CN101864439A - β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了编码β-葡萄糖苷酶同工酶BglA的基因SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明利用ATCC标准真菌菌株S.singularis，采用现代分子生物学技术，克隆、表达具有高β-葡萄糖苷酶活性的BglA蛋白，利用其生物转化橙皮苷，将苷转化为苷元，消除苷类中药人群中应用个体差异，提高苷类中药生物利用度，进而提高苷类中药有效成分的药理作用。本发明首次在一个实验室中同时进行橙皮苷和橙皮素的口服给药和静脉给药两种给药方式的药代动力学平行对比实验。发现橙皮素比橙皮苷易于吸收且清除较慢，从而补充了橙皮苷生物利用度低于其苷元的原因。

Description

β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白及其用途

技术领域

本发明属于微生物转化工程技术领域，涉及β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白及其用途。更具体的说是利用β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白对陈皮进行生物转化可提高陈皮中橙皮苷的生物利用度的方法。

背景技术

生物转化法本质是由微生物产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物催化剂对外源性底物进行的一种或几种化学反应。生物转化既可增加目标产物产量，克服化学合成的缺点，又因其大多数是在室温、中性环境中作用，减少了产物分解、异构、消旋和重排反应，反应具有位置选择性和立体选择性，因此生物转化具有无毒、无污染、低成本、高收率、环境友好等特点。

S.Singularis分离自Scolytus spp.昆虫幼虫粪便，由于此类真菌自然条件下的生存环境决定了其体内可产生用于分解来自于蔬菜的苷类化合物的酶类。Ishikawa EIJI等研究发现S.Singularis只能产生一种水解酶，称作BglA蛋白，并验证此酶是具有高半乳糖苷酶活性的β-葡萄糖苷酶同工酶。

橙皮苷是广泛存在于柑橘类果实中主要类黄酮苷类成份之一，药理研究证实其具有抗氧化、调节脂类代谢、干扰肿瘤发生等生物活性。但橙皮苷与其他类黄酮一样口服生物利用度不高，究其原因之一是其含有的配糖基团影响了其水溶性。相关研究表明橙皮苷的苷元，橙皮素的口服生物利用度高于橙皮苷，因为橙皮素不含有配糖基团，不需要脱糖基化。因此水解橙皮苷，脱去其配糖基团是提高其口服生物利用度的特异性方法之一。目前研究的转化方法主要有化学法，如日本Hayashibara橙皮研究所采用糖基化方法制成糖基化橙皮苷。但强烈化学反应会改变苷类化合物的结构和构型，导致产物不稳定或药效消失；酶解法，如瑞士雀巢研究中心采用酶修饰方法，用橙皮苷酶水解橙皮苷获得橙皮素-7-糖苷。酶解法转化苷类中药是以苷类提取物为作用底物，使用糖苷水解酶作为催化剂，工艺过程复杂，不利于工业化生产。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供一种β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白。本发明使用β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白生物转化陈皮中的主要活性成分橙皮苷，口服给药和静脉给药两种给药途径的药代动力学结果均表明此酶的生物转化作用提高了橙皮苷的生物利用度，因此我们探索微生物转化技术，利用ATCC标准真菌菌株S.singularis，采用现代分子生物学技术，克隆、表达具有高β-葡萄糖苷酶活性的BglA蛋白，利用其生物转化橙皮苷，将苷转化为苷元，消除苷类中药人群中应用个体差异，提高苷类中药生物利用度，进而提高苷类中药药效。

本发明的另一个目的在于公开了β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白在提高苷类中药生物利用度方面的应用，特别是将橙皮苷转化为苷元药物方面的应用。

为实现上述目的本发明提供如下的技术方案：

一种编码β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶的基因，该基因具有SEQ ID NO：1。

本发明所述的β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶，它具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

本发明所述β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶的重组表达质粒的载体为pQE30-Xa-bglA。

本发明进一步公开了β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶在制备提高苷类化合物生物利用度药物方面的应用。特别是β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶在制备提高陈皮中橙皮苷的生物利用度药物方面的应用。

实验结果表明：本发明的β-葡萄糖苷酶同工酶BglA是一种新型的酶，这种酶不但耐高温，而且热稳定性优良，特别是在体外水解橙皮苷，将橙皮苷转化为苷元药物方面具有明显的作用。从而完成了本发明的工作。

本发明首先公开了橙皮苷的提取及BglA蛋白体外水解橙皮苷的方法：

橙皮苷提取自陈皮，采用超声提取方法。4g陈皮被粉碎为粒径大小为1mm粉末，200ml甲醇溶解，40℃，60mHz超声60min，重复一次。将甲醇超声提取液过滤后蒸发干燥，残留物溶解于含5％(v/v)丙二醇的水中，终浓度为10mg/ml。所得溶液用0.1ml，0.01M草酸酸化，HPLC定量。然后将本研究克隆S.singularis的bglA基因，将之与表达载体pQE30-Xa相连接组成重组质粒pQE-30Xa-bglA，并成功在E.coli中表达。

本实验前期在microRNA水平体外研究发现橙皮苷可以抑制JSRV引起的人支气管上皮细胞中致瘤性microRNA-17-92基因高表达，是一种可用于干扰人BAC发生的候选化学预防肿瘤药物。但是研究发现橙皮苷体内生物利用度不高，且人群中由于能够特异性水解不同苷类化合物的肠道菌群个体差异导致人群苷类化合物生物利用度个体差异，进而导致药效差异，影响了橙皮苷在体内发挥生物活性。

考虑到我国古老的中药炮制方法能够提高中国传统中药陈皮的药效，因此为探讨陈皮经发酵炮制药效提高的机制，摸索提高橙皮苷生物利用度的生物转化方法，本研究选择了ATCC标准菌株Sporobolomyces singularis，从中提取其产生的BglA蛋白，并在E.coli中表达其β-葡萄糖苷酶同工酶bglA基因。继而本发明使用提取于S.singularis和表达于E.coli的β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白体外生物转化橙皮苷提取物，通过观察橙皮苷经生物转化后，大鼠血浆内总橙皮素药代动力学变化，来观察β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白生物转化作用对橙皮苷生物利用度的影响。

本发明的选用pQE30-Xa载体，除具有pQE载体的一些基本特征，如优化的启动子-操纵元模式，包括来自噬菌体的T5启动子(由大肠杆菌的RNA聚合酶识别)和两个乳糖操纵子识别序列；合成的核糖体结合位点RBS II，保证高效的翻译；有多个终止密码子，无论目的片段从多克隆位点的哪里插入都可以正确的终止；两个强而有力的转录终止子：来自λ噬菌体的t0和来自大肠杆菌rrnB操纵元的T1，可以有效预防转录中的通读现象并保证表达质粒的稳定性；所有质粒含有β-内酰胺酶(bla)基因；ColE1复制起点等特点外，还在其N末端加入6×组氨酸标签，对于比较难表达的蛋白以及蛋白太小容易被降解的蛋白可以利用这种标签。它可以保证蛋白的稳定性，同时不会对外源蛋白的免疫原性造成很大的影响；同时，此载体在6×组氨酸和外源蛋白之间含有一个Xa因子蛋白酶识别位点，Xa因子可以从识别位点的精氨酸后准确将外源蛋白分离而不带有任何载体加入的氨基酸。

本发明的β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白所具有的积极效果在于：

(1)利用β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白对陈皮进行生物转化可提高陈皮的主要活性成分橙皮苷的生物利用度。相比较于橙皮苷提取物对照组，经β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用组血浆总橙皮素浓度明显增高，达到最大血药浓度的时间T_max明显缩短。从而本研究建立了一种提高苷类化合物生物利用度，进而提高其药效的新方法。

(2)初步探讨了陈皮经炮制药效增加的机制，即生物利用度低的橙皮苷可被β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用转化为橙皮素。

(3)提取自S.singularis菌株的BglA蛋白和表达自E.coli菌株的BglA蛋白均具有β-葡萄糖苷酶同工酶活性，体外可将橙皮苷水解为其苷元橙皮素。

(4)首次在一个实验室中同时进行橙皮苷和橙皮素的口服给药和静脉给药两种给药方式的药代动力学平行对比实验。发现橙皮素比橙皮苷易于吸收且清除较慢，从而补充了橙皮苷生物利用度低于其苷元的原因。首次说明苷体内血浆快速清除率和目前已知的苷具有低水溶性、在肠上皮细胞上的低透过性或/和肠上皮细胞对其的外排作用一样，都与苷类化合物低生物利用度有关联。

附图说明

图1为pQE30-Xa载体图；

图2HPLC代表性图谱，其中(A)橙皮苷标准品(tR＝20.38min)和橙皮素标准品(tR＝10.77min)图谱；(B)空白大鼠血浆图谱；(C)大鼠血浆中0.02μmol/L橙皮素和0.02μmol/L橙皮苷图谱；

图3bglA基因RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；

图4pQE30-Xa-bglA酶切结果图；

图5BglA蛋白SDS-PAGE电泳图；其中1：细菌细胞提取物；2：分子量标准；3：BglA蛋白；

图6橙皮苷被BglA蛋白和β-葡萄糖苷酶体外生物转化图；

图7单次静脉给药后大鼠体内总橙皮素药代动力学变化。大鼠被随机分为5组，每只大鼠静脉注射相当于31μmol/kg橙皮苷。血浆样本使用β-葡萄糖醛酸酶水解，血浆内药物水平以血浆总橙皮素表示。每一数值以

表示；

图8单次口服给药后大鼠血浆总橙皮素药代动力学变化。大鼠被随机分为5组，每只大鼠口服相当于31μmol/kg橙皮苷。血浆样本使用β-葡萄糖醛酸酶水解，血浆内药物水平以血浆总橙皮素表示。每一数值以

图9橙皮苷和橙皮素肠道内代谢途径，包括橙皮苷体外被BglA蛋白水解及体内被肠道细菌水解、橙皮苷和橙皮素的转运途径，以及两者体内代谢途径。

具体实施方式：

为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细节影响对本技术方案的描述。以下结合实例对本发明做进一步的说明。

实施例1

1.材料

1.1试剂

橙皮素标准品                         Sigma

β-葡萄糖苷酶                        Sigma

PNP-Glc                              Sigma

M-MLV逆转录酶                        Invitrogen

BamH I内切酶                         TaKaRa

Hind III内切酶                       TaKaRa

10×K buffer                         TaKaRa

2×Ligation Master Mix               Qiagen

Amp                                  上海生工

小型质粒提取试剂盒                   Invitrogen

凝胶回收试剂盒                       Invitrogen

IPTG                                 Sigma

SDS                                  Sigma

蛋白分子量ladder                     MBI

Usukizyme                            日本Kyowa

考马氏亮蓝G250                       Amresco

YWG-C₁₈(4.6×150mm，5μm)            SHIMADZU

蛋白胨                               上海生工

酵母提取物                           上海生工

麦芽提取物                           上海源聚生物科技有限公司

琼脂粉                               上海生工

其他相关试剂均为分析纯或HPLC级

1.2菌株

1.2.1S.Singularis

购自ATCC(American Type Culture Collection)，菌株号24193，接种于YM培养基，24℃生化培养箱培养。

1.2.2E.coli TOP10

基因型为F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)

80lacZΔM15ΔlacX74nupG recA1araD139Δ(ara-leu)7697galE15galK16rpsL(Str^R)endA1λ^-，购自Invitrogen公司。

1.2.3E.coli M15(pREP4)

基因型为Nal^sStr^sRif^s Thi^-lac^-Ara⁺Gal⁺Mtl^-F^-RecA^-Uvr⁺Lon⁺，购自Qiagen公司

1.3pQE30-Xa载体

购自Qiagen公司，其酶切位点如图1所示。

1.4动物

6周龄雄性Wistar大鼠(180～220g)25只，购自北京实验动物中心，许可证号SCXK-Military-2002，饲养于室温(23±2℃)，实验前适应性饲养1w。

1.5培养基

1.5.1YM培养基

1L蒸馏水中含有酵母提取物3g，麦芽提取物3g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂20g，pH 5.0。高压灭菌备用。

1.5.2LB液体培养基

1L蒸馏水中含有蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl 10g，用10N NaOH调节pH值至7.0，高压灭菌备用。

1.5.3LB固体培养基

1L LB液体培养基中加入琼脂粉15g溶解，高压灭菌备用。

1.5.4含Amp LB培养基

经灭菌后呈液态的LB培养基冷至50℃时，加入Amp至终浓度为50μg/ml。

1.6常用溶液及配制：

1.6.11M IPTG，200mg IPTG溶于1ml去离子水中，过滤除菌分装，-20℃保存。

1.6.21M CaCl₂储存液，200ml纯水中溶解54g，用0.22μm的除菌滤器过滤，每10ml分装保存于-20℃；100mM的工作液：将储存液用4℃预冷的无菌纯水稀释至100mM。1.6.310％SDS，在90ml水中溶解10g电泳级的SDS，加热至68℃助溶，调pH至7.2，加水定容至1L。

1.6.412％SDS-PAGE分离胶，纯净水1.6ml，30％聚丙烯酰胺2.0ml，1.5M Tris·Cl(pH 8.8))1.3ml，10％SDS 0.05ml，10％过硫酸铵0.05ml，TEMED 0.002ml。

1.6.5考马斯亮蓝蛋白定量染液，将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95％乙醇中，加入100ml磷酸，然后加水定容至1L，滤纸过滤，4℃保存。

1.7主要仪器：

超声波仪            KQ-100A中国昆明

HPLC仪LC-6          日本岛津

2.方法

2.1橙皮苷提取

橙皮苷提取自陈皮，采用超声提取方法。4g陈皮被粉碎为粒径大小为0.5～1mm粉末，200ml甲醇溶解，40℃60mHz超声60min，重复一次。将甲醇超声提取液过滤后蒸发干燥，残留物溶解于含5％(v/v)丙二醇的水中，终浓度为10mg/ml。所得溶液用0.1ml 0.01M草酸酸化，HPLC定量。

2.2从S.Singularis中提取BglA蛋白

收集处于对数生长中期的S.Singularis细胞，离心(2,000×g，5min)。使用50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)冲洗沉淀两次后，使用50mM柠檬酸磷酸盐缓冲液(pH 4.0)溶解沉淀，37℃下使用1％(w/v)Usukizyme作用2h。可溶性产物与上清液混合均匀得粗提物。

2.3.克隆、表达bglA基因

2.3.1总RNA提取及RT-PCR

(1)当S.Singularis生长到对数生长期(OD₆₆₀＝2×10⁸cells/ml)时，使用50mM磷酸柠檬酸缓冲液冲洗细胞。在150μl冲洗液加入500μl Trizol，震荡混匀30s，冰上放置5min。(2)加入氯仿(0.2ml氯仿/ml Trizol)，剧烈震荡15s，冰上放置10min。(3)4℃12,000rpm离心15min，取上清移至新管。(4)加入异丙醇(0.5ml异丙醇/mlTrizol)，混匀震荡，冰上放置10min。(5)4℃12,000rpm离心15min，弃上清。(6)75％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀，垂直震荡，4℃12,000rpm离心5min。重复一次。(7)弃上清，室温干燥沉淀，DEPC水溶解RNA。-70℃保存。

(8)RT：冰浴中加入

总RNA                5.0μl

Oligo(dT)₁₈          1.0μl

混匀离心3-5s，70℃5min，冰浴1min，离心3-5s。继续加入：

dNTP(10mM)                2.5μl

5×RT buffer              4.0μl

RNase inhibitor(40U/ml)   0.5μl

M-MLV(10U/μl)            2.0μl

37℃1h，70℃15min，所得cDNA分装，-20℃保存。

(9)PCR反应体系

利用GeneBank中已公布的S.Singularis bglA基因序列(GI：62533244)，用Gene Runner软件设计引物。引物由Invitrogen公司合成。引物序列如下：

上游引物：5′-CGC GGATCCATGATGCTGCATGCGGCAC-3′(序列表3)

下游引物：5′-CCCAAGCTT TCAGAGGTGGTTGCGACC-3′(序列表4)

PCR反应体系：

模板cDNA                4μl

10×Ex Taq buffer       5μl

dNTP                    1μl

上游引物                1μl

上游引物                1μl

Ex Taq                  0.5μl

ddH₂O                   37.5μl

总体积                  50μl

经优化后的PCR循环参数为：94℃2min，94℃30s，58℃30s，72℃2min 30个循环，72℃延伸5min。琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶检测仪检测结果。PCR产物用TaKaRa琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收、定量、分装，-20℃保存。

2.3.2重组载体的构建及鉴定：

(1)酶切：BamH I 1μl，Hind III I 1μl，共用10×K buffer 1μl，DNA片段5μl(或质粒4μl)，ddH₂O 2μl(或3μl)，总体系为10μl。混匀，离心3～5s，37℃酶切2h。回收酶切产物，2％琼脂糖凝胶电泳定量。

(2)连接：质粒1μl，DNA片段4μl，2×Ligation MasterMix 5μl，总体系10μl。混匀，16℃连接过夜。

(3)重组载体转化E.coli TOP10感受态细胞：①将10μl连接产物加入50μl感受态细胞中，混匀，冰浴30min。②42℃热休克30s，立即置冰浴中。③加入500μl 37℃预温LB液体培养基，37℃200rpm振摇培养1h。④取适量上述转化菌液涂布于37℃预温含Amp LB平板，37℃培养过夜。

(4)重组载体的筛选和鉴定：①PCR鉴定。挑取含Amp LB平板上单菌落接种于含Amp LB液体培养基中，37℃200rpm振摇培养过夜。按试剂盒说明书用小型质粒提取试剂盒从菌液中提取质粒。以提取的质粒DNA为模板，用前述引物进行PCR扩增，扩增条件与参数同前，琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶检测仪检测结果。②酶切鉴定，酶切反应体系如表2所示。③测序鉴定，将PCR鉴定和酶切鉴定正确的重组质粒由北京赛博基因有限公司测序鉴定，鉴定正确的质粒命名为pQE30-Xa-bglA。

表2重组质粒pQE30-Xa-bglA酶切反应体系(单位：μl)

混匀，离心3-5s，37℃酶切过夜，2％琼脂糖凝胶电泳分析结果。

2.3.3重组载体表达

将构建正确的重组表达质粒pQE30-Xa-BglA转化E.coli M15(pREP4)，操作步骤同上。将培养过夜的阳性克隆菌液，按1∶100接种4ml Amp抗性LB，37℃摇床培养至OD值处于0.6～0.8之间。加入终浓度为0.4mM IPTG，37℃振摇培养3h。取菌液1ml，12,000×g 30s收集沉淀，加入100μl 1×SDS加样缓冲液重悬，同蛋白Marker一起70℃10min，离心12,000×g 1min，取上清，Bio-Safe考马氏亮蓝G250染色，12％SDS-PAGE凝胶电泳分析结果。

2.4BglA蛋白的β-葡萄糖苷酶活性检测

使用对硝基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNP-β-Glc)作为底物，孵育混合物(总体积＝1ml)包含1.5mM PNP-β-Glc，50mM磷酸缓冲液(pH6.0)以及0.1ml BglA蛋白真菌提取物或E.coli表达纯化产物。37℃孵育4h后，加入4ml 0.25M Na₂CO₃终止反应。420nm波长下测量吸光度。

2.5体外BglA蛋白水解橙皮苷实验

分别从S.Singularis和E.coli中提取BglA蛋白，检测出其酶活性后，进行体外BglA蛋白水解橙皮苷实验。每一酶反应体系(1ml体积)包含0.5μM橙皮苷、50mM柠檬酸磷酸缓冲液(pH6.0)以及相当于0.01mg酶活性的BglA蛋白。反应混合物在加入酶前先在40℃预孵育5min，在加入酶后再在40℃孵育30min，最后煮沸5min终止反应。同时设立相同反应条件下的两个对照，一为β-葡萄糖苷酶商品阳性对照，另一为橙皮苷空白对照。反应体系中的橙皮苷和橙皮素用HPLC方法定量。用于HPLC检测的标本先经3,000×g离心20min，取上清，再用500μl甲醇提取，提取所得的有机相被转移到微离心管中，真空干燥。干燥所得产物使用100μl甲醇再溶解并3,000×g离心10min，所得上清用于HPLC分析。每一实验重复三次。

2.6HPLC方法检测大鼠血浆标本中的橙皮苷和橙皮素。

2.6.1色谱条件：

使用YWG-C18(4.6×150mm，5μm)色谱柱，流动相为甲醇∶0.04M KH₂PO₄(两者体积比为40∶60，使用H₃PO₄调节pH到4.0)，进样量为20μl，柱温为30℃，流速为1ml/min，检测波长为283nm。

2.6.2血浆标本预处理：

取大鼠血浆标本50μl，用等量溶于0.1mM醋酸钠缓冲液(pH6.8)的β-葡萄糖醛酸酶H-5(500U/ml)37℃孵育90min，0.01M草酸100μl终止酶作用。向反应混合物中加入500μl甲醇涡旋混匀2min，3000×g离心10min，提取上清液体，真空干燥，100μl甲醇重悬、3,000×g离心10min，取上清进行HPLC检测。

2.6.3分析方法确证：

本研究代表性HPLC谱图如图2所示。配制一定浓度的橙皮苷和橙皮素标准品溶液，进样20μl，得图2(A)，显示橙皮苷的保留时间t_R＝20.38min，橙皮素的保留时间t_R＝10.77min，说明本研究所使用HPLC方法可完全区分橙皮苷和橙皮素；取大鼠空白血浆50μl，按照血浆样本预处理方法2.6.2操作，进样20μl，得色谱图2(B)；将一定浓度橙皮苷和橙皮素标准品溶液加入到空白血浆中，依照同法操作，得色谱图2(C)。结果表明，大鼠血浆中内源性物质不干扰本研究中使用的HPLC方法检测橙皮苷和橙皮素。

2.6.4标准曲线和线性范围：

分别取空白血浆50μl，加入橙皮苷标准品和橙皮素标准系列溶液50μl，配制成分别相当于橙皮苷和橙皮素血浆浓度为0.002，0.005，0.02，0.05，0.2，0.5和1μmol/L的样品，按上述方法进行操作，建立标准曲线。以待测物浓度为横坐标，待测物峰高度为纵坐标，用加权(W＝1/C²)最小二乘法进行回归计算，求得的直线回归方程即为橙皮苷和橙皮素的标准曲线。橙皮苷的标准曲线方程为y＝0.1676x-0.0092，r²＝0.998；橙皮素的标准曲线方程为y＝0.1083x-0.0065，r²＝0.998。则由本HPLC测量方法得到橙皮苷和橙皮素的线性范围分别为3.5～1000nmol/ml和1.5～1000nmol/ml。

2.6.5定量下限

用空白血浆分别配制浓度为3.5nmol/L的橙皮苷溶液和1.5nmol/L的橙皮素溶液，则分别相当于含橙皮苷血浆浓度为3.5nmol/L和含橙皮素血浆浓度为1.5nmol/L的样品。对此两样品进行5样本分析，并根据当日标准曲线计算每一样本测得浓度。则在此待测浓度下，橙皮苷和橙皮素的日内精密度(RSD)分别为13.4％和12.9％，准确度(RE)分别为16.5％和17.8％。结果表明本研究所使用的HPLC法测量橙皮苷和橙皮素的定量下限分别为3.5nmol/L和1.5nmol/L。

2.6.6方法精密度和准确度：

取空白血浆50μl，按“标准曲线和线性范围”项下方法制备橙皮素低、中、高浓度(0.005、0.05和0.8μmol/L)的质量控制样品，每一浓度进行5样本分析，连续测定3天，并与标准曲线同时进行，计算质量控制样品的测得浓度，将测得浓度与配制浓度比较计算得本研究HPLC测量方法的准确度和精密度，结果如表3所示。实验数据表明，橙皮素日内精密度均小于7％，日间精密度均小于11％，准确度在±4.2％之内，说明测定橙皮素的HPLC分析方法符合有关国际规范要求。

2.6.7提取回收率考察：

取空白血浆50μl，按“标准曲线和线性范围”项下方法制备橙皮素低、中、高浓度(0.005、0.05和0.8μmol/L)的质量控制样品，考察样品提取回收率。结果发现三种浓度下样品的回收率均＞95％。

表3检测大鼠血浆中橙皮素HPLC方法的精密度和准确度，(n＝5)

2.7橙皮苷大鼠体内药代动力学实验

2.7.1口服给药实验：

雄性Wistar大鼠(6周龄，180～220g)试验前一天禁食，试验前称重，按体重随机分组，每组5只，共分5组，即为橙皮苷提取物组、橙皮苷提取物经S.Singularis中提取BglA蛋白作用组、橙皮苷提取物组经表达于E.coli中BglA蛋白作用组和两个标准品对照组，即橙皮苷标准品组和橙皮素标准品组。给药剂量参照中国药典推荐的陈皮剂量，经换算，用于大鼠的剂量为橙皮苷18.9mg/kg，橙皮素9.4mg/kg。口服给药后取血时间分别为灌胃后0，0.5，1，2，3，4，6，8，10，12，14和24h。经颈静脉插管采集血液标本。血液标本采取后经10,000×g离心2min，在30min内收集血浆贮存于-20℃。HPLC检测前血浆标本的预处理如前2.6.2所述。

2.7.2静脉给药试验：

雄性Wistar大鼠(6周龄，180～220g)试验前一天禁食，试验前称重，按体重随机分为5组，每组5只。分组情况和给药剂量与口服给药组相同。药物经静脉给药前先经过滤，10,000×g离心2min，并经溶血性检测为非溶血性物质，再高压灭菌后静脉注射。取血时间分别为静脉注射后0，0.5，1，2，4，6，8，12和24h。经颈静脉插管采集血液标本。血液标本采取后经10,000×g离心2min，在30min内收集血浆贮存于-20℃。HPLC检测前血浆标本的预处理如前2.6.2所述。

2.8检测指标及统计学分析：

大鼠血浆总橙皮素检测结果药物动力学分析采用WinNonlin分析软件(Version 5.2Build 200701231637，Pharsight，CA)。药代动力学各参数计算采用非房室模型分析、线性插值法及标准方程方法，各个参数所采用的计算公式如下所示。分别计算每只大鼠的血药浓度曲线，使用spss 11.5进行参数多组比较的方差分析。

$t_{1/2}=\frac{0.693}{{\mathrm{\λ}}_n}$ 公式1

${\mathrm{AUC}}_{(0\→t)}=\underset{i=0}{\overset{n-1}{\mathrm{\Σ}}}\frac{t_{i+1}-t_i}{2}(C_i+C_{i+1})$ 公式2

$\mathrm{CL}=\frac{\mathrm{FD}}{{\mathrm{AUC}}_{\∞}}$ 公式3

$V=\frac{\mathrm{FD}}{{\mathrm{AUC}}_{\∞}{\mathrm{\λ}}_z}$ 公式4

公式5

结果

3.1重组质粒pQE30-Xa-bglA构建

3.1.1获得目的基因bglA基因

利用特异性引物，以S.Singularis总RNA逆转录的cDNA为模板，扩增bglA基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，可见1785bp片段，大小与预期结果相符，未发现非特异性扩增条带，如图3所示。

3.1.2重组质粒鉴定

3.1.2.1PCR鉴定

bglA基因扩增产物经双酶切、纯化回收后，插入载体pQE-30Xa，转化E.coli TOP10。经Amp平板筛选后，挑取菌落，摇菌，提取质粒，以质粒为模板进行PCR，琼脂糖凝胶电泳后可见1785bp的片段。

3.1.2.2酶切鉴定

重组质粒pQE30-Xa-bglA酶切结果如图4所示。可见单酶切的片段大小是空质粒和基因片段大小之和，而双酶切的两条带与空质粒和目的基因片段大小符合。说明重组质粒大小及插入方向是正确的。

3.1.2.3测序鉴定

测序结果表明bglA目的基因插入正确，符合pQE30-Xa载体的读码框架。

3.2重组质粒pQE30-Xa-bglA在E.coli中的表达

经转染bglA基因后，从E.coli M15(pREP4)细胞中提取的BglA蛋白SDS-PAGE分析结果如图5所示，电泳可见一大小为约为66Kda的明显条带。此条带的分子量大小与由bglA基因氨基酸序列推导出的分子量期望大小65.67KD十分符合。在没有转染bglA基因的E.coli M15(pREP4)细胞提取物中没有检测到此明显蛋白条带。

3.3BglA蛋白体外水解橙皮苷

橙皮苷体外被BglA蛋白水解结果如图6所示。橙皮苷空白对照组中未检测到橙皮素产生。从S.Singularis分离出的BglA蛋白和在E.coli M15(pREP4)中克隆表达的BglA蛋白均能将橙皮苷水解为橙皮素，而两种来源的BglA蛋白水解橙皮苷的情况与β-葡萄糖苷酶商品对照组之间的差别无统计学意义(P＞0.05)，说明β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白将橙皮苷由糖苷水解为苷元，而苷元比糖苷具有更强的活性。

3.4单次静脉给药后BglA蛋白生物转化橙皮苷对大鼠体内总橙皮素药代动力学的影响。

在既往橙皮苷药代动力学研究中发现，机体摄入的橙皮苷和橙皮素经吸收代谢后，人体血浆中主要活性代谢产物是橙皮素葡萄糖醛酸化合物，而其他类型的活性代谢产物，如橙皮素硫酸酯化合物及橙皮素葡萄糖醛酸硫酸酯化合物在血浆中仅少量存在。其他橙皮苷药代动力学相关研究也发现如在检测血浆药物浓度前，血浆标本不使用β-葡萄糖醛酸酶作用，则将不能在血浆标本中检测到游离橙皮苷或橙皮素，从而从另一方面说明橙皮苷摄入后在血浆中并非以原形或其苷元形式存在，而是以代谢化合物形式存在。因此根据这些文献报道以及目前尚无橙皮素葡萄糖醛酸化合物标准品商品出售的情况，本研究在HPLC检测前，也使用了β-葡萄糖醛酸酶作用各血浆标本以释放橙皮苷苷元(见本部分方法2.6.2)，并将β-葡萄糖醛酸酶水解产物命名为“总橙皮素”。

单次静脉给药后大鼠体内总橙皮素血药浓度-时间曲线分析结果如图7所示。

表4单次静脉给药后大鼠体内总橙皮素药代动力学参数(

n＝5)

a橙皮苷标准品和橙皮素标准品的AUC0bs之间的差别有统计学意义(P＜0.05)。

b橙皮苷提取物+BlgA蛋白组AUC0bs，Vz，CL和橙皮苷提取物对照组之间的差别有统计学意义(P＜0.05)。

橙皮苷标准品和橙皮素标准品组几个重要药代动力学参数结果如表4所示。可见静脉给药后，橙皮素标准品组AUC值(为61.5nmol·hr/ml)远远高于橙皮苷标准品组的AUC值(为30.1nmol·hr/ml)，可见其相对生物利用度约是橙皮苷标准品组的2倍。橙皮素标准品组血浆清除率(为0.56ml/hr)快于橙皮苷标准品组(为1.17ml/hr)，可见此两组血浆清除率差别趋势与此两组AUC值差别相一致。但是，橙皮素标准品组分布容积(为5.40ml)要比橙皮苷标准品组(为10.73ml)小得多。本研究除了以橙皮苷标准品和橙皮素标准品为研究对象，同时我们也给大鼠注射了经或不经β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用的橙皮苷提取物，而据本研究体外实验结果BglA蛋白能够将橙皮苷水解为橙皮素。单次静脉给药结果表明，橙皮苷提取物如不被β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用，而单独注射于大鼠时，大鼠血浆总橙皮素药代动力学变化与橙皮苷标准品的类似；而如被β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用，不管是使用从S.Singularis细胞中提取的还是表达于E.coli中BglA蛋白，大鼠血浆总橙皮素药代动力学变化都与橙皮素标准品的类似，如表4所示。

但是当将橙皮苷提取物对照组与橙皮苷标准品组相对比时，可见橙皮苷提取物对照组血浆总橙皮素的AUC更小、血浆清除率更快、分布容积更大，如表4所示。这一结果表明由于本研究所用橙皮苷提取于中药陈皮，则提取物内可能还含有其他植物性化合物，而这些植物性化合物会干扰橙皮苷体内代谢，从而影响到橙皮苷药代动力学各参数数值。

3.5单次口服给药后BglA蛋白生物转化橙皮苷对大鼠体内总橙皮素药代动力学的影响。

本研究不但观察了大鼠经静脉注射给予经或不经BglA蛋白生物转化作用的橙皮苷提取物的血浆总橙皮素药动学行为，而且观察了灌胃给予经或不经BglA蛋白生物转化作用的橙皮苷提取物的血浆总橙皮素药动学行为，并通过比较相同剂量两种给药途径后的药物动力学参数来计算大鼠给药后的绝对生物利用度，如表5所示。

本研究结果表明，各实验组橙皮苷和橙皮素均能被实验中大鼠吸收。橙皮素标准品组和两个经β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用的橙皮苷提取物组中，大鼠血浆总橙皮素达到最大血药浓度(C_max)的时间约在摄入后4h，明显短于橙皮苷标准品组和橙皮苷提取物对照组(T_max＝6h)，如图8和表5所示。在橙皮苷提取物对照组和橙皮苷标准品组中，药物口服2h后才可在大鼠血浆中检测到橙皮素，血浆总橙皮素在6h达到峰值，两组峰值分别为0.20μM和0.35μM；另一方面，在两个经β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用的橙皮苷提取物组中，大鼠血浆总橙皮素药代动力学变化与橙皮素标准品的相类似。当大鼠摄入橙皮素标准品或者经生物转化的橙皮苷提取物后，血浆总橙皮素在摄入后30min内即可被检测到，三组均在摄入后4h达到C_max(分别为0.82μM，0.74μM和0.95μM)，如表5所示。可见，此橙皮素标准品组和两个经β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用的橙皮苷提取物组的C_max和T_max水平相类似，认为BglA蛋白生物转化能够将橙皮苷水解为橙皮素。

另外，由于既往橙皮苷和橙皮素药代动力学方面的研究均是单独进行，所以本研究是首次在同一实验室中进行的橙皮苷和橙皮素口服给药及静脉给药两种给药方式的药代动力学平行对比实验。

综上可见，当静脉给药时，与β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用组相比，橙皮苷提取物对照组吸收较慢、AUC值减小约2倍；当灌胃给药时，橙皮素标准品组和橙皮苷标准品组之间的AUC值之间相差3倍，而经与不经β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用橙皮苷提取物组间AUC值之间的差别达到4倍多。灌胃给药结果与静脉给药结果相类似的是，由于橙皮苷提取物中可能还含有其他植物性化合物成分，这些植物性化合物会干扰橙皮苷体内吸收与代谢过程，因此橙皮苷提取物经口服给药的大鼠药代动力学结果与其标准品之间也存在很大不同。

表5单次口服给药后大鼠血浆总橙皮素药代动力学参数(

n＝5)

a橙皮苷标准品和橙皮素标准品的AUC0bs之间的差别有统计学意义(P＜0.05)。

b橙皮苷提取物+BlgA蛋白组AUC0bs，Vz，CL和橙皮苷提取物对照组之间的差别有统计学意义(P＜0.05)。

讨论

本发明结果亦显示此BglA蛋白具有β-葡萄糖苷酶活性，是β-葡萄糖苷酶同工酶，体外可将橙皮苷水解为橙皮素(图6)。迄今，已克隆表达出的真菌BglA蛋白均具有β-葡萄糖苷酶活性，其氨基酸序列分析结果表明这些真菌的BglA蛋白互相之间具有很高同源性，表现出的β-葡萄糖苷酶活性均属于糖基水解酶家族1的B亚科，而此亚科包含的酶均能够水解β-葡萄糖苷类。本研究克隆S.singularis的bglA基因，将之与表达载体pQE30-Xa相连接组成重组质粒pQE-30Xa-bglA，并成功在E.coli中表达。

本发明体外实验结果发现实验真菌菌株的β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白对橙皮苷具有水解作用，提取自S.singularis菌株和表达自E.coli菌株的BglA蛋白均可将橙皮苷水解为橙皮素(图6)；体内实验结果发现，大鼠通过口服或静脉给药方式摄入经β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用的橙皮苷提取物后，相比较于橙皮苷提取物对照组，大鼠体内血浆总橙皮素药代动力学有很大变化(图7和图8)，如血浆总橙皮素浓度明显增高，达到最大血药浓度的时间T_max明显缩短。同时发现，在两个经β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用的橙皮苷提取物组中，大鼠血浆总橙皮素的药代动力学与橙皮素标准品组的相类似，并明显高于橙皮苷标准品组(表4和表5)。因此，利用β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白对陈皮进行生物转化可提高陈皮中橙皮苷的生物利用度。

在本发明中，体外实验结果表明β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白具有将橙皮苷水解为其苷元的能力，体内实验结果表明橙皮苷提取物经β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白生物转化后，生物利用度提高。既往经Caco-2细胞模型、大鼠体内及人体体内药代动力学实验均发现橙皮素比橙皮苷吸收得快。因此结合体内外实验结果，本研究认为相比较于橙皮苷提取物对照组，BglA蛋白生物转化组橙皮苷生物利用度提高是由于在β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用下橙皮苷被转化为橙皮素。

本发明使用β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白生物转化陈皮中的主要活性成分橙皮苷，口服给药和静脉给药两种给药途径的药代动力学结果均表明此酶的生物转化作用提高了橙皮苷的生物利用度，因此本研究方法有助于将苷转化为苷元，消除苷类中药人群中应用个体差异，提高苷类中药生物利用度，进而提高苷类中药药效。

另一方面，由本研究结果，苷的最大血药浓度C_max相对较低，而T_max相对较长(图8)，可见橙皮苷的吸收差、排泄快，但是其半衰期较长(6h)。形成此长半衰期的原因首先是由于橙皮苷吸收相长于橙皮素吸收相(表5)。研究已知机体内只有回肠和结肠部富含能够分泌β-葡萄糖苷酶的细菌，所以摄入体内的大部分苷(即橙皮苷)需要进入回肠和结肠代谢后才能被吸收。在回肠和结肠部，苷被肠道细菌产生的β-葡萄糖苷酶水解为相应苷元而被吸收。正是由于苷在吸收前需要先经肠道细菌水解为相应苷，而只有在结肠和回肠部苷才会被逐步水解为大量苷元，所以苷摄入后出现相对较长的T_max，导致苷的吸收相延长。

橙皮苷体内代谢半衰期较长的另外一个原因是在体内，其苷元橙皮素在被肠道细胞吸收后要参与肠道再吸收和肝肠循环两个循环，本研究结果亦表明单次摄入橙皮苷时，血浆总橙皮素浓度在摄入后24h仍然保持在一定水平(图7和图8)。苷被摄入体内后，先被水解为其苷元，继而苷元被吸收入肠上皮细胞内。在肠上皮细胞内苷元在II相酶作用下被进一步代谢，发生结合反应形成代谢结合物，如经葡萄糖醛酸化反应生成橙皮素葡萄糖醛酸化合物和经硫酸酯化反应生成橙皮素硫酸酯化合物。这些代谢化合物生成后一部分被肠上皮细胞和肝细胞排泄出体外，而另一部分被重新外排到肠腔中，如图9所示。在回结肠部，这些代谢化合物可被肠道细菌产生的β-葡萄糖醛酸酶或/和硫酸酯酶水解而再次释放出苷元，水解释放出苷元可被重吸收入血液循环。

本研究认为相比较于橙皮苷提取物对照组，β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白作用组和橙皮素标准品组生物利用度提高的另一个原因是由于苷在体内的清除率(clearance，CL)较快。清除率是指单位时间从体内消除的含药血浆体积或单位时间从体内消除的药物表观分布容积。从研究结果可知，在口服给药和静脉注射给药这两种给药方式下观察，苷的CL均快于苷元(表4和表5)。由于本实验是首次在同一实验室中同时进行的橙皮苷及其苷元药代动力学实验，所以本实验结果首次说明橙皮苷(苷)在体内比橙皮素(其苷元)清除得快。目前研究认为造成苷生物利用度低的原因包括苷在肠道细胞上的低透过性、苷被细胞膜上的载体如多重耐药相关蛋白(Multidrug resistance-associated protein 2，MPR2)等的外排效应、以及当苷被消化成苷元而被吸收后的被进一步代谢过程’但尚未有关于苷的体内清除与苷生物利用度低之间关系的报道，因此本研究结果是对现有苷低生物利用度现象解释的补充。

综上所述，本发明是在同一个实验室中，同时进行橙皮苷及其苷元，同时进行静脉给药和口服给药的较全面的比较性研究。研究结果首次表明血浆快速清除率和目前已知的低透过性、低水溶性、或/和肠道外排作用类似，都与类黄酮苷类的生物利用度低有关。由于橙皮苷的苷元，橙皮素比其苷易于吸收、且清除较慢，从而苷元生物利用度高，因此遵循传统的发酵方法，使用真菌的BglA蛋白作用于陈皮，可使陈皮中橙皮素的含量增多，生物利用度提高，进而增强陈皮的生物活性。

在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。

序列表

<110>天津医科大学

<120>β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白及其用途

<160>4

<210>1

<211>1785bp

<212>DNA

<213>S.singularis bglA菌株

<400>1

atgatgctgc atgcggcact gctcgttgcg ctcccctgcg tggttcttgc tcgtcccgcc    60

ggtgcagtta cctaccccgg tgcgattcca cttagcttga ccagcaatta cgagacgccg    120

agtccgaccg ccatccccct ggagccgacc ccaacggcga ccggaaccgc cgaacttgat    180

gcgctctgga atttggtgga agcacagtac cctgttcaga cggcggctgt caccaccctg    240

gtgacggtgc ccgacgacta caagtttgaa gcagaccctc cttcctatgc tcttgctggc    300

tacgagacat cagaaattgc cggcttgaag ttcccgaagg ggttcaagtt tggcgtggcc    360

ggcgcggcta ttcaagtgga aggcgcagcg aaagcagagg gacgaggccc atccacttgg    420

gattacttgt gccaccatta cgcgtccaca cagtgcaaca actatgatcc tgacattacg    480

acgaaccatt actaccttta ccctcttgat ttcgcccggc tccagcatct aggcatcaac    540

acgtattcgt tttcaatctc ctggactcgt atataccctc tgggtgctgg ctacgttaac    600

gaagccggtt tggcgcatta cgacgcggta atccactcgg ccaagaagta cgggctggag    660

cctgtcggaa cagtatttca ctgggacacc cctctcagcc tcatgctcaa atatggcgcg    720

tggcaagata ccggcgacca gatcgttaaa gatttcgtca catacgccac caccgtcttc    780

aaacgatacg gtaatgaagt caagacctgg ttcacgttca atgagcctcg cgtgttctgt    840

tctcaaaaca gtggccttcc ctataacctc acgtatcctg agggaatcaa ctcaacttca    900

gccgtcttcc ggtgtactta taacgtcctg aaagcccatg gccacgcggt taaggtttac    960

cgggatctcg ttgccagcgg aaccattgct gctggagaga tcggcttcaa gtcggacgac    1020

aactacccaa tcccagcgcg gcccggaaac gcggacgacg aggaatccgc caaacgtcac    1080

gaagcgttcc gaatcggaat ctttgcccag ccagtttacg gaaacggcga ctatcctgat    1140

gtagtaaaag agaccgttgg cgacatgctg cccgccctga cggatgagga caagggctac    1200

atcaagggca gcggcgacat cttcgccatt gacggttacc ggaccgatat ctcgcatgcc    1260

gcactgaatg gaatcgcgaa ttgcatcaga aaccagtcgg accctaactg gcctgtttgc    1320

gaggaagggt ctgacccgtt cgcccacgta tacccgtctg gtttcgccat cggccagtcc    1380

gccgatccgc tgtcgtcatg gctcgtcaac tccgccccat ttattcgcga ccagctgaag    1440

ttcctcactc aaacgtaccc ggcaaaggga ggtatttact tcagcgagtt tgggtgggcc    1500

gaggatgcgg agtacgaccg ccagctgttg taccaaatca cctgggacgg tcttaggacc    1560

cagtatctca ctgactacct gtcccaactc ctgctcgccg tccataagga tgggattaat    1620

cttcgcggcg cgttaacctg gagtttcgtc gacaactggg aatggggact ggggatgcaa    1680

cagaaattcg gattccagtt tgtcaatcag tcggacccag atctcaccag gaccttcaaa    1740

ctctctgcgc acgcttacgc tcaatttggt cgcaaccacc tctga                    1785

<210>2

<211>594

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>CHAIN

<222>(1)..(594)

<400>2

Met Met Leu His Ala Ala Leu Leu Val Ala Leu Pro Cys Val Val Leu

1               5                   10                  15

Ala Arg Pro Ala Gly Ala Val Thr Tyr Pro Gly Ala Ile Pro Leu Ser

            20                  25                  30

Leu Thr Ser Asn Tyr Glu Thr Pro Ser Pro Thr Ala Ile Pro Leu Glu

        35                  40                  45

Pro Thr Pro Thr Ala Thr Gly Thr Ala Glu Leu Asp Ala Leu Trp Asn

    50                  55                  60

Leu Val Glu Ala Gln Tyr Pro Val Gln Thr Ala Ala Val Thr Thr Leu

65                  70                  75                  80

Val Thr Val Pro Asp Asp Tyr Lys Phe Glu Ala Asp Pro Pro Ser Tyr

                85                  90                  95

Ala Leu Ala Gly Tyr Glu Thr Ser Glu Ile Ala Gly Leu Lys Phe Pro

            100                 105                 110

Lys Gly Phe Lys Phe Gly Val Ala Gly Ala Ala Ile Gln Val Glu Gly

        115                 120                 125

Ala Ala Lys Ala Glu Gly Arg Gly Pro Ser Thr Trp Asp Tyr Leu Cys

    130                 135                 140

His His Tyr Ala Ser Thr Gln Cys Asn Asn Tyr Asp Pro Asp Ile Thr

145                 150                 155                 160

Thr Asn His Tyr Tyr Leu Tyr Pro Leu Asp Phe Ala Arg Leu Gln His

                165                 170                 175

Leu Gly Ile Asn Thr Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Trp Thr Arg Ile Tyr

            180                 185                 190

Pro Leu Gly Ala Gly Tyr Val Asn Glu Ala Gly Leu Ala His Tyr Asp

        195                 200                 205

Ala Val Ile His Ser Ala Lys Lys Tyr Gly Leu Glu Pro Val Gly Thr

    210                 215                 220

Val Phe His Trp Asp Thr Pro Leu Ser Leu Met Leu Lys Tyr Gly Ala

225                 230                 235                 240

Trp Gln Asp Thr Gly Asp Gln Ile Val Lys Asp Phe Val Thr Tyr Ala

                245                 250                 255

Thr Thr Val Phe Lys Arg Tyr Gly Asn Glu Val Lys Thr Trp Phe Thr

            260                 265                 270

Phe Asn Glu Pro Arg Val Phe Cys Ser Gln Asn Ser Gly Leu Pro Tyr

        275                 280                 285

Asn Leu Thr Tyr Pro Glu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Ala Val Phe Arg

    290                 295                 300

Cys Thr Tyr Asn Val Leu Lys Ala His Gly His Ala Val Lys Val Tyr

305                 310                 315                 320

Arg Asp Leu Val Ala Ser Gly Thr Ile Ala Ala Gly Glu Ile Gly Phe

                325                 330                 335

Lys Ser Asp Asp Asn Tyr Pro Ile Pro Ala Arg Pro Gly Asn Ala Asp

            340                 345                 350

Asp Glu Glu Ser Ala Lys Arg His Glu Ala Phe Arg Ile Gly Ile Phe

        355                 360                 365

Ala Gln Pro Val Tyr Gly Asn Gly Asp Tyr Pro Asp Val Val Lys Glu

    370                 375                 380

Thr Val Gly Asp Met Leu Pro Ala Leu Thr Asp Glu Asp Lys Gly Tyr

385                 390                 395                 400

Ile Lys Gly Ser Gly Asp Ile Phe Ala Ile Asp Gly Tyr Arg Thr Asp

                405                 410                 415

Ile Ser His Ala Ala Leu Asn Gly Ile Ala Asn Cys Ile Arg Asn Gln

            420                 425                 430

Ser Asp Pro Asn Trp Pro Val Cys Glu Glu Gly Ser Asp Pro Phe Ala

        435                 440                 445

His Val Tyr Pro Ser Gly Phe Ala Ile Gly Gln Ser Ala Asp Pro Leu

    450                 455                 460

Ser Ser Trp Leu Val Asn Ser Ala Pro Phe Ile Arg Asp Gln Leu Lys

465                 470                 475                 480

Phe Leu Thr Gln Thr Tyr Pro Ala Lys Gly Gly Ile Tyr Phe Ser Glu

                485                 490                 495

Phe Gly Trp Ala Glu Asp Ala Glu Tyr Asp Arg Gln Leu Leu Tyr Gln

            500                 505                 510

Ile Thr Trp Asp Gly Leu Arg Thr Gln Tyr Leu Thr Asp Tyr Leu Ser

        515                 520                 525

Gln Leu Leu Leu Ala Val His Lys Asp Gly Ile Asn Leu Arg Gly Ala

    530                 535                 540

Leu Thr Trp Ser Phe Val Asp Asn Trp Glu Trp Gly Leu Gly Met Gln

545                 550                 555                 560

Gln Lys Phe Gly Phe Gln Phe Val Asn Gln Ser Asp Pro Asp Leu Thr

                565                 570                 575

Arg Thr Phe Lys Leu Ser Ala His Ala Tyr Ala Gln Phe Gly Arg Asn

            580                 585                 590

His Leu

<210>3

<211>28bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cgcggatcca tgatgctgca tgcggcac    28

<210>4

<211>27bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cccaagcttt cagaggtggt tgcgacc     27

Claims (6)

1.一种编码β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶的基因，该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种编码β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶，它具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.一种重组表达质粒，它含有权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶编码基因。

4.权利要求3所述的重组表达质粒，所述重组质粒的载体为pQE30-Xa-bglA。

5.权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶基因在制备提高苷类化合物生物利用度药物方面的应用。

6.权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶基因在制备提高陈皮中橙皮苷的生物利用度药物方面的应用。

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