KR20120024840A

KR20120024840A - 바실러스 서쿨란스 유래의 β-갈락토시다제

Info

Publication number: KR20120024840A
Application number: KR1020117030832A
Authority: KR
Inventors: 도루 가타세; 유키코 호시; 미호 나가야; 쇼타로 야마구치; 마사시 미노다; 가즈히로 나카니시
Original assignee: 아마노 엔자임 가부시키가이샤
Priority date: 2009-06-05
Filing date: 2010-04-23
Publication date: 2012-03-14
Also published as: JP5643756B2; RU2011150421A; WO2010140435A1; CN102449148B; JPWO2010140435A1; AU2010255150A1; BRPI1012062A2; CN102449148A; US9516888B2; DK2439270T3; KR101729048B1; EP2439270A4; US20120135468A1; EP2439270B1; AU2010255150B2; EP2439270A1

Abstract

신규한 β-갈락토시다제를 제공하는 것을 과제로 한다. 바실러스 서쿨란스 유래의 β-갈락토시다제 및 그 유전자가 제공된다. 본 발명의 β-갈락토시다제는, 우유, 유제품, 발효유 제품, 갈락토올리고당 또는 식사용 보충제의 제조 등에 이용 가능하다.

Description

바실러스 서쿨란스 유래의 β-갈락토시다제{β-GALACTOSIDASE DERIVED FROM BACILLUS CIRCULANS}

본 발명은 β-갈락토시다제에 관한 것이다. 상세하게는, 바실러스 서쿨란스(Bacillus circulans)로부터 분리된 신규한 β-갈락토시다제, 그 유전자 및 그 용도 등에 관한 것이다. 본 발명의 β-갈락토시다제는, 예를 들면, 저유당 우유의 제조나, 장내 비피더스균 증식 인자인 갈락토올리고당의 제조, 또는 유당 불내증 환자를 위한 의약 또는 보충제의 유효 성분으로서 이용된다.

본 출원은 2009년 6월 5일자에 출원된 일본 특허 출원 제2009-136735호에 의거한 우선권을 주장하며, 상기 특허 출원의 전 내용은 참조에 의해 원용된다.

β-갈락토시다제(EC3.2.1.23)는 β-D-갈락토시드 결합을 가수분해하여 D-갈락토오스를 유리하는 효소로서, 일반적으로 미생물 및 동식물들에 널리 존재한다. β-갈락토시다제는 별칭으로서 락타제라고도 하는데, 유당 불내증용의 저유당 우유나 치즈의 제조시에 부수적으로 산출되는 유청으로부터 유청 시럽을 제조하기 위한 효소로서 또는 유당 불내증 환자용의 의약이나 보충제의 유효 성분으로서 사용되고 있다. 또한, β-갈락토시다제는 갈락토시드 결합을 전이시키는 능력도 가지고 있으며, 이 능력을 이용하여 갈락토올리고당(갈락토오스 잔기를 가지는 올리고당)을 제조하는 방법도 알려져 있다. 이러한 용도에 사용되는 β-갈락토시다제로서는 누룩곰팡이 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 효모 클루이베로마이세사 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시누스(K. marxinus)나 세균 바실러스 서쿨란스(Bacillus circulans) 등에서 공지되어 있다.

이 중, 바실러스 서쿨란스의 β-갈락토시다제에 대해서는, Mozaffer 등(비특허 문헌 1), Vetere 등(비특허 문헌 2), Ito 등(비특허 문헌 3, 4)에 의해 연구되었다. 비특허 문헌 1에는 분자량 240 kDa와 160 kDa인 2종의 효소의 정제가 보고되어 있다. 아울러, 전자는 분해 활성이 높고, 후자는 갈락토오스 전이 활성이 높으며, 또한 전자는 락토스에 대한 분해 활성에 비해 합성 기질인 p-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드(ONPG)에 대한 분해 활성이 높은 것으로 보고되어 있다. 한편, 비특허 문헌 2에는, 분자량 212 kDa, 145 kDa 및 86 kDa인 3종의 효소의 정제가 보고되어 있다. 그러나, 이들 복수개의 효소의 상호간의 단백질 화학적 상관성이나 분자 생물학적(유전자적) 특성은 명확하지 않다. 또한, 비특허 문헌 3 및 4에 67 kDa 효소의 유전자 클로닝과 재조합 단백질의 성질이 보고되어 있지만, 이 효소는 β-1,3 결합에 특이적인 효소이며, 우유에 존재하는 락토스 결합인 β-1,4 결합에는 작용하지 않는다. 따라서, 우유나 우유 유래의 유당 처리에 사용되는 통상적인 β-갈락토시다제와는 다른 것이다. 또한, 유전자은행(GenBank)에는 바실러스 서쿨란스 유래의 β-갈락토시다제 유전자 2 종(유전자은행 등재 번호 L03424 및 L03425)이 등록되어 있지만, 이들에 대한 유전자 서열만 보고되어 있을 뿐으로, 실제로 활성이 있는 단백질을 코딩하고 있는지는 확실하지 않다.

Mozaffar, Z., Nakanishi, K., Matsuno, R., and Kamikubo, T. Agric. Biol. Chem., 48(12), 3053-3061, 1984 Vetere, A., and Paoletti, S. Biochem. Biophys. Acta., 1380, 223-231 (1998) Ito. Y., and Sasaki, T. Biosci. Biotech. Biochem., 61(8), 1270-1276 (1997) Fujimoto, H., Miyasato, M., Ito, Y., Sasaki, T., and Ajisaka, K. Glycoconjugate Journal, 15, 1550160 (1998) Saito, and Miura. Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629 (1963)

이와 같이 바실러스 서쿨란스 유래의 β-갈락토시다제로서 복수의 효소가 보고되어 있지만, 이들 상호간의 단백질의 화학적 상관성이나 분자 생물학적(유전자적) 특성이 명확하지 않았기 때문에, 저유당 우유의 제조나 갈락토올리고당의 제조 등의 산업상의 각각의 용도에 적합한 효소제를 제조하는데 있어서 제한이 있었다.

본 발명은 바실러스 서쿨란스 유래의 신규한 β-갈락토시다제를 제공한다. 본 발명자들은 바실러스 서쿨란스에 의해 생산되는 β-갈락토시다제를 연구하던 중에, 지금까지 보고된 적 없는 분자량 195 kDa(SDS-PAGE에 의해 추정됨, 질량 분석에서는 189.3 kDa임)의 효소(이하, 본원에서는 「β-Gal1」으로 칭함)를 발견하였고, 이 효소를 코딩하는 유전자(이하, 「본 유전자」라고 함)의 클로닝에도 성공하였다. 그리고, 본 유전자의 염기 서열과, 추정되는 아미노산 서열은, 지금까지 보고된 바실러스 서쿨란스 유래의 3종의 β-갈락토시다제(아미노산 서열은 비특허 문헌 3을 참조, GenBank accession No. L03424 및 L03425)와 크게 다른, 신규한 것으로 판명되었다. 또한, 본 발명자들은, 바실러스 서쿨란스가 합성 기질인 2-니트로페닐 β-D-갈락토피라노시드(ONPG)에 대한 분해 활성이 낮고, 즉, 갈락토실 전이 활성이 높은, 효소 3종(본원에서는, 「β-Gal2」, 「β-Gal3」, 「β-Gal4」라 칭함)을 생산하는 것을 발견하였다. 또한, 이들 3종의 β-갈락토시다제가 본 유전자(β-Gal1 코딩 유전자)로부터 생산된다는 것도 발견하였다. 나아가, 본 유전자 및 본 유전자의 단편을 적당한 숙주에게 도입함으로써, 이들 β-갈락토시다제 단백질 군의 제조법도 확립하였다. 본 발명은 이상의 결과를 기초로 완성되었다. 이하, 본 발명을 나타낸다.

[1] 분자량 195 kDa(SDS-PAGE에 의함)의 바실러스 서쿨란스 유래의 β-갈락토시다제.

[2] [1]에 기재된 β-갈락토시다제의 단편을 포함하는 바실러스 서쿨란스 유래의 β-갈락토시다제.

[3] 서열번호 7의 아미노산 서열, 또는 β-갈락토시다제 활성을 나타내는 그 단편을 포함하는 β-갈락토시다제.

[4] 상기 단편이 서열번호 7의 아미노산 서열에서 N 말단으로부터 WSIGNEIY(서열번호 18)까지의 영역을 포함하는 것인, [3]에 기재된 β-갈락토시다제.

[5] 상기 단편이 서열번호 8 - 10 중 어느 하나의 서열번호의 아미노산 서열을 포함하는 것인, [3]에 기재된 β-갈락토시다제.

[6] 서열번호 5의 서열을 포함하는 DNA에 의해 코딩되는, [3]에 기재된 β-갈락토시다제.

[7] 이하의 (a) - (e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 DNA를 포함하는 β-갈락토시다제 유전자:

(a) 서열번호 6 또는 7의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA;

(b) 서열번호 5의 서열을 포함하는 DNA;

(c) 서열번호 5의 서열에 상보적인 서열에 대하여 엄격 조건하에서 혼성화하는 DNA;

(d) 서열번호 5의 서열의 DNA 서열 축중체(degenerate)인 DNA;

(e) 서열번호 5의 서열을 기준으로 하여 1개 또는 복수개의 염기의 치환, 결손, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 서열을 포함하며, β-갈락토시다제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA.

[8] β-갈락토시다제 활성을 가지는 단백질이 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 60% 미만, 바람직하게는 45% 미만, 또는 바람직하게는 25% 미만의 변형을 포함하는 서열 또는 그 단편으로 이루어지는 것인, [7]에 기재된 β-갈락토시다제 유전자.

[9] 상기 변형이 보존적 아미노산 치환인 것인, [8]에 기재된 β-갈락토시다제 유전자.

[10] [7] - [9] 중 어느 한 항에 기재된 β-갈락토시다제 유전자에 의해 코딩되는 β-갈락토시다제.

[11] [7] - [9] 중 어느 한 항에 기재된 β-갈락토시다제 유전자를 포함하는 재조합 벡터.

[12] 발현 벡터인 [11]에 기재된 재조합 벡터.

[13] [7] -[9] 중 어느 한 항에 기재된 β-갈락토시다제 유전자가 도입된 형질전환체.

[14] [11] 또는 [12]에 기재된 재조합 벡터가 도입된 형질전환체.

[15] 세균 세포, 효모 세포 또는 진균류 세포인, [13] 또는 [14]에 기재된 형질전환체.

[16] 하기 공정 (1) 및 (2)를 포함하는, β-갈락토시다제의 제조 방법:

(1) [13] -[15] 중 어느 한 항에 기재된 형질전환체를, 상기 β-갈락토시다제 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 생산되는 조건하에서 배양하는 공정;

(2) 생산된 상기 단백질을 회수하는 공정.

[17] [1] - [6] 및 [10] 중 어느 한 항에 기재된 β-갈락토시다제를 유효 성분으로 포함하는 효소제.

[18] 상기 유효 성분이 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 β-갈락토시다제, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 β-갈락토시다제, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 β-갈락토시다제, 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 β-갈락토시다제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 β-갈락토시다제인 것인, [17]에 기재된 효소제.

[19] 저유당 우유, 장내 비피더스균 증식 인자인 갈락토올리고당, 유당 불내증 환자용 의약 또는 보충제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제품의 제조에 있어서의, [1] -[6] 및 [10] 중 어느 한 항에 기재된 β-갈락토시다제 또는 [17] 또는 [18]에 기재된 효소제의 용도.

[20] [1] -[6] 및 [10] 중 어느 한 항에 기재된 β-갈락토시다제 또는 [17] 또는 [18]에 기재된 효소제를 사용하여 수득되는, 저유당 우유, 장내 비피더스균 증식 인자인 갈락토올리고당, 유당 불내증 환자를 위한 의약 또는 보충제.

도 1은 바실러스 서쿨란스 유래의 β-갈락토시다제 미정제(crude) 효소액의 하이드록시아파타이트 크로마토그래피의 용출 패턴이다. 280 nm의 흡광도는 단백질을, 420 nm의 흡광도는 ONPG법으로 측정한 β-갈락토시다제 활성을 각각 나타낸다.
도 2는 수득한 분획 1(도 1를 참조)의 친화성 크로마토그래피에 의한 용출 패턴이다. 280 nm의 흡광도는 단백질 농도를, 420 nm의 흡광도는 ONPG법으로 측정한 β-갈락토시다제 활성을 각각 나타낸다.
도 3은 수득한 분획 2(도 1를 참조)의 친화성 크로마토그래피에 의한 용출 패턴이다. 280 nm의 흡광도는 단백질 농도를, 420 nm의 흡광도는 ONPG법으로 측정한 β-갈락토시다제 활성을 각각 나타낸다.
도 4는 4종의 정제된 β-갈락토시다제 β-Gal1(레인 3), β-Gal2(레인 4), β-Gal3(레인 5) 및 β-Gal4(레인 6)의 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동의 결과이다. 레인 2에는 미정제 효소 분말을 사용하였다. 좌측 끝에는 사용한 분자량 마커(레인 1 및 7)의 분자량이 표시되어 있다.
도 5는 대장균 형질전환체의 세포 용혈물(lysate)의 원심분리 상청액을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동한 결과이다. 레인 1은 β-Gal1, 레인 2는 β-Gal2, 레인 3은 β-Gal3, 레인 4는 β-Gal4이다. 레인 5 및 6은, 대장균 벡터-형질전환체의 세포 용혈물의 원심분리 상청액이다. 화살표는 발현된 β-갈락토시다제 단백질을 표시한다. 좌측 끝에는 사용한 분자량 마커(레인 M)의 분자량이 표시되어 있다.

(용어)

본 발명에서, 「아미노산 서열을 코딩하는 DNA」란, 그것을 발현시켰을 경우에 상기 아미노산 서열을 가진 단백질을 얻을 수 있는 DNA, 즉, 상기 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 포함하는 DNA를 의미한다. 따라서, 코돈의 축중도 고려된다.

본 명세서에서, 용어 「분리된」은 「정제된」과 상호 호환적으로 사용된다. 본 발명의 효소(β-갈락토시다제)에 대해 사용하는 경우, 「분리된」은, 본 발명의 효소가 천연 재료에서 유래하는 경우에 상기 천연 재료에서 상기 효소 이외의 성분은 실질적으로 포함하지 않은(특히, 협잡 단백질이 실질적으로 포함되지 않음) 상태를 의미한다. 구체적으로는, 예를 들면, 본 발명의 분리된 효소에서, 협잡 단백질의 함유량은 중량 환산으로 전체의 약 20% 미만, 바람직하게는 약 10% 미만, 또한 바람직하게는 약 5% 미만, 보다 더 바람직하게는 약 1% 미만이다. 한편, 본 발명의 효소가 유전자 공학적 방법에 따라 제조된 것인 경우에는, 용어 「분리된」은, 사용된 숙주 세포로부터 유래된 다른 성분이나 배양액 등이 실질적으로 포함되지 않은 상태를 의미한다. 구체적으로는, 예를 들면, 본 발명의 분리된 효소에서는 협잡 성분의 함유량은 중량 환산으로 전체의 약 20% 미만, 바람직하게는 약 10% 미만, 또한 바람직하게는 약 5% 미만, 보다 더 바람직하게는 약 1% 미만이다. 그리고, 이와 다른 의미를 의미하는 것이 명확하지 않은 한, 본 명세서에 있어서 단지 「β-갈락토시다제」라고 기재한 경우에는 「분리된 상태의 β-갈락토시다제」를 의미하는 것이다. β-갈락토시다제 대신 사용되는 용어 「본 효소」에 대해서도 마찬가지이다.

DNA에 사용되는 경우, 「분리된」은, 원래 천연에 존재하고 있는 DNA인 경우에는, 전형적으로는, 천연 상태에서 공존하는 그 외의 핵산으로부터 분리된 상태를 의미한다. 단, 천연 상태에서 인접하는 핵산 서열(예, 프로모터 영역의 서열이나 터미네이터 서열 등) 등의 일부의 다른 핵산 성분을 포함할 수도 있다. 예를 들면, 게놈 DNA의 경우, 「분리된」 상태에서는, 바람직하게는, 천연 상태에서 공존하는 다른 DNA 성분을 실질적으로 포함하지 않는다. 한편, cDNA 분자 등 유전자 공학적 방법에 따라 제조되는 DNA인 경우에도, 「분리된」 상태에서는, 바람직하게는, 세포 성분이나 배양액 등을 실질적으로 포함하지 않는다. 마찬가지로, 화학 합성에 의해 제조되는 DNA인 경우, 「분리된」 상태에서는, 바람직하게는, dNTP 등의 전구체(원재료)나 합성 과정에서 사용되는 화학물질 등을 실질적으로 포함하지 않는다. 아울러, 이와 다른 의미를 지칭하는 것이 명확하지 않은 한, 본 명세서에서 단지 「DNA」라고 기재한 경우에는 분리된 상태의 DNA를 의미한다.

β-갈락토시다제는 일반적으로 락토스 분해 활성(β-1,4 결합에 작용하여 락토스를 분해하는 활성)과 갈락토실 전이 활성(갈락토오스를 전이하는 활성)을 나타낸다. 그래서, 본 발명에서의 「β-갈락토시다제 활성」은 상기 2개의 활성을 포함하는 의미이다. 락토스 분해 활성은 실시예에 나타낸 락토스 방법에 따라 측정할 수 있다. 다른 갈락토실 전이 활성은, 실시예에 나타낸 ONPG 방법에 따른 활성치와 락토스 방법에 따른 활성치의 비를 지표로 하여, 표시할 수 있다. [실시예에 나타낸 ONPG 방법에 따른 활성치/락토스 방법에 따른 활성치]의 값이 낮을 수록, 전이 활성은 높은 것으로 알려져 있다(비특허 문헌 1).

본 발명에서 「분자량」은, 특별히 언급하지 않은 한, SDS-PAGE(SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동)로 측정되는 분자량을 지칭한다.

(β-갈락토시다제)

본 발명의 제1 측면은 본 발명자들이 분리 및 특정화에 성공한, 바실러스 서쿨란스 유래의 β-갈락토시다제를 제공한다. 본 발명의 β-갈락토시다제는, 일 태양에서, 그 분자량이 195 kDa(SDS-PAGE에 의함)이다. 본 발명자들은, 본 β-갈락토시다제를 분리 정제하는 과정에서, 그 밖에 분자량 135 kDa의 β-갈락토시다제(β-Gal2), 86 kDa의 β-갈락토시다제(β-Gal3) 및 160 kDa의 β-갈락토시다제(β-Gal4)(모두 SDS-PAGE에 의함)가 생산됨을 발견하였고, 아울러 이들 3종의 β-갈락토시다제가 모두 1개의 유전자로부터 파생됨을 발견하였다. 한편, 실제, C 말단 영역이 반 이상 제거된 유전자에서, 활성이 있는 β-갈락토시다제가 발현되는 것을 확인하였다. 이들 지견에 따라, 본 발명은 다른 태양으로서 상기 β-갈락토시다제(분자량이 195 kDa인, 바실러스 서쿨란스 유래의 β-갈락토시다제)의 단편(이하, 「본 단편」이라고 함)을 포함하는 β-갈락토시다제를 제공한다. β-갈락토시다제 활성을 나타내는 한, 본 단편의 길이는 특별히 한정되지 않지만, 기준이 되는 단백질을, 예를 들면, 5-98%, 바람직하게는 40-95%, 가장 바람직하게는 55-75%의 단백질로 포함한다. 또한, 기준이 되는 단백질의 N 말단 영역을 포함하는 것이 바람직하다. 본 단편의 구체예는, 본 발명자들이 발견한, 분자량 135 kDa의 β-갈락토시다제(β-Gal2), 86 kDa의 β-갈락토시다제(β-Gal3) 및 160 kDa의 β-갈락토시다제(β-Gal4)이다.

본 단편은 프로테아제 처리에 의해서도 수득할 수 있다. 예를 들면, 정제 한 상기 β-갈락토시다제(분자량이 195 kDa인, 바실러스 서쿨란스 유래의 β-갈락토시다제)를 프로테아제 처리함으로써 본 단편을 수득한다. 또는, 상기 β-갈락토시다제를 포함하는, 바실러스 서쿨란스의 배양액을 프로테아제로 처리함으로써, 본 단편을 수득할 수도 있다. 사용되는 프로테아제에는 특별한 제한이 없다. 예를 들면, 시판 중인 프로테아제나, 바실러스 서쿨란스에서 생산되는 내인성 프로테아제를 사용할 수 있다.

본 발명의 β-갈락토시다제는, 일 태양에 있어서, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 아미노산 서열은 서열번호 6의 아미노산 서열에서 시그널 펩티드 부분을 제외한 것이다. 그리고, 서열번호 6의 아미노산 서열은, 바실러스 서쿨란스로부터 클로닝하여 수득한 유전자의 염기 서열(서열번호 5)로부터 추정된 아미노산 서열이다. 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 본 발명의 β-갈락토시다제는, 아미노산의 수적 차이와 낮은 상동성(10-12%)으로 인해, 지금까지 보고된 3종의 바실러스 서쿨란스 유래의 β-갈락토시다제와는 분명하게 다른, 신규한 효소이다.

본 발명의 다른 일 태양은, 서열번호 7의 아미노산 서열을 가진 단편을 포함하는 β-갈락토시다제이다. 여기서 단편은, 바람직하게는, 서열번호 7의 아미노산 서열에서, N 말단으로부터 WSIGNEIY(서열번호 18)까지의 영역을 포함한다. 상기 부분 서열(WSIGNEIY)은, 추정되는 활성 영역이다. 단편의 구체적인 예로는, 서열번호 8-10 중 어느 하나의 서열번호의 아미노산 서열을 포함하는 것을 들 수 있다. 서열번호 8의 아미노산 서열은 Gal2이고, 서열번호 9의 아미노산 서열은 Gal3이고, 서열번호 10의 아미노산 서열은 Gal4이다.

일반적으로, 어떤 단백질의 아미노산 서열 중 일부에 변형을 가하였을 때 변형을 가한 후의 단백질이 변형 전의 단백질과 동등한 기능을 가지는 경우가 있다. 즉, 아미노산 서열의 변형이 단백질의 기능에 실질적인 영향을 주지 않고, 단백질의 기능이 변형 전후에 유지되는 경우가 있다. 이러한 기술적인 상식을 고려하면, 본 발명의 β-갈락토시다제(서열번호 7-10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어짐)와 비교하여, 아미노산 서열 상에 근소한 차이는 인정되지만, β-갈락토시다제로서의 기능 상에는 실질적인 차이가 인정되지 않는 경우는, 상기 β-갈락토시다제와 실질적으로 동일한 효소로 간주할 수 있다. 여기서의 「아미노산 서열의 근소한 차이」란, 전형적으로는, 아미노산 서열을 구성하는 1 내지 수개(상한은 예를 들면, 3개, 5개, 7개, 10개)의 아미노산의 결손, 치환, 또는 1 내지 수개(상한은 예를 들면, 3개, 5개, 7개, 10개)의 아미노산의 부가, 삽입, 또는 이들 조합에 의해, 아미노산 서열에 변이(변형)가 발생하는 것을 지칭한다. 「실질적으로 동일한 효소」의 아미노산 서열과, 기준이 되는 상기 β-갈락토시다제의 아미노산 서열과의 동일성(%)은, 바람직하게는 90% 이상이며, 또한 바람직하게는 95% 이상이며, 또한 더 바람직하게는 98% 이상이며, 가장 바람직하게는 99% 이상이다. 아울러, 아미노산 서열에서의 차이는 복수 위치에서 발생할 수도 있다.

「아미노산 서열의 근소한 상이」는, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환에 의해 발생된다. 여기에서 「보존적 아미노산 치환」은, 어떤 아미노산 잔기를 비슷한 성질의 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 치환하는 것을 지칭한다. 아미노산 잔기는 그 측쇄에 의해 알칼리성 측쇄(예를 들면, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들면, 아스파라긴산, 글루타민산), 비하전된 극성 측쇄(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들면, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β-분지 측쇄(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소루신), 방향족 측쇄(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)과 같이, 몇가지의 패밀리로 분류되어 있다. 보존적 아미노산 치환은 바람직하게는 동일한 패밀리에 속하는 아미노산 잔기 간의 치환이다.

또한, 2개의 아미노산 서열 간의 동일성(%)은, 예를 들면, 아래 과정으로 결정할 수 있다. 먼저, 최적 비교가 가능하도록 2개의 서열을 정렬한다(예를 들면, 제1 서열에 갭을 도입하여 제2 서열과의 정렬을 최적화할 수도 있음). 제1 서열의 특정 위치의 분자(아미노산 잔기)가, 제2 서열에서의 대응되는 위치의 분자와 같다면, 그 위치의 분자는 동일하다고 할 수 있다. 서열 동일성은, 그 2개의 서열에 공통되는 동일 위치의 수의 함수이며(즉, 동일성(%) = 동일 위치의 수/위치의 총수 x 100), 바람직하게는, 정렬의 최적화에 필요로 한 갭의 수 및 사이즈도 고려한다. 2개의 서열에 대한 비교 및 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 실행할 수 있다. 서열의 비교에 이용가능한 수학적 알고리즘의 구체예로서는, Karlin 및 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68에 기재되어 있고, Karlin 및 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77에서 변형된 알고리즘이 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 이러한 알고리즘은 Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10에 기재된 NBLAST 프로그램 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)에 내장되어 있다. 예를 들면, XBLAST 프로그램으로 score = 50, wordlength = 3으로서 BLAST 폴리펩티드 검색을 행하면, 동일성이 높은 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교를 위한 갭 정렬은 Altschul등 (1997) Amino Acids Research 25(17): 3389-3402에 기재된 Gapped BLAST에서 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST를 이용하는 경우, 대응하는 프로그램(예를 들면, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. 상세하게는, 예컨대, NCBI의 웹페이지를 참조할 수 있다. 서열 비교에 이용가능한 다른 수학적 알고리즘의 예로서는, Myers 및 Miller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17에 기재된 알고리즘이 있다. 이러한 알고리즘은, 예를 들면, GENESTREAM 네트워크 서버(IGH Montpellier, 프랑스) 또는 ISREC 서버로 이용가능한 ALIGN 프로그램에 내장되어 있다. 아미노산의 서열 비교에 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우, 예를 들면, PAM120 잔기 질량표를 사용하고, 갭 길이 패널티 = 12, 갭 패널티 = 4로 할 수 있다. 2개의 아미노산 서열 간의 동일성은, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 사용하여, Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스를 사용함으로써, 갭 웨이트 = 12, 10, 8, 6, 또는 4, 갭 길이 웨이트 = 2, 3, 또는 4에서, 결정할 수 있다.

(β-갈락토시다제 유전자)

본 발명의 제2 측면은 β-갈락토시다제 유전자에 관한 것이다. 일 태양에서, 본 발명의 유전자는 서열번호 6 또는 7의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 포함한다. 상기 태양의 구체예는 서열번호 5의 염기 서열로 이루어진 DNA이다.

일반적으로, 어떤 단백질을 코딩하는 DNA의 일부에 변형을 가하였을 때, 변형된 DNA에 의해 코딩되는 단백질이, 변형 전의 DNA에 의해 코딩되는 단백질과 동등한 기능을 가지는 경우가 있다. 즉, DNA 서열의 변형이 코딩된 단백질의 기능에 실질적으로 영향을 주지 않고, 코딩된 단백질의 기능이 변형 전후에 유지되는 경우가 있다. 이에, 본 발명은 다른 태양으로서 서열번호 5의 염기 서열과 등가의 염기 서열을 가지며, β-갈락토시다제 활성을 가진 단백질을 코딩하는 DNA(이하, 「등가 DNA」라고도 함)를 제공한다. 여기서, 「등가의 염기 서열」은, 서열번호 5에 나타낸 핵산과 일부 상이하지만, 이러한 상이에 의해 그것이 코딩하는 단백질의 기능(여기서는 β-갈락토시다제 활성)이 실질적인 영향을 받지 않는 염기 서열을 말한다.

등가 DNA의 구체예는, 서열번호 5의 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대하여 엄격 조건하에서 혼성화하는 DNA이다. 여기서, 「엄격 조건」은 이른바 특이적인 하이브리드는 형성되고, 비특이적인 하이브리드는 형성되지 않는 조건을 말한다. 이와 같은 엄격 조건은 당업자에게 공지된 예로서는 Molecular Cloning(Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) 또는 Current protocols in molecular biology(edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987)을 참조하여 설정할 수 있다. 엄격 조건으로는, 예를 들면, 혼성화 용액(50% 포름 아미드, 10x SSC(0.15 M NaCl, 15 mM 소듐 사이트레이트, pH 7.0), 5x Denhardt 용액, 1% SDS, 10% 덱스트란 설페이트, 10 ㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA, 50 mM 인산 버퍼(pH7.5)를 사용하여 약 42 ℃ - 약 50 ℃에서 인큐베이션하고, 그 후 0.1x SSC, 0.1% SDS를 사용하여 약 65 ℃ - 약 70 ℃에서 세정하는 조건을 들 수 있다. 또한, 바람직한 엄격 조건으로는, 예를 들면, 혼성화 용액으로서 50% 포름아미드, 5x SSC(0.15 M NaCl, 15 mM 소듐 사이트레이트, pH 7.0), 1x Denhardt 용액, 1% SDS, 10% 덱스트란 설페이트, 10 ㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA, 50 mM 인산 버퍼(pH7.5)를 사용하는 조건을 들 수 있다.

등가 DNA의 다른 구체예로서, 서열번호 5에 나타낸 염기 서열을 기준으로, 1개 또는 복수개(바람직하게는 1 - 수 개)의 염기의 치환, 결손, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 염기 서열을 포함하고, β-갈락토시다제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA를 들 수 있다. 염기의 치환이나 결손 등은 복수 부위에서 이루어질 수 있다. 여기서, 「복수개」란, 상기 DNA에 의해 코딩된 단백질의 입체 구조에서 아미노산 잔기의 위치나 종류에 따라 상이하지만, 예를 들면, 2-40개의 염기, 바람직하게는 2-20개의 염기, 보다 바람직하게는 2-10개의 염기이다. 이상과 같은 등가 DNA는, 예를 들면, 제한 효소 처리, 엑소뉴클레아제나 DNA 리가제 등에 의한 처리, 위치 지정 돌연변이 도입법(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)이나 랜덤 돌연변이 도입법(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)에 따른 변이 도입 등에 의해, 염기의 치환, 결손, 삽입, 부가, 및/또는 역위를 포함하도록, 서열번호 5에 나타내는 염기 서열을 가진 DNA를 변형함으로써, 수득할 수 있다. 또한, 자외선 조사 등의 다른 방법으로도 등가 DNA를 수득할 수 있다.

등가 DNA의 또다른 예로서, SNP(단일 염기 다형)로 대표되는 다형에 기인한, 상기와 같은 염기의 상이가 인정되는 DNA를 들 수 있다.

여기서, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 서열번호 7의 아미노산 서열(Gal1)의 단편인, 서열번호 8-10의 아미노산 서열을 포함하는, 단백질(Gal2, Gal3 및 Gal4)은, 높은β-갈락토시다제 활성을 나타낸다. 이러한 사실에 따른 본 발명의 일 태양은, 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열에 60% 미만, 바람직하게는 45% 미만, 또한 바람직하게는 25% 미만의 변형이 있는 서열 또는 그 단편을 포함하는, 단백질을 코딩하는 β-갈락토시다제 유전자를 제공한다.

본 발명의 유전자는, 본 명세서 또는 첨부된 서열목록에 개시된 서열 정보를 참고하여, 표준적인 유전공학 방법, 분자 생물학적 방법, 생화학적 방법 등을 사용함으로써 분리된 상태로 제조할 수 있다. 구체적으로는, 적절한 바실러스 서쿨란스의 게놈 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리, 또는 바실러스 서쿨란스의 균체 추출액으로부터, 본 발명의 유전자에 특이적으로 혼성화 가능한 올리고뉴클레오티드 프로브/프라이머를 적절하게 이용하여, 제조할 수 있다. 올리고 뉴클레오티드 프로브/프라이머는, 시판 중인 자동화 DNA 합성 장치 등을 사용하여 용이하게 합성할 수 있다. 그리고, 본 발명의 유전자를 제조하기 위해 사용되는 라이브러리의 제작 방법에 대해서는, 예를 들면, Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York를 참조할 수 있다.

예를 들면, 서열번호 5의 염기 서열을 가진 유전자는, 상기 염기 서열 또는 그 상보 서열의 전체 또는 일부를 프로브로 한 혼성화 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 일부에 특이적으로 혼성화하도록 디자인된 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 핵산 증폭 반응(예, PCR)을 이용하여 증폭 및 분리할 수 있다. 또한, 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열이나 서열번호 5의 염기 서열의 정보를 기반으로 하여, 화학 합성을 통해 목적 유전자를 수득할 수도 있다(참고 문헌: Gene, 60(1), 115-127 (1987)).

(재조합 벡터)

본 발명의 새로운 측면은 본 발명의 β-갈락토시다제 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 명세서에서, 용어 「벡터」는, 여기에 삽입된 핵산 분자를 세포 등의 타겟내로 수송할 수 있는 핵산성 분자를 의미하며, 그 종류, 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터, 바이러스 벡터(예, 아데노바이러스 벡터, 아데노-수반 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 등)의 형태를 취할 수 있다.

사용 목적(클로닝, 단백질 발현)에 따라, 또한, 숙주 세포의 타입을 고려하여, 적절한 벡터가 선택된다. 벡터의 구체예로는, 대장균을 숙주로 하는 벡터(M13 파지 또는 그 변형체, λ 파지 또는 그 변형체, pBR322 또는 그 변형체(pB325, pAT153, pUC8 등) 등), 효모를 숙주로 하는 벡터(pYepSec1, pMFa, pYES2 등), 곤충 세포를 숙주로 하는 벡터(pAc, pVL 등), 포유류 세포를 숙주로 하는 벡터(pCDM8, pMT2PC 등) 등이다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 발현 벡터이다. 「발현 벡터」란, 여기에 삽입된 핵산을 목적 세포(숙주 세포)내로 도입할 수 있으며, 상기 세포내에서 발현시킬 수 있는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는, 통상적으로, 삽입된 핵산의 발현에 필요한 프로모터 서열이나 발현을 촉진시키는 인핸서 서열 등을 포함한다. 선택 마커를 포함하는 발현 벡터를 사용할 수도 있다. 이러한 발현 벡터를 사용한 경우, 선택 마커를 이용하여 발현 벡터의 도입 유무(및 그 정도)를 확인할 수 있다.

본 발명의 유전자의 벡터내 삽입, 선택 마커 유전자의 삽입(필요한 경우), 프로모터의 삽입(필요한 경우) 등은 표준적인 재조합 DNA 기술(예, Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York를 참조할 수 있는, 제한 효소 및 DNA 리가제를 사용하는 주지의 방법)을 사용하여 행할 수 있다.

(형질전환체)

또한, 본 발명은 본 발명의 유전자가 도입된 숙주 세포(형질전환체)에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환체에서, 본 발명의 유전자는 외래성 분자로서 존재하게 된다. 본 발명의 형질전환체는, 바람직하게는, 상기 본 발명의 벡터를 사용한 형질감염 또는 형질전환에 의해 제조된다. 형질감염 또는 형질변환은 인산 칼슘 공침법, 전기천공(Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984)), 리포펙션(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984)), 미세주사법(Graessmann, M. [ Graessmann, A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73,366-370(1976)), Hanahan의 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557-580(1983)), 아세트산 리튬법(Schiestl, R.H. et al., Curr. Genet. 16, 339-346(1989)), 원형질체-폴리에틸렌 글리콜법(Yelton, M.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1470-1474(1984)) 등에 의해 실시할 수 있다.

숙주 세포는, 본 발명의 β-갈락토시다제를 발현하는 한, 특별히 한정되지 않으며, 예컨대, 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtillus), 바실러스 리케미포르미스(Bacillus likemiformis), 바실러스 서쿨란스(Bacillus circulans) 등의 바실러스 속 세균, 락토코커스(Lactococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 루코노스톡(Leuconostoc), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 등의 유산균, 에스케리치아(Escherichia), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 등의 그 외의 세균, 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 토룰라(Torula), 토룰롭시스(Torulopsis) 등의 효모, 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 등의 아스퍼질러스 속, 페니실리움 속, 트리코더마 속, 푸사리움 속 등의 사상균(진균) 등으로부터 선택된다.

(β-갈락토시다제의 제조법)

본 발명의 또다른 측면은 β-갈락토시다제의 제조법을 제공한다. 본 발명의 제조법의 일 태양에서는 상기의 형질전환체를 사용하여 β-갈락토시다제를 제조한다. 상기 태양의 제조법에서는, 먼저, 거기에 도입된 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 생산되는 조건하에 상기의 형질전환체를 배양한다(공정(1)). 다양한 벡터- 숙주 시스템에 대한 형질전환체의 배양 조건이 공지되어 있으며, 당업자는 적절한 배양 조건을 용이하게 설정할 수 있다.

배양법과 배양 조건은 목적 단백질인 β-갈락토시다제가 생산되는 한 특별히 제한되지 않는다. 즉, β-갈락토시다제가 생산되는 것을 조건으로 하며, 사용되는 미생물의 배양에 적합한 방법이나 배양 조건을 적절히 설정할 수 있다. 배양법으로서는 액체 배양, 고체 배양 중 어느 한가지일 수도 있지만, 바람직하게는 액체 배양을 이용한다. 액체 배양을 예로 들어, 그 배양 조건을 설명한다.

배양 배지는 사용하는 형질전환체가 생육가능한 배양 배지라면 어떤 것이라도 가능하다. 예를 들면, 글루코스, 슈크로스, 겐티오바이오스, 가용성 전분, 글리세린, 덱스트린, 당밀, 유기산 등의 탄소원, 또한 황산 암모늄, 탄산 암모늄, 인산 암모늄, 아세트산 암모늄, 또는 펩톤, 효모 엑기스, 옥수수 침지액(corn steep liquor), 카제인 가수분해물, 겨(bran), 고기 엑기스 등의 질소원, 또한 칼륨염, 마그네슘염, 나트륨염, 인산염, 망간염, 철염, 아연염 등의 무기염을 첨가한 것을 사용할 수 있다. 사용하는 형질전환체의 생육을 촉진하기 위해, 비타민, 아미노산 등을 배양 배지에 첨가할 수도 있다. 배양 배지의 pH는, 예를 들면, 약 3-10, 바람직하게는 약 7-8 정도로 조정하며, 배양 온도는 통상 약 10 - 50 ℃, 바람직하게는 약 20 - 37 ℃ 정도로, 1-7일간, 바람직하게는 3-4일간 정도 호기 조건하에서 배양한다. 배양법으로서는, 예를 들면, 진탕 배양법, 발효조(jar fermenter)에 의한 호기적 심부 배양법을 이용할 수 있다.

배양 공정에 이어서, 생산된 단백질(β-갈락토시다제)을 회수한다(공정(2)). 배양액으로부터의 회수는, 예를 들면, 배양상청 여과, 원심 처리 등에 의해 불용물을 제거한 후, 한외 여과막에 의한 농축, 암모늄 설페이트 등의 염석, 투석, 이온 교환 수지 등의 각종 크로마토그래피 등을 적절히 조합하여 분리, 정제를 행함으로써 본 효소를 얻을 수 있다. 다른 한편으로는, 균체내로부터 회수하는 경우에는, 예를 들면, 균체를 가압 처리, 초음파 처리 등에 의해 파쇄한 후, 상기와 마찬가지로 분리, 정제를 행함으로써 목적 단백질을 얻을 수 있다. 그리고, 여과, 원심 처리 등에 의해 미리 배양액으로부터 균체를 회수한 후, 상기 일련의 공정(균체의 파쇄, 분리, 정제)을 행해도 된다.

β-갈락토시다제의 정제도는 특별히 한정되지 않는다. 또한, 최종적인 형태는 액체상 또는 고체상(분체상을 포함함)일 수도 있다

(효소제)

본 발명의 β-갈락토시다제는 예를 들면, 효소제의 형태로 제공된다. 효소제는, 유효 성분(본 발명의 β-갈락토시다제) 외에, 부형제, 완충제, 현탁제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리 식염수 등을 함유할 수도 있다. 부형제로서는 유당, 소르비톨, D-만니톨, 슈크로스 등을 사용할 수 있다. 완충제로서는 인산염, 구연산염, 아세트산염 등을 사용할 수 있다. 안정제로서는 프로필렌글리콜, 아스코르빈산 등을 사용할 수 있다. 보존제로서는 페놀, 염화 벤즈알코늄, 벤질알코올, 클로로부탄올, 메틸파라벤 등을 사용할 수 있다. 방부제로서는 염화 벤즈알코늄, 파라옥시 안식향산, 클로로 부탄올 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 효소제의 일 태양에서는, 유효 성분으로서 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 β-갈락토시다제, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 β-갈락토시다제, 서열번호 9에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 β-갈락토시다제, 및 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 β-갈락토시다제으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1이상의 β-갈락토시다제가 사용된다. 일 태양으로서 이들 4종의 β-갈락토시다제를 모두 포함하는 효소제가 제공된다.

(β-갈락토시다제의 용도)

본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 β-갈락토시다제 또는 효소제의 용도를 제공한다. 용도의 예는, 저유당 우유의 제조, 장내 비피더스균 증식 인자인 갈락토올리고당의 제조, 또는 유당 불내증 환자를 위한 의약이나 보충제의 제조이다. 본 발명의 β-갈락토시다제 또는 효소제의 사용에 의해 원재료 중의 유당을 저감할 수 있다. 예를 들면, 생유 1 mL에 대하여 1 U의 β-갈락토시다제를 첨가하고, 10℃의 저온하에서 방치함으로써, 유당이 분해되어 저유당 우유를 얻을 수 있다. 갈락토올리고당의 제조에 있어서는, 예를 들면, 미리 가열 용해시킨 40% 유당액(pH 7.0)에 100 LU의 β-갈락토시다제를 가하여, 40℃에서 5시간 방치함으로써, 갈락토올리고당을 생성시킨다. 그리고, 갈락토올리고당은 Gal-(Gal)n-Glc(n는 통상 0-3)으로 표시된다(Gal: 갈락토오스 잔기, Glc: 글루코오스잔기). 결합 방식으로는 β1-6, β-3, β-4, β-2 외에도 α-3, α-6 등이 있다.

[실시예]

1. 바실러스 서쿨란스 유래의 β-갈락토시다제의 정제

(a) β-갈락토시다제 활성 측정법

하기 정제에서, β-갈락토시다제 활성 측정은 2-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드(ONPG)를 기질로 한 방법(i)과 락토스를 기질로 한 방법(ii), 2가지로 측정하였다. 모두 비특허 문헌 1에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 또한 단백질 농도는 280 nm의 흡광도로 나타낸다.

i) ONPG법

0.245% ONPG를 포함하는 100 mM 인산 완충액(pH 6.0) 1.98 ml를 40℃에서 10분간 예온하였다. 여기에 샘플 20 ㎕를 첨가하고, 40℃에서 10분간 반응시킨 후, 10% 탄산나트륨 용액 2.0 ml를 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액의 420 nm에서의 흡광도를 측정하고, 1분간 1 μmol의 2-니트로페놀을 생성할 때의 활성을 1 U로하여, β-갈락토시다제 활성을 산출하였다.

ii) 락토스법

5% 락토스를 포함하는 100 mM 인산 완충액(pH 6.0) 2 ml를 40℃에서 10분간 예온 하였다. 여기에 샘플 50 ㎕를 첨가하여 40℃에서 15분간 반응시킨 후, 비등조에서 끓여 반응을 정지시켰다. 반응액 100 ㎕에 대해 글루코오스타트 방법에 의해 글루코오스 농도를 측정하였다. 즉, 반응액 100 ㎕에 0.1 N 수산화 나트륨 용액 100 ㎕를 가하여 1분간 방치한 다음, 0.1 N 아세트산, 3 ml의 아세트산 완충액(pH 5.0)을 첨가하였다. 이 용액에 글루코오스타트 용액(오노 약품공업사) 500 ㎕를 첨가하여 550 nm에서 흡광도의 증가 속도를 측정하였고, 1분간 1 μmol의 글루코오스를 생성할 때의 활성을 1 U로 하여, 락토스 분해 활성을 산출하였다.

(b) β-갈락토시다제의 미정제 효소 분말의 제조

바실러스 서쿨란스(Bacillus circulans) ATCC 31382를, 3.0% 대두 펩톤, 2.5% 고기 엑기스, 1.0% 효모 엑기스, 0.5% 락토스를 포함하는 액체 배양 배지에 접종하여, 30℃에서 3일간 진탕 배양하였다. 원심분리에 의해 균체를 제거하고, 얻어진 배양 상청은 한외 여과막(AIP-1013 D, 아사히화성 사제)을 이용하여 5배 농축하였다. 얻어진 농축액을 분무 건조하여, β-갈락토시다제의 미정제 효소 분말을 수득하였다.

(c) β-갈락토시다제의 정제

얻어진 미정제 효소 분말을 10 mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.0) 중에 5.0%의 농도로 용해한 용액 50 ml를, 동일 완충액으로 평형화한 하이드록시아파타이트 겔 컬럼(CHTTM Ceramic hydroxyapataite, BIO-RAD 사제, 내경 2.5 cm, 길이 25 cm)에 제공하여, 10 mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.0)을 사용하여 미흡착 단백질을 용출시켰다. 그 후, 인산 나트륨 완충액 농도를 100 mM, 150 mM, 200 mM, 300 mM 및 500 mM의 순서로 변화시키는 단계적인 용출법을 실시하여, 효소를 용출시켰다. 본 크로마토그래피는 실온에서 행하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 인산 나트륨 완충액 농도 100 mM, 150 mM, 300-500 mM에서 β-갈락토시다제(ONPG) 활성을 나타내는 효소가 용출되었고, 이 각각의 분획을 순서대로 분획 1, 2, 3으로 하였다. 분획 3에 포함되는 효소는, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에서 분자량 약 195 kDa의 단일 단백질이며, 이를 β-Gal1로 호칭하였다.

다음으로, 분획 1을 친화성 크로마토그래피에 의해 분리 정제를 행하였다. 먼저, 분획 1을 50 mM 아세트산 완충액(pH 5.8)에서 투석하였다. 투석된 효소액을, 동일 완충액으로 평형화한 친화성 겔 컬럼(p-아미노벤질-1-티오-β-D-갈락토피라노시드-아가로스, Sigma 사제, 직경 1.6 cm, 길이 18 cm)을 통해 동일 완충액으로 미흡착 단백질을 용출시킨 후, 4℃에서 pH를 5.8에서 3.5으로 변화시키는 직선 구배법(50 mM 아세트산 완충액(pH 5.8)/50 mM 아세트산 완충액(pH 3.5))을 통해 용출시켰다. 분획 1에서 확인된 바와 같이, 세정 분획과 pH 4.4 전후에 각각 β-갈락토시다제 활성을 가지는 효소가 용출되었다. 이들은 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 대략 단일의 밴드로 나타났으며, 분자량은 각각 135 kDa, 86 kDa이었다. 전자를 β-Gal2, 후자를 β-Gal3로 호칭하였다.

한편, 분획 2를, 분획 1과 동일하게 친화성 크로마토그래피에 의해 분리 정제하였다. 분획 2를 50 mM 아세트산 완충액(pH 5.8)으로 투석하고, 동일 완충액으로 평형화한 상기 친화성 컬럼에 주입하였다. 도 2에서와 동일하게, 동일 완충액으로 미흡착 단백질을 용출시킨 후, 4℃에서 pH를 5.8에서 3.5에 변화시키는 직선 구배법에 의해 용출시켰다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 세정 분획과 pH 4.4 전후에 각각 β-갈락토시다제 활성을 가지는 효소가 용출되었다. 이들은 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에서 대략 단일의 밴드를 나타났으며, 분자량은 각각 86 kDa, 160 kDa이었다. 전자는 β-Gal3와 동일하였고, 후자는 β-Gal4로 호칭하였다. 도 4에, 미정제 효소 샘플(레인 2)과 정제된 β-Gal1(레인 3), β-Gal2(레인 4), β-Gal3(레인 5) 및 β-Gal4(레인 6)의 10% SDS-PAGE의 분석 결과를 나타낸다.

2. 바실러스 서쿨란스 유래의 정제 β-갈락토시다제의 여러가지 성질

정제한 4종의 β-갈락토시다제의 주요 성질을 조사하였다.

(a) 비활성(specific activity) 측정

기질로서 ONPG(최종 농도 0.24%) 및 락토스(최종 농도 4.88%)를 사용한 경우의 활성을, 40℃, 100 mM 인산 완충액(pH 6) 중에서 측정하였다. 결과는 표 1에 나타낸다. 그리고, 기질로서 ONPG를 사용한 경우, 40℃, pH 6의 조건에서의, 생성물 니트로페놀 1 μmol을 1 분간에 생성하는 효소량을 1 U로 정의하였고, 기질로서 락토스를 사용한 경우에는, 40℃, pH 6의 조건에서의 생성물 글루코오스 1 μmol을 1분간에 생성하는 효소량을 1 U로 정의하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 락토스 분해 활성에 비해 ONPG 분해 활성이 β-Gal1에서 높았지만, β-Gal2, β-Gal3 및 β-Gal4에서는 낮은 것을 알 수 있다.

효소	미정제 효소(U/mg)	β-Gal1 (U/mg)	β-Gal2 (U/mg)	β-Gal3 (U/mg)	β-Gal4 (U/mg)
비활성 (기질: ONPG)	16.0	50.0	13.4	17.6	10.9
비활성 (기질: 락토스)	35.4	46.5	62.0	72.6	45.0
분자량 (SDS-PAGE)	-	189.283 kDa (195 kDa)	137.788 kDa (135 kDa)	91.027 kDa (86 kDa)	153.932 kDa (160 kDa)
N-말단 아미노산 서열	-	GNSVSYDGERRVNFNEN (SVSYDGERRVNFNEN_	좌측과 동일	좌측과 동일	좌측과 동일

(b) 분자량의 결정

4종의 β-갈락토시다제의 분자량을, Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization, MALDI 분석계를 사용하여 구하였다. 샘플은 0.1 ㎕의 10 mg/ml 시나핀산/0.1 ㎕의 0.7-3 mg/ml 효소 용액의 혼합 용액을 사용하였다. 그 결과, β-Gal1는 189.283 kDa, β-Gal2는 134.788 kDa, β-Gal3는 91.027 kDa, β-Gal4는 153.932 kDa로 확인되었다(표 1). 또한, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 구한 분자량(도 4)을 표 1의 괄호 안에 나타내었다. 질량 분석계로 구한 분자량은, 모든 효소들에서, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 구한 분자량에 가까운 결과를 보여주었다.

(c) N-말단 아미노산 서열의 결정

단백질 서열분석기를 이용하여 4종의 β-갈락토시다제의 N-말단 아미노산 서열을 분석하였다. 그 결과, β-Gal1에는 2종류의 서열, GNSVSYDGERRVNFNEN(서열번호 1) 및 SVSYDGERRVNFNEN(서열번호 17)가 포함되어 있음이 밝혀졌다. 그러나, 이 2종의 서열은, N-말단에 GN가 있는지 여부의 차이가 있을 뿐 기본적으로는 같은 서열인 것을 알 수 있었다. 또한, β-Gal2, β-Gal3, β-Gal4의 N-말단 아미노산 서열도 β-Gal1과 동일하였다.

(d) 내부 아미노산 서열의 결정

다음으로, β-Gal1, β-Gal2, β-Gal3의 정제 효소를 1-2 mg/ml로 조제하고, 여기에 트립신(0.5 mg/ml)을 가하여 37℃에서 인큐베이션하였다. 48시간 후, 8% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 실시하였다. 이들 효소들에서 70 kDa의 밴드가 검출되었다. 전기영동한 겔을 니트로셀룰로스 막으로 전사하여 코마시브릴리언트 블루로 염색하였다. 염색된 밴드들 중 각각의 효소로부터 유래된 70 kDa의 밴드를 잘라, 단백질 서열분석기로 아미노산 서열을 분석하였다. 그 결과, 각 효소 유래의 70 kDa 단백질은 N-말단 5잔기개의 서열이 일치하였다. 또한, β-Gal3 유래의 70 kDa 단백질의 N-말단 15개 잔기의 아미노산 서열은 EDRADVNIKTKISND(서열번호 2)이었다.

3. 바실러스 서쿨란스 유래의 β-갈락토시다제를 코딩하는 유전자 단편의 입수

(a) 염색체 DNA의 분리

바실러스 서쿨란스(Bacillus circulans) ATCC 31382의 균체로부터 사이토?미우라의 방법(비특허 문헌 5)에 의해 염색체 DNA를 수득하였다.

(b) PCR에 의한 DNA 프로브의 제작

상기 2에서 결정된 N-말단 아미노산 서열 및 내부 아미노산 서열을 기초로 2종의 올리고뉴클레오티드(서열번호 3, 4)를 합성하고, PCR 프라이머로 사용하였다. 이 프라이머를 사용하고, 바실러스 서쿨란스의 염색체 DNA를 주형으로, 이하의 조건에 의해 PCR 반응을 행하였다.

10x PCR 반응 완충액(TaKaRa 사) 5.0 ㎕

dNTP 혼합액(각각 2.5 mM, TaKaRa 사) 8.0 ㎕

25 mM MgCl₂ 5.0 ㎕

50 μM 센스 프라이머 0.5 ㎕

50 μM 안티센스 프라이머 0.5 ㎕

증류수 29.5 ㎕

염색체 DNA 용액(100 ㎍/ml) 1.0 ㎕

LA Taq DNA 중합효소(TaKaRa 사) 0.5 ㎕

스테이지 1: 변성(95℃, 5분) 1 사이클

스테이지 2: 변성(95℃, 1분) 30 사이클

어닐링(52℃, 1분)

신장(72℃, 1분)

스테이지 3: 신장(72℃, 10분) 1 사이클

얻어진 약 0.6 kb의 DNA 단편을 pGEM-Teasy(Promega 사)에 클로닝한 후, 염기 서열 분석에 의해, 센스 프라이머의 바로 뒤와 안티센스 프라이머의 바로 앞에서, 상기의 부분 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열이 확인되었다. 본 DNA 단편을 전장 유전자 클로닝용 DNA 프로브로 사용하였다.

(c) 유전자 라이브러리의 제작

바실러스 서쿨란스의 염색체 DNA의 서든 혼성화 분석 결과, SpeI 분해물 중 프로브 DNA와 혼성하는 약 8.2 kb의 싱글 밴드가 확인되었다. 이 약 8.2 kb의 SpeI DNA 단편을 클로닝하기 위하여, 하기 유전자 라이브러리를 제작하였다. 상기 (a)에서 조제한 염색체 DNA의 SpeI 처리를 행하였다. 염색체 DNA 50 ㎍, 10x M 완충액 40 ㎕, 증류수 342.0 ㎕, 및 SpeI를 8.0 ㎕를 혼합하여, 37℃에서 15시간 처리하였다. 얻어진 분해물을 SpeI 처리한 pBluescript II KS+벡터(Stratagene 사)에 라이게이션하여, 유전자 라이브러리를 수득하였다.

(d) 유전자 라이브러리의 스크리닝

상기 (b)에서 수득한 0.6 kb의 DNA 단편을 DIG-High Prime(Roche사)를 사용하여 표지하였다. 이것을 DNA 프로브로서 사용하여, (c)에서 수득한 유전자 라이브러리를 콜로니 혼성화로 스크리닝하였다. 얻어진 양성 콜로니에서 플라스미드 pBlue-Gal1를 수득하였다.

(e) 염기 서열의 결정

플라스미드 pBlue-Gal1의 염기 서열을 일반적인 방법에 따라 결정하였다. 바실러스 서쿨란스 유래 β-갈락토시다제를 코딩하는 염기 서열(5214 bp)은 서열번호 5에 나타낸다. 또한, 서열번호 5에 의해 코딩되는 아미노산 서열(1738 아미노산)은 서열번호 6에 나타낸다. 이 아미노산 서열에서, 상기 2에서 결정된 N-말단 영역 아미노산 서열(서열번호 1)과 내부 아미노산 서열(서열번호 2)이 발견되었다. 흥미로운 점으로서, 본 유전자에서 개시 코돈은 GTG인 것으로 보였다. 아울러, 서열번호 6의 아미노산 서열에서 시그널 펩티드를 제외한 아미노산 서열은 서열번호 7에 나타낸다.

4. 바실러스 서쿨란스 유래의 β-갈락토시다제 β-Gal1, β-Gal2, β-Gal4의 대장균에서의 발현

(a) 대장균 발현용 β-갈락토시다제 플라스미드의 구축

분자량 189.3 kDa, 134.8 kDa, 153.9 kDa(질량 분석의 값)의 β-Gal1, β-Gal2, β-Gal4에 해당되는 단백질의 N-말단 영역 아미노산 서열이 공통되므로, 이 서열을 코딩하는 DNA 서열을 기초로, 1종의 올리고 뉴클레오티드 F-Gal(서열번호 11)을 합성하였다. 또한, 각각 추정되는 C-말단 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 기초로, 3종의 올리고 뉴클레오티드 R-Gal1, R-Gal2, R-Gal4(서열번호 12, 13, 14)를 합성하고, PCR 프라이머로 사용하였다. 센스 프라이머 F-Gal에는 SacI 제한효소 인지 부위를, 안티센스 프라이머 R-Gal1, R-Gal2, R-Gal4에는 SalI 제한효소 인지 부위를 부가하였다. 이들 프라이머와 β-갈락토시다제 유전자를 가지는 염색체 DNA를 주형으로, 이하의 조건에 의해 PCR 반응을 행하였다.

10x PCRP 반응 완충액(TOYOBO 사) 5.0 ㎕

dNTP 혼합액(각각 2.5 mM, TOYOBO 사) 5.0 ㎕

10 μM 센스 프라이머 1.5 ㎕

10 μM 안티센스 프라이머 1.5 ㎕

25 mM MgSO₄ 2.0 ㎕

증류수 33.0 ㎕

염색체 DNA 용액(200 ㎍/ml) 1.0 ㎕

KOD-Plus- DNA 중합효소(TOYOBO 사) 1.0 ㎕

스테이지 1: 변성(94℃, 2분) 1 사이클

스테이지 2: 변성(94℃, 15초) 30 사이클

어닐링(57℃, 30초)

신장(68℃, 5분)

얻어진 PCR 산물을 전기영동에 의해 확인한 후, 에탄올 침전에 의해 탈염(69 ㎕)하였다. 이어서, 15 ㎕의 10x T 완충액, 10 ㎕의 0.1% BSA 용액 및 SacI 3 ㎕와 SalI 3 ㎕을 가하여, 37℃에서 15시간 동안 효소 처리하였다. 제한 효소 처리액을 전기영동에 의해 확인하고, NucleoSpin Extract II(일본 유전학사)로 정제한 후, 미리 SacI와 SalI로 처리한 벡터 pCold II DNA(다카라 바이오사)에 β-Gal1, β-Gal2, β-Gal4 단편을 라이게이션하여, 발현 플라스미드 pCold-Gal1, Gal2, Gal4를 제작하였다.

(b) β-갈락토시다제의 대장균에서의 발현

발현 플라스미드 pCold-Gal1, Gal2, Gal4를 대장균 BL21 Competent Cell(다카라 바이오사)에 도입하였다. 암피실린 내성주로서 수득한 형질전환체 중에서, 콜로니 PCR에 의해 목적 β-갈락토시다제 유전자가 삽입된 pCold-Gal1, Gal2, Gal4를 보유한 균주를 선별하였다. 또한, 대조군으로서 발현 벡터 pCold II DNA를 가지는 대장균 BL21의 형질전환체도 수득하였다. 이들 형질전환체를 100 ㎍/ml의 암피실린이 포함된 LB 배양 배지 1 ml에 식균하여, 37℃ 및 170 rpm으로 O.D₆₀₀ = 0.4 - 1.0에 도달할 때까지 배양하였다(전 배양). 이어서, 전 배양액 300 ㎕를 100 ㎍/ml의 암피실린이 포함된 LB 배양 배지 9 ml에 식균하여, 37℃ 및 170 rpm으로 O.D₆₀₀ = 0.4 - 1.0에 도달할 때까지 배양하였다. 15℃에서 30분 방치한 후, 0.1 M IPTG를 9 ㎕를 첨가하고, 15℃에서 160 rpm으로 24시간 배양(본 배양)하고, 집균하였다. 균체를 1.0 ml의 100 mM 인산 완충액(pH 6.0)에 현탁하고, Φ 0.1 mm 유리 비드 0.50 g을 가한 다음, 멀티-비드 쇼커(야스이기계)에 의해 균체를 파쇄하였다. 파쇄 조건은, ON 120초, OFF 60초를 3.75 사이클로 반복하였다. 얻어진 세포-제거 추출물을 원심분리하여, 가용성 성분을 수득하였다.

(c) β-갈락토시다제의 발현 확인

수득한 가용성 성분을 SDS-PAGE로 분석하였다. 전기영동 장치로서 PhastSystem(GE Healthcare)를, 분리 겔로서 PhastGel Homogeneous 7.5(GE Healthcare)를 사용하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, pCold-Gal1에서는 189 kDa 부근에, pCold-Gal2에서는 135 kDa 부근에, pCold-Gal4에서는 154 kDa 부근에서, 각각 β-Gal1, β-Gal2, β-Gal4로 고려되는 유의한 단백질의 생산이 확인되었다. 대조군의 경우, pCold II DNA에서는 이러한 단백질의 생산이 확인되지 않았으므로, 본 단백질은 각각 β-갈락토시다제 유전자 β-Gal1, β-Gal2, β-Gal4의 도입에 인한 것으로 여겨진다.

또한, 동일 샘플에 대하여 ONPG 및 락토스를 기질로 한 β-갈락토시다제 활성을 측정하였다. 활성 측정 결과는 표 2에 나타낸다.

	ONPG 분해 활성 (U/mg)	락토스 분해 활성 (U/mg)
pColdII-Gal	31.99	34.19
pColdII-Ga2	6.40	26.43
pColdII-Ga4	2.13	8.74
pColdII	0.48	0.00

어떤 경우에는, ONPG를 기질로 하였을 때 대조군의 4배 이상, 락토스를 기질로 하였을 때는 대조군에 비해 명확한 β-갈락토시다제 활성이 검출되어, 목적 β-갈락토시다제 β-Gal1, β-Gal2, β-Gal4의 발현이 검증되었다.

5. 바실러스 서쿨란스 유래의 β-갈락토시다제 β-Gal3의 대장균에서의 발현

(a) β-갈락토시다제의 대장균에서의 발현 플라스미드의 구축

상기와 동일하게 β-Gal3의 발현 플라스미드를 구축하였다. 분자량 91.0 kDa(질량 분석의 값)의 β-Gal3에 해당되는 단백질의 N-말단 영역의 아미노산 서열과 추정의 C-말단 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 기초로, 2종의 올리고 뉴클레오티드(서열번호 15, 16)를 합성하고, PCR 프라이머로 사용하였다. 센스 프라이머 F-Gal3에는 NdeI 제한 효소 인식 부위를, 안티센스 프라이머 R-Gal3에는 XbaI 제한 효소 인식 부위를 부가하였다. 이들 프라이머와 β-갈락토시다제 유전자를 가진 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이하의 조건에 의해 PCR 반응을 행하였다.

10x PCRP 반응 완충액(TOYOBO) 5.0 ㎕

dNTP 혼합액(각각 2.5 mM, TOYOBO) 5.0 ㎕

10 μM 센스 프라이머 1.5 ㎕

10 μM 안티센스 프라이머 1.5 ㎕

25 mM MgSO₄ 2.0 ㎕

증류수 33.0 ㎕

염색체 DNA 용액(200 ㎍/ml) 1.0 ㎕

KOD-Plus-DNA 중합효소(TOYOBO) 1.0 ㎕

스테이지 1: 변성(94℃, 2분) 1 사이클

스테이지 2: 변성(94℃, 15초) 30 사이클

어닐링(57℃, 30초)

신장(68℃, 3분)

얻어진 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 후, 에탄올 침전에 의해 탈염(84 ㎕)하였다. 이어서, 10 ㎕의 적합한 완충액과 NdeI 3 ㎕ 및 XbaI 3 ㎕를 가하여, 37℃에서 15시간 효소 처리하였다. 제한 효소 처리액을 전기영동에 의해 확인하고, NucleoSpin Extract II로 정제한 다음 미리 NdeI 및 XbaI로 처리한 벡터 pCold III DNA에 라이게이션하여 발현 플라스미드 pCold-Gal3를 구축하였다.

(b) β-갈락토시다제의 대장균에서의 발현

발현 플라스미드 pCold-Gal3를 대장균 BL21 Competent Cell에 도입하였다. 암피실린 내성주로서 얻어진 형질전환체 중에서, 콜로니 PCR에 의해 목적 β-갈락토시다제 유전자가 삽입된 pCold-Gal3를 유지하는 균주를 선별하였다. 또한 대조군으로 발현 벡터 pCold III DNA를 가지는 대장균 BL21의 형질전환체도 수득하였다. 이들 형질전환체를 100 ㎍/ml의 암피실린이 함유된 LB 배양 배지 1 ml에 식균하고, 37℃, 170 rpm로 O.D₆₀₀ = 0.4 - 1.0에 도달할 때까지 배양하였다(전 배양). 이어서, 전 배양액 300 ㎕를 100 ㎍/ml의 암피실린이 함유된 LB 배양 배지 9 ml에 식균하고, 37℃, 170 rpm로 O.D₆₀₀ = 0.4 - 1.0에 도달할 때까지 배양하였다. 15℃에서 30분간 처리한 후, 0.1 M IPTG를 9 ㎕ 첨가하고, 15℃, 160 rpm로 24시간 배양(본 배양)하여, 집균하였다. 균체를 1.0 ml의 100 mM 인산 완충액(pH 6.0)에 현탁하고, Ø0.1 mm의 유리 비드 0.50 g을 가하여, 멀티-비드 쇼커에 의해 균체를 파쇄하였다. 파쇄 조건은, ON 120초, OFF 60초를 3.75 사이클의 반복이었다. 얻어진 세포 제거된 추출물을 원심분리하여, 가용성 성분을 수득하였다.

(c) β-갈락토시다제의 발현 확인

상기 4와 동일하게 수득한 가용성 성분을 SDS-PAGE로 분석하였다. 전기영동 장치로서 PhastSystem를, 분리 겔로서 PhastGel Homogeneous 7.5를 사용하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, pCold-Gal3에서는 91 kDa 부근에 β-Gal3으로 여겨지는 유의한 단백질의 생산이 확인되었다. 대조군인 pColdIII DNA에서는 동일한 단백질의 생산은 확인되지 않아, 본 단백질은 β-갈락토시다제 유전자 β-Gal3의 도입에 인한 것으로 여겨진다. 또한, 동일 샘플에 대한 ONPG 및 락토스를 기질로 한 β-갈락토시다제 활성 측정을 실시하였다. 활성 측정 결과는 표 3에 나타낸다. ONPG를 기질로 한 경우에는 대조군의 5배 이상, 락토스를 기질로 한 경우에는 대조군의 200배 이상의 β-갈락토시다제 활성이 검출되어, 목적 β-갈락토시다제 β-Gal3의 발현이 검증되었다.

	ONPG 분해 활성 (U/mg)	락토스 분해 활성 (U/mg)
pColdIII-Ga3	1.79	6.01
pColdIII	0.34	0.03

본 발명은 바실러스 서쿨란스 유래의 신규한 β-갈락토시다제를 제공한다. 본 발명의 β-갈락토시다제는 산업상 유용하며, 예컨대 우유, 유제품, 발효 유제품, 갈락토올리고당 또는 식사 보충제의 제조에 이용된다.

본 발명은, 상기 발명의 실시형태 및 실시예의 설명에 어떠한 한정도 적용되지 않는다. 특허청구의 범위의 기재를 이탈하지 않고, 당업자가 용이하게 생각할 수 있는 범위에 포함되는 여러가지 변형 태양도 본 발명에 포함된다. 본 명세서에 명시된 논문, 공개 특허 공보, 및 특허 공보 등의 내용은, 그 모든 내용이 원용에 의해 본원에 포함된다.

서열목록

서열번호 3, 4, 11-16: 인공 서열: 프라이머

SEQUENCE LISTING <110> AMANO ENZYME INC. KATASE, Toru HOSHI, Yukiko NAGAYA, Miho YAMAGUCHI, Shotaro MINODA, Masashi NAKANISHI, Kazuhiro <120> BETA-GALACTOSIDASE DERIVED FROM BACILLUS CIRCULANS <130> AE09007P <150> JP P2009-136735 <151> 2009-06-05 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Bacillus circulans <400> 1 Gly Asn Ser Val Ser Tyr Asp Gly Glu Arg Arg Val Asn Phe Asn Glu 1 5 10 15 Asn <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Bacillus circulans <400> 2 Glu Asp Arg Ala Asp Val Asn Ile Lys Thr Lys Ile Ser Asn Asp 1 5 10 15 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ggcaatagcg tgagctatga tgg 23 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 gattttcgtt ttgatattca catcggc 27 <210> 5 <211> 5214 <212> DNA <213> Bacillus circulans <400> 5 gtgaaaaaag cgattagctg cgttttttta atttcagcac tgattctatc aagctttcaa 60 gtccctgtac agggacaagc catgtcaaaa acgacatcgg cagcaggaaa cagtgtgagc 120 tatgatggag agagacgagt gaattttaac gagaattggc gatttcaacg agaaaccaat 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Ser Leu Lys Ala Lys Ala Phe Val Ile Val Lys Gly Ile Val Ala 885 890 895 Val Lys Pro Tyr Ser Thr Ala Thr Lys Val Gly Val Gln Pro Val Leu 900 905 910 Pro Glu Lys Ala Thr Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Thr Thr Lys Gly Ala 915 920 925 Thr Val Thr Trp Asp Glu Ile Pro Glu Asp Lys Leu Ala Lys Glu Gly 930 935 940 Arg Phe Thr Val Glu Gly Ser Val Glu Gly Thr Asp Leu Lys Ala Asn 945 950 955 960 Val Tyr Val Arg Val Thr Asn Glu Val Lys Ser Val Asn Ile Met Leu 965 970 975 Gln Glu Gln Gly Ser Ala Tyr Pro Lys Leu Glu Ala Thr Phe Thr Asn 980 985 990 Pro Ala Asp Asn Leu Gln His Leu Asn Asp Gly Ile Lys Ser Tyr Thr 995 1000 1005 Asn Asn Pro Val Asn Arg Trp Thr Asn Trp Thr Arg Thr Pro Arg 1010 1015 1020 Asp Ala Gly Asp Ser Ile Thr Val Asn Phe Gly Lys Lys His Val 1025 1030 1035 Ile Asn Asn Leu Asp Leu Phe Val Phe Thr Asp Ser Gly Thr Val 1040 1045 1050 Val Pro Glu Lys Ala Glu Val Gln Tyr Trp Asp Gly Thr Ala Trp 1055 1060 1065 Lys Asp Val Glu Asn Leu Thr Gln Pro Ser Pro Tyr Val Val Glu 1070 1075 1080 Lys Asn Glu Leu Thr Phe Asp Ala Val Ala Thr Glu Lys Leu Lys 1085 1090 1095 Phe His Leu Thr Pro Ser Val Lys Gly Lys Phe Leu Ala Leu Thr 1100 1105 1110 Glu Ala Glu Val Tyr Ala Asp Gln Ile Val Met Gly Glu Thr Ala 1115 1120 1125 Lys Leu Gln Ser Ile Thr Val Asn Gly Lys Ala Leu Glu Gly Phe 1130 1135 1140 Asp His Ala Lys Lys Asn Tyr Glu Leu Val Leu Pro Tyr Gly Ser 1145 1150 1155 Glu Leu Pro Lys Ile Glu Ala Ala Ala Ala Asp Asn Ala Thr Val 1160 1165 1170 Thr Ile Leu Pro Ala Phe Ser Tyr Pro Gly Thr Ala Lys Leu Phe 1175 1180 1185 Val Thr Ser Glu Asp Gly Lys Val Thr Thr Glu Tyr Ser Ile Gly 1190 1195 1200 Val Ser Thr Glu Glu Pro Lys Leu Val Ser Ala Glu Leu Ser Ala 1205 1210 1215 Asp Lys Thr Asn Val Met Glu Asp Asp Ile Ile Asp Leu Lys Val 1220 1225 1230 Ile Gly Leu Phe Glu Ser Lys Glu Lys Ile Asp Val Thr Asp Ser 1235 1240 1245 Gln Pro Thr Tyr Glu Phe Asp Gln Gln Ile Ile Lys Ile Glu Gly 1250 1255 1260 Asn Lys Leu Tyr Ala Leu Glu Thr Gly Asn Val Lys Val Lys Val 1265 1270 1275 Thr Val Thr Tyr Lys Gly Val Ser Val Thr Thr Pro Ala Leu Glu 1280 1285 1290 Phe Thr Ile Ala Lys Asn Pro Ala Pro Lys Tyr Ile Thr Ser Leu 1295 1300 1305 Glu Pro Val Thr Val Val Val Lys Lys Gly Glu Ala Pro Glu Leu 1310 1315 1320 Pro Ala Thr Val Val Ala His Tyr Asn Arg Gly Ile Pro Arg Asp 1325 1330 1335 Val Lys Val Lys Trp Glu Arg Ile Asn Pro Ser Lys Tyr Gln Gln 1340 1345 1350 Leu Gly Glu Phe Thr Val Ser Gly Met Val Glu Gly Thr Asp Ile 1355 1360 1365 Lys Ala Gln Ala Lys Val Ile Val Lys Gly Ala Val Ala Val Glu 1370 1375 1380 Asp Ile Arg Met 1385 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 aaggtgagct cggaaacagt gtgagc 26 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 aaggtgtcga cttatttata gtgaatg 27 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 accttgtcga ctcatgcgga gacgagc 27 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 accttgtcga ctcacattct aatatcc 27 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 catcgcatat gggaaacagt gtgagctatg 30 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 tttgtctcta gattatggcg ttaccgtaaa tacg 34 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Bacillus circulans <400> 17 Ser Val Ser Tyr Asp Gly Glu Arg Arg Val Asn Phe Asn Glu Asn 1 5 10 15 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus circulans <400> 18 Trp Ser Ile Gly Asn Glu Ile Tyr 1 5

Claims

분자량 195 kDa(SDS-PAGE에 의함)의 바실러스 서쿨란스(Bacillus circulans) 유래의 β-갈락토시다제.
제1항에 기재된 β-갈락토시다제의 단편을 포함하는 바실러스 서쿨란스 유래의 β-갈락토시다제.
서열번호 7의 아미노산 서열 또는 β-갈락토시다제 활성을 나타내는 그 단편을 포함하는 β-갈락토시다제.
제3항에 있어서, 상기 단편이 서열번호 7의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 WSIGNEIY(서열번호 18)까지의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 β-갈락토시다제.
제3항에 있어서, 상기 단편이 서열번호 8-10 중 어느 하나의 서열번호의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 β-갈락토시다제.
제3항에 있어서, 서열번호 5의 서열을 포함하는 DNA에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 β-갈락토시다제.
하기 (a) - (e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 DNA를 포함하는 β-갈락토시다제 유전자:
(a) 서열번호 6 또는 7의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA;
(b) 서열번호 5의 서열을 포함하는 DNA;
(c) 서열번호 5의 서열에 상보적인 서열에 대해 엄격 조건하에서 혼성화하는 DNA;
(d) 서열번호 5의 서열의 DNA 축중(degenerate) 서열인 DNA;
(e) 서열번호 5의 서열을 기준으로 1 또는 수개의 염기의 치환, 결손, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 서열을 포함하며, β-갈락토시다제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA.
제7항에 있어서, 상기 β-갈락토시다제 활성을 가지는 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열에서 60% 미만, 바람직하게는 45% 미만, 더 바람직하게는 25% 미만의 변형이 있는 서열 또는 그 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 β-갈락토시다제 유전자.
제8항에 있어서, 상기 변형은 보존적 아미노산 치환인 것을 특징으로 하는 β-갈락토시다제 유전자.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 β-갈락토시다제 유전자에 의해 코딩되는 β-갈락토시다제.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 β-갈락토시다제 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제11항에 있어서, 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 β-갈락토시다제 유전자가 도입된 형질전환체.
제11항 또는 제12항에 기재된 재조합 벡터가 도입된 형질전환체.
제13항 또는 제14항에 있어서, 세균 세포, 효모 세포 또는 진균류 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
하기 공정 (1) 및 (2)를 포함하는 β-갈락토시다제의 제조 방법:
(1) 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 형질전환체를, 상기 β-갈락토시다제 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 생산되는 조건하에서 배양하는 공정; 및
(2) 생산된 상기 단백질을 회수하는 공정.
제1항 내지 제6항 또는 제10항 중 어느 한 항에 기재된 β-갈락토시다제를 유효 성분으로 포함하는 효소제.
제17항에 있어서, 상기 유효 성분이 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 β-갈락토시다제, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 β-갈락토시다제, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 β-갈락토시다제, 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 β-갈락토시다제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 β-갈락토시다제인 것을 특징으로 하는 효소제.
저유당 우유, 장내 비피더스균 증식 인자인 갈락토올리고당, 유당 불내증 환자를 위한 의약 또는 보충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 제품의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제6항 또는 제10항 중 어느 한 항에 기재된 β-갈락토시다제 또는 체17항 또는 제18항에 기재된 효소제의 용도.
제1항 내지 제6항 또는 제10항 중 어느 한 항에 기재된 β-갈락토시다제 또는 제17항 또는 제18항에 기재된 효소제를 사용하여 얻어지는, 저유당 우유, 장내 비피더스균 증식 인자인 갈락토올리고당, 또는 유당 불내증 환자를 위한 의약 또는 보충제.