JPWO2019069977A1 - アルカリホスファターゼの製造方法及びそれを用いて得られるアルカリホスファターゼ、並びにその製造のためのベクター及び形質転換体 - Google Patents
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Abstract
Description
効率良く均質に抗体を標識するためには、さらには、そのように標識された抗体(標識抗体)を利用して精度の良い臨床検査結果を得るためには、標識される抗体自体が、できる限り均質なものであることが好ましい。そして、そのためには、標識酵素自体も、できる限り均質なものであることが望ましい。
例えば標識抗体を均質なものとする方法として、抗体を標識する工程の後工程においては、標識された抗体と、標識されきらなかった抗体と、余剰の標識酵素とを物理的分離手法を用いて分離して、標識された抗体のみを取得する作業が必要となる。この作業において、標識酵素自体が、例えば分子量の点であるいは酵素としての性能の点で、不均一な混合物のような状態であった場合には、標識抗体も不均一な分子量及び酵素としての性能を有することとなってしまう場合がある。
また、ALPには複数のアイソフォームが存在することも知られており、それらは比活性においてもばらつきを有しているため、例えば異なる比活性特性等を有する複数のアイソフォームの混合物からなるALP組成物を標識酵素として用いて抗体を標識したような場合においては、得られる標識抗体には活性の面での不均一性も生じてしまうこととなる。この観点からも、標識酵素自体の均質性を高めることに対するニーズが存在する。
加えて、酵母細胞を宿主としたALP発現系においては、哺乳類細胞を宿主として発現させる時よりも生産量は多いとは言えるものの、生産されるALPはほとんど細胞外に分泌されず、細胞中に蓄積される。すなわち、ALPを取得するためには、酵母細胞を破砕して、細胞中のあらゆるその他の成分との混合状態の中から目的のALPを精製する工程を要し、製造工程上の作業効率の面でも未だ改善の余地を有する。
[1]
アルカリホスファターゼ(ALP)を生産する能力を有するアスペルギルス(Aspergillus)属形質転換体を培養する工程を含む、ALPの製造方法。
[2]
ALPは、N型糖鎖付加モチーフの一部に糖鎖が付加しない変異を含むALPである、
[1]に記載のALPの製造方法。
[3]
アスペルギルス属形質転換体は、ALPのN末端側に、CDHss、CDHcytbkex、CDHcytbKexmut1〜4、CDHall、GlaB、GlaBss、CelBss、CelB、SKIK_CDHss、AsAP1ss54、及びAsAP3ss72からなる群より選択されるアスペルギルス属菌由来の分泌シグナルペプチドを有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する、
[1]又は[2]に記載のALPの製造方法。
[4]
アスペルギルス属形質転換体は、ALPをコードする塩基配列に対して、その5’末端側に:
以下の(a)〜(c)のいずれかの塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子:
(a)配列番号2〜15のいずれかの塩基配列;
(b)配列番号2〜15のいずれかの塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列;
(c)配列番号2〜15のいずれかの塩基配列と90%以上の相同性を有し、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列;
あるいは、
以下の(d)〜(f)のいずれかの分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子:
(d)配列番号17〜30のいずれかのアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチド;
(e)配列番号17〜30のいずれかのアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド;
(f)配列番号17〜30のいずれかのアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド;
を有する、
[1]又は[2]に記載のALPの製造方法。
[5]
ALPは、ALPII又はIVである、
[1]〜[4]のいずれかに記載のALPの製造方法。
[6]
ALPは、以下の(i)〜(iii)のいずれかのタンパク質:
(i)配列番号31又は32のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(ii)配列番号31又は32のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつALP活性を有するタンパク質;
(iii)配列番号31又は32のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつALP活性を有する活性を有するタンパク質;
あるいは、
以下の(iv)〜(vi)のいずれかの塩基配列によりコードされるタンパク質:
(iv)配列番号33又は34の塩基配列;
(v)配列番号33又は34の塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつALP活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;
(vi)配列番号33又は34の塩基配列と90%以上の相同性を有し、かつ、ALP活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;
を有する、
[1]〜[5]のいずれかに記載のALPの製造方法。
[7]
ALPは、3個のN型糖鎖付加モチーフのうち1個又は2個に変異を有し、変異を有する該N型糖鎖付加モチーフには糖鎖が付加していないALPIIである、
[1]〜[6]のいずれかに記載のALPの製造方法。
[8]
ALPIIにおいて、N型糖鎖付加モチーフが有する変異は、配列番号31の122位、249位、251位、及び410位のうちの1個又は2個である、
[7]に記載のALPの製造方法。
[9]
ALPIIにおいて、N型糖鎖付加モチーフが有する変異は、配列番号31の122位におけるAsnからGln又はLysへの変異、249位におけるAsnからGln、Asp又はHisへの変異、251位におけるThrからCysへの変異、410位におけるAsnからGln又はLysへの変異のうちの1個又は2個である、
[7]又は[8]に記載のALPの製造方法。
[10]
アスペルギルス属形質転換体がショウユコウジカビ(Aspergillus sojae:アスペルギルス・ソーヤ)、ニホンコウジカビ(Aspergillus oryzae (Ahlburg) Cohn:アスペルギルス・オリゼー)、クロコウジカビ(Aspergillus luchuensis:アスペルギルス・リュウキュウエンシス)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamarii)、アスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・ウサミ(Aspergillus usamii)、又はアスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi)のいずれかの形質転換体である、
[1]〜[9]のいずれかに記載のALPの製造方法。
[11]
アスペルギルス属形質転換体を培養した培養物から分泌画分を得る工程、及び、
分泌画分からALPを抽出する工程、
をさらに含む、
[1]〜[10]のいずれかに記載のALPの製造方法。
[12]
ゲルろ過法によって測定される分子量が80〜150kDaである、糖鎖付加アルカリホスファターゼ(ALP)II。
[12−1]
単離された[12]に記載のALPII。
[13]
ALPのN末端側に対して、CDHss、CDHcytbkex、CDHcytbKexmut1〜4、CDHall、GlaBss、CelBss、CelB、SKIK_CDHss、AsAP1ss54、及びAsAP3ss72からなる群より選択されるアスペルギルス属菌由来の分泌シグナルペプチドを有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する、アスペルギルス属形質転換用ベクター。
[14]
ALPをコードする塩基配列に対して、その5’末端側に:
以下の(a)〜(c)のいずれかの塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子:
(a)配列番号2〜15のいずれかの塩基配列;
(b)配列番号2〜15のいずれかの塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列;
(c)配列番号2〜15のいずれかの塩基配列と90%以上の相同性を有し、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列;
あるいは、
以下の(d)〜(f)のいずれかの分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子:
(d)配列番号17〜30のいずれかのアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチド;
(e)配列番号17〜30のいずれかのアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド;
(f)配列番号17〜30のいずれかのアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド;
を有する、アスペルギルス属形質転換用ベクター。
[15]
[13]又は[14]に記載のアスペルギルス属形質転換用ベクターを用いて形質転換された、アスペルギルス属形質転換体。
[16]
[1]〜[11]のいずれかに記載のALPの製造方法によって得られる、糖鎖付加アルカリホスファターゼ。
本発明のALPの製造方法(以下、本発明製造方法と略称する。)とは、ALPを生産する能力を有するアスペルギルス属形質転換体(以下、本発明形質転換体と略称する。)を培養する工程を含む製造方法である。より具体的には、ウシ腸管由来のALPを組換え発現によって製造する方法であって、ウシ腸管由来のALPを生産する能力を有する本発明形質転換体を培養する工程を含む製造方法である。
ALPは単離されたALPであってもよく、単離する方法としては、例えば後述する抽出する工程が挙げられる。
本発明に用いるALPをコードする遺伝子を得るには、一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を用いることができる。例えば、ウシ腸管細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNA又はmRNAを抽出する。さらにmRNAを鋳型としてcDNAを合成することができる。
このようにして得られた染色体DNA又はcDNAのライブラリーを作製する。
次いで、ウシ腸管由来のALPのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブDNAを合成して、これを用いて染色体DNA又はcDNAのライブラリーからスクリーニングする方法あるいは上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーDNAを作製して、5’RACE法あるいは3’RACE法等の適当なポリメラーゼ連鎖反応(PCR法)により、目的の遺伝子断片を含むDNAを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むDNAを得ることができる。
本発明形質転換体は、特に限定されないが、上述したように得られた種々の組換え体DNAを用いて、アスペルギルス属菌株を形質転換又は形質導入し、種々の改変されたALP遺伝子断片を保有する組換え体DNAを含むアスペルギルス属形質転換体として得ることができる。
以下の(a)〜(c)のいずれかの塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子:
(a)配列番号2〜15のいずれかの塩基配列;
(b)配列番号2〜15のいずれかの塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列;
(c)配列番号2〜15のいずれかの塩基配列と90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列;
あるいは、
以下の(d)〜(f)のいずれかの分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子:
(d)配列番号17〜30のいずれかのアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチド;
(e)配列番号17〜30のいずれかのアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド;
(f)配列番号17〜30のいずれかのアミノ酸配列と90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド;
を有する。
配列番号2の塩基配列は、麹菌セロビオースデヒドロゲナーゼ(CDH)由来の分泌シグナルペプチド(CDHss)をコードする塩基配列である。
配列番号3の塩基配列は、キャリアタンパク質である麹菌CDH由来のシトクロームbドメインとKex2切断リンカーからなる分泌シグナルペプチド(CDHcytbkex)をコードする塩基配列である。
配列番号4の塩基配列は、キャリアタンパク質である麹菌CDH由来のシトクロームbドメインとKex2切断リンカー変異体1からなる分泌シグナルペプチド(CDHcytbkexmut1)をコードする塩基配列である。
配列番号5の塩基配列は、キャリアタンパク質である麹菌CDH由来のシトクロームbドメインとKex2切断リンカー変異体2からなる分泌シグナルペプチド(CDHcytbkexmut2)をコードする塩基配列である。
配列番号6の塩基配列は、キャリアタンパク質である麹菌CDH由来のシトクロームbドメインとKex2切断リンカー変異体3からなる分泌シグナルペプチド(CDHcytbkexmut3)をコードする塩基配列である。
配列番号7の塩基配列は、キャリアタンパク質である麹菌CDH由来のシトクロームbドメインとKex2切断リンカー変異体4からなる分泌シグナルペプチド(CDHcytbkexmut4)をコードする塩基配列である。
配列番号8の塩基配列は、キャリアタンパク質である麹菌CDHとKex2切断リンカーからなる分泌シグナルペプチドキャリアタンパク質(CDHall)をコードする塩基配列である。
配列番号9の塩基配列は、麹菌グルコアミラーゼB由来の分泌シグナルペプチド(GlaBss)をコードする塩基配列である。
配列番号10の塩基配列は、キャリアタンパク質である麹菌グルコアミラーゼBとKex2切断リンカーからなる分泌シグナルペプチド(GlaB)をコードする塩基配列である。
配列番号11の塩基配列は、麹菌エンドグルカナーゼ由来の分泌シグナルペプチド(CelBss)をコードする塩基配列である。
配列番号12の塩基配列は、キャリアタンパク質である麹菌エンドグルカナーゼとKex2切断リンカーからなる分泌シグナルペプチド(CelB)をコードする塩基配列である。
配列番号13の塩基配列は、麹菌CDH由来の分泌シグナルペプチドの開始コドン直後にSKIKのアミノ酸配列が挿入された分泌シグナルペプチド(SKIK_CDHss)をコードする塩基配列である。
配列番号14の塩基配列は、麹菌ALP由来の分泌シグナルペプチド1(AsAP1ss54)をコードする塩基配列である。
配列番号15の塩基配列は、麹菌ALP由来の分泌シグナルペプチド3(AsAP1ss72)をコードする塩基配列である。
配列番号17のアミノ酸配列は、麹菌セロビオースデヒドロゲナーゼ由来の分泌シグナルペプチド(CDHss)のアミノ酸配列である。
配列番号18のアミノ酸配列は、キャリアタンパク質である麹菌CDH由来のシトクロームbドメインとKex2切断リンカーからなる分泌シグナルペプチド(CDHcytbkex)のアミノ酸配列である。
配列番号19のアミノ酸配列は、キャリアタンパク質である麹菌CDH由来のシトクロームbドメインとKex2切断リンカー変異体1からなる分泌シグナルペプチド(CDHcytbkexmut1)のアミノ酸配列である。
配列番号20のアミノ酸配列は、キャリアタンパク質である麹菌CDH由来のシトクロームbドメインとKex2切断リンカー変異体2からなる分泌シグナルペプチド(CDHcytbkexmut2)のアミノ酸配列である。
配列番号21のアミノ酸配列は、キャリアタンパク質である麹菌CDH由来のシトクロームbドメインとKex2切断リンカー変異体3からなる分泌シグナルペプチド(CDHcytbkexmut3)のアミノ酸配列である。
配列番号22のアミノ酸配列は、キャリアタンパク質である麹菌CDH由来のシトクロームbドメインとKex2切断リンカー変異体4からなる分泌シグナルペプチド(CDHcytbkexmut4)のアミノ酸配列である。
配列番号23のアミノ酸配列は、キャリアタンパク質である麹菌CDHとKex2切断リンカーからなる分泌シグナルペプチド(CDHall)のアミノ酸配列である。
配列番号24のアミノ酸配列は、麹菌グルコアミラーゼB由来の分泌シグナルペプチド(GlaBss)のアミノ酸配列である。
配列番号25のアミノ酸配列は、キャリアタンパク質である麹菌グルコアミラーゼBとKex2切断配列からなる分泌シグナルペプチド(GlaB)のアミノ酸配列である。
配列番号26のアミノ酸配列は、麹菌エンドグルカナーゼ由来の分泌シグナルペプチド(CelBss)のアミノ酸配列である。
配列番号27のアミノ酸配列は、キャリアタンパク質である麹菌エンドグルカナーゼとKex2切断配列からなる分泌シグナルペプチド(CelB)のアミノ酸配列である。
配列番号28のアミノ酸配列は、麹菌CDH由来の分泌シグナルペプチドの開始コドン直後にSKIKのアミノ酸配列が挿入された分泌シグナルペプチド(SKIK_CDHss)のアミノ酸配列である。
配列番号29のアミノ酸配列は、麹菌ALP由来の分泌シグナルペプチド1(AsAP1ss54)のアミノ酸配列である。
配列番号30のアミノ酸配列は、麹菌ALP由来の分泌シグナルペプチド3(AsAP1ss72)のアミノ酸配列である。
分泌率=(培養上清総活性[U]÷(培養上清総活性[U]+菌体内画分総活性[U])×100)
本発明形質転換体のALPの分泌活性は、特に限定されないが、例えば後述の実施例におけるAPIVssを分泌シグナルペプチドとして用いた場合の分泌率と同等以上の分泌活性であることが好ましく、より具体的には後述の実施例において測定される分泌率として、10%以上であることがより好ましく、20%以上であることがさらに好ましく、30%以上であることがよりさらに好ましい。
より具体的には、ウシ腸管由来のALPアイソフォームII(bIAPII又はALPII)が、3個のN型糖鎖付加モチーフのうち1個又は2個に変異を有し、変異を有する該N型糖鎖付加モチーフには糖鎖が付加しないように、デザインされた遺伝子を有する。さらに具体的には、そのウシ腸管由来のALPIIにおいて、N型糖鎖付加モチーフが有する変異が、配列番号31の122位、249位、251位、及び410位のうちの1個又は2個である。より具体的には、そのウシ腸管由来のALPIIにおいて、N型糖鎖付加モチーフが有する変異は、配列番号31の122位におけるAsnからGln又はLysへの変異、249位におけるAsnからGln、Asp又はHisへの変異、251位におけるThrからCysへの変異、410位におけるAsnからGln又はLysへの変異のうちの1個又は2個である。
(i)配列番号31又は32のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(ii)配列番号31又は32のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつALP活性を有するタンパク質;
(iii)配列番号31又は32のアミノ酸配列と90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつALP活性を有する活性を有するタンパク質;
あるいは、
以下の(iv)〜(vi)のいずれかの塩基配列によりコードされるタンパク質:
(iv)配列番号33又は34の塩基配列;
(v)配列番号33又は34の塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつALP活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;
(vi)配列番号33又は34の塩基配列と90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ、ALP活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;
を有する。
本発明形質転換体のALP活性は、特に限定されないが、例えば形質転換前の野生株を培養して得られる分泌画分と同等以上の活性であることが好ましく、より具体的には分泌画分における後述する酵素活性値(U/ml)が10(U/ml)以上であることがより好ましい。
配列番号32のアミノ酸配列は、ウシ腸管由来アルカリホスファターゼIV(bIAPIV)のアミノ酸配列である。
配列番号34の塩基配列は、ウシ腸管由来アルカリホスファターゼIV(bIAPIV)をコードする塩基配列である。
本発明形質転換体を培養する工程は、特に限定されないが、本発明変異化物を固体培養法又は液体培養法のいずれで培養してもよく、液体培養法で培養することが好ましい。
A.試薬の調製
(1)試薬1:1.0M MgCl2溶液
2.03gのMgCl2・6H2Oをイオン交換水に溶解し、10mlに定容する。
(2)試薬2:ジエタノールアミン(DEA)バッファー(用時調製)
52.2gDEA(Sigma―Aldrich社)を400mLイオン交換水に溶解し、0.25ml MgCl2溶液(試薬1)を加える。その後、37℃に暖めてから、2N HClでpH9.8に調整し、イオン交換水で500mlに定容する。
(3)試薬3:0.65M p−ニトロフェニルリン酸溶液
247mg p−ニトロフェニルリン酸(Sigma―Aldrich社)を1mlのイオン交換水に溶解する。
(4)酵素希釈液
活性測定値が、0.10〜0.20U/mlになるようにDEAバッファー(試薬2)で希釈する。
B.活性測定法
2.90mlのDEAバッファー(試薬2)と0.05mlのp−ニトロフェニルリン酸溶液(試薬3)を混和し、37℃で5分加温する。その後、0.05mlの酵素希釈液を添加し、混合の後、分光光度計(U−3010、日立ハイテクノロジーズ社)により、405nmにおける吸光度を測定する。測定値(ΔODtest)は、405nmにおける2分後から4分後の1分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液(ΔODblank)は、酵素液の代わりに0.05mlのDEAバッファーを加える以外は前記と同様にしたものである。下記の計算式に従い、算出した値を酵素活性値(U/ml)とした。
C.比活性の算出
酵素溶液のタンパク質濃度(mg/ml)は分光光度計(U−3010、日立ハイテクノロジーズ社)を用いて280nmにおける吸光度を測定し、1.0OD=1.0mg/mlとして算出した。酵素活性値(U/ml)をタンパク質濃度(mg/ml)で除して、比活性(U/mg)を算出した。
(1−1)コンストラクト用プラスミドの作製
国際公開第2016/121285号パンフレットの「[例1.遺伝子AsEgtA、AsEgtB又はAsEgtCを挿入したDNAコンストラクトの作製](3)コンストラクト用プラスミドの作製」に記載の方法と同様の方法で、In−Fusion HD Cloning Kit(クロンテック社)に付属されているpUC19 linearized VectorのマルチクローニングサイトにあるIn−Fusion Cloning Siteに翻訳伸長因子遺伝子tef1のプロモーター配列であるPtef、アルカリプロテアーゼ遺伝子alpのターミネーター配列であるTalp、及びウリジン要求性を相補する形質転換マーカー遺伝子pyrGを連結させたコンストラクト用プラスミドを作製した。
コンストラクト用プラスミドのPtef及びTalpの間に、対象遺伝子であるbIAPIIを連結させたDNAコンストラクトを次のとおりに作製した。
鋳型DNAとして上記で得られたコンストラクト用プラスミド、PCRの酵素としてKOD−Plus−DNA Polymerase(東洋紡社)、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてT100TM サーマルサイクラー(BIO−RAD社)を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースPCRを実施することによりコンストラクト用プラスミドのベクター断片を得た。使用したプライマーを下記に示す。増幅したベクター断片を1%(w/v)アガロースゲル中で分離し、QIAquick Gel Extraction Kit(キアゲン社)を用いて精製した。
その後、氷水中で大腸菌コンピテントセルECOS Competent E.coli JM109(ニッポンジーン社)にDNAコンストラクト液を1/10量混合し、5分間氷水中で放置した後、42℃、45秒間処理することで形質転換した。その後、50 μg/mlのアンピシリンを含むLB(Luria−Bertani)プレートへ塗り広げた。これを37℃で一晩静置培養し、コロニーを形成させた。
得られたコロニーを、50μg/mlのアンピシリンを含むLB液体培地で37℃、一晩振とう培養した。培養後の培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体について、FastGene Plasmid Mini Kit(日本ジェネティクス社)を用いて、そのキットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドDNA(DNAコンストラクト)を抽出した。
抽出したプラスミドDNA中に挿入された各DNAの塩基配列を決定することにより、CDHss―bIAPIIが挿入されたDNAコンストラクト(DNAコンストラクト名:pbIAPII)が得られたことを確認した。
N型糖鎖付加モチーフ改変型ALP_Asn122Gln(Δ1)を生成するために、CDHss―bIAPIIが挿入された遺伝子挿入DNAコンストラクト(pbIAPII)をテンプレートとし、PCRの酵素としてKOD−Plus−DNA Polymerase(東洋紡社)、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてT100TM サーマルサイクラー(BIO−RAD社)を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースPCRを実施した。使用したプライマーを下記に示す。増幅したDNA断片を1%(w/v)アガロースゲル中で分離し、QIAquick Gel Extraction Kit(キアゲン社)を用いて精製した。上記のDNA断片を、In−Fusion HD Cloning Kitを使用して、そのキットに添付されたプロトコールに従って連結して、N型糖鎖付加モチーフへの変異Asn122Glnを含むCDHss―bIAPIIが挿入された遺伝子挿入DNAコンストラクト(pΔ1)を得た。以降、下記表に基づいて順次部位特的変異を導入することで各種のN型糖鎖付加モチーフ改変型ALP遺伝子挿入DNAコンストラクトを得た。
(2−1)Aspergillus sojae NBRC4239株由来pyrG破壊株
各遺伝子挿入DNAコンストラクトをエタノール沈殿した後に、TEバッファーに溶解して、所望の濃度に調製したDNA溶液を、下記の手順でAspergillus sojae NBRC4239株由来pyrG破壊株(pyrG遺伝子の上流48bp、コード領域896bp、下流240bp欠損株)の形質転換に用いた。
500ml容三角フラスコ中の20mMウリジンを含むポリペプトンデキストリン液体培地100mlに、Aspergillus sojae NBRC4239株由来pyrG破壊株の分生子を接種し、30℃で約20時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び20μgの遺伝子挿入DNAコンストラクトを用いて、プロトプラストPEG法により形質転換を行い、次いで0.5%(w/v)寒天及び1.2Mソルビトールを含むCzapek−Dox最少培地(ディフコ社;pH6)を用いて、30℃、5日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換Aspergillus sojaeを得た。
得られた形質転換Aspergillus sojaeは、ウリジン要求性を相補する遺伝子であるpyrGが導入されることにより、ウリジン無添加培地に生育できるようになることで、目的の遺伝子が導入された株として選択できた。
3L容ジャーファーメンター中の液体培地(2%(w/v)ハイポリペプトン(日本製薬社)、2%(w/v)パインデックス#2(松谷化学工業社)、1%(w/v)酵母エキス(オリエンタル酵母社)、0.25%(w/v)KH2PO4(和光純薬工業社)、0.25%(w/v)K2HPO4(和光純薬工業社)、0.05%(w/v)MgSO4・7H2O(和光純薬工業社)、3mM MgCl2(和光純薬工業社)、0.1mM ZnCl2(和光純薬工業社);pH未調整)1800mlに、各種形質転換株の分生子を接種し30℃、撹拌速度250rpm、通気毎分25L、0.05MPa圧力下で培養を開始し、48時間後から撹拌速度500rpmに変更し、計5日間培養を行った。次いで、培養後の培養物をミラクロス(カルバイオケム社)でろ過分離し、培養上清と菌体を回収した。回収した菌体を蒸留水で洗浄した後、菌体をペーパータオルに挟むことによって水分を押し出して湿菌体を得た。得られた湿菌体を秤量し、50mg湿菌体/mlになるようTrisバッファー(20mM Tris−HCl pH8.0、3mM MgCl2、0.1mM ZnCl2)を添加して、ホモジナイズ処理後、一部をジルコニアビーズと共に2mlスクリューキャップバイアルに入れ、ビーズショッカー(MS−100R、トミー精工社)を用いて2500rpm、20秒間の破砕を2回繰り返した。次いで、15000×gで5分間遠心し、得られた遠心上清を菌体内画分とした。
得られた培養上清画分と菌体内画分のALP活性測定を上述した「B.活性測定法」以下の記載に従い、分泌率(培養上清総活性[U]÷(培養上清総活性[U]+菌体内画分総活性[U])×100)を計算した(図1)。
特開2008−5734号の実施例5で得られるALP生産酵母S.pombeの培養液を同様に作製し、その培養液を遠心分離して菌体と培養上清画分に分け、続いて菌体をTrisバッファー(10mM Tris−HCl pH7.0、5mM MgCl2、0.1mM ZnCl2)に懸濁してビーズショッカーで菌体を破砕し、菌体内画分を取得した。得られた培養上清画分と菌体内画分について、実施例3と同様の方法でALP活性測定を行い、実施例3と同様に分泌率を計算した(図1)。
培養上清を8000rpm、90分間間遠心分離して上清を回収し、限外ろ過膜AIP−1010(旭化成社)により濃縮、Trisバッファーで透析した。内液を回収し0.45μmフィルター(材質PES、ミリポア社)を通過したろ液を回収した。Trisバッファーで平衡化したQ−Sepharose Fast Flow(GEヘルスケア社)陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに試料を吸着させた後、1M NaClを含むTrisバッファーでグラジエント溶出した。終濃度30%になるように硫酸アンモニウムを加え、0.2μmフィルター(材質PES、ミリポア社)を通過したろ液を回収した。次いで、30%硫酸アンモニウムを含むTrisバッファーで平衡化したTOYOPearl Butyl―650C(東ソー社)疎水カラムクロマトグラフィーに試料を吸着させた後、Trisバッファーでグラジエント溶出し、限外ろ過膜アミコンウルトラ−15(分画分子量30kDa、ミリポア社)を用いて濃縮した。次いで、Trisバッファーで平衡化したHiload Superdex200pg(GEヘルスケア社)ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより分画精製した。
精製された各種ALPのALP活性を測定し、タンパク質量を280nmの吸光度により求め、比活性を算出した(図2)。
麹菌発現したbIAPII、Δ1、Δ1k、Δ13、及びΔ1k3は6000U/mg以上の高い比活性を示した。
Aspergillus sojae NBRC4239株の代わりにAspergillus oryzae RIB40株を用いた以外は実施例2〜5と同じ手順で、形質転換Aspergillus oryzae発現bIAPIIを調製した。
精製された各種ALPの分子量をHPLC(Agilent 1220 Infinity LC、アジレント社)を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した。0.1M NaClを含んだ100mMリン酸バッファーpH7.0で平衡化したTSK−gel G3000SW(7.5mmI.D.×30cm、東ソー社)に精製ALP溶液50μLをアプライし、カラム温度25℃、流速1mL/minで同バッファーにより溶出させ、280nmの吸光度を測定した。分子量マーカー(MW−Marker proteins、オリエンタル酵母工業社)により検量線を作成し、精製ALPの分子量を算出した(表4)。対照として、市販の酵母組換え発現ウシ腸管由来ALP(Alkaline Phosphatase recombinant highly active:Roche_ALP、Roche社)、脱糖鎖処理された酵母組換え発現ウシ腸管由来ALP(Alkaline Phosphatase recombinant highly active, Carbohydrate Reduced:Roche_ALP_CR、Roche社)、及び高比活性なウシ腸管抽出物由来ALP(ALP13G、BBI solutions社)を用いた。
(8−1)コンストラクト用プラスミドの作製
実施例1−1のCDHss―bIAPIIを挿入したDNAコンストラクト用プラスミドと同様の手順で、各種分泌シグナルペプチドが融合したbIAPIVを挿入したDNAコンストラクト用プラスミドを作製した。
コンストラクト用プラスミドのPtef及びTalpの間に、対象遺伝子であるbIAPIV遺伝子を連結させたDNAコンストラクトを次のとおりに作製した。
鋳型DNAとして上記で得られたコンストラクト用プラスミド、PCRの酵素としてKOD−Plus−DNA Polymerase(東洋紡社)、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてT100TM サーマルサイクラー(BIO−RAD社)を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースPCRを実施することによりコンストラクト用プラスミドのベクター断片を得た。使用したプライマーを下記に示す。増幅したベクター断片を1%(w/v)アガロースゲル中で分離し、QIAquick Gel Extraction Kit(キアゲン社)を用いて精製した。
その後、氷水中で大腸菌コンピテントセルECOS Competent E.coli JM109(ニッポンジーン社)にDNAコンストラクト液を1/10量混合し、5分間氷水中で放置した後、42℃、45秒間処理することで形質転換した。その後、50 μg/mlのアンピシリンを含むLB(Luria−Bertani)プレートへ塗り広げた。これを37℃で一晩静置培養し、コロニーを形成させた。
得られたコロニーを、50μg/mlのアンピシリンを含むLB液体培地で37℃、一晩振とう培養した。培養後の培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体について、FastGene Plasmid Mini Kit(日本ジェネティクス社)を用いて、キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドDNA(DNAコンストラクト)を抽出した。
抽出したプラスミドDNA中に挿入された各DNAの塩基配列を決定することにより、bIAPIV合成遺伝子が挿入されたDNAコンストラクト(pbIAPIV)が得られたことを確認した。
bIAPIV合成遺伝子がコードするN末端側分泌シグナルペプチドが表3に示す分泌シグナルペプチド(Kex2切断リンカーを融合したキャリアタンパク質としての分泌シグナルペプチドを含む。)に置き換えられたbIAPIV合成遺伝子が挿入された種々のDNAコンストラクトを次のとおりに作製した。
得られたコロニーを、50μg/mlのアンピシリンを含むLB液体培地で37℃、一晩振とう培養した。培養後の培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体について、FastGene Plasmid Mini Kit(日本ジェネティクス社)を用いて、キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドDNA(DNAコンストラクト)を抽出した。
抽出したプラスミドDNA中に挿入されたDNAの塩基配列を決定することにより、目的のDNAコンストラクト(pCDHall、pGlaB、及びpCelB)が得られたことを確認した。
上述の方法でプレート培養し、得られたコロニーを培養後、菌体からプラスミドDNAを回収した。抽出したプラスミドDNA中に挿入されたDNAの塩基配列を決定することによりDNAコンストラクト(pCDHcytbkex)が得られたことを確認した。
上述の方法でプレート培養し、得られたコロニーを培養後、菌体からプラスミドDNAを回収した。抽出したプラスミドDNA中に挿入されたDNAの塩基配列を決定することによりDNAコンストラクト(pCDHss)が得られたことを確認した。
上述の方法でプレート培養し、得られたコロニーを培養後、菌体からプラスミドDNAを回収した。抽出したプラスミドDNA中に挿入されたDNAの塩基配列を決定することによりDNAコンストラクト(pSKIK_CDHss)が得られたことを確認した。
上述の方法でプレート培養し、得られたコロニーを培養後、菌体からプラスミドDNAを回収した。抽出したプラスミドDNA中に挿入されたDNAの塩基配列を決定することによりDNAコンストラクト(pCDHcytbkexmut1、pCDHcytbkexmut2、pCDHcytbkexmut3、pCDHcytbkexmut4)が得られたことを確認した。
上述の方法でプレート培養し、得られたコロニーを培養後、菌体からプラスミドDNAを回収した。抽出したプラスミドDNA中に挿入されたDNAの塩基配列を決定することによりDNAコンストラクト(pGlaBss)が得られたことを確認した。
上述の方法でプレート培養し、得られたコロニーを培養後、菌体からプラスミドDNAを回収した。抽出したプラスミドDNA中に挿入されたDNAの塩基配列を決定することにより、bIAPIV遺伝子の上流にCelBssをコードする遺伝子が挿入されたDNAコンストラクト(pCelBss)が得られたことを確認した。
上述の方法でプレート培養し、得られたコロニーを培養後、菌体からプラスミドDNAを回収した。抽出したプラスミドDNA中に挿入されたDNAの塩基配列を決定することによりDNAコンストラクト(pAsAP1ss54及びpAsAP3ss72)が得られたことを確認した。
実施例8で得られた各種分泌シグナルペプチドを有するbIAPIV合成遺伝子を挿入したDNAコンストラクトを用い、実施例2に記載の方法に従って、Aspergillus sojae NBRC4239株由来pyrG破壊株の形質転換株を取得した。
50mL容三角フラスコ中の液体培地(2%(w/v)ハイポリペプトン(日本製薬社)、2%(w/v)パインデックス#2(松谷化学工業社)、1%(w/v)酵母エキス(オリエンタル酵母社)、0.25%(w/v)KH2PO4(和光純薬工業社)、0.25%(w/v)K2HPO4(和光純薬工業社)、0.05%(w/v)MgSO4・7H2O(和光純薬工業社)、3mM MgCl2(和光純薬工業社)、0.1mM ZnCl2(和光純薬工業社);pH未調整)20mlに、実施例9で得られた各種形質転換株の分生子を接種し30℃、撹拌速度180rpmで培養を開始し、計3日間培養を行った。次いで、培養後の培養物をミラクロス(カルバイオケム社)でろ過分離し、培養上清と菌体を回収した。回収した菌体を蒸留水で洗浄した後、菌体をペーパータオルに挟むことによって水分を押し出して湿菌体を得た。得られた湿菌体を秤量し、50mg湿菌体/mlになるようTrisバッファー(20mM Tris−HCl pH8.0、3mM MgCl2、0.1mM ZnCl2)を添加して、ホモジナイズ処理後、一部をジルコニアビーズと共に2mlスクリューキャップバイアルに入れ、ビーズショッカー(MS−100R、トミー精工社)を用いて2500rpm、20秒間の破砕を2回繰り返した。次いで、15000×gで5分間遠心し、得られた遠心上清を菌体内画分とした。
得られた培養上清画分と菌体内画分のALP活性測定を特開2008−5734号に記載の方法で行い、分泌率(培養上清総活性[U]÷(培養上清総活性[U]+菌体内画分総活性[U])×100)を計算した(図3)。
Claims (15)
- アルカリホスファターゼ(ALP)を生産する能力を有するアスペルギルス(Aspergillus)属形質転換体を培養する工程を含む、ALPの製造方法。
- ALPは、N型糖鎖付加モチーフの一部に糖鎖が付加しない変異を含むALPである、
請求項1に記載のALPの製造方法。 - アスペルギルス属形質転換体は、ALPのN末端側に、CDHss、CDHcytbkex、CDHcytbKexmut1〜4、CDHall、GlaB、GlaBss、CelBss、CelB、SKIK_CDHss、AsAP1ss54、及びAsAP3ss72からなる群より選択されるアスペルギルス属菌由来の分泌シグナルペプチドを有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する、
請求項1又は2に記載のALPの製造方法。 - アスペルギルス属形質転換体は、ALPをコードする塩基配列に対して、その5’末端側に:
以下の(a)〜(c)のいずれかの塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子:
(a)配列番号2〜15のいずれかの塩基配列;
(b)配列番号2〜15のいずれかの塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列;
(c)配列番号2〜15のいずれかの塩基配列と90%以上の相同性を有し、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列;
あるいは、
以下の(d)〜(f)のいずれかの分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子:
(d)配列番号17〜30のいずれかのアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチド;
(e)配列番号17〜30のいずれかのアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド;
(f)配列番号17〜30のいずれかのアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド;
を有する、
請求項1又は2に記載のALPの製造方法。 - ALPは、ALPII又はIVである、
請求項1〜4のいずれか一項に記載のALPの製造方法。 - ALPは、以下の(i)〜(iii)のいずれかのタンパク質:
(i)配列番号31又は32のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(ii)配列番号31又は32のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつALP活性を有するタンパク質;
(iii)配列番号31又は32のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつALP活性を有する活性を有するタンパク質;
あるいは、
以下の(iv)〜(vi)のいずれかの塩基配列によりコードされるタンパク質:
(iv)配列番号33又は34の塩基配列;
(v)配列番号33又は34の塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつALP活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;
(vi)配列番号33又は34の塩基配列と90%以上の相同性を有し、かつ、ALP活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;
を有する、
請求項1〜5のいずれか一項に記載のALPの製造方法。 - ALPは、3個のN型糖鎖付加モチーフのうち1個又は2個に変異を有し、変異を有する該N型糖鎖付加モチーフには糖鎖が付加していないALPIIである、
請求項1〜6のいずれか一項に記載のALPの製造方法。 - ALPIIにおいて、N型糖鎖付加モチーフが有する変異は、配列番号31の122位、249位、251位、及び410位のうちの1個又は2個である、
請求項7に記載のALPの製造方法。 - ALPIIにおいて、N型糖鎖付加モチーフが有する変異は、配列番号31の122位におけるAsnからGln又はLysへの変異、249位におけるAsnからGln、Asp又はHisへの変異、251位におけるThrからCysへの変異、410位におけるAsnからGln又はLysへの変異のうちの1個又は2個である、
請求項7又は8に記載のALPの製造方法。 - アスペルギルス属形質転換体がショウユコウジカビ(Aspergillus sojae:アスペルギルス・ソーヤ)、ニホンコウジカビ(Aspergillus oryzae (Ahlburg) Cohn:アスペルギルス・オリゼー)、クロコウジカビ(Aspergillus luchuensis:アスペルギルス・リュウキュウエンシス)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamarii)、アスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・ウサミ(Aspergillus usamii)、又はアスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi)のいずれかの形質転換体である、
請求項1〜9のいずれか一項に記載のALPの製造方法。 - アスペルギルス属形質転換体を培養した培養物から分泌画分を得る工程、及び、
分泌画分からALPを抽出する工程、
をさらに含む、
請求項1〜10のいずれか一項に記載のALPの製造方法。 - ゲルろ過法によって測定される分子量が80〜150kDaである、糖鎖付加アルカリホスファターゼ(ALP)II。
- ALPのN末端側に対して、CDHss、CDHcytbkex、CDHcytbKexmut1〜4、CDHall、GlaBss、CelBss、CelB、SKIK_CDHss、AsAP1ss54、及びAsAP3ss72からなる群より選択されるアスペルギルス属菌由来の分泌シグナルペプチドを有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する、アスペルギルス属形質転換用ベクター。
- ALPをコードする塩基配列に対して、その5’末端側に:
以下の(a)〜(c)のいずれかの塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子:
(a)配列番号2〜15のいずれかの塩基配列;
(b)配列番号2〜15のいずれかの塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列;
(c)配列番号2〜15のいずれかの塩基配列と90%以上の相同性を有し、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列;
あるいは、
以下の(d)〜(f)のいずれかの分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子:
(d)配列番号17〜30のいずれかのアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチド;
(e)配列番号17〜30のいずれかのアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド;
(f)配列番号17〜30のいずれかのアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつALPの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド;
を有する、アスペルギルス属形質転換用ベクター。 - 請求項13又は14に記載のアスペルギルス属形質転換用ベクターを用いて形質転換された、アスペルギルス属形質転換体。
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