JP2023526655A - ヒトミルクオリゴ糖を産生するための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の産生に関連する組成物及び方法を提供する。特に、本開示は、ラクトース及びＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を、新規のβ－ヘキソシルトランスフェラーゼ（ＢＨＴ）酵素を使用して、Ｎ－アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）に富むガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）組成物に変換するための組成物及び方法を提供する。

Description

発明の詳細な説明

〔技術分野〕
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月１９日出願の米国仮特許出願第６３／０２６，７７６号、及び２０２０年５月２６日出願の米国仮特許出願第６３／０３０，０５４号に対する優先権及び利益を主張するものであり、これらの仮出願は、いずれも、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書にその全体が参照により組み込まれるのは、本明細書と同時に提出され、以下のように識別されるコンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列表である：１７，８８６バイトＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル名「３８３８９－６０１＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５」作成日２０２１年５月１８日。

技術分野
本開示は、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の産生に関連する組成物及び方法を提供する。特に、本開示は、ラクトース及びＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を、新規のβ－ヘキソシルトランスフェラーゼ（ＢＨＴ）酵素を使用して、Ｎ－アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）に富むガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）組成物に変換するための組成物及び方法を提供する。

〔背景技術〕
食事、正常な腸内微生物相、及び健康の複雑な相互作用は、ヒトの胃腸管への有益な微生物の選択的増殖を促進するための戦略の開発を助長している。プロバイオティクスとは、強力な抗病原性及び抗炎症性に起因する、ヒトの健康にプラスの影響を与える微生物である。

また、何年にもわたるプロバイオティクス研究は、選択的プレバイオティクスが食事に存在することによって、腸内微生物相及びそれに関連する生化学的活動の選択的改変を促進できることを示している。幼児または成人の食事に加えられるプレバイオティクスは、アレルギー、乳糖不耐症の症状などの疾患、及び食物過敏症の予防に関与する。プレバイオティクスは、二重の能力を有する難消化性オリゴ糖（ＮＤＯ）である。第一に、それらは有害な細菌の腸内コロニー形成効率を低下させ、第二に、成長を促進するための選択的基質として作用し、それによって特定のプロバイオティクス細菌の数を増加させる。さらに、プロバイオティクスは、プレバイオティクスと組み合わせたときに、最善な働きをすることを示す研究が増えている。

ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）は、プレバイオティクスの好ましい選択肢のうちの１つと考えられており、胃腸管では、ＧＯＳは酵素に耐性があり、消化されることなく、小腸を通過するが、大腸では、ＧＯＳが発酵し、腸内ビフィズス菌、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ属、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ及びＬ．ｃａｓｅｉの成長を促進し、プレバイオティクスとして作用する。ＧＯＳは、そのアノマーＣ原子（Ｃ_１またはＣ_２）のコンフォメーションにより非消化性オリゴ糖であり、そのグリコシド結合により、胃または小腸中の消化酵素による加水分解が回避され得る。遊離オリゴ糖は、すべての有胎盤哺乳動物の乳中に見られ、乳児期中のプレバイオティクス摂食の天然な例を提供する。ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の組成は、非常に複雑であるため、類似組成のオリゴ糖を含む代替的供給源を見つけることはほとんどない。母乳で育てられた乳児の結腸の健康状態の改善は、母乳中のＧＯＳの存在に起因している。実際に、ＧＯＳを添加した乳児用調製粉乳では、結腸微生物相の代謝活性及び細菌数に関して、ヒトミルクのビフィズス菌効果（ｂｉｆｉｄｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）が再現された。非乳オリゴ糖の中でも、ＧＯＳは、その構造がＨＭＯのコア分子に類似しているため、特に注目されている。しかし、ＧＯＳの濃度及び組成は、その生成に使用される方法及び酵素によって異なり、それがプレバイオティクス効果及び結腸プロバイオティクス株の増殖に影響を与え得る。従来、ＧＯＳは、中温性または好熱性微生物のβ－ガラクトシダーゼを使用して産生されてきた。β－ガラクトシダーゼは、反応をラクトース加水分解から離れて、ＧＯＳ合成に向かわせるように駆動させるために、高い初期濃度のラクトースを必要とする。ラクトースは、高温時に溶解性が高いため、高い初期速度及び半減期の増長を呈する熱安定性β－ガラクトシダーゼが、トランスガラクトシル化反応の好ましい平衡に到達するために利用されてきた。しかし、グルコース及び／またはガラクトースによる競合阻害は、残存して、反応に細胞を組み込むことによって克服され得る別の障害である。

担子菌酵母Ｈａｍａｍｏｔｏａ（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ（以前のＢｕｌｌｅｒａ ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）は、ガラクトースを利用して成長することはできないが、β－ヘキソシルトランスフェラーゼ（ＢＨＴ、ＥＣ３．２．１．２１）の活性により、ラクトース上で増殖する。複数の研究において、ＢＨＴは、ラクトース濃度が低く、ラクトース加水分解が非常に限られていても、トランスガラクトシル化を有することが示されている。さらに、この酵素は２０％を超えるラクトース濃度によって阻害されるとは考えられず、理論上の最大値７５％に近いＧＯＳに変換される可能性を有する。β－ガラクトシダーゼとは異なり、Ｈａｍａｍｏｔｏａ（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ由来のＢＨＴは、グリコシルヒドロラーゼ及びβ－ヘキソシルトランスフェラーゼ活性を同時に実行し、ガラクトースの細胞外蓄積なく、ラクトースをＧＯＳに変換する。トランスガラクトシル化反応には、ラクトースの２つの分子が必要であり、１つ目の分子は、加水分解され、２つ目の分子は、ガラクトースアクセプターとして機能し、三糖ガラクトシルラクトースβ－Ｄ－Ｇａｌ（１－４）－β－Ｄ－Ｇａｌ（１－４）－β－Ｄ－Ｇｌｃ）及び残留グルコースとなる。ガラクトシル－ラクトースは、新しいガラクトースのアクセプターとしても作用し、四糖ガラクトシルガラクトシル－ラクトース（β－Ｄ－Ｇａｌ（１－４）－β－Ｄ－Ｇａｌ（１－４）－β－Ｄ－Ｇａｌ（１－４）－β－Ｄ－Ｇｌｃ）、及び五糖以降も同様に生成する。Ｈ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓに蓄積する三糖、四糖、及び五糖は、まとめてＧＯＳと称されている。

実際的な利益のために、組換え分泌型ＢＨＴは、大規模産生及び精製の改善など、ネイティブ酵素よりもいくつかの利点を有し得る。現在、Ｈａｍａｍｏｔｏａ（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ由来の活性酵素の精製には、細胞溶解及びその後の複数のクロマトグラフィーステップを必要とする。大腸菌ＢＬ２１中で、組換えβ－ヘキソシル－トランスフェラーゼを発現させる以前の試みでは、高レベルの生産をもたらしたが、酵素は不活性かつ不溶性であった。

〔発明の概要〕
本開示の実施形態は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性、及び配列番号１に関して少なくとも１つのアミノ酸のＮ末端短縮型を含む、機能的組換えβ－ヘキソシル－トランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）ポリペプチドを含む。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１つの追加のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、約１～約８１アミノ酸長であるＮ末端短縮を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端短縮型は、約１～約５６アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３、５、７、及び９のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を含む。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、シグナル配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、非天然である。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、酵母タンパク質に由来するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ（Ｐｉｃｈｉａ）ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ（Ｏｇａｔａｅａ）ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓのいずれか１つに由来するタンパク質に由来するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα接合因子シグナル配列（ＭＦα）（配列番号２９）、インベルターゼ（ＩＶ）シグナル配列（配列番号３０）、グルコアミラーゼ（ＧＡ）シグナル配列（配列番号３１）、またはイヌリナーゼ（ＩＮ）シグナル配列（配列番号３２）のうちの少なくとも１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、または７０のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１に対して、２８９位、２９７位、４３１位、及び／または５６９位に少なくとも１つのアスパラギン残基を含む。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、可溶性または膜結合性である。いくつかの実施形態では、約１％～約５０％のポリペプチドが可溶性である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ラクトースβ－（１－４）グリコシド連結の加水分解を触媒する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドによるラクトースβ－（１－４）グリコシド連結の加水分解の触媒は、ＬａｃＮＡｃに富むＧＯＳを含む組成物を生成する。

本開示の実施形態は、上記のポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子も含む。本開示の実施形態は、これらの核酸分子のいずれか１つを含むベクターも含む。

本開示の実施形態はまた、上記のポリペプチドのいずれかを使用して、宿主細胞においてラクトースからＧＯＳ組成物を生成する方法を含む。いくつかの実施形態では、ＧＯＳ組成物は、ＬａｃＮＡｃに富むＧＯＳ及び／またはＧｌｃＮＡｃ非含有ＧＯＳを含む。

本方法のいくつかの一実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または藻類細胞のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、宿主細胞には、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属由来の任意の細胞が含まれる。

本方法のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ （Ｐｉｃｈｉａ） ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ （Ｏｇａｔａｅａ） ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来の１つ以上の細胞を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、最初のラクトース濃度の少なくとも１０％及び最初のラクトース濃度の少なくとも５０％の総ＧＯＳ濃度のＬａｃＮＡｃに富むＧＯＳ収量を生成する。

本開示の実施形態はまた、上記のポリペプチドのいずれかを含む組成物、及び／または上記のポリペプチドのいずれかを使用する１つ以上のＬａｃＮＡｃに富むＧＯＳを含む組成物を含む。

いくつかの実施形態では、組成物は食品である。いくつかの実施形態では、食品は、乳児用調製粉乳、ヨーグルト、乳製品、乳ベース飲料、フルーツ飲料、水分補給飲料、エネルギー飲料、フルーツ調製物、及びミールリプレイスメント飲料のうちの１つ以上を含む。

本開示の他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明に照らして明らかになるであろう。

〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕Ｈ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ由来のβ－ヘキソシルトランスフェラーゼの予測される構造翻訳後修飾及び無秩序二次モチーフ対秩序二次モチーフを示す図である。ＢＨＴタンパク質のグリコシル化、リン酸化、及び二次構造は、様々なアルゴリズムを使用して予測した。記述しているのは、ＰＳＩＰＲＥＤ及びＧｌｏｂｐｌｏｔＧｌｏｂｕｌａｒ予測ツールを使用したＢＨＴの構造エレメント、保存領域、及び機能ドメインである。無秩序領域は、Ｐｈｙｒｅ２、ＩＵＰＲＥＤ２Ａ、ＤＩＳＯＰＲＥＤ３、ＧｌｏｂｐｌｏｔＤｉｓｏｒｄｅｒ、及びＰＯＮＤＲアルゴリズムを使用して予測した。リン酸化サーバーＤｉｓＰｈｏｓ１．３及びＮｅｔＰｈｏｓＹｅａｓｔ１．０は、リン酸化部位を示す。ＧｌｙｃｏＥＰは、Ｎ－グリコシル化（赤い線）及びＯ－グリコシル化（黒い線）を示すが、Ｃ－マンノシル化部位は予測されなかった。各予測線の下の数字は、ＢＨＴアミノ酸残基番号を示す。

〔図２〕図２Ａ：ｒＢＨＴバリアントの酵素活性比較は、ＡＯＸ１プロモーター制御下で、ｒＢｈｔ－ＨＩＳの短縮型バリアントを保持する組換えＫ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株によって生成された分泌可溶性タンパク質量（最終培養物（ＯＤ_{６００ｎｍ}）について正規化）である。（Ａ）リーダードメインとｒＢｈｔバリアントの ＯＲＦとの組み合わせを含む生成されたキメラ遺伝子のグラフにより図示したものである。特定のタグ、突然変異、及び欠失が示されている。図２Ｂ：ｒＢＨＴバリアントの酵素活性比較は、ＡＯＸ１プロモーター制御下で、ｒＢｈｔ－ＨＩＳの短縮型バリアントを保持する組換えＫ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株によって生成された分泌可溶性タンパク質量（最終培養物（ＯＤ_{６００ｎｍ}）について正規化）である。次の組換え株によって分泌された可溶性分泌タンパク質のタンパク質濃度（Ｂ）を比較した：列１、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ_{（１－５９４）}－ＨＩＳ；列２、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１－５９４）}－ＨＩＳ；列３、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ；列４、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}（Ｎ２８９Ｑ）－ＨＩＳ；列５、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}（Ｎ２９７Ｑ）－ＨＩＳ；列６、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}（Ｎ４３１Ｑ）－ＨＩＳ；列７、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}（Ｎ５６９Ｑ）－ＨＩＳ；列８、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳ；列９、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；列１０、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳ；列１１、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（８２－５９４）}－ＨＩＳ；列１２、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（９５－５９４）}－ＨＩＳ；列１３、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１０３－５９４）}－ＨＩＳ；列１４、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１１１－５９４）}－ＨＩＳ；列１５、ＧＳ１１５：：ＩＶ－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；列１６、ＧＳ１１５：：ＧＡ－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；列１７、ＧＳ１１５：：ＩＮ－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；列１８、ＧＳ１１５：：ＭＦα_{（Δ５７－７０）}－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ；列１９、ＧＳ１１５：：ＭＦα_{（Δ５７－７０）}－ｒＢｈｔ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳ；列２０、ＧＳ１１５（Ｈｉｓ^＋）対照。図２Ｃ：ｒＢＨＴバリアントの酵素活性比較は、ＡＯＸ１プロモーター制御下で、ｒＢｈｔ－ＨＩＳの短縮型バリアントを保持する組換えＫ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株によって生成された分泌可溶性タンパク質量（最終培養物（ＯＤ_{６００ｎｍ}）について正規化）である。次の組換え株によって分泌された可溶性分泌タンパク質の酵素活性（Ｃ）を比較した：列１、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ_{（１－５９４）}－ＨＩＳ；列２、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１－５９４）}－ＨＩＳ；列３、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ；列４、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}（Ｎ２８９Ｑ）－ＨＩＳ；列５、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}（Ｎ２９７Ｑ）－ＨＩＳ；列６、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}（Ｎ４３１Ｑ）－ＨＩＳ；列７、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}（Ｎ５６９Ｑ）－ＨＩＳ；列８、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳ；列９、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；列１０、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳ；列１１、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（８２－５９４）}－ＨＩＳ；列１２、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（９５－５９４）}－ＨＩＳ；列１３、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１０３－５９４）}－ＨＩＳ；列１４、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１１１－５９４）}－ＨＩＳ；列１５、ＧＳ１１５：：ＩＶ－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；列１６、ＧＳ１１５：：ＧＡ－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；列１７、ＧＳ１１５：：ＩＮ－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；列１８、ＧＳ１１５：：ＭＦα_{（Δ５７－７０）}－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ；列１９、ＧＳ１１５：：ＭＦα_{（Δ５７－７０）}－ｒＢｈｔ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳ；列２０、ＧＳ１１５（Ｈｉｓ^＋）対照。

〔図３〕図３Ａ：クーマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０％）分離及びウエスタンブロットを示す図である。図は、Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５の異なる組換え体によって発現したタンパク質無細胞抽出物（可溶性分泌タンパク質）を示している。（Ａ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって生成された分離タンパク質の抗ＨＩＳ抗血清にさらした；レーン１、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ－ＨＩＳ；レーン２、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ；レーン３、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳ；レーン４、ＧＳ１１５：：αＭＦ－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；レーン５、ＧＳ１１５：：αＭＦ－ｒＢｈｔ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳ；レーン６、ＧＳ１１５：：αＭＦ－ｒＢｈｔ_{（８２－５９４）}－ＨＩＳ；レーン７、ＧＳ１１５：：αＭＦ－ｒＢｈｔ_{（９５－５９４）}－ＨＩＳ；レーン８、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１０３－５９４）}－ＨＩＳ；レーン９、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１１１－５９４）}－ＨＩＳ；レーン１０、空ｐＰＩＣ９ベクターを含むＧＳ１１５対照。比較を補助するために、各レーンに等量をロードした。各ウェルにロードした総タンパク質（ｎｇ）は、上記（Ａ）に示す。「－－－」は、濃度を測定できなかったことを示す。Ｍは、分子量タンパク質マーカーを含むレーンを示し、（ｋＤａ）は、パネルの左側に表示する。図３Ｂ：クーマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０％）分離及びウエスタンブロットを示す図である。図は、Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５の異なる組換え体によって発現したタンパク質無細胞抽出物（可溶性分泌タンパク質）を示している。（Ｂ）ウエスタンブロットによって生成された分離タンパク質の抗ＨＩＳ抗血清にさらした；レーン１、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ－ＨＩＳ；レーン２、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ；レーン３、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳ；レーン４、ＧＳ１１５：：αＭＦ－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；レーン５、ＧＳ１１５：：αＭＦ－ｒＢｈｔ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳ；レーン６、ＧＳ１１５：：αＭＦ－ｒＢｈｔ_{（８２－５９４）}－ＨＩＳ；レーン７、ＧＳ１１５：：αＭＦ－ｒＢｈｔ_{（９５－５９４）}－ＨＩＳ；レーン８、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１０３－５９４）}－ＨＩＳ；レーン９、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１１１－５９４）}－ＨＩＳ；レーン１０、空ｐＰＩＣ９ベクターを含むＧＳ１１５対照。比較を補助するために、各レーンに等量をロードした。各ウェルにロードした総タンパク質（ｎｇ）は、上記（Ｂ）に示す。「－－－」は、濃度を測定できなかったことを示す。Ｍは、分子量タンパク質マーカーを含むレーンを示し、（ｋＤａ）は、パネルの左側に表示する。

〔図４〕２０℃、３０℃、４２℃、及び５５℃で試験したｒＢＨＴバリアントの酵素動力学パラメータを示す図である。ｋｃａｔ／ｋｍ対温度。酵素アッセイは、０．３μｇのｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ、ｒＢＨＴ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳ、ｒＢＨＴ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ、及びｒＢＨＴ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳの存在下で、「方法」に記載のＯＮＰ－Ｇｌｕ基質濃度の範囲（０．０８～１０．４ｍＭ）で実施した。Ｋｍ及びｋｃａｔは、Ｈｉｌｌ式を使用して、ＯＮＰ－Ｇｌｕ切断の初期速度から算出した。値は、３つの独立した測定値の平均±標準偏差（ＳＤ）である。

〔図５〕図５Ａ：ラクトース／Ｎ－アセチルグルコサミン１：２の比でのＮ－アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）の産生例を示す図である。本開示の組換えＢＨＴ（ｒＢＨＴ）ポリペプチドは、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）へのガラクトース（ラクトースからのＧａｌ）の反復付加を触媒することができる。図５Ｂ：ラクトース／Ｎ－アセチルグルコサミン１：２の比でのＮ－アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）の産生例を示す図である。ｒＢＨＴ によって触媒される酵素反応を示す。ガラクトシル－ラクトース（Ｇａｌ－ラクトース）、ガラクトシル－Ｎ－アセトアラクトサミン（Ｇａｌ－ＬａｃＮＡｃ）、及びＮ－アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）合成の時間経過研究の例は、全細胞膜結合タンパク質（１Ｕ ｒＢＨＴ．ｇ^－１ラクトース）を使用して実施した。アッセイには約２０ｇ／Ｌのラクトース；約１０ｇ／Ｌ Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含む５ｍＭリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）を含み、３０℃でインキュベートした。サンプルを定期的に取り出し、ＨＰＬＣによって分析し、ＥＬＳＤ及びＰＤＡにより検出した。

〔図６Ａ〕６ｍ４ｅ（ＨｓＢｇｌＡ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ）と構造的にＧＨ１相同タンパク質との複数の二次構造アラインメントを示す図である。（Ａ）ＰＤＢデータベースから最も構造的に相同であることが判明したタンパク質とてしては、２Ｅ３ＺＡ（ＢＧＬ１Ａ）、３ＡＨＹＢ（ＴｒＢｇｌ２）、５ＢＷＦＡ（ＴｈＢｇｌ）、４ＭＤＯＡ（ＨｉＢＧ）、及び５ＪＢＯＡ（ＴｈＢｇｌ２）が挙げられる（表４）。一次配列アラインメントは、下部に示す。ｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ］の二次構造エレメント及びその名称は、アラインメントの上に示す。βストランドは、黒い矢印で示し、コイルによるαヘリックス構造、厳密なαターン（ＴＴＴ文字）、βターン（ＴＴ文字）、及びηは、３_１０ヘリックスランダムコイルを指す。（α／β）－Ｔｉｍバレル構造の二次構造エレメントの番号は、構造アライメントの上に（α１－α８）及び（β１－β８）として示す。ＨｓＢｇｌＡ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ非構造化領域の分析では、アミノ末端からカルボキシル末端までのＨｓＢｇｌＡのアミノ酸の番号には、破線の矢印で示されている欠失シグナル配列（残基１～２２）及び点線で示されている結晶構造（残基２３－５３）から欠落している非構造化領域を含む。アミノ酸は、％配列類似性に基づいて、ＣｌｕｓｔａｌＯにより整列させた。同一の残基は、背景が黒の白で、保守的変更は、背景が灰色のボックスで囲まれている。挿入は、紫色の背景で強調表示されている。触媒酸／塩基求核残基は、星印で示す。ＨｓＢｇｌＡ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳに見られるグリコシル化部位は、三角で示す。図６Ａは、図１に示すＮ末端における予測されるリン酸化部位及び潜在的Ｏ－グリコシル化部位を示し、それぞれの部位を四角及び丸で示す。コンセンサス配列は、整列された配列の下部に示す。画像は、ＥＮＤｓｃｒｉｐｔ２．０ Ｗｅｂサーバーを使用して生成し（ｈｔｔｐ：／／ｅｎｄｓｃｒｉｐｔ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ＥＳＰｒｉｐｔ／ＥＮＤｓｃｒｉｐｔ／）（５）、Ｄａｌｉタンパク質構造比較サーバー（ｈｔｔｐ：／／ｅｋｈｉｄｎａ２．ｂｉｏｃｅｎｔｅｒ．ｈｅｌｓｉｎｋｉ．ｆｉ／ｄａｌｉ／）で得られたデータを使用して、ＨｓＢｇｌＡ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ（ＰＤＢ ＩＤ：Ｍ６Ｅ４）に基づいて、３Ｄ結晶構造とタンパク質データバンクの結晶構造比較から導出した（Ｈｏｌｍ，２０１９）。

〔図６Ｂ〕６ｍ４ｅ（ＨｓＢｇｌＡ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ）と構造的にＧＨ１相同タンパク質との複数の二次構造アラインメントを示す図である。ＨｓＢｇｌＡ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ（ＰＤＢＩＤ：Ｍ６Ｅ４）４つの伸長ループＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、青、緑、黄、及び赤で着色され、基質結合ポケット入口を形成するのと同色の矢印として示され、（Ａ）の二次構造の上に示されている。ＰｙＭＯＬを使用して生成した（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ／２／）。

〔図６Ｃ〕６ｍ４ｅ（ＨｓＢｇｌＡ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ）と構造的にＧＨ１相同タンパク質との複数の二次構造アラインメントを示す図である。ＨｓＢｇｌＡ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ（ＰＤＢＩＤ：Ｍ６Ｅ４）の保存度は、赤から青への色のグラデーションによって表す。深い赤色は、より保存された残基を意味し、より可変的残基は、深い青色である。ＰｙＭＯＬを使用して生成した（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ／２／）。

〔図７〕図７Ａ：１ｍｇ／ｍｌ（赤）と４ｍｇ／ｍｌ（青）のＢＨＴのＳＡＸＳデータを示す図である。ＳＡＸＳデータは、対数プロット（左）に示す。Ｉ（Ｑ）は、任意の単位である。図７Ｂ：ＳＡＸＳデータから計算されたＰ（ｒ）曲線は、最大高さ１．０に正規化される。

〔発明を実施するための形態〕
本開示は、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の産生に関連する組成物及び方法を提供する。特に、本開示は、ラクトース及びＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を、新規のβ－ヘキソシルトランスフェラーゼ（ＢＨＴ）酵素を使用して、Ｎ－アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）に富むガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）組成物に変換するための組成物及び方法を提供する。

Ｈａｍａｍｏｔｏａ（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓは、産業上重要な誘導性膜結合β－ヘキソシルトランスフェラーゼ（ＢＨＴ）をコードしており、これはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ（Ｐｉｃｈｉａ）ｐａｓｔｏｒｉｓによって異種発現した場合、部分的に分泌され可溶性である。ＢＨＴ分泌は、新規アミノ末端領域（１～１１０アミノ酸）の一部である２２アミノ酸シグナル配列によって決定され、カルボキシル末端ドメイン内の触媒糖加水分解酵素（ＧＨ１）の４つのアルギニン位置でグリコシル化されることが予測される。生物学的に活性な可溶性酵素の生成における各Ｎ－グリコシル化部位の役割を評価するために、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ（Ｐｉｃｈｉａ）ｐａｓｔｏｒｉｓによって産生されたＮ－グリコシル化組換え酵素バリアント（例えば、Ｎ２８９Ｑ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ４３１Ｑ及びＮ５６９Ｑ）の活性を比較分析した。４つの脱グリコシル化可溶性バリアントの機能分析により、全組換え（ｒＢＨＴ）の測定可能な活性の低下（５８～９７％の減少）が明らかになり、これは、４つの部位すべてでのグリコシル化が活性酵素の生成に重要であることを示している。さらに、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ構造予測では、触媒Ｃ末端ＧＨ１ドメインに先行する新規アミノ末端領域（１～１１０アミノ酸）内に無秩序なセグメントが存在することを示している。欠失分析は、８つの短縮Ｎ末端ドメイン酵素バリアントを生成するために、推定無秩序領域を囲むセグメントを標的にして実施した。分泌された可溶性酵素バリアントに対する膜結合バリアントの比率に対する酵素短縮の影響を評価した。活性可溶性短縮バリアントのＭＦαシグナル配列及びＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ（Ｐｉｃｈｉａ）ｐａｓｔｏｒｉｓによって生成された修飾ＭＦα型への融合は、分泌力価、安定性、及び酵素動力学について比較した。驚くべきことに、最大５６アミノ酸のＮ末端欠失により、完全に機能的な分泌された可溶性酵素バリアントが産生され、分泌された全活性酵素の約６５％が、本明細書に記載の実験条件下で膜結合した。

Ｈａｍａｍｏｔｏａ（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ（Ｈ．Ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）は、誘導可能な条件下で、細胞外膜結合グリコシル化β－ヘキソシルトランスフェラーゼ（ＢＨＴ）を発現する。ＢＨＴは、セロビオースβ－（１－４）グリコシド連結の加水分解を触媒し、ラクトースの存在下で魅力的な酵素的トランスガラクトシル化能力を有し、プレバイオティクスと見なされ、機能性食品添加物として広く使用されているガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の合成が可能になる。このため、トランスガラクトシル化反応を触媒するこの新規酵素の重要な役割に対する関心が高まっている。

近年では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）による生物学的に不活性なｒＢＨＴの異種発現により、グリコシル化などの翻訳後修飾が活性酵素を得るために必要であることが示唆された。しかし、カルボキシル末端ドメイン及び／またはＮ末端領域のモチーフ内の潜在的なすべてのグリコシル化部位が、生物学的に活性なｒＢＨＴの生成に関与するか否かについては不明のままである。新規Ｎ末端領域は、既知の配列相同体を有さず、特徴も依然として明らかになっていない。糖タンパク質の炭水化物部分は、一般に、タンパク質の折り畳み、オリゴマー化、タンパク質分解からの保護、分泌、細胞内輸送、細胞表面発現、及び酵素活性を促進すると考えられている。

Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ（Ｐｉｃｈｉａ）ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、その翻訳後修飾及び分泌能力により、組換えタンパク質の産生のための真核宿主として一般的に使用されている。本開示に基づいて当業者によって認識されるように、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ（Ｐｉｃｈｉａ）ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、Ｋａｍａｇａｔａａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉとも呼ばれる。本明細書でさらに説明するように、本開示の様々な組成物及び方法は、これらに限定されないが、酵母細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または藻類細胞など、任意の宿主細胞に適用可能である。いくつかの実施形態では、宿主細胞には、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属由来の任意の細胞が含まれる。

Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓでは、Ｎ－グリカンは、認識配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ中のアスパラギンにおいて、コアユニットＧｌｃ_３Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２の付加から始まる高マンノース型異種オリゴ糖を形成する（Ｇｌｃ＝グルコース；ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ－アセチルグルコサミン；Ｍａｎ＝マンノース）。Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓによるｒＢＨＴの異種発現により、グリコシル化された細胞外細胞壁または膜結合酵素がもたらされた。驚くべきことに、天然のタンパク質リーダーは、酵素の小分画を活性可溶性酵素として培養ブロスに分泌するように指示した。以前の研究では、Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓが可溶性の生物学的に活性なｒＢＨＴを培養ブロスに分泌できることが実証されており、これにより、下流の簡単な回収プロセスプロトコルの可能性が開かれた。したがって、可溶性活性酵素の活性及び安定性を回収、精製、及び評価し、それを膜結合ｒＢＨＴと比較するために実験を行った。

予測されたタンパク質は、５９４アミノ酸を含み、１～１１０アミノ酸のアミノ末端領域を含み、既知の配列相同体は含まず、その後にカルボキシル末端グリコシルヒドロラーゼファミリー１（ＧＨ１）触媒ドメインが続く。Ｎ末端には、２２個のアミノ酸からなる分泌シグナルペプチドもあり、これにより、オープンリーディングフレーム全体の上流で、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα接合因子（ＭＦα）シグナル配列に融合したときに、分泌が制限される。実験は、ネイティブＢＨＴシグナル配列（１～２２ａａ）をＭＦαシグナル配列で置き換えることにより、この制限を部分的に解除できることを示した。その結果、培養ブロス中の生物学的に活性な可溶性酵素の活性が予想外に５３倍増加し、この酵素のＫ．ｐａｓｔｏｒｉｓ膜会合形態も増加した。これらの結果は、ＢＨＴシグナル配列が膜結合局在化対培地への可溶性酵素の分泌に影響を与えることを実証した。以前の結果は、最初の２２アミノ酸シグナルペプチドの外側のＮ末端領域の役割に対処しなかったが、本明細書でさらに説明するとおり、新規の１－１１０Ｎ末端ドメイン内の欠失突然変異誘発を使用してこの問題を評価できる系を確立した。

Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓによる可溶性タンパク質の分泌は、タンパク質依存性が高く、当技術分野で十分に認識されているとおり、依然として、生産プロセスの一般的なボトルネックである。この制限の理由の１つは、フォールディングヘルパータンパク質を過剰発現させることによって改善できる、不適切なフォールディングに起因すると考えられている。代替的方法としては、分泌を改善する方法として、再設計された株及び突然変異誘発が挙げられ得る。さらに、複数の研究が、グリコシル化及び細胞輸送関連遺伝子を変化させることにより、可溶性組換えタンパク質の分泌が増加することを示している。

本開示では、可溶性活性ｒＢＨＴの分泌が、Ｃ末端ＧＨ１ドメイン内に埋もれた、かつ／または新規１１０Ｎ末端領域（アミノ酸２３～１１０）内に含まれる機能によって制限された翻訳後Ｎグリコシル化修飾によって制御されるか否かに対処するために、（部位特異的突然変異誘発及び漸進的欠失分析を使用して）実験を行った。改変または短縮された各酵素バリアントのｒＢＨＴ発現の全体的な分析は、可溶性酵素と膜会合酵素の比として測定される酵素活性の分析によって補完した。最後に、本開示の結果は、最近導出されたＢＨＴ酵素の結晶構造を使用して、その座標がタンパク質データバンク（ＰＤＢ）で利用可能である、相同なＧＨ１タンパク質との比較配列及び構造分析を提示することによって、Ｎ末端の独自性をさらに実証している。

ＢＨＴの産業用途及び重要性に基づいて、可溶性活性酵素の分泌効率を改善することが強く望まれている。近年では、ＢＨＴ酵素の９０％の構造情報が利用できるようになり、その所見を他のＧＨ１ファミリーメンバーと比較した。得られたデータから、シグナル配列及び推定無秩序領域を含む新規１１０Ｎ末端ドメインと、保存されたカルボキシルＧＨ１ドメインの２つの異なる構造ドメインを示す酵素のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ構造予測を確認した。これらのデータから、様々なグリコシル化部位及びリン酸化部位も予測した。したがって、タンパク質構造修飾の３つの一般的なカテゴリを実行した。１）４つのグリコシル化部位の部位特異的突然変異誘発；２）１１０個のＮ末端領域における短縮；３）分泌シグナルの置換及び修飾。第１のグループの修飾では、部位特異的変異誘発によってグリコシル化部位を標的とし、酵素活性に対するそれらの重要性が確認された。第２のグループの修飾では、最大５６のＮ末端アミノ酸の除去が酵素活性に影響を与えないこと、及びこれらの残基が可溶性活性型ｒＢＨＴの分泌に重要な役割を果たさないことが示された。第３のグループの修飾では、ＭＦαシグナル配列を改変することにより、分泌された可溶性タンパク質と膜会合タンパク質の比率が上昇する（０．６７）ことが示された（表１）。

ｒＢＨＴ Ｎ－グリコシル化と対応する酵素特性との相関関係を調べることは、酵素の安定性、活性、さらには産生を評価することに対する重要なステップである。Ｎ－グリコシル化などの翻訳後修飾は、ＥＲでのタンパク質のフォールディングに関与し、異種タンパク質の分泌に重要な役割を果たす。しかし、ポリペプチド中の予測されたＮ－グリコシル化シークオン（ｓｅｑｕｏｎ）のすべてがｉｎ ｖｉｖｏでグリコシル化されるわけではない。複数のアルゴリズムが、Ｎ－及びＯ－グリコシル化部位を予測するために利用できるが、発現及び分泌に対する推定部位の増強または除去の効果は、ｉｎ ｖｉｖｏでのみ確認できる。Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析では、近年、三次元構造によって確認されたＢＨＴＧＨ１ドメインが４つのＮ－グリコシル化部位を含むことが示唆された（ＨｓＢｇｌＡ，ＰＤＢ ＩＤ：Ｍ６Ｅ４）。重要なことに、グルタミンによるアスパラギンの単一部位の置換は、活性酵素の発現との強い関連性を示した。しかし、驚くべきことに、分泌された可溶性酵素と細胞膜会合活性との比は、ＢＨＴ_{（２３－５９４）（Ｎ５６９Ｑ）}－ＨＩＳで０．４０から０．６６に増大した。特に、これらの置換により、親株のｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳと比較して、分泌された可溶性タンパク質が５８％から９７％、細胞膜結合活性タンパク質では、７５％から９５％と劇的に減少した。完全に活性な酵素のパーセンテージとして表される活性のこの広い範囲は、１つのＮ－グリコシル化部位が不在であって、活性酵素の力価を減少させるのに十分であり、完全に機能する酵素は、試験した４つの部位すべてがグリコシル化されている場合にのみ得られることを示している。

実験では、可溶性活性タンパク質の分泌が無秩序Ｎ末端セグメントの存在によって影響を受けるか否か、及びそれらの除去が、短縮された分泌可溶性ｒＢＨＴバリアントの触媒活性に対して機能的重要性を有するか否かも調べた。ＢＨＴの新規１１０Ｎ末端領域についてはほとんど知られていないが、これまでのところ他の既知のタンパク質との相同性を欠いている断片である。新規１１０Ｎ末端ドメインの予測された無秩序セグメントをベースにして、ＭＦαシグナル配列を融合した欠失キメラが生成された。アミノ酸１～５６を含むＮ末端短縮の異種発現により、分泌された可溶性、安定性、及び生物活性酵素のそれぞれについて同等の酵素動力学パラメータ値が生じたが、無秩序のセグメントのＮ末端がさらに欠失したことにより、分泌プロセスは無効になった（図２；図３；表１）。したがって、ＢＨＴの活性及び安定性は、Ｎ末端の５６アミノ酸に依存しないが、Ｎグリコシル化部位について説明したとおり、分泌への影響は、ｉｎ ｖｉｖｏでのみ確認できる。例えば、アミノ酸５６でＩＵＰＲＥＤ２Ａによって予測される無秩序領域のカルボキシル末端境界は除去できるが、活性酵素を得るには、下流で予測される無秩序領域が必要であった。

本質的に無秩序なタンパク質（ＩＤＰ）は、明確に定義された構造に適応するのではなく、コンフォメーションを交換して存在する。無秩序領域は、アミノ酸配列に基づいて秩序のある領域と区別することができ、ほとんどの場合、無秩序なタンパク質は、進化的にあまり保存されておらず、むしろその無秩序な構造が維持されている。ＩＤＰは、転写、翻訳、調節、及びシグナル伝達など、複数の細胞機能に関与し、リン酸化部位中で豊富にある。多くの場合、ＩＤＰは、ＤＮＡまたはＲＮＡの結合、及び他のタンパク質への結合に関与しており、多タンパク質複合体の組み立てを支援できる。さらに、ＩＤＰは、酵素では低頻度であり、異なるサーバーにより、ＧＨ１ドメイン内の出力として有意な偏差が生じるが、より厳密なサーバーＤＩＳＯＰＲＥＤ３を使用した場合に、ＧＨ１ドメイン中に無秩序領域がない。

さらに、本明細書でさらに説明するとおり、Ｈ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓの細胞膜からのタンパク質細胞抽出物中で、残基１７または２２で、ＢＨＴの短縮型活性ポリペプチドが以前に検出されたことを考慮して、分泌シグナルを置換することによって構造修飾を行った。この発見は、この断片が切断されて成熟ＢＨＴを形成したことを示唆するものであった。Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓを使用した場合、結果は、ＢＨＴアミノ酸１～２２が、機能的天然シグナル配列として作用することを実証するものであった。そのＭＦαシグナル配列との置換により、可溶性活性ｒＢＨＴバリアントの分泌が可能になることが実証されたが、分泌された酵素のさらなる約７１％が、依然として膜に会合しており（表１）、これは、以前の結果と一致している。

Ｎ末端無秩序領域の除去後の細胞膜によるｒＢＨＴの永続的な部分的局在化は、ＭＦαの偏らない切断、またはおそらく新規Ｎ末端領域またはＢＨＴ ＧＨ１ドメイン内の５７～１１０アミノ酸のいずれかに、細胞膜との結合点が含まれ得ることを示唆していることに留意すべきである。真核生物中のほとんどの分泌タンパク質には、タンパク質を細胞内または細胞外の場所に誘導するＮ末端シグナル配列が含まれている。最小の配列相同性を有するペプチド配列がシグナルペプチドとして機能する能力により、元のシグナル配列を酵母中に見られるシグナルペプチド配列で置換することが可能になっている。４つのシグナル配列を比較することにより、分泌ＢＨＴペプチドが、引き続き細胞膜に会合することが明らかになった。

シグナルペプチドの切断は、Ｅ．ｃｏｌｉ膜を通過する機能性プロリポタンパク質の組み立て及び分泌に重要であることがわかっている。ある研究では、未処理コンセンサスＭＦα－α－インターフェロンが、ペリプラズム空間及び細胞壁に蓄積し、培地への分泌及び細胞内蓄積は、ＭＦαとα－インターフェロンとの間のＧｌｕ－Ａｌａジペプチドにより軽減できた。さらに、ＭＦαのプロ領域中でのアミノ酸５７～７０の欠失は、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びリパーゼの分泌を少なくとも５０％増大させることを示している。したがって、これらの結果に基づいて、シグナルペプチダーゼによるシグナルペプチドの切断は、可溶性ｒＢＨＴの最終的な組み立て及び分泌に必要であり得る。バリアントＧＳ１１５：：ＭＦα_{（Δ５７－７０）}－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ及びＧＳ１１５：：ＭＦα_{（Δ５７－７０）}－ｒＢｈｔ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳで見られるＭＦαへの同じ修飾は、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳと比較して、分泌が５８％増加し、その結果、会合している膜に分泌される可溶性の比率が４０％増加した（表１）。

ＢＨＴの結晶構造は、全体的にＧＨ１ファミリーのタンパク質と類似しているが、Ｎ末端（残基１～１１０）は、既知の相同体を有さず、残基２３～５４は、構造内で画定されていなかった。この領域は、構造化されておらず、構造的に動的であることが以前に提唱されていた。本明細書でさらに説明するように、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ結果に基づいて、Ｎ末端の非構造化ドメインに対して欠失分析を行った。これらの結果に照らして、第１のＮ末端の５６残基内の特徴は、細胞会合活性において限られた役割を果たす可能性が高いが、酵素の折り畳み、分泌または活性には必要とされない。

合理的な酵素を再設計するには、ＢＨＴ Ｎ末端の非構造化領域の可能な調節メカニズムを決定することが不可欠である。本開示の結果によれば、相同構造は、保存されたＣ末端触媒ドメインを含むが、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析におけるＢＨＴで見られる高度に本質的に無秩序なＮ末端ドメインを欠いている（図１）。Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測と一致して、Ｘ線結晶構造解析（ＨｓＢｇｌＡ、ＰＤＢ：６Ｍ４Ｅ）によって分解された、近年公開されたＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳの三次元構造では、Ｎ末端内の残基２３～５４については、検出可能な電子密度は有しない。これは、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで予測されたこの領域中の構造化されていない残基と一致する（図１）。Ｃ末端触媒ドメインの全体構造は、古典的なＧＨ１構造に類似しており、これは、結晶構造によっても確認されている。しかし、特定のエレメント（図６）が触媒求核剤内の固有のアミノ酸に加えて見出され、今後の研究のためにＢＨＴの異なる触媒特性のハンドルを提供し得る。

上記のすべてのデータは、アクティブなｒＢＨＴを維持するための残基５６を超えるＮ末端無秩序領域の役割をさらに記録したものであり、細胞壁結合ｒＢＨＴの部分的選択的隔離の基礎が、シグナル分泌配列の非効率的な処理にあるものとする。全体として、Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓを用いた本開示の結果は、短縮型ＭＦαに融合しながら、内因性の５６個のＮ末端アミノ酸を除去することによって、可溶性ｒＢＨＴの分泌力価を改善した。

このセクション及び本明細書の開示全体で使用されているセクションの見出しは、単に構成上の目的のためであり、限定を意図したものではない。

１．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。相反する場合、定義を含めて、本書類が優先する。好ましい方法及び材料については後述するが、本明細書に記載されるものと類似するまたは同等の方法及び材料も、本開示の実施または試験に使用することができる。「一実施形態では」という語句は、本明細書で使用される場合、同じ実施形態を指す場合もあるが、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない。更に、「別の実施形態では」という語句は、本明細書で使用される場合、異なる実施形態を指す場合もあるが、必ずしも異なる実施形態を指すとは限らない。したがって、以下に記載のとおり、本開示の様々な実施形態は、本明細書で提供される実施形態の範囲または趣旨から逸脱することなく、容易に組み合わせることができる。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照により、それらの全体が組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、及び例は、例示的であるに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、及びそれらの変形は、本明細書で使用される場合、さらなる行為または構造の可能性を排除しない、開放式の移行句、用語、または語句であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上、そうではないという指示がない限り、複数の指示対象を含む。本開示はまた、明示的に記載されているかどうかにかかわらず、本明細書に存在する実施形態または要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も企図する。

本明細書における数値範囲の列挙の場合、それらの間に介在する同程度の正確さを有する各数値が明示的に企図される。例えば、６～９の範囲では、６及び９に加えて、数値７及び８が企図され、範囲６．０～７．０では、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が、明示的に企図される。

「と相関する」は、本明細書で使用する場合、比較することを指す。

本明細書で使用される「核酸分子」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むがこれらに限定されない任意の核酸含有分子を指す。この用語は、これらに限定されないが、４－アセチルシトシン、８－ヒドロキシ－Ｎ６－メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルアデニン、１－メチルシュードウラシル、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルケオシン、５’－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、ケウオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、シュードウラシル、ケウオシン、２－チオシトシン、及び２，６－ジアミノプリンなど、ＤＮＡ及びＲＮＡの既知の塩基類似体のいずれかを含む配列を包含する。

用語「遺伝子」は、ポリペプチド、前駆体、またはＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ）の産生のためのコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。ポリペプチドは、全長または断片の所望の活性または機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性等）が保持される限り、全長コード配列によって、またはコード配列の任意の部分によってコードされてもよい。この用語はまた、構造遺伝子のコード領域と、遺伝子が全長ｍＲＮＡの長さに対応するように、いずれの末端においても約１ｋｂ以上の距離の間、５’末端及び３’末端の両方でコード領域に隣接して位置する配列と、を包含する。コード領域の５’側に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’側または下流に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡ及びゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム型またはクローンは、「イントロン」、「介在領域」、「介在配列」のうちのいずれかと称される非コード配列で隔たれているコード領域を含有する。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンは、エンハンサーなどの調節エレメントを含有し得る。イントロンは、核または一次転写物から除去または「スプライシングにより除去」され、そのため、イントロンはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物中には存在しない。ｍＲＮＡは、新生ポリペプチド中でアミノ酸の配列または順序を規定するように翻訳中に機能する。

本明細書で使用される「異種遺伝子」という用語は、その自然環境にない遺伝子を指す。例えば、異種遺伝子としては、ある種から別の種に導入された遺伝子が挙げられる。異種遺伝子には、何らかの方法で改変された（例えば、突然変異、複数のコピーでの付加、非天然の調節配列への連結など）生物に固有の遺伝子も含む。異種遺伝子は、異種遺伝子配列が、典型的には、染色体内の遺伝子配列に自然に会合することが見られないＤＮＡ配列に連結されるか、または自然界では見られない染色体の一部分に会合する（例えば、遺伝子が正常に発現しない遺伝子座に発現する遺伝子）という点で、内因性遺伝子と区別される。

本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、短い長さの一本鎖ポリヌクレオチド鎖を指す。オリゴヌクレオチドは、典型的には、約３００残基未満の長さ（例えば、１５～１００）であるが、本明細書で使用する場合、この用語は、これよりも長いポリヌクレオチド鎖も包含することを意図している。オリゴヌクレオチドは、多くの場合、その長さによって呼ばれる。例えば、２４残基のオリゴヌクレオチドは、「２４－ｍｅｒ」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイズまたは他のポリヌクレオチドへのハイブリダイズにより、二次構造及び三次構造を形成することができる。そのような構造としては、これらに限定されないが、二重鎖、ヘアピン、十字形、屈曲、及び三重鎖が挙げられる。

本明細書で使用される「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、特に明記しない限り、ペプチドアミド結合（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）によって主鎖を介して連結された２つ以上のアミノ酸のポリマー化合物を指す。「ペプチド」という用語は、典型的には、短いアミノ酸ポリマー（例えば、２５個未満のアミノ酸を有する鎖）を指し、「ポリペプチド」という用語は、典型的には、これよりも長いアミノ酸ポリマー（例えば、２５個を超えるアミノ酸を有する鎖）を指す。

本明細書で使用する場合、用語「断片」は、大きい実体全体（例えば、タンパク質、ポリペプチド、酵素など）の切り出しもしくは「断片化」から生じるペプチドもしくはポリペプチド、またはそれらと同じ配列を有するように調製されるペプチドもしくはポリペプチドを指す。したがって、断片は、それが作られるかつ／または設計される全体の実体（例えば、タンパク質、ポリペプチド、酵素など）の部分配列である。既存の全タンパク質の部分配列ではないペプチドまたはポリペプチドは、断片ではない（例えば、既存のタンパク質の断片ではない）。

本明細書で使用する「配列同一性」という用語は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）が、単量体サブユニットの同じ連続組成を有する程度を指す。「配列類似性」という用語は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）が類似のポリマー配列を有する程度を指す。例えば、類似アミノ酸は、同じ生物物理学的特徴を共有するものであり、ファミリー；例えば、酸性（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、無電荷極性（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）にグループ化することができる。「パーセント配列同一性」（または「パーセント配列類似性」）は、以下によって計算される：（１）比較ウィンドウ（例えば、長い方の配列の長さ、短い方の配列の長さ、指定されたウィンドウ）での２つの最適に整列された配列を比較する、（２）一致する位置の数を得るために、同一の（または類似の）モノマー（例えば、同じアミノ酸が両方の配列に存在する、類似のアミノ酸が両方の配列に存在する）を含む位置の数を決定する、（３）一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（例えば、長い方の配列の長さ、短い方の配列の長さ、指定されたウィンドウ）で除算する、及び（４）結果に１００を乗算して、配列同一性パーセント、または配列類似性パーセントを求める。例えば、ペプチドＡ及びＢがいずれも２０アミノ酸長で、１つの位置を除いてすべて同一のアミノ酸を有する場合、ペプチドＡ及びペプチドＢは、９５％配列同一性を有する。同一でない位置のアミノ酸が同じ生物物理学的特徴を共有する場合（例えば、両方とも酸性）、ペプチドＡ及びペプチドＢは、１００％配列類似性を有することになる。別の例として、ペプチドＣが２０アミノ酸長であり、ペプチドＤが１５アミノ酸長であり、ペプチドＤ中の１５アミノ酸のうち１４がペプチドＣの一部のものと同一である場合、ペプチドＣ及びＤは、配列同一性は７０％であるが、ペプチドＤは、ペプチドＣの最適な比較ウィンドウに対して９３．３％の配列同一性を有する。本明細書で「パーセント配列同一性」（または「パーセント配列類似性」）を計算する目的で、アラインされた配列のあらゆるギャップは、その位置でのミスマッチとして扱う。

いくつかの実施形態では、置換は、保存的アミノ酸置換であり得る。生物学的活性に影響を与える可能性が低い保存的アミノ酸置換の例としては、以下が挙げられる：セリンはアラニン、イソロイシンはバリン、グルタミン酸はアスパラギン酸、セリンはスレオニン、グリシンはアラニン、スレオニンはアラニン、アスパラギンはセリン、バリンはアラニン、グリシンはセリン、フェニルアラニンはチロシン、プロリンはアラニン、アルギニンはリジン、アスパラギンはアスパラギン酸、イソロイシンはロイシン、バリンはロイシン、グルタミン酸はアラニン、グリシンはアスパラギン酸、及びこれらの逆に変化する。例えば、Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９）を参照されたい。その関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、あるグループ内の１つのアミノ酸を同じグループ内の別のアミノ酸に交換することは保存的置換であり、グループは次のとおりである：（１）アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、ノルロイシン、及びフェニルアラニン：（２）ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、及びアスパラギン；（３）アスパラギン酸及びグルタミン酸；（４）セリン、スレオニン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びシステイン；（５）グリシン、プロリン、及びアラニン。

「相同性」及び「相同の」という用語は、同一性の程度を指す。部分的相同性または完全相同性があってもよい。部分的相同配列とは、別の配列と１００％未満同一である配列である。

本明細書で使用する場合、「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対形成規則により関係しているポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたは標的核酸などのヌクレオチドの配列）に関して使用される。例えば、配列「５’－Ａ－Ｇ－Ｔ－３’」は、配列「３’－Ｔ－Ｃ－Ａ－５’」に相補的である。相補性は「部分的」であってもよく、その場合、核酸塩基の一部のみが塩基対合則に従って一致する。あるいは、核酸間で「完全な」または「全体的な」相補性が存在してもよい。核酸鎖間での相補性の程度は、核酸鎖間でのハイブリダイゼーションの効率及び強度に著しい影響力を持っている。相補性は、核酸間の結合に依存する増幅反応及び検出法において特に重要である。いずれの用語も、特にポリヌクレオチドの文脈内で、個々のヌクレオチドに関して使用され得る。例えば、オリゴヌクレオチド内の特定のヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの残りと核酸鎖との間の相補性とは対照的にまたはそれらと比較して、別の核酸鎖内のヌクレオチドに対するその相補性またはその欠如について注目され得る。

いくつかの文脈では、「相補性」という用語及び関連する用語（例えば、「相補」、「相補体」）は、水素結合を介して別の核酸配列に結合することができる核酸配列のヌクレオチド、例えば、ワトソン・クリック塩基対形成または他の塩基対形成により塩基対形成可能なヌクレオチドを指す。例えば互いに相補的である塩基対を形成できるヌクレオチドは、シトシンとグアニン、チミンとアデニン、アデニンとウラシル、及びグアニンとウラシルの対である。パーセント相補性は、核酸配列の全長において計算する必要はない。パーセント相補性は、例えば、最初の塩基対のヌクレオチドから始まり、最後の塩基対のヌクレオチドで終わる、塩基対である核酸配列の特定の領域に限定され得る。本明細書で使用される核酸配列の相補体とは、一方の配列の５’末端が他方の配列の３’末端と対になるように核酸配列と整列した場合、「逆平行会合」にあるオリゴヌクレオチドを指す。天然の核酸には一般的に見られない特定の塩基が、本開示の核酸に含まれてもよく、例えば、イノシン及び７－デアザグアニンが含まれる。相補性は、完全である必要はなく、安定した二本鎖には、ミスマッチの塩基対または不一致の塩基が含まれ得る。核酸技術の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成及び配列、イオン強度及びミスマッチ塩基対の発生率など、複数の変数を考慮して、二本鎖の安定性を経験的に決定することができる。

したがって、いくつかの実施形態では、「相補性」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のヌクレオチドの領域で、第１の核酸塩基配列が第２の核酸塩基配列に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一である、または２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを指す。「完全相補的」とは、第１の核酸の各核酸塩基が、第２の核酸の対応する位置において、各核酸塩基と対形成できることを意味する。例えば、特定の実施形態では、各核酸塩基がある核酸に対して相補性を有するオリゴヌクレオチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上の核酸塩基である領域において、核酸の相補体と同一である核酸塩基配列を有する。

本明細書で使用される場合、「二本鎖核酸」は、核酸の一部、長い核酸の領域、または核酸全体であり得る。「二本鎖核酸」は、例えば、限定されないが、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドなどであり得る。二次構造（例えば、塩基対二次構造）及び／それより高次の構造を有する一本鎖核酸は、「二本鎖核酸」を含む。例えば、三重構造は、「二本鎖」と見なされる。いくつかの実施形態では、任意の塩基対核酸は、「二本鎖核酸」である。

「単離された」という用語は、「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」のように核酸に関して使用される場合、その天然源中で通常付随する少なくとも１つの成分または混在物から同定され分離される核酸配列を指す。単離された核酸は、核酸が天然に見出されるものとは異なる形態または状況でこのように存在する。対照的に、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸として単離されていない核酸は、それらが天然に存在する状態で見出される。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、隣接する遺伝子に近接する宿主細胞染色体上で見出され、ＲＮＡ配列、例えば、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列などは、多数のタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として細胞中に見出される。しかしながら、所与のタンパク質をコードする単離された核酸は、一例として、所与のタンパク質を通常発現する細胞中の核酸などを含み、ここで核酸は、天然細胞のものと異なる染色体場所にあるか、またはその他の点で天然に見出されるものと異なる核酸配列と隣接している。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖形態で存在し得る。単離された核酸またはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがタンパク質を発現するために利用される場合、このオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、センス鎖またはコード鎖を最小限含む（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖であってよい）が、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含んでもよい（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、二本鎖であってもよい）。

本明細書で使用される場合、「精製された」または「精製するための」という用語はまた、試料からの成分（例えば、混入物）の除去も指す。例えば、抗体は、混入している非免疫グロブリンタンパク質を除去することによって精製される。また、標的分子に結合しない免疫グロブリンを除去することによって精製される。非免疫グロブリンタンパク質を除去すること及び／または標的分子に結合しない免疫グロブリンを除去することにより、試料中の標的反応性免疫グロブリンの割合が増加することになる。別の例では、組換えポリペプチドが、細菌宿主細胞中で発現され、このポリペプチドが、宿主細胞タンパク質の除去により精製され、それにより組換えポリペプチドのパーセントが試料中で上昇する。

好ましい方法及び材料については後述するが、本明細書に記載されるものと類似するまたは同等の方法及び材料も、本開示の実施または試験に使用することができる。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照により、それらの全体が組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、及び例は、例示的であるに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。

２．組換えβ－ヘキソシル－トランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）ポリペプチド
本開示の実施形態は、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の産生に関連する組成物及び方法を提供する。特に、本開示は、ラクトース及びＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を、新規のβ－ヘキソシルトランスフェラーゼ（ＢＨＴ）酵素を使用して、Ｎ－アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）に富むガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）組成物に変換するための組成物及び方法を提供する。

本開示に基づいて当業者によって認識されるように、組換えｒＢＨＴタンパク質、またはｒＢＨＴタンパク質は、全長ｒＢＨＴタンパク質及び任意の断片及び／またはそのバリアントを含み、ｒＢＨＴ遺伝子の天然に存在する対立遺伝子バリアントによってコードされるタンパク質、ならびに天然に存在するｒＢＨＴタンパク質と比較して、いくつかの配列の変化を含み得る組換え産生ｒＢＨＴタンパク質を含む。組換えタンパク質は、核酸分子及び対応するペプチドを発現させるために、操作された宿主細胞に挿入されるペプチドをコードする対応する組換え核酸分子の使用を一般に含む、遺伝子工学のプロセスから生じるタンパク質であり得る。すなわち、宿主細胞は、組換えポリヌクレオチド分子でトランスフェクト、形質転換、または形質導入され、それによって、細胞が所望のポリペプチド（例えば、ｒＢＨＴ）を発現するように改変されている。

これらの実施形態によれば、本開示は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を含み、配列番号１に対して少なくとも１つのアミノ酸のＮ末端短縮を含む、機能的組換えβ－ヘキソシル－トランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１つの追加のアミノ酸置換をさらに含む。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、約１～約８１アミノ酸長であるＮ末端短縮を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端短縮は、約１～約５６アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、８３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、または８１のアミノ酸長であるＮ末端短縮を含む。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３、５、７、及び９のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３、５、７、及び９のいずれかと少なくとも９１％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３、５、７、及び９のいずれかと少なくとも９２％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３、５、７、及び９のいずれかと少なくとも９３％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３、５、７、及び９のいずれかと少なくとも９４％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３、５、７、及び９のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３、５、７、及び９のいずれかと少なくとも９６％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３、５、７、及び９のいずれかと少なくとも９７％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３、５、７、及び９のいずれかと少なくとも９８％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３、５、７、及び９のいずれかと少なくとも９９％の配列同一性を含む。

本開示に基づいて当業者によって認識されるように、可溶性分泌タンパク質及び細胞表面上に発現するタンパク質は、Ｎ末端シグナル配列を含むことができ、これは一般に、真核細胞中で小胞体（ＥＲ）の膜を介してタンパク質の挿入を媒介する疎水性配列である。１型膜貫通タンパク質もシグナル配列を含む。本明細書で使用されるシグナル配列は、ＥＲ膜を介してＥＲの内腔にタンパク質の一部または全部を挿入後、一般に酵素的に除去されるアミノ末端疎水性配列を含むことができる。したがって、シグナル配列は、分泌タンパク質または膜貫通タンパク質の前駆体形態の一部として存在する可能性があるが、一般にタンパク質の成熟形態には存在しない。タンパク質がシグナル配列を含むと言われる場合、タンパク質の前駆体形態はシグナル配列を含むが、タンパク質の成熟形態はシグナル配列を含まない可能性が高いことは理解されるべきである。シグナル配列は、この酵素的切断に重要な、切断部位（１位）に隣接して、そのすぐ上流の残基、及び３位の別の残基を含み得る。（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９７Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ１０（１）１－６；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ １９８３Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ１３３（１）７－２１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ １９８５Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ１８４ ９９－１０５を参照されたい。これは、シグナル配列及びその識別方法について説明している）。いくつかの実施形態では、本開示のｒＢＨＴポリペプチドは、可溶性または膜結合性であり得る。いくつかの実施形態では、約１％～約５０％のポリペプチドが可溶性である。いくつかの実施形態では、約１％～約４５％のポリペプチドが可溶性である。いくつかの実施形態では、約１％～約４０％のポリペプチドが可溶性である。いくつかの実施形態では、約１％～約３５％のポリペプチドが可溶性である。いくつかの実施形態では、約１％～約３０％のポリペプチドが可溶性である。いくつかの実施形態では、約１％～約２５％のポリペプチドが可溶性である。いくつかの実施形態では、約１％～約２０％のポリペプチドが可溶性である。いくつかの実施形態では、約１％～約１５％のポリペプチドが可溶性である。いくつかの実施形態では、約１％～約１０％のポリペプチドが可溶性である。

本開示の実施形態に従って、原核生物、真核生物、真菌、哺乳動物、昆虫、酵母、または植物に由来するペプチド（複数可）またはポリペプチド（複数可）に由来するシグナル配列など、任意のシグナルペプチド（複数可）またはシグナル配列（複数可）を本開示のｒＢＨＴポリペプチドに含めることができる。いくつかの実施形態では、本開示のｒＢＨＴポリペプチドに含めることができるがこれに限定されないシグナル配列（複数可）としては、Ａｈｍａｄ，Ｍ．，ｅｔ．Ａｌ．，（２０１４）「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ（Ｐｉｃｈｉａ）ｐａｓｔｏｒｉｓ：ｒｅｃｅｎｔ ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９８（１２）：５３０１－５３１７に記載のものが挙げられる。

いくつかの実施形態では、本開示のｒＢＨＴポリペプチドは、ｒＢＨＴポリペプチドを発現するように操作された宿主細胞に関して非天然または外因性であるシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のｒＢＨＴポリペプチドは、ｒＢＨＴポリペプチドを発現するように操作された宿主細胞に関して天然または内因性であるシグナル配列を含む。いずれの場合も、シグナル配列は、その天然形態／配列中であってもよく、または短縮され得、かつ／またはその天然形態／配列に関して少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことができる。

いくつかの実施形態では、シグナル配列は、酵母タンパク質に由来するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ（Ｐｉｃｈｉａ）ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ（Ｏｇａｔａｅａ）ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓのいずれか１つに由来するタンパク質に由来するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα接合因子シグナル配列（ＭＦα）（配列番号２９）、インベルターゼ（ＩＶ）シグナル配列（配列番号３０）、グルコアミラーゼ（ＧＡ）シグナル配列（配列番号３１）、またはイヌリナーゼ（ＩＮ）シグナル配列（配列番号３２）のうちの少なくとも１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９、３０、３１、または３２のいずれかと少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２９のいずれかと少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３０のいずれかと少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３１のいずれかと少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３２のいずれかと少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を含む。

本明細書にさらに記載されるとおり、本開示のｒＢＨＴポリペプチドは、配列番号２９、３０、３１、または３２のいずれかからのシグナル配列（またはその機能的断片）を含む。これの実施形態によれば、ｒＢＨＴポリペプチドは、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、または７０のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、または７０のいずれかと少なくとも９１％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、または７０のいずれかと少なくとも９２％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、または７０のいずれかと少なくとも９３％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、または７０のいずれかと少なくとも９４％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、または７０のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、または７０のいずれかと少なくとも９６％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、または７０のいずれかと少なくとも９７％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、または７０のいずれかと少なくとも９８％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、または７０のいずれかと少なくとも９９％の配列同一性を含む。

本開示のｒＢＨＴポリペプチドは、様々な程度までグリコシル化されていてもよいし、グリコシル化されていなくてもよい。例えば、本開示のｒＢＨＴポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、または７０のいずれかを含むタンパク質またはポリペプチド中に既に見出されているものに加えて、１つ以上のＮ連結型またはＯ連結型グリコシル化部位を含むことができる。当業者は、本開示に基づいて、配列Ａｓｎ Ｘｘｘ Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここでＸｘｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸）の一部であるアスパラギン残基が、Ｎ－グリカンの付加部位として働き得ることを認識するであろう。さらに、Ｏ連結型グリコシル化部位として機能し得るセリン及びスレオニン残基が存在する。グリコシル化は、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長し得る、または生物学的活性を改変させ得る。ｒＢＨＴタンパク質のバリアントには、得られたタンパク質またはポリペプチドが、グリコシル加水分解酵素及びβ－ヘキソシルトランスフェラーゼとしての機能を維持する限り、対応する野生型タンパク質またはポリペプチドに存在するよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個多いＮ連結型及び／またはＯ連結型グリコシル化部位を含むタンパク質も含まれる。バリアントｒＢＨＴポリペプチドとしは、得られたタンパク質またはポリペプチドが、グリコシル加水分解酵素及びβ－ヘキソシルトランスフェラーゼとしての機能を維持する限り、対応する野生型タンパク質またはポリペプチドに存在するよりも１、２、３、４、または５個少ないＮ連結型及び／またはＯ連結型グリコシル化部位を有するものも含まれる。いくつかの実施形態では、本開示のｒＢＨＴポリペプチドは、配列番号１に対して、２８９位、２９７位、４３１位、及び５６９位に少なくとも１つのアスパラギン残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のｒＢＨＴポリペプチドは、配列番号１に対して２８９、２９７、４３１、及び５６９位に少なくとも２つのアスパラギン残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のｒＢＨＴポリペプチドは、配列番号１に対して２８９、２９７、４３１、及び５６９位に少なくとも３つのアスパラギン残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のｒＢＨＴポリペプチドは、配列番号１に対して２８９、２９７、４３１、及び５６９位にアスパラギン残基を含む。

本開示の実施形態は、本明細書に記載のｒＢＨＴポリペプチドの分泌された可溶性バリアント、ならびに細胞表面上に発現し得る膜貫通ドメインを含むバリアントを含む。そのようなタンパク質は、ｒＢＨＴポリペプチドが調製物中に存在するタンパク質の少なくとも８０％または少なくとも９０％を構成する精製タンパク質調製物の一部として単離することができる。本開示のｒＢＨＴポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、または７０に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質及びポリペプチド、ならびにそれらの断片、誘導体、及びバリアント、例えば、融合タンパク質を包含する。

本開示のｒＢＨＴポリペプチドは、少なくとも１つのｒＢＨＴポリペプチドを含む融合タンパク質であり得、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、または７０（上に記載の通り）のいずれかのバリアント及び／または断片であるアミノ酸配列及び少なくとも１つの他の部分を含むことができる。他の部分はまた、非タンパク質部分、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、または細胞障害性、細胞増殖抑制性、発光性、及び／または放射性部分であり得る。ＰＥＧの接着は、少なくともいくつかのタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長させることが示されている。さらに、細胞傷害性、細胞増殖抑制性、発光性、及び／または放射性部分は、診断または治療目的で抗体に融合されている。ｒＢＨＴポリペプチド以外の様々なポリペプチド（またはその断片）は、様々な目的のために、例えば、タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長させるため、タンパク質の同定、単離及び／または精製を容易にするため、タンパク質の活性を増加するため、及びタンパク質のオリゴマー化を促進するために、ｒＢＨＴポリペプチドに融合することができる。

多くのポリペプチドが、一部である組換え融合タンパク質の同定及び／または精製を容易にすることができる。例としては、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、または固定化された金属イオンに対して高い親和性を有する非隣接ヒスチジン残基の天然配列であるＨＡＴ（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。これらのポリペプチドを含むｒＢＨＴタンパク質は、例えば、固定化ニッケル、または固定化コバルトトンを含むＴＡＬＯＮ（商標）樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。例えば、Ｋｎｏｌ ｅｔ ａｌ．１９９６Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７（２６）１５３５８－１５３６６を参照されたい。ポリアルギニンを含むポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィーによる効果的な精製が可能になる。他の有用なポリペプチドとしては、例えば、米国特許第５，０１１，９１２号及びＨｏｐｐ ｅｔ ａｌ．１９８８Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６ １２０４に記載の抗原同定ペプチドが挙げられる。そのような１つのペプチドは、ＦＬＡＧ（商標）ペプチドである。これは抗原性が高く、特定のモノクローナル抗体によって可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現された組換え融合タンパク質の迅速なアッセイ及び容易な精製が可能になる。４Ｅ１１と命名されたマウスハイブリドーマは、米国特許第５，０１１，９１２号に記載のとおり、特定の二価金属陽イオンの存在下で、ＦＬＡＧペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号ＨＢ９２５９で、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。ＦＬＡＧペプチドに結合するモノクローナル抗体は、ＦＬＡＧペプチドを含むポリペプチド精製試薬を回収するために、アフィニティー試薬として使用できる。他の好適なタンパク質タグ及びアフィニティー試薬は、１）固定化グルタチオンに対するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ融合タンパク質の親和性を利用するＧＳＴ－Ｂｉｎｄ（商標）システム（Ｎｏｖａｇｅｎ）に記載されているもの；２）モノクローナル抗体に対するＴ７遺伝子１０タンパク質のアミノ末端１１アミノ酸の親和性を利用する、Ｔ７－ＴＡＧ（登録商標）親和性精製キットに記載されているもの；または３）タンパク質タグに対するストレプトアビジンの操作された形態の親和性を利用するＳＴＲＥＰ－ＴＡＧ（登録商標）システム（Ｎｏｖａｇｅｎ）に記載されているものである。上記のタンパク質タグのいくつかは、他のものと同様に、Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ １９９０ ＴＩＢＴＥＣＨ８：８８－９３，Ｂｒｅｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｐｐ．２３９－２６６，Ｓｅｅｔｈａｒａｍ ａｎｄ Ｓｈａｒｍａ（ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（１９９１）、及びＢｒｅｗｅｒ ａｎｄ Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．９１－１１１，Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ（ｅｄｓ．），Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９０）に記載されている。タンパク質タグを記載するこれらの参考文献の部分は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、例えばＦＬＡＧタグとポリヒスチジンタグとの融合など、本明細書に記載のタグの２つ以上の融合を、本開示のｒＢＨＴポリペプチドに融合することができる。

いくつかの実施形態では、本開示のｒＢＨＴポリペプチドは、ポリペプチドを産生するための手段の一部として使用できるアフィニティータグも含む。本明細書にさらに記載される６Ｘ－ＨＩＳタグに加えて、抗原タグなど、様々な精製方法が使用され得る（例えば、ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．１９８８Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ６：１２０４－１２１０）、ヘマグルタニン（ＨＡ）（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４Ｃｅｌｌ３７：７６７）、インテイン融合発現システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９７Ｇｅｎｅ１９２（２），２７１－２８１、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／グルタチオン、ポリＨｉｓ／ＮｉまたはＣｏ（Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８９ ＰＮＡＳ ＵＳＡ８６：８２１－８２４）。タンパク質のＮ末端にＧＳＴタグを含む融合タンパク質もまた、米国特許第５，６５４，１７６号（Ｓｍｉｔｈ）に記載されている。Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ－ＤｙｎａＢｅａｄｓ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）などの磁気分離技術も使用することができる。あるいは、光切断可能なリンカーが使用されてもよい（例えば、第７，５９５，１９８号（Ｏｌｅｊｎｉｋ＆Ｒｏｔｈｃｈｉｌｄ））。多くの他のシステムが当技術分野で知られており、本開示の実施形態での使用に適している。

３．核酸構築物
本開示の実施形態はまた、本明細書に記載のｒＢＨＴポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子を含む。本開示の実施形態は、これらの核酸分子のいずれか１つを含むベクターも含む。いくつかの実施形態では、例えばＤＮＡ及びＲＮＡ分子などの単離された核酸は、本明細書に記載のｒＢＨＴポリペプチドをコードし、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、または７０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及びその断片及び／またはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、これらの核酸は、グリコシルヒドロラーゼ及びβ－ヘキソシル－トランスフェラーゼ活性を有する組換えタンパク質を産生するために有用である。そのような核酸は、修飾されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。場合によっては、核酸は、ｒＢＨＴタンパク質をコードする中断のないオープンリーディングフレームを含むことができる。本開示の核酸分子は、１本鎖及び２本鎖両方の形態のＤＮＡ及びＲＮＡ、ならびに対応する相補配列を含む。天然に存在する供給源から単離された核酸の場合、単離された核酸は、核酸が単離された生物のゲノム中に存在する隣接する遺伝子配列から分離された核酸であり、オリゴヌクレオチドなどの化学的に合成された核酸、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物またはｃＤＮＡなど、鋳型から酵素的に合成された核酸の場合、そのようなプロセスから生じる核酸は、単離された核酸であることが理解される。単離された核酸分子は、別個の断片の形態の、またはより大きい核酸構築物の構成成分としての核酸分子を指す。

本開示は、配列番号２、４、６、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、及び６９の配列を含む核酸もしくはその断片、または配列番号２、４、６、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、及び６９のヌクレオチド配列を含む核酸に対して、適度にストリンジェントな条件、及び任意により高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含み、完全長ｒＢＨＴ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を含み、核酸は、グリコシルヒドロラーゼ及びβ－ヘキソシルトランスフェラーゼとして作用できるタンパク質をコードする。ハイブリダイゼーション技術は、当技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ ９ ａｎｄ １１，１９８９）及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．１０及び６．３－６．４ １９９５）に記載されている。

４．産生方法
本開示の実施形態は、本明細書に記載のｒＢＨＴポリペプチドのいずれかを使用して、宿主細胞においてラクトースからＧＯＳを含む組成物（「ＧＯＳ組成物」）を生成する方法を含む。本明細書にさらに記載されるとおり、本開示のｒＢＨＴポリペプチドは、ラクトースから任意のＧＯＳ組成物（複数可）（これらに限定されないが、ＧｌｃＮＡｃの有無にかかわらずＧＯＳ、ならびにＬａｃＮＡｃに富むＧＯＳ組成物など）を生成するために、β－（１－４）グリコシド連結の加水分解を触媒して、ラクトースから任意のＧＯＳ組成物を生成する能力を示すという点で機能的である。本開示に基づいて当業者によって認識されるように、ＧＯＳは一般に、２糖単位以上を有するガラクトース含有多糖を指す；例えば、Ｇａｌ－Ｇａｌまたは［Ｇａｌ］ｎ－Ｇｌｃ（１≦ｎ≦８）、例えば、β－Ｄ－Ｇａｌ（１→４）－β－Ｄ－Ｇａｌ（１→４）－β－Ｄ－Ｇｌｃ、β－Ｄ－Ｇａｌ（１→４）－β－Ｄ－Ｇａｌ（１→４）－β－Ｄ－Ｇａｌ（１→４）－β－Ｄ－Ｇｌｃ、及びβ－Ｄ－Ｇａｌ（１→４）－β－Ｄ－Ｇａｌ（１→４）－β－Ｄ－Ｇａｌ（１→４）－β－Ｄ－Ｇａｌ（１→４）－β－Ｄ－Ｇｌｃ。

いくつかの実施形態では、本開示のｒＢＨＴポリペプチドを使用して産生されるＧＯＳは、１つ以上のＮ－アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）単位を含む。一実施形態では、ＧＯＳは、ｒＢＨＴポリペプチドを発現する宿主細胞を、例えばラクトースなどの二糖基質を含む培地中でインキュベートすることによって産生することができる。一実施形態では、ＧＯＳは、グルコース除去システムと同時にラクトースから産生される。グルコース除去システムは、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）生物であり得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または藻類細胞のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ（Ｐｉｃｈｉａ）ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｋａｍａｇａｔａａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉとも称される）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ（Ｏｇａｔａｅａ）ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来の１つ以上の細胞を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞には、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属由来の任意の細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、ＧＯＳは、Ｎ－アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ラクトース初期濃度の少なくとも１０％のＬａｃＮＡｃに富むＧＯＳ収量、及びラクトース初期濃度の少なくとも５０％の総ＧＯＳ濃度とする。いくつかの実施形態では、この方法は、ラクトース初期濃度の少なくとも１０％のＬａｃＮＡｃに富むＧＯＳ収量、及びラクトース初期濃度の少なくとも６０％の総ＧＯＳ濃度とする。いくつかの実施形態では、この方法は、ラクトース初期濃度の少なくとも１０％のＬａｃＮＡｃに富むＧＯＳ収量、及びラクトース初期濃度の少なくとも７０％の総ＧＯＳ濃度とする。いくつかの実施形態では、この方法は、ラクトース初期濃度の少なくとも１０％のＬａｃＮＡｃに富むＧＯＳ収量、及びラクトース初期濃度の少なくとも７５％の総ＧＯＳ濃度とする。例えば、初期ラクトース対ＧｌｃＮＡｃ比１：８を用いて、約２００ｇのラクトース及び約２５ｇのＧｌｃＮＡｃを有するｒＢＨＴポリペプチド（例えば、全細胞膜結合酵素）を用いて、本明細書中で提供される方法は、約２５ｇのＬａｃＮＡｃ及び約１００ｇのＧＯＳを生成する。ラクトース対ＧｌｃＮＡｃの初期比は、約１：２０～約２０：１の範囲である。

いくつかの実施形態では、本開示のｒＢＨＴポリペプチドは、ＬａｃＮＡｃ及び関連組成物を産生するのに有用である。プレバイオティックＬａｃＮＡｃは、高次のヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を生成するための最も重要なビルディングブロックの１つと見なされている。しかし、化学合成による実行可能な工業生産経路は、収率が低いことが問題であるため、ＬａｃＮＡｃの生体触媒作用が有利である。本明細書でさらに説明するように、他の生合成経路と、酵素ＢＨＴを用いたＬａｃＮＡｃの生物学的合成との間の主な違いは、低コスト及び高純度であることである。本開示の実施形態は、本明細書に記載のｒＢＨＴポリペプチドによるＬａｃＮＡｃ産生が、他のプロセスと比較した場合、工業規模により適していることを実証する。図５の例に示すとおり、ラクトース及びＧｌｃＮＡｃをｒＢＨＴポリペプチドと混合することにより、ＬａｃＮＡｃが生成される。本開示の結果は、単一の合成ステップにおいて、約２５ｇ／ＬのＧｌｃＮＡｃ及び約２００ｇ／Ｌのラクトースからの少なくとも約２５ｇ／ＬのＬａｃＮＡｃの収率を実証し、ラクトース対ＧｌｃＮＡｃの反応比約１：８である場合に、反応混合物中に最初にスズが存在した。

いくつかの実施形態では、本開示のｒＢＨＴポリペプチドは、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含まないＧＯＳ組成物を産生するために使用することができる。本開示の実施形態は、ＧｌｃＮＡｃを含まないＧＯＳ組成物を産生するための材料及び方法を含み、これは、ＧＯＳを生成するために、好適な条件下で本明細書に提供されるアミノ酸配列を有するｒＢＨＴポリペプチドとラクトースとを反応させることを含む。同様の組成物及び方法は、関連米国特許第１０，５１３，６９５号及び第９，７８３，７８９号に記載されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。

本開示のｒＢＨＴポリペプチドは、当技術分野で知られている様々な手段を使用して作製することができる。例えば、本明細書に記載のｒＢＨＴポリペプチドをコードする核酸分子は、宿主細胞に導入できるベクターに導入することができる。ｒＢＨＴポリペプチドをコードする核酸を含むベクター及び宿主細胞は、本開示の実施形態に包含される。ｒＢＨＴポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞は、ｒＢＨＴポリペプチドが発現できるような条件下で培養することができる。次いで、発現されたｒＢＨＴポリペプチドは、細胞が培養される培地から、または細胞から得られ、当技術分野で知られている多くの適切な手段のいずれかによって精製され得る。さらに、ｒＢＨＴポリペプチドを産生するための遺伝子工学的方法には、公知の方法による無細胞発現系、細胞宿主、組織、及び動物モデル中でのポリヌクレオチド分子の発現が含まれる。

ベクターは、宿主における増殖のために、選択マーカー及び複製起点を含むことができる。ベクターは、ｒＢＨＴポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子に由来するものなど、好適な転写または翻訳調節配列をさらに含むことができる。そのような調節配列の例としては、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに転写及び翻訳を制御する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、調節配列が標的タンパク質をコードするＤＮＡに機能的に関連する場合、作動可能に連結される。したがって、プロモーターヌクレオチド配列がｒＢＨＴタンパク質コード配列の転写を指令する場合、プロモーターヌクレオチド配列は、ｒＢＨＴポリペプチド配列に作動可能に連結される。ｒＢＨＴポリペプチドが融合タンパク質である場合、融合タンパク質の一部をコードする核酸配列、例えばシグナル配列は、ベクターの一部であることができ、ｒＢＨＴポリペプチドをコードする核酸は、そのようなベクターに挿入することができ、これにより、追加されたシグナル配列及びｒＢＨＴポリペプチドを含むタンパク質がベクターによってコードされるようになる。

ｒＢＨＴポリペプチドの発現に好適である宿主細胞としては、原核細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び高等真核細胞が挙げられる。ベクター内の調節配列は、宿主細胞内で作動可能であるように選択される。好適な原核宿主細胞には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属の細菌、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のメンバーが挙げられる。原核細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ中での発現のために、ｒＢＨＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、組換えポリペプチドの発現を容易にするＮ末端メチオニン残基を含む。Ｎ末端メチオニンは、発現されたポリペプチドから任意に切断され得る。好適な酵母宿主細胞としては、これらに限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）、及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓなどの属の細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞には、Ｐｉｃｈｉａ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属由来の任意の細胞が含まれる。好ましい酵母宿主は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｋａｍａｇａｔａａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉとも呼ばれる）である。昆虫宿主細胞における発現に好適である系は、例えば、Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓによる概説（１９８８ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６ ４７－５５）に記載されており、その関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。好適な哺乳動物宿主細胞としては、ＣＯＳ－７系統のサル腎臓細胞（Ｇｌｕｚｍａｎら、１９８１Ｃｅｌｌ２３ １７５－１８２）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｐｕｃｋ ｅｔ ａｌ．１９５８ＰＮＡＳ ＵＳＡ６０ １２７５－１２８１））、ＣＶ－１（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．１９７０Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ５ ２１－２７）、ヒト腎臓由来の２９３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（商標登録））カタログ番号ＣＲＬ－１０８５２（商標））、及びヒト子宮頸部癌細胞（ＨＥＬＡ）（ＡＴＣＣ（商標登録）ＣＣＬ２）が挙げられる。この段落で言及した参考文献の関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。

細胞宿主で使用するための発現ベクターは、一般に、１つ以上の表現型選択マーカー遺伝子を含む。そのような遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するタンパク質または栄養要求性要件を供給するタンパク質をコードする。多種多様なそのようなベクターが商業的供給源から容易に入手可能である。例としては、ｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＳＰＯＲＴベクター、及びｐＰＲＯＥＸベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、及びｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）が挙げられる。酵母ベクターは、多くの場合、酵母プラスミド由来の複製開始配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、及び選択マーカー遺伝子を含む。酵母及びＥ．ｃｏｌｉの両方中で複製可能なベクター（シャトルベクターと呼ばれる）も使用できる。酵母ベクターの上記の特徴に加えて、シャトルベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉでの複製及び選択のための配列も含む。酵母宿主で発現する標的ポリペプチドの直接分泌は、ｒＢＨＴコードヌクレオチド配列の５’末端に、酵母α因子リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含めることによって達成され得る。Ｂｒａｋｅ １９８９Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３ ２６９－２８０。

哺乳動物宿主細胞での使用に好適である発現ベクターの例としては、ｐｃＤ Ａ３．１／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＣ４０９（ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．１９９１ＥＭＢＯ Ｊ１０： ２８２１－２８３２）、及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が挙げられる。哺乳動物宿主細胞で使用するための発現ベクターは、ウイルスゲノムに由来する転写及び翻訳制御配列を含むことができる。

ｒＢＨＴ ＲＮＡを発現させるために使用できる一般的に使用されるプロモーター配列及びエンハンサー配列には、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス２、ポリオーマウイルス、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物発現ベクターの構築方法は、例えば、Ｏｋａｙａｍａ ａｎｄ Ｂｅｒｇ（１９８２Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ２：１６１－１７０）、Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ２３：９３５－９４１）、Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４Ｎａｔｕｒｅ３１２：７６８－７７１）、ＥＰ－Ａ－０３６７５６６、及びＷＯ９１／１８９８２に記載されている。これらの参考文献の関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本開示に基づいて当業者によって認識されるように、任意の噴霧乾燥または凍結乾燥または他の濃縮方法を使用して、反応混合物を最終生成物とすることができる。純粋な酵素の代わりに全細胞を使用する場合、細胞分離技術が必要になり得る。

５．組成物
本開示の実施形態は、本明細書に記載のポリペプチドのいずれか、及び／または本明細書に記載のポリペプチドのいずれかを使用して生成された１つ以上のＧＯＳ（例えば、ＧｌｃＮＡｃを含むまたは含まないＧＯＳ、ならびにＬａｃＮＡｃに富むＧＯＳ）を含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は食品である。いくつかの実施形態では、食品は、限定するものではないが、乳児用調製粉乳、ヨーグルト、乳製品、乳ベース飲料、フルーツ飲料、水分補給飲料、エネルギー飲料、フルーツ調製物、及びミールリプレイスメント飲料が挙げられる。

本開示に基づいて当業者によって認識されるとおり、ＧｌｃＮＡｃを含むまたは含まないＧＯＳ及びＬａｃＮＡｃに富むＧＯＳ組成物などのＧＯＳ組成物は、世界中の食品及び飲料におけるプレバイオティックサプリメントとして広く使用されている。これらの非常に貴重な非消化糖は、胃腸（ＧＩ）細菌（プロバイオティクス）の成長及び代謝にプラスの影響を有することにより、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を模倣することができる。食事へプレバイオティクスを添加することにより、胃腸の不快感を軽減すること、免疫系を管理すること、ならびに病原性及び日和見細菌及びウイルスを減少させることにより、宿主の全体的な健康状態における実質的な改善を示している。本開示の実施形態は、純粋なラクトース及びＧｌｃＮＡｃからＬａｃＮＡｃを生成するように、及び分泌された可溶性ｒＢＨＴの濃度を有意に増加させるように、プレバイオティクスを開発するための新規材料及び方法を実証する。

いくつかの実施形態では、本開示は、ｒＢＨＴタンパク質またはｒＢＨＴを発現する細胞を使用して、ＬａｃＮＡｃに富むＧＯＳ組成物を含む食品または栄養補助食品を製造することを含む。食品は、ヨーグルト、チーズ、または発酵乳製品などの酪農食品であってもよい。ｒＢＨＴまたはｒＢＨＴを発現する細胞は、食品または栄養補助食品に部分的に添加され得る。ｒＢＨＴは、噴霧乾燥を使用して乾燥させ得、これは、もっとも少量の、温度に敏感な物質を粉末形態で得る迅速かつ穏やかな方法である。乾燥ｒＢＨＴは、粒子をコーティングし、固体材料をマトリックスに固定し、マイクロカプセルを製造する噴霧乾燥機の能力を使用してカプセル化することもできる（ｗｗｗ．ｂｕｃｈｉ．ｃｏｍ／Ｍｉｎｉ＿Ｓｐｒａｙ＿Ｄｒｙｅｒ＿Ｂ－２９０．１７９．０ ＤＯＴ ｈｔｍｌ）。機能性ＧＲＡＳカプセル化剤及び技術を使用した他の薬物送達アプリケーションを使用してもよい。乾燥ｒＢＨＴ錠剤及び粉末形態は、ラクトースを含む緩衝液及び乳製品で再水和した後、ｒＢＨＴの活性速度について分析することができる。

本明細書に記載の任意のｒＢＨＴポリペプチドは、組成物の形態で、すなわち、生理学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤など、１つ以上の追加成分と共に送達され得る。例えば、組成物は、本明細書に記載の可溶性ｒＢＨＴポリペプチドに加えて、緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量ポリペプチド（１０個未満のアミノ酸を有するものなど）、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、またはデキストリン、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ、グルタチオン、及び／または他の安定剤、賦形剤、及び／または防腐剤を含んでもよい。組成物は、液体または凍結乾燥粉末として配合され得る。医薬製剤に使用され得る成分のさらなる例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６^ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，（１９８０）に示されており、その関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。

上記の治療用分子を含む組成物は、非経口、局所、経口、経鼻、経膣、経腸、または肺（吸入による）投与を含むがこれらに限定されない任意の適切な手段によって投与することができる。注射する場合、組成物（複数可）は、ボーラス注射または連続注入によって、関節内、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内または皮下に投与することができる。局所、すなわち疾患部位での投与が企図され、経皮送達及びインプラント、皮膚パッチ、または坐剤からの徐放が企図される。吸入による送達としては、例えば、鼻吸入または経口吸入、ネブライザーの使用、エアロゾル形態での吸入などが挙げられる。体腔内に挿入される坐剤による投与は、例えば、選択された体腔内に固体形態の組成物を挿入し、それを溶解させることによって達成することができる。他の代替手段としては、点眼薬、経口調製物、例えば、丸剤、トローチ剤、シロップ、チューインガム、ならびに局所調製物、例えば、ローション、ジェル、スプレー、及び軟膏剤が挙げられる。ほとんどの場合、ポリペプチドである治療用分子は、局所的に、または注射または吸入によって投与することができる。

上記の治療用分子は、治療される状態を治療するのに効果的であり得る任意の投与量、頻度、及び期間で投与することができる。投与量は、治療用分子の分子的性質及び治療される障害の性質に依存する。治療は、望ましい結果を達成するために必要な限り継続され得る。治療の周期性は、治療期間を通して一定であっても、一定でなくてもよい。例えば、治療は、最初は週間隔で行われ、その後隔週で行われ得る。数日、数週間、数ヶ月、または数年の期間を有する治療は、本開示の実施形態に包含される。治療は、中断して、再開してもよい。

維持用量は、初期治療後に投与することができる。投与量は、身長または体重に関係なく、体重１キログラムあたりのミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）、皮膚表面の平方メートルあたりのミリグラム（ｍｇ／ｍ^２）、または固定用量として測定できる。これらは、当技術分野における標準投与単位である。ヒトの皮膚表面積は、標準式を使用して、身長及び体重から計算される。例えば、治療用ｒＢＨＴタンパク質は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。あるいは、約１ｍｇ～約５００ｍｇの用量を投与することができる。または約５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇまたは３００ｍｇの用量を投与できる。

６．材料及び方法
株及び培地。株ＧＳ１１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び培地の増殖及び維持は、以前に記載されている。Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅをクローニング宿主として使用した（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。プラスミドｐＰＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、コドン最適化Ｂｈｔ（ｒＢｈｔバリアント）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＦ２９８２８）を含む発現ベクターを構築した。

プラスミド構築、ｒＢＨＴ短縮バリアントの発現及び精製。すべての分子生物学プロトコールは、以前に説明されているとおりに実施した。簡潔に言えば、短縮変異をコードするＫ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中でｒＢＨＴバリアントの発現のために構築されたプラスミドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入したプライマーを使用して、ｐＰＩＣ９－ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１－５９４）}－ＨＩＳ中のコドン最適化ｒＢｈｔオープンリーディングフレームのＰＣＲ増幅によって生成した（ＩＤＴ Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）（表５に記載）。この研究で使用した細菌株及びＫ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を表４に示す。細菌は、抗生物質アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で３７℃で成長させた。

突然変異誘発及びクローニング。短縮ｒＢＨＴバリアントをコードするプラスミドは、鋳型としてＨｏｔＳｔａｒ（登録商標）Ｔａｑ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びｐＪＢ１１０（ｐＰＩＣ９－ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１－５９４）}－ＨＩＳ）を使用して、ＰＣＲ増幅によって生成した。プライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）から購入した。適宜、クローニングを容易にするために、プライマーには制限部位を含めた（表５に記載）。簡潔に言えば、アミノ酸３２～５９４をコードする短縮型ｒＢＨＴバリアントをコードする配列のプライマーペア（プライマー：ＪＢＢ２１／ＪＢＢ５）、５４－５９４（プライマー：ＪＢＢ２２／ＪＢＢ５）、５７－５９４（プライマー：ＪＢＢ２３／ＪＢＢ５）、８２－５９４（プライマー：ＪＢＢ２４／ＪＢＢ５）、９５－５９４（プライマー：ＪＢＢ２５／ＪＢＢ５）及び１０３－５９４（プライマー：ＪＢＢ２６／ＪＢＢ５）。アンプリコンをＸｈｏＩ－ＮｏｔＩで消化し、ｐＰＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングして、それぞれ、ｐＪＢ１２３（ｐＰＩＣ９－ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳ）、ｐＪＢ１２４（ｐＰＩＣ９－ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ）、ｐＪＢ１２５（ｐＰＩＣ９－ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳ）、ｐＪＢ１２６（ｐＰＩＣ９－ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（８２－５９４）}－ＨＩＳ）、ｐＪＢ１２７（ｐＰＩＣ９－ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（９５－５９４）}－ＨＩＳ）及びｐＪＢ１２８（ｐＰＩＣ９－ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１０３－５９４）}－ＨＩＳ）を生成した。

ｐＪＢ１３４（ｐＰＩＣ９－ＩＶ－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ）、ｐＪＢ１３５（ｐＰＩＣ９－ＧＡ－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ）及びｐＪＢ１３６（ｐＰＩＣ９－ＩＮ－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ）をコードするプラスミドは、それぞれ、鋳型及びプライマーセットＪＢＢ３７／ＪＢＢ５、ＪＢＢ３８／ＪＢＢ５及びＪＢＢ３９／ＪＢＢ５として、ｐＪＢ１２４（ｐＰＩＣ９－ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ）を使用して生成した。アンプリコンをＸｈｏＩ－ＮｏｔＩで消化し、ｐＰＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））にクローニングした。

部位特異的突然変異誘発は、製造業者の指示に従って、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、所望の塩基変化を組み込むように設計された相補的オリゴヌクレオチドを使用して実施し、推定Ｎ－グリコシル化部位において、（ｐＪＢ１１２、ｐＰＩＣ９－ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ）を鋳型として使用し、ヌクレオチドを置換したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて（表５）、アスパラギンからグルタミンへの単一アミノ酸交換を含む構築物を生成した（Ｎ２８９Ｑ（プライマー：ＪＢＢ２７／ＪＢＢ２８）、Ｎ２９７Ｑ（プライマー：ＪＢＢ２９／ＪＢＢ３０）、Ｎ４３１Ｑ（プライマー：ＪＢＢ３１／ＪＢＢ３２）、及びＮ５６９Ｑ（プライマー：ＪＢＢ３３／ＪＢＢ３４））。

部位特異的突然変異誘発は、プライマーセットＪＢＢ３５／ＪＢＢ３６（表５）を使用してＭＦαからアミノ酸５７～７０を除去するためにも使用し、ｐＪＢ１３３（ｐＰＩＣ９－ＭＦα（Δ５７－７０）－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ）及びｐＪＢ１３７（ｐＰＩＣ９－ＭＦα_{（Δ５７－７０）}－ｒＢｈｔ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳ）（表４）を生成した。ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、制限酵素消化物からのＤＮＡ断片をアガロースゲルから精製した。すべての変異は、プライマー内の制限部位を検出するための制限消化と、プライマーＪＢＢ３、ＪＢＢ４、５’ＡＯＸ１、３’ＡＯＸ１、及びα因子（表１）を使用して、ＮＣ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ，ＵＳＡ）によって実行されるサンガー配列決定によって確認した。

Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓの形質転換及び発現。Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔマニュアル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）に従って、線形化されたプラスミドにより形質転換した。プラスミドの統合及びヒスチジン陽性コロニーのＭｕｔ^＋表現型は、プライマー５’ＡＯＸ１及び３’ＡＯＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐｉｃｈｉａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎキット）によって生成されたＰＣＲ産物を配列決定することによって確認した。前述のとおり、単一コピーの統合が確認された。発現及び精製は、以前に記載されている。簡潔に言えば、ろ過培養培地は、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ及びＨＩＳＴｒａｐ（商標）ＨＰ Ｎｉｃｋｅｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。精製されたタンパク質は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量化した。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンイムノブロット分析。タンパク質は、１０％分解ゲルを使用してＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ及び銀染色（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で可視化した。免疫ブロットは、抗ＨＩＳ抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の１：１０，０００希釈後、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の１：１０，０００希釈でプローブした。検出は、製造業者の指示（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って、１－Ｓｔｅｐ（商標）ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質溶液で行った。

酵素アッセイ。ＯＮＰ－Ｇｌｕ活性は、以前に記載された方法を使用して測定した（例えば、Ｄａｇｈｅｒ，Ｓ．Ｆ．，ａｎｄ Ｂｒｕｎｏ－Ｂａｒｃｅｎａ，Ｊ．Ｍ．（２０１６）Ａ ｎｏｖｅｌ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ β－ｈｅｘｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １６２，２３－３４を参照されたい）。

配列分析。アライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＸアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ／）及びＪａｌｖｉｅｗアルゴリズムを使用して生成した。ＮＣＢＩ ｂｌａｓｔｐを使用して、上位５つの相同タンパク質の配列を選択した（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）：グリコシド加水分解酵素ファミリー１タンパク質、グリコシド加水分解酵素ファミリー１タンパク質［Ｓｐｈａｅｒｏｂｏｌｕｓ ｓｔｅｌｌａｔｕｓ ＳＳ１４］、アクセッション番号ＢＡＤ９５５７０．１、グリコシド加水分解酵素［Ｖｉｏｌａｃｅｏｍｙｃｅｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ］、アクセッション番号ＫＩＪ５７３０８．１、グリコシド加水分解酵素［Ｖｉｏｌａｃｅｏｍｙｃｅｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ］、アクセッション番号ＰＷＮ４８５５３．１、仮想タンパク質ＰＦＬ１＿０６０９８［Ａｎｔｈｒａｃｏｃｙｓｔｉｓ ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ ＰＦ－１］、アクセッション番号ＸＰ＿００７８８１８２７．１、グリコシド加水分解酵素［Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒｉａ ｃｙｐｅｒｉ］、アクセッション番号ＰＷＺ０３７３６．１及びグリコシド加水分解酵素ファミリー１タンパク質［Ｇｙｍｎｏｐｕｓ ｌｕｘｕｒｉａｎｓ ＦＤ－３１７ Ｍ１］アクセッション番号ＫＩＫ５７３９０．１。

二次構造予測。ＢＨＴの二次構造コンセンサス予測は、ＰＳＩＰＲＥＤサーバー（タンパク質構造予測）及びＮＰＳ＠ｓｅｒｖｅｒ（ネットワークタンパク質配列分析）で実施した。シグナル配列は、ＳｉｇｎａｌＰ ５．０アルゴリズムを使用して予測した。タンパク質障害は、Ｄｉｓｐｒｅｄ３、Ｐｈｙｒｅ２、ＩＵＰｒｅｄ２Ａ、ＰＯＮＤＲ－ＶＳＬ２、及びＧｌｏｂＰｌｏｔ（タンパク質障害及び球状性の予測）、ＰＨＹＲＥ２の６つの方法のコンセンサスを使用して予測した。ドメイン境界は、ＤｏｍＰｒｅｄサーバー及びＰｆａｍバージョン３２．０を使用して予測した。

Ｎ－グリコシル化予測。ＢＨＴのＮ－及びＯ－グリコシル化部位の予測は、ＧｌｙｃｏＥＰサーバーで実施した（例えば、Ｃｈａｕｈａｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｒａｏ，Ａ．，ａｎｄ Ｒａｇｈａｖａ，Ｇ．Ｐ．Ｓ．（２０１３）Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ－，Ｏ－ ａｎｄ Ｃ－Ｇｌｙｃｏｓｉｔｅｓ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＰＬＯＳ ＯＮＥ ８，ｅ６７００８を参照されたい）。

リン酸化部位の予測。ＢＨＴリン酸化部位の予測は、ＤｉｓＰｈｏｓ１．３としても知られるＤＥＰＰ（Ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄａｂｉ．ｔｅｍｐｌｅ．ｅｄｕ／ｄｉｓｐｈｏｓ／）及びＮｅｔＰｈｏｓＹｅａｓｔ１．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＰｈｏｓＹｅａｓｔ／）を使用して実行した。

構造モデリングプログラム。構造図及び構造重ね合わせは、ＰｙＭＯＬで作製した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ．ｃｏｍ／ｐｙｍｏｌ／）。二量体は、結晶非対称ユニットに存在する。しかし、単量体は、構造分析のために検討した。ＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳと他の既知の構造との構造比較は、Ｄａｌｉを使用して実行した（ｈｔｔｐ：／／ｅｋｈｉｄｎａ２．ｂｉｏｃｅｎｔｅｒ．ｈｅｌｓｉｎｋｉ．ｆｉ／ｄａｌｉ／）。ＰＤＢ９０データベースに対するＤａｌｉ Ｓｅｒｖｅｒは、タンパク質構造のアラインメントのために使用した。アライメントは、ＥＳＰｒｉｐｔ／ＥＮＤｓｃｒｉｐｔプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｅｓｐｒｉｐｔ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ＥＳＰｒｉｐｔ／ＥＳＰｒｉｐｔ／）により可視化した。タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）から取得し、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａツールを使用して整列させた。

サイズ排除クロマトグラフィー。分子量を決定するために、ＮＴＡ精製サンプルをサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけ、ＳＥＣバッファ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、２００ｍＭ塩化ナトリウム）で平衡化した。ＳＥＣバッファで平衡化したタンパク質サンプルをカラムに用いた。ＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳの質量は、高分子量ゲルキャリブレーションキット（ＣｙｔｉｖａＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））の標準に基づいて計算した。

小角Ｘ線散乱：データの収集及び分析。ｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳサンプル、１ｍｇ／ｍｌ及び４ｍｇ／ｍｌを含む５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５をＲｉｇａｋｕ Ｂｉｏ－ＳＡＸＳ２０００で測定した。この機器は、ＣｕＫ_α放射線（λ＝１．５４Å）で、０．０１～０．６７Å^－１の十分なＱ範囲を提供するためにコリメートした。測定は、周囲温度で実施した。サンプルは、５分間のスキャンで合計４０分間測定した。データは、透過率及びサンプルのバックグラウンドについて修正した。Ｒｉｇａｋｕ ＳＡＸＳＬａｂ ３．１．０ｂ１４を用いて、縮小、平均化、及び緩衝液減算を行った（図７Ａ）。

７．実施例
当業者には当然のことながら、本明細書に記載の本開示の方法の他の適切な修正及び適合は、容易に適用可能かつ認識可能であり、本開示の範囲、または本明細書に開示の態様及び実施形態を逸脱することなく、適切な同等物を使用して行われてよい。本開示を詳細に説明したので、以下の実施例を参照することにより、本開示がより明確に理解され、これらは、単に開示のいくつかの態様及び実施形態を説明することのみを意図し、開示の範囲を制限するものとみなすべきではない。本明細書において参照されるすべてのジャーナルの参照、米国特許、及び出版物の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

本開示は、以下の非限定的な実施例によって示される複数の態様を有する。

実施例１
ＢＨＴのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析。翻訳後、様々な翻訳後修飾（ＰＴＭ）によってタンパク質を改変できる。この改変には、例えば、グリコシル化及びリン酸化が含まれ得る。ＰＴＭは、タンパク質のコンフォメーションを改変させ、それによって安定性、活性、細胞内分布、及び分泌に影響を与えることができる。ＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ（６Ｍ４Ｅ）の結晶構造が近年解明されたが、新規Ｎ末端領域（残基２３－５４）の最初の部分は、モデル化されておらず、依然として既知の構造が存在しない。ＢＨＴ Ｎ末端構造及びＰＴＭの正確な予測を達成するために、様々な比較方法を使用して包括的ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測を行った（図１）。

実施例２
ＢＨＴ ＧＨ１保存ドメイン内の予測されるＮ－グリコシル化部位の部位特異的突然変異誘発。グリコシル化は、グリカンをアスパラギン残基の窒素原子（Ｎ－連結）またはセリン、スレオニン、またはチロシン残基のヒドロキシル酸素に結合する（Ｏ－連結）ことによって主に生じるタンパク質の中心的な翻訳後修飾の１つであるが、Ｃ－マンノシル化、リン酸化セリングリコシル化、及び糖化（ＧＰＩアンカーの形成）によっても生じる。Ｎ－グリコシル化は、以前に概説したとおり、酵素活性、安定性、及び細胞表面発現に影響を与えることが示されている。したがって、ＢＨＴ相同体を特定するために実施した広範な検索及びアラインメント分析により、２５の潜在的なＮ連結型グリコシル化部位を予測した。そのうちの４つは、ＧＨ１ドメイン内に位置し、高度に保存されたグリコシル化コンセンサス部位（Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）が予測されており、これは、Ｎ２８９ＬＴＹ、Ｎ２９７ＳＴＳ、Ｎ４３１ＱＳＤ及びＮ５６９ＱＳＤ（図１；ＧｌｙｃｏＥＰ分析）の位置で、機能的に関連するグリコシル化の可能性が高いことを示唆するものであり、近年、ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ（ＨｓＢｇｌＡ、ＰＤＢ：６Ｍ４Ｅ）の結晶構造が確認された。それらのうち、Ｎ４３１ＱＳＤは、両方ともＮ－グリコシル化されていると予測され（図１；ＧｌｙｃｏＥＰ）、Ｎ４３１ＱＳＤ内のセリン４３３でリン酸化されている（ＮｅｔＰｈｏｓＹｅａｓｔ１．０）。したがって、膜会合ｒＢＨＴの原因となる推定領域を絞り込むのを助け、これらの部位が機能的重要性を有するかを判断するために、ＢＨＴの４つのＮ－グリコシル化部位を分析した。アスパラギン残基（Ｎ２８９、Ｎ２９７、Ｎ４３１、及びＮ５６９）は、ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳを鋳型として使用した部位特異的突然変異誘発によってグルタミン残基に独立して変異させ、材料及び方法に記載のとおりグリコシル化を無効にした。

結果は、非変異バリアントＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳの活性と比較した場合、３つのバリアント；ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）（Ｎ４３１Ｑ）}－ＨＩＳ、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）（Ｎ２８９Ｑ）}－ＨＩＳ及びＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）（Ｎ２９７Ｑ）}－ＨＩＳから分泌された可溶性酵素活性の有意な減少を示した（９０％、９５％及び９７％）。ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）（Ｎ５６９Ｑ）}－ＨＩＳバリアントは、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳと比較して、厳密ではない活性の低下（５８％）を示した（図２；表１）。親株ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳと比較した場合、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）（Ｎ２８９Ｑ）}－ＨＩＳ、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）（Ｎ２９７Ｑ）}－ＨＩＳ、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）（Ｎ４３１Ｑ）}－ＨＩＳ、及びＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）（Ｎ５６９Ｑ）}－ＨＩＳの細胞膜会合活性も、それぞれ、８１％、９５％、８４％及び７５％減少した（図２及び表１）。特に、膜結合関連活性は、大幅に減少したが、完全になくなってはおらず、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）（Ｎ５６９Ｑ）}－ＨＩＳについては、細胞膜会合活性に対する分泌の比率が、０．４０から０．６６に増加した（表１）。これは、グリコシル化が触媒活性に影響を与えるが、細胞膜の局在化を完全には決定するものではないことを示唆するものである。

実施例３
Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓによる短縮型Ｎ末端ｒＢＨＴバリアントの発現及び分泌。新規ＢＨＴＮ末端１１０領域は、既知のタンパク質との相同性がない。したがって、この領域では、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ構造予測を実施して、５つの利用可能な予測ツールを使用して、無秩序な断片の大部分を主に示した（図１）。既知のＰＳＩＰＲＥＤ及びＧｌｏｂｐｌｏｔ法を使用して、二次構造及び球状ドメインを予測した。比較すると、Ｐｈｙｒｅ２、ＩＵＰＲＥＤ２Ａ、ＤＩＳＯＰＲＥＤ３、ＧｌｏｂｐｌｏｔＤｉｓｏｒｄｅｒ及びＰＯＮＤＲから導出した障害データセット（図１）は、１８～４２、４３～５７、８７～９６、及び９６～１１０残基間の可能性のある障害境界を示している。異なる障害予測因子を組み合わせることにより、異なる定義の障害を使用するために、予測領域の信頼性が強化される。

無秩序領域の主な機能は、膜との接触時及び特異的リガンド結合時に折り畳まれる能力であると考えられている。本開示のアプローチでは、この情報を利用して、予測される無秩序断片の漸進的かつ選択的に欠失させ、それらが可溶性活性ｒＢＨＴの分泌を制限することに影響を有するか否かを決定することであった。完全ｒＢＨＴ、及び本開示で生成し、試験を行った酵素の８つのｒＢＨＴ短縮バリアントの模式図を図２Ａに示す。これらのｒＢＨＴバリアントは、ｒＢＨＴ_{（１－５９４）}－ＨＩＳ親配列からＮ末端アミノ酸ブロック基を徐々に除去することによって作成し、これらのｒＢＨＴバリアントとしては、図２Ａに示すとおり、１～２２ ｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ、１～３１ ｒＢＨＴ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳ、１～５３ ｒＢＨＴ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ、１～５６ ｒＢＨＴ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳ、１～８１ ｒＢＨＴ_{（８２－５９４）}－ＨＩＳ、１～９４ ｒＢＨＴ_{（９５－５９４）}－ＨＩＳ、１～１０２ ｒＢＨＴ_{（１０３－５９４）}－ＨＩＳ及び１～１１０ ｒＢＨＴ_{（１１１－５９４）}－ＨＩＳが挙げられる。Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ分泌膜会合酵素及び可溶性活性酵素は、前述のとおりメタノール誘導後の各短縮型バリアントについて評価した。

分泌可溶性ｒＢＨＴ短縮型タンパク質バリアントの存在を調べるために、最初にクーマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図３Ａ）、その後ウエスタンブロット分析（図３Ｂ）によって培地ブロスを検査した。分泌可溶性ｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ、ｒＢＨＴ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳ、ｒＢＨＴ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ及びｒＢＨＴ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳは、クーマシー染色（図３Ａ）及びウエスタンブロットにより明確に検出可能であった（図３Ｂ）。ｒＢＨＴ_{（８２－５９４）}－ＨＩＳ、ｒＢＨＴ_{（９５－５９４）}－ＨＩＳ、ｒＢＨＴ_{（１０３－５９４）}－ＨＩＳ、ｒＢＨＴ_{（１１１－５９４）}－ＨＩＳタンパク質バンドは、ウエスタンブロットでは検出できなかった（図２Ｂ）。または銀染色はできなかった（データは示されていないが、要求に応じて利用可能である）。これにより、５７の下流の残基が、分泌タンパク質の処理に重要であることが示唆される。これまでの結果と一致して、ｒＢＨＴ_{（１－５９４）}－ＨＩＳ バリアントは、ウエスタンブロットではほとんど見えなかった（図３Ｂ）（８）。ｐＰＩＣ９空ベクターで形質転換した誘導ＧＳ１１５のブロス培地を陰性対照として使用した場合、タンパク質バンドは検出されなかった。

最も注目すべき発見は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでｒＢＨＴ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳとｒＢＨＴ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳとの約３０ｋＤａの移動度シフトであり、これはおそらく予測されたリン酸化部位と周囲の酸性残基（Ｙ３７（ＬＴＳＮＹＥＴＰＳ）、Ｔ３９（ＳＮＹＥＴＰＳＰＴ）、Ｓ４１（ＹＥＴＰＳＰＴＡＩ）、Ｔ４３（ＴＰＳＰＴＡＩＰＬ）、Ｔ５０（ＰＬＥＰＴＰＴＡＴ）、Ｔ５２（ＥＰＴＰＴＡＴＧＴ））の欠失によるためであり（図１；ＤｉｓＰｈｏｓ３．１）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて、タンパク質を遅延させることが知られている。アルゴリズムＤｉｓＰｈｏｓ１．３（ＤＥＰＰ）は、障害情報を使用して、リン酸化部位及び非リン酸化部位の改善と同定を支援する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｏｎｄｒ．ｃｏｍ／ｐｏｎｄｒ－ｔｕｔ２．ｈｔｍｌ）。さらに、ＤＥＰＰの精度は、セリン、スレオニン、及びチロシンについて、それぞれ、７６．０＋／－０．３％、８１．３＋／－０．３％、及び８３．３＋／－０．３％に達する。リン酸化部位に隣接する領域内のアミノ酸の特徴が無秩序領域と本質的に類似しているという観察結果は、潜在的なリン酸化部位内及びその周辺の無秩序がリン酸化の前提条件であり得ることを示唆するものである。さらに、膜貫通無秩序タンパク質は、リン酸化残基が豊富であり、構造化された対応物よりも多くのパートナーと相互作用する。

上記の結果に続いて、基質としてＯＮＰ－Ｇｌｕを使用して４２℃でアッセイしたときの細胞濃度（ＯＤ_{６００ｎｍ}）に対して正規化させた可溶性タンパク質の濃度及び活性を比較した（図２）。短縮型タンパク質バリアントｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ、ｒＢＨＴ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳ、及びｒＢＨＴ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳの間で、酵素活性に有意差は検出されなかった。一方、短縮バリアントｒＢＨＴ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳは、ｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳと比較して培地中の酵素活性の３８％の上昇を示した。

さらに試験を行った機能は、主に会合した膜からの分泌を可溶形態に駆動する能力であった。膜に会合する分泌酵素活性は、ｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ、ｒＢＨＴ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳ及びｒＢＨＴ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ及びｒＢＨＴ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳでは一定であり、バリアントｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ、ｒＢＨＴ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳ及びｒＢＨＴ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳでは、分泌可溶性酵素活性対膜会合酵素活性の比は、有意差なしであることが観察された。しかし、膜との会合が見られた活性は、依然として比較的一定であったが、ｒＢＨＴ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳバリアントの分泌型酵素活性対膜会合酵素活性の比は、バリアントｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ、ｒＢＨＴ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳ及びｒＢＨＴ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳと比較した場合、２５～３８％増加した（表１）。生物活性のあるｒＢＨＴ_{（８２－５９４）}－ＨＩＳ、ｒＢＨＴ_{（９５－５９４）}－ＨＩＳ及びｒＢＨＴ_{（１０３－５９４）}－ＨＩＳバリアントが、少量ではあるが産生及び分泌されるかをさらに評価するために、対応する細胞株の誘導を行い、培養ブロスを１００倍に濃縮し、その後ニッケル樹脂を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行った。それでも、タンパク質は、溶出できず、かつ／または活性は、これらの欠失バリアントからの可溶性または細胞会合ｒＢＨＴから検出された（データは示していないが、要求に応じて利用可能できる）。活性アッセイの結果では、アミノ酸残基１～５６が活性酵素の発現及び分泌に必要でないことが示された。この発見は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットのデータと一致する（図３）。

実施例４
代替的シグナル配列の評価。広く使用されているＭＦα以外の代替的シグナル配列の試験を行うことは、増え続ける選択肢を考慮すると、困難であると考えられた。したがって、ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}バリアントを以下のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：グルコアミラーゼ（ＧＡ）、インベルターゼ（ＩＶ）、及びイヌリナーゼ（ＩＮ）のシグナル配列にマージして、キメラを生成した。実験条件下で、結果は、本開示を通じて日常的に使用されるＭＦαシグナル配列と比較して、可溶性タンパク質及び膜会合活性タンパク質の量が少ないことを示した（表１）。そのため、ＭＦαを重点的に調査することに決定した。ＭＦαプロ領域のアミノ酸５７～７０の欠失は、レポータータンパク質の分泌を少なくとも５０％高めた。ＧＳ１１５：：ＭＦα_{（Δ５７－７０）}－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ及びｄＧＳ１１５：：ＭＦα_{（Δ５７－７０）}－ｒＢｈｔ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳバリアントの発現のために、ＭＦαからアミノ酸５７～７０を除去することにより、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ及びＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳからの発現と比較して、それぞれ、５８％及び３１％の可溶性酵素の分泌の増加を得た（表１）。

これらの実験から、ＢＨＴ Ｎ末端ドメインからのＢＨＴアミノ酸５７～１１０を維持することが酵素活性、分泌、及び安定性に必要であることが推測された。これらの知見はまた、可溶性対細胞会合ｒＢＨＴの不均衡な分泌を強調するものであり、５６個のアミノ末端アミノ酸が欠失されるか、ＭＦαシグナル配列が改変されるかいずれかの場合、バランスが活性な可溶性分泌形態にシフトする（表１）。

分泌可溶性ｒＢＨＴバリアントの動力学パラメータ。カルボキシ６ｘヒスチジンエピトープ及びニッケルアフィニティクロマトグラフィー精製を使用して均質になるまで精製後、活性な可溶性の分泌型ｒＢＨＴバリアントを標準的な速度論的アッセイによって機能的に特徴を明らかにした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離及びその後の還元条件下での抗ＨＩＳモノクローナル抗体を用いた検出は、単離されたタンパク質が本質的に均質であることを示した（図３Ａ～３Ｂ）。ｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ、ｒＢＨＴ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳ、ｒＢＨＴ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ、ｒＢＨＴ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳを含む各活性分泌型可溶性バリアントの特徴を示す動力学パラメータを調べた。完全な動態像を得るために、評価する重要なパラメータは、酵素活性に対する温度の影響である。したがって、基質としてＯＮＰ－Ｇｌｕを使用して、ｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳの最適温度４２℃（８）、それより低い温度（２０及び３０℃）及び高い温度（５５℃）でアッセイを実施した。４つすべての短縮酵素バリアントのそれぞれの結果ｋｃａｔ／ｋｍは、最適温度を示す。驚くべきことに、すべての酵素短縮バリアントは、基質ＯＮＰ－Ｇｌｕ（Ｋｍ）及びターンオーバー活性（ｋｃａｔ）に対して同様の親和性を保持しており、これは、短縮が酵素の触媒完全性に影響を与えないことを示している（図４）。

実施例５
Ｎ－アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）の産生。図５Ａに示すとおり、本開示のｒＢＨＴポリペプチドは、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）へのガラクトース（ラクトースからのＧａｌ）の反復付加を触媒することができる。図５Ｂは、ｒＢＨＴによって触媒される酵素反応を実証する代表的な結果を含む。ガラクトシル－ラクトース及びＮ－アセチルグルコサミン（ＬａｃＮＡｃ）合成の時間経過研究は、全細胞膜結合タンパク質（１Ｕ ｒＢＨＴ．ｇ^－１ラクトース）を使用して実施した。アッセイには約２０ｇ／Ｌのラクトース；約１０ｇ／Ｌ Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含む５ｍＭリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）を含み、３０℃でインキュベートした。サンプルを定期的に取り出し、ＨＰＬＣによって分析し、ＥＬＳＤ及びＰＤＡにより検出した。

ここで提供されるデータは、コスト競争力のある産業規模で、ＬａｃＮＡｃを生成するための効率的な解決策を提供する。本開示のｒＢＨＴポリペプチドが、ラクトースをドナーとして、Ｎ－アセチルグルコサミンをアクセプターとして使用して、ＬａｃＮＡｃを合成する能力が実証された（図５）。これらのデータは、この酵素が、グラム濃度を超える濃度で、ＬａｃＮＡｃ（Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ）の合成を達成するための必須かつ新規のツールである証拠となり、これが、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）様糖と見なされる。これらの触媒反応は、非常に位置選択的であり、ＧｌｃＮＡｃの４位及びＤ－ガラクトースの１位でもβ－ガラクトシル連結を形成し、可溶性ＧｌｃＮＡｃから直接様々な複合糖質を合成した。得られた生成物は、Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃ（ＬａｃＮＡｃ、図５Ａ、パネルＢ）二糖類及びＧａｌβ（１，４）Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃ（ガラクトシル－ＬａｃＮＡｃ、図５Ａ、パネルＣ）三糖類を含み、２回の逐次トランスガラクトシル化によって産生された（図５Ａ～５Ｂ）。

実施例６
配列及び構造のＢＨＴ相同体。β－グルコシダーゼＧＨ１ファミリーメンバーは、ＣａＺｙ分類において、（α／β）_８ＴＩＭバレルトポロジを有する単一ドメインで構成されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／ＧＨ１＿ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ．ｈｔｍｌ）。しかし、ＢＨＴは、２つのドメインに折り畳まれる（図１）。メインドメインは、（α／β）_８ＴＩＭバレルであり、残基１１６から始まり、残基５４７（ＨｓＢｇｌＡ、ＰＤＢ：６Ｍ４Ｅ）まで伸長している（１７）。このドメインは、ＧＨ１ファミリーメンバーに共通の８つの外部αヘリックスによって接続された中央バレルを形成する８つの平行なβストランドを有する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ＿Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ＿Ｆａｍｉｌｙ＿１）。類似の構造を同定するために、Ｄａｌｉサーバーを使用して、ヒューリスティックＰＤＢ検索を実行し、ｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ（ＨｓＢｇｌＡ、ＰＤＢ：６Ｍ４Ｅ）の構造をクエリとして使用して、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ内のすべての寄託物に対して検索を実行した。ＤａｌｉサーバーＰＤＢ９０データベースの構造は、担子菌Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ （ＰＤＢ：２Ｂ３Ｚ－Ａ）由来のβ－グルコシダーゼＢＧＬ１Ａが、ｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳのＣドメインに最も近い構造一致であり、最も高いＺスコアが４９．３であることが明らかになった（表２）。この場合、４６０のアミノ酸Ｃαのうち４５０が、ｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ構造及び３４％及び配列同一性で重ね合わせることができた。ｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳとの構造的類似性及び相違点を直接比較するために、Ｚスコアが４６．５を超え、ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．が１．８Å未満の上位５つの構造を選択した。興味深いことに、構造的に一致する上位５つは、真菌のβ－グルコシダーゼでもあり、アラインメントは、５つすべてについて、ｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳのＣ末端ドメインに特異的である（表２）。

Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ＢＧＬ１Ａ（ＰＤＢ：２Ｂ３Ｚ－Ａ）の他に、このリストには、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来のβ－グルコシダーゼ（ＰＤＢ：３ＡＨＹ－Ｂ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ由来のβ－１，４－グルコシダーゼ（ＰＤＢ：５ＢＷＦ－Ａ）、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ由来のβ－グルコシダーゼ（ＰＤＢ：４ＭＤＯ－Ａ）、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ由来のβ－グルコシダーゼ（ＰＤＢ：５ＪＢＯ－Ａ）が記載されている。これら上位５つの構造とｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳとの一次配列アラインメントは、コアＧＨ１構造が共有されている一方で、そのＮ末端が明確で独特であることを示している（図６Ａ）。配列同一性は、３１％から３４％までほとんど変化しなかったが、酵素配列中の求核剤及び一般的な酸／塩基残基は良好に整列した。これらの構造とｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ（ＨｓＢｇｌＡ，ＰＤＢ：６Ｍ４Ｅ）構造の重ね合わせは、ｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳのＣ末端コアが、ＧＨ１タンパク質の典型的なバレルの中心に位置する触媒ポケットの輪郭を示す（図６Ａ～６Ｂ）ループＡ～Ｄに見られる変動性を除いて、他のＧＨ１構造とほぼ同一である。最も顕著な特徴は、ループＣ（残基４２３～４３３、ＮＧＩＡＮＣＩＲＮＱＳ）での長い挿入及びループＡ（Ｙ１４７）、ループＢ（Ｑ２８２、Ｎ２８３、Ｌ２９０）、ループＣ（Ｓ４６０及びＡ４６１）及びループＤ（Ｌ５１０、Ｙ５１１、Ｑ５１２）及びＴ２４４、Ｇ２４５、Ｇ３２７、Ｔ３２８、Ｇ３７４、Ｋ４８９での短い挿入及びＰ５７３の挿入（図６Ａ）である。挿入された残基は、構造の表面に存在する（図６Ｂ）。興味深いことに、５つのすべての構造相同体において、ループＣ内の非－（α／β）_８ＴＩＭバレルβ８及びループＤ内のβ９は、ＨｓＢｇｌＡ（ＰＤＢ：６Ｍ４Ｅ）に見られるものよりもはるかに長く、３番目のβシートは、ループＣ内のα１７で置換されている（図６Ａ）。確立された４つのＮ－グリコシル化部位（Ｎ２８９、Ｎ２９７、Ｎ４３１及びＮ５６９）すべてにＮ－グリコシル化残基が存在しないことも注目に値する（図６Ａ）。

ＣａＺｙデータベースは、ＧｅｎＢａｎｋに４０，０００を超えるＧＨ１タンパク質が含まれており、２７０を超えるＰＤＢ構造が利用可能であることを示している。ＲＣＳＢ ＰＤＢデータベース（ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）からのＧＨ１タンパク質配列は、ＳＡＮＳｐａｒａｌｌｅｌを使用して抽出し（ｈｔｔｐ：／／ｅｋｈｉｄｎａ２．ｂｉｏｃｅｎｔｅｒ．ｈｅｌｓｉｎｋｉ．ｆｉ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｓａｎｓ／ｓａｎｓ．ｃｇｉ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａプログラムと連携している。ＢＨＴのＣ末端ドメインと構造的に相同で、Ｚスコアが４０を超える６０個のＧＨ１遺伝子のアミノ酸配列は、互いに６０％の配列同一性を示し、ＢＨＴとは２７～３３％の同一性を示し、Ｎ末端には一致しなかった。さらに、Ｎ末端ドメインのアミノ酸配列のＢｌａｓｔ分析では、一致は確認されなかった。この配列と構造の比較データから、６Ｍ４Ｅ構造に見られるＢＨＴのＮ末端の構造は、ＧＨ１タンパク質にとって新規であり、現在ＰＤＢデータベースに近い構造相同体を有しないと結論付けた。

実施例７
Ｎ末端欠失がｒＢＨＴ二量体化に及ぼす影響。ｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳは、セファクリルＳ－２００を充填したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムによって測定された溶液中の二量体形態として存在し、ｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳが、二量体状態に対応する計算されたＭ_ｗ１５０ｋＤａ、保持時間１２．５分を有する単一ピークとして溶出されたことを示した（データは示していないが、要求に応じて利用可能にすることができる）。微小Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）によって溶液中で二量体立体構造をさらに検証した（図７Ａ）。Ｇｕｉｎｉｅｒ及びＰ（ｒ）分析は、それぞれ、ＰＲＩＭＵＳ及びＧＮＯＭを使用して実施した。Ｐ（ｒ）計算を最適化するために、Ｄ_ｍａｘ値をＧＮＯＭで手動で選択した（図７Ｂ）。これらのＤ_ｍａｘ値は、近似値である。約±２～３Å。分子量は、Ｒａｍｂｏ ａｎｄ Ｔａｉｎｅｒによって記述された方法を使用して計算した。データを表３に示す。ＳＡＸＳから求めた分子量（約１６９ＫＤａ）では、ＢＨＴが溶液中で二量体を形成することが確認された（表３）。溶液中の二量体のＲ_ｇ及びＤ_ｍａｘは、それぞれ、３９Å及び１２４Åである。堆積したＸ線結晶構造（６Ｍ４Ｅ、６Ｍ４Ｆ、及び６Ｍ５５）も、ＢＨＴが二量体を形成することを示唆している。Ｃｒｙｓｏｌを使用して計算した６Ｍ４Ｆ結晶二量体（分子Ａ及び分子Ｃ）のＲ_ｇ及びＤ_ｍａｘは、それぞれ３４Å及び１１０Åである。これらの値は、ＳＡＸＳ実験データと十分に一致している。無秩序なＮ末端は、溶液中でより拡大した二量体をもたらし、ｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳは、二量体として機能する可能性が高いと結論付けた。同様に、ｒＢＨＴ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳ、ｒＢＨＴ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ、及びｒＢＨＴ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳのＳＥＣ分析も二量体形成を示し（データは示していないが、要求に応じて利用可能にすることができる）、これは、残基２３～５６にまたがる非構造化領域が、二量体化に関与していないことを示唆するものである

８．配列
本開示の様々な実施形態に関連する配列を以下の表に提供する。

本開示の実施形態に関連する株及びプラスミドを以下の表に提供する。

上記の詳細な説明及び付随する実施例は、例示であるに過ぎず、添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物によってのみ定義される本開示の範囲に対する制限であると解釈されるべきではないことを理解されたい。

上記明細書に記載した全ての刊行物及び特許は、本明細書に明示的に記載されるかのように、参照により本明細書に援用される。開示された実施形態に対する様々な変更及び修正は、当業者には明らかであり、その趣旨及び範囲から逸脱することなく行うことができる。

Ｈ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ由来のβ－ヘキソシルトランスフェラーゼの予測される構造翻訳後修飾及び無秩序二次モチーフ対秩序二次モチーフを示す図である。ＢＨＴタンパク質のグリコシル化、リン酸化、及び二次構造は、様々なアルゴリズムを使用して予測した。記述しているのは、ＰＳＩＰＲＥＤ及びＧｌｏｂｐｌｏｔＧｌｏｂｕｌａｒ予測ツールを使用したＢＨＴの構造エレメント、保存領域、及び機能ドメインである。無秩序領域は、Ｐｈｙｒｅ２、ＩＵＰＲＥＤ２Ａ、ＤＩＳＯＰＲＥＤ３、ＧｌｏｂｐｌｏｔＤｉｓｏｒｄｅｒ、及びＰＯＮＤＲアルゴリズムを使用して予測した。リン酸化サーバーＤｉｓＰｈｏｓ１．３及びＮｅｔＰｈｏｓＹｅａｓｔ１．０は、リン酸化部位を示す。ＧｌｙｃｏＥＰは、Ｎ－グリコシル化（赤い線）及びＯ－グリコシル化（黒い線）を示すが、Ｃ－マンノシル化部位は予測されなかった。各予測線の下の数字は、ＢＨＴアミノ酸残基番号を示す。 図２Ａ：ｒＢＨＴバリアントの酵素活性比較は、ＡＯＸ１プロモーター制御下で、ｒＢｈｔ－ＨＩＳの短縮型バリアントを保持する組換えＫ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株によって生成された分泌可溶性タンパク質量（最終培養物（ＯＤ_{６００ｎｍ}）について正規化）である。（Ａ）リーダードメインとｒＢｈｔバリアントの ＯＲＦとの組み合わせを含む生成されたキメラ遺伝子のグラフにより図示したものである。特定のタグ、突然変異、及び欠失が示されている。図２Ｂ：ｒＢＨＴバリアントの酵素活性比較は、ＡＯＸ１プロモーター制御下で、ｒＢｈｔ－ＨＩＳの短縮型バリアントを保持する組換えＫ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株によって生成された分泌可溶性タンパク質量（最終培養物（ＯＤ_{６００ｎｍ}）について正規化）である。次の組換え株によって分泌された可溶性分泌タンパク質のタンパク質濃度（Ｂ）を比較した：列１、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ_{（１－５９４）}－ＨＩＳ；列２、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１－５９４）}－ＨＩＳ；列３、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ；列４、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}（Ｎ２８９Ｑ）－ＨＩＳ；列５、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}（Ｎ２９７Ｑ）－ＨＩＳ；列６、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}（Ｎ４３１Ｑ）－ＨＩＳ；列７、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}（Ｎ５６９Ｑ）－ＨＩＳ；列８、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳ；列９、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；列１０、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳ；列１１、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（８２－５９４）}－ＨＩＳ；列１２、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（９５－５９４）}－ＨＩＳ；列１３、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１０３－５９４）}－ＨＩＳ；列１４、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１１１－５９４）}－ＨＩＳ；列１５、ＧＳ１１５：：ＩＶ－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；列１６、ＧＳ１１５：：ＧＡ－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；列１７、ＧＳ１１５：：ＩＮ－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；列１８、ＧＳ１１５：：ＭＦα_{（Δ５７－７０）}－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ；列１９、ＧＳ１１５：：ＭＦα_{（Δ５７－７０）}－ｒＢｈｔ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳ；列２０、ＧＳ１１５（Ｈｉｓ^＋）対照。図２Ｃ：ｒＢＨＴバリアントの酵素活性比較は、ＡＯＸ１プロモーター制御下で、ｒＢｈｔ－ＨＩＳの短縮型バリアントを保持する組換えＫ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株によって生成された分泌可溶性タンパク質量（最終培養物（ＯＤ_{６００ｎｍ}）について正規化）である。次の組換え株によって分泌された可溶性分泌タンパク質の酵素活性（Ｃ）を比較した：列１、ＧＳ１１５：：ｒＢｈｔ_{（１－５９４）}－ＨＩＳ；列２、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１－５９４）}－ＨＩＳ；列３、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ；列４、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}（Ｎ２８９Ｑ）－ＨＩＳ；列５、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}（Ｎ２９７Ｑ）－ＨＩＳ；列６、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}（Ｎ４３１Ｑ）－ＨＩＳ；列７、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}（Ｎ５６９Ｑ）－ＨＩＳ；列８、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳ；列９、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；列１０、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳ；列１１、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（８２－５９４）}－ＨＩＳ；列１２、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（９５－５９４）}－ＨＩＳ；列１３、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１０３－５９４）}－ＨＩＳ；列１４、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１１１－５９４）}－ＨＩＳ；列１５、ＧＳ１１５：：ＩＶ－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；列１６、ＧＳ１１５：：ＧＡ－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；列１７、ＧＳ１１５：：ＩＮ－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；列１８、ＧＳ１１５：：ＭＦα_{（Δ５７－７０）}－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ；列１９、ＧＳ１１５：：ＭＦα_{（Δ５７－７０）}－ｒＢｈｔ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳ；列２０、ＧＳ１１５（Ｈｉｓ^＋）対照。 図３Ａ：クーマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０％）分離及びウエスタンブロットを示す図である。図は、Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５の異なる組換え体によって発現したタンパク質無細胞抽出物（可溶性分泌タンパク質）を示している。（Ａ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって生成された分離タンパク質の抗ＨＩＳ抗血清にさらした；レーン１、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ－ＨＩＳ；レーン２、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ；レーン３、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳ；レーン４、ＧＳ１１５：：αＭＦ－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；レーン５、ＧＳ１１５：：αＭＦ－ｒＢｈｔ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳ；レーン６、ＧＳ１１５：：αＭＦ－ｒＢｈｔ_{（８２－５９４）}－ＨＩＳ；レーン７、ＧＳ１１５：：αＭＦ－ｒＢｈｔ_{（９５－５９４）}－ＨＩＳ；レーン８、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１０３－５９４）}－ＨＩＳ；レーン９、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１１１－５９４）}－ＨＩＳ；レーン１０、空ｐＰＩＣ９ベクターを含むＧＳ１１５対照。比較を補助するために、各レーンに等量をロードした。各ウェルにロードした総タンパク質（ｎｇ）は、上記（Ａ）に示す。「－－－」は、濃度を測定できなかったことを示す。Ｍは、分子量タンパク質マーカーを含むレーンを示し、（ｋＤａ）は、パネルの左側に表示する。図３Ｂ：クーマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０％）分離及びウエスタンブロットを示す図である。図は、Ｋ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５の異なる組換え体によって発現したタンパク質無細胞抽出物（可溶性分泌タンパク質）を示している。（Ｂ）ウエスタンブロットによって生成された分離タンパク質の抗ＨＩＳ抗血清にさらした；レーン１、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ－ＨＩＳ；レーン２、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ；レーン３、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳ；レーン４、ＧＳ１１５：：αＭＦ－ｒＢｈｔ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ；レーン５、ＧＳ１１５：：αＭＦ－ｒＢｈｔ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳ；レーン６、ＧＳ１１５：：αＭＦ－ｒＢｈｔ_{（８２－５９４）}－ＨＩＳ；レーン７、ＧＳ１１５：：αＭＦ－ｒＢｈｔ_{（９５－５９４）}－ＨＩＳ；レーン８、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１０３－５９４）}－ＨＩＳ；レーン９、ＧＳ１１５：：ＭＦα－ｒＢｈｔ_{（１１１－５９４）}－ＨＩＳ；レーン１０、空ｐＰＩＣ９ベクターを含むＧＳ１１５対照。比較を補助するために、各レーンに等量をロードした。各ウェルにロードした総タンパク質（ｎｇ）は、上記（Ｂ）に示す。「－－－」は、濃度を測定できなかったことを示す。Ｍは、分子量タンパク質マーカーを含むレーンを示し、（ｋＤａ）は、パネルの左側に表示する。 ２０℃、３０℃、４２℃、及び５５℃で試験したｒＢＨＴバリアントの酵素動力学パラメータを示す図である。ｋｃａｔ／ｋｍ対温度。酵素アッセイは、０．３μｇのｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ、ｒＢＨＴ_{（３２－５９４）}－ＨＩＳ、ｒＢＨＴ_{（５４－５９４）}－ＨＩＳ、及びｒＢＨＴ_{（５７－５９４）}－ＨＩＳの存在下で、「方法」に記載のＯＮＰ－Ｇｌｕ基質濃度の範囲（０．０８～１０．４ｍＭ）で実施した。Ｋｍ及びｋｃａｔは、Ｈｉｌｌ式を使用して、ＯＮＰ－Ｇｌｕ切断の初期速度から算出した。値は、３つの独立した測定値の平均±標準偏差（ＳＤ）である。 図５Ａ：ラクトース／Ｎ－アセチルグルコサミン１：２の比でのＮ－アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）の産生例を示す図である。本開示の組換えＢＨＴ（ｒＢＨＴ）ポリペプチドは、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）へのガラクトース（ラクトースからのＧａｌ）の反復付加を触媒することができる。図５Ｂ：ラクトース／Ｎ－アセチルグルコサミン１：２の比でのＮ－アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）の産生例を示す図である。ｒＢＨＴ によって触媒される酵素反応を示す。ガラクトシル－ラクトース（Ｇａｌ－ラクトース）、ガラクトシル－Ｎ－アセトアラクトサミン（Ｇａｌ－ＬａｃＮＡｃ）、及びＮ－アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）合成の時間経過研究の例は、全細胞膜結合タンパク質（１Ｕ ｒＢＨＴ．ｇ^－１ラクトース）を使用して実施した。アッセイには約２０ｇ／Ｌのラクトース；約１０ｇ／Ｌ Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含む５ｍＭリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）を含み、３０℃でインキュベートした。サンプルを定期的に取り出し、ＨＰＬＣによって分析し、ＥＬＳＤ及びＰＤＡにより検出した。 ６ｍ４ｅ（ＨｓＢｇｌＡ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ）と構造的にＧＨ１相同タンパク質との複数の二次構造アラインメントを示す図である。（Ａ）ＰＤＢデータベースから最も構造的に相同であることが判明したタンパク質とてしては、２Ｅ３ＺＡ（ＢＧＬ１Ａ）、３ＡＨＹＢ（ＴｒＢｇｌ２）、５ＢＷＦＡ（ＴｈＢｇｌ）、４ＭＤＯＡ（ＨｉＢＧ）、及び５ＪＢＯＡ（ＴｈＢｇｌ２）が挙げられる（表４）。一次配列アラインメントは、下部に示す。ｒＢＨＴ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ］の二次構造エレメント及びその名称は、アラインメントの上に示す。βストランドは、黒い矢印で示し、コイルによるαヘリックス構造、厳密なαターン（ＴＴＴ文字）、βターン（ＴＴ文字）、及びηは、３_１０ヘリックスランダムコイルを指す。（α／β）－Ｔｉｍバレル構造の二次構造エレメントの番号は、構造アライメントの上に（α１－α８）及び（β１－β８）として示す。ＨｓＢｇｌＡ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ非構造化領域の分析では、アミノ末端からカルボキシル末端までのＨｓＢｇｌＡのアミノ酸の番号には、破線の矢印で示されている欠失シグナル配列（残基１～２２）及び点線で示されている結晶構造（残基２３－５３）から欠落している非構造化領域を含む。アミノ酸は、％配列類似性に基づいて、ＣｌｕｓｔａｌＯにより整列させた。同一の残基は、背景が黒の白で、保守的変更は、背景が灰色のボックスで囲まれている。挿入は、紫色の背景で強調表示されている。触媒酸／塩基求核残基は、星印で示す。ＨｓＢｇｌＡ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳに見られるグリコシル化部位は、三角で示す。図６Ａは、図１に示すＮ末端における予測されるリン酸化部位及び潜在的Ｏ－グリコシル化部位を示し、それぞれの部位を四角及び丸で示す。コンセンサス配列は、整列された配列の下部に示す。画像は、ＥＮＤｓｃｒｉｐｔ２．０ Ｗｅｂサーバーを使用して生成し（ｈｔｔｐ：／／ｅｎｄｓｃｒｉｐｔ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ＥＳＰｒｉｐｔ／ＥＮＤｓｃｒｉｐｔ／）（５）、Ｄａｌｉタンパク質構造比較サーバー（ｈｔｔｐ：／／ｅｋｈｉｄｎａ２．ｂｉｏｃｅｎｔｅｒ．ｈｅｌｓｉｎｋｉ．ｆｉ／ｄａｌｉ／）で得られたデータを使用して、ＨｓＢｇｌＡ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ（ＰＤＢ ＩＤ：Ｍ６Ｅ４）に基づいて、３Ｄ結晶構造とタンパク質データバンクの結晶構造比較から導出した（Ｈｏｌｍ，２０１９）。 ６ｍ４ｅ（ＨｓＢｇｌＡ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ）と構造的にＧＨ１相同タンパク質との複数の二次構造アラインメントを示す図である。ＨｓＢｇｌＡ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ（ＰＤＢＩＤ：Ｍ６Ｅ４）４つの伸長ループＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、青、緑、黄、及び赤で着色され、基質結合ポケット入口を形成するのと同色の矢印として示され、（Ａ）の二次構造の上に示されている。ＰｙＭＯＬを使用して生成した（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ／２／）。 ６ｍ４ｅ（ＨｓＢｇｌＡ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ）と構造的にＧＨ１相同タンパク質との複数の二次構造アラインメントを示す図である。ＨｓＢｇｌＡ_{（２３－５９４）}－ＨＩＳ（ＰＤＢＩＤ：Ｍ６Ｅ４）の保存度は、赤から青への色のグラデーションによって表す。深い赤色は、より保存された残基を意味し、より可変的残基は、深い青色である。ＰｙＭＯＬを使用して生成した（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ／２／）。 図７Ａ：１ｍｇ／ｍｌ（赤）と４ｍｇ／ｍｌ（青）のＢＨＴのＳＡＸＳデータを示す図である。ＳＡＸＳデータは、対数プロット（左）に示す。Ｉ（Ｑ）は、任意の単位である。図７Ｂ：ＳＡＸＳデータから計算されたＰ（ｒ）曲線は、最大高さ１．０に正規化される。

Claims (27)

1. 配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性、及び配列番号１に関して少なくとも１つのアミノ酸のＮ末端短縮を含む、機能的組換えβ－ヘキソシル－トランスフェラーゼ（ｒＢＨＴ）ポリペプチド。
2. 配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 少なくとも１つの追加のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
4. 前記Ｎ末端短縮が、約１～約８１アミノ酸長である、請求項１～３のいずれかに記載のポリペプチド。
5. 前記Ｎ末端短縮が、約１～約５６アミノ酸長である、請求項１～４のいずれかに記載のポリペプチド。
6. 配列番号３、５、７、及び９のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項１～５のいずれかに記載のポリペプチド。
7. シグナル配列をさらに含む、請求項１～６のいずれかに記載のポリペプチド。
8. 前記シグナル配列が非天然である、請求項７に記載のポリペプチド。
9. 前記シグナル配列が、酵母タンパク質由来のアミノ酸配列を含む、請求項７または請求項８に記載のポリペプチド。
10. 前記シグナル配列が、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ（Ｐｉｃｈｉａ）ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ（Ｏｇａｔａｅａ）ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓのいずれか１つに由来するタンパク質に由来するアミノ酸配列を含む、請求項７～９のいずれかに記載のポリペプチド。
11. 前記シグナル配列が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα接合因子シグナル配列（ＭＦα）（配列番号２９）、インベルターゼ（ＩＶ）シグナル配列（配列番号３０）、グルコアミラーゼ（ＧＡ）シグナル配列（配列番号３１）、またはイヌリナーゼ（ＩＮ）シグナル配列（配列番号３２）のうちの少なくとも１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項７～１０のいずれかに記載のポリペプチド。
12. 配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、または７０のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項７～１１のいずれかに記載のポリペプチド。
13. 配列番号１に対して、２８９位、２９７位、４３１位、及び／または５６９位に少なくとも１つのアスパラギン残基を含む、請求項１～１２のいずれかに記載のポリペプチド。
14. 可溶性または膜結合性である、請求項１～１３のいずれかに記載のポリペプチド。
15. 前記ポリペプチドの約１％～約５０％が可溶性である、請求項１４に記載のポリペプチド。
16. ラクトースβ－（１－４）グリコシド連結の加水分解を触媒する、請求項１～１５のいずれかに記載のポリペプチド。
17. 前記ポリペプチドによるラクトースβ－（１－４）グリコシド連結の加水分解の触媒は、ＬａｃＮＡｃに富むＧＯＳを含む組成物を生成する、請求項１６に記載のポリペプチド。
18. 請求項１～１７のいずれかに記載のポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子。
19. 請求項１８に記載の核酸を含むベクター。
20. 請求項１～１７のいずれかに記載のポリペプチドのうちのいずれかを使用して、宿主細胞においてラクトースからＧＯＳ組成物を生成する方法。
21. 前記ＧＯＳ組成物が、ＬａｃＮＡｃに富むＧＯＳ及び／またはＧｌｃＮＡｃ非含有ＧＯＳを含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記宿主細胞が、酵母細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または藻類細胞のうちの１つ以上である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記宿主細胞が、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ（Ｐｉｃｈｉａ）ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ（Ｏｇａｔａｅａ）ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来の１つ以上の細胞を含む、請求項２２に記載の方法。
24. ラクトース初期濃度の少なくとも１０％のＬａｃＮＡｃに富むＧＯＳ収量、及びラクトース初期濃度の少なくとも５０％の総ＧＯＳ濃度とする、請求項２１～２３のいずれかに記載の方法。
25. 請求項１～１７に記載のポリペプチドのいずれか及び／または請求項１～１７のポリペプチドのいずれかを使用して生成された１つ以上のＬａｃＮＡｃに富むＧＯＳを含む組成物。
26. 食品である、請求項２５に記載の組成物。
27. 前記食品が、乳児用調製粉乳、ヨーグルト、乳製品、乳ベース飲料、フルーツ飲料、水分補給飲料、エネルギー飲料、フルーツ調製物、及びミールリプレイスメント飲料のうちの１つ以上を含む、請求項２６に記載の組成物。

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