rBHT (42℃) 의 Michaelis-Menten 상수(km and Vmax)는, 50 mM 소디움 포스페이트 (pH 5) 중에서 ONP-Glu를 0 내지 10.4 mM 까지 변화시키고, 20℃, 30℃, 40℃ 및 50℃에서 초기 반응 속도를 측정함으로써 결정했다. 각각의 온도에서 동역학 상수는, OriginPro 7.5 를 사용하고 Hill 계수가 1인 Hill 식의 비선형 회귀 분석을 통해서 결정했다. 형성 조건 하에서 얻어진 값은 다음과 같다(T, km, Vmax): (20℃, 0.37 mM, 0.09 mM.min-1), (30℃, 0.48 mM, 0.12 mM.min-1), (40℃, 0.71 mM, 0.23 mM.min-1) and (50℃, 1.3 mM, 0.42 mM.min-1). 회귀의 피팅 계수(R2)는 20℃에서 0.9869, 30℃에서 0.99065, 40℃에서 0.99115, 50℃에서 0.98996이었다.
rBHT 특징
효소 활성 분석은 상기 기재된 형성 조건 하에서 수행했다. 효소 활성에 대한 pH의 영향은 50 mM 소디움 포스페이트 (pH 5.0 내지 11.0), 50 mM 시트레이트 (pH 2.0 내지 5.0) 및 50 mM 포스페이트-시트레이트 (pH 2 내지 11) 를 포함하는 버퍼 용액에서 시험했다(도 2A). 단당(글루코오스 및 갈락토오스)에 의한 경쟁 억제는 반응 혼합물 중에서 이들의 농도를 변화시켜서 조사했다(도 2C). 온도 및 열 안정성은 20, 30, 40, 50, 60, 70 또는 80℃에서 잔류 활성을 측정해서 결정했다(도 2B 및 2D). 간단히, 효소 활성 분석은, 잠재적인 억제제/활성화제로서 첨가제를 평가하기 위해 사용했다. 10 mM 이하의 다음의 첨가제를 시험하고, 첨가제로는, 킬레이트제 (EDTA), 환원제 (디티오트레이톨 (DTT), 2-메르캅토에탄올 (2-ME), 및 구리 (Cu2+)), 및 이온 (1가 양이온; NH4 +, Cs+, K+, Na+, Li+, 및 Rb+; 2가 양이온; Ba2 +, Ca2+, Co2 +, Fe2 +, Mg2 +, Mn2 + , Ni2 +, and Zn2 +; 3가 양이온 Ag3 +). 중금속(Co2 +, Fe2 +, and Zn2 +) 은 침전을 막기 위해 50 mM 시트레이트 버퍼(pH 5.0) 중에서 실험했다. 또한, 반응 혼합물에 첨가되는 1% (v/v)의 계면활성제로는, TritonX-100, Tween 20, Tween 80, 및 소디움 도데실 설페이트 (SDS)이다. 용매는 10% v/v 로, 에탄올, 메탄올, 아세톤, 아세토니트릴, PEG400 및 글리세롤이다.
GOS 생산 및 분석
정제된 rBHT 또는 P. 파스토리스 휴지 세포 (막 결합 효소에 서식)를 사용하는 표준 갈락토실 전환 반응은, 30℃ 또는 42℃에서 락토오스(22 gL-1 또는 200 gL-1)를 함유하는 5 mM 소디움 포스페이트 버퍼 (pH 5.0) 중에서 표준화된 효소 (0.5 Ug-1 락토오스)의 표준화된 양을 첨가해서 개시했다.
반응 생성물 및 기질은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)(Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) 를 isocratic 조건하에서 65℃에서 0.4 ml.min- 1유속에서 분석했다. 이동상은 굴절률 검출기에 결합된 Alltech IOA-1000 유기산 컬럼 (300 mm by 7.8 mm) (Alltech, IL) 을 사용하는 5 mM 황산(H2SO4)이었다. 컬럼은 ; 갈락토실-락토오스 (Carbosynth (Berkshire, UK)), 락토오스, 글루코오스 및 갈락토오스 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 사용해서 검량했다. 잔류 비 정량화 GOS 종(4당 및 5당)은 굴절률 검출기로부터 신호 강도 측정값으로 기재된다.
6.2 결과
대장균에서 재조합 β헥소실-전이효소 (rBHT)의 발현
대장균 BL21은 이종 단백질을 생성하기 위해 가장 널리 사용되는 숙주이다. 불운하게도, 이러한 숙주 균주(host strain)는 rBHT 로서 지정된 β-헥소실-전이효소의 평가를 간섭하는 활성 내인성 β-갈락토시다제를 함유한다(물질 및 방법 참조). BL21, BLR, NovaBlue, Origami, and Rosetta (표 3)를 포함하는pET-기반 발현 시스템에 적합한 상이한 대장균 균주를 선별한 후, 대장균 BLR은 내인성 β-갈락토시다제 활성의 부족인 것으로 확인되었다. 대장균 CC118 (ΔlacZ) 균주는 대조군으로 사용되었다(36). rBht 유전자를, C-말단 6XHIS 또는 4개의 용해도 향상 공-발현 파트너(글루타티온-S-전이효소 (GST), 티오레독신 (Trx), PelB 리더, 및 DsbA) 중 하나를 함유하는 pET 발현 플라스미드에 삽입해서 pJB101, pJB103, pJB104, pJB105, 및 pJB106 (표 3)를 형성했다(표3). 전체 세포 또는 세포 부재 추출물 중에서 대장균 BLR로 전환하고 IPTG로 유도해서 비활성 rBHT를 발현시켰다.
rBHT 항혈청에 의한 융합 단백질의 면역블로팅 분석은, 예상된 분자량으로 모든 rBHT 융합 단백질을 검출하고, 불용성 분획에서 가장 강한 반응성이 관찰되었다. 잠재적인 숙주 의존 단백질 비용해성을 배제하기 위해, rBHT 발현은, PJB102에 서식하는 대장균 CC118(T7 프로모터가 테트라시클린(TET) 유도 프로모터로 대체된 pJB101)은, 성공적인 않은 것이 입증되었다(데이터 미기재).
P. 파스토리스로부터 rBHT의 발현 및 정제
P. 파스토리스는 번역 후 개질을 도입하고 많은 활성 재조합 단백질(여기서 대장균을 실패)을 생성하는 능력에 대해 공지되어 있다(14). 따라서, 발명자들은, S. 세레비시아에 α-팩터 신호(단백질 분비에 대한 서열) 및 N 말단 6XHIS, 이어서 TEV 프로테아제 절단 부위(pJB108, 표 3)을 갖는 프레임 내에서, 코돈 최적화된 rBht 유전자를, 알코올 산화효소 프로모터(AOXI)를 조절해서 pPIC9 내에 삽입했다. P. 파스토리스 GS115는 pJB108 (GS115/rBht) 로 전환시키고, rBHT 활성을 6개의 GS115/rBht 재조합에서 평가했다. 가장 높은 농도의 생활성 단백질을 분비하는 재조합 균주가 추가로 연구되었다. 자이모그램에 의해 활성 rBHT가 존재하는 것을 확인했다. 단지 GS115/rBht 는 포지티브 신호를 제공하고, pJB101 에 서식하는 대장균 BLR로부터 세포 추출물 및 변형되지 않은 GS115로부터 배양액 상청액은 네가티브였다(도 1c). 예상된 바와 같이, BHT에서 단백질 막 관통 영역은, 또한 세포 표면에 결합된 rBHT 활성을 나타내는 GS115/rBht 세포를 형성하고, 천연 BHT S.신 구라리스에서 위치에 상응한다(15,16).
rBHT 정제는 니켈 치환성 크로마토그래피를 사용해서 수행하지만, HIS tag는 존재하지 않거거나 항 HIS 항혈청을 사용하는 웨스턴 블로팅 분석에 의해 단백질이 검출되지 않은 것으로, 이는 예상된 절단 부위에서 N-말단 신호 서열의 가능한 처리를 나타낸다(16). 이어서, rBHT 효소는 Mono Q 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용해서 정제되었다(20℃에서 8.2 U.mg- 1 의 특이적 활성)(표 5).
6.3. P. 파스토리스에서 발현되는 rBHT의 특성
1. rBHT의 명백한 분자량
6XHIS 및 TEV 프로테아제 부위 태그를 포함하는, 비갈락토실화되고, 충분히 처리된 rBHT에 대해 추정된 분자량은, 68 kDa였다. 효소는, 단백질 갈락토실화의 변형을 반영하는 53 내지 146 kDa 범위의 명백한 분자량을 갖는 단량체뿐 아니라 이량체로서 이전에 정제되었다 (표 5) (1,16). 여기서, 효소 활성은 실험적 명백한 분자량 110 kDa을 가지고 하나의 단량체 피크로서 용출되었다. 본 발명자들은, 천연 효소 pH 최적(3.7 내지 6) 산성 범위 내에서 2량체 형태가 두드러지는 것으로 요약했다(표 5). 그러나, pH 4.0에서 Superdex 200 컬럼으로부터 분획은, 동일한 프로파일을 나타내는 것으로, 이는 재조합 효소의 안정한 단량체 형태를 확인했다. 효소 활성 분석, 자이모그램 또는 웨스턴 블로팅 결과, 높은 분자량의 응집체는 검출되지 않았다. 항-rBHT를 사용하는 컬럼 분획 및 면역블로팅 분석의 정제에 따르면, 효소가 명백한 분자량 110 kDa를 갖는 단일 밴드로서 이동하는 것이 입증되었다(도 1a 및 1b).
2. 기질 특이성
ONP Gal은 전통적으로 β-갈락토시다제에 대한 기질로서 사용되었다. ONP-Gal, PNP-Gal and PNP-Glu 는 천연 BHT 활성에 대한 이전 연구에서 사용되었다(표 5). rBHT 효소 활성(0.2 U.ml-1) 는 동일한 실험 조건에서 상기 기질들을 비교했다. 재조합 효소는 ONP-Glu 및 PNP-Glu에 대해 동일한 활성이 있었다. 글리콘 부분 내에서 갈락토오스를 갖는 기질은 ONP-Glu에 대해 약 41% (ONP-Gal) 및 23%(PNP-Gal) 의 속도로 가수분해되었다. 이러한 결과에 따르면, rBHT는 당에 대해 좁은 특이성을 갖고 글루코오스 당 유도체가 기질로서 사용되는 경우 C2 및 C4에서 탄소 연결 위치의 구조에 대한 큰 유연성을 갖는 것으로 나타난다.
3. rBHT의 최적 pH, 온도, 및 열 안정성
rBHT는 pH 4.0에서 최고치를 나타내는 넓은 pH 범위(pH 3.5 내지 6) 내에서 활성이 있다(도 2A). 효소 활성 프로파일에 따르면, pH 7 초과 또는 3.5 미만에서 최대 효소 활성의 50% 미만으로 급격히 감소하는 것을 나타냈다. 이러한 결과는 보고된 pH 최적치에 일치하고(1)(표 5의 문헌 참조), 단 알칼리성 조건은 효소 활성 및 안정성에 대한 해로운 영향을 가질 수 있다.
초기의 반응 속도는 20℃ 내지 80℃ 범위의 상이한 온도에서 측정하고, 이는 효소는 20℃ 내지 50℃의 온도에 걸쳐서 활성이 있고, 최적은 40℃ 내지 50℃에서 발생하는 것을 나타낸다(도 2B). 30℃ 미만의 온도에서, 초기 반응 속도의 50% 감소가 관찰되고, 50℃를 초과한 온도에서 빠르고 비가역적으로 효소를 비활성화시킨다. 효소 반응 속도를 최대화하는 경우의 최적 온도는 Vmax/Km 최대값으로부터 얻어질 수 있다(33). Vmax 는 20℃ 내지 40℃의 온도에서 Km값 보다 빠른 속도로 증가하고, 따라서 Vmax/Km값(0.242 min-1, 20℃; 0.255 min-1, 30℃; 0.324 min-1, 40℃; 0.322 min-1, 50℃)은 이러한 범위를 넘어서 증가하고 40℃ 내지 50℃의 온도에서 일정했다. 따라서, Vmax/Km 에 의해 결정된 최적 온도는 40℃ 내지 50℃이었고, 최적 값은 각 온도에서 초기 반응 속도를 사용해서 달성되는 것을 확인했다.
도 2D에서 도시된 바와 같이, rBHT의 열 안정성은 20℃로부터 50℃까지 평가되었다. 20℃ 및 30℃에서, 효소는 6일 동안 원래 활성의 적어도 90%를 유지하고, 이는, 천연 효소에 대해서 이전에 보고된 결과를 확인했다(4). 4℃에서 6개월 동안 저장된 rBHT의 5개의 독립적인 배치는 초기 활성의 95% 유지했다(데이터 미도시). 최적 온도가 40℃ 내지 50℃에서 발견되지만, 40℃를 초과한 온도에서 배양은 rBHT에 대해서 유해했다. 40℃에서, 효소는 초기의 활성의 70%를 12h 정도 유지하고, 이러한 활성 수준은 추가의 36 h 동안 지속했다. 대조적으로, 효소 활성은 처음 12 h 배양 기간 내에 50℃에서 급격히 감소했다.
4. 금속, 염, 계면활성제, 및 용매의 rBHT 활성에 대한 효과
효소 억제/활성은 광범위한 첨가제 내에서 시험했다. rBHT는, 마그네슘이 일부 β-갈락토시다제의 효소 활성을 현저히 증가하더라도, 시험된 임의의 이온((NH4 +, Ba2 +, Ca2 +, Cs+, Co2 +, Cu2 +, Li+, Rb+, Mg2 +, Ni2 +, Na+ and Zn2 +)에 대한 요건을 갖지 않았다(26). 또한, 재조합 효소는 이온-킬레이트제 EDTA 1 및 5 mM의 존재하에서 충분히 활성이 있고, 이는 상기 발견 및 이전 보고를 확인했다(1). 또한, 디설파이드 브리지를 분해하는 것으로 입증된 화합물, 예를 들면, Cu2 + 및 환원제(디티오트레이톨(DTT) 및 2-메르캅토에탄올(2ME))(1,18,19))는, 활성에 대한 부정적인 결과는 없었다. 용매(메탄올, 에탄올, 아세톤 및 아세토니트릴)는, 단지 부분적으로 효소를 억제한다(66% 내지 81% 상대활성)을 억제한다. 반면, 10% 글리세롤 또는 1% SDS (비이온성 계면활성제) 의 첨가는 거의 완전히 효소를 억제했다.
정제된 rBHT를 사용하는 GOS 합성
효소가 특징이 있다면, 분비된 rBHT는 2% 락토오스가 GOS로의 생체전환에 대해 시험했다. 반응 조건은 5 mM 소디움 포스페이트 버퍼 (pH 5.0)에서 42℃에서 락토오스의 0.5 U rBHT.g- 1 이었다. 도 3은, 시간에 따라 락토오스 소비 및 GOS 축적을 나타낸다. 가장 높은 생산 속도는 처음 12 h 및 갈락토실-락토오스 중에 관찰되고, 글루코오스는 주요한 생성물이었다. 갈락토오스는 검출되지 않았으며, 이는, 갈락토실 전환 반응에 완전히 혼합되어 GOS를 형성하는 것을 나타낸다. 30 h 후, 4.2 g.L- 1 의 글루코오스는 축적되고 락토오스(54%)는 최대로 이용되었다. 또한, 이 시점에서, 7.8 g.L- 1 의 3당이 축적되고, 이용된 락토오스의 평균 67% 전환율로 도달했다. 반응이 진행됨에 따라, 갈락토오스는 효소 반응을 이탈하고 흔적 농도로 축적된다. 경쟁 효소 억제는 락토오스 생체전환 효율을 감소시키기 때문에, 본 발명자들은, 반응 혼합물에서 효소 활성에 대한 글루코오스 또는 갈락토오스의 농도를 변화시키는 효과를 조사했다. 5 g.L-1 글루코오스는 rBHT 활성을 90%까지 감소시키는 반면, 효소 활성은 형성 조건하에서 70 g.L-1 갈락토오스까지 영향을 미치지 않았다(도 2C).
P. 파스토리스 휴지 세포 GOS 합성(막 결합 rBHT에 서식)
경쟁 억제를 피하고, 락토오스의 GOS로의 전환은 글루코오스가 동시에 반응 혼합물로부터 제거되는 경우에 개선하기 위해, 본 발명자들은, P. 파스토리스 GS115/rBht의 휴지 세포에 의해 20% 락토오스의 생체 전환을 평가했다. 막 결합 rBHT에서 서식하는 P. 파스토리스 GS115/rBht는, 5 mM 소디움 포스페이트 버퍼 (pH 5)에서 0.5 U rBHT.g-1 락토오스를 함유하는 세포 밀도로 정규화했다. 반응은, 30℃에서 10일 동안 수행하고, P. 파스토리스 성장의 최적 온도는 42℃로 초기 반응 속도가 분비되는 rBHT에 대해 최대값인 온도이다. 예상된 바와 같이, 초기 락토오스의 90% 가 30℃에서 부수적인 생성물을 갖지 않고 GOS로 전환된다(42℃에 경우 락토오스의 51%). 결과적으로, 얻어진 세포는 생리적으로 활성이 있고, 반응의 글루코오스 부산물을 소비할 수 있고, 따라서, 경쟁 억제를 피할 수 있다. 그러나, 42℃에서 GOS 형성의 초기 반응 속도는 처음 48 h 동안 30℃에서 속도의 두 배였다. 80 g.L-1 갈락토실-락토오스의 최종 농도는, 42℃에서 1.6 g.L-1.h- 1 의 생산성에 상응해서 도달되었다(도 4a) 30℃에서 락토오스가 63% 이용되면, 갈락토실 락토오스의 농도는 100 g.L- 1 이고, 5일 후 0.8 g.L-1.h- 1 의 생산성에 도달했다(도 4b).
6.4. 고찰
본 연구에서, 대장균 및 P 파소토리스 중에서 발현하기 위해 S.신구라리스(기탁번호 AB126324)로부터 β-헥소실-전이효소 유전자의 DNA 서열을 최적화했다. 얻어진 rBht유전자는 합성적으로 생성되고 (기탁번호 JF29828), 대장균에서 발현되었다. 그러나, 이러한 세균 숙주는, 이전에 관찰된 용해성 및 활성 rBHT 생성에 필수적인 번역 후 개질을 포함하는 능력이 부족했다(16). 이어서, AOXI 프로모터를 조절해서 rBht 유전자를 성공적으로 P. 파스토리스 염색체에 통합시켜서, 세포 표면에 관련될 뿐 아니라 배양액 브로스 중에 검출되는, 충분히 활성적인 효소를 형성했다. P. 파스토리스 GS115 에 의해 rBHT의 분비는, GS115가 S. 싱그라리스로부터 순수한 BHT를 얻기 위해 필요한 복잡한 정제 공정을 피할 수 있다. 또한, P.파스토리스는 천연단백질을 매우 낮은 수준으로 분비하기 때문에, 세포외 rBHT는, 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 전체 세포의 제거와 같이 단순하게 회수된다(5).
재조합 효소의 분자량은 단일 110 kDa 촉매 활성 폴리펩티드에 상응하고 작은 폴리펩티드 또는 rBHT 응집물은 검출되지 않았다. 번역 후 개질은, 단백질 접힘, 구조적 안정성, 올리고머 형성 및 기질 인식(17,24)에서 중요한 역할을 하고, 이러한 분자량이 대장균에서 발현되고 아미노산 서열에 의해 예상되는 단백질(68 kDa)보다 큰 것은 놀랍지 않았다. S. 신구라리스 에 의한 천연 BHT의 번역 후 글리코실화는 종래에 보고되어 있고, chitinase 및 EndoHf 처리 후 정제된 단백질의 분자량이 73.9 kDa 로부터 66.3 kDa 로 이동하는 것이 관찰되었다 (16). 예상된 글리코실화 부위의 돌연변이 유발은, 글리코실화가 rBHT 분자량의 변동에 대한 원인인지를 결정하는 것을 돕는다.
본원에 보고된 데이터는, 천연 S. 신구라리스 BHT에 대해 데이터를 정리하기 위해 rBHT의 이용을 비교하는 큰 연구 중 일부이다(표 5). 본 발명의 연구에 따르면, 재조합 효소는 β-갈락토시드에 대해 경우에 따라 필수적인 환원제 또는 코팩터를 필요로 하지 않는 것이 확인되었다. 효소는, 낮은 온도(40℃ 미만)에서 양호한 열 안정성 및 40℃ 내지 50℃ 및 pH 3.5 내지 6에서 최적 활성을 나타냈다. 또한, 효소는, 글루코오스 억제에 의해 조절되지만, rBHT는 천연 BHT에 대해 이전에 보고된 바와 같이 갈락토오스 또는 Ag3 +에 대해 민감하지 않았다(4,16,25,35).
락토오스 이용 및 초기 락토오스 농도는, 최종 GOS 축적을 최대화하기 위해 기여하는 2개의 주요한 팩터이다. 본 발명자는, 생리적 활성 휴지 세포인 P. 파스토리스 GS115/rBht를 사용해서 락토오스 이용(90%)이 개선되는 공정을 증명했다. 이러한 조건하에서, 세포는 30℃에서 잔류 글루코오스를 소비하고, 글루코오스 억제를 피하고, 상당한 공정 개선 및 높은 정도의 최종 프리바이오틱 순도를 보장한다(도 4b). 반면, 25℃를 초과한 온도는 막 결합 천연 BHT를 함유하는 S. 신구라리스 휴지 세포가 잔류 글루코오스를 소비하는 것을 방지하고, 이어서 최종 GOS 농도 및 순도를 제한 것으로 보고되었다(Gosling et al.에 의해 보고)(11).
42℃에서 배양된 GS115/rBht 휴지 세포는, 초기 락토오스의 51%가 갈락토실 락토오스 및 잔류 글루코오스로 전환된다(도 4a). 이러한 데이터는 동일한 조건 하에서 분비된 rBHT에 의해 갈락토실 락토오스를 형성하는 것과 매우 유사했다(도 3). 또한, 전환 및 이용 값은 S. 신구라리스 에 의해 종래에 보고된 공정과 비교할 수 있었다(표 5). 일반적인 락토오스 이용값은 초기 락토오스의 30% 내지 40%인 것으로 보고되어 있지만(11), 본 발명의 연구에 따르면, 분비된 rBHT에 비해 락토오스의 그램당 10.8배의 효소를 사용하는 50% 락토오스 이용을 보고한다(표 5)(4).
20세기 중반에 S. 신구라리스 에 의한 GOS 합성의 발견은, 효율적으로 GOS를 생산하는 우수한 β-갈락토시다제에 대한 연구를 장려했다((9,10,37)). 그러나, 효소 연구에 따르면, S. 신구라리스 로부터 BHT에 비해, 락토오스 이용 값은 낮고 최종 농도의 바람직하지 않은 부산물이 많은 것을 나타냈다(1,4,12,16,27,34,35). 그럼에도 불구하고, S. 신구라리스 BHT 의 산업적 이용의 진보에 따라, 순수한 천연 BHT를 얻기 위해 필요한 문제의 다단계정제 공정 때문에 바람직한 공정에 의해 필요한 것에 비해 느려졌다(1,4,16). P. 파스토리스로부터 분비된 또는 막 결합 효소의 생활성 rBHT는, GOS를 생성하기 위한 분명한 공정상 이점을 나타낸다. 장래의, 연구는, 단백질 발현 수율, 단백질 안정성, 및 효소 활성을 개선하기 위해 단백질 개질 전략을 연구할 것이다.
표 6은, 본 발명에서 제조된 구조에 대해 요약한다. 모든 구조는 pPIC9 에 제조되지만, P. 파스토리스에서 염색체 요소로서 존재한다.
6.5. 락토오스 풍부 유청으로부터 갈락토-올리고당
전세계 유제품 시장은 2009년에 $299.7B 이었고, 2014년에 $370.9B 로 증가하고, 23.8% 증가할 것으로 기대된다. 전세계 유제품 산업 프로파일: Global. Dairy Industry Profile: Global [serial online]. October 2010:1. Business Source Complete, Ipswich, MA. Accessed February 24, 2012. Global (2012) 로부터 이용가능함. 우유 및 치즈는 시장의 35.2% 및 28.3% 을 차지했다. 전세계 치즈 소비는, 2015년에 2억 천 만톤에 도달할 것으로 기대된다(Lenoir-Wijnkoop I. & van Aalderen WM,B.G.K.D.S.A.N.MJ. The Netherlands. Eur J Health Econ (2010)에서 프리바이오틱의 특이적 혼합물의 비용 효율 모델). 유제품 시장 성장은 상당한 산업 폐기 처리 문제를 일으키고, 유제품 가공 중에 생성되는 높은 락토오스 함량의 우유 및 부산물을 제공한다. 높은 락토오스 함량의 폐기물 액체는 예외적으로 높은 생물학적 산소 요구랑(BOD)을 갖고, 락토오스를 분해하는 데 필요한 산소량은 다른 유기체의 생존에 필요한 산소를 빼앗는데 매우 충분하다. 따라서, 많은 국가에서는, 락토오스 함유 유체를 물에 바로 폐기하는 것을 제한하는 환경보호법을 제정했다(Ganzle,M.G., Haase,G. & Jelen,P. Lactose: Crystallization, hydrolysis and value-added derivatives. International Dairy Journal 18, 685-694 (2008)). 수돗물 처리 공정에 대한 추가 부담은, 유제품 경제에 의존하는 국가 및 주에서는 문제가 되고 많은 비용이 들 수 있다(4-6)(Affertsholt-Allen T. 락토오스 및 락토오스 유도체의 시장 개발 및 산업 도전. IDF Symposium "Lactose and its Derivatives." Moscow. ( lactose . ru/present/1Tage_Affertsholt-Allen. pdf. Accessed Sept 30, 2009) (2007); Markets and Markets. U.S. Digestive Health Ingredients Market Worth $495.3 million in 2015. (www. marketsandmarkets. com/ PressReleases /us-digestive-health-ingredients-market. asp) (2010); UBIC consulting. THE WORLD GALACTO-OLIGOSACCHARIDE MARKET. (www. ubic -consulting. com/template/ fs /documents/Dairy-Ingredients/ Galacto - Oligosaccharide -Ingredient-Market. pdf ) (2010)).
예를 들면, 치즈 제조는, 2개의 생성물(치즈 및 유청)을 생성한다. 제조된 치즈의 1 파운드마다 유청 9 파운드가 생성되고, 과잉의 유청을 형성하고(2008년 168,000,000 톤), 이는 약 5% 락토오스를 함유한다. 이러한 락토오스 분획은 일반적인 하수 배출보다 약 175배 큰 BOD를 갖고, 처리되지 않은 폐기물은 직접 물에 폐기될 수 없다(Smithers, G.W. Whey and whey proteins. "From Glitter to Gold". International Dairy Journal 18, 695-704 (2008). 참조). 이러한 문제의 일반적인 해결책은, 락토오스를 추출하기 위해 고가의 공정을 적용함으로써 락토오스 풍부 배출액을 생물학적 환경정화하는 것으로, 최고값 $1.50/kg에서 상품으로 판매될 수 있다. 매년 생산되고 있는 치즈 유청의 50%은 식품 성분 및 동물 사료와 같은 유용한 제품으로 재활용되고 있다. 나머지는, 경제적 재순환 가능하도록 하는 임계 부피에 도달되지 않거나, 생체전환에 수반되는 어려운 높은 기술 정도 때문에 폐기물로 여겨진다. 따라서, 전체 공정 비용을 줄이고 미국 유제품 산업 경제를 개선하기 위해, 락토오스를 시판되는 적합한 고부가가치 제품으로 만드는 전략이 필요하다.
본 발명자들은, 이러한 산업적 문제에 대한 이상적인 해결책으로서 새로운 식품 개발 공정을 적용함으로써 화학적 락토오스의 동시의 생체내 변환/생물학적 환경정화를 제안한다. 본 발명자들은, 락토오스가 효소 반응을 통해 갈락토 올리고당(GOS)라고 하는 갈락토실 락토오스 유도체로 전환할 수 있는 방법을 개선했다. GOS는 프리바이오틱으로 분류하고, 이는 소화계에서 이로운 세균의 성장 및 활성을 자극하고, 유아기 유동식, 영양 보충제, 요거트, 구운 제품, 및 동물 사료와 같은 식품에 널리 사용되고 있다. 상용 락토오스 제품과 달리, GOS는 중요한 식품 성분으로, 이러한 전환의 경제적 가치는, 락토오스 가격($1.50/kg)을 GOS의 가격($5.20-8.50/kg)과 비교함으로써 쉽게 증명된다. GOS는 2010년 $265,900,000 가치의 소화 건강 식품 성분 트렌드의 일부이고, 매년 성장 속도 18.3%이고, 2010년부터 2015년까지 화합물 매년 성장 속도 13.2%로 성장할 것으로 기대된다.
본 발명의 락토오스를 GOS로 전환하는 방법은, 기존의 공정에 비해 매우 뛰어난 것으로, 본 발명자들은 효소를 생성하기 위해 효율적인 숙주를 이용함으로써 전체 반응 부피를 50배 정도 감소시키고, 생성된 GOS 부피 및 순도를 증가시키고, 잠재적으로 락토오스-부재 생성물을 생성하기 때문이다 (Euromonitor. Lactose-free Foods Maintain Their Global Appeal, March 1, 2011. Euromonitor (2011). 참조). 전세계 시장에서 락토오스 부재 제품은, 2009년에 $3.4B 이었으며, 소비자의 건강 및 웰빙 기능성 식품에 대한 지속적으로 관심 때문에 성장할 것으로 기대된다. 그 외의 유제품은 가격에 매우 민감하고, 락토오스 부재 제품과 같은 기능성 식품은 프리미엄을 붙여 판매될 수 있다.
본원에 기재된 개선된 공정을 사용해서, 미국 및 전세계 유제품 산업 및 보조식품 제조업자들은, 3개의 이점이 있다. 1) 다량의 GOS 품질 형성, 고가의 건강 촉진 보조식품/유제품 보충제, 2)가치 있는 락토오스 부재 우유 또는 유청 제품의 동시 잠재적인 생성, 및 3) 유청 및 우유 부산물의 재순환을 통해 환경 영향의 비용 효율적 감소
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
6.6. 신호 도메인을 대체함으로써 β-헥소시전이효소의 분비가 향상된다
6.6.1. 요약
소포로미세스 신구라리스 로부터 β-헥소실-전이효소 (BHT) 는 갈락토실 전환 반응을 촉진하고 갈락토올리고당(GOS)를 합성하기 위한 능력에 대해 공지되어 있다. 본 발명자들은, 피키아 파스토리스 (GS115::αMF-HIS-TEV-rBht)의 재조합 균주에 의해 생활성 충분한 길이의 폴리펩티드(rBHT)의 이종 발현을 보고했다. 재조합 균주는, 사카로마이세스 세레비시아에 메이팅 팩터 pre pro 신호 (αMF), 히스티딘 tag 및 TEV 절단 부위에 의해 진행된 전체 길이의 Bht 유전자를 갖는다. 메탄올 도입 후, GS115::αMF -HIS-TEV-rBht 에 의해 발생된 rBHT는 부분적으로 분비되고, 대부분의 단백질은 세포 막에 결합된 채로 유지되었다. 분비된 rBHT 양을 증가시키기 위해, 이러한 작업은 2개의 추정 내인성 구조적 도메인을 함유하는 특징 지워지지 않은 BHT 아미노 말단 영역(아미노산 1-110)을 연구한다. 아미노산 말단은 도메인(아미노산 1-22)을 포함하고, 이는 종래의 분비 리더 신호로서 역할을 할 수 있고 남은 23-110 아미노산은 추정 비- 종래의 분비신호를 포함한다. 따라서, 본 발명자들은, 기능적으로 rBHT-HIS를 발현하는 재조합 P. 파스토리스 GS115 균주를 발생시킴으로써 이러한 도메인을 평가했다. 결과적으로, αMF가 γBht(1-22) 종래의 리더 신호(아미노산 1-22)를 뒤따르는 경우 단백질 분비에 영향을 미치는 신호 간섭을 나타내고, 리더 신호(아미노산 1-22)을 αMF(αMF-rBht (23-594)) 로 대체한 것은 50 and 14 접힌 분비된 및 막-결합된 효소의 P. 파스토리스 생성에 영향을 미쳤다. 단백질 분비를 촉진하는 BHT 아미노 말단 도메인을 확인하기 위해, 본 발명자들은 비-분비 추가의 단백질, 항-β갈락토시다제 단쇄 가변 항체 단편 scFv13R4로 도메인을 시험했다. αMF 및 rBHT의 아미노 말단 도메인, 이어서 항체 scFv13R4의 조합을 발현하는 재조합 P. 파스토리스 균주는, rBHT-HIS를 발현하는 재조합에 의해 얻어지는 분비 강도와 연관되는 결과를 생성할 수 있다. 최종적으로, 효율적인 재조합으로부터 얻어진 활성 rBHT-HIS and rBHT 단백질(GS115::αF-rBht (23-594)-HIS and GS115:αF-rBht (23-594)))은, 균질하게 정제되고 효소 활성에서 가능한 변경에 대해 평가했다. 6XHIS tagged 및 태그되지 않은 분비된 효소의 활성은 GOS 생성 속도에 의해 표시된 바와 같이 비교 가능했다.
6.6.2. 도입
기능성 식품의 도입, 특히 락토오스 유도체를 얻기 위해 락토오스로부터 프리바이오틱 생산 분야에 있어서 효소 사용에 대한 관심이 증가하고 있다.
소포로미세스 신구라리스 는 락토오스와, 갈락토오스가 아닌 글루코오스를 동화시킬 수 있지만 락토오스의 글루코오스 부분에만 대사 작용할 수 있다. 또한, 이용되지 않는 갈락토오스 단량체는 갈락토 올리고당(GOS) 의 구성 성분으로서 브로스 중에서 발견될 수 있다. 이러한 생리적 특징으로 인해, β-헥소실-전이효소 (BHT) (Blakely and Mackenzi 1021-25;Phaff and Carmo-Sousa 193-207;Spencer, de Spencer, and Laluce 147-56;Gorin, Phaff, and Spencer 1341-44;Gorin, Spencer, and Phaff 2307-17)이 발견되었다. S. 신구라리스로부터 BHT에 의해 합성된 GOS와 같은 프리바이오틱은 GRAS로서 인식되고 기능성 식품 첨가제로서 널리 사용된다(Tzortzis and Vulevic 207-44).
락토오스로부터 GOS 의 합성 이외에, BHT는 또한 ONP-Glu and PNP-Glu 와 같은 β글리코시드 결합의 가수분해를 촉진한다((Blakely and Mackenzi 1021-25). BHT 효소 능력은 특히 경쟁 기술에 대해 바람직한데, 산업적 이점을 갖는 GOS의 생성을 촉진할 수 있는 효소 중 하나이기 때문이며, 이는 추가의 이온 및 코팩터 없이 발생하는 촉매 및 초기의 락토오스 농도의 독립적으로 갈락토실 전환 반응을 수행하는 그 능력을 포함한다. (Gosling et al. 307-18;Blakely and Mackenzi 1021-25).
S. 신구라리스에서 , Bht는 글루코오스로 나타낸 유도성 유전자이고, 락토오스와 같은 유도자의 존재는 세포 막에 결합되는 것으로 발견된다. 세포 위치로 인해, BHT 의 정제는 다중 크로마토그래피 단계를 필요로 하고, 14% 내지 16% 범위의 매우 낮은 수율로 S. 신구라리스 로부터 회수되었다(Blakely and Mackenzi 1021-25;Cho, Shin, and Bucke 2107-11;Ishikawa et al. 331-39). 종래의 단백질 정제 프로토콜은 효소 회수 및 그 기술적 적용을 제한하기 때문에, 추가의 전략이 평가되었다. 제1접근 방법은 S. 신구라리스를 돌연변이를 통한 선택에 의해 노출되는 단계로 구성된다. 이러한 방법을 새로운 균주에 적용하는 단계는, 글루코오스 억제가 부족하도록 선택하고 막 결합 BHT가 10 배 증가할 수 있지만, 분비된 효소의 생성 증가는 보고되지 않았다(Ishikawa et al. 331-39). 또한, 본 발명자는, 최근에 P. 파스토리스 GS115 는 19 아미노산 신호 서열 (pre서열), 이어서 66 아미노산 pro서열로 이루어진 αMF prepro 분비 신호 및 2염기 Kex2 엔도펩티다아제 처리 부위(Kurjan and Herskowitz 933-43)에 의해 진행되는 경우 생리적 활성 재조합 rBHT 폴리펩티드를 분비할 수 있다. 본 연구에서, 세포 부재 추출물 및 막 결합 연관된 활성 분석에 따르면, 대부분의 효소가 세포 막에 연관된 채로 유지되는 것을 나타냈다. 따라서, P. 파스토리스 GS115 는 생활성 rBHT의 생성 및 분비에 대해 적절한 숙주인 것을 나타내는 것으로, 생활성 rBHT는 분비된 및 막-결합된 생활성 rBHT의 생성 가능성을 처리하고 입증하는 하류를 용이하게 할 것이다(Dagher et al., 2013).
천연 BHT 단백질 서열에 대한 추가의 연구는, 아미노 말단에서 내인성 구조 특징을 함유하고, 적합한 종래의 및 비-종래의 분비 신호로 기능할 수 있는 아미노 말단 도메인을 포함한다. 이들이 리더 신호로 기능하면, S. 신구라리스 의 다음의 처리를, 세포벽 용해물 효소로 처리한 후, 대부분의 방출된 BHT는 아미노 말단 종래의 리더 신호가 없는 것을 나타냈다(Ishikawa et al. 331-39). 유전자 발현 및 단백질 분비 효율은 세 결합 및 분비에 참석하는 단백질 구조 요소에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에, 동일한 기능은, P. 파스토리스 GS115에 의해 발현되는 경우, 단백질 세포 위치로 연장될 수 있다.
본 연구에서, 발명자들은, BHT 아미노 말단 도메인의 생리적인 역할을 실험하고, P. 파스토리스 GS115에 의한 단백질 분비와 이들의 관계를 실험했다. 또한, rBHT 아미노 말단 도메인의 분비 역활은 카르복실 말단으로서 단일의 단쇄 항 β갈락토시다제 항체 scFv13R4를 함유하는 재조합 키메라를 사용해서 입증했다. 항체 scFv13R4는 결합 활성에 이황화 가교 형성에 대해 독립적인 비-분비 매우 안정한 단쇄의 일례이다(Martineau, Jones, and Winter 117-27). scFv13R4는 Escherichia coli, 사카로마이세스 cerevisiae, and Chinese hamster ovary cells (CHO)에서 이종 발현되었다(Visintin et al. 11723-28;Grage and Rehm 254-62;Bach et al. 79-93).
6.6.3. 결과
β-헥소실-전이효소 (BHT) 컴퓨터에 의한 단백질 서열 분석
BHT 폴리펩티드(594 아미노산)의 카르복실 말단 부분(아미노산 111 내지 594)은, β-글루코시다제에 대해 현저한 상동성이 있다. 이러한 글리코 가수분해효소 I (GHI) 도메인은 단백질 N-글리코실화에 대해 잠재적으로 필요한 추정 촉매 산/염기, 촉매 뉴클레오필, 및 3개의 아스파라긴 잔기를 함유한다(도 7a). 두드러지게, BHT 아미노산 말단은 처음 110 아미노산에 놓여있는 독특한 영역을 드러냈다. 이러한 영역은 아미노 말단 종래의 리더 신호 도메인(아미노산 1 내지 22), 이어서 예측된 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP) 낮은 복잡한 비-종래의 분비 신호(NC)(http://mendel.imp.ac.at/METHODS/seg.server.html)을 포함한다. 아미노 말단 리더 신호(아미노산 1 내지 22)은 N-영역(아미노 말단, 아미노산 1 내지 5), H-영역(소수성, 아미노산 6 내지 17), 및 C- 영역(카르복시 말단, 아미노산 18 내지 22)(도 7b)로 분해될 수 있다.
Phobius 웹 기반 프로그램(http://phobius.sbc.su.se/) 및 신호 P 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk/services/신호P/) 과 같은 추가의 알고리즘에 의해, 추정 종래의 리더 신호 및 잠재적인 절단 부위(잔기 17과 18 사이 및 22와 23 사이)가 예상된다. 또한, 종래의 리더 신호는 막 단백질의 국소화 및 분비를 용이하게 할 수 있는 전하 분포 및 H 영역(RHYTHM, http://proteinformatics.charite.de/rhythm/) 내에 막에 접촉하는 5개의 아미노산을 함유하는 것으로 예상되었다. 막 관통 영역 예상 알고리즘(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)은, Kyte and Doolittle hydropathy 플롯에서 예상된 바와 같이 단백질 및 비-시토플라스믹 영역(아미노산 23-594)에 걸치는 통합 막에 대한 일반적인 BHT 내에서 1-17 and 177-199의 소수성 잔기의 스트래치가 예상되었다(도 7c). 이러한 구조적 특징은, 아미노 말단 종래의 리더 신호가 효모 분비 경로를 통해 통과하는 중에 막 앵커로서 작용할 수 있는 것을 나타낼 수 있다.
아미노 말단 영역은, 단백질 분비에 참석한다. 2개 아미노 말단 분비 도메인(종래의 및 비-종래의 분비 신호)의 가능성 있는 생리적인 역할을 조사하기 위해, 카르복실 말단 BHT 도메인(아미노산 111 내지 594) 및 단쇄 항-β-갈락토시다제 항체(scFv13R4)의 발현을 시험했다. 안정한 재조합 P. 파스토리스 GS115 균주는, rBht 아미노 말단 도메인 및/또는 강한 9.3 kDa αMF prepro 서열에 의해 진행되는 적합한 개질된 유전자 조합의 염색체 통합에 의해 얻어졌다. rBht and scFv13R4 유전자 조합은, AOX1 프로모터의 하류에 삽입하고, 이어서 카르복실 말단 6X HIS 태그를 삽입해서 검출 및 정제(도 8A 및 8D)를 돕는다(물질 및 방법 참조).
리더 신호(아미노산 1 내지 22)를 강한 αMF prepro 분비신호(GS115::αMF-rBht (23-594)-HIS)로 대체하면, αMF 분비 신호(GS115: αMF-rBht-HIS) (0.49 ㎍.ml-1) 에 의해 진행되는 전체 길이 rBHT-HIS 의 발현에 비해, 단백질 분비를 19배 넘게(9.80 ㎍.ml-1) 증가시켰다(도 8B). 마찬가지로, αMF의 부재하에서, 리더 신호는 분비를 위해 이종 단백질을 검출할 수 있었다(GS115::rBht-HIS)(6.35 ㎍.ml-1). 또한, 단백질 분비는, αMF 및 리더 신호 (GS115::rBht (23-594)-HIS)의 부재하에서 검출되었고 (4.65 ㎍.ml-1), 단, 종래의 리더 및 비-종래의 분비 신호는 분비하기 위해 단백질을 타겟으로 하는 정보를 포함한다.
상기 기재된 바와 같이, 아미노 말단 도메인을 입증하기 위해, 분비 경로에 대한 타겟 단백질로서, 본 발명자들은 신호 서열이 없는 세포간 단백질인 항체 scFv13R4를 선택하였다. 항체 scFv13R4 키메라의 다이아그램은 도 8C에 도시된다. GS115::scFv13R4-HIS (리더 분비 신호 부족) 로 발현되는 경우 scFv13R4-HIS 는, SDS-PAGE 은 염색 또는 웨스턴 블롯 분석 (데이터 미도시)에 의해 배양액 브로스 내에서 검출될 수 없다. GS115::rBht (1-110)-scFv13R4-HIS 또는 GS115::rBht (23-110)-scFv13R4-HIS 에 의해 scFv13R4-HIS 분비는, scFv13R4 를 Bht 종래의 리더 분비 신호 (25.17 ㎍.ml-1)에 융합되는 경우, 또는 Bht 비-종래의 신호 (7.03 ㎍.ml-1)에 융합되는 경우에 나타났다. 마찬가지로, BHT-HIS에 의해 보여지는 것과 같이, αMF에 의해 구동되는 분비(GS115::αMF - scFv13R4-HIS)는 가장 높은 수준의 분비 단백질을 제공했다(91.02 ㎍.ml-1).
P. 파스토리스 GS115에 의해 발현되는 rBHT-HIS의 효소 활성 및 웨스텃 블롯 분석
단백질 발현이 효소 활성에 상호 관련되는 것을 확인하기 위해, 분비된 및 막 결합된 rBHT-HIS 활성은 기질로서 ONP-Glu를 사용해서 측정되었다(물질 및 방법 참조). rBHT-HIS에 의해 검출가능한 양 및 활성 값으로 분비되는 모든 재조합 균주는 분비된 단백질의 증가를 반영했다. GS115::αMF- rBht (23-594)-HIS 에 의해 분비된 단백질은 효소 활성(3.7 mU.OD-1) 을 나타내고, 이는, 완전한 아미노 말단 영역(아미노산 1-110)에 의해 분비되는 경우 측정된 활성((GS115::rBht-HIS (0.63 mU.OD-1))보다 6배 높은 값이다. 마찬가지로, 측정된, GS115::αMF-rBht (23-594)-HIS에 의해 분비된 단백질의 효소 활성은, αMF 및 리더 신호(GS115::αMF- rBht-HIS (0.07 mU.OD-1))를 함유하는 재조합으로부터 얻어지는 것보다 53배 높았다. 재조합 GS115::rBht (23-594)-HIS (0.26 mU.OD-1) 는 분비되는 효소의 활성이 감소되는 것을 나타낸다(표 8).
각각의 재조합의 휴지 세포에 의해 표시되는 막 결합 효소의 활성에 대해 시험했다. 본 발명자들은, GSll5::αMF-rBht-UlS (1.48 mU.OD-1)에 비해, 균주 GSll5::αMF-rBht (23.594)- HIS (21.52 mU.OD-1)의 막 결합 활성이 15배 증가하고 균주 GS115::rBht-HIS(1.94 mU.OD-1)에 대해 1.3배 증가를 나타내는 전체 분비 단백질과 상관 관계가 있는 활성 값을 발견했다. 재조합 GS115::rBht (23-594)-HIS (0.15 mU.OD-1)은 막 결합 효소가 감소하는데, 이러한 재조합은 추정 비-종래 분비 경로를 통해 단백질을 전환시키는 것을 확인했다.
전체 결과에 따르면, αMF 또는 BHT 리더 분비 신호에 의해 rBHT-HIS 분비를 충분히 종료할 수 없다는 것을 나타낸 것으로, 아미노산 177 내지 199 사이에서 예상되는 막 통과 영역의 존재에 관련될 수 있다.
항 HIS 항체를 사용하는 세포 부재 추출물의 웨스턴 블롯 분석에 따르면, GS115::αMF - rBht (23-594)-HIS, GS115::rBht-HIS, and GS115::rBht (23-594)-HIS에 의해 분비된 단백 값을 확인 했다(도 9a). 각각의 경우, 약 110 kDa 분자량에 상응하는 현저한 rBHT-HIS 밴드가 존재했다. 이러한 결과는, 이전에 보고된 SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그α래피 이동 패턴과 일치했다(Dagher, Azcarate-Peril, and Bruno-Barcena). GS115::αMF-rBht (23-594)-HIS, GS115::rBht-HIS, and GS115::αMF-rBht-HIS로부터 얻어진 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석에 따르면, 또한 약 110 kDa의 분자량을 나타내지만, GS115::rBht (23-594)-HIS 는 세포간 열화 또는 또 다른 글리코실화 패턴을 나타낼 수 있는 98 kDa와 64 kDa 사이에서 현저한 밴드가 나타났다(도 9b).
rBHT 가수분해 활성
또한, 본 발명자들은, GS115::αMF-rBht (23-594)-HIS and GS115::αMF-rBht (23-594)로부터 HIS-태그 및 비-HIS tag 단백질에 대한 분비된 효소를 실험했다. 효소 들은 비슷한 결과를 나타내고 10 내지 50℃의 온도 및 (2.8 내지 6)의 pH 범위에서 활성이 있었다. 최대 활성은 pH 3.6 내지 5 로부터 얻어지고(최대 활성 91 내지 100%), pH 2.6(최대 활성 43%)부터 pH 6.8(최대 활성29%)까지 서서히 감소되었다. 마찬가지로, 최적 온도는 40 내지 45℃이지만(최대 활성 97% 내지 100%), 50℃ 초과 20℃ 미만으로 빠르게 감소되었다(최대 활성 25% 미만)(데이터 미도시).
효소는 50 mM 소디움 포스페이트 버퍼(pH 5, 4℃)에서 적어도 6개월 동안 안정하고 활성은 -80℃에서 보관함으로써 영향을 받지 않았다. GS115::αMF-rBht (23-594)-HIS 에 의해 분비된 효소에 대해 동역학 상수는 Hill 식에 따라 얻어졌다(효소의 Km 0.79 mM and Vmax 3.97 mmol.min-1 per mg-1, 42℃, pH 4). 이러한 발견은 본 발명자 등(Blakely and Mackenzi 1021-25;Cho, Shin, and Bucke 2107-11;Gorin, Phaff, and Spencer 1341-44;Gorin, Spencer, and Phaff 2307-17;Ishikawa et al. 331-39;Sakai et al. 285-93;Shin, Park, and Yang 787-92;Shin and Yang 484-89;Dagher, Azcarate-Peril, and Bruno-Bracena)에 의해 이전에 보고된 것과 일치했다.
rBHT 안정성
장기간 효소 안정성을 조사하기 위해, 모든 새롭게 유도된 재조합 균주는 2% 글루코오스를 함유하는 버퍼에서 배양하고 막 결합 및 분비된 rBHT의 가수분해 활성은 시간 경과에 따라 측정했다. 종래의 또는 비-종래의 분비 경로를 통한모든 재조합으로부터 얻어진 분비된 rBHT-HIS는, 1주 시험 기간 동안 안정하게 유지되고 초기 활성의 95%를 초과해서 유지되었다. 동일한 안정성은, 막 결합 효소를 함유하는 휴지세포가 GS115::αMF-rBht-HIS, GS115::rBht-HIS, and GS115::αMF-rBht (23-594)-HIS에 의해 발현되는 경우에 관찰되었다. 그러나, GS115::rBht (23-594)-HIS에 의해 발현된 막 결합 효소를 함유하는 휴지세포를 시험하는 경우, 활성은 추가의 비-종래의 분비 경로로 24 h 내에 감소하기 시작했다
GS115::αMF-rBht (23-594)-HIS에 의해 발생된 rBHT-HIS 의 정제 및 특징
GS115::αMF-rBht (23-594)-HIS 에 의해 발현된 rBHT 단백질은 니켈 친화도 크로마토그래피를 사용해서 정제되었다. 카르복실-말단에 6XHIS 태그를 배치하면, 성공적으로 원래 효소 활성의 73% 넘게 단일 단계 회수가 가능하고, SDS-PAGE 후, 약 110kDa의 단일 폴리펩티드 밴드가 나타났다(도 9c). 배양액 상청액으로부터 6.54 배의 단백질 정제는, 42℃, pH 4에서 18.45 mU.mg- 1 의 특이적 활성을 갖는 7.24 mg의 효소가 회수되었다(표 9). 또한, 동일한 방법 후, 본 발명자들은, 상이한 재조합에 의해 분비된 rBHT-HIS를 정제하고, 18.45 내지 18.65 mU.mg-1의 필적할 만한 특이적 활성을 발견했다. GS115::αMF- rBht (23-594)-HIS 에 의해 분비된 폴리펩티드의 아미노 말단 서열 결정에 따르면, 전체 rBHT(23-594)-HIS 단백질이 브로스(V-X-Y-P-G 잔기) 및 2개의 추가의 아미노 말단 아미노산을 함유하는 생성물(E-A-V-X-Y 잔기)에 존재하는 것을 나타냈다. 분비중 아미노산 A-E의 절단에서의 변이성은, 둘러싼 아미노산 서열 및 3가 구조체((Cereghino and Cregg 45-66)에 의해 영향을 받을 수 있다. 남은 비-종래의 서열은 새로운 절단 부위가 도입되지 않았다.
rBHT 전이효소 활성에 대한 HIS 태그 영향
재조합 GS115::αMF-rBht (23-594)-HIS and GS115::αMF-rBht (23-594) 은, HIS 태그가 락토오스로부터 GOS의 합성에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 비교 평가하기 위해 더 사용되었다. GOS 축적은 220 gL-1 초기 락토오스, 0.5 U rBHT g- 1락토오스를 함유하는 반응 혼합물로부터 HPLC에 의해 정량 분석하고, 30℃에서 배양했다.
도 10a는 6XHIS 태그 또는 비-태그 분비된 효소에 의해 반응이 촉진되는 경우 시간 경과에 따라 GOS 축적 및 락토오스 소비의 비교를 도시한다. 두 경우에, 최대 생성속도는 주요 생성물로서 갈락토실 락토오스로 처음 25 h 동안 관찰되었다. 이전에 기재된 125 h 후 효소 경쟁 글루코오스 억제를 확인한 결과, 갈락토실-락토오스(75 gL-1) 축적은 이용된 초기 락토오스의 60%로부터 평균 67% 전환율에 정적으로 도달한다((Dagher, Azcarate-Peril, and Bruno-Bracena).
막 결합 HIS 및 비-HIS 태그 rBHT를 발현하는 휴지세포를 사용하는 경우, 시간 경과에 따른 비교 GOS 축적 및 락토오스 소비가 확인되었다. 도 10b는 카르복시 말단 HIS이 갈락토실 락토오스 형성의 초기 반응속도에 영향을 미치지 않은 것을 나타낸다(1.87 and 1.7 g.L-1.h-1). 이전에 보고된 바와 같이, 글루코오스는 P. 파스토리스 의 휴지세포에 의해 소비되는 반면, 갈락토오스를 사용해서 이론적 수율 75%에 도달하는 GOS를 합성했다(68% 수율(g/g))((Dagher, Azcarate-Peril, and Bruno-Bracena).
6.6.4. 고찰
프리바이오틱은 기능성 식품으로서 판매되는 탄수화물 유도체로, 위 내에서 유익한 세균의 성장을 특이하게 자극함으로써 소비자의 건강이 개선되는 것으로 활발히 홍보하고 있다. 프리바이오틱스는, 낮은 조작 비용으로 높은 효율의 제품 공정이 가능하다는 것이 이를 개발하는 근본적인 힘이다. 그러나, 화학적 방법에 의해 특이적 탄수화물 유도체의 생성 또는 합성은 복잡하고, 유사한 반응성을 갖는 다수의 하이드록실기의 존재로 인해 보호 및 탈보호 단계가 필요하다(Sears and Wong 2344-50). 따라서, 효소적 접근 방법의 개발이 실제 관심을 받고 있고, 효소 활성을 개질하고, 촉매 메카니즘의 깊은 지식을 얻고, 단백질 분비를 증가시키기 위해, 유전자 개질이 광범위하게 사용되고 있다. 분비될 단백질은 보통 20-30 아미노산의 아미노 말단 리더 신호에 의해 진행되고, 결국 막 결합 신호 펩티다아제에 의해 처리된다(Von Heijne 17-21). P. 파스토리스 에 의해 단백질 분비는 초기 뉴클레오티드 서열의 성질에 의해 영향을 받고, 경우에 따라 코돈 최적화가 필요하며, 또한 글리코실화 패턴, 최종 3차 구조, 배양액 조건, 및 배지 조성물에 대한 고려사항이 필요하다(Damasceno, Huang, and Batt 31-39). 또한, 리더 도메인 내에 주입된 아미노산의 분포는 막의 국소화 및 분비된 단백질을 용이하게 하는 데에 중요한 역할을 한다(Boyd and Beckwith 1031-33).
상기 기재된 바와 같이, P. 파스토리스는, 효율적으로 번역 후 개질에 통합하는 능력으로 인해 대장균에서 rBHT를 발현하는 이점을 제공하고, 이는 소량의 생활성 rBHT의 이질적 생성이 가능하다. BHT의 컴퓨터 분석에 따르면, 이러한 효소는 막 관통 도메인을 함유하고 이는 P. 파스토리스에 의한 효소의 분비를 증가시키기 위해 검토되어야 하는 것으로 제안한다. BHT 독특한 단백질 영역(1-110 아미노산)은 종래의 리더 신호(BHT(1-22)) 및 비-종래의 분비 신호 도메인(BHT(23-110))로 기능하는 것으로 예상되는 2개의 도메인을 포함한다. 종래의 리더 신호는 또한 세포 막에서 기능을 수행하기 위해 단백질을 대상으로 한다(RHYTHM method and hydropathy plots에 표시, 도 1). 특히, 위치 17에서 아르기닌과 같은 염기성 아미노산의 존재는, 분비 효율 및 막 내의 단백질 배향에 관련될 수 있다(도 1).
제시된 데이터에 따르면, αMF 및 리더 신호(BHT(1-22))의 동시 존재로 인해 GS115::αMF-rBht - HIS 에 의한 단백질 분비 간섭을 나타낸다. 단백질 분비 수준은 GS115::αMF-rBht - HIS 에 의해 상기 기재된 값까지 필적할 만하다 (Dagher, Azcarate-Peril, and Bruno-Bracena). 한편, 분비된 단백질의 높은 축적량은, αMF 또는 BHT(1-22), 가 존재하지 않는, 재조합 GS115::rBht-HIS and GS115::αMF-rBht (23-594)-HIS 에 의해 얻어졌다. 따라서, 리더 신호 도메인(BHT(1-22))이, αMF 에 필적할 만한 신호 펩티드 매개 메카니즘(종래의 분비 경로)에 관련되어 있는 것을 입증한다. 리더 신호는, 리더 서열을 함유하는 GS115::αMF-rBht -HIS에 비해, 막 결합 및 분비된 rBHT의 단백질 발현을 증가시킬 수 있다. 분비된(50배 증가) 및 막 결합(14배 증가) 생활성 rBHT 단백질에 대한 최대값은, 재조합 GS115::αMF-rBht (23-594)-HIS 에 의해 얻어졌다(표 3). GS115::αMF-rBht (23-594)-HIS 로부터 발현된 생활성 단백질의 정제는 SDS-PAGE에 의해 특이적 활성(18.45 U.mg-1)을 갖는 매우 순수한 단백질을 형성했다(표 4). rBHT 분자량(110kDa)은 세포 막 결합 및 분비된 rBHT 사이의 차이는 없으며, 본 발명의 이전 연구로부터 rBHT와 유사한 효소 활성, 열안정성, 재사용성, 및 보관 안정성을 나타냈다(Dagher et al., 2013).
본 발명자들은, 리더 도메인(BHT(1-22)) 및 αMF의 제거에 의해 효소 분비가 방해를 받는 것으로 예상했다. 그러나, αMF 및 BHT(1-22)의 제거로, 낮은 양의 분비 단백질을 나타냈다. 또한, 110 아미노산 독특한 영역은 이중 기능을 포함하는데, 이는 리더 도메인 BHT(1-22) 이 효율적인 분비 신호(종래의 분비 경로)로서 작용하고, 예상된 BHT(23-110) 도메인이 추가의 분비 신호(비-종래의 분비 경로)로 작동할 수 있는 것이다. 웨스턴 블롯 분석에 따르면, 단백질 분해에 의해 세포 내에서 단백질 감도를 증가시키는 것을 나타낸다. 대부분의 측정된 가수분해 활성은 분비된 효소의 양에 영향을 미치는 최대 질량(110 kDa) 미만으로 다중 밴드로 검출되었다(도 9a-9c). 본 발명자는, 신호서열이 분비 중에 분비 경로 내에서 단백질 분해 효소로부터 단백질을 유지함으로써 단백질을 보호하는 작용을 할 수 있다고 생각한다.
비록 다량 단백질이 GS115::αMF-rBht (23-594)-HIS에 의해 분비되더라도, 상당량은 안정하게 막에 결합되어 있고, 경우에 따라 단백질 카르복시 말단 도메인(아미노산 177-199) 내에서 막 관통 도메인의 존재로 인해 막 내의 이동성을 제한하는 것으로 예상되기 때문이다. 따라서, 분비 신호로서 이러한 도메인의 생리적 기능을 확인하기 위해, 본 발명자들은 rBHT(23-594) 도메인을 항체 scFv13R4 단백질로 대체함으로써 새로운 단백질 키메라를 생성했다. BHT(1-110) 종래의 리더에 이어서 추정 비-종래의 리더, BHT(23-110) 추정 비-종래의 리더, 및 αMF 도메인은 scFv13R4를 갖는 아미노 말단 위치에 프레임 내에서 배치되었다. 이러한 새로운 조합 분석에 따르면, 항체가 분비됨으로써 리더 분비 기능을 확증할 수 있었다. 본 발명자들의 결과에 따르면, 신호 서열의 선택은 재조합 BHT 및 scFv13R4을 포함하는 단백질의 생성 및 분비 수준에 대해 강한 영향을 미친다는 것을 확인한다. 새로운 작은 리더 신호(22 아미노산)은 αMF(66 아미노산)에 비해 크기의 이점이 있고, 새로운 독특한 서열에 의해 이종 단백질이 분비하게 할 수 있는 것을 입증했다. 이러한 리더 도메인은, 기계적 수단을 사용해서 파괴 또는 화학적 처리에 의한 투과에 의해 추출되어야 하는 세포간 효소 내에 형성될 수 있는 새로운 특징을 추가한다. (Panesar et al. 530-43).
BHT의 지속적인 분자 개발은, 열 활성, 냉각 안정성 및 특이적 올리고당의 합성과 같은 새로운 특성을 갖는 효소에 대해 식품 산업 문제를 해결하는 것을 도울 것이다. 이러한 발견은, 글리코실 전환 활성 및 기질 특이성에 기여하는 특징을 해명하기 위한 구조적 분석에 동기를 부여한다. 3D 구조에 기초한 촉매 부위 및 합리적인 돌연부위는 프리바이오틱 후보로서 새로운 GOS의 생성을 위한 기질 특이성을 변경의 길을 준비할 것이다.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
6.7. 섹션 6.6의 참고문헌
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7. 참고문헌
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Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015

본 발명은 상세한 설명에 의해 기재되지만, 상기 설명은 본 발명을 설명하는 것으로 본 발명의 범위로 제한되지 않는 것으로 이해된다. 본 발명의 그 외의 형태, 이점 및 개질은 하기 기재된 특허 청구범위 내에 포함된다. 본 명세서 내에 인용된 모든 공보, 특허, 특허 출원은, 각각 개별 공보 또는 특허 출원은 특히 개별적으로 참조로 포함되는 것처럼, 본원에 참조로 포함되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> North Carolina State University <120> Beta-Hexosyl-Transferases and Uses Thereof <130> NS12009WO <150> 61/734,742 <151> 2012-12-07 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1782 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 1 atgatgctgc atgctgcact gctagtagcg ctgccatgtg ttgttttggc gcgcccggcc 60 ggagcggtta cttatccggg agccattcct ctgtccctga cgagcaatta cgaaacccca 120 agtccgacag caatcccgct ggagccaaca ccgacggcta ccggtacagc agaattagat 180 gcgctgtgga acttagtcga agctcagtac ccagttcaaa ctgctgcagt gacaactttg 240 gtgacagtgc ccgatgatta taagtttgag gcagatccac cgagttatgc attagcaggg 300 tatgaaacaa gcgagattgc cggactgaag tttccaaagg ggtttaagtt tggtgttgcg 360 ggggcagcca ttcaagttga aggtgcagca aaagccgaag ggcggggccc aagtacctgg 420 gattatctgt gtcatcacta tgccagcacg cagtgtaaca attatgatcc cgatattaca 480 accaaccatt actacctgta cccattggac tttgcgcgcc tgcaacacct aggcattaac 540 acttactcgt tttcaatttc atggacgcgt atttatccat tgggcgcagg ctatgttaat 600 gaagcagggt tagcccacta tgatgccgta 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atggacgcgt atttatccat tgggcgcagg ctatgttaat 600 gaagcagggt tagcccacta tgatgccgta atccatagtg ccaagaagta tggtctggaa 660 ccagtgggca ccgtttttca ctgggatacg ccactgtctc tgatgctgaa atacggtgcc 720 tggcaagata ctggtgacca aattgttaag gactttgtta cctatgccac aactgtgttt 780 aagcgttatg gtaatgaagt caagacgtgg tttactttca atgaaccacg ggttttctgt 840 tcacaaaata gtggtctgcc atacaatctg acgtatccag aaggtattaa cagcacctcc 900 gctgtatttc gttgcaccta caatgttctg aaagctcatg gtcatgctgt taaagtgtat 960 cgggatctag ttgcctccgg gaccattgcg gcaggtgaaa tcggctttaa atccgatgat 1020 aactacccaa tcccggcccg tccagggaac gccgatgacg aggaatcagc caagcgtcac 1080 gaggcttttc gcattgggat ttttgcgcaa ccggtttatg gtaatggcga ttatccagat 1140 gttgttaaag aaactgttgg agatatgctg ccggccctga cggatgaaga taaaggatac 1200 attaaaggta gcggagatat ttttgcgatt gacgggtatc gtaccgatat ttcccatgcg 1260 gctctgaacg ggatcgcgaa ttgtattcgc aaccaaagtg acccgaattg gccagtgtgt 1320 gaagaagggt cagatccttt tgctcatgtt tacccatccg ggtttgctat tggtcaatca 1380 gccgatccac tgtcttcatg gttagtcaac 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cagccgatcc actgtcttca tggttagtca actcagcccc gtttatccgc 1380 gatcaactga agtttctgac acaaacctac cctgctaagg gtggtattta tttctcggaa 1440 tttggttggg ctgaagacgc cgaatatgat cgtcaactgc tgtatcaaat tacctgggat 1500 ggtctgcgta cgcaatacct gacggactat ctgagccagc tgctgttggc tgtgcacaaa 1560 gacgggatta atctgcgagg cgcgctgacg tggagttttg tcgataattg ggagtggggt 1620 ttagggatgc aacagaaatt cggatttcag tttgttaatc aatcagatcc cgatctgaca 1680 cgcacgttta aactgagcgc tcacgcttac gcccaatttg ggcgtaatca tctgcaccac 1740 caccaccacc actaa 1755 <210> 20 <211> 584 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 20 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Tyr Val 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Lys Val Tyr 290 295 300 Arg Asp Leu Val Ala Ser Gly Thr Ile Ala Ala Gly Glu Ile Gly Phe 305 310 315 320 Lys Ser Asp Asp Asn Tyr Pro Ile Pro Ala Arg Pro Gly Asn Ala Asp 325 330 335 Asp Glu Glu Ser Ala Lys Arg His Glu Ala Phe Arg Ile Gly Ile Phe 340 345 350 Ala Gln Pro Val Tyr Gly Asn Gly Asp Tyr Pro Asp Val Val Lys Glu 355 360 365 Thr Val Gly Asp Met Leu Pro Ala Leu Thr Asp Glu Asp Lys Gly Tyr 370 375 380 Ile Lys Gly Ser Gly Asp Ile Phe Ala Ile Asp Gly Tyr Arg Thr Asp 385 390 395 400 Ile Ser His Ala Ala Leu Asn Gly Ile Ala Asn Cys Ile Arg Asn Gln 405 410 415 Ser Asp Pro Asn Trp Pro Val Cys Glu Glu Gly Ser Asp Pro Phe Ala 420 425 430 His Val Tyr Pro Ser Gly Phe Ala Ile Gly Gln Ser Ala Asp Pro Leu 435 440 445 Ser Ser Trp Leu Val Asn Ser Ala Pro Phe Ile Arg Asp Gln Leu Lys 450 455 460 Phe Leu Thr Gln Thr Tyr Pro Ala Lys Gly Gly Ile Tyr Phe Ser Glu 465 470 475 480 Phe Gly Trp Ala Glu Asp Ala Glu Tyr Asp Arg Gln Leu Leu Tyr Gln 485 490 495 Ile Thr Trp Asp Gly Leu Arg Thr Gln Tyr Leu Thr Asp Tyr Leu Ser 500 505 510 Gln Leu Leu Leu Ala Val His Lys Asp Gly Ile Asn Leu Arg Gly Ala 515 520 525 Leu Thr Trp Ser Phe Val Asp Asn Trp Glu Trp Gly Leu Gly Met Gln 530 535 540 Gln Lys Phe Gly Phe Gln Phe Val Asn Gln Ser Asp Pro Asp Leu Thr 545 550 555 560 Arg Thr Phe Lys Leu Ser Ala His Ala Tyr Ala Gln Phe Gly Arg Asn 565 570 575 His Leu His His His His His His 580 <210> 21 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 21 ccgctcgaga aaagagaggc tgaagctcac caccaccacc accacgaaaa cctgtatttt 60 cagatgatgc tgcatgctgc ac 82 <210> 22 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 22 aaggaaaaaa gcggccgctt acagatgatt acgcccaaat tg 42 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 23 atcactatgc cagcacgcag tgta 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 24 tttaaagccg atttcacctg ccgc 24 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 25 gactggttcc aattgacaag c 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 26 gcaaatggca ttctgacatc c 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 27 tactattgcc agcattgctg c 21

Claims (22)

  1. 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20에 나타내는 아미노산 서열을 갖는, 재조합 β-헥소실-전이효소(rBHT) 단백질을 코딩하는 분리된 DNA.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 12 또는 14에 나타내는 아미노산 서열을 갖는, 재조합 β-헥소실-전이효소(rBHT) 단백질을 코딩하는 분리된 DNA.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 DNA는, 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 또는 19에 나타내는 핵산 서열을 갖는, 재조합 β-헥소실-전이효소 (rBHT) 단백질을 코딩하는 분리된 DNA.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 DNA는, 서열번호 13 또는 15에 나타내는 핵산 서열을 갖는, 재조합 β-헥소실-전이효소 (rBHT) 단백질을 코딩하는 분리된 DNA.
  5. 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20에 나타내는 아미노산 서열을 갖는, 효소 활성의 재조합 β-헥소실-전이효소 (rBHT) 단백질.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 단백질은 막에 결합되는, 효소 활성의 rBHT 단백질.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 단백질은 가용성 효소인, 효소 활성의 rBHT 단백질.
  8. 진핵생물 숙주 세포 내에서 효소 활성의 재조합 β-헥소실-전이효소(rBHT) 단백질을 제조하는 방법으로,
    상기 진핵생물 숙주 세포를, 적합한 프로모터를 조절해서 플라스미드로 변형하는 단계를 포함하고, 상기 플라스미드는, 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20에 나타내는 아미노산 서열을 갖는, rBHT 단백질을 코딩하는 분리된 DNA를 함유하는, 효소 활성의 재조합 β-헥소실-전이효소(rBHT) 단백질의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 분리된 DNA는 신호 펩티드를 코딩하는 DNA에 결합되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 신호 펩티드는 사카로미세스 세레비시아에 α-팩터 신호 펩티드인, 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 적합한 프로모터는 알코올 산화효소 프로모터인, 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 효소 활성의 rBHT 단백질은 20℃에서 약 8 U.mg- 1 의 특이한 활성을 갖는, 방법.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 진핵생물 숙주 세포는 효모 세포인, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 효모 세포는 피키아 파스토리스인, 방법.
  15. 갈락토-올리고당(GOS)를 제조하는 방법으로,
    GOS를 제조하기 위한 적합한 조건하에서, 락토오스를, 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20 에 나타내는 아미노산 서열을 갖는, 효소 활성의 재조합 β-헥소실-전이효소(rBHT) 단백질과 반응시키는 단계를 포함하는, GOS의 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 효소 활성의 rBHT 단백질은 고체 지지체 상에 고정되는, 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 GOS는 회분식 또는 연속식 교반 탱크 반응기, 충진형 반응기, 또는 한외여과막 반응기 내에서 제조되는, 방법.
  18. 제15항에 있어서,
    경쟁 글루코오스 억제를 방지하기 위한 글루코오스 제거 시스템으로서, 일반적으로 안전한 것으로 인식되는(GRAS) 유기체를 더 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 글루코오스 제거 시스템은 상기 효소 활성의 rBHT 단백질과 동시에 사용되는, 방법.
  20. 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20에 나타내는 아미노산 서열을 갖는, 재조합 β-헥소실-전이효소(rBHT) 단백질을 포함하는, 개질된 락토오스 함유 식재 또는 식품 부산물.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 식재 또는 식품 부산물은 유제품 또는 부산물인, 락토오스 함유 식재 또는 식품 부산물.
  22. 제18항에 있어서,
    상기 식재 또는 식품 부산물은 베이비 디저트, 베이비 주스, 베이비 스낵, 베이비 요거트 음료, 에너지 음료, 피트니스 워터 또는 갈증 해소 음료, 냉동 유제품 디저트, 과일 음료(비타민/미네랄 강화), 과일 파이 필링, 과일 제제, 유아기 유동식, 유아기 식사 대용 음료, 젤리 잼, 식사 대용 음료, 우유, 우유 기반 음료, 우유 대용, 시럽 향을 첨가한 우유, 요거트, 또는 유청인, 락토오스 함유 식재 또는 식품 부산물.
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