CN104937097B - β-己糖基转移酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及发现了β‑己糖基‑转移酶(BHT)的新型重组形式及其用于生产低聚半乳糖(GOS)或作为食品添加剂的用途。

Description

β-己糖基转移酶及其应用
相关申请的引用
本申请要求Bruno-Barcena等人于2012年12月7日提交的美国临时申请61/734,742的优先权，名称为“β-己糖基转移酶及其应用”，律师卷号为NS12009USV，其全部内容通过引用合并于此。
1.技术领域
本申请总体上涉及发现了β-己糖基-转移酶(BHT)的一种新型重组形式及其用于生产低聚半乳糖(GOS)的用途。
2.背景技术
2.1介绍
饮食、正常肠道微生物群和健康之间的复杂相互作用促使人们开发改善有益微生物在人体胃肠道中的选择性增殖的策略。由于其具有强大的抗病原菌和抗炎性质，因而益生菌是积极影响人类健康的微生物(27)(表1)。
表1.益生菌的健康益处
而且，多年的益生菌研究表明，肠道微生物群的选择性改性及其相关的生物化学活性能够通过选择性益生元来得到改善。Osborn DA,Sinn JK.益生元在婴儿中针对变应性疾病和食物超敏反应的预防进行了研究。Cochrane Database of SystematicReviews2007。益生元是具有双重功能的不易消化的低聚糖(NDO)。其一是其降低有害细菌的肠道定植效率，其二是其起到选择性底物的作用以促进生长并从而增加特定益生菌的数目。
另外，越来越多的研究已经显示出，当与益生元组合时，益生菌的效果最好。Mayer等人2003关于具有双歧杆菌的功能性食品的制造的研究。Acta Alimentaria 3227-39。这种组合形式的递送被称为合生元(synbiotic)。Gibson GR,Roberfroid MB.1995DietaryModulation of the Human Colonic Microbiota-Introducing the Concept ofPrebiotics.Journal of Nutrition 125:1401-12。
低聚半乳糖(GOS)被认为是益生元的优选选择之一，并且在胃肠道中GOS是耐酶降解的且通过小肠运送而不会被消化，但在大肠中GOS被发酵并且能够激活肠道双歧杆菌的生长例如嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和干酪乳酸杆菌(L.casei)，因而起到益生菌的作用(26,27,37)。
GOS是不易消化的低聚糖，由于其异头C原子(C1或C2)的构造体,使得其糖苷键避免被胃或小肠中的消化酶水解。在所有胎盘哺乳动物的乳汁中发现了游离低聚糖，其提供了在婴儿期中提供益生菌的天然实例。根据国际益生菌和益生素科学委员会(International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics，ISAPP)的最新定义，“膳食益生菌是使得胃肠道微生物群的组成和/或活性发生特定改变从而为宿主健康提供益处的选择性发酵的成分”(30)。人乳低聚糖(HMO)的组成非常复杂，这使得不太可能找到类似组合物的含低聚糖的可替代来源。母乳喂养的婴儿中改善的结肠健康归因于母乳中存在GOS(2)。事实上，添加了GOS的婴儿配方食品复制了人乳的双歧效应(bifidogenic effect)，其与结肠微生物群的代谢活性和细菌数目有关(6,21)。在非-乳低聚糖中GOS具有特殊的益处，因为其结构类似于HMO的核心分子(3)。然而，GOS浓度和组成随其产生时所施用的方法和酶而不同，这又会影响其益生菌效应和结肠益生菌菌株的增殖(29)。传统上，GOS是利用β-半乳糖苷酶由嗜维微生物生产的。嗜温β-半乳糖苷酶需要较高的乳糖初始浓度来驱动反应远离乳糖水解并朝向GOS合成。由于乳糖在高温下的可溶性更好，因此耐热的β-半乳糖苷酶显示出较高的初始速度并且利用增加的半衰期以达到半乳糖基转移反应(transgalactosylation reaction)的有利平衡(27，37)。然而，葡萄糖和/或半乳糖引起的竞争性抑制是仍然存在的另一个障碍，其可通过在反应中结合细胞而得到克服(16,20,25,27,35)。
担子菌类酵母独特掷孢酵母(formerly Bullera singularis)不能利用半乳糖来生长，而是由于其β-己糖基-转移酶(BHT,EC 3.2.1.21)活性在乳糖上繁殖。研究已经显示，BHT甚至是在低乳糖浓度和非常有限的乳糖水解条件下也具有半乳糖基转移活性。另外，该酶似乎不受到高于20％乳糖浓度的抑制，并且具有以接近最大理论值75％转化为GOS的潜力(1,9,10,28)。与β-半乳糖苷酶不同，来自独特掷抱酵母的BHT同时执行糖基-水解酶和β-己糖基-转移酶活性，将乳糖转化为GOS而没有细胞外半乳糖累积。在半乳糖基转移事件中需要两种分子的乳糖：一种分子被水解而第二种分子起到半乳糖受体的作用，产生三糖半乳糖基-乳糖(β-D-Gal(1-4)-β-D-Gal(1-4)-β-D-Glc)和残余葡萄糖。半乳糖基-乳糖能够起到新的半乳糖的受体的作用，以产生四糖半乳糖基半乳糖基-乳糖(β-D-Gal(1-4)-β-D-Gal(1-4)-β-D-Gal(1-4)-β-D-Glc)，并且对于四糖和随后的产物而言也是相似的。在独特掷孢酵母中累积的三糖、四糖和五糖已全体被命名为GOS(9,10)。
出于实际利益，重组分泌的BHT相对于天然酶能够具有若干优点，包括改进的大规模生产和纯化。目前，来自独特掷孢酵母的活性酶的纯化要求细胞裂解，之后还需要多个层析步骤(1,4,16)。之前尝试在大肠杆菌BL21中表达重组β-己糖基-转移酶已经得到了高水平的生产，但该酶是无活性的且不可溶的(16)。
3.发明内容
在特定的非限制性实施方式中，本发明提供了编码具有SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18或20中列出的氨基酸序列的重组β-己糖基-转移酶(rBHT)蛋白的分离的DNA。该编码重组β-己糖基-转移酶(rBHT)蛋白的分离的DNA可以具有SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17或19中列出的核酸序列。
本发明还提供了酶活性重组β-己糖基-转移酶(rBHT)蛋白，其中该蛋白具有SEQID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18或20中列出的氨基酸序列。该rBHT蛋白可以是膜结合的或可以是可溶性酶。
产生GOS的酶活性rBHT可以被半乳糖抑制或可以不被半乳糖抑制。
本发明还提供了用于在真核宿主细胞中生产酶活性重组β-己糖基-转移酶(rBHT)蛋白的方法，包括用在适合的启动子的控制下的质粒转化所述真核宿主细胞，其中该质粒含有编码rBHT蛋白的分离的DNA，所述rBHT蛋白具有SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18或20中列出的氨基酸序列。
在一些实施方式中，分离的DNA连接于编码信号肽的DNA。信号肽可以是啤酒酵母(S.cerevisiae)α-因子信号肽且适合的启动子可以是乙醇氧化酶启动子。
在一些实施方式中，酶活性rBHT蛋白在20℃具有约8U.mg-1的比活性。
真核宿主细胞可以是酵母细胞，例如毕赤酵母(Pichia.pastoris)。
本发明还提供了用于生产低聚半乳糖(GOS)的方法，包括在适合的条件下使乳糖与具有SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18或20中列出的氨基酸序列的酶活性重组β-己糖基-转移酶(rBHT)蛋白反应，以产生GOS。
该酶活性rBHT蛋白可以被固定在固体支持物上。该固体支持物可以位于分批或连续的搅拌罐式反应器、填充床反应器或超滤膜反应器中。或者，该酶活性rBHT蛋白可以在分批或连续的搅拌罐式反应器、填充床反应器或超滤膜反应器中直接使用。该方法可以进一步包括葡萄糖清除系统以避免竞争性葡萄糖抑制，如通常被认为安全的(GRAS)生物体。该葡萄糖清除系统可以与酶活性rBHT蛋白同时使用。
本发明还涉及包含具有SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18或20中列出的氨基酸序列的重组β-己糖基-转移酶(rBHT)蛋白的改良的含乳糖食品或食品副产物。含乳糖食品或食品副产物可以是乳制品或副产物，例如乳清。在一些实施方式中，食品或食品副产物为婴幼儿甜点、婴幼儿果汁、婴幼儿零食、婴幼儿酸奶饮品、能量饮料、健身饮用水或解渴饮品、冷冻含乳甜品、果味饮料(维生素/矿物质强化)、水果派馅料、水果制品、婴儿配方食品、婴儿代餐饮品、果酱、代餐饮品、乳品、乳基饮料、乳替代品、为乳品增加风味的糖浆、酸奶、或乳清。
4.附图说明
图1A-1C.在毕赤酵母中表达的纯化的rBHT的凝胶电泳。(1A)银染色的纯化的rBHT的SDS-PAGE：泳道1，0.5μg rBHT；泳道2，0.1μg rBHT。(1B)具有抗-rBHT抗血清的Western印迹分析。泳道M表示标志物蛋白的分子量(kDa)，其在图A的右侧示出。(1C)rBHT的酶谱。泳道1，在大肠杆菌BLR培养物中表达的纯化的rBHT-6XHIS；泳道2，来自未转化的甲醇诱导的GS115的肉汤培养基；泳道3，来自甲醇诱导的重组GS115/rBHT的肉汤培养基。通过由于X-GAL的酶切造成的蓝色沉淀的形成来表现活性。
图2A至2D.根据(2A)pH；(2B)20℃至80℃的温度；(2C)半乳糖(实心圆形)和葡萄糖(实心方形)浓度；(2D)在20℃至50℃的热稳定性的rBHT相对活性。每12小时取出样品并在20℃对活性进行分析。除了(A)使用磷酸钠(pH 5至11)或柠檬酸钠(pH 2至5)缓冲液之外，在含有1.3mM ONP-Glu的50mM磷酸钠(pH 5.0)中在20℃下进行酶活性分析。相对于在时间为零(100％)时获得的值计算酶活性。待测酶的初始浓度为0.2U.ml-1，在20℃(Km＝0.37mM和Vmax＝0.09mM.min-1)下进行分析。数据表示可靠性为±5％的两次实验的平均值。
图3.在5mM磷酸钠缓冲液中(pH 5.0)利用部分纯化的rBHT(0.5U.g-1乳糖)由乳糖(2％)合成半乳糖基-乳糖，在42℃下孵育。乳糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖基-乳糖的浓度以g.l-1表示。残余的未量化GOS物质作为折射率检测器的信号强度读数示出。数据表示可靠性为±5％的两次实验的平均值。
图4A至4B.在5mM磷酸钠缓冲液中(pH 5.0)利用毕赤酵母静止细胞(在0.5U.g-1乳糖条件下包藏膜结合rBHT)由乳糖(20％)合成低聚半乳糖，在42℃(4A)或30℃(4B)下孵育。乳糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖基-乳糖的浓度以g.l-1表示。残余的未量化GOS物质作为折射率检测器的信号强度读数示出。数据表示可靠性为±5％的两次实验的平均值。
图5.示出了在30℃下包括由本文中描述的rBHT产生的GOS(GOS NCSU)和两种可商购获得的酶Vivinal GOS和Oligomate 55NP(购自Yakalt Pharmaceuticals,Inc.)产生的GOS的糖和酶活性的比较。参见第6.3节中所述的程序。
图6A-6B.BHT的Kyte和Doolittle亲水性图。对预测的膜锚着点/信号序列的氨基酸序列进行扩增。跨膜区预测算法(www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)还预示BHT中对完整穿膜蛋白来说典型的一段疏水残基1-17，且SignalP算法(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预示着对于相同残基的可能的信号序列以及残基17和18之间和残基22和23的可能的剪切位点。在构造体1,2,3,4and 7中保留信号序列以起到天然膜锚着点的作用。
图7A至7C.BHT的序列分析。(7A)来自独特掷孢酵母的BHT多肽的图示，其是通过基于网络的SMART程序(http://smart.embl-heidelberg.de)来确定的。由实心方形表示的先导肽是通过SignalP程序确定的。由实心圆形表示的低组合复杂性的部分是通过SEG程序(http://mendel.imp.ac.at/METHODS/seg.server.html)来确定的。仅通过BLAST发现的中签物(hits)由甘油水解酶结构域表示。实心三角形表示通过NetNGlyc 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)确定的三个推定的N-糖基化位点的位置。(7B)通过RHYTHM跨膜预测方法计算的先导肽的图示。已对预测的膜锚着点序列的氨基酸序列进行扩增。膜接触氨基酸以大号黑体字表示，螺旋接触氨基酸以大号字体表示并加下划线。还示出了预测的胞质区和胞外区的位置。箭头指示可能的剪切位点。(7C)亲水性图。利用在九个氨基酸的窗口长度上计算亲水性的Kyte-Doolittle方法来产生该图。在X-轴下方示出了氨基酸的数目。Y-轴上的零将疏水性和亲水性氨基酸分离。
图8A至8D.每一重组毕赤酵母菌株分泌的蛋白的浓度。在点图的左侧(8A))和右侧(8D)分别示出了含有rBht和scFv13R4的重组菌株的图示。(8B)分泌rBHT-HIS的。(8C)分泌scFv13R4-HIS的。分泌蛋白的值被归一化用于OD600并且表示为平均值±SE。分析由以下的重组菌株分泌的蛋白：(8A和8B)第1行，GS115::αMF-rBht((23-594)-HIS；第2行，GS115::rBht-HIS；第3行，GS115::rBht(23-594)-HIS；第4行，GS115::αMF-rBht-HIS。(8C和8D)第1行，GS115::αMF-scFv13R4-HIS；第2行，GS115::rBht(1-110)-scFv13R4-HIS；第3行，GS115::rBht(23-110)-scFv13R4-HIS；第4行，GS115::scFv13R4-HIS。
图9A至9C.显示出抗-His抗血清的SDS-PAGE(8％)分离和Western印迹，其显示出由不同毕赤酵母GS115重组体表达的分泌的、细胞相关的或纯化的rBHT-HIS。(9A)将通过所有重组体产生的蛋白无细胞提取物(分泌的蛋白)浓缩20倍。(9B)由在1X Laemmli缓冲液中用玻璃珠破坏的五个OD600重组细胞获得的细胞相关的蛋白。泳道1，GS115::αMF-rBht-HIS；泳道2，GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS；泳道3，GS115::rBht-HIS；泳道4，GS115::rBht(23-594)-HIS；和泳道5，GS115对照。(9C)由利用镍亲和层析纯化并溶解于SDS-PAGE(8％)的GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS表达的rBHT-HIS的银染色。M表示标志物泳道。在图的左侧示出了标志物蛋白的分子量(kDa)。
图10A至10B.利用可溶性rBHT或含有膜结合rBHT(0.5U rBHT.g-1乳糖)的毕赤酵母静止细胞进行半乳糖基-乳糖合成的时程。(10A)通过由GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS表达的分泌的rBHT-HIS(实线)和由GS115::αMF-rBht(23-594)表达的rBHT(虚线)的合成。(10B)通过静止细胞GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS(实心方形)和GS115::αMF-rBht(23-594)(空心方形)合成半乳糖基-乳糖的速率。在30℃孵育在5mM磷酸钠缓冲液(pH 5.0)中含有200g.L-1乳糖和纯化的酶或毕赤酵母静止细胞的测试。周期性取出样品并通过HPLC进行分析。乳糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖基-乳糖的浓度以g.L-1表示。残余的未量化GOS物质表示为折射率检测器的信号强度读数。数据代表两次独立实验的平均值。
5.具体实施方式
本发明报告了用于表达独特掷孢酵母BHT的若干种方法，包括，但不限于，利用在毕赤酵母中表达的密码子最优化的、在毕赤酵母中表达的合成的rBht基因(GenBank登录号JF29828)的方法。我们研究了通过分泌的重组β-己糖基-转移酶(rBHT)由乳糖产生GOS的动力学，并与包藏膜结合rBHT的毕赤酵母静止细胞进行了比较。
“rBHT蛋白”在本文中是指包括全长rBHT蛋白以及其片段和/或变体，其奥阔由天然存在的rBHT基因的等位基因变体编码的蛋白，以及重组产生的rBHT蛋白，相对于天然存在的rBHT蛋白其可以含有一些序列变化。
“重组体”蛋白是由基因工程技术产生的蛋白。术语“基因工程”是指用于产生细胞的重组DNA或核酸方法，该细胞以升高的水平或降低的惠普表达基因，或表达基因的突变体形式。换言之，已用重组多核苷酸分子对细胞进行转染、转化或转导，并从而使细胞发生改变以使得细胞对于期望多肽的表达发生改变。
“低聚半乳糖”或“GOS”意指具有两个或更多个糖单元例如Gal-Gal或
[Gal]n-Glc(1≤n≤8)的含半乳糖的多糖，包括
β-D-Gal(1→4)-β-D-Gal(1→4)-β-D-Glc、
β-D-Gal(1→4)-β-D-Gal(1→4)-β-D-Gal(1→4)-β-D-Glc和
β-D-Gal(1→4)-β-D-Gal(1→4)-β-D-Gal(1→4)-β-D-Gal(1→4)-β-D-Glc。
5.1信号序列
可溶性分泌的蛋白和在细胞表面上表达的蛋白通常包含N-端“信号序列”，其是在真核细胞中介导蛋白穿过膜结合内质网(ER)的插入的疏水序列。1型跨膜蛋白还包含信号序列。“信号序列”在本文中意指氨基端疏水序列。其通常酶除去以下部分或全部蛋白的插入穿过ER膜进入到ER腔中。因此，本领域中已知信号序列能够作为分泌的跨膜蛋白的前体形式的部分存在，但通常会缺少该蛋白的突变体形式。当提到蛋白包含信号序列时，应该理解，尽管该蛋白的前体形式不含有信号序列，但该蛋白的突变体形式有可能不含有该信号序列。信号序列可以含有邻近于且位于剪切位点(位置-1)上游的残基和位于位置-3的其他残基，其对于这种酶促剪切而言是很重要的。Nielsen等人1997Protein Eng 10(l)l-6；vonHeijne 1983Eur J Biochem 133(1)7-21；von Heijne 1985J Mol Biol 18499-105，将描述了信号序列和如何鉴定它们的部分结合于此作为参考。能够通过Nielsen等人(同上)的描述来鉴定信号序列。在哺乳动物宿主细胞中具有功能性的信号肽或序列的实例包括以下：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)pre-pro-α-交配因子信号序列；US专利4,965,195中描述的白介素-7(IL-7)的信号序列：Cosman等人1984Nature 312768-771描述的白介素-2受体的信号序列；EP专利0367566中描述的白介素-4受体信号肽；US专利4,968,607中描述的1型白介素-1受体信号序列；EP专利0460846中描述的II型白介素-1受体信号肽。许多其他的信号序列是本领域已知的。
5.2 rBHT蛋白
本发明包括分泌的、可溶性形式的rBHT，以及能够在细胞表面上表达的包含跨膜结构域的形式。这样的蛋白能够被分离，即，作为纯化蛋白制备的一部分，其中rBHT蛋白构成制备过程中存在的蛋白的至少80％或至少90％。本发明进一步包括由以下所述的rBHT核酸编码的rBHT蛋白。如本文中所述的，rBHT蛋白包括包含SEQ ID NO.2、4、6,8、10、12、14、16、18或20及其片段、衍生物和变体的蛋白的氨基酸序列，包括，融合蛋白。SEQ ID NO.2、4、6,8、10、12、14、16、18或20的氨基酸序列包括信号序列。
5.3保守置换
在一些实施方式中，置换可以是保守氨基酸置换。不太可能影响氨基酸活性的保守氨基酸置换的实例包括如下置换：用丙氨酸置换丝氨酸、用缬氨酸置换异亮氨酸、用天冬氨酸盐/酯置换谷氨酸盐/酯、用苏氨酸置换丝氨酸、用丙氨酸置换甘氨酸、用丙氨酸置换苏氨酸、用丝氨酸置换天门冬酰胺、用丙氨酸置换缬氨酸、用丝氨酸置换甘氨酸、用酪氨酸置换苯基丙氨酸、用丙氨酸置换脯氨酸、用赖氨酸置换精氨酸、用天冬氨酸盐/酯置换天门冬酰胺、用亮氨酸置换异亮氨酸、用亮氨酸置换缬氨酸、用丙氨酸置换谷氨酸盐/酯、用天冬氨酸盐/酯置换甘氨酸，以及用这些变化的反向置换。参见例如，Neurath等人，The proteins,Academic Press,New York(1979)，其相关部分结合于本文作为参考。此外，一个组中的一种氨基酸交换同组中另一种氨基酸为保守置换，分组如下：(1)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸和苯基丙氨酸；(2)组氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和天门冬酰胺；(3)天冬氨酸盐/酯和谷氨酸盐/酯；(4)丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸和半胱氨酸；和(5)甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸。
5.4糖基化
rBHT蛋白可被糖基化为不同程度或者不被谭计划。如所举例说明的，除了那些已经在含有SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18或20的蛋白中发现的之外，本发明的rBHT蛋白可以包含一个或多个N-或O-连接的糖基化位点。本领域技术人员知晓作为序列Asn XxxSer/Thr(其中Xxx为除脯氨酸之外的任意氨基酸)中的部分的天门冬酰胺残基能够起到用于加入N-聚糖的位点的作用。另外，存在许多可作为O-连接的糖基化位点的丝氨酸和苏氨酸残基。糖基化可增加体内半衰期或改变生物学活性。rBHT蛋白的变体也包括包含比SEQID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18或20中存在的多一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、或十个N-和/或O-连接的糖基化位点的蛋白，只要所得的蛋白能够起到糖基水解酶和β-己糖基-转移酶的作用即可。变体rBHT蛋白还包括那些具有比SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18或20中存在的少一个、两个、三个、四个、五个N-和/或O-连接的糖基化位点的蛋白，只要其能够起到糖基水解酶和β-己糖基-转移酶的作用即可。
如在本文中使用的，rBHT蛋白可以是包含至少一个rBHT多肽的融合蛋白，其能够包含SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18或20(如上文中解释的)和至少和一个其他部分的变体和/或片段的氨基酸序列。该其他部分也可以是非蛋白部分，例如聚乙二醇(PEG)部分或细胞毒性、细胞生长抑制、发光、和/或放射性的部分。附着PEG已示出使得至少一些蛋白的体内半衰期增加。而且，出于诊断和治疗目的，已将细胞毒性、细胞生长抑制、发光、和/或放射性的部分融合至抗体中。
出于各种目的，除rBHT之外的多种多肽能够被融合至rBHT多肽，例如为了增加蛋白的体内半衰期，为了有助于鉴定、分离和/或纯化蛋白，为了增加该蛋白的活性，以及为了促进蛋白的寡聚。
许多多肽能够有助于重组融合蛋白的鉴定和/或纯化，但这只是一部分。实例包括聚精氨酸、聚组氨酸或HATTM(Clontech)，其是对于固定的金属离子具有高亲和性的不相邻的组氨酸残基的天然存在的序列。包含这些多肽的rBHT蛋白能够例如利用固定的镍或TALONTM树脂(Clontech)通过亲和层析来纯化，其包含固定的钴tons。参见，例如Knol等人1996J Biol Chem 27(26)15358-15366。包含聚精氨酸的多肽使得能够通过离子交换色谱进行有效纯化。其他有用的多肽包括，例如，在U.S.专利5,011,912和Hopp等人1988Bio/Technology 61204中描述的抗原识别肽。一种这样的肽为FLAGTM肽，其具有高度抗原性并且提供通过特异性单克隆抗体可逆地结合的表位，其使得能够进行所表达的重组融合蛋白的快速测试和简易纯化。被称为4E11的鼠杂交瘤产生单克隆抗体，该单克隆抗体在某些二价金属阳离子存在下结合FLAG肽，如在U.S.专利5,011,912中所描述的。该4E11杂交瘤细胞系以登录号HB 9259保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)。结合FLAG肽的单克隆抗体能够被用作亲和试剂以回收包含FLAG肽的多肽纯化试剂。其他适合的蛋白质标签和亲和性试剂为：1)在GST-BindTM系统中(Novagen)描述的那些，其利用谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白对于固定的谷胱甘肽的亲和性；2)在亲和纯化试剂盒中描述的那些，其利用T7基因10蛋白的氨基端11氨基酸对于单克隆抗体亲和性；或3)在系统(Novagen)中描述的那些，其利用工程化形式的链霉亲和素对于蛋白质标签的亲和性。上述蛋白质标签中的一些，以及其他标签在Sassenfeld1990TIBTECH 8:88-93,Brewer等人，在Purification and Analysis of Recombinant Proteins中,第239-266页，Seetharam和Sharma(编著)，Marcel Dekker,Inc.(1991),以及Brewer和Sassenfeld,在Protein Purification Applications中，第91–111页，Harris和Angal(编著)，Press,Inc.,Oxford England(1990)中描述这些参考文献中描述了蛋白质标签的部分结合于本文作为参考。此外，上文所述的两个或更多个标签的融合，例如FLAG标签和具备组氨酸标签的融合能够被融合到本发明的rBHT蛋白中。
5.5 rBHT核酸
本发明包括分离的核酸，包括，例如DNAs和RNAs，其编码本文中所述的rBHT蛋白，包括包含SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18或20以及其片段和/或变体的氨基酸序列的蛋白。优选地，该蛋白具有SEQ ID NO.12或14的氨基酸序列。这些核酸可被用于产生具有糖基水解酶和β-己糖基-转移酶活性的重组蛋白，反之亦然。这样的核酸可以是改良的基因组DNA或cDNA。优选地，该核酸能够包含编码rBHT蛋白的不间断的开放阅读框。本发明的核酸分子包括二者均为单链和双链形式的DNA和RNA，以及相应的互补序列。“分离的核酸”是已经从存在于核酸从其分离的生物体基因组中的相邻基因序列分离出来的核酸，在核酸是从天然存在的来源分离的情况下，在核酸是化学合成的情况下，例如寡核苷酸，或从模板酶促合成的情况下，例如聚合酶链反应(PCR)产物或cDNAs，应该理解从这样的方法获得的核酸是分离的核酸。分离的核酸分子是指呈分离片段形式或者作为较大核酸构建体的组分的核酸分子。
本发明还包括包含序列SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19，或其片段的核酸或在中等严格条件下以及可选地高严格条件下杂交至包含核苷酸序列SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19的核酸的核酸，其是全长rBHT cDNA的核苷酸序列，其中该核酸编码能够起到糖基水解酶和β-己糖基-转移酶作用的蛋白。杂交技术是本领域中公知的并且被Sambrook,J.、E.F.Fritsch和T.Maniatis(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,第9章和第11章,1989)和Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人,eds.,JohnWiley&Sons,Inc.,第2.10节和第6.3-6.4节1995)所描述，其相关部分结合于本文作为参考。用于滤膜杂交的中等严格条件包括在大约50％甲酰胺、6x SSC中在约42℃至55℃的温度下进行杂交，并在约60℃在0.5x SSC,0.1％SDS中洗涤。高严格条件被定义为如上所述的杂交条件，但在大约68℃在0.2x SSC,0.1％SDS中洗涤。在杂交和洗涤缓冲液中SSPE(lxSSPE为0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.26mM EDTA,pH 7.4)可以代替SSC(l xSSC为0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠)；洗涤可选地至少两次洗涤在杂交后15分钟内完成。
应该理解，洗涤温度和洗涤液盐浓度能够随着达到所需程度的严格性的需要通过控制杂交反应和双向稳定性的基本原则来进行调整，如本领域技术人员已知的和下文中进一步描述的(参见例如Sambrook等人，同上)。当已知序列的核酸被杂交时，能够通过核酸序列的比对(例如，利用GAP)和识别最优序列互补性的一个或多个区域来确定该杂合体长度。预期长度小于50个碱基对的杂合体的杂交温度应比杂合体的熔融温度(Tm)低5℃至10℃，其中Tm是根据以下等式来确定的。对于长度小于18个碱基对的杂合体，Tm(℃)＝2(A+T碱基的#)+4(G+C碱基的#)。对于长度大于18个碱基对的杂合体，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600N)，其中N为该杂合体中的碱基数目，且[Na+]为杂交缓冲液中钠离子的浓度。每一这种杂交核酸的长度为至少15个核苷酸(或至少18个核苷酸，或至少20个，或至少25个，或至少30个，或至少40个，或至少50，或至少100个核苷酸。Sambrook等人，同上。
rBHT核酸包括包含以下多核苷酸的核酸：(1)SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19的全部的片段，其中该片段编码能够起到糖基水解酶和β-己糖基-转移酶作用的rBHT蛋白；(2)包括与SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，其中比对窗长度为至少100、125、150、175、200、225、250、300、400、500、600、800、1000或120个核苷酸，并且其中该序列编码能够起到糖基水解酶和β-己糖基-转移酶作用的rBHT蛋白；(3)相对于SEQ IDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19包含不超过1、2、3、4、6、8、10、15、20、25或30个单个核苷酸改变的多核苷酸，其中该改变可以是单个核苷酸的插入、缺失或替换，并且其中该多核苷酸编码能够起到糖基水解酶和β-己糖基-转移酶作用的rBHT蛋白；以及(4)编码本文中所述的rBHT蛋白的多核苷酸，包括rBHT蛋白的片段、衍生物和变体。在优选的实施方式中中，该rBHT蛋白是通过用异种分泌信号肽替代先导序列来制备的。
5.6制备rBHT蛋白的方法
rBHT蛋白能够如下制备。如本文中所述，能够将编码rBHT蛋白的核酸引入到载体中，该载体能够被引入到宿主细胞中。包含编码rBHT蛋白的载体和宿主细胞通过本发明被包括在内。含有编码rBHT蛋白的核酸的宿主细胞能够在使得该rBHT蛋白能够表达的条件下培养。然后能够从细胞在其中培养的培养基或细胞获得所表达的rBHT蛋白，并通过本领域已知的任何适当的方式进行纯化。另外，用于生产rBHT蛋白的基因工程方法包括根据已知的方法在无细胞表达系统中、在细胞宿主中、在组织中、以及在动物模型表达该多核苷酸分子。
为了在宿主中繁殖，载体能够包括可选择的标志物和复制的起点(原点，origin)。该载体能够进一步包括适合的转录或翻译调控序列，例如那些来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的序列，其可操作第连接于编码rBHT蛋白的核酸。这样的调控序列的实例包括转录启动子、操纵子或增强子，mRNA核糖体结合位点，以及控制转录和翻译的适合序列。当该调控序列功能上涉及编码靶蛋白的DNA时，核苷酸序列被可操作地连接。因此，如果启动子核苷酸序列指向编码rBHT蛋白的序列的转录，则启动子核苷酸序列被可操作地连接至rBHT核酸序列。如果rBHT蛋白为融合蛋白，则编码该融合蛋白的一部分的核酸序列，例如信号序列可以是载体的一部分，并且可将编码rBHT蛋白的核酸插入到载体中以使得包含该加入的信号系列加上rBHT蛋白的蛋白被该载体编码。
用于表达rBHT蛋白的适合的宿主细胞包括原核、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、和高级真核细胞。选择载体中的调控序列以使得其在宿主细胞中是可操作的。适合的原核宿主细胞包括埃希氏菌(Escherichia)、杆菌(Bacillus)、和沙门氏菌(Salmonella)的细菌，以及假单胞菌(Pseudomonas)、链霉菌(Streptomyces)和葡萄球菌(Staphylococcus)属的成员。为了在原核细胞(例如在大肠杆菌)中表达，编码rBHT蛋白的多核苷酸分子优选包括N-端甲硫氨酸残基以有助于重组多肽的表达。该N-端甲硫氨酸可以可选地从表达的多肽剪切。适合的酵母宿主细胞包括来自包括酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia)和克鲁维酵母(Kluveromyces)属的细胞。优选的酵母宿主为啤酒酵母和毕赤酵母。昆虫宿主中的适合的表达系统在例如Luckow和Summers的综述(1988BioTechnology 647-55)中描述，其相关部分结合于此作为参考。适合的哺乳动物宿主细胞包括猴肾细胞的COS-7细胞系(Gluzman等人1981Cell 23175-182)、幼仓鼠肾(BHK)细胞、中华仓鼠卵母(CHO)细胞(Puck等人1958PNAS USA 601275-1281)、CV-1(Fischer等人1970Int J Cancer 521-27)、来自人肾脏的细胞293(美国典型培养物保藏中心()分类号CRL-10852TM)和人宫颈癌细胞(HELA)(CCL 2)。涉及这一段相关内容的部分结合于本文作为参考。
用于细胞宿主的表达载体通常包含一种或多种表型可选择的标志物基因。这样的基因编码，例如，赋予抗生素抗性或提供营养缺陷型要求的蛋白。大量的这样的载体可以容易地商购获得。实例包括pGEM载体(Promega)、pSPORT载体和pPROEX载体(InVitrogen,LifeTechnologies,Carlsbad,CA)、Bluescript载体(Stratagene)和pQE载体(Qiagen)。酵母载体通常含有来自酵母质粒的复制序列的起点、自主复制序列(ARS)、启动子区、用于多腺苷酸化的序列、用于转录终止的序列以及可选择的标志物基因。也可以使用在酵母和大肠杆菌中均可复制的载体载体(被称作穿梭载体)。除了酵母载体的上述特征之外，穿梭载体还包括用于在大肠杆菌中进行复制和选择的序列。在酵母宿主中表达的靶标多肽的直接分泌可通过在编码rBHT-的核苷酸序列的5’包括编码酵母a-因子先导序列的核苷酸序列来实线。Brake 1989Biotechnology 13269-280。
用于在哺乳动物宿主中使用的适合的表达载体包括pcD A3.1/Hygro(Invitrogen)、pDC409(McMahan等人1991EMBO J 10:2821-2832)、和pSVL(PharmaciaBiotech)。用于在哺乳动物宿主中使用的表达载体可以包括来自病毒基因组的转录和翻译控制序列。
能够用于表达rBHT RNA的常用的启动子序列和增强子序列可以包括，但不限于，来自于人巨细胞病毒(CMV)的那些。Adenovirus 2,Polyomavirus,and Simian virus 40(SV40)。例如在Okayama和Berg(1982Mol Cell Biol 2:161-170)、Cosman等人(1986MolImmunol 23:935-941)、Cosman等人(1984Nature 312:768-771)、EP-A-0367566和WO 91/18982中披露了用于构建哺乳动物表达载体的方法。这些文献的相关部分结合于本文作为参考。
5.7纯化标签
除了本文中描述的6XHIS标签之外，大量的纯化方法可以使用，例如亲和性标签，例如抗原标(例如，FLAG(Sigma-Aldrich,Hopp等人1988Nat Biotech6:1204–1210)、红细胞凝集素(HA)(Wilson等人,1984Cell 37:767)、内含肽融合表达系统(New EnglandBiolabs,USA)Chong等人1997Gene 192(2),271-281,或麦芽糖结合蛋白(MBP))、谷胱甘肽S转移酶(GST)/谷胱甘肽、聚His/Ni或Co(Gentz等人,1989PNAS USA 86:821-824)。在U.S.专利No.5,654,176(Smith)中也描述了在蛋白的N-末端含有GST-标签的融合蛋白。也可以使用磁力分离技术，例如(Life Technologies,USA)。可替代地，可以使用可光剪切的接头(photo-cleavable linkers)，例如U.S.专利No.7,595,198(Olejnik&Rothchild)。许多其他系统是本领域已知的并且适合与本发明一起使用。
5.8制备低聚半乳糖(GOS)的方法
在本发明的一种实施方式中，低聚半乳糖(GOS)是通过在包含二糖底物(例如乳糖或纤维二糖)的培养基中孵育表达rBHT的细胞来生产的。在一种实施方式中，GOS是由同时具有葡萄糖清除系统的乳糖生产的。该葡萄糖清除系统可以是通常认为安全的(GRAS)生物体。
5.9配方
本发明的另一个方面设计利用rBHT蛋白或表达rBHT的细胞来生产含有低聚半乳糖(GOS)的食品或膳食补充剂。该食品可以是乳类食品，例如酸奶、奶酪或发酵乳制品。可将rBHT或表达rBHT的细胞部分加入到食品或膳食补充剂中。可利用喷雾干燥；获得甚至最少量的粉末形式的温度敏感性物质快速和一般方法来干燥rBHT。也可以利用喷雾干燥机以涂覆颗粒、将固体材料固定在基质中并制造微囊以使经干燥的rBHT形成包封的形式(www.buchi.com/Mini_Spray_Dryer_B-290.179.0.html)。也可以使用利用功能性GRAS包封剂和技术的其他药物递送应用。一旦其在含有乳糖的缓冲液中和在乳制品中再水化，可以对经干燥的rBHT片和粉末形式进行rBHT活性速率的分析。
食品的实例包括，但不限于，婴儿配方食品、乳制品、饮料和膳食补充剂。参见下表2。
表2.
上述rBHT蛋白中的任一种可以组合物的方式递送，即，具有一种或多种另外的组分，例如生理学上可接受的运载体，赋形剂或稀释剂。例如，组合物可以包含如本文中所述的可溶性rBHT蛋白加上缓冲剂，抗氧剂例如抗坏血酸，低分子量多肽(例如那些小于10个氨基酸的肽)，蛋白质，氨基酸，碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖或糊精，螯合剂例如EDTA，谷胱甘肽，和/或其他稳定剂、赋形剂和/或防腐剂。该组合物可以被配制成液体或冻干粉。在药物配方中可以采用的组分的其他实例记载于Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.,(1980)，其相关部分结合于本文作为参考。
包含上述治疗分子的组合物能够通过任何适合的方式基于，包括但不限于，肠胃外、局部,、口服、经鼻、经阴道、经直肠或经肺(通过吸入)给药。如果注射的话，该组合物可通过推注或连续滴注进行关节内、静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内或皮下给药。局部给药，即，在疾病位置处给药作为经皮递送和从移植物、皮肤贴片或栓剂持续释放是经过仔细考虑的。通过吸入给药包括，例如经鼻或口服吸入、使用喷雾器、以气溶胶形式吸入，等等。经由栓剂插入到体腔内可以通过例如将固体形式的组合物插入到所选择的体腔内并使其溶解来完成。其他替代方式包括滴眼液、口服制剂如烷基、锭剂、糖浆剂、口香糖和局部制剂例如乳液、凝胶、喷雾和软膏剂。在大多数情况下，多肽治疗分子能够局部给药或通过注射或吸入给药。
上文所述的治疗分子能够以能够有效治疗待治疗疾病的任意剂量、频率和期间给药。该剂量取决于治疗分子的分子性质和待治疗病症的性质。治疗可以持续只要有必要达到所需结果几何。治疗的周期性可以与整个治疗期间一致或可不与整个治疗期间一致。例如，治疗可以最初以一周为间隔开始并且之后可以每隔一周进行。本发明中包括为期数天、数周、数月或数年的治疗周期。事了可以被中断，然后重新开始。
维持剂量可以在初始治疗之后给予。可以毫克/千克体重(mg/kg)或毫克/平方米皮肤表面(mg/m2)或作为固定剂量(与身高或体重无关)来衡量剂量。这些是本领域的标准剂量单位。人的皮肤表面积是由其身高和体重利用标准公式计算得到的。例如，治疗性rBHT蛋白可以约0.05mg kg至约10mg/kg或from约0.1mg/kg至约1.0mg/kg的剂量给药。可替代地，可以给予约1mg至约500mg的剂量，或可以给予约5mg、10mg、15mg 20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45、mg、50mg、55mg、60mg、100mg、200mg或300mg的剂量。
冠词“一个”和“一种”在本文中用于指一种或多于一种(即，至少一种)该冠词的语法修饰对象。举例而言，“元素”意指一种或多种元素。
在说明书全文中，词语“包含”或其变体“包括”或“含有”将被理解为暗示包括所述的元素、整数或步骤，或者元素、整数或步骤的组，但不排除其他的远足、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组。本发明可以适合低“包含”权利要求中所述的步骤、元素和/或试剂，“由其组成”或“基本由其组成”。
以下的实施例进一步说明了本发明，而并不是意在限制本发明的范围。
6.实施例
6.1材料和方法
密码子优化的β-己糖基-转移酶基因的设计。利用Clone Manager软件(Cary,NC)通过连接外显子来组装针对独特掷孢酵母β-己糖基-转移酶基因(16)(GenBank登录号AB126324；1,782bp)的DNA编码序列。基于毕赤酵母和大肠杆菌优选的密码子重新设计该编码序列，最优化最小自由能(-619.9)、特异性限制位点(5’NcoI和3’NotI)、和GC含量(48.89％)。将这种重新设计的基因版本加标签rBht(GenBank登录号JF29828)，合成并插入到pGS21a和pUC57中以分别产生pJB100和pJB107(表1)。验证rBht的DNA序列(GenScript,Piscataway,NJ)。
含有在大肠杆菌中表达的rBht的质粒的构造体。如前所述进行克隆程序(32)。标3中列出了用于克隆和rBht表达的大肠杆菌菌株。限制性内切酶和T4DNA连接酶获自NewEngland Biolabs(Beverly,MA)。用NcoI和NotI消化质粒pJB100和pJB107，并将含有rBht基因的片段插入到Novagen质粒中以产生表达质粒pJB101、pJB103、pJB104、pJB105和pJB106(参见表3，关于该构造体的描述)。
rBHT融合构造体在大肠杆菌BLR中的表达。该表达是如在pET系统手册TB055第8版，02/99(Novagen)中所述进行的。简言之，该表达质粒被转化到大肠杆菌BLR中，并且之后针对rBHT活性筛选IPTG诱导。通过在50mM磷酸钠缓冲液(pH 4和pH 6)以及50μg.ml-1细胞穿透显色底物X-GAL(表4)中孵育IPTG诱导的BLR细胞来评价体内rBHT活性。在37℃将培养物孵育过夜以用于使颜色显现可视化。利用含有内源性β-半乳糖苷酶活性的BL21细胞作为阳性对照。
抗-rBHT的产生。利用表达并纯化自包藏有pJB101的大肠杆菌BLR细胞的rBHT-6XHIS来生产抗-rBHT抗血清。存在于无细胞提取物流分中的rBHT-6XHIS的纯化是根据制造商的说明(QIAGEN,Germany)通过利用镍琼脂糖凝胶色谱进行的，并且然后根据制造商的说明(Bio-Rad,Richmond,CA)通过电洗脱从凝胶进一步纯化。纯的蛋白被用于兔免疫(Cocalico Biologics Reamstown,PA)。标4中列出联德本研究中使用的另外的抗体。
电泳和免疫印迹。在Laemmli系统中常规进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE-4-12％)(23)。通过考马斯蓝(Bio-Rad,Richmond,CA)或银染色(Bio-Rad,Richmond,CA)使蛋白可视化。SeeBlue plus(Invitrogen,Carlsbad,CA)被用作分子量标志物。除了利用缀合了碱性磷酸酶的山羊抗兔或山羊抗小鼠抗体(RocklandImmunochemicals,Gilbertsville,PA)进行检测以及利用NBT(氯化硝基四氮唑蓝)和BCIP(5-溴-4-氯-3'-吲哚基磷酸盐对甲苯胺盐)预混溶液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)进行可视化之外，如之前所述在复制PAGE凝胶上进行免疫印迹分析(7)。
毕赤酵母重组菌株的构造体。利用利用引物JBB1和JBB2从pJB107通过PCR扩增rBht基因，从而在包含在pPIC9中的酿酒酵母pre-pro-α-交配因子信号序列的框架中中加入限制性位点，之后通过6XHIS标签，和改良的TEV蛋白酶切位点进行扩增(表2)。将PCR产物结合到pPIC9XhoI和NotI限制性位点中以产生pJB108(表3)。利用引物5’AOX1和3’AOX1(表4)通过测序(Sequatech,Mountain View,CA)来更正框内连接(in-frame ligation)。
利用Bio-Rad Gene Pulser(Bio-Rad,Richmond,CA)，以用SacI(Invitrogen的毕赤酵母表达试剂盒手册，M版本)线性化的pJB108来电转化毕赤酵母GS115(表1)。在30℃下在组氨酸缺陷的葡萄糖再生培养基(RDB-琼脂板)上选择重组体。随机选择His+菌落，利用引物5’AOX1、3’AOX1和α-因子(表4)通过PCR来验证表达盒的基因组整合。根据Invitrogen的毕赤酵母表达试剂盒手册版本M中指出的程序确定重组GS115/rBht的甲醇利用(mut+)表型。
在毕赤酵母生产rBHT。为了选择重组rBHT的高水平生产基因(producer)，在30℃和250rpm条件下使六种His+分离物在酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基(YPD)中生长12小时，然后将其用于接种100ml缓冲甘油复合培养基(BMGY)至初始OD600＝0.1。当培养物超过OD600＝10时，以24小时的间隔加入甲醇至最终浓度为0.5％直至培养物超过OD600＝50，之后每12小时加入甲醇。针对BHT活性的存在，每24小时利用兔抗-rBHT通过Western印迹对培养基样品进行分析，以确定最佳收获时间。所选择的GS115/rBht重组体在0.5L BMGY中常规生长并且用甲醇诱导6天。
分泌的rBHT的纯化。用硫酸铵对培养物上清(500ml)进行分馏。将60％-80％硫酸铵之间的沉淀物重悬于50mM磷酸钠缓冲液(pH 6)中。在用Amicon MWCO15膜(Amicon Inc.,Beverly,MA)，将溶液上样至1/30(5ml)Mono Q预平衡柱(四氨基乙酯)(AmershamBiosciences)。然后用50ml的缓冲液洗涤柱，并用3倍柱体积的50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)中的0至0.2M氯化钠溶液以1ml.min-1的流速线性梯度洗脱。以1ml的部分收集洗脱液。收集活性流分，浓缩并重悬于10mM磷酸钠(pH 6.8)中，然后上样至用相同的缓冲液预平衡的Bio-Gel HT羟基磷灰石柱(Bio-Rad,Richmond,CA)(1/102ml)，用10mM磷酸钠(pH 6.8)洗涤，并用50mM磷酸钠(pH 6.8)洗脱。具有最高比活性的流分含有纯的rBHT，其具有的比活性为8.2U.mg-1。在所有的色谱流分上分析酶活性(如下文所述)并在25℃进行纯化步骤。
分子量的确定。将通过超滤(0.5ml)浓缩20倍的培养物培养基上样至用50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)、0.1M NaCl预平衡的尺寸排阻柱Superdex 200(AmershamBiosciences)1/30(18ml)。以0.5ml.min-1的流速收集0.5ml的流分并且如下文所述利用ONP-Glu作为底物并通过酶谱来分析rBHT活性。在280nm处理监测rBHT和分子量标准物的洗脱。利用以下的分子来校准柱：甲状腺球蛋白，669kDa；铁蛋白，440kDa；过氧化氢酶(Catalase)，232kDa；乳酸脱氢酶，140kDa；牛血清白蛋白，67kDa(GE,Healthcare)。从log分子量(Y轴)对洗脱体积(X轴)的校准曲线推算rBHT的分子量。所有的层析步骤在25℃进行。
酶活性测试。在既定条件下通过改进的Kuby's方法(13,22)测量rBHT的初始反应速率。简言之，反应在以250μl的含有1.3mM ONP-Glu和50mM磷酸钠缓冲液(pH 5)的一体积进行。在既定条件下进行该测试10分钟，并通过加入1体积的0.25M Na2CO3中止反应。含有煮沸的rBHT和底物的反应混合物作为阴性对照。测试总是以±5％的可靠性平行进行两次。如上文所述获得无细胞肉汤培养基和蛋白提取物的样品。在既定条件下，对用50mM磷酸钠缓冲液(pH 5.0)预洗涤的静止细胞(包藏膜结合的rBHT)进行测定。当X-GAL为反应的底物时，在50mM磷酸钠缓冲液(pH 4)中的浓度为浓度50μg.ml-1。
以单位(U)的酶活性等于在测定条件下每分钟释放的1μmol o-硝基酚。比活性被定义为单位/mg蛋白。o-硝基酚的摩尔消光系数为：ε＝0.033mM-1cm-1,pH 4；ε＝0.036mM- 1cm-1,pH 5；ε＝0.038mM-1cm-1,pH 6。在405nm(Y轴)对o-硝基酚浓度(X轴)处从o-硝基酚吸光率的校准曲线推算所释放的o-硝基酚的量。
还通过酶谱来使酶活性可视化。利用Gallagher描述的改进的实验方案来进行Native PAGE(8)。将来自大肠杆菌裂解液或毕赤酵母上清的蛋白溶解于5％(w/v)蔗糖/10μg.ml-1溴酚蓝并利用作为电泳缓冲液的50mM磷酸钠缓冲液(pH 6)在6％天然聚丙烯酰胺凝胶中分离。使该凝胶在Mighty Small Hoefer电泳装置中保持低温，其中在电泳过程中冷水在60mA下再循环5小时。电泳之后，用洗涤缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液，pH 4.0)冲洗该凝胶两次，持续10分钟。通过在20℃铺放浸泡在含有50μg.ml-1X-GAL的洗涤缓冲液中的滤纸获得酶谱。蓝色沉淀定义了酶的位置。
酶动力学。在42℃在50mM磷酸钠(pH 5)中对0至1.2U.ml-1的系列稀释的酶稀释液进行测定。通过添加1.3mM ONP-Glu启动酶活性测定并以1分钟的间隔在405nm处监测吸光率总共持续20分钟。以实验吸光率值对时间作图，显示出在至少20分钟内高达0.6U.ml-1的线性比例，同时高于1.0U.ml-1的吸光率值的酶浓度在5分钟之前进入平台期。
0.2U.ml-1rBHT(42℃)的米氏常数(Michaelis-Menten constant)(km和Vmax)通过在50mM磷酸钠(pH 5)中使ONP-Glu从0变化至10.4mM并在20℃、30℃、40℃和50℃测量初始反应来确定。用OriginPro 7.5利用Hill等式(Hill系数为1)的非线性回归来确定在每一温度下的动力学常数。在既定条件下获得的数值如下(T,km,Vmax)：(20℃,0.37mM,0.09mM.min-1)、(30℃,0.48mM,0.12mM.min-1)、(40℃,0.71mM,0.23mM.min-1)和(50℃,1.3mM,0.42mM.min-1)。在20℃、30℃、40℃和50℃时回归的拟合系数(R2)分别为0.9869、0.99065、0.99115和0.98996。
rBHT的表征。在上文所述的既定条件下进行酶活性测定测定。在包括50mM磷酸钠(pH 5.0至11.0)、50mM柠檬酸盐(pH 2.0至5.0)和50mM磷酸盐-柠檬酸盐(pH 2至11)的缓冲溶液中测试pH对酶活性的影响(图2A)。通过改变其在反应混合物中的浓度来检测单糖(葡萄糖和半乳糖)引起的竞争性抑制(图2C)。通过在20、30、40、50、60、70或80℃测量残余活性来确定温度和热稳定性(图2B和图2D)。类似地，酶活性测定被用于评价作为潜在抑制剂/活化剂的添加剂。对高达10mM的以下添加剂进行了测试：螯合剂(EDTA)、还原剂(二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(2-ME)、和铜(Cu2+))、和铁(一价阳离子；NH4+、Cs+、K+、Na+、Li+、和Rb+；二价阳离子；Ba2+、Ca2+、Co2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Ni2+、和Zn2+；三价阳离子Ag3+)。重金属(Co2+、Fe2+、和Zn2+)在50mM柠檬酸缓冲液(pH 5.0)中进行测试以避免沉淀。另外，向反应混合物中加入的1％(v/v)表面活性剂为：TritonX-100、Tween 20、Tween 80和十二烷基硫酸钠(SDS)。以10％v/v测试的溶剂包括：乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、PEG400和甘油。
GOS生产和分析。通过在30℃或42℃加入含有乳糖(22gL-1或200gL-1)的5mM磷酸钠缓冲液(pH 5.0)中的标准量的酶(0.5Ug-1乳糖)利用纯化的rBHT或毕赤酵母静止细胞(包藏膜结合的酶)来启动标准半乳糖基转移反应。
在65℃下在洗脱条件下以0.4ml.min-1的流速通过高效液相色谱(HPLC)(ShimadzuCorporation,东京,日本)来分析反应的产物和底物。流动相为5mM硫酸(H2SO4)，利用结合于折射率检测器的Alltech IOA-1000有机酸柱(300mm×7.8mm)(Alltech,IL)。利用半乳糖基-乳糖(Carbosynth(Berkshire,UK))、乳糖、葡萄糖和半乳糖(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)对该柱进行校准。残余的未量化GOS物质(四糖和五糖)被报告为来自折射率检测器的信号强度读数。
6.2结果
重组β-己糖基-转移酶(rBHT)在大肠杆菌中的表达。大肠杆菌BL21是用于异种蛋白生产的最广泛使用的宿主。遗憾的是，该宿主菌株含有干扰β-己糖基-转移酶的评价的活性内源性β-半乳糖苷酶，其被称作rBHT(参见材料和方法部分)。在筛选适合于包括BL21、BLR、NovaBlue、Origami和Rosetta(表3)的pET-系列表达系统的不同大肠杆菌菌株之后，大肠杆菌BLR被证实缺少内源性β-半乳糖苷酶活性。大肠杆菌CC118(ΔlacZ)菌株被用作对照(36)。
将rBht基因插入到含有C-端6XHIS或四种稳定性增强的共表达伴侣(谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白(Trx)、PelB leader和DsbA)之一的pET表达质粒中，得到pJB101、pJB103、pJB104、pJB105和pJB106(表3)。转化到大肠杆菌BLR中并用IPTG诱导导致未活化的rBHT在整个细胞中或在无细胞提取物中表达。具有rBHT-抗血清的融合蛋白的免疫印迹分析以其预测分子量检测所有的rBHT融合蛋白，在不可溶流分中观察到最强的反应性。为了排除可能的宿主依赖性蛋白不可溶性，在包藏pJB102(具有用四环素(TET)可诱导的启动子代替T7启动子的pJB101)的大肠杆菌CC118中对rBHT表达进行分析，但也被证明无法取得成功(数据未示出)。
来自毕赤酵母的rBHT的表达和纯化。毕赤酵母能够被引入到翻译后修饰并且其能够产生大量的活化重组蛋白(而大肠杆菌则不能)是公知的(14)。因此，在醇氧化酶启动子(AOX1)的控制下，我们将密码子优化的rBht基因插入到pPIC9中，其在框架区中具有啤酒酵母α-因子信号(蛋白分泌的序列)和N-端6XHIS之后是TEV蛋白酶切位点(pJB108,表3)。用pJB108(GS115/rBht)转化毕赤酵母GS115并在六个GS115/rBht重组体中评价rBHT的活性。对分泌最高浓度的生物活性蛋白的重组菌株进行进一步研究。酶谱证实了存在活性rBHT：仅GS115/rBht给出了阳性信号，而来自BLR包藏pJB101的大肠杆菌的细胞提取物和来自未转化的GS115的培养物上清为阴性(图1C)。如所期望的，BHT中的蛋白跨膜区也会导致GS115/rBht细胞显示出细胞表面相关的rBHT活性，与独特掷孢酵母中天然BHT的位置相类似(15,16)。
利用镍亲和层析尝试进行rBHT的纯化，但不存在HIS-标签，也不利用抗-HIS抗血清通过Western印迹分析来检测蛋白，其表示在预测的剪切位点处可能具有N-端信号序列(16)。随后，利用Mono Q和羟磷灰石色谱纯化rBHT酶(在20℃比活性为8.2U.mg-1)(表5)。
6.3在毕赤酵母中表达的rBHT的表征。
1. rBHT的表观分子量。包括6XHIS和TEV蛋白酶位点标签的未糖基化的完全加工的rBHT的估计的分子量为68kDa。该酶之前已作为表观分子量范围为53至146kDa的二聚体和单体被纯化，该数据反映了蛋白糖基化中的变化(表5)(1,16)。此处，作为单峰洗脱的酶活性具有的表观分子量为110kDa。我们推测在酸性范围的天然酶的pH最适宜条件(3.7至6)中二聚体形式是主要的(表5)。然而，来自Superdex 200柱(pH 4.0)的流分显示出相同的情况，这证实了重组酶的稳定单体形式。通过酶活性测定、酶谱或Western印迹没有检测到更高分子量的聚集体。利用抗-rBHT进行柱流分的纯化和免疫印迹分析，其验证了酶作为表观分子量为110kDa的单个条带迁移(图1A和图1B)。
2.底物特异性。ONP-Gal通常被用作β-半乳糖苷酶的底物，并且ONP-Gal、PNP-Gal和PNP-Glu均已被用于之前用于检测天然BHT活性的研究中(表5)。在相同的实验条件下在上述底物之间比较rBHT的酶活性(0.2U.ml-1)。重组酶在响应于ONP-Glu和PNP-Glu时具有相等的活性。二醇部分中的具有半乳糖的底物部分以大约41％(ONP-Gal)和23％(PNP-Gal)的ONP-Glu的速率被水解。这些结果表明，当使用葡萄糖作为底物时，rBHT对于糖具有较窄的特异性，而对于C2和C4的碳键位置的构造体具有较大的灵活性。
3. rBHT的最佳pH、温度和热稳定性。rBHT在较宽的pH范围内(pH 3.5至6)有活性，在pH 4.0处显示出最高值(图2A)。在pH值大于7或小于3.5时，酶活性分布显示出陡降至低于50％最大酶活性。这些结果与所报道pH最佳条件(1)是一致的(参见表5的参考文献)；这暗示了碱性条件对于酶活性和稳定性具有决定性影响。
在20℃至80℃的不同温度范围测量的初始反应速率表明，酶在20℃至50℃的温度范围内是有活性的，在40℃至50℃之间是最佳的(图2B)。在低于30℃的温度下观察到50％的初始反应速率下降，而在50℃时酶会快速且不可逆地失活。使酶反应速率最大的最佳温度也可以从Vmax/Km的最高值获得(33)。在20℃至40℃的温度下，Vmax以比Km更快的速率增加，因而Vmax/Km值(0.242min-1,20℃；0.255min-1,30℃；0.324min-1,40℃；0.322min-1,50℃)在该范围内增加并且在40℃至50℃的温度范围内保持恒定。因此，通过Vmax/Km确定的最佳温度在40℃-50℃的范围内，这证实了在每一温度下利用初始反应速率值确定的最佳值。
如图2D中所示，rBHT的热稳定性从20℃升高至50℃。在20℃至30℃，酶在6天内保留至少90％的原始活性，这证实了之前关于天然酶所报道的结果(4)。在4℃下储存6个月的五个独立批次的rBHT保留95％的初始活性(数据未示出)。尽管发现了最佳温度范围为40℃至50℃，但在高于40℃的温度下孵育对rBHT是有害的。在40℃下，酶在前12小时保留70％的初始活性且这种水平的活性仅能够再持续36小时。相对而言，在50℃下，酶活性在最初12小时的孵育期间快速下降。
4.金属、盐、表面活性剂和溶剂对rBHT活性的影响。在较宽范围的添加剂中对酶抑制/活化进行测试。rBHT并未表现出需要任何所测试的离子(NH4+、Ba2+、Ca2+、Cs+、Co2+、Cu2+、Li+、Rb+、Mg2+、Ni2+、Na+和Zn2+)，尽管镁能够显著增加一些β-半乳糖苷酶的酶活性(26)。而且，重组镁在存在1和5mM的离子螯合剂EDTA的条件下完全活化，这证实了上述发现和之前的报道(1)。另外，已被证实破坏二硫桥的混合物，例如Cu2+和还原剂二硫苏糖醇(DTT)和2-巯基乙醇(2ME)(1,18,19)对于活性没有负面结果。溶剂甲醇、乙醇、丙酮和乙腈仅部分抑制酶(保留66％-81％相对活性)。相对而言，添加10％甘油或1％的SDS(非离子表面活性剂)几乎完全抑制酶。
利用纯化的rBHT合成GOS。酶被表征后，针对2％乳糖向GOS的生物转化，对分泌的rBHT进行测试。反应条件为0.5U rBHT.g-1的乳糖在42℃在5mM磷酸钠缓冲液(pH 5.0)。图3示出了随时间的乳糖消耗和GOS累积。在最初的12小时观察到最高生产速率，且半乳糖基-乳糖和葡萄糖是主要产物。没有检测到半乳糖表明其完全被结合到半乳糖基转移反应中以形成GOS。在30小时后，累积了4.2g.L-1的葡萄糖并且乳糖利用(54％)达到最大。此外，在此时间点，已经累积了7.8g.L-1的三糖，所利用的乳糖达到平均67％的转化。随着反应进行，半乳糖开始逃脱酶反应并以痕量浓度累积。由于竞争性酶抑制能够降低乳糖生物转化的效率，因此我们检查了不同浓度的葡萄糖或半乳糖对反应混合物中酶活性的影响。在既定条件下，存在5g.L-1葡萄糖会使rBHT活性减少90％，而高达70g.L-1的半乳糖则对酶活性没有影响(图2C).
通过包藏膜结合rBHT的毕赤酵母静止细胞合成GOS。为了避免竞争性抑制并证实在从反应混合物同时除去葡萄糖时乳糖向GOS的转化能够得到改善，我们评价了毕赤酵母GS115/rBht的静止细胞的20％乳糖生物转化。包藏膜结合rBHT的毕赤酵母GS115/rBht被归一化为在5mM磷酸钠缓冲液(pH 5)中含有0.5U rBHT.g-1乳糖的细胞密度。反应在30℃、毕赤酵母生长的最佳温度和42℃下进行10天，初始反应速率的温度对于rBHT而言是其最大值。如所期望的，在30℃，90％的初始乳糖转化为GOS而没有次级产物，相比之下，在42℃，乳糖利用为51％。结果表明，静止细胞是生理学活性的并且能够消耗反应的葡萄糖副产品，从而避免竞争性抑制。然而，在最初48小时内，在42℃下GOS形成的初始反应速率为在30℃下的两倍。最终达到80g.L-1的半乳糖基-乳糖浓度，对应于在42℃生产率为1.6g.L-1.h-1(图4A)。在30℃，当乳糖利用为63％时，为半乳糖基-乳糖浓度为100g.L-1并且在5天后达到0.8g.L-1.h-1的生产率(图4B)。
6.4讨论
在本研究中，我们对来自在大肠杆菌和毕赤酵母中表达的独特掷孢酵母(登录号AB126324)的β-己糖基-转移酶基因的DNA序列进行了最优化。所得的rBht基因合成地产生(登录号JF29828)并且在大肠杆菌中表达。然而，这种细菌宿主不具备如之前所观察到的其对于产色号功能可溶性和活化的rBHT至关重要的结合翻译后修饰的能力(16)。随后，在AOX1启动子控制下的rBht基因被成功整合到毕赤酵母基因组中，导致在培养物肉汤中检测到的以及与细胞表面相关的完全活性酶的表达。毕赤酵母GS115分泌rBHT使得我们能够避免复杂的纯化过程，其需要从独特掷孢酵母获得纯的BHT。此外，由于毕赤酵母仅天然分泌非常低水平的天然蛋白，因此胞外rBHT的回收就像通过离心或过滤从培养基中除去整个细胞一样简单(5)。
检测了对应于单个110kDa催化活性多肽可无较小多肽或rBHT聚集体的重组酶的分子量。翻译后修饰在蛋白折叠、结构稳定性、低聚体形成和底物识别中起到起到关键作用(17,24)，因此分子量高于在大肠杆菌中表达的以及通过氨基酸序列预测的68kDa蛋白并不出人意料。之前已经报道过通过独特掷孢酵母进行的天然BHT的翻译后糖基化，以及在用几丁质酶和EndoHf处理后观察到经纯化的蛋白的分子量从73.9变化至66.3kDa(16)。预测的糖基化位点的进一步突变形成应该辅助确定糖基化是否也是导致rBHT分子量发生变化的原因。
本文中报告的数据是比较了rBHT应用与针对独特掷孢酵母BHT的文献记载数据的大量研究中的一部分(表5)。我们的研究证实了重组酶不需要对于β-半乳糖苷至关重要的共因子或还原剂。该酶在较低温度下(低于40℃)显示出更好的热稳定性，并且在40℃至50℃的温度和pH 3.5至6的条件下具有最佳活性。另外，该酶通过rBHT受到葡萄糖抑制的控制且如之前针对天然BHT所报道的对半乳糖或Ag3+不敏感(4,16,2535)。
乳糖利用和初始乳糖浓度是贡献使最终GOS累积最大化的两个重要因素。这里，我们证明了通过采用毕赤酵母GS115/rBht的生理学活性静止细胞改善了乳糖利用的过程(90％)。在这些条件下，细胞在30℃消耗残余葡萄糖，避免葡萄糖抑制并确保显著工艺改建和较高程度的最终益生菌纯度(图4B)。相对而言，报道了高于25℃的温度会阻止含有没结合天然BHT的独特掷孢酵母静止细胞消耗残余葡萄糖，其反过来又限制了最终GOS浓度和纯度(Gosling等人的综述(11))。
在42℃下孵育的GS115/rBht静止细胞仅将51％的初始乳糖转化为半乳糖基-乳糖和残余葡萄糖(图4A)。这些数据与在相同条件下通过分泌的rBHT形成半乳糖基-乳糖非常相似(图3)。此外，转化和利用值也与之前报道的通过独特掷孢酵母进行的相当(表5)。已经报道了典型的乳糖利用值为初始乳糖的30％至40％(11)，一项研究报告了相比于分泌的rBHT，每克乳糖利用10.8倍的酶，乳糖利用为50％(表5)(4)。
20世纪中期通过独特掷孢酵母合成GOS的发现鼓舞了人们开发更有效产生GOS的品质优良的β-半乳糖苷酶(9,10,37)。然而，当与来自独特掷孢酵母的BHT相比时，所研究的酶显示出较低的乳糖利用值和较高最终浓度的不期望副产品的，(1,4,12,16,27,34,35)。尽管如此，由于具有挑战性的多步骤纯化工艺需要获得醇的天然BHT，独特掷孢酵母BHT在工业利用中的增长比需求要慢(1,4,16)。来自毕赤酵母的分泌的生物活性rBHT或膜结合酶预示着针对生产GOS的明确工艺改进。进一步研究将探索蛋白质修饰策略，一改进蛋白表达产量、蛋白稳定性和酶活性。
下表6总结了与本发明有关制备的构建体。所有的构建体在pPIC9中制备但在毕赤酵母中作为染色体整合体存在。
6.5来自富含乳糖的乳清的低聚半乳糖
2009年全球乳制品市场规模为2997亿美元，并且到2014年预期增长至3709亿美元，增长23.8％。Global.Dairy Industry Profile:Global.Dairy Industry Profile:Global[serial online].2010年10月:1。可获自:Business Source Complete,Ipswich,MA.Accessed 2012年2约24日.Global(2012)。乳品也奶酪分别占市场规模的5.2％和28.3％。2015年全球奶酪消费预期达到2100万吨。Lenoir-Wijnkoop I.&van Aalderen WM,B.G.K.D.S.A.N.MJ.Cost-effectiveness model for a specific mixture ofprebiotics in The Netherlands.Eur J Health Econ(2010)。乳制品市场的增长产生了在乳品加工过程中产生的具有高乳糖含量的乳品和食品副产物的大量工业废料处理问题。高乳糖含量废料流体具有异常地高的生物需氧量(BOD)，这意味着破坏乳糖所需的氧的量足够高以剥夺其他生物体生存所需的氧。因此，许多国家制定了环境保护法律来限制直接排放到水体中的含乳糖流体的处置。Ganzle,M.G.,Haase,G.&Jelen,P.lactose:Crystallization,lactose and value-added derivatives.International DairyJournal 18,685-694(2008)。为市政水处理增加的负担尤其高并且对于依赖于乳品经济的国家和地区而言也是个问题(4,6)。Affertsholt-Allen T.Market developments andindustry challenges for lactose and lactose derivatives.IDF Symposium"lactoseand its Derivatives."Moscow.(lactose.ru/present/1Tage_Affertsholt-Allen.pdf.Accessed Sept 30,2009)(2007)；Markets and Markets.U.S.DigestiveHealth Ingredients Market Worth$495.3million in 2015.(www.marketsandmarkets.com/PressReleases/us-digestive-health-ingredients-market.asp)(2010)；UBIC consulting.THE WORLD GALACTO-OLIGOSACCHARIDE MARKET.(www.ubic-consulting.com/template/fs/documents/Dairy-Ingredients/Galacto-Oligosaccharide-Ingredient-Mar ket.pdf)(2010)。例如，奶酪制造产生两种产品：奶酪和乳清。每制造一磅奶酪，就会产生九磅乳清，产生的过剩乳清越来越多(在2008年为1亿8千6百万吨)，其含有～5％乳糖。这种乳糖流分具有比通常污水排放高大约175-倍的BOD，因此未经处理的废料不能被直接排放到水体中。Smithers,G.W.whey and whey proteins."From Glitter to Gold".International Dairy Journal 18,695-704(2008)。对该问题的常规解决方案是通过昂贵的处理对富含乳糖的废水进行生物治理以提取乳糖，然后将其以$1.50/kg的上限值作为商品出售。每年产生的奶酪乳清只有50％被回收为有用的产品，例如食品成分和动物饲料。因为量太大而使得不能达到经济回收或者由于在生物转化中涉及的高度技术困难，剩余的被认为是废料。因此，对于将乳糖转化为可商业上可行的、高价值的产品以减少总体处理成本并改善美国乳品工业经济存在战略性需要。
在本文中，我们提出通过采用食品开发工艺作为理想解决方案同时进行商品化学乳糖的生物转化/生物治理从而解决该产业问题。我们已经改善了通过酶促反应能够使乳糖转化为被称作低聚半乳糖(GOS)的半乳糖基-乳糖衍生物的方法。GOS被分类为益生元，其刺激消化系统中有益细菌的生长和活性，并且被广泛用于食品产品中，例如婴儿配方食品、营养补充剂、酸奶、烘焙食品和动物饲料。与商品化的产品乳糖不同，GOS是价值较高的食品成分，并且这种转化的经济价值容易通过比较乳糖的市场价格($1.50/kg)和GOS的市场价格($5.20-8.50/kg)而得到证实。GOS是助消化健康食品成分趋势的一部分，其在2010年价值2亿6590万美元且年增长率为18.3％并且预期从2010年至2015年复合增长率为13.2％。
我们的乳糖向GOS转化的方法极大地由于现有方法，因为我们能够通过利用有效的宿主以产生酶而使反应的总体积减小50倍，增加所产生的GOS的体积和纯度，并潜在地产生无乳糖的产品。Euromonitor.Lactose-free Foods Maintain Their Global Appeal,2011年3月1日.Euromonitor(2011)。在2009年，该无乳糖产品全球市场为34亿美元，并且随着消费者对健康和保健功能性食品的持续关注预期其会增长。尽管其他的乳制品对价格极为敏感，但功能性食品(例如无乳糖产品)仍能够以高价出售。
通过利用本文中所述的改进方法，美国和全球乳品工业和食品补充剂制造商显然能够以如下三种方式获益：1)产生大量的具有高市场价值的高品质GOS、健康促进食品成分/膳食补充剂，2)刺激潜在产生有价值的无乳糖乳糖乳品或乳清产品，以及3)通过回收乳清和乳品食品副产物成本有效地减少环境影响。
表3.本研究中使用的菌株和质粒
αMF,啤酒酵母α-交配因子分泌信号
表4.本研究中使用的引物、抗体和底物(SEQ ID NOS:21-27)
a编码区为大写字母，限制性位点加下划线。
表5.评价来自独特掷孢酵母(Sporobolomyces singularis)的BHT用于生产低聚半乳糖(GOS)的报告
MM，分子量(kDa)；SA，比活性(U.mg-1酶)；T,温度(℃)；U.g-1lac,单位/克初始乳糖；Lint，初始乳糖浓度(％)；Lutil，所利用的乳糖(％)；Cmax，来自初始乳糖的GOS最大转化(％)；(Y)，转化％(由所利用的乳糖形成的总GOS)；STR，搅拌罐反应器；IE，固定的酶；PBR，填充床反应器；连续IE，固定的酶(连续)；RB IE，固定的酶(重复分批)。酶反应的底物aONP-Gal；bPNP-Gal；cPNP-Glu；dONP-Glu。eGOS包括二糖；所报道的fGOS值是在三糖(半乳糖基-乳糖)的最大累积值条件下进行的。
表6.毕赤酵母rBHT蛋白
aMF＝在pPIC9载体中发现的酿酒酵母α交配因子
BHTss＝在氨基酸1-22中发现的BHT信号序列
6.6通过替代信号结构域来使β-己糖基转移酶的分泌增强
6.6.1摘要
已知来自独特掷孢酵母的β-己糖基-转移酶(BHT)能够催化半乳糖基转移反应并合成低聚半乳糖(GOS)。我们之前报告了通过毕赤酵母的重组菌株(GS115::αMF-HIS-TEV-rBht)异种表达生物活性全长多肽(rBHT)。这种重组菌株携带在酿酒酵母α交配因子prepro信号(αMF)、组氨酸标签和TEV剪切位点之后的全长Bht基因。在甲醇后，由GS115::αMF-HIS-TEV-rBht产生的rBHT基因仅部分分泌并且剩余的大多蛋白与细胞膜相关。为了增加分泌的rBHT的量，本研究检查了含有两个推定的内源性结构域的未表征的BHT氨基末端区域(氨基酸1-110)。氨基端包括可能起到典型分泌先导信号作用的结构域(氨基酸1-22)，而其余的23-110个氨基酸含有推定的非典型分泌信号。因此，我们通过产生表达rBHT-HIS的重组毕赤酵母GS115菌株功能性地评价了这些结构域。当αMF之后是rBht(1-22)典型先导信号(氨基酸1-22)，同时用由毕赤酵母生产的分泌的和膜结合的酶分别增加50倍和14倍的αMF(αMF-rBht(23-594))替代先导信号(氨基酸1-22)时，结果显示出影响蛋白分泌的信号干扰。为了验证BHT氨基端结构域促进蛋白分泌的作用，我们用非分泌的可替代蛋白、抗-β-半乳糖苷酶单链可变抗体片段scFv13R4对该结构域进行了测试。表达αMF和rBHT的氨基端结构域的重组毕赤酵母菌株，之后是抗体scFv13R4能够产生与通过表达rBHT-HIS的重组体获得的分泌强度相关的结果。最后，获自更高效的重组体(GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS和GS115::αMF-rBht(23-594))的活性rBHT-HIS和rBHT蛋白被纯化至同质并且对其酶活性的变化进行评价。加标签和未加标签的的分泌的酶的6XHIS的酶活性与GOS生产速率所示出的相当。
6.6.2简介
对于使用酶来生产功能性食品的兴趣越来越大，尤其是由乳糖生产益生菌以获得乳糖衍生物的领域。独特掷孢酵母能够同化乳糖和葡萄糖但不能同化半乳糖表明，它们仅能够代谢乳糖的葡萄糖部分。而且，仅能够在肉汤培养基找到作为低聚半乳糖(GOS)的被利用的半乳糖单体。这种生理学特征导致发现了β-己糖基-转移酶(BHT)(Blakely和Mackenzi1021-25；Phaff和Carmo-Sousa193-207；Spencer,de Spencer,和Laluce 147-56；Gorin,Phaff,和Spencer1341-44；Gorin,Spencer,和Phaff 2307-17)。通过BHT从独特掷孢酵母合成的益生元(例如GOS)被认为是GRAS并且被广泛用作功能性添加剂(Tzortzis和Vulevic207-44)。
除了由乳糖合成GOS之外，BHT还催化β-半乳糖苷键的(例如ONP-Glu和PNP-Glu)的水解(Blakely和Mackenzi 1021-25)。在竞争技术方面，BHT酶能力尤其迫切，因为其是较少的能够以工业优势催化产生GOS的酶之一；在不存在额外离子和共因子的条件下发生催化以及其能够不依赖于初始乳糖浓度实施半乳糖基转移反应(Gosling等人307-18；Blakely和Mackenzi 1021-25)。
在独特掷孢酵母中，Bht是一种被葡萄糖抑制的可诱导的基因，并且当存在诱导剂(如乳糖)时，在大多数情况下发现所产生的酶(BHT)与细胞膜有关。由于细胞定位，BHT的纯化需要多个层析步骤并且以非常低的产量范围(14％至16％)从独特掷孢酵母回收(Blakely和Mackenzi 1021-25；Cho,Shin,和Bucke2107-11；Ishikawa等人331-39)。由于常规的蛋白质纯化限制了酶回收并且因此限制了其技术应用，已经评价了可替代的策略。第一种方法由暴露独特掷孢酵母以通过突变发生进行选择构成。采用这种方法，选择出缺少葡萄糖抑制并且能够产生增加10倍的膜结合BHT的新菌株；然而，没有报道分泌的酶的产生增加(Ishikawa等人331-39)。可替代地，我们最近描述了当其之前具有由19个氨基酸信号序列(pre序列)组成的αMF prepro分泌信号且之后具有66个氨基酸的pro序列和二碱基Kex2肽链内切酶加工位点时，毕赤酵母GS115能够分泌生物活性重组rBHT多肽(Kurjan和Herskowitz 933-43)。在本研究中，对无细胞提取物和膜结合相关活性的分析表明，其余的大多数酶与细胞膜相关。因此，示出了毕赤酵母GS115是用于产生和分泌生物活性rBHT的适合宿主，其能够促进下游加工并证实产生分泌的和膜相关的生物活性rBHT的可行性(Dagher等人,2013)。
进一步关注天然BHT蛋白序列，其显示出在氨基端含有内源性结构特征，包括能够起到适合的典型和非典型分泌信号作用的氨基端结构域。支持这些作为先导信号的功能，其已经显示出之后用最能够释放最多BHT的细胞壁裂解酶处理独特掷孢酵母缺乏氨基端典型先导信号(Ishikawa等人331-39)。由于基因表达和蛋白分泌的效率会受到参与细胞细胞联合(cell association)和分泌那些蛋白质结构因素的影响，因此当由毕赤酵母GS115表达时，相同的功能也会延伸至蛋白细胞定位。
在本研究中，我们测试了BHT氨基端结构域的生理学作用和其与毕赤酵母GS115的蛋白分泌的关系。此外，利用含有单链抗-β-半乳糖苷酶抗体scFv13R4重组嵌合体的验证了rBHT氨基端结构域的辅助作用。该抗体scFv13R4是非分泌的超-稳定的单链蛋白的一个实例，其与针对结合活性的二硫桥的形成无关(Martineau,Jones,和Winter 117-27)。因而，已经在大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和中华仓鼠卵母细胞(CHO)中异种表达了scFv13R4(Visintin等人11723-28；Grage和Rehm 254-62；Bach等人79-93)。
6.6.3结果
在计算机上进行β-己糖基转移酶(BHT)的蛋白序列分析。羧基末端区域(氨基酸111至594)of the BHT多肽(594个氨基酸)has noticeably homology toβ-葡萄糖苷。这种葡萄糖水解酶I(GHI)结构域含有推定的催化酸/碱、催化亲核试剂、和用于蛋白N-糖基化可能需要的三个天门冬酰胺残基(图7A)。显然，BHT氨基端显现出覆盖最初110个氨基酸的独特区。这个区域包含氨基端典型先导信号结构域(氨基酸1至22)，之后是预测的(http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP)低复杂性(氨基酸72至83)的(http://mendel.imp.ac.at/METHODS/seg.server.html)非典型分泌信号(NC)。氨基端先导信号(氨基酸1至22)能够被进一步破坏为N-区(氨基端；氨基酸1至5)、H-区(疏水；氨基酸6至17)和C-区(羧基端；氨基酸18至22)(图7B)。可替代的算法例如Phobius基于网络的程序(http://phobius.sbc.su.se/)和SignalP算法(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)也预测推定的典型先导信号和潜在剪切位点在残基17和18以及在22和23之间。此外，预测典型先导信号含有在H-区接触膜的五个氨基酸(RHYTHM,http://proteinformatics.charite.de/rhythm/)和能够促进膜蛋白定位和分泌的电荷分布(Boyd和Beckwith 1031-33)。跨膜区预测算法(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)也预测了通常用于完整跨膜蛋白(integral membrane spanning protein)和非细胞质区域(氨基酸23-594)的BHT中1-17和177-199的疏水残基的延伸，如在Kyte和Doolittle亲水性图中所示出的(图7C)。这些结构特征也可以表明，氨基端典型先导信号在穿过酵母分泌途径的过程中可起到膜锚着点的作用。
氨基端结构域参与蛋白分泌。为了研究两种氨基端分泌结构域(典型合物非典型分泌信号)可能的生理学作用，对羧基端BHT结构域(氨基酸111至594)和单链抗-β-半乳糖苷酶抗体(scFv13R4)的表达进行测试。通过rBht氨基端结构域和/或强9.3kDaαMF prepro序列进行的适当改良的基因组合的染色体整合获得稳定的重组毕赤酵母GS115菌株。将rBht和scFv13R4基因组合插入到AOX1启动子的下游，其后是羧基端6XHIS标签，以辅助检测和纯化图8A和图8D(参见材料和方法部分)。
用相比于在αMF分泌信号(GS115::αMF-rBht-HIS)之前的全长rBHT-HIS的表达(0.49μg.ml-1)蛋白分泌增加超过19倍(9.80μg.ml-1)的的强αMF prepro分泌信号(GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS)代替先导信号(氨基酸1至22)(图8B)。类似地，在不存在αMF的条件下，先导信号能够指示用于分泌的异种蛋白(GS115::rBht-HIS)(6.35μg.ml-1)。另外，在不存在αMF和先导信号(GS115::rBht(23-594)-HIS)的条件下检测蛋白分泌(4.65μg.ml-1)，这表明典型先导和非典型分泌信号含有靶向于分泌的蛋白形成。
如上文所述，为了验证氨基端结构域，靶向于分泌途径的蛋白，我们选择了抗体scFv13R4，其是不含信号序列的胞内蛋白。图(8C)中示出了抗体scFv13R4嵌合体的图示。当通过GS115::scFv13R4-HIS(缺少先导分泌信号)表达scFv13R4-HIS时，能够通过SDS-PAGE银染色或Western印迹分析在培养物肉汤培养基中进行检测(数据未示出)。显示了当将scFv13R4融合于Bht典型先导分泌信号(25.17μg.ml-1)时或融合于Bht非典型信号(7.03μg.ml-1)时GS115::rBht(1-110)-scFv13R4-HIS或GS115::rBht(23-110)-scFv13R4-HIS的分泌scFv13R4-HIS。同样，如与BHT-HIS所见，分泌由αMF驱动，(GS115::αMF-scFv13R4-HIS)提供了最高水平的分泌的蛋白(91.02μg.ml-1)。
通过毕赤酵母GS115表达的rBHT-HIS的酶活性和Western印迹分析。为了证实与酶活性相关的蛋白表达，利用ONP-Glu作为底物测量了分泌的和膜结合的rBHT-HIS活性(参见材料和方法部分)。以可检测量分泌rBHT-HIS的所有重组菌株和活性的值反映了分泌蛋白的增加。GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS分泌的蛋白显示出3.7mU.OD-1的酶活性，其比当分泌由完整氨基端区域(氨基酸1-110)驱动时的酶活性)(GS115::rBht-HIS(0.63mU.OD-1))高6倍。类似地，GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS分泌的蛋白的测量酶活性比获自含有αMF和先导信号的重组体的酶活性高53倍(GS115::αMF-rBht-HIS(0.07mU.OD-1))。重组GS115::rBht(23-594)-HIS(0.26mU.OD-1)显示出减少量的活性分泌酶(表8)。
还对每种重组体的静止细胞表现出的膜结合酶的活性进行了测试。我们发现，活性值与总分泌蛋白有关，相比于GS115::αMF-rBht-HIS(1.48mU.OD-1)，针对菌株GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS(21.52mU.OD-1)其显示出15-倍增加的膜结合活性，以及对于菌株GS115::rBht-HIS(1.94mU.OD-1)显示出1.3倍倍增加的膜结合活性。重组GS115::rBht(23-594)-HIS(0.15mU.OD-1)显示出减少量的膜结合酶，这证明了这种重组通过推定的非典型分泌途径重定向了蛋白。总体上，这些结果示出了αMF和BHT先导分泌信号都不能完全完成rBHT-HIS的分泌，其可能与预测在氨基酸177至199之间存在跨膜区有关。
利用抗-HIS抗体进行的无细胞提取物的Western印迹分析证实了GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS、GS115::rBht-HIS和GS115::rBht(23-594)-HIS分泌的蛋白值(图9A)。在每一种情况下，存在对应于分子量大约为110kDa的明显的rBHT-HIS条带。这些结果与之前报道的SDS-PAGE和尺寸排阻色谱迁移模式相同(Dagher,Azcarate-Peril和Bruno-Bárcena)。获自GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS、GS115::rBht-HIS和GS115::αMF-rBht-HIS的细胞提取物的Western印迹分析还显示出分子量约为110kDa，而GS115::rBht(23-594)-HIS显示出在98和64kDa之间具有明显的条带，这可能指示胞内降解或可替代的糖基化方式(图9B)。
rBHT水解活性。另外，我们分步测试了针对来自GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS andGS115::αMF-rBht(23-594)的HIS-加标签的和非-HIS加标签的蛋白的分泌酶。该酶带来相当的结果并且在宽的温度(10至50℃)和pH值(2.8至6)范围内是活性的。在pH 3.6至5观察到最大活性(最大活性的91至100％)之后稳定下降至pH2.6(最大活性的43％)和达到pH 6.8(最大活性的29％)。同样，在40至45℃的范围内发现最优温度(最大活性的97至100％)，但在温度高于50℃和低于20℃时快速下降(低于最大活性的的25％)(数据未示出)。该酶在4℃下在50mM磷酸钠缓冲液(pH 5)中保持稳定至少6个月并且活性不会受到于-80℃下储存的影响。由Hill等式(酶在42℃ pH 4下的Km 0.79mM和Vmax 3.97mmol.min-1/mg-1)获得GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS分泌的酶的动力学常数的值。这些发现与我们和其他人之前所报道的一致(Blakely和Mackenzi 1021-25；Cho,Shin,和Bucke2107-11；Gorin,Phaff,和Spencer1341-44；Gorin,Spencer,和Phaff 2307-17；Ishikawa等人331-39；Sakai等人285-93；Shin,Park,和Yang 787-92；Shin和Yang484-89；Dagher,Azcarate-Peril,和Bruno-Bárcena)。
rBHT稳定性。为了检验酶的长期稳定性，在含有2％葡萄糖缓冲液中诱导所有新鲜诱导的重组菌株，并随时间测量膜结合的和分泌的rBHT的水解活性。通过典型或非典型分泌途径获自所有重组体的分泌的rBHT-HIS在一周的测试期内仍然是稳定的并且保留95％的初始活性。当用GS115::αMF-rBht-HIS、GS115::rBht-HIS和GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS表达含有膜相关的酶的静止细胞时，观察到相同的稳定性。然而，当测试含有用GS115::rBht(23-594)-HIS表达的膜相关酶时，活性在24小时内开始下降，这指出了可替代的非典型分泌途径。
由GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS产生的rBHT-HIS的纯化和表征。利用镍亲和层析来纯化GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS表达的rBHT蛋白。在羧基端替代6XHIS标签成功使得超过73％的原始酶活性的单步骤回收并且在SDS-PAGE之后观察到大约110kDa的单个多肽条带(图9C)。从培养物上清的6.54倍蛋白纯化回收了7.24mg的酶，这使得在42℃和pH 4的比活性为18.45mU.mg-1(表9)。此外，遵循相同的方法，我们纯化了不同重组体分泌的rBHT-HIS并且发现相当的比活性范围为18.45至18.65mU.mg-1。GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS分泌的多肽的氨基端序列的确定显示出，除了含有两个另外的氨基端氨基酸(E-A-V-X-Y残基)的产物之外，在肉汤培养基中还存在完整的rBHT(23-594)-HIS蛋白(V-X-Y-P-G残基)。分泌期间氨基酸A-E剪切的可变性受到附近氨基酸序列和四级结构的影响(Cereghino和Cregg 45-66)。其余的非典型序列不会引入新的剪切位点。
HIS标签对rBHT转移酶活性的影响。重组体GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS和GS115::αMF-rBht(23-594)被进一步用于比较性评价HIS标签的存在是否会影响由乳糖合成GOS。由含有220gL-1初始乳糖、0.5U rBHT g-1乳糖并在30℃孵育的反应混合物通过HPLC来定量分析GOS累积。
图10A显示出当通过6XHIS加标签的或未加标签的分泌酶对话反映时随时间的比较GOS累积和乳糖消耗。在两种情况下，在半乳糖基-乳糖作为主要产物的最初25小时期间观察到最大生产速率。在125小时后证实了之前所述的酶促竞争性葡萄糖抑制，半乳糖基-乳糖(75gL-1)累积从利用的60％初始乳糖保持不变达到平均67％转化(Dagher、Azcarate-Peril和Bruno-Bárcena)。
当利用表达膜相关的HIS和非-HIS加标签的rBHT静止细胞时，也证实了最时间的相当GOS累积和乳糖消耗。(图10B)示出了羧基端HIS的存在不会影响半乳糖基-乳糖形成的初始反应速率(1.87和1.7g.L-1.h-1)。如之前所报道了，毕赤酵母的静止细胞消耗葡萄糖，而半乳糖被用于合成GOS(68％产率(g/g))，其接近理论产率75％(Dagher,Azcarate-Peril,和Bruno-Bárcena)。
6.6.4讨论
益生元是作为功能性食品上市销售并且积极地促进改善消费者健康的碳水化合物衍生物，其意在具体刺激肠内有益细菌的生长。驱动益生元发展的基本力是以较低的操作成本实现更高效生产的承诺。然而，通过化学方法生产或合成碳水化合物衍生物是复杂的并且由于存在若干类似反应性的羟基而需要保护和脱保护步骤(Sears and Wong 2344-50)。因此，酶促方法的发展具有实际意义并且基因修饰已经被广泛用于改进酶活性，从而获得对于酶促机制的更深入理解，并增加蛋白分泌。指定用于分泌的蛋白通常位于20–30个氨基酸的氨基端先导信号之后并且最终用膜结合信号肽酶进行的处理(Von Heijne 17-21)。毕赤酵母蛋白分泌受到初始核苷酸序列性质以及偶尔需要密码子最优化的影响，以及还要考虑糖基化方式、最终3-维结构、培养条件和培养基组合物(Damasceno,Huang,andBatt31-39)。另外，先导结构域中带电荷氨基酸的分步在簇集膜和分泌的蛋白的定位方面起到重要作用(Boyd和Beckwith 1031-33)。
如之前所报道的，毕赤酵母在rBHT表达方面具有优于大肠杆菌的优点，这是由于其能够有效地结合翻译后修饰，使得能够异种生产少量的生物活性rBHT。BHT的计算机分析表明，这种酶含有待研究的跨膜结构域以增加毕赤酵母的酶分泌。BHT独特蛋白区(1-110个氨基酸)含有预测起到典型先导信号(BHT(1-22))和非典型分泌信号结构域(BHT(23-110))作用的两个结构域。典型先导信号还靶向于该蛋白以在细胞膜处实现其功能(如通过RHYTHM方法和亲水性预测的，图1)。尤其是，在第17位存在碱性氨基酸(例如精氨酸)能够影响分泌效率和蛋白在膜中的取向(图1)。
本文中披露的数据显示，GS115::αMF-rBht-HIS由于同时存在αMF和先导信号(BHT(1-22))而会干扰蛋白分泌。蛋白分泌的水平与之前所报道的GS115::αMF-HIS-TEV-rBht的值相当(Dagher,Azcarate-Peril,和Bruno-Bárcena)。另一方面，分泌蛋白的较高累积是通过分别缺少αMF或BHT(1-22)的重组体GS115::rBht-HIS和GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS获得的。因此，表明该先导信号结构域(BHT(1-22))涉及与αMF相当的信号肽-介导的机制(典型分泌途径)。相比于含有两个先导序列的GS115::αMF-rBht-HIS，两种先导信号独立地能够增加膜相关的和分泌的rBHT的蛋白表达。分泌的(增加50倍)和膜结合(增加14倍)生物活性rBHT蛋白的最佳值是通过重组GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS(表3)获得的。GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS表达的生物活性蛋白的随后纯化获得非常纯的蛋白，该纯化以of18.45U.mg-1的比活性通过SDS-PAGE进行(表4)。rBHT的分子量(110kDa)不会在细胞膜相关的rBHT和分泌的rBHT之间发生偏离(deviate)，并且相比于来自我们之前研究的rBHT(Dagher等人,2013)，显示出相似的酶活性、热稳定性、可再用性和储存稳定性。
我们期望除去两个先导结构域(BHT(1-22))且αMF会阻碍酶分泌。然而，除去αMF和BHT(1-22)仍显示出少量的分泌蛋白。还证实了110个氨基酸独特区含有双重功能，先导结构域BHT(1-22)通过该功能起到有效分泌信号(典型分泌途径)的作用并且预测的BHT(23-110)结构域可作为可替代的分泌信号(非典型分泌途径)操作。Western印迹分析显示，蛋白质水解表明在细胞中蛋白敏感性增加。大多数测得的水解活性被检测为最大质量110kDa下方的多个条带，有可能影响分泌酶的量(图9A-9C)。我们推测信号序列在分泌期间可能通过在分泌途径中使蛋白质保持远离蛋白酶而起到保护蛋白质的作用。
尽管GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS分泌了较大量的蛋白质，但大量的蛋白质仍稳定结合于膜，这可能是由于蛋白羧基端结构域中的跨膜结构域(氨基酸177-199)的存在使膜中的预测流动相有限。因此，为了证实这些结构域作为辅助信号的生理学功能，我们通过用抗体scFv13R4蛋白代替rBHT(23-594)结构域而产生了新的蛋白嵌合体。BHT(1-110)典型先导序列之后是推定的非典型先导序列、BHT(23-110)推定的非典型先导序列、以及αMF结构域，其位于具有scFv13R4的氨基端部分的框架中。这些新的重组体的分析能够证实通过引导抗体分泌带来的先导辅助功能。我们的结果证实了信号序列的选择显著影响蛋白(包括重组BHT和scFv13R4)的生产和分泌水平。值得注意的是，相比于αMF(66个氨基酸)，新的较小先导信号(22个氨基酸)具有尺寸优势，并且在本文中已被证明是新的独特序列，能够直接分泌异种蛋白。这种先导信号结构域加入了新的特征，其能够构建成新的胞内酶，需要利用机械方式破坏或通过化学处理透化才能提取(Panesar等人530-43)。
BHT的持续分子开发将有助于解决食品工业中有关于具有新性质的酶的问题，例如热活性、低温稳定性可特定低聚糖的合成。本发明的发现激发了进一步的结构分析的积极性以阐明归因于糖基化转移活性和底物特异性的特征。催化位点的突变形成和基于3D结构的合理突变形成将为用于作为益生菌候选物的新型GOS的生产的底物特异性的改变铺平道路。
表7.本研究中使用的菌株和质粒
aαMF,在pPIC9载体中发现的啤酒酵母α-交配因子分泌信号。
表8.毕赤酵母的不同重组体分泌的和膜结合rBHT-HIS酶活性
表9.毕赤酵母GS115::αMF-rBht(23-594)-HIS分泌的rBHT-HIS的纯化
a,在BMGY肉汤培养基中在28℃生长的1升培养物
b,通过Bradford分析确定的蛋白浓度
c,比活性，表示为总活性(U)除以总蛋白(mg)
d,镍层析纯化之后的总单位
e,镍层析纯化之后的总蛋白(mg)
f,镍层析纯化之后的比活性，表示为总活性(U)除以总产量(mg)
g,比活性的增加
h,产量，表示为镍柱层析之后的总活性除以肉汤培养基中的总活性
6.7第6.6节的参考资料
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应该理解，尽管已经结合详细的描述叙述了本发明，但是前述的描述仅是以一在举例说明而不是限制本发明的方位。本发明的其他方面、优点和修改也包括在所附权利要求的范围内。本说明书中饮用的所有出版物、专利和专利申请结合于本文作为参考，就像单独的出版物或专利申请具体地或单独地说明结合于本发明作为参考一样。
8.序列表
SEQ ID NO.1
>gi|345649663|gb|JF298281.1|合成构建体β-己糖基转移酶(bglA)基因，部分cds
ATGATGCTGCATGCTGCACTGCTAGTAGCGCTGCCATGTGTTGTTTTGGCGCGCCCGGCCGGAGCGGTTA
CTTATCCGGGAGCCATTCCTCTGTCCCTGACGAGCAATTACGAAACCCCAAGTCCGACAGCAATCCCGCT
GGAGCCAACACCGACGGCTACCGGTACAGCAGAATTAGATGCGCTGTGGAACTTAGTCGAAGCTCAGTAC
CCAGTTCAAACTGCTGCAGTGACAACTTTGGTGACAGTGCCCGATGATTATAAGTTTGAGGCAGATCCAC
CGAGTTATGCATTAGCAGGGTATGAAACAAGCGAGATTGCCGGACTGAAGTTTCCAAAGGGGTTTAAGTT
TGGTGTTGCGGGGGCAGCCATTCAAGTTGAAGGTGCAGCAAAAGCCGAAGGGCGGGGCCCAAGTACCTGG
GATTATCTGTGTCATCACTATGCCAGCACGCAGTGTAACAATTATGATCCCGATATTACAACCAACCATT
ACTACCTGTACCCATTGGACTTTGCGCGCCTGCAACACCTAGGCATTAACACTTACTCGTTTTCAATTTC
ATGGACGCGTATTTATCCATTGGGCGCAGGCTATGTTAATGAAGCAGGGTTAGCCCACTATGATGCCGTA
ATCCATAGTGCCAAGAAGTATGGTCTGGAACCAGTGGGCACCGTTTTTCACTGGGATACGCCACTGTCTC
TGATGCTGAAATACGGTGCCTGGCAAGATACTGGTGACCAAATTGTTAAGGACTTTGTTACCTATGCCAC
AACTGTGTTTAAGCGTTATGGTAATGAAGTCAAGACGTGGTTTACTTTCAATGAACCACGGGTTTTCTGT
TCACAAAATAGTGGTCTGCCATACAATCTGACGTATCCAGAAGGTATTAACAGCACCTCCGCTGTATTTC
GTTGCACCTACAATGTTCTGAAAGCTCATGGTCATGCTGTTAAAGTGTATCGGGATCTAGTTGCCTCCGG
GACCATTGCGGCAGGTGAAATCGGCTTTAAATCCGATGATAACTACCCAATCCCGGCCCGTCCAGGGAAC
GCCGATGACGAGGAATCAGCCAAGCGTCACGAGGCTTTTCGCATTGGGATTTTTGCGCAACCGGTTTATG
GTAATGGCGATTATCCAGATGTTGTTAAAGAAACTGTTGGAGATATGCTGCCGGCCCTGACGGATGAAGA
TAAAGGATACATTAAAGGTAGCGGAGATATTTTTGCGATTGACGGGTATCGTACCGATATTTCCCATGCG
GCTCTGAACGGGATCGCGAATTGTATTCGCAACCAAAGTGACCCGAATTGGCCAGTGTGTGAAGAAGGGT
CAGATCCTTTTGCTCATGTTTACCCATCCGGGTTTGCTATTGGTCAATCAGCCGATCCACTGTCTTCATG
GTTAGTCAACTCAGCCCCGTTTATCCGCGATCAACTGAAGTTTCTGACACAAACCTACCCTGCTAAGGGT
GGTATTTATTTCTCGGAATTTGGTTGGGCTGAAGACGCCGAATATGATCGTCAACTGCTGTATCAAATTA
CCTGGGATGGTCTGCGTACGCAATACCTGACGGACTATCTGAGCCAGCTGCTGTTGGCTGTGCACAAAGA
CGGGATTAATCTGCGAGGCGCGCTGACGTGGAGTTTTGTCGATAATTGGGAGTGGGGTTTAGGGATGCAA
CAGAAATTCGGATTTCAGTTTGTTAATCAATCAGATCCCGATCTGACACGCACGTTTAAACTGAGCGCTC
ACGCTTACGCCCAATTTGGGCGTAATCATCTG
SEQ ID NO.2
>gi|345649664|gb|AEO14215.1|β-己糖基转移酶[合成构建体]
MMLHAALLVALPCVVLARPAGAVTYPGAIPLSLTSNYETPSPTAIPLEPTPTATGTAELDALWNLVEAQYPVQTAAVTTLVTVPDDYKFEADPPSYALAGYETSEIAGLKFPKGFKFGVAGAAIQVEGAAKAEGRGPSTWDYLCHHYASTQCNNYDPDITTNHYYLYPLDFARLQHLGINTYSFSISWTRIYPLGAGYVNEAGLAHYDAVIHSAKKYGLEPVGTVFHWDTPLSLMLKYGAWQDTGDQIVKDFVTYATTVFKRYGNEVKTWFTFNEPRVFCSQNSGLPYNLTYPEGINSTSAVFRCTYNVLKAHGHAVKVYRDLVASGTIAAGEIGFKSDDNYPIPARPGNADDEESAKRHEAFRIGIFAQPVYGNGDYPDVVKETVGDMLPALTDEDKGYIKGSGDIFAIDGYRTDISHAALNGIANCIRNQSDPNWPVCEEGSDPFAHVYPSGFAIGQSADPLSSWLVNSAPFIRDQLKFLTQTYPAKGGIYFSEFGWAEDAEYDRQLLYQITWDGLRTQYLTDYLSQLLLAVHKDGINLRGALTWSFVDNWEWGLGMQQKFGFQFVNQSDPDLTRTFKLSAHAYAQFGRNHL
SEQ ID NO.3
FP#1 aMF-6XHIS-TEV(Q/M)-rBHT(XhoI-NotI)
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT
CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT
TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT
AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA
TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT CACCACCACCACCACCACGAAAACCTGTATTTT
CAGATGATGCTGCATGCTGCACTGCTAGTAGCGCTGCCATGTGTTGTTTTGGCGCGCCCG
GCCGGAGCGGTTACTTATCCGGGAGCCATTCCTCTGTCCCTGACGAGCAATTACGAAACC
CCAAGTCCGACAGCAATCCCGCTGGAGCCAACACCGACGGCTACCGGTACAGCAGAATTA
GATGCGCTGTGGAACTTAGTCGAAGCTCAGTACCCAGTTCAAACTGCTGCAGTGACAACT
TTGGTGACAGTGCCCGATGATTATAAGTTTGAGGCAGATCCACCGAGTTATGCATTAGCA
GGGTATGAAACAAGCGAGATTGCCGGACTGAAGTTTCCAAAGGGGTTTAAGTTTGGTGTT
GCGGGGGCAGCCATTCAAGTTGAAGGTGCAGCAAAAGCCGAAGGGCGGGGCCCAAGTACC
TGGGATTATCTGTGTCATCACTATGCCAGCACGCAGTGTAACAATTATGATCCCGATATT
ACAACCAACCATTACTACCTGTACCCATTGGACTTTGCGCGCCTGCAACACCTAGGCATT
AACACTTACTCGTTTTCAATTTCATGGACGCGTATTTATCCATTGGGCGCAGGCTATGTT
AATGAAGCAGGGTTAGCCCACTATGATGCCGTAATCCATAGTGCCAAGAAGTATGGTCTG
GAACCAGTGGGCACCGTTTTTCACTGGGATACGCCACTGTCTCTGATGCTGAAATACGGT
GCCTGGCAAGATACTGGTGACCAAATTGTTAAGGACTTTGTTACCTATGCCACAACTGTG
TTTAAGCGTTATGGTAATGAAGTCAAGACGTGGTTTACTTTCAATGAACCACGGGTTTTC
TGTTCACAAAATAGTGGTCTGCCATACAATCTGACGTATCCAGAAGGTATTAACAGCACC
TCCGCTGTATTTCGTTGCACCTACAATGTTCTGAAAGCTCATGGTCATGCTGTTAAAGTG
TATCGGGATCTAGTTGCCTCCGGGACCATTGCGGCAGGTGAAATCGGCTTTAAATCCGAT
GATAACTACCCAATCCCGGCCCGTCCAGGGAACGCCGATGACGAGGAATCAGCCAAGCGT
CACGAGGCTTTTCGCATTGGGATTTTTGCGCAACCGGTTTATGGTAATGGCGATTATCCA
GATGTTGTTAAAGAAACTGTTGGAGATATGCTGCCGGCCCTGACGGATGAAGATAAAGGA
TACATTAAAGGTAGCGGAGATATTTTTGCGATTGACGGGTATCGTACCGATATTTCCCAT
GCGGCTCTGAACGGGATCGCGAATTGTATTCGCAACCAAAGTGACCCGAATTGGCCAGTG
TGTGAAGAAGGGTCAGATCCTTTTGCTCATGTTTACCCATCCGGGTTTGCTATTGGTCAA
TCAGCCGATCCACTGTCTTCATGGTTAGTCAACTCAGCCCCGTTTATCCGCGATCAACTG
AAGTTTCTGACACAAACCTACCCTGCTAAGGGTGGTATTTATTTCTCGGAATTTGGTTGG
GCTGAAGACGCCGAATATGATCGTCAACTGCTGTATCAAATTACCTGGGATGGTCTGCGT
ACGCAATACCTGACGGACTATCTGAGCCAGCTGCTGTTGGCTGTGCACAAAGACGGGATT
AATCTGCGAGGCGCGCTGACGTGGAGTTTTGTCGATAATTGGGAGTGGGGTTTAGGGATG
CAACAGAAATTCGGATTTCAGTTTGTTAATCAATCAGATCCCGATCTGACACGCACGTTT
AAACTGAGCGCTCACGCTTACGCCCAATTTGGGCGTAATCATCTGTAA
SEQ ID NO.4
FP#1 aMF-6XHIS-TEV(Q/M)-rBHT
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTN
NGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA HHHHHHENLYFQMMLHAALLVALPCVVLARP
AGAVTYPGAIPLSLTSNYETPSPTAIPLEPTPTATGTAELDALWNLVEAQYPVQTAAVTT
LVTVPDDYKFEADPPSYALAGYETSEIAGLKFPKGFKFGVAGAAIQVEGAAKAEGRGPST
WDYLCHHYASTQCNNYDPDITTNHYYLYPLDFARLQHLGINTYSFSISWTRIYPLGAGYV
NEAGLAHYDAVIHSAKKYGLEPVGTVFHWDTPLSLMLKYGAWQDTGDQIVKDFVTYATTV
FKRYGNEVKTWFTFNEPRVFCSQNSGLPYNLTYPEGINSTSAVFRCTYNVLKAHGHAVKV
YRDLVASGTIAAGEIGFKSDDNYPIPARPGNADDEESAKRHEAFRIGIFAQPVYGNGDYP
DVVKETVGDMLPALTDEDKGYIKGSGDIFAIDGYRTDISHAALNGIANCIRNQSDPNWPV
CEEGSDPFAHVYPSGFAIGQSADPLSSWLVNSAPFIRDQLKFLTQTYPAKGGIYFSEFGW
AEDAEYDRQLLYQITWDGLRTQYLTDYLSQLLLAVHKDGINLRGALTWSFVDNWEWGLGM
QQKFGFQFVNQSDPDLTRTFKLSAHAYAQFGRNHL
SEQ ID NO.5
FP#2 aMF-6XHIS-TEV(Q/M)-aMF-rBHT-6XHIS(XhoI-NotI)
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT
CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT
TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT
AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA
TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT CACCACCACCACCACCACGAAAACCTGTATTTT
CAGATGATGCTGCATGCTGCACTGCTAGTAGCGCTGCCATGTGTTGTTTTGGCGCGCCCG
GCCGGAGCGGTTACTTATCCGGGAGCCATTCCTCTGTCCCTGACGAGCAATTACGAAACC
CCAAGTCCGACAGCAATCCCGCTGGAGCCAACACCGACGGCTACCGGTACAGCAGAATTA
GATGCGCTGTGGAACTTAGTCGAAGCTCAGTACCCAGTTCAAACTGCTGCAGTGACAACT
TTGGTGACAGTGCCCGATGATTATAAGTTTGAGGCAGATCCACCGAGTTATGCATTAGCA
GGGTATGAAACAAGCGAGATTGCCGGACTGAAGTTTCCAAAGGGGTTTAAGTTTGGTGTT
GCGGGGGCAGCCATTCAAGTTGAAGGTGCAGCAAAAGCCGAAGGGCGGGGCCCAAGTACC
TGGGATTATCTGTGTCATCACTATGCCAGCACGCAGTGTAACAATTATGATCCCGATATT
ACAACCAACCATTACTACCTGTACCCATTGGACTTTGCGCGCCTGCAACACCTAGGCATT
AACACTTACTCGTTTTCAATTTCATGGACGCGTATTTATCCATTGGGCGCAGGCTATGTT
AATGAAGCAGGGTTAGCCCACTATGATGCCGTAATCCATAGTGCCAAGAAGTATGGTCTG
GAACCAGTGGGCACCGTTTTTCACTGGGATACGCCACTGTCTCTGATGCTGAAATACGGT
GCCTGGCAAGATACTGGTGACCAAATTGTTAAGGACTTTGTTACCTATGCCACAACTGTG
TTTAAGCGTTATGGTAATGAAGTCAAGACGTGGTTTACTTTCAATGAACCACGGGTTTTC
TGTTCACAAAATAGTGGTCTGCCATACAATCTGACGTATCCAGAAGGTATTAACAGCACC
TCCGCTGTATTTCGTTGCACCTACAATGTTCTGAAAGCTCATGGTCATGCTGTTAAAGTG
TATCGGGATCTAGTTGCCTCCGGGACCATTGCGGCAGGTGAAATCGGCTTTAAATCCGAT
GATAACTACCCAATCCCGGCCCGTCCAGGGAACGCCGATGACGAGGAATCAGCCAAGCGT
CACGAGGCTTTTCGCATTGGGATTTTTGCGCAACCGGTTTATGGTAATGGCGATTATCCA
GATGTTGTTAAAGAAACTGTTGGAGATATGCTGCCGGCCCTGACGGATGAAGATAAAGGA
TACATTAAAGGTAGCGGAGATATTTTTGCGATTGACGGGTATCGTACCGATATTTCCCAT
GCGGCTCTGAACGGGATCGCGAATTGTATTCGCAACCAAAGTGACCCGAATTGGCCAGTG
TGTGAAGAAGGGTCAGATCCTTTTGCTCATGTTTACCCATCCGGGTTTGCTATTGGTCAA
TCAGCCGATCCACTGTCTTCATGGTTAGTCAACTCAGCCCCGTTTATCCGCGATCAACTG
AAGTTTCTGACACAAACCTACCCTGCTAAGGGTGGTATTTATTTCTCGGAATTTGGTTGG
GCTGAAGACGCCGAATATGATCGTCAACTGCTGTATCAAATTACCTGGGATGGTCTGCGT
ACGCAATACCTGACGGACTATCTGAGCCAGCTGCTGTTGGCTGTGCACAAAGACGGGATT
AATCTGCGAGGCGCGCTGACGTGGAGTTTTGTCGATAATTGGGAGTGGGGTTTAGGGATG
CAACAGAAATTCGGATTTCAGTTTGTTAATCAATCAGATCCCGATCTGACACGCACGTTT
AAACTGAGCGCTCACGCTTACGCCCAATTTGGGCGTAATCATCTGCACCACCACCACCAC
CACTAA
SEQ ID NO.6
FP#2 aMF-6XHIS-TEV(Q/M)-aMF-rBHT-6XHIS
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTN
NGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA HHHHHHENLYFQMMLHAALLVALPCVVLARP
AGAVTYPGAIPLSLTSNYETPSPTAIPLEPTPTATGTAELDALWNLVEAQYPVQTAAVTT
LVTVPDDYKFEADPPSYALAGYETSEIAGLKFPKGFKFGVAGAAIQVEGAAKAEGRGPST
WDYLCHHYASTQCNNYDPDITTNHYYLYPLDFARLQHLGINTYSFSISWTRIYPLGAGYV
NEAGLAHYDAVIHSAKKYGLEPVGTVFHWDTPLSLMLKYGAWQDTGDQIVKDFVTYATTV
FKRYGNEVKTWFTFNEPRVFCSQNSGLPYNLTYPEGINSTSAVFRCTYNVLKAHGHAVKV
YRDLVASGTIAAGEIGFKSDDNYPIPARPGNADDEESAKRHEAFRIGIFAQPVYGNGDYP
DVVKETVGDMLPALTDEDKGYIKGSGDIFAIDGYRTDISHAALNGIANCIRNQSDPNWPV
CEEGSDPFAHVYPSGFAIGQSADPLSSWLVNSAPFIRDQLKFLTQTYPAKGGIYFSEFGW
AEDAEYDRQLLYQITWDGLRTQYLTDYLSQLLLAVHKDGINLRGALTWSFVDNWEWGLGM
QQKFGFQFVNQSDPDLTRTFKLSAHAYAQFGRNHLHHHHHH
SEQ ID NO.7
FP#3 aMF-rBHT-6XHIS(XhoI-NotI)
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT
CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT
TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT
AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA
TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT ATGATGCTGCATGCTGCACTGCTAGTAGCGCTG
CCATGTGTTGTTTTGGCGCGCCCGGCCGGAGCGGTTACTTATCCGGGAGCCATTCCTCTG
TCCCTGACGAGCAATTACGAAACCCCAAGTCCGACAGCAATCCCGCTGGAGCCAACACCG
ACGGCTACCGGTACAGCAGAATTAGATGCGCTGTGGAACTTAGTCGAAGCTCAGTACCCA
GTTCAAACTGCTGCAGTGACAACTTTGGTGACAGTGCCCGATGATTATAAGTTTGAGGCA
GATCCACCGAGTTATGCATTAGCAGGGTATGAAACAAGCGAGATTGCCGGACTGAAGTTT
CCAAAGGGGTTTAAGTTTGGTGTTGCGGGGGCAGCCATTCAAGTTGAAGGTGCAGCAAAA
GCCGAAGGGCGGGGCCCAAGTACCTGGGATTATCTGTGTCATCACTATGCCAGCACGCAG
TGTAACAATTATGATCCCGATATTACAACCAACCATTACTACCTGTACCCATTGGACTTT
GCGCGCCTGCAACACCTAGGCATTAACACTTACTCGTTTTCAATTTCATGGACGCGTATT
TATCCATTGGGCGCAGGCTATGTTAATGAAGCAGGGTTAGCCCACTATGATGCCGTAATC
CATAGTGCCAAGAAGTATGGTCTGGAACCAGTGGGCACCGTTTTTCACTGGGATACGCCA
CTGTCTCTGATGCTGAAATACGGTGCCTGGCAAGATACTGGTGACCAAATTGTTAAGGAC
TTTGTTACCTATGCCACAACTGTGTTTAAGCGTTATGGTAATGAAGTCAAGACGTGGTTT
ACTTTCAATGAACCACGGGTTTTCTGTTCACAAAATAGTGGTCTGCCATACAATCTGACG
TATCCAGAAGGTATTAACAGCACCTCCGCTGTATTTCGTTGCACCTACAATGTTCTGAAA
GCTCATGGTCATGCTGTTAAAGTGTATCGGGATCTAGTTGCCTCCGGGACCATTGCGGCA
GGTGAAATCGGCTTTAAATCCGATGATAACTACCCAATCCCGGCCCGTCCAGGGAACGCC
GATGACGAGGAATCAGCCAAGCGTCACGAGGCTTTTCGCATTGGGATTTTTGCGCAACCG
GTTTATGGTAATGGCGATTATCCAGATGTTGTTAAAGAAACTGTTGGAGATATGCTGCCG
GCCCTGACGGATGAAGATAAAGGATACATTAAAGGTAGCGGAGATATTTTTGCGATTGAC
GGGTATCGTACCGATATTTCCCATGCGGCTCTGAACGGGATCGCGAATTGTATTCGCAAC
CAAAGTGACCCGAATTGGCCAGTGTGTGAAGAAGGGTCAGATCCTTTTGCTCATGTTTAC
CCATCCGGGTTTGCTATTGGTCAATCAGCCGATCCACTGTCTTCATGGTTAGTCAACTCA
GCCCCGTTTATCCGCGATCAACTGAAGTTTCTGACACAAACCTACCCTGCTAAGGGTGGT
ATTTATTTCTCGGAATTTGGTTGGGCTGAAGACGCCGAATATGATCGTCAACTGCTGTAT
CAAATTACCTGGGATGGTCTGCGTACGCAATACCTGACGGACTATCTGAGCCAGCTGCTG
TTGGCTGTGCACAAAGACGGGATTAATCTGCGAGGCGCGCTGACGTGGAGTTTTGTCGAT
AATTGGGAGTGGGGTTTAGGGATGCAACAGAAATTCGGATTTCAGTTTGTTAATCAATCA
GATCCCGATCTGACACGCACGTTTAAACTGAGCGCTCACGCTTACGCCCAATTTGGGCGT
AATCATCTGCACCACCACCACCACCACTAA
SEQ ID NO.8
FP#3 aMF-rBHT-6XHIS
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTN
NGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA MMLHAALLVALPCVVLARPAGAVTYPGAIPL
SLTSNYETPSPTAIPLEPTPTATGTAELDALWNLVEAQYPVQTAAVTTLVTVPDDYKFEA
DPPSYALAGYETSEIAGLKFPKGFKFGVAGAAIQVEGAAKAEGRGPSTWDYLCHHYASTQ
CNNYDPDITTNHYYLYPLDFARLQHLGINTYSFSISWTRIYPLGAGYVNEAGLAHYDAVI
HSAKKYGLEPVGTVFHWDTPLSLMLKYGAWQDTGDQIVKDFVTYATTVFKRYGNEVKTWF
TFNEPRVFCSQNSGLPYNLTYPEGINSTSAVFRCTYNVLKAHGHAVKVYRDLVASGTIAA
GEIGFKSDDNYPIPARPGNADDEESAKRHEAFRIGIFAQPVYGNGDYPDVVKETVGDMLP
ALTDEDKGYIKGSGDIFAIDGYRTDISHAALNGIANCIRNQSDPNWPVCEEGSDPFAHVY
PSGFAIGQSADPLSSWLVNSAPFIRDQLKFLTQTYPAKGGIYFSEFGWAEDAEYDRQLLY
QITWDGLRTQYLTDYLSQLLLAVHKDGINLRGALTWSFVDNWEWGLGMQQKFGFQFVNQS
DPDLTRTFKLSAHAYAQFGRNHLHHHHHH
SEQ ID NO.9
FP#4 aMF-rBHT(XhoI-NotI)
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT
CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT
TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT
AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA
TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT ATGATGCTGCATGCTGCACTGCTAGTAGCGCTG
CCATGTGTTGTTTTGGCGCGCCCGGCCGGAGCGGTTACTTATCCGGGAGCCATTCCTCTG
TCCCTGACGAGCAATTACGAAACCCCAAGTCCGACAGCAATCCCGCTGGAGCCAACACCG
ACGGCTACCGGTACAGCAGAATTAGATGCGCTGTGGAACTTAGTCGAAGCTCAGTACCCA
GTTCAAACTGCTGCAGTGACAACTTTGGTGACAGTGCCCGATGATTATAAGTTTGAGGCA
GATCCACCGAGTTATGCATTAGCAGGGTATGAAACAAGCGAGATTGCCGGACTGAAGTTT
CCAAAGGGGTTTAAGTTTGGTGTTGCGGGGGCAGCCATTCAAGTTGAAGGTGCAGCAAAA
GCCGAAGGGCGGGGCCCAAGTACCTGGGATTATCTGTGTCATCACTATGCCAGCACGCAG
TGTAACAATTATGATCCCGATATTACAACCAACCATTACTACCTGTACCCATTGGACTTT
GCGCGCCTGCAACACCTAGGCATTAACACTTACTCGTTTTCAATTTCATGGACGCGTATT
TATCCATTGGGCGCAGGCTATGTTAATGAAGCAGGGTTAGCCCACTATGATGCCGTAATC
CATAGTGCCAAGAAGTATGGTCTGGAACCAGTGGGCACCGTTTTTCACTGGGATACGCCA
CTGTCTCTGATGCTGAAATACGGTGCCTGGCAAGATACTGGTGACCAAATTGTTAAGGAC
TTTGTTACCTATGCCACAACTGTGTTTAAGCGTTATGGTAATGAAGTCAAGACGTGGTTT
ACTTTCAATGAACCACGGGTTTTCTGTTCACAAAATAGTGGTCTGCCATACAATCTGACG
TATCCAGAAGGTATTAACAGCACCTCCGCTGTATTTCGTTGCACCTACAATGTTCTGAAA
GCTCATGGTCATGCTGTTAAAGTGTATCGGGATCTAGTTGCCTCCGGGACCATTGCGGCA
GGTGAAATCGGCTTTAAATCCGATGATAACTACCCAATCCCGGCCCGTCCAGGGAACGCC
GATGACGAGGAATCAGCCAAGCGTCACGAGGCTTTTCGCATTGGGATTTTTGCGCAACCG
GTTTATGGTAATGGCGATTATCCAGATGTTGTTAAAGAAACTGTTGGAGATATGCTGCCG
GCCCTGACGGATGAAGATAAAGGATACATTAAAGGTAGCGGAGATATTTTTGCGATTGAC
GGGTATCGTACCGATATTTCCCATGCGGCTCTGAACGGGATCGCGAATTGTATTCGCAAC
CAAAGTGACCCGAATTGGCCAGTGTGTGAAGAAGGGTCAGATCCTTTTGCTCATGTTTAC
CCATCCGGGTTTGCTATTGGTCAATCAGCCGATCCACTGTCTTCATGGTTAGTCAACTCA
GCCCCGTTTATCCGCGATCAACTGAAGTTTCTGACACAAACCTACCCTGCTAAGGGTGGT
ATTTATTTCTCGGAATTTGGTTGGGCTGAAGACGCCGAATATGATCGTCAACTGCTGTAT
CAAATTACCTGGGATGGTCTGCGTACGCAATACCTGACGGACTATCTGAGCCAGCTGCTG
TTGGCTGTGCACAAAGACGGGATTAATCTGCGAGGCGCGCTGACGTGGAGTTTTGTCGAT
AATTGGGAGTGGGGTTTAGGGATGCAACAGAAATTCGGATTTCAGTTTGTTAATCAATCA
GATCCCGATCTGACACGCACGTTTAAACTGAGCGCTCACGCTTACGCCCAATTTGGGCGT
AATCATCTGTAA
SEQ ID NO.10
FP#4 aMF-rBHT
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTN
NGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA MMLHAALLVALPCVVLARPAGAVTYPGAIPL
SLTSNYETPSPTAIPLEPTPTATGTAELDALWNLVEAQYPVQTAAVTTLVTVPDDYKFEA
DPPSYALAGYETSEIAGLKFPKGFKFGVAGAAIQVEGAAKAEGRGPSTWDYLCHHYASTQ
CNNYDPDITTNHYYLYPLDFARLQHLGINTYSFSISWTRIYPLGAGYVNEAGLAHYDAVI
HSAKKYGLEPVGTVFHWDTPLSLMLKYGAWQDTGDQIVKDFVTYATTVFKRYGNEVKTWF
TFNEPRVFCSQNSGLPYNLTYPEGINSTSAVFRCTYNVLKAHGHAVKVYRDLVASGTIAA
GEIGFKSDDNYPIPARPGNADDEESAKRHEAFRIGIFAQPVYGNGDYPDVVKETVGDMLP
ALTDEDKGYIKGSGDIFAIDGYRTDISHAALNGIANCIRNQSDPNWPVCEEGSDPFAHVY
PSGFAIGQSADPLSSWLVNSAPFIRDQLKFLTQTYPAKGGIYFSEFGWAEDAEYDRQLLY
QITWDGLRTQYLTDYLSQLLLAVHKDGINLRGALTWSFVDNWEWGLGMQQKFGFQFVNQS
DPDLTRTFKLSAHAYAQFGRNHL
SEQ ID NO.11
FP#5 aMF-rBHT(Δ1-22)-6XHIS(XhoI-NotI)
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT
CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT
TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT
AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA
TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT GTTACTTATCCGGGAGCCATTCCTCTGTCCCTG
ACGAGCAATTACGAAACCCCAAGTCCGACAGCAATCCCGCTGGAGCCAACACCGACGGCT
ACCGGTACAGCAGAATTAGATGCGCTGTGGAACTTAGTCGAAGCTCAGTACCCAGTTCAA
ACTGCTGCAGTGACAACTTTGGTGACAGTGCCCGATGATTATAAGTTTGAGGCAGATCCA
CCGAGTTATGCATTAGCAGGGTATGAAACAAGCGAGATTGCCGGACTGAAGTTTCCAAAG
GGGTTTAAGTTTGGTGTTGCGGGGGCAGCCATTCAAGTTGAAGGTGCAGCAAAAGCCGAA
GGGCGGGGCCCAAGTACCTGGGATTATCTGTGTCATCACTATGCCAGCACGCAGTGTAAC
AATTATGATCCCGATATTACAACCAACCATTACTACCTGTACCCATTGGACTTTGCGCGC
CTGCAACACCTAGGCATTAACACTTACTCGTTTTCAATTTCATGGACGCGTATTTATCCA
TTGGGCGCAGGCTATGTTAATGAAGCAGGGTTAGCCCACTATGATGCCGTAATCCATAGT
GCCAAGAAGTATGGTCTGGAACCAGTGGGCACCGTTTTTCACTGGGATACGCCACTGTCT
CTGATGCTGAAATACGGTGCCTGGCAAGATACTGGTGACCAAATTGTTAAGGACTTTGTT
ACCTATGCCACAACTGTGTTTAAGCGTTATGGTAATGAAGTCAAGACGTGGTTTACTTTC
AATGAACCACGGGTTTTCTGTTCACAAAATAGTGGTCTGCCATACAATCTGACGTATCCA
GAAGGTATTAACAGCACCTCCGCTGTATTTCGTTGCACCTACAATGTTCTGAAAGCTCAT
GGTCATGCTGTTAAAGTGTATCGGGATCTAGTTGCCTCCGGGACCATTGCGGCAGGTGAA
ATCGGCTTTAAATCCGATGATAACTACCCAATCCCGGCCCGTCCAGGGAACGCCGATGAC
GAGGAATCAGCCAAGCGTCACGAGGCTTTTCGCATTGGGATTTTTGCGCAACCGGTTTAT
GGTAATGGCGATTATCCAGATGTTGTTAAAGAAACTGTTGGAGATATGCTGCCGGCCCTG
ACGGATGAAGATAAAGGATACATTAAAGGTAGCGGAGATATTTTTGCGATTGACGGGTAT
CGTACCGATATTTCCCATGCGGCTCTGAACGGGATCGCGAATTGTATTCGCAACCAAAGT
GACCCGAATTGGCCAGTGTGTGAAGAAGGGTCAGATCCTTTTGCTCATGTTTACCCATCC
GGGTTTGCTATTGGTCAATCAGCCGATCCACTGTCTTCATGGTTAGTCAACTCAGCCCCG
TTTATCCGCGATCAACTGAAGTTTCTGACACAAACCTACCCTGCTAAGGGTGGTATTTAT
TTCTCGGAATTTGGTTGGGCTGAAGACGCCGAATATGATCGTCAACTGCTGTATCAAATT
ACCTGGGATGGTCTGCGTACGCAATACCTGACGGACTATCTGAGCCAGCTGCTGTTGGCT
GTGCACAAAGACGGGATTAATCTGCGAGGCGCGCTGACGTGGAGTTTTGTCGATAATTGG
GAGTGGGGTTTAGGGATGCAACAGAAATTCGGATTTCAGTTTGTTAATCAATCAGATCCC
GATCTGACACGCACGTTTAAACTGAGCGCTCACGCTTACGCCCAATTTGGGCGTAATCAT
CTGCACCACCACCACCACCACTAA
SEQ ID NO.12
FP#5 aMF-rBHT(Δ1-22)-6XHIS
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTN
NGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA VTYPGAIPLSLTSNYETPSPTAIPLEPTPTA
TGTAELDALWNLVEAQYPVQTAAVTTLVTVPDDYKFEADPPSYALAGYETSEIAGLKFPK
GFKFGVAGAAIQVEGAAKAEGRGPSTWDYLCHHYASTQCNNYDPDITTNHYYLYPLDFAR
LQHLGINTYSFSISWTRIYPLGAGYVNEAGLAHYDAVIHSAKKYGLEPVGTVFHWDTPLS
LMLKYGAWQDTGDQIVKDFVTYATTVFKRYGNEVKTWFTFNEPRVFCSQNSGLPYNLTYP
EGINSTSAVFRCTYNVLKAHGHAVKVYRDLVASGTIAAGEIGFKSDDNYPIPARPGNADD
EESAKRHEAFRIGIFAQPVYGNGDYPDVVKETVGDMLPALTDEDKGYIKGSGDIFAIDGY
RTDISHAALNGIANCIRNQSDPNWPVCEEGSDPFAHVYPSGFAIGQSADPLSSWLVNSAP
FIRDQLKFLTQTYPAKGGIYFSEFGWAEDAEYDRQLLYQITWDGLRTQYLTDYLSQLLLA
VHKDGINLRGALTWSFVDNWEWGLGMQQKFGFQFVNQSDPDLTRTFKLSAHAYAQFGRNH
LHHHHHH
SEQ ID NO.13
FP#6 aMF-rBHT(Δ1-22)(XhoI-NotI)
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT
CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT
TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT
AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA
TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT GTTACTTATCCGGGAGCCATTCCTCTGTCCCTG
ACGAGCAATTACGAAACCCCAAGTCCGACAGCAATCCCGCTGGAGCCAACACCGACGGCT
ACCGGTACAGCAGAATTAGATGCGCTGTGGAACTTAGTCGAAGCTCAGTACCCAGTTCAA
ACTGCTGCAGTGACAACTTTGGTGACAGTGCCCGATGATTATAAGTTTGAGGCAGATCCA
CCGAGTTATGCATTAGCAGGGTATGAAACAAGCGAGATTGCCGGACTGAAGTTTCCAAAG
GGGTTTAAGTTTGGTGTTGCGGGGGCAGCCATTCAAGTTGAAGGTGCAGCAAAAGCCGAA
GGGCGGGGCCCAAGTACCTGGGATTATCTGTGTCATCACTATGCCAGCACGCAGTGTAAC
AATTATGATCCCGATATTACAACCAACCATTACTACCTGTACCCATTGGACTTTGCGCGC
CTGCAACACCTAGGCATTAACACTTACTCGTTTTCAATTTCATGGACGCGTATTTATCCA
TTGGGCGCAGGCTATGTTAATGAAGCAGGGTTAGCCCACTATGATGCCGTAATCCATAGT
GCCAAGAAGTATGGTCTGGAACCAGTGGGCACCGTTTTTCACTGGGATACGCCACTGTCT
CTGATGCTGAAATACGGTGCCTGGCAAGATACTGGTGACCAAATTGTTAAGGACTTTGTT
ACCTATGCCACAACTGTGTTTAAGCGTTATGGTAATGAAGTCAAGACGTGGTTTACTTTC
AATGAACCACGGGTTTTCTGTTCACAAAATAGTGGTCTGCCATACAATCTGACGTATCCA
GAAGGTATTAACAGCACCTCCGCTGTATTTCGTTGCACCTACAATGTTCTGAAAGCTCAT
GGTCATGCTGTTAAAGTGTATCGGGATCTAGTTGCCTCCGGGACCATTGCGGCAGGTGAA
ATCGGCTTTAAATCCGATGATAACTACCCAATCCCGGCCCGTCCAGGGAACGCCGATGAC
GAGGAATCAGCCAAGCGTCACGAGGCTTTTCGCATTGGGATTTTTGCGCAACCGGTTTAT
GGTAATGGCGATTATCCAGATGTTGTTAAAGAAACTGTTGGAGATATGCTGCCGGCCCTG
ACGGATGAAGATAAAGGATACATTAAAGGTAGCGGAGATATTTTTGCGATTGACGGGTAT
CGTACCGATATTTCCCATGCGGCTCTGAACGGGATCGCGAATTGTATTCGCAACCAAAGT
GACCCGAATTGGCCAGTGTGTGAAGAAGGGTCAGATCCTTTTGCTCATGTTTACCCATCC
GGGTTTGCTATTGGTCAATCAGCCGATCCACTGTCTTCATGGTTAGTCAACTCAGCCCCG
TTTATCCGCGATCAACTGAAGTTTCTGACACAAACCTACCCTGCTAAGGGTGGTATTTAT
TTCTCGGAATTTGGTTGGGCTGAAGACGCCGAATATGATCGTCAACTGCTGTATCAAATT
ACCTGGGATGGTCTGCGTACGCAATACCTGACGGACTATCTGAGCCAGCTGCTGTTGGCT
GTGCACAAAGACGGGATTAATCTGCGAGGCGCGCTGACGTGGAGTTTTGTCGATAATTGG
GAGTGGGGTTTAGGGATGCAACAGAAATTCGGATTTCAGTTTGTTAATCAATCAGATCCC
GATCTGACACGCACGTTTAAACTGAGCGCTCACGCTTACGCCCAATTTGGGCGTAATCAT
CTGTAA
SEQ ID NO.14
FP#6 aMF-rBHT(Δ1-22)
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTN
NGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA VTYPGAIPLSLTSNYETPSPTAIPLEPTPTA
TGTAELDALWNLVEAQYPVQTAAVTTLVTVPDDYKFEADPPSYALAGYETSEIAGLKFPK
GFKFGVAGAAIQVEGAAKAEGRGPSTWDYLCHHYASTQCNNYDPDITTNHYYLYPLDFAR
LQHLGINTYSFSISWTRIYPLGAGYVNEAGLAHYDAVIHSAKKYGLEPVGTVFHWDTPLS
LMLKYGAWQDTGDQIVKDFVTYATTVFKRYGNEVKTWFTFNEPRVFCSQNSGLPYNLTYP
EGINSTSAVFRCTYNVLKAHGHAVKVYRDLVASGTIAAGEIGFKSDDNYPIPARPGNADD
EESAKRHEAFRIGIFAQPVYGNGDYPDVVKETVGDMLPALTDEDKGYIKGSGDIFAIDGY
RTDISHAALNGIANCIRNQSDPNWPVCEEGSDPFAHVYPSGFAIGQSADPLSSWLVNSAP
FIRDQLKFLTQTYPAKGGIYFSEFGWAEDAEYDRQLLYQITWDGLRTQYLTDYLSQLLLA
VHKDGINLRGALTWSFVDNWEWGLGMQQKFGFQFVNQSDPDLTRTFKLSAHAYAQFGRNH
L
Seq.ID No.15
FP#7 rBHT-6XHIS(BamHI-NotI)
ATGATGCTGCATGCTGCACTGCTAGTAGCGCTGCCATGTGTTGTTTTGGCGCGCCCGGCC
GGAGCGGTTACTTATCCGGGAGCCATTCCTCTGTCCCTGACGAGCAATTACGAAACCCCA
AGTCCGACAGCAATCCCGCTGGAGCCAACACCGACGGCTACCGGTACAGCAGAATTAGAT
GCGCTGTGGAACTTAGTCGAAGCTCAGTACCCAGTTCAAACTGCTGCAGTGACAACTTTG
GTGACAGTGCCCGATGATTATAAGTTTGAGGCAGATCCACCGAGTTATGCATTAGCAGGG
TATGAAACAAGCGAGATTGCCGGACTGAAGTTTCCAAAGGGGTTTAAGTTTGGTGTTGCG
GGGGCAGCCATTCAAGTTGAAGGTGCAGCAAAAGCCGAAGGGCGGGGCCCAAGTACCTGG
GATTATCTGTGTCATCACTATGCCAGCACGCAGTGTAACAATTATGATCCCGATATTACA
ACCAACCATTACTACCTGTACCCATTGGACTTTGCGCGCCTGCAACACCTAGGCATTAAC
ACTTACTCGTTTTCAATTTCATGGACGCGTATTTATCCATTGGGCGCAGGCTATGTTAAT
GAAGCAGGGTTAGCCCACTATGATGCCGTAATCCATAGTGCCAAGAAGTATGGTCTGGAA
CCAGTGGGCACCGTTTTTCACTGGGATACGCCACTGTCTCTGATGCTGAAATACGGTGCC
TGGCAAGATACTGGTGACCAAATTGTTAAGGACTTTGTTACCTATGCCACAACTGTGTTT
AAGCGTTATGGTAATGAAGTCAAGACGTGGTTTACTTTCAATGAACCACGGGTTTTCTGT
TCACAAAATAGTGGTCTGCCATACAATCTGACGTATCCAGAAGGTATTAACAGCACCTCC
GCTGTATTTCGTTGCACCTACAATGTTCTGAAAGCTCATGGTCATGCTGTTAAAGTGTAT
CGGGATCTAGTTGCCTCCGGGACCATTGCGGCAGGTGAAATCGGCTTTAAATCCGATGAT
AACTACCCAATCCCGGCCCGTCCAGGGAACGCCGATGACGAGGAATCAGCCAAGCGTCAC
GAGGCTTTTCGCATTGGGATTTTTGCGCAACCGGTTTATGGTAATGGCGATTATCCAGAT
GTTGTTAAAGAAACTGTTGGAGATATGCTGCCGGCCCTGACGGATGAAGATAAAGGATAC
ATTAAAGGTAGCGGAGATATTTTTGCGATTGACGGGTATCGTACCGATATTTCCCATGCG
GCTCTGAACGGGATCGCGAATTGTATTCGCAACCAAAGTGACCCGAATTGGCCAGTGTGT
GAAGAAGGGTCAGATCCTTTTGCTCATGTTTACCCATCCGGGTTTGCTATTGGTCAATCA
GCCGATCCACTGTCTTCATGGTTAGTCAACTCAGCCCCGTTTATCCGCGATCAACTGAAG
TTTCTGACACAAACCTACCCTGCTAAGGGTGGTATTTATTTCTCGGAATTTGGTTGGGCT
GAAGACGCCGAATATGATCGTCAACTGCTGTATCAAATTACCTGGGATGGTCTGCGTACG
CAATACCTGACGGACTATCTGAGCCAGCTGCTGTTGGCTGTGCACAAAGACGGGATTAAT
CTGCGAGGCGCGCTGACGTGGAGTTTTGTCGATAATTGGGAGTGGGGTTTAGGGATGCAA
CAGAAATTCGGATTTCAGTTTGTTAATCAATCAGATCCCGATCTGACACGCACGTTTAAA
CTGAGCGCTCACGCTTACGCCCAATTTGGGCGTAATCATCTGCACCACCACCACCACCAC
TAA
SEQ ID NO.16
FP#7 rBHT-6XHIS
MMLHAALLVALPCVVLARPAGAVTYPGAIPLSLTSNYETPSPTAIPLEPTPTATGTAELD
ALWNLVEAQYPVQTAAVTTLVTVPDDYKFEADPPSYALAGYETSEIAGLKFPKGFKFGVA
GAAIQVEGAAKAEGRGPSTWDYLCHHYASTQCNNYDPDITTNHYYLYPLDFARLQHLGIN
TYSFSISWTRIYPLGAGYVNEAGLAHYDAVIHSAKKYGLEPVGTVFHWDTPLSLMLKYGA
WQDTGDQIVKDFVTYATTVFKRYGNEVKTWFTFNEPRVFCSQNSGLPYNLTYPEGINSTS
AVFRCTYNVLKAHGHAVKVYRDLVASGTIAAGEIGFKSDDNYPIPARPGNADDEESAKRH
EAFRIGIFAQPVYGNGDYPDVVKETVGDMLPALTDEDKGYIKGSGDIFAIDGYRTDISHA
ALNGIANCIRNQSDPNWPVCEEGSDPFAHVYPSGFAIGQSADPLSSWLVNSAPFIRDQLK
FLTQTYPAKGGIYFSEFGWAEDAEYDRQLLYQITWDGLRTQYLTDYLSQLLLAVHKDGIN
LRGALTWSFVDNWEWGLGMQQKFGFQFVNQSDPDLTRTFKLSAHAYAQFGRNHLHHHHHH
SEQ ID NO.17
FP#8 rBHT(Δ1-22)-6XHIS(BamHI-NotI)
ATGGTTACTTATCCGGGAGCCATTCCTCTGTCCCTGACGAGCAATTACGAAACCCCAAGT
CCGACAGCAATCCCGCTGGAGCCAACACCGACGGCTACCGGTACAGCAGAATTAGATGCG
CTGTGGAACTTAGTCGAAGCTCAGTACCCAGTTCAAACTGCTGCAGTGACAACTTTGGTG
ACAGTGCCCGATGATTATAAGTTTGAGGCAGATCCACCGAGTTATGCATTAGCAGGGTAT
GAAACAAGCGAGATTGCCGGACTGAAGTTTCCAAAGGGGTTTAAGTTTGGTGTTGCGGGG
GCAGCCATTCAAGTTGAAGGTGCAGCAAAAGCCGAAGGGCGGGGCCCAAGTACCTGGGAT
TATCTGTGTCATCACTATGCCAGCACGCAGTGTAACAATTATGATCCCGATATTACAACC
AACCATTACTACCTGTACCCATTGGACTTTGCGCGCCTGCAACACCTAGGCATTAACACT
TACTCGTTTTCAATTTCATGGACGCGTATTTATCCATTGGGCGCAGGCTATGTTAATGAA
GCAGGGTTAGCCCACTATGATGCCGTAATCCATAGTGCCAAGAAGTATGGTCTGGAACCA
GTGGGCACCGTTTTTCACTGGGATACGCCACTGTCTCTGATGCTGAAATACGGTGCCTGG
CAAGATACTGGTGACCAAATTGTTAAGGACTTTGTTACCTATGCCACAACTGTGTTTAAG
CGTTATGGTAATGAAGTCAAGACGTGGTTTACTTTCAATGAACCACGGGTTTTCTGTTCA
CAAAATAGTGGTCTGCCATACAATCTGACGTATCCAGAAGGTATTAACAGCACCTCCGCT
GTATTTCGTTGCACCTACAATGTTCTGAAAGCTCATGGTCATGCTGTTAAAGTGTATCGG
GATCTAGTTGCCTCCGGGACCATTGCGGCAGGTGAAATCGGCTTTAAATCCGATGATAAC
TACCCAATCCCGGCCCGTCCAGGGAACGCCGATGACGAGGAATCAGCCAAGCGTCACGAG
GCTTTTCGCATTGGGATTTTTGCGCAACCGGTTTATGGTAATGGCGATTATCCAGATGTT
GTTAAAGAAACTGTTGGAGATATGCTGCCGGCCCTGACGGATGAAGATAAAGGATACATT
AAAGGTAGCGGAGATATTTTTGCGATTGACGGGTATCGTACCGATATTTCCCATGCGGCT
CTGAACGGGATCGCGAATTGTATTCGCAACCAAAGTGACCCGAATTGGCCAGTGTGTGAA
GAAGGGTCAGATCCTTTTGCTCATGTTTACCCATCCGGGTTTGCTATTGGTCAATCAGCC
GATCCACTGTCTTCATGGTTAGTCAACTCAGCCCCGTTTATCCGCGATCAACTGAAGTTT
CTGACACAAACCTACCCTGCTAAGGGTGGTATTTATTTCTCGGAATTTGGTTGGGCTGAA
GACGCCGAATATGATCGTCAACTGCTGTATCAAATTACCTGGGATGGTCTGCGTACGCAA
TACCTGACGGACTATCTGAGCCAGCTGCTGTTGGCTGTGCACAAAGACGGGATTAATCTG
CGAGGCGCGCTGACGTGGAGTTTTGTCGATAATTGGGAGTGGGGTTTAGGGATGCAACAG
AAATTCGGATTTCAGTTTGTTAATCAATCAGATCCCGATCTGACACGCACGTTTAAACTG
AGCGCTCACGCTTACGCCCAATTTGGGCGTAATCATCTGCACCACCACCACCACCACTAA
SEQ ID NO.18
FP#8 rBHT(Δ1-22)-6XHIS
MVTYPGAIPLSLTSNYETPSPTAIPLEPTPTATGTAELDALWNLVEAQYPVQTAAVTTLV
TVPDDYKFEADPPSYALAGYETSEIAGLKFPKGFKFGVAGAAIQVEGAAKAEGRGPSTWD
YLCHHYASTQCNNYDPDITTNHYYLYPLDFARLQHLGINTYSFSISWTRIYPLGAGYVNE
AGLAHYDAVIHSAKKYGLEPVGTVFHWDTPLSLMLKYGAWQDTGDQIVKDFVTYATTVFK
RYGNEVKTWFTFNEPRVFCSQNSGLPYNLTYPEGINSTSAVFRCTYNVLKAHGHAVKVYR
DLVASGTIAAGEIGFKSDDNYPIPARPGNADDEESAKRHEAFRIGIFAQPVYGNGDYPDV
VKETVGDMLPALTDEDKGYIKGSGDIFAIDGYRTDISHAALNGIANCIRNQSDPNWPVCE
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DAEYDRQLLYQITWDGLRTQYLTDYLSQLLLAVHKDGINLRGALTWSFVDNWEWGLGMQQ
KFGFQFVNQSDPDLTRTFKLSAHAYAQFGRNHLHHHHHH
SEQ ID NO.19
FP#9 aMF-rBHT(Δ1-110)-6XHIS(EcoRI-NotI)
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT
CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT
TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT
AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA
TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTC ATGTTTCCAAAGGGGTTTAAG
TTTGGTGTTGCGGGGGCAGCCATTCAAGTTGAAGGTGCAGCAAAAGCCGAAGGGCGGGGC
CCAAGTACCTGGGATTATCTGTGTCATCACTATGCCAGCACGCAGTGTAACAATTATGAT
CCCGATATTACAACCAACCATTACTACCTGTACCCATTGGACTTTGCGCGCCTGCAACAC
CTAGGCATTAACACTTACTCGTTTTCAATTTCATGGACGCGTATTTATCCATTGGGCGCA
GGCTATGTTAATGAAGCAGGGTTAGCCCACTATGATGCCGTAATCCATAGTGCCAAGAAG
TATGGTCTGGAACCAGTGGGCACCGTTTTTCACTGGGATACGCCACTGTCTCTGATGCTG
AAATACGGTGCCTGGCAAGATACTGGTGACCAAATTGTTAAGGACTTTGTTACCTATGCC
ACAACTGTGTTTAAGCGTTATGGTAATGAAGTCAAGACGTGGTTTACTTTCAATGAACCA
CGGGTTTTCTGTTCACAAAATAGTGGTCTGCCATACAATCTGACGTATCCAGAAGGTATT
AACAGCACCTCCGCTGTATTTCGTTGCACCTACAATGTTCTGAAAGCTCATGGTCATGCT
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AAATCCGATGATAACTACCCAATCCCGGCCCGTCCAGGGAACGCCGATGACGAGGAATCA
GCCAAGCGTCACGAGGCTTTTCGCATTGGGATTTTTGCGCAACCGGTTTATGGTAATGGC
GATTATCCAGATGTTGTTAAAGAAACTGTTGGAGATATGCTGCCGGCCCTGACGGATGAA
GATAAAGGATACATTAAAGGTAGCGGAGATATTTTTGCGATTGACGGGTATCGTACCGAT
ATTTCCCATGCGGCTCTGAACGGGATCGCGAATTGTATTCGCAACCAAAGTGACCCGAAT
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ATTGGTCAATCAGCCGATCCACTGTCTTCATGGTTAGTCAACTCAGCCCCGTTTATCCGC
GATCAACTGAAGTTTCTGACACAAACCTACCCTGCTAAGGGTGGTATTTATTTCTCGGAA
TTTGGTTGGGCTGAAGACGCCGAATATGATCGTCAACTGCTGTATCAAATTACCTGGGAT
GGTCTGCGTACGCAATACCTGACGGACTATCTGAGCCAGCTGCTGTTGGCTGTGCACAAA
GACGGGATTAATCTGCGAGGCGCGCTGACGTGGAGTTTTGTCGATAATTGGGAGTGGGGT
TTAGGGATGCAACAGAAATTCGGATTTCAGTTTGTTAATCAATCAGATCCCGATCTGACA
CGCACGTTTAAACTGAGCGCTCACGCTTACGCCCAATTTGGGCGTAATCATCTGCACCAC
CACCACCACCACTAA
SEQ ID NO.20
FP#9 aMF-rBHT(Δ1-110)-6XHIS
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTN
NGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAYVEF MFPKGFKFGVAGAAIQVEGAAKAEGRG
PSTWDYLCHHYASTQCNNYDPDITTNHYYLYPLDFARLQHLGINTYSFSISWTRIYPLGA
GYVNEAGLAHYDAVIHSAKKYGLEPVGTVFHWDTPLSLMLKYGAWQDTGDQIVKDFVTYA
TTVFKRYGNEVKTWFTFNEPRVFCSQNSGLPYNLTYPEGINSTSAVFRCTYNVLKAHGHA
VKVYRDLVASGTIAAGEIGFKSDDNYPIPARPGNADDEESAKRHEAFRIGIFAQPVYGNG
DYPDVVKETVGDMLPALTDEDKGYIKGSGDIFAIDGYRTDISHAALNGIANCIRNQSDPN
WPVCEEGSDPFAHVYPSGFAIGQSADPLSSWLVNSAPFIRDQLKFLTQTYPAKGGIYFSE
FGWAEDAEYDRQLLYQITWDGLRTQYLTDYLSQLLLAVHKDGINLRGALTWSFVDNWEWG
LGMQQKFGFQFVNQSDPDLTRTFKLSAHAYAQFGRNHLHHHHHH

Claims (28)

1.编码由SEQ ID NO.12或14中列出的氨基酸序列表示的重组β-己糖基-转移酶(rBHT)蛋白的分离的DNA。
2.根据权利要求1所述的编码重组β-己糖基-转移酶(rBHT)蛋白的分离的DNA，其中，所述DNA具有SEQ ID NO.11或13中列出的核酸序列。
3.酶活性重组β-己糖基-转移酶(rBHT)蛋白，其中，所述蛋白由SEQ ID NO.12或14中列出的氨基酸序列表示。
4.根据权利要求3所述的酶活性rBHT蛋白，其中，所述蛋白是膜结合的。
5.根据权利要求3所述的酶活性rBHT蛋白，其中，所述蛋白是可溶性酶。
6.用于在酵母宿主细胞中产生酶活性重组β-己糖基-转移酶(rBHT)蛋白的方法，包括用在适合的启动子的控制下的质粒转化所述酵母宿主细胞，其中，所述质粒含有编码根据权利要求1至2中任一项所述的rBHT蛋白的分离的DNA。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述适合的启动子为乙醇氧化酶启动子。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述酶活性rBHT蛋白在20℃具有8U.mg-1的比活性。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述酵母细胞为毕赤酵母。
10.用于生产低聚半乳糖(GOS)的方法，包括在适合的条件下使乳糖与根据权利要求6至9中任一项所述的方法获得的酶活性重组β-己糖基-转移酶(rBHT)蛋白反应，以产生GOS。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述酶活性rBHT蛋白被固定在固体支持物上。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述GOS在分批或连续的搅拌罐式反应器、填充床反应器或超滤膜反应器中产生。
13.根据权利要求10所述的方法，进一步包括作为葡萄糖清除系统的通常被认为GRAS安全的生物体以避免竞争性葡萄糖抑制。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述葡萄糖清除系统与所述酶活性rBHT蛋白同时使用。
15.改良的含乳糖的食品或食品副产物，包含由SEQ ID NO.12或14中列出的氨基酸序列表示的重组β-己糖基-转移酶(rBHT)蛋白。
16.根据权利要求15所述的含乳糖食品或食品副产物，其中，所述食品或食品副产物是乳制品或副产物。
17.根据权利要求15所述的含乳糖食品或食品副产物，其中，所述食品或食品副产物是婴儿配方食品。
18.根据权利要求15所述的含乳糖食品或食品副产物，其中，所述食品或食品副产物是婴幼儿甜点、婴幼儿果汁、婴幼儿零食、婴幼儿酸奶饮品、婴儿代餐饮品。
19.根据权利要求15所述的含乳糖食品或食品副产物，其中，所述食品或食品副产物是冷冻含乳甜品或酸奶。
20.根据权利要求15所述的含乳糖食品或食品副产物，其中，所述食品或食品副产物是乳品。
21.根据权利要求15所述的含乳糖食品或食品副产物，其中，所述食品或食品副产物是代餐饮品、乳替代品或为乳品增加风味的糖浆。
22.根据权利要求15所述的含乳糖食品或食品副产物，其中，所述食品或食品副产物是健身饮用水或解渴饮品。
23.根据权利要求15所述的含乳糖食品或食品副产物，其中，所述食品或食品副产物是维生素和/或矿物质强化的果味饮料。
24.根据权利要求15所述的含乳糖食品或食品副产物，其中，所述食品或食品副产物是能量饮料。
25.根据权利要求15所述的含乳糖食品或食品副产物，其中，所述食品或食品副产物是水果制品。
26.根据权利要求15所述的含乳糖食品或食品副产物，其中，所述食品或食品副产物是水果派馅料或果酱。
27.根据权利要求15所述的含乳糖食品或食品副产物，其中，所述食品或食品副产物是乳基饮料。
28.根据权利要求15所述的含乳糖食品或食品副产物，其中，所述食品或食品副产物是乳清。
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