KR101825456B1 - 고당전이 활성의 베타-갈락토시다제 변이체 및 그 용도 - Google Patents

고당전이 활성의 베타-갈락토시다제 변이체 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고당전이 활성을 갖으며, 카르복시 말단부가 절단된, 베타-갈라토시다제 효소의 변이체 및 그 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 카르복시 말단부가 절단된 베타-갈락토시다제 변이체, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 상기 유전자 또는 재조합 벡터로 형질 전환된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제 변이체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 카르복시 말단부가 절단된 베타-갈락토시다제 변이체의 높은 당전이 활성을 이용하여, 효율적으로 갈락토올리고당을 대량 생산할 수 있다.

Description

고당전이 활성의 베타-갈락토시다제 변이체 및 그 용도{Fully active beta-galactosidase mutants and Uses thereof}
본 발명은 신규 베타-갈락토시다제 변이체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans) 유래의 신규 베타-갈락토시다제 변이체, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제 변이체의 제조방법 및 상기 베타-갈락토시다제 변이체를 이용한 갈락토올리고당의 제조방법에 관한 것이다.
베타-갈락토시다제(β-galactosidase)는 젖당 같은 베타-D-갈락토피라노사이드(β-D-galactopyranoside)에서 말단의 비환원성 베타-D-갈락토스(β-D-galactose)를 가수분해하여 갈락토스(Galactose)와 포도당을 만들거나, 비환원성 갈락토스를 다른 화합물에 옮기는 갈락토스 전이반응을 촉매한다. 일반적으로 이 부류의 효소는 가수분해 활성과 당 전이 활성의 두 기능을 가지고 있으나, 베타-갈락토시다제의 종류에 따라 두 반응의 비율이 다르다. 베타-갈락토시다제의 가수분해 활성은 우유와 유제품의 젖당을 가수분해하여 젖당 불내증을 막아주며, 우유의 당도를 높이거나, 우유 부산물로 감미 시럽을 제조하는 데 사용되고, 당 전이 활성은 인간의 장내 유용미생물인 유산균의 성장을 증진시키는 갈락토올리고당(Glactooligosaccharide)의 제조에 사용되는 등, 산업적으로 매우 유용한 효소이다.
베타-갈락토시다제는 포유동물의 장기, 식물의 종자를 비롯하여 세균, 곰팡이, 효모로부터 널리 발견된다. 식품공업에 클루이베로마이세스 락티스( Kluyveromyces lactis)와 클루이베로마이세스 프래길리스(Kluyveromyces fragilis ) 등의 효모, 아스페르길러스 나이거(Aspergillus niger)와 아스페르길러스 오리재(Aspergillus oryzae) 등의 곰팡이, 그리고 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans)유래의 베타-갈락토시다제를 사용하고 있다. 그중 바실러스 서큘란스 ATCC 31382 유래의 베타-갈락토시다제는 Biolacta (Daiwa Kasei 사, US Patent 4237230 (1980)) 제품명으로 판매되고 있다.
베타-갈락토시다제가 젖당과 결합하여, 베타-갈락토시다제 반응중심부에 있는 글루타메이트 잔기의 카르복실기가 산염기 촉매로 작용하면서 반응이 시작된다(Juers et al., Biochemistry, 40, 14781-14794, 2001). 이 nucleophile 글루타메이트 잔기는 포도당에 결합된 갈락토스의 1번 탄소를 공격하여 포도당을 떼어내면서, 갈락토스에 일시적인 공유결합을 한다. 이때 떨어져 나가는 포도당의 4번 탄소에 붙은 하이드록실기는 산성촉매 역할을 하는 다른 글루타메이트의 도움으로 안정화되었다가, 양성자를 받아 자유 포도당으로 되면서 효소에서 떨어져 나간다. 효소의 글루타메이트 잔기에 일시적으로 공유결합 상태로 붙어 있던 갈락토스는 물과 반응하여 효소에서 떨어져 나가거나(가수분해반응), 효소의 반응중심에 새로 들어온 젖당이나 다른 화합물에 결합한다(갈락토스 전이반응). 이러한 갈락토스 전이반응으로 생긴 하나 이상의 갈락토스 단위체(galactoside)를 가지는 물질을 갈락토올리고당(galactooligosaccharide, GOS)라고 한다.
GOS는 소화 흡수되지 않고 대장에 도달하여, Bifidobacteria나 Lactobacilli 같은 대장에 공생하는 유용미생물의 생장과 활성을 촉진하는 프리바이오틱스로 작용한다. GOS는 암 예방, 무기질 흡수, 지질 대사, 항염증, 아토피 완화 등의 건강 증진에 효과가 있다고 알려졌다(Macfarlane et al., J. Appl. Mcriobiol., 104, 305-344, 2008). 또한, 과민성 장 증후군을 앓고 있는 사람이 GOS를 섭취하였을 때, 이로운 장내세균인 Bifidobacteria의 양을 증가시키며, 증상도 완화된다는 연구보고가 있다(Silk et al., Aliment. Pharmacol. Ther., 29, 508-518, 2009)
현재 GOS 생산에 Bacillus 또는 Aspergillus 유래의 베타-갈락토시다제가 많이 사용되고 있으며, 특히 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans) 유래 베타-갈락토시다제는 상대적으로 높은 온도인 50~60 도씨의 최적반응온도를 가지고 있고 높은 갈락토스 전이반응 효율을 가지고 있기 때문에 상업적으로 가장 많이 사용되고 있다. 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans)로부터 240 kDa, 160 kDa (Mozafar et al., Agric. Biol. Chem., 48, 3053-3061, 1984); 212 kDa, 145 kDa, 86 kDa (Vetere 와 Paoletti, Biochim. Biophys. Acta, 1380, 223-231, 1998); 195 kDa, 160 kDa, 135 kDa, 86 kDa (Song et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 75, 268-278, 2011) 등 여러 가지 베타-갈락토시다제가 보고 되었다. 또한 145 kDa의 크기이지만, 새로운 종류인 베타-갈락토시다제, BgaII가 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans)에서 발견 보고되었다(대한민국 등록특허, 제1,121,161호).
이에 본 발명에서는 젖당에서 갈락토올리고당 생산능력이 향상된 베타-갈락토시다제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 베타-갈락토시다제 BgaII의 C-말단부를 절단하여 변이체를 제작할 경우, 갈락토올리고당의 생산능력이 향상되고, 열안정성이 획기적으로 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 베타-갈락토시다제 변이체, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제 변이체의 제조방법 및 갈락토올리고당의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 베타-갈락토시다제에서, 카르복시 말단부가 절단된 변이를 통해 열안정성 또는 효소 활성 등의 생화학적 특성이 개선된 베타-갈락토시다제 변이체를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 베타-갈락토시다제에서, 1-798번째 아미노산을 포함하고 799 내지 1396번째 아미노산 잔기 중 어느 하나의 카르복시 말단이 절단된 변이를 포함하는 아미노산 서열을 가지는 베타-갈락토시다제 변이체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 베타-갈락토시다아제 변이체를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 베타-갈락토시다제 변이체를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-갈락토시다제 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 베타-갈락토시다제의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 베타-갈락토시다제 변이체를 락토스 함유 기질과 반응시켜 갈락토올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 갈락토올리고당을 회수하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 베타-갈락토시다제 변이체를 이용하면, 갈락토올리고당을 효율적으로 대량 생산할 수 있다.
도 1은 베타-갈락토시다제와 그 변이체를 구성하는 아미노산 서열의 보존된 도메인을 도식화 한 것이다.
도 2는 베타-갈락토시다제와 그 변이체의 SDS-PAGE 수행 후, 코마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색한 결과이다(MW: 단백질 크기 마커, WT: 야생형, 799~1350:변이체).
도 3은 베타-갈락토시다제와 그 변이체의 SDS-PAGE 수행 후, X-gal로 염색한 결과이다(MW: 마커, WT: 야생형, 799~1350:변이체).
도 4는 베타-갈락토시다제와 그 변이체의 효소활성을 측정한 결과이다(WT: 야생형, 873~1350:변이체).
도 5는 베타-갈락토시다제와 그 변이체의 oNPG와 젖당을 이용한 기질특이성을 측정한 결과이다(WT: 야생형, 873~1350:변이체).
도 6은 베타-갈락토시다제와 그 변이체에서 생산한 탄수화물의 HPLC 분석결과이다(BgaII: 야생형, BgaII-950:변이체).
도 7은 베타-갈락토시다제와 그 변이체의 열안정성을 측정한 결과이다(WT: 야생형, 873~1350:변이체).
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 선행특허(대한민국 등록특허, 제1,121,161호)에서 발굴한 베타-갈락토시다제의 카르복시 말단을 절단한 변이체를 제작할 경우, 당전이 활성과 열안정성이 증가하는 것을 확인하고자 하였다.
본 발명에서는, 선행특허(대한민국 등록특허, 제1,121,161호)에서 발굴한 베타-갈락토시다제의 도메인이 도 1과 같이 다중 도메인 구조를 가지고 있는 것을 알 수 있었다. 베타-갈락토시다제의 GH2_SB, GH2와 GH2_TIM으로 이루어진 LacZ 도메인은 효소활성을 갖는 부분이다. 베타-갈락토시다제의 카르복시 말단부 쪽으로 한 개의 BIG1과 세 개의 BIG4, bacteria Ig-like 도메인을 가지고 있으며, 가장 카르복시 말단부에 discoidin 도메인이라고도 불리는 F5/8_C 도메인을 가지고 있다. 특정 구조를 가지지 않는 폴리펩타이드 사슬이 도메인 사이를 연결하고 있으며, 그 길이는 약 10, 50, 130 아미노산 잔기이다. 또한, 카르복시-말단부의 F5/8_C 도메인 뒤쪽에 구조가 없는 약 100 아미노산 잔기 폴리펩타이드 사슬이 있는 것을 확인하고, 카르복시 말단의 도메인을 순차적으로 절단하는 변이체를 제작하여 그 활성 및 열안정성을 측정하였다. 그 결과 카르복시 말단이 절단된 베타 갈락토시다제의 효소활성과 열 안정성이 증가한 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 베타-갈락토시다제의 카르복시 말단 변이체를 제작하고, 상기 제작된 변이체의 효소활성과 열 안정성을 분석한 결과, 그 효과가 매우 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 베타-갈락토시다제에서, 카르복시 말단부가 절단된 변이를 통해 열안정성 또는 효소 활성 등의 생화학적 특성이 개선된 베타-갈락토시다제 변이체에 관한 것이다.
본 발명에서 카르복시 말단부가 절단된 변이는 서열번호 3의 아미노산 서열료 표시되는 베타-갈락토시다제의 효소활성을 저하시키지 않는 범위에서 아미노산 잔기의 카르복시 말단부가 절단된 변이를 모두 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 베타-갈락토시다제에서, 1-798번째 아미노산을 포함하고, 799 내지 1396번째 아미노산 잔기 중 어느 하나의 카르복시 말단이 절단된 변이를 포함하는 아미노산 서열을 가지는 베타-갈락토시다제 변이체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 변이는 a) 799번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; b) 873번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; c) 900번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; d) 950번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; e) 1000번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; f) 1059번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; g) 1066번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; h) 1115번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; i) 1164번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; j) 1200번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; k) 1302번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; 및 l) 1350번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단; 으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 또는 26인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 베타-갈락토시다제 변이체를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 상기 베타-갈락토시다아제 변이체를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 베타-갈락토시다아제 변이체를 코딩하는 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 대장균에서 사용되는 단백질 발현 벡터로는 Novagen (미국) 사의 pET 계열; Invitrogen (미국)의 pBAD 계열; Takara (일본)의 pHCE 나 pCOLD; 제노포커스 (대한미국)의 pACE 계열; 등을 사용할 수 있다. 고초균에서는 게놈의 특정부분에 목적 유전자를 삽입하여 단백질 발현을 구현하거나, MoBiTech (독일)의 pHT 계열의 벡터, 등을 사용할 수 있다. 곰팡이나 효모에서도 게놈 삽입이나 자가복제 벡터들 이용하여 단백질 발현이 가능하다. Agrobacterium tumefaciens나 Agrobacterium rhizogenes 등의 T-DNA 시스템을 이용하여 식물용 단백질 발현 벡터를 사용할 수 있다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.
"발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
본 발명의 정의상 "실질적으로 순수한"이란 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드를 코딩하는 DAN 서열이 박테리아로부터 유래된 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
재조합 단백질을 발현하기 위한 숙주세포는 짧은 시간 내 고농도 균체 배양이 가능하고 유전자 조작이 용이하고 유전학적, 생리적 특징이 잘 밝혀져 있는 대장균 (Escherichia coli), 고초균 (Bacillus subtillis) 등과 같은 원핵세포가 널리 이용되어 왔다. 그러나, 단백질의 번역 후 수식 (post-translational modification), 분비과정 및 활성형의 3차원 구조, 단백질의 활성상태의 문제점들을 해결하기 위해 최근 단세포 진핵세포인 효모 계열 (Pichia pastoris , Saccharomyces cerevisiae , Hansenula polymorpha 등), 사상성 진균류 (filamentous fungi), 곤충세포 (insect cells), 식물세포, 포유동물세포 (mammalian cells) 등 고등생물에 이르기까지 재조합 단백질 생산의 숙주세포로 활용하고 있으므로, 실시예에서 예시된 고초균 뿐만 아니라 다른 숙주세포를 이용하는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 용이하게 적용가능하다.
본 발명은, 또 다른 관점에서, 상기 형질전환된 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제 변이체의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로, 상기 재조합 미생물을 배양하여 베타-갈락토시다제 변이체를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-갈락토시다제 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 베타-갈락토시다제 변이체의 제조방법에 관한 것이다.
상기 형질전환된 재조합 미생물의 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행되고, 배양 온도 및 시간, 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다.
상기 배양된 재조합 미생물로부터의 베타-갈락토시다제 변이체의 회수는 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.
본 발명의 일실시예에서는 형질전환된 재조합 고쵸균을 이용하여 재조합 베타-갈락토시다제 야생형 및 변이체를 제조하였으며, 상기 pD92(대한민국 특허, 공개번호, 10-2011-0102862) 벡터는 단백질 발현을 위해 별도의 유도제(Inducer) 첨가가 필요 없이 미생물 배양만으로 세포성장과 단백질 발현이 분리된 상태로 재조합 단백질이 가능하다. 상기 방법으로 생산된 베타-갈락토시다제 야생형 및 변이체는 SDS-PAGE로 확인결과 예측된 크기를 가지고 X-gal 염색 결과 베타-갈락토시다제의 활성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 2, 도 3).
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 수득한 재조합 베타-갈락토시다제 야생형 및 변이체를 o-니트로페닐-갈락토피라노사이드(o-Nitrophenyl-Galactopyranoside, oNPG)를 기질로 하여, 효소 활성을 측정한 결과, 베타-갈락토시다제 변이체의 활성이 야생형에 비해 뛰어난 것을 확인하였고(도 4), 젖당과 oNPG를 이용한 분해특성을 분석한 결과, 야생형에 비해 변이체가 젖당에 대한 기질특이성이 뛰어난 것을 확인하였으며(도 5), 생산한 탄수화물을 HPLC로 분석한 결과, 야생형과 변이체에서 모두 갈락토올리고당이 생산되며, 그 생산량이 야생형보다 변이체가 월등히 많은 것을 확인하였다(도 6).
본 발명의 또다른 실시예에서는, 재조합 베타-갈락토시다제 야생형 및 변이체를 최적 반응온도인 50 ℃ 보다 더 높은 60 ℃에서 1시간 동안 열처리를 한 후, oNPG를 기질로 이용하여 잔류 효소 활성을 측정한 결과, 야생형에 비해 변이체의 잔류 효소 활성이 뛰어난 것을 확인하였다(도 7).
따라서, 본 발명은 또다른 관점에서, 상기 베타-갈락토시다제 변이체를 락토스 함유 기질과 반응시켜 갈락토올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 갈락토올리고당을 회수하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 락토스 함유 기질은 30~60%(w/v), 바람직하게는 45~55%, 가장 바람직하게는 50%농도의 락토스 용액을 의미한다. 락토스는 함량이 높아질수록 용해도가 떨어지므로, 50% 락토스 용액의 제조는 고온하에 이루어지며, 갈락토올리고당 합성 온도 또한 고농도 락토스 용액 이용시에 50 ℃ 이상, 바람직하게는 60 내지 70 ℃가 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 갈락토올리고당은 액상유, 건조분말우유, 유아 우유, 유아 조제식 (baby formula), 아이스크림, 요거트, 치즈, 유제품, 음료, 유아 식품, 시리얼, 빵, 비스켓, 제과류, 케이크, 식품보조제, 식이보충제, 프로바이오틱 식료품, 프리바이오틱 식료품, 동물 사료, 가축 사료 및 약제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 구성성분일 수 있다.
여기서, 프로바이오틱(probiotic)이란 대부분 가장 흔한 병원균이 사용하는 젖산균을 가지고 있으며 잠재적으로 이익이 있는 박테리아 또는 효모를 포함한 식이 보충제를 의미한다. 프로바이오틱스는 젖산으로 다른 탄수화물과 설탕으로 전환할 수 있기 때문에 오랫동안 식품산업에서 사용되어 왔다. 프로바이오틱스는 요구르트와 같은 발효 유제품의 신맛을 제공할 뿐만 아니라, 성장을 위해 손상된 조직을 재건하기도 하며 pH를 낮추어 부식방지제로서 작용한다. 프로바이오틱스의 가장 흔한 형태는 발효된 유제품과 프로바이오틱스가 강화된 식품이며, Kefir (우유 발효 음료), 요구르트, Sauerkraut (발효된 독일식 김치), 한국김치 등의 젖산균도 프로바이오틱스의 건강효과와 유사한 것으로 나타났다.
또한, 프리바이오틱스(prebiotics)란 결장에 있는 박테리아의 수를 한정하며 선택적으로 박테리아의 성장을 자극하여 인체에 유리한 영향을 주는 물질로 인체 내에서 소화되지 않는 소당류로 구성되어 있다. 프리바이오틱스는 항암작용, 항균작용, Hypolipidemic 및 포도당 변조를 일으키는 활동을 한다. 프리바이오틱스는 결장에 있는박테리아의 수를 한정하며 선택적으로 박테리아의 성장을 자극하여 인체에 유리한 영향을 주는 물질이며 인체 내에서 소화되지 않는 식품 구성요소로서 정의할 수 있다. 주로 소당류(oligosaccharides)이며, 프락토 올리고당(Fructo-oligosaccharides), 이눌린, Isomalto-oligosaccharides, Lactilol, 유과올리고당(Lactosucrose), 락툴로스(Lactulose), Pyrodextrins, Soy oligosaccharides, Xylo-oligosaccharides을 포함하고 있다. 이들은 주로 bifidogenic 요인으로서 불리워지며, bifidobacteria의 성장을 촉진한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험방법
대장균 균주 및 성장조건
대장균 E. coli DH5a (Enzynomics, 대한민국)를 사용하여 플라스미드를 제작하거나 분리하였다. 세균은 LB 배지에서 키웠으며, 필요에 따라 100 ug/mL ampicillin, 5 ug/mL chloramphenicol 등, 적당량의 항생제를 사용하였다.
제작한 플라스미드로 형질전환한 Bacillus subtilis DB104를 사용하여 단백질을 발현하였다. Bacillus subtilis DB104를 LB 배지에서 12 시간 배양하고, 3500 rpm 에서 10 분간 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 세포 침전물을 세포 용해 완충용액 (100 mM sodium phosphate pH 7.0, Triton X-100 1%, lysozyme 1 mg/mL, DNase I 1 U/mL)에 풀어 상온에서 30분간 방치하였다. 이를 13,000 rpm 에서 5 분간 원심분리하여, 세포 잔유물을 제거하였다.
DNA 관련 실험조건
DNA 절단용 제한효소를 Enzynomics (대한민국)에서 구매하여 제작자의 안내서 내용에 따라 사용하였다. ELPIS Biotech (대한민국)의 Plasmid mini-prep kit와 DNA gel purification kit를 사용하여 대장균으로부터 플라스미드를 정제하고 전기영동 후 DNA 띠를 정제하였다. Genotech (대한민국)에서 DNA 염기서열을 확인하고 올리고 핵산을 합성하였다. DNA 농도를 확인하기 위하여 NanoDrop (Thermo Scientific, USA)를 사용하였다. DNA를 증폭하기 위하여 PCR-2000 (Bioneer, 대한민국) 기계와 pfu DNA 중합효소 (Sungenetics, 대한민국)를 사용하였다.
실시예 1: 야생형 베타- 갈락토시다제 ( BgaII ) 단백질 발현벡터와 생산균의 제작
야생형 베타-갈락토시다제 BgaII를 Bacillus subtilis DB104에서 발현하기 위하여, Bacillus subtilis 염색체에 삽입용 플라스미드 제작하였다. pACE-BgaII (대한민국 등록특허, 제1,121,161호)를 원본으로 하고, 서열변호 1과 서열번호 2의 올리고 핵산을 프라이머로 하여 중합효소사슬반응 (PCR)을 수행하였다. PCR은 pACE-BgaII 1 ng, 10배 pfu DNA 중합효소 반응 완충용액 5 uL, pfu DNA 중합효소 5 unit, 2 mM dNTP, 50 pmol 서열번호 1 올리고 핵산, 50 pmol 서열번호 2 올리고 핵산을 혼합하여 총 50 uL로 부피로 만들었다. 94 °C에서 1분간 DNA를 변성시키고, 94 °C 30 초, 57 °C 30 초, 72 °C 4 분의 반응을 35회 진행하여 DNA를 증폭하였다. 72 °C에서 7 분간 더 배양하여 반응을 종결하였다. 증폭한 DNA를 1% 한천에서 전기영동하여 약 4kb 위치에 있는 증폭한 DNA 띠를 정제하였다.
Bacillus subtilis 염색체 삽입용 벡터는 cry3Aa 프로모터 변이체를 가지는 pD92 (대한민국 특허, 공개번호 10-2011-0102862)를 사용하였다. 대장균에서 분리한 pD92를 제한효소 BamHI 및 PvuII로 이중절단하고 정제하였다. 100ng의 절단한 플라스미드와 100 ng의 증폭한 DNA 단편을 2.5 U의 T4 DNA polymerase (ELPIS Biotech)를 사용하여 붙이고, 대장균 DH5a에 열충격 방법으로 넣었다. 항생제 ampicillin이 들어있는 고체 LB 에서 자라는 형질전환된 대장균 군락을 골라 5 mL의 액체 LB 배지에서 키운 다음, plasmid mini-prep kit를 사용하여 플라스미를 정제하였다. 플라스미드를 제한효소 Hind III로 잘라, 맞게 나오는 플라스미드를 골라 Bacillus subtilis DB104에 자연도입법으로 집어넣었다. 항생제 chloramphenicol 5 ug/mL이 들어있는 고체 LB 배지에서 자라는 Bacillus subtilis 균군락을 1% 전분이 들어있는 고체 LB 배지에서 다시 키웠다. 전분을 1% KI와 1% I2 용액으로 전분을 염색하였을 때, 염색이 되지 않는 Bacillus subtilis 균군락을 선택하여 서열번호 3의 야생형 베타-갈락토시다제 생산균주로 사용하였다.
서열번호 1
A GGAAGAAAAG GATCC ATGAGACGAA TTAATTTTAA TG
서열번호 2
GCGACCGGCG CTCAGCTGTC ATTCTGTAAA ACGAATG
실시예 2: 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타- 갈락토시다제 ( BgaII ) 단백질 발현벡터와 생산균의 제작
카르복시 말단부가 절단된 베타-갈락토시다제 변이체 단백질 발현벡터를 제작하기 위하여 pACE-BgaII (대한민국 등록특허, 제1,121,161호)를 원본으로 하고, 하기의 표 1과 같은 조합을 이용하여 벡터 및 생산균주를 제작하였다(도 1).
변이체 프라이머 및 아미노산 서열번호
변이체명 변이체 서열번호 포워드 프라이머 백워드 프라이머
BgaII-799 서열번호 4 서열번호 1 서열번호 5
BgaII-873 서열번호 6 서열번호 1 서열번호 7
BgaII-900 서열번호 8 서열번호 1 서열번호 9
BgaII-950 서열번호 10 서열번호 1 서열번호 11
BgaII-1000 서열번호 12 서열번호 1 서열번호 13
BgaII-1059 서열번호 14 서열번호 1 서열번호 15
BgaII-1066 서열번호 16 서열번호 1 서열번호 17
BgaII-1115 서열번호 18 서열번호 1 서열번호 19
BgaII-1164 서열번호 20 서열번호 1 서열번호 21
BgaII-1200 서열번호 22 서열번호 1 서열번호 23
BgaII-1302 서열번호 24 서열번호 1 서열번호 25
BgaII-1350 서열번호 26 서열번호 1 서열번호 27
PCR은 pACE-BgaII 1ng, 10 배 pfu DNA 중합효소 반응 완충용액 5 uL, pfu DNA 중합효소 5 unit, 2 mM dNTP, 50 pmol 서열번호 1 올리고 핵산, 50 pmol 정방향/역방향 프라이머 올리고 핵산을 혼합하여 총 50 uL로 부피로 만들었다. 94 °C에서 1분간 DNA를 변성시키고, 94 °C 30 초, 57 °C 30 초, 72 °C 4분의 반응을 35회 진행하여 DNA를 증폭하였다. 72 °C에서 7분간 더 배양하여 반응을 종결하였다. 증폭한 DNA를 1% 한천에서 전기영동하여 증폭한 DNA 띠를 정제하였다.
Bacillus subtilis 염색체 삽입용 벡터는 cry3Aa 프로모터 변이체를 가지는 pD92(대한민국 특허, 공개번호 10-2011-0102862)를 사용하였다. 대장균에서 분리한 pD92를 BamHI과 PvuII로 이중절단하고 정제하였다. 100 ng의 절단한 플라스미드와 100 ng의 증폭한 DNA 단편을 2.5 U의 T4 DNA polymerase (ELPIS Biotech)를 사용하여 붙이고, 대장균 DH5a에 열충격 방법으로 넣었다. 항생제 ampicillin이 들어있는 고체 LB 에서 자라는 형질전환된 대장균 군락을 골라 5 mL의 액체 LB 배지에서 키운 다음, plasmid mini-prep kit를 사용하여 플라스미를 정제하였다. 제한효소 Hind III로 잘라 맞는 플라스미드를 골라 Bacillus subtilis DB104에 자연도입법으로 집어넣었다. 항생제 chloramphenicol 5 ug/mL이 들어있는 고체 LB 배지에서 자라는 Bacillus subtilis 균군락을 1% 전분이 들어있는 고체 LB 배지에서 다시 키웠다. 전분을 1% KI와 1% I2 용액으로 전분을 염색하였을 때, 염색이 되지 않는 Bacillus subtilis 균군락을 선택하여 서열번호 3의 야생형 베타-갈락토시다제 생산균주로 사용하였다.
실시예 3: 야생형 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타- 갈락토시다제 (BgaII) 단백질 발현 및 확인
야생형 및 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제를 만드는 Bacillus subtilis DB104 균을 항생제 chloramphenicol 5 ug/mL이 들어있는 고체 LB 배지에 도말하여 37 °C 배양기에 넣어 단일 균군락이 자라도록 하였다. 각각에서 1개의 균군락을 5 mL의 액체 배지에 접종하고 37 °C 교반배양기에서 배양하였다. 항생제 chloramphenicol 5 ug/mL이 들어있는 액체 LB 배지 50 mL에 종자배양액 0.5 mL을 접종하고, 37 °C 교반배양기에 넣어 배양하였다. 배양액을 3,500 rpm에서 10 분간 원심분리하여 배양액으로부터 세포를 분리하였다. 세포 침전물을 세포 용해 완충용액 (100 mM sodium phosphate pH 7.0, Triton X-100 1%, lysozyme 1 mg/mL, DNase I 1 U/mL)에 풀어 상온에서 30 분간 방치하였다. 이를 13,000 rpm 에서 5 분간 원심분리하여, 세포 잔유물을 제거하였다. 세포 용해액내의 단백질 조성을 확인하기 위하여, 5배 gel loading buffer와 시료를 1:4로 섞어, 5 분간 끓인 다음, 4-20% 농도구배 아크릴아마이드 gel (Bio-Rad, 미국)에서 SDS-PAGE를 수행하였다. Gel은 colloidal blue로 염색하였다. ElpisBiotech (대한민국)의 염색된 단백질 분자량 표준 물질을 사용하여, 야생형 및 C-말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII) 단백질의 상대적 크기를 확인하였다.
도 2에 개시된 바와 같이, 야생형 베타-갈라토시데이즈 II를 약 150 kD에서 두꺼운 단백질 띠로 확인할 수 있다. 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII) 단백질들, BgaII-873, BgaII-900, BgaII-950, BgaII-1000, BgaII-1059, BgaII-1066, BgaII-1115, BgaII-1164, BgaII-1200, BgaII-1302 및 BgaII-1350도 염색한 gel에서 계단 모양을 이루는 두꺼운 단백질 띠로 확인할 수 있었다. BgaII-799는 약하게 발현되는 것을 확인하였다.
Colloidal blue로 염색한 gel에서 두꺼운 단백질 띠가 야생형 및 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII) 단백질임을 다시 확인하기 위하여, SDS-PAGE 후 단백질 gel을 베타-갈락토시다제의 발색 시약인 x-gal 용액(Sigma Alrich, 미국)에 담가 반응시켰다. 세포 용해액을 0.5% sodium dodecyl sulfate를 함유하는 gel loading buffer와 4:1의 비율로 섞은 다음, 4-20% 농도구배 아크릴아마이드 gel (Bio-Rad, 미국)에서 SDS-PAGE를 수행하였다. 전기영동은 50 V에서 실시하여, 열 발생으로 인한 단백질 변성을 최소화하였다. 전기영동이 끝나고 gel을 생리식염수로 3회 세척한 다음, 1 mg/mL x-gal을 함유하는 생리식염수에서 베타-갈락토시다제의 반응을 진행하여 단백질 전기영동 gel 상에 효소반응 산물인 청색 띠를 만들었다.
도 3에 개시된 바와 같이, C-말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII) 단백질들, BgaII-873, BgaII-900, BgaII-950, BgaII-1000, BgaII-1059, BgaII-1066, BgaII-1115, BgaII-1064, BgaII-1200, BgaII-1302, BgaII-1350 및 야생형 베타-갈락토시다제는 낮은 곳부터 높은 곳으로의 계단 모양을 이루는 청색 띠로 확인할 수 있었다. BgaII-799는 세포 용해액 시료에서는 희미한 청색띠를 확인할 수 없었다.
실시예 4: 야생형 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타- 갈락토시다제 (BgaII) 단백질의 활성 측정 oNPG 방법
활성측정 실험 10분전에 1 mM o-nitrophenol galactopyranoside (oNPG)를 함유하는 100 mM Phosphate acetate 완충용액 1.5 mL이 들어있는 시험관을 50 °C 수조에 꽂아 미리 데웠다. 여기에 50 uL 시료를 첨가하여, 10 분간 반응을 진행시켰다. 다시 10% sodium carbonate를 첨가하여 반응을 종료하고, 상온에 방치하여 식혔다. 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 여러 농도의 o-nitrophenol용액을 만들어 농도표준 곡선을 그리고, 이 그래프의 기울기를 이용하여, 베타-갈락토시다제 반응 산물의 농도를 구하였다. 베타-갈락토시다제 1 U는 1분간 1 umol의 o-nitrophenol을 만드는 활성으로 정의하였다.
야생형 및 카르복시-말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제의 생산성을 확인하기 위하여, LB 배지에서 베타-갈락토시다제 생산균주의 세포양과 효소 활성을 측정하였다. Bacillus subtilis DB104 균을 항생제 chloramphenicol 5 ug/mL이 들어있는 고체 LB 배지에 도말하여 37 °C 배양기에 넣어 단일 균군락으로 자라도록 하였다. 각각에서 1개의 균군락 5 mL의 액체 배지에 접종하여 37 °C 교반배양기에서 배양하였다. 항생제 chloramphenicol 5 ug/mL이 들어있는 액체 LB 배지 50 mL에 종자배양액 0.5 mL을 접종하고, 37 °C 교반배양기에 넣어 배양하였다. 배양액을 취하여 10배 희석한 다음 광파장 600 nm에서 흡광도를 측정하여 세포양을 구하였다. 배양액을 3,500 rpm에서 10분간 원심분리하여 배양액으로부터 세포를 분리하였다. 세포 침전물을 세포 용해 완충용액 (100 mM sodium phosphate pH 7.0, Triton X-100 1%, lysozyme 1 mg/mL, DNase I 1 U/mL)에 풀어 상온에서 30 분간 방치하였다. 이를 13,000 rpm 에서 5 분간 원심분리하여, 세포 잔유물을 제거하였다. 상층액에 있는 베타-갈락토시다제의 활성을 oNPG 방법으로 측정하여 U/mL의 비활성을 구한 다음, 세포양에 해당하는 흡광도로 나누어 U/mL/OD를 계산하였다.
도 4에 개시된 바와 같이, BgaII-1066, BgaII-1200, BgaII-1302 및 야생형 베타-갈락토시다제는 효소 생산성이 약 4 U/mL/OD로 비슷하였다. BgaII-900은 야생형 베타-갈락토시다제 보다 약 10% 적은 생산성을 보였다. 야생형 베타-갈락토시다제에 비하여 BgaII-873, BgaII-950, BgaII-950, BgaII-1000, BgaII-1059, BgaII-1115, BgaII-1164 및 BgaII-1350는 약 20% 정도 더 많은 베타-갈락토시다제 활성이 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 5: 야생형 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타- 갈락토시다제 (BgaII) 단백질의 기질 특이성 측정
먼저, 베타-갈락토시다제가 젖당을 분해할 때 생성되는 포도당의 농도를 측정하여 젖당 분해활성을 결정하였다. 1 분간 1 umol의 포도당을 만드는 활성을 1 U로 정의하였다.
완충용액 100 mM Phosphate acetate로 5% 젖당용액을 만들었다. 젖당 용액 1.5 mL이 들어있는 시험관을 50 °C수조에 꽂아 미리 데웠다. 여기에 50 uL 시료를 첨가하여, 10 분간 반응을 진행시켰다. 시험관을 끓는 물에 5 분간 담가, 효소반응을 멈추었다. 용액내의 포도당 농도를 측정하기 위하여, 포도당 측정 반응용액 50 uL를 포도당 측정용액 50 uL과 섞어, 1 시간 동안 37 °C 배양기에 넣었다. 포도당 측정 반응용액은 glucose oxidase, dianisidine, hydrogen peroxidase를 100 mM potassium phosphate 완충용액 pH 6.0에 혼합하여 제조하였다. 10 N 황산 용액 100 uL을 첨가하여 반응을 멈췄다. 광파장 540 nm에서 포도당 측정 반응용액의 흡광도를 측정하였다. 여러 농도의 포도당 용액으로 만든 농도표준 곡선의 기울기로부터, 베타-갈라토시데이즈의 젖당 분해 반응에서 생성된 포도당의 농도를 계산하였다.
그 뒤, 야생형 및 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제의 기질 특이성을 확인하기 위하여, 실시예 4와 상기의 방법으로 젖당과 oNPG 두 효소기질에 대한 비활성을 측정하고, 그 값을 나누어 기질 특이성을 계산하였다.
도 5에 개시된 바와 같이, 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제, BgaII-873, BgaII-900, BgaII-950, BgaII-1000, BgaII-1059, BgaII-1066, BgaII-1115, BgaII-1164, BgaII-1200, BgaII-1302 및 BgaII-1350모두 야생형 BgaII 보다 높은 값을 보여, oNPG 보다 젖당을 효소기질로 더 잘 사용함을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 야생형 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타- 갈락토시다제 (BgaII) 단백질의 갈락토올리고당 합성능 측정
야생형 및 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제는 젖당으로부터 갈락토올리고당을 합성할 수 있다. Potassium phosphate 완충용액 100 mM에 50%의 젖당용액을 만들어 젖당 1 g 당 2 U의 베타-갈락토시다제를 첨가하여, 50 °C에서 24시간 동안 갈락토올리고당 합성 반응을 수행하였다. 반응 용액을 끓는 물에 5 분간 처리하여 효소 반응을 멈추었다. 시료에 들어있는 탄수화물을 Shepadex 칼럼(BioRad, USA)과 HPLC(Agilent, Germany)을 이용하여 정량분석 하였다. 용출 용액은 0.1% 황산용액을 사용하였으며, 굴절계수기를 이용하여 탄수화물을 감지하였다.
도 6에 개시된 바와 같이, 야생형 베타-갈락토시다제 (BgaII)와 950 번째 아미노산 잔기 뒤의 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII-950)의 HPLC 분석결과, BgaII-950은 같은 시간 동안 야생형 베타-갈락토시다제 보다 더 많은 포도당을 생산하는 것을 확인할 수 있었으며, BgaII-950이 다섯 개의 육탄당으로 이루어진 갈락토올리고당 GOS5도 야생형 베타-갈락토시다제 보다 더 많이 만드는 것을 확인하였다.
실시예 7: 야생형 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타- 갈락토시다제 (BgaII) 단백질의 열안정성 측정
베타-갈락토시다제 (BgaII)의 갈락토올리고당 합성 반응은 50 °C의 다소 높은 온도에서 진행된다. 따라서 효소의 열안정성은 효소의 산업적 이용에 중요한 특성이다. 야생형과 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII) 단백질들, BgaII, BgaII-873, BgaII-900, BgaII-950, BgaII-1000, BgaII-1059, BgaII-1066, BgaII-1115, BgaII-1164, BgaII-1200, BgaII-1302 및 BgaII-1350의 열안정성을 확인하기 위하여, 60 °C의 수조에서 1 시간 동안 열처리를 하고, oNPG를 효소 기질로 이용하여 잔류 효소 활성을 측정하였다. 잔류 효소 활성 정도는 열처리를 하지 않은 베타-갈락토시다제와 열처리 한 베타-갈락토시다제의 효소 활성 비율로 표시하였다.
도 7에 개시된 바와 같이, 야생형 베타-갈락토시다제는 1시간 동안의 열처리로 인해 약 70%의 효소 활성을 잃은데 비해, 카르복시 말단부가 절단된 변이체 베타-갈락토시다제 (BgaII) 단백질들, BgaII-873, BgaII-900, BgaII-950, BgaII-1000, BgaII-1059, BgaII-1066, BgaII-1115, BgaII-1164, BgaII-1200, BgaII-1302 및 BgaII-1350은 60% 이상의 효소 활성을 가지고 있어, 야생형 베타-갈락토시다제 보다 열안정성이 우수함을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> GENOFOCUS CO., LTD. <120> Fully active beta-galactosidase mutants and Uses thereof <130> P17-B047 <160> 27 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D92-BgaII-F <400> 1 aggaagaaaa ggatccatga gacgaattaa ttttaatg 38 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BgaII-D92-R <400> 2 gcgaccggcg ctcagctgtc attctgtaaa acgaatg 37 <210> 3 <211> 1396 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BgaII <400> 3 Met Arg Arg Ile Asn Phe Asn Asp Asn Trp Arg Phe Gln Arg Glu Ile 1 5 10 15 Ser Thr Ser Leu Arg Glu Ala Gln Lys Pro Ser Phe Asn Asp His Ser 20 25 30 Trp Arg Gln Leu Ser Leu Pro His Asp Trp Ser Ile Glu Leu Asp Phe 35 40 45 Asn Lys Asp Ser Leu Ala Thr His Glu Gly Gly Tyr Leu Asp Gly Gly 50 55 60 Val Gly Trp Tyr Arg Lys Thr Phe Thr Val Pro Ser Ala Met Glu Gly 65 70 75 80 Lys Arg Ile Ser Leu Asp Phe Asp Gly Val Tyr Met Asn Ser Thr Thr 85 90 95 Tyr Leu Asn Gly Glu Glu Leu Gly Thr Tyr Pro Phe Gly Tyr Asn Ala 100 105 110 Phe Ser 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Ile Met Lys Asp Met Gly Val Asn Ala Ile Arg Gly Thr His 325 330 335 Asn Pro Val Ser Pro Glu Phe Leu Glu Ala Val Asn Asn Leu Gly Leu 340 345 350 Leu Leu Ile Glu Glu Ala Phe Asp Cys Trp Ser Gln Ser Lys Lys Thr 355 360 365 Tyr Asp Tyr Gly Arg Phe Phe Thr Arg Trp Ala Glu His Asp Val Lys 370 375 380 Glu Met Val Asp Arg Gly Lys Asn Glu Pro Ser Ile Ile Met Trp Ser 385 390 395 400 Ile Gly Asn Glu Ile Tyr Asp Thr Thr Ser Pro Ser Gly Val Glu Thr 405 410 415 Ala Arg Asn Leu Val Arg Trp Ile Lys Glu Ile Asp Thr Thr Arg Pro 420 425 430 Thr Thr Ile Gly Glu Asp Lys Thr Arg Gly Asp Lys Val Asn Val Thr 435 440 445 Pro Ile Asp Pro Asn Ile Leu Glu Ile Phe His Thr Val Asp Val Val 450 455 460 Gly Leu Asn Tyr Ser Glu Asn Asn Tyr Val Gly Tyr His Glu Gln His 465 470 475 480 Pro Asn Trp Lys Leu Tyr Gly Ser Glu Thr Ser Ser Ala Thr Arg Ser 485 490 495 Arg Gly Val Tyr Thr His Pro Tyr Glu Tyr Asn Leu Gly Thr Lys Tyr 500 505 510 Asp Asp Leu Gln Gln Ser Ser Tyr Asp Asn Asp Tyr Val Pro Trp Gly 515 520 525 Arg Thr Ala Glu Asp Ala Trp Lys Ser Asp Arg Asp Leu Lys His Phe 530 535 540 Ala Gly Gln Phe Ile Trp Thr Gly Phe Asp Tyr Ile Gly Glu Pro Thr 545 550 555 560 Pro Tyr Tyr Asp Ser Tyr Pro Ala Lys Ser Ser Tyr Phe Gly Ala Val 565 570 575 Asp Thr Ala Gly Phe Pro Lys Asp Ile Phe Tyr Tyr Tyr Gln Ser Gln 580 585 590 Trp Lys Lys Glu Pro Met Val His Leu Leu Pro His Trp Asn Trp Thr 595 600 605 Glu Gly Glu Pro Val Arg Val Leu Ala Tyr Thr Asn Ala His Gln Val 610 615 620 Glu Leu Phe Leu Asn Gly Lys Ser Leu Gly Val Arg Gly Tyr Glu Asn 625 630 635 640 Lys Lys Thr Ser Trp Gly Ala Pro Tyr Lys Glu Thr Lys Asp Gly Lys 645 650 655 Thr Tyr Leu Glu Trp Ala Val Pro Phe Lys Ala Gly Thr Leu Glu Ala 660 665 670 Val Ala Met Asp Glu Asn Gly Lys Glu Ile Ala Arg Asp Gln Val Thr 675 680 685 Thr Ala Gly Ala Pro Ala Ala Val Lys Leu Thr Ala Asp Arg Lys Val 690 695 700 Ile Lys Ala Asp Gly Thr Asp Leu Ser Phe Ile Thr Ala Glu Ile Val 705 710 715 720 Asp Ser Lys Gly Asn Val Val Pro Asn Ala Asp His Leu Ile Gln Phe 725 730 735 His Leu Ser Gly His Gly Glu Leu Ala Gly Val Asp Asn Gly Asp Ala 740 745 750 Ala Ser Val Glu Arg Tyr Lys Asp Asn Lys Arg Lys Ala Phe Ser Gly 755 760 765 Lys Ala Leu Ala Ile Val Gln Ser Asn Lys Leu Asp Gly Asn Ile Thr 770 775 780 Leu His Ala Ser Ala Glu Gly Leu Ser Ser Gly Asn Val Thr Ile Phe 785 790 795 800 Thr Thr Ala Ser Ala Asp Gln Asn Ser Ile Thr Ile Ala Gly Ile Asp 805 810 815 Glu Val Asn Val Leu Val Asp Phe Asn Val Val Pro Glu Leu Pro Ser 820 825 830 Gln Ile Lys Val Tyr Tyr Ser Asp Ser Thr Val Glu Met Lys Pro Val 835 840 845 Thr Trp Asp Ala Val Asp Pro Asn Leu Leu Asn Thr Ala Gly Lys Ile 850 855 860 Ile Val Glu Gly Thr Val Glu Gly Thr Asp Lys Lys Ala Lys Ala Leu 865 870 875 880 Leu Ile Val Lys Gly Asn Gly Gln Glu Asn Ser Glu Tyr Arg Ile Asp 885 890 895 Leu Phe Ser Pro Asp Pro Lys Leu Ile Ser Thr Glu Leu Thr Val Glu 900 905 910 Lys Thr Asn Ile Met Glu Asp Asp Phe Ile Asp Ile Lys Val Ile Gly 915 920 925 Gln Leu Glu Asn Lys Glu Val Val Asp Leu Ser Asn Phe Met Pro Ile 930 935 940 Tyr Glu Phe Asp Cys Asp Ile Ile Lys Ile Glu Gly Asn Lys Leu Tyr 945 950 955 960 Ala Leu Glu Glu Gly Leu Val Lys Val Thr Ala Ala Val Thr Tyr Lys 965 970 975 Gly Arg Thr Val Thr Ser Pro Glu Met Met Leu Lys Ile Thr Lys Asn 980 985 990 Pro Val Pro Lys Thr Ile Thr His Ile Asp Ser Ile Thr Val Val Ala 995 1000 1005 Gly Lys Gly Glu Ala Pro Val Leu Pro Ala Thr Ala Val Ala His Phe 1010 1015 1020 Asp Arg Gly Met Pro Arg Asp Val Lys Val Lys Trp Glu Ile Val Asn 1025 1030 1035 1040 Pro Ala Leu Tyr Gln Asn Leu Gly Glu Phe Thr Val Ser Gly Asp Val 1045 1050 1055 Glu Gly Thr Glu Ile Lys Ala Gln Ala Lys Val Met Val Arg Ser Ala 1060 1065 1070 Leu Ala Ile Glu Thr Ile Ser Met Ala Val Leu Pro Asn Gln Lys Pro 1075 1080 1085 Glu Leu Pro Gln Lys Val Thr Val Tyr Tyr Ser Asp Gly Thr Glu Glu 1090 1095 1100 Gln Ala Asp Val Asp Trp Asp Ala Met Pro Ser Ala Glu Leu Lys Ser 1105 1110 1115 1120 Glu Gly Val Val Lys Val Lys Gly Ser Val Lys Gly Val Asp Leu Lys 1125 1130 1135 Ala Thr Ala Gln Ile Arg Val Thr Ser Glu Val Gly Gly Val Gln Asn 1140 1145 1150 Ile Ser Arg Ala Lys Asn Gly Tyr Glu Tyr Pro Lys Ala Glu Ala Ser 1155 1160 1165 Phe Thr Asn Thr Gly Pro Gly Ser Asn Asp Arg Ile Glu Ala Ile Asn 1170 1175 1180 Asp Asp Val Ile Ser Tyr Asp Ala Glu Pro His Asn Arg Trp Thr Asn 1185 1190 1195 1200 Trp Gln Pro Thr Pro Arg Pro Gly Asp Trp Val Ser Ile Thr Phe Gly 1205 1210 1215 Asp Ser Lys Pro Arg Lys Tyr Asp Ile Asp Ser Met Glu Ile His Trp 1220 1225 1230 Tyr Glu Asp Leu Gly Thr Ser Ser Pro Ala Tyr Phe Arg Ile Gln Tyr 1235 1240 1245 Lys Ser Gly Asp Glu Trp Lys Asp Val Ser Gly Leu Lys Thr Asn Pro 1250 1255 1260 Ser Asn Thr Val Leu Arg Gln Ala Asn Val Tyr Thr Phe Asp Lys Val 1265 1270 1275 1280 Arg Thr Ser Ala Ile Arg Val Asp Met Thr Ala Lys Thr Gly Lys Ser 1285 1290 1295 Leu Ala Ile Thr Glu Ile Lys Val Phe Ser Lys Trp Ala Lys Ala His 1300 1305 1310 Thr His Pro Met Val Thr Asp Ile Lys Leu Gly Asp Leu Ser Ile Leu 1315 1320 1325 Asp Asp Phe Ser Lys Lys Gly Asp Asn Asn Glu Leu Thr Phe Gln Val 1330 1335 1340 Lys Asp Pro Arg Asp Ile Pro 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Ser Glu Thr Ser Ser Ala Thr Arg Ser 485 490 495 Arg Gly Val Tyr Thr His Pro Tyr Glu Tyr Asn Leu Gly Thr Lys Tyr 500 505 510 Asp Asp Leu Gln Gln Ser Ser Tyr Asp Asn Asp Tyr Val Pro Trp Gly 515 520 525 Arg Thr Ala Glu Asp Ala Trp Lys Ser Asp Arg Asp Leu Lys His Phe 530 535 540 Ala Gly Gln Phe Ile Trp Thr Gly Phe Asp Tyr Ile Gly Glu Pro Thr 545 550 555 560 Pro Tyr Tyr Asp Ser Tyr Pro Ala Lys Ser Ser Tyr Phe Gly Ala Val 565 570 575 Asp Thr Ala Gly Phe Pro Lys Asp Ile Phe Tyr Tyr Tyr Gln Ser Gln 580 585 590 Trp Lys Lys Glu Pro Met Val His Leu Leu Pro His Trp Asn Trp Thr 595 600 605 Glu Gly Glu Pro Val Arg Val Leu Ala Tyr Thr Asn Ala His Gln Val 610 615 620 Glu Leu Phe Leu Asn Gly Lys Ser Leu Gly Val Arg Gly Tyr Glu Asn 625 630 635 640 Lys Lys Thr Ser Trp Gly Ala Pro Tyr Lys Glu Thr Lys Asp Gly Lys 645 650 655 Thr Tyr Leu Glu Trp Ala Val Pro Phe Lys Ala Gly Thr Leu Glu Ala 660 665 670 Val Ala Met Asp Glu Asn Gly Lys Glu Ile Ala Arg Asp Gln Val Thr 675 680 685 Thr Ala Gly Ala Pro Ala Ala Val Lys Leu Thr Ala Asp Arg Lys Val 690 695 700 Ile Lys Ala Asp Gly Thr Asp Leu Ser Phe Ile Thr Ala Glu Ile Val 705 710 715 720 Asp Ser Lys Gly Asn Val Val Pro Asn Ala Asp His Leu Ile Gln Phe 725 730 735 His Leu Ser Gly His Gly Glu Leu Ala Gly Val Asp Asn Gly Asp Ala 740 745 750 Ala Ser Val Glu Arg Tyr Lys Asp Asn Lys Arg Lys Ala Phe Ser Gly 755 760 765 Lys Ala Leu Ala Ile Val Gln Ser Asn Lys Leu Asp Gly Asn Ile Thr 770 775 780 Leu His Ala Ser Ala Glu Gly Leu Ser Ser Gly Asn Val Thr Ile Phe 785 790 795 800 Thr Thr Ala Ser Ala Asp Gln Asn Ser Ile Thr Ile Ala Gly Ile Asp 805 810 815 Glu Val Asn Val Leu Val Asp Phe Asn Val Val Pro Glu Leu Pro Ser 820 825 830 Gln Ile Lys Val Tyr Tyr Ser Asp Ser Thr Val Glu Met Lys Pro Val 835 840 845 Thr Trp Asp Ala Val Asp Pro Asn Leu Leu Asn Thr Ala Gly Lys Ile 850 855 860 Ile Val Glu Gly Thr Val Glu Gly Thr Asp Lys Lys Ala Lys Ala Leu 865 870 875 880 Leu Ile Val Lys Gly Asn Gly Gln Glu Asn Ser Glu Tyr Arg Ile Asp 885 890 895 Leu Phe Ser Pro Asp Pro Lys Leu Ile Ser Thr Glu Leu Thr Val Glu 900 905 910 Lys Thr Asn Ile Met Glu Asp Asp Phe Ile Asp Ile Lys Val Ile Gly 915 920 925 Gln Leu Glu Asn Lys Glu Val Val Asp Leu Ser Asn Phe Met Pro Ile 930 935 940 Tyr Glu Phe Asp Cys Asp Ile Ile Lys Ile Glu Gly Asn Lys Leu Tyr 945 950 955 960 Ala Leu Glu Glu Gly Leu Val Lys Val Thr Ala Ala Val Thr Tyr Lys 965 970 975 Gly Arg Thr Val Thr Ser Pro Glu Met Met Leu Lys Ile Thr Lys Asn 980 985 990 Pro Val Pro Lys Thr Ile Thr His Ile Asp Ser Ile Thr Val Val Ala 995 1000 1005 Gly Lys Gly Glu Ala Pro Val Leu Pro Ala Thr Ala Val Ala His Phe 1010 1015 1020 Asp Arg Gly Met Pro Arg Asp Val Lys Val Lys Trp Glu Ile Val Asn 1025 1030 1035 1040 Pro Ala Leu Tyr Gln Asn Leu Gly Glu Phe Thr Val Ser Gly Asp Val 1045 1050 1055 Glu Gly Thr Glu Ile Lys Ala Gln Ala Lys Val Met Val Arg Ser Ala 1060 1065 1070 Leu Ala Ile Glu Thr Ile Ser Met Ala Val Leu Pro Asn Gln Lys Pro 1075 1080 1085 Glu Leu Pro Gln Lys Val Thr Val Tyr Tyr Ser Asp Gly Thr Glu Glu 1090 1095 1100 Gln Ala Asp Val Asp Trp Asp Ala Met Pro Ser Ala Glu Leu Lys Ser 1105 1110 1115 1120 Glu Gly Val Val Lys Val Lys Gly Ser Val Lys Gly Val Asp Leu Lys 1125 1130 1135 Ala Thr Ala Gln Ile Arg Val Thr Ser Glu Val Gly Gly Val Gln Asn 1140 1145 1150 Ile Ser Arg Ala Lys Asn Gly Tyr Glu Tyr Pro Lys Ala Glu Ala Ser 1155 1160 1165 Phe Thr Asn Thr Gly Pro Gly Ser Asn Asp Arg Ile Glu Ala Ile Asn 1170 1175 1180 Asp Asp Val Ile Ser Tyr Asp Ala Glu Pro His Asn Arg Trp Thr Asn 1185 1190 1195 1200 Trp Gln Pro Thr Pro Arg Pro Gly Asp Trp Val Ser Ile Thr Phe Gly 1205 1210 1215 Asp Ser Lys Pro Arg Lys Tyr Asp Ile Asp Ser Met Glu Ile His Trp 1220 1225 1230 Tyr Glu Asp Leu Gly Thr Ser Ser Pro Ala Tyr Phe Arg Ile Gln Tyr 1235 1240 1245 Lys Ser Gly Asp Glu Trp Lys Asp Val Ser Gly Leu Lys Thr Asn Pro 1250 1255 1260 Ser Asn Thr Val Leu Arg Gln Ala Asn Val Tyr Thr Phe Asp Lys Val 1265 1270 1275 1280 Arg Thr Ser Ala Ile Arg Val Asp Met Thr Ala Lys Thr Gly Lys Ser 1285 1290 1295 Leu Ala Ile Thr Glu Ile Lys Val Phe Ser Lys Trp Ala Lys Ala His 1300 1305 1310 Thr His Pro Met Val Thr Asp Ile Lys Leu Gly Asp Leu Ser Ile Leu 1315 1320 1325 Asp Asp Phe Ser Lys Lys Gly Asp Asn Asn Glu Leu Thr Phe Gln Val 1330 1335 1340 Lys Asp Pro Arg Asp Ile 1345 1350 <210> 27 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BgaII-1350-D92-R <400> 27 gcgaccggcg ctcagctgtt atatgtctct tgggtctttg a 41

Claims (9)

  1. 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 베타-갈락토시다제에서,
    a) 873번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 아미노산 서열번호 6으로 표시되는 베타-갈락토시다제 변이체;
    b) 950번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 아미노산 서열번호 10으로 표시되는 베타-갈락토시다제 변이체;
    c) 1000번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 아미노산 서열번호 12로 표시되는 베타-갈락토시다제 변이체;
    d) 1059번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 아미노산 서열번호 14로 표시되는 베타-갈락토시다제 변이체;
    e) 1115번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 아미노산 서열번호 18로 표시되는 베타-갈락토시다제 변이체;
    f) 1164번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 아미노산 서열번호 20으로 표시되는 베타-갈락토시다제 변이체; 및
    g) 1350번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 아미노산 서열번호 26으로 표시되는 베타-갈락토시다제 변이체로 구성된 군 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 베타-갈락토시다제 변이체.
  2. 삭제
  3. 제1항의 베타-갈락토시다제 변이체를 코딩하는 유전자.
  4. 제3항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제3항의 유전자 또는 제4항의 재조합 벡터가 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 숙주세포는 고초균인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  7. 제5항의 재조합 미생물을 배양하여 베타-갈락토시다제를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-갈락토시다제 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 베타-갈락토시다제의 제조방법.
  8. 제1항의 베타-갈락토시다제 변이체를 락토스 함유 기질과 반응시켜 갈락토올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 갈락토올리고당을 회수하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 갈락토올리고당은 액상유, 건조분말우유, 유아 우유,유아 조제식 (baby formula), 아이스크림, 요거트, 치즈, 유제품, 음료, 유아 식품, 시리얼, 빵, 비스켓, 제과류, 케이크, 식품보조제, 식이보충제, 프로바이오틱 식료품, 프리바이오틱 식료품, 동물 사료, 가축 사료 및 약제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 구성성분인 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조방법.
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