JP6364506B2

JP6364506B2 - 新規β−ガラクトシダーゼ

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Publication number: JP6364506B2
Application number: JP2016569966A
Authority: JP
Inventors: ジェヨルチョイ; ジェグパン; スンファンパク; ウィジュンキム
Original assignee: Genofocus Co Ltd
Current assignee: Genofocus Co Ltd
Priority date: 2014-05-23
Filing date: 2015-05-19
Publication date: 2018-07-25
Anticipated expiration: 2035-05-19
Also published as: EP3147357A4; EP3147357A1; CN106459946B; EP3147357B1; JP2017516479A; US10036000B2; CN106459946A; KR20150135701A; WO2015178639A1; US20170198271A1; KR101619863B1

Description

本発明は、新規β−ガラクトシダーゼに関し、より詳細にはバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来の新規β−ガラクトシダーゼ、これをコードする遺伝子、前記遺伝子を含有する組換えベクターおよび組換え微生物、前記組換え微生物を利用したβ−ガラクトシダーゼの製造方法および前記β−ガラクトシダーゼを利用したガラクトオリゴ糖の製造方法に関する。

β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）は、乳糖のようなβ−Ｄ−カラクトシピラノシド（β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）で非還元末端β−Ｄ−ガラクトース（β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）を加水分解したり、ガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）の転移反応を触媒する。一般にこの酵素は、加水分解活性と糖転移活性の二種類の特性を有しているが、いずれも産業的に応用性がある。加水分解活性は、牛乳と乳製品の乳糖を加水分解して乳糖不耐症を防ぎ甘味度を高めて、糖転移活性は、ヒトの腸内有用微生物である乳酸菌の成長を増進させるガラクトオリゴ糖（Ｇａｌａｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の製造に利用される。

β−ガラクトシダーゼは、種々の微生物、植物、そして動物で発見されるが、現在産業的に利用される多くのβ−ガラクトシダーゼは、微生物から分離されたものである。糖転移反応の特異性が異なるβ−ガラクトシダーゼが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓｐ）等から分離されており、その他の高温性微生物から分離された耐熱性酵素に関する研究も多様に進行された。

現在世界的にガラクトオリゴ糖生産に使用されるβ−ガラクトシダーゼは、バチルスまたはアスペルギルス由来のものが大多数であり、特にバチルス由来、具体的に、バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼは、５０〜６０℃の活性温度と高い糖転移活性のために商業的に最も多く使用されるものの一つであり、特に、バチルス・サーキュランスＡＴＣＣ３１３８２由来のβ−ガラクトシダーゼは、ＢＩＯＬＡＣＴＡ（Ａｍａｎｏ社）との製品名で販売されている。前記酵素は、適切な培養培地にバチルス・サーキュランスを培養させた後、細胞破砕または培養培地から回収する方法で生産されると知られている。

また、バチルス・サーキュランスＡＴＣＣ３１３８２由来のβ−ガラクトシダーゼの特性は、多くの文献に報告されている。前記微生物には三つの構造的亜型（Ｉｓｏｆｏｒｍ）のβ−ガラクトシダーゼが存在すると報告され、タンパク質の大きさに応じて２１２ｋＤａのβ−ガラクトシダーゼＩ、１４５ｋＤａのβ−ガラクトシダーゼＩＩ、そして８６ｋＤａのβ−ガラクトシダーゼIIIと命名される。前記三つの亜型の遺伝子塩基配列は、β−ガラクトシダーゼＩは、Ａｍａｎｏ社（ＷＯ２０１０／１４０４３５）で、β−ガラクトシダーゼＩＩは、ＧｅｎｏＦｏｃｕｓ社（韓国登録特許第１，１２１，１６１号）で、β−ガラクトシダーゼＩＩＩは、Ｉｔｏグループ（ＩｔｏＹ．ｅｔａｌ．，ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｃｈｅｍ．，６１：１２７０−６，１９９７）で確認した。この三つの亜型中β−ガラクトシダーゼＩとＩＩが、ガラクトオリゴ糖合成に利用できると確認された。今まで様々なグループの研究でバチルス・サーキュランスには三つのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子だけが存在すると報告された。

本発明者等は、バチルス・サーキュランスにβ−ガラクトシダーゼ亜型が存在するなら、今まで確認された３種のβ−ガラクトシダーゼとはさらに異なる追加β−ガラクトシダーゼの特性を有するβ−グリコシダーゼ（ｂｅｔａ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ）系列の遺伝子が存在できると予想し、これを基に、新規β−グリコシダーゼを確認するために努力した結果、バチルス・サーキュランスで既存の報告された三つのβ−ガラクトシダーゼの他にさらに異なる新規なβ−ガラクトシダーゼの存在とこれの遺伝子塩基配列を確認して、本発明を完成した。

本発明の目的は、バチルス・サーキュランス由来の新規β−ガラクトシダーゼを提供するところにある。
本発明の他の目的は、前記新規β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、前記遺伝子を含有する組換えベクターおよび前記遺伝子または前記組換えベクターが導入されている組換え微生物を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、前記組換え微生物を利用したβ−ガラクトシダーゼの製造方法を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、前記新規β−ガラクトシダーゼを利用したガラクトオリゴ糖の製造方法を提供するところにある。

前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するβ−ガラクトシダーゼを提供する。

本発明は、また、前記β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子（ｏｎｅａｓｐｅｃｔ）および前記遺伝子を含有する組換えベクターを提供する。

本発明は、また、前記遺伝子または前記組換えベクターが、バクテリア、カビおよび酵母で構成された群から選択される宿主細胞に挿入されている組換え微生物を提供する。

本発明は、また、前記組換え微生物を培養してβ−ガラクトシダーゼを生成させる工程；および前記生成されたβ−ガラクトシダーゼを回収する工程を含むβ−ガラクトシダーゼの製造方法を提供する。

本発明は、また、前記β−ガラクトシダーゼをラクトース含有基質と反応させてガラクトオリゴ糖を製造する工程；および前記製造されたガラクトオリゴ糖を回収する工程を含むガラクトオリゴ糖の製造方法を提供する。

バチルス・サーキュランスのゲノムＤＮＡをＨｐａＩ制限酵素で処理した断片で確認されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のＯＲＦの大きさおよび位置を示した模式図である。組換えβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が形質転換された大腸菌ＤＨ５α／ｐＡＣＥ−ＢｇａＩ．Ｎｅｗで生産された組換えβ−ガラクトシダーゼのタンパク質発現様子をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果（Ｍ：タンパク質サイズマーカー、１：ＤＨ５α／Ｎｏｎｅ、２：ＤＨ５α／ｐＡＣＥ−ＢｇａＩ．Ｎｅｗ、矢印:β−ガラクトシダーゼ）である。形質転換された大腸菌ＤＨ５α／ｐＡＣＥ−ＢｇａＩ．Ｎｅｗで生産された組換えβ−ガラクトシダーゼの最適温度を示す。

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。

一観点において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するβ−ガラクトシダーゼおよび前記β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子に関する。

本発明では、バチルス・サーキュランスで今まで確認された３種のβ−ガラクトシダーゼ以外のさらに異なる追加β−ガラクトシダーゼの特性を有するβ−グリコシダーゼ（ｂｅｔａ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ）系列の遺伝子が存在できると予想して、バチルス・サーキュランスのゲノムから新規β−ガラクトシダーゼ遺伝子を分離した。

本発明の一様態では、バチルス・サーキュランスＡＴＣＣ３１３８２のゲノムＤＮＡを２３種の制限酵素で切断して、β−ガラクトシダーゼクローニング用ゲノムライブラリーを作製して、前記ライブラリーでβ−ガラクトシダーゼ活性を有する菌株を選別した。

前記選別されたβ−ガラクトシダーゼ活性を有する菌株が含有するバチルス・サーキュランスゲノム断片を配列分析を行った結果、既に知られているバチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の他に新規な配列を有するβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する断片を確認した。

前記新規β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する断片の塩基配列は、配列番号３に示し、β−ガラクトシダーゼ遺伝子が含まれたＤＮＡ断片の全体大きさは６７３１ｂｐで、前記断片では三つのＯＲＦ（ＯｐｅｎＲｅａｄｉｎｇＦｒａｍｅｓ）が発見された（図１）。そのうち三つ目のＯＲＦが３１０５ｂｐのＤＮＡ大きさ（配列番号２）と１０３５個のアミノ酸（配列番号１）からなり、β−ガラクトシダーゼ活性を有することが確認された。

他の観点で、本発明は、前記β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターおよび前記β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子または前記組換えベクターがバクテリア、カビおよび酵母で構成された群から選択される宿主細胞に挿入されている組換え微生物に関する。

本願において、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、適切な宿主内でＤＮＡを発現させることができる適切な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子または単に潜在的ゲノム挿入物であってもよい。適当な宿主で形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムと関係がなく複製して機能できるか、または、一部の場合にはゲノムそれ自体に統合され得る。プラスミドが現在のベクターの最も通常的に用いられる形態であるため、本発明の明細書で「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」及び「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、時には互いに交換的に用いられる。しかし、本発明は、当業界に知られているまたは知られるようになるものと同等な機能を有するベクターの異なる形態を含む。哺乳動物細胞培養物発現のための典型的な発現ベクターは、例えばｐＲＫ５（ＥＰ３０７，２４７号）、ｐＳＶ１６Ｂ（ＷＯ９１／０８２９１号）およびｐＶＬ１３９２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に基づいている。

「現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という表現は、特定の宿主生物で作動可能に連結されたコード配列の現に必須的なＤＮＡ配列を意味する。そのような調節配列は、転写を施するためのプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解の終結を調節する配列を含む。例えば、原核生物に適した調節配列は、プロモーター、任意にオペレーター配列及びオペレーター結合部位を含む。核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーがこれに含まれる。プラスミドで遺子の現量に最も影響をえる因子はプロモーターである。高現用のプロモーターとしてＳＲαプロモーターとサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）由プロモーター等が好ましく使用される。

本発明のＤＮＡ配列を発現させるために、非常に様々な発現調節配列中いずれもベクターに使用できる。有用な発現調節配列としては、例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期および後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣまたはＴＲＣシステム、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ファージラムダの主なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコードタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは、他のグリコール分解酵素に対するプロモーター、前記ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏ５、酵母α−交配システムのプロモーターおよび原核細胞または真核細胞またはこれらのウイルスの遺伝子の発現を調節すると知られている構成と誘導のその他の配列およびこれらの種々の組合せが含まれる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターΦ１０はＥ．ｃｏｌｉでタンパク質ＮＳＰを発現させるのに有用に使用できる。

核酸配列は、他の核酸配列と機能的関係で配置される時、「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙｌｉｎｋｅｄ）」される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）は、調節配列（等）に結合する時遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子および調節配列（等）であってもよい。例えば、プレ配列（ｐｒｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結されて；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されたり；またはリボソーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されたり；またはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されたＤＮＡ配列が接触して、また、分泌リーダーの場合、接触してリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）は、接触する必要がない。これらの配列の連結は、便利な制限酵素部位でライゲーション（連結）により行われる。そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｄａｐｔｏｒ）またはリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使用する。

本願明細書に使用される用語「発現ベクター」とは、通常異種のＤＮＡの断片が挿入された組換えキャリア（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｃａｒｒｉｅｒ）であり一般に二本鎖のＤＮＡの断片を意味する。ここで、異種ＤＮＡは、宿主細胞で天然では発見されないＤＮＡである異形ＤＮＡを意味する。発現ベクターは、一度宿主細胞内に存在すると、宿主染色体ＤＮＡと関係なく複製することができ、ベクターの数個のコピーおよびそれの挿入された（異種）ＤＮＡが生成され得る。

当業界に周知された通り、宿主細胞で形質感染遺伝子の発現水準を高めるためには、該当遺伝子が、選択された発現宿主内で機能を発揮する転写および解読発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。好ましくは発現調節配列および該当遺伝子は、細菌選択マーカーおよび複製開始点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｒｉｇｉｎ）を一緒に含んでいる一つの発現ベクター内に含まれるようになる。発現宿主細胞が真核細胞である場合には、発現ベクターは、真核発現宿主内で有用な発現マーカーをさらに含まなければならない。

上述した発現ベクターによって形質転換または形質感染された宿主細胞は、本発明のさらに他の側面を構成する。本願明細書に使用される用語「形質転換」とは、ＤＮＡを宿主に導入してＤＮＡが染色体外因子としてまたは染色体統合完成によって複製可能になることを意味する。本願明細書に使用される用語「形質感染」とは、任意のコード配列が実際に発現してもしなくても発現ベクターが宿主細胞によって受容されることを意味する。

すべてのベクターと発現調節配列が、本発明のＤＮＡ配列を発現するが、すべてが同等に機能を発揮するとは限らないことを理解しなければならない。同様にすべての宿主が同じ発現システムに対して同じ機能を発揮することはない。しかし、当業者なら、過度な実験的負担なしに本発明の範囲を逸脱しないまま種々のベクター、発現調節配列および宿主の中から適切な選択を行うことができる。例えば、ベクターを選択するには宿主を考慮しなければならないが、これはベクターがその中で複製されなければならないためである。ベクターの複製数、複製数を調節できる能力および当該ベクターによってコードされる他のタンパク質、例えば抗生剤マーカーの発現もさらに考慮されなければならない。発現調節配列を選定するに当たっても、種々の因子を考慮しなければならない。例えば、配列の相対的強度、調節可能性および本発明のＤＮＡ配列との相溶性等、特に可能性がある二次構造と関連して考慮しなければならない。単細胞宿主は、選定されたベクター、本発明のＤＮＡ配列によってコードされる産物の毒性、分泌特性、タンパク質を正確にフォールディングさせることができる能力、培養および発酵要件、本発明ＤＮＡ配列によってコードされる産物を宿主から精製することの容易性などの因子を考慮して選定されなければならない。これらの変数の範囲内で、当業者は、本発明のＤＮＡ配列を発酵または大規模動物培養で発現させることができる種々のベクター／発現調節配列／宿主の組合せを選定することができる。発現クローニングによってＮＳＰタンパク質のｃＤＮＡをクローニングしようとする時のスクリーニング法として、バインディング法（ｂｉｎｄｉｎｇ法）、パニング法（ｐａｎｎｉｎｇ法）、フィルムエマルジョン法（ｆｉｌｍｅｍｕｌｓｉｏｎ法）などが適用され得る。

本発明の定義上「実質的に純粋な」とは、本発明に係るポリペプチドおよびポリペプチドをコードするＤＡＮ配列がバクテリアから由来した他のタンパク質を実質的に含まないことを意味する。

組換えタンパク質を発現するための宿主細胞は、短い時間内高濃度菌体培養が可能で遺伝子操作が容易で遺伝学的、生理的特徴が明らかになっている大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）等のような原核細胞が広く利用されてきた。しかし、タンパク質の翻訳後修飾（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、分泌過程および活性型の３次元構造、タンパク質の活性状態の問題点を解決するために、最近単細胞真核細胞である酵母系列（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ等）、糸状の真菌類（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉ）、昆虫細胞（ｉｎｓｅｃｔｃｅｌｌｓ）、植物細胞、ほ乳動物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ）等高等生物に至るまで組換えタンパク質生産の宿主細胞として活用しているので、実施例で例示された大腸菌だけでなく他の宿主細胞を利用することは当業界の通常の知識を有する者にとって容易に適用可能である。

さらに他の観点で、本発明は、前記組換え微生物を培養してβ−ガラクトシダーゼを生成させる工程；および前記生成されたβ−ガラクトシダーゼを回収する工程を含むβ−ガラクトシダーゼの製造方法に関する。

本発明の一様態では、形質転換された組換え大腸菌（ＤＨ５α／ｐＡＣＥ−ＢｇａＩ．Ｎｅｗ）を利用して組換えβ−ガラクトシダーゼを製造して、前記ｐＡＣＥ（ＧｅｎｏＦｏｃｕｓ社、韓国）ベクターは、タンパク質発現のために別途の誘導剤（Ｉｎｄｕｃｅｒ）添加の必要がなく、微生物培養だけで細胞成長とタンパク質発現が分離された状態で組換えタンパク質が可能である。前記方法で生産されたβ−ガラクトシダーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認結果、１２０ｋＤａの大きさを有するバンドが確認された（図２）。

本発明の他の様態では、前記収得した組換えβ−ガラクトシダーゼと４−ニトロフェニル−β−Ｄ−カラクトピラノシド（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（ＳＩＧＭＡ社）を基質として、酵素反応の最適温度を確認した結果、本発明の新規β−ガラクトシダーゼの最適活性温度は４０℃と確認された。

さらに他の観点で、本発明は、前記β−ガラクトシダーゼをラクトース含有基質と反応させてガラクトオリゴ糖を製造する工程；および前記製造されたガラクトオリゴ糖を回収する工程を含むガラクトオリゴ糖の製造方法に関する。

本発明において、前記ガラクトオリゴ糖は、液状乳、乾燥粉末牛乳、乳児用牛乳、乳児用調製食（ｂａｂｙｆｏｒｍｕｌａ）、アイスクリーム、ヨーグルト、チーズ、乳製品、飲料、乳児食品、シリアル、パン、ビスケット、菓子類、ケーキ、食品補助剤、食餌補充剤、プロバイオティクス食品、プリバイオティクス食品、動物飼料、家畜飼料および薬剤からなる群から選択される一つの構成成分であることを特徴とする。

本発明のさらに他の様態では、ラクトースを基質として使用して、本発明の新規β−ガラクトシダーゼのガラクトオリゴ糖を合成能を確認して、本発明に係るβ−ガラクトシダーゼのガラクトオリゴ糖の転化率は３２％程度と確認された。

以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。

実施例１：バチルス・サーキュランス由来新規β−ガラクトシダーゼのクローニング
バチルス・サーキュランスＡＴＣＣ３１３８２は、基本培地であるＬＢ（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ）培地で培養して、培養された細胞からゲノムＤＮＡ５００μｇを分離（ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ；ＲＢＣ社）した。前記分離したゲノムＤＮＡを２３種の制限酵素ＡａｔＩＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇａｌＩＩ、ＢｓｉＷＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＭｌｕＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｓｉＩ、ＰｃｉＩ、ＰｓｉＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｃａＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｔｕＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩおよびＸｍａＩで各々単一処理して、各制限酵素で切られたゲノムＤＮＡ断片中１〜８ｋｂのＤＮＡ断片の混合物をクレノウ酵素（ｋｌｅｎｏｗｆｒａｇｍｅｎｔｅｎｚｙｍｅ；ＴａＫａＲａ社）で処理して制限酵素で切られたＤＮＡ断片の両末端をブラント化（ｂｌｕｎｔｅｎｄ）させて、Ｔ−ｂｌｕｎｔ（ＳｏｌＧｅｎｔ社）ベクターにライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）して、Ｔ−ｇＤＮＡ．ｆｌａｇと命名した各ベクターを含有するライブラリーを作製した。

前記ライブラリーを大腸菌ＤＨ５αに形質転換させて、Ｘ−ｇａｌが含まれたＬＢａｇａｒ（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天、５０ｕｇ／ｍｌＸ−ｇａｌ）に培養した。２４時間後ＬＢａｇａｒで成長した形質転換大腸菌コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）中Ｘ−ｇａｌを分解して緑色のコロニーを示すものをβ−ガラクトシダーゼ機能の遺伝子を含有する菌株と判断して、回収した。回収されたコロニーを各々ＬＢ液体培地に培養して、これらからプラスミドベクターを回収（Ｐｌａｓｍｉｄｍｉｎｉｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ；Ｂｉｏｎｅｅｒ社）して、塩基配列分析（ＳｏｌＧｅｎｔ社）を行った。

その結果、既に報告されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配列が多数確認されて、ＨｐａＩ制限酵素を単一処理して生成したベクターライブラリーで新規β−ガラクトシダーゼ遺伝子が確認された。

前記新規β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する断片を配列番号３に示し、β−ガラクトシダーゼ遺伝子が含まれたＤＮＡ断片の全体の大きさは、６７３１ｂｐで、前記断片では三つのＯＲＦ（ＯｐｅｎＲｅａｄｉｎｇＦｒａｍｅｓ）が発見された（図１）。

その中の３番目のＯＲＦが、３１０５ｂｐのＤＮＡ大きさ（配列番号２）と１０３５個のアミノ酸（配列番号１）からなり、β−ガラクトシダーゼ活性を有することが確認された。

実施例２：β−ガラクトシダーゼＩＩ遺伝子を含有する組換えベクターおよび組換え微生物の製造
実施例１で確保されたバチルス・サーキュランスの新規β−ガラクトシダーゼ遺伝子塩基配列を利用して組換えベクターおよび組換え微生物を製造した。

配列番号２のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基配列を基に下記のような配列番号４と配列番号５のプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を作製した。
配列番号４：ａａａａａｔｇｔｃａｃａａｔｔａａｃｇｔａｔｇａ
配列番号５：ａａａａｃｔｇｃａｇｔｔａｇｔｇｔａａｇｇｔａａａｔｇａａｔ

バチルス・サーキュランスＡＴＣＣ３１３８２のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号４と配列番号５のプリイマーを利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を精製後、各プライマーに挿入した制限酵素配列ＮｄｅＩとＰｓｔＩを利用して、ｐＡＣＥ（ＧｅｎｏＦｏｃｕｓ社、韓国）ベクターに同一制限酵素部位に挿入してｐＡＣＥ−ＢｇａＩ．Ｎｅｗと命名したベクターを製造して、前記製造されたベクターを大腸菌ＤＨ５α菌株に形質転換させた。

実施例３：組換え微生物を利用したバチルス・サーキュランス由来の新規β−ガラクトシダーゼ製造
実施例２で作製された組換え大腸菌（ＤＨ５α／ｐＡＣＥ−ＢｇａＩ．Ｎｅｗ）を利用して組換えβ−カラクトシダーゼを製造した。ｐＡＣＥ（ＧｅｎｏＦｏｃｕｓ社、韓国）ベクターは、タンパク質発現のために別途の誘導剤（Ｉｎｄｕｃｅｒ）添加の必要がなく微生物培養だけで細胞成長とタンパク質発現が分離された状態で組換えタンパク質を生産することができる。したがって、滅菌された１００ｍｌＬＢ（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ）培地が入っている１Ｌの三角フラスコに前日に十分に種培養した前記形質転換された組換え菌株培養物５ｍｌを接種して、３０℃で撹はん速度２００ｒｐｍで２４時間培養した。培養が完了した前記形質転換された組換え菌株は、遠心分離によって培養液と分離して、滅菌蒸溜水に適正濃度に再び希釈した。超音波粉砕機（ＶｉｂｒａＣｅｌｌ社）で形質転換された組換え菌株を破砕して遠心分離で細胞残渣とβ−ガラクトシダーゼＩＩを最終的に分離して、タンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。

その結果、図２に示した通り、約１２０ｋＤａ程度のβ−ガラクトシダーゼバンドを確認した。

実施例４：新規β−ガラクトシダーゼの最適温度活性確認
実施例３で収得した組換えβ−ガラクトシダーゼを利用して最適温度を確認した。β−ガラクトシダーゼの活性決定は、種々の緩衝液中に４−ニトロフェニル−β−Ｄ−カラクトピラノシド（４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（ＳＩＧＭＡ社）を溶解させて基質として使用して、３０〜６０℃で反応後１０％（ｗ／ｖ）炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）を利用して酵素反応を中止させて発色させた。

前記酵素の活性は、４２０ｎｍにおける吸光度で遊離されたＯ−ニトロフェノールの濃度を確認した。β−ガラクトシダーゼ１ｕｎｉｔは、前記条件で１分当り１μｍｏｌのＯ−ニトロフェノールを遊離させる酵素の量で決めた。

図３に示した通り、新規β−ガラクトシダーゼの最適活性温度は、４０℃と確認された。

実施例５：新規β−ガラクトシダーゼを利用したオリゴ糖の合成
実施例３で収得したβ−ガラクトシダーゼのガラクトオリゴ糖を合成能を確認した。ガラクトオリゴ糖の基質としては、ラクトースを使用して、ラクトースを５００ｇ／Ｌの濃度で５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に高温を加えて溶解させた。１Ｌ容量の反応器に５００ｇ／Ｌ濃度のラクトース溶液５００ｍｌを添加して、反応温度は５０℃に固定して、撹はん速度は１００ｒｐｍを維持した。β−ガラクトシダーゼの投入量は最終濃度が１０ｕｎｉｔｓ（Ｕ／ラクトースｇ）になるように投与した。合成時間は４８時間を行った。

ガラクトオリゴ糖の分析は、ポリアミンＩＩ（ＰｏｌｙａｍｉｎｅＩＩ；ＹＭＣ社）コラムを使用してＲＩ検出器付きＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で測定した。この時、移動相はアセトニトリル（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）と精製水の比が６５％／３５％（ｖ／ｖ）になるように使用した。この時、移動相の流度は、１．０ｍｌ／ｍｉｎであった。前記反応完了後のガラクトオリゴ糖の分析結果は表１に示した。

ガラクトオリゴ糖の転化率は、下記のように計算した。以下表現する量は、ＨＰＬＣに測定されたピーク（ｐｅａｋ）面積を示し、ラクトース基質からの生成物で単糖類であるグルコース、ガラクトースと二糖類のラクトースを除いた二糖類以上の糖類をガラクトオリゴ糖と定義する。
ガラクトオリゴ糖の転化率（％）
＝［全体糖の量］−［グルコース量］−［ガラクトース量］−［ラクトース量］

前記含量（％）は、全体糖（グルコース、ガラクトース、ラクトースおよびオリゴ糖）の合計において各糖に対する比である。したがって、本発明に係るβ−ガラクトシダーゼによるガラクトオリゴ糖の転化率は３２％程度であった。

本発明に係る新規β−ガラクトシダーゼを使用すると、ガラクトオリゴ糖を効率的に大量生産することができる。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

Claims

配列番号１のアミノ酸配列で表示されるβ−ガラクトシダーゼ。
請求項１に記載のβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子。
前記β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子は、配列番号２の塩基配列で表示されることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子。
請求項２に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
請求項２に記載の遺伝子または請求項４に記載の前記組換えベクターがバクテリア、菌類および酵母で構成された群から選択される宿主細胞に導入されている組換え微生物。
請求項５に記載の組換え微生物を培養してβ−ガラクトシダーゼを生成させる工程；および
前記生成されたβ−ガラクトシダーゼを回収する工程
を含むβ−ガラクトシダーゼの製造方法。
請求項１に記載のβ−ガラクトシダーゼをラクトース含有基質と反応させてガラクトオリゴ糖を製造する工程；および
前記製造されたガラクトオリゴ糖を回収する工程
を含むガラクトオリゴ糖の製造方法。
前記ガラクトオリゴ糖は、液状乳、乾燥粉末牛乳、乳児用牛乳、乳児用調製食（ｂａｂｙｆｏｒｍｕｌａ）、アイスクリーム、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品、飲料、乳児食品、シリアル、パン、ビスケット、菓子類、ケーキ、食品補助剤、栄養補助食品、プロバイオティクス食品、プレバイオティクス食品、動物飼料、家畜飼料および薬剤からなる群から選択される一つの構成成分であることを特徴とする請求項７に記載のガラクトオリゴ糖の製造方法。