CN106459946B - 新的β-半乳糖苷酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的β‑半乳糖苷酶，更详细地，涉及一种来自环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的新的β‑半乳糖苷酶、编码上述新的β‑半乳糖苷酶的基因、含有上述基因的重组载体和重组微生物、利用上述重组微生物的β‑半乳糖苷酶的制造方法、以及利用上述β‑半乳糖苷酶的低聚半乳糖的制造方法。使用本发明的β‑半乳糖苷酶能够有效地大量生产低聚半乳糖。

Description

新的β-半乳糖苷酶

技术领域

本发明涉及一种新的β-半乳糖苷酶，更详细地，涉及一种来自环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)的新的β-半乳糖苷酶、编码上述新的β-半乳糖苷酶的基因、含有上述基因的重组载体和重组微生物、利用上述重组微生物的β-半乳糖苷酶的制造方法、以及利用上述β-半乳糖苷酶的低聚半乳糖的制造方法。

背景技术

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)在乳糖等β-D-吡喃半乳糖苷(β-D-galactopyranoside)中水解非还原末端β-D-半乳糖(β-D-galactose)，或者催化半乳糖(Galactose)的转移反应。一般情况下，这种酶具有水解活性和糖转移活性这两种特性，均在工业上具有实用性。水解活性通过对牛奶和乳制品的乳糖进行水解，防止乳糖不耐症且增加甜度，糖转移活性用于制造低聚半乳糖(Galactooligosaccharide)，该低聚半乳糖促进作为人体肠内有效微生物的乳酸菌的生长。

虽然β-半乳糖苷酶发现于很多种类的微生物、植物、还有动物中，但是目前工业上利用的大多数β-半乳糖苷酶是从微生物分离的。糖转移反应的特异性不同的β-半乳糖苷酶从芽胞杆菌属(Bacillus sp)、曲霉属(Aspergillus sp)、酵母菌属(Saccharomyces sp)等中被分离，并且对其他嗜热菌中分离的热稳定酶，也进行了多种多样的研究。

目前，世界上使用于低聚半乳糖制造的β-半乳糖苷酶，大多数来自芽孢杆菌属或者曲霉菌属，尤其是来自芽孢杆菌属，具体而言，来自环状芽胞杆菌的β-半乳糖苷酶由于其具有50～60℃的活性温度和高糖转移活性，因此，是工业上使用最多的一种，尤其是，来自环状芽胞杆菌ATCC31382的β-半乳糖苷酶，正在以BIOLACTA(Amano公司)的商品名称销售中。已知上述酶，是在适当的培养基培养环状芽胞杆菌后，通过细胞破碎或者从培养基回收的方法生产。

另外，来自环状芽胞杆菌ATCC31382的β-半乳糖苷酶的特性，已报道于很多文献中。已有报道称上述微生物中存在3个亚型(Isoform)结构的β-半乳糖苷酶，且根据蛋白质大小的不同，命名为212kDa的β-半乳糖苷酶I、145kDa的β-半乳糖苷酶II，还有86kDa的β-半乳糖苷酶III。上述三种亚型的基因碱基序列中，β-半乳糖苷酶I由Amano公司(WO2010/140435)、β-半乳糖苷酶II由GenoFocus公司(大韩民国登记专利第1,121,161号)、β-半乳糖苷酶III由Ito集团(Ito Y.et al.，Biosci Biotechnol Biochem.，61:1270-6，1997)已被确认到。并且，确认到这三种亚型中，β-半乳糖苷酶I和II可以利用于低聚半乳糖的合成。目前为止，各种机构的研究报告了环状芽胞杆菌中只有三种β-半乳糖苷酶基因存在。

本发明人预想到了如果环状芽胞杆菌中存在β-半乳糖苷酶亚型，则可能存在具有与目前确认的三种β-半乳糖苷酶不同的其他β-半乳糖苷酶特性的β-糖苷酶(beta-glycosidase)系列的基因，并以此为前提，为了确认新的β-糖苷酶努力的结果，确认了在环状芽胞杆菌中除了存在已知的三种β-半乳糖苷酶以外，还存在其他新的β-半乳糖苷酶，并确认了其基因碱基序列，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种来自环状芽胞杆菌的新的β-半乳糖苷酶。

本发明的其他目的在于，提供一种编码上述新的β-半乳糖苷酶的基因。

本发明的其他目的在于，提供一种含有上述基因的重组载体以及导入有上述基因或者上述重组载体的重组微生物。

本发明的其他目的在于，提供一种利用上述重组微生物的新的β-半乳糖苷酶的制造方法。

本发明的其他目的在于，提供一种利用上述新的β-半乳糖苷酶的低聚半乳糖的制造方法。

为了达成上述目的，本发明提供一种β-半乳糖苷酶，其具有序列号1的氨基酸序列。

另外，本发明提供一种编码上述β-半乳糖苷酶的基因以及包含上述基因的重组载体。

另外，本发明提供一种重组微生物，其中，上述基因或者上述重组载体插入在选自于由细菌、霉以及酵母所组成的组中的宿主细胞中。

另外，本发明提供一种β-半乳糖苷酶的制造方法，包括：

培养上述重组微生物生成β-半乳糖苷酶的步骤；以及

回收上述生成的β-半乳糖苷酶的步骤。

另外，本发明提供一种低聚半乳糖的制造方法，包括：

将上述β-半乳糖苷酶与含有乳糖的基质反应，制造低聚半乳糖的步骤；以及

回收上述制造的低聚半乳糖的步骤。

附图说明

图1是表示将环状芽胞杆菌的基因组DNA用HpaI限制酶处理的片段中确认到的β-半乳糖苷酶基因的ORF的大小以及位置的示意图。

图2是表示通过SDS-PAGE确认在重组β-半乳糖苷酶基因转化而成的大肠杆菌DH5α/pACE-BgaI.New中生产的重组β-半乳糖苷酶的蛋白质表达状态的结果的图(M:蛋白质大小标记、1:DH5α/None、2:DH5α/pACE-BgaI.New、箭头:β-半乳糖苷酶)。

图3是表示在转化大肠杆菌DH5α/pACE-BgaI.New中生产的重组β-半乳糖苷酶的最适温度的图。

具体实施方式

除非有其他定义，本说明书中使用的所有技术术语以及科学术语与本领域技术人员通常理解的术语具有相同的意义。一般情况下，本说明书中使用的命名法以及以下记述的实验方法，是在本领域中众所周知且通常被使用的。

一方面，本发明涉及一种具有序列号1的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶以及编码上述β-半乳糖苷酶的基因。

在本发明中，预想到在环状芽胞杆菌中可能还存在具有目前为止确认到的三种β-半乳糖苷酶以外的其他β-半乳糖苷酶特性的β-糖苷酶(beta-glycosidase)系列的基因，并从环状芽胞杆菌的基因组分离了新的β-半乳糖苷酶基因。

本发明的一实施方式中，通过将环状芽胞杆菌ATCC31382的基因组DNA用23种限制酶切断，制作了用于克隆β-半乳糖苷酶的基因组文库，在上述文库中筛选了具有β-半乳糖苷酶活性的菌株。

将上述筛选的具有β-半乳糖苷酶活性的菌株所含有的环状芽胞杆菌基因组片段进行序列分析的结果，除了已知的来自环状芽胞杆菌的β-半乳糖苷酶基因以外，还确认到了含有具有新的序列的β-半乳糖苷酶基因的片段。

将含有上述新的β-半乳糖苷酶基因片段的碱基序列显示于序列号3，包含β-半乳糖苷酶基因的DNA片段的总大小为6731bp，上述片段中发现了3个ORF(Open ReadingFrames，可读框)(图1)。确认到了其中第三个ORF由3105bp的DNA大小(序列号2)和1035个氨基酸(序列号1)组成，并且具有β-半乳糖苷酶活性。

另一方面，本发明涉及一种含有编码上述β-半乳糖苷酶的基因的重组载体、以及编码上述β-半乳糖苷酶的基因或者上述重组载体插入在选自于由细菌、霉和酵母所组成的组中的宿主细胞的重组微生物。

本发明中使用的术语“载体(vector)”，是指含有DNA序列的DNA产品，所述DNA序列可操作性连接于能够在适合的宿主内表达DNA的适合的调控序列上。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、或者简单的潜在性基因组插入物。如果载体转化成适当的宿主，载体与宿主基因组无关地复制和产生作用，或者在某些情况下可以合并于基因组其本身。由于质粒是目前载体通常使用的形态，因此，本发明的说明书中“质粒(plasmid)”以及“载体(vector)”有时可互换使用。然而，本发明包含本领域已知的或者将会知晓的具有相同功能的载体的其他形态。用于表达哺乳动物细胞培养物的典型的表达载体，例如以pRK5(EP307,247号)，pSV16B(WO91/08291号)以及pVL1392(Pharmingen)作为基础。

“表达调控序列(expression control sequence)”，是指在特定的宿主生物中可操作性连接的编码序列的表达所必要的DNA序列。该调控序列包含用于实施转录的启动子、用于调控该转录的任意的操纵基因序列、用于编码适合的mRNA核糖体结合位点的序列、以及调控转录和解读终止的序列。例如，适合原核生物的调控序列，包含启动子、任意的操纵基因序列以及核糖体结合位点。真核细胞的调控序列包含启动子、多聚腺苷酸信号以及增强子。质粒中对基因的表达量影响最大的因子是启动子。因此，作为表达用的启动子，优选使用SRα启动子和来自巨细胞病毒(cytomegalovirus)的启动子等。

为了表达本发明的DNA序列，可将多种多样的表达调控序列中的任意一种应用于载体。有用的表达调控序列的例子，例如，包括：SV40或者腺病毒的初期和后期启动子、lac体系、trp体系、TAC或TRC体系、T3和T7启动子、噬菌体的主要操纵基因和启动子区域、fd代码蛋白质的调控区域、3-磷酸甘油激酶或其他乙二醇分解酶的启动子、如Pho5等的上述磷酸酶的启动子、酵母α-杂交体系的启动子、已知调节原核细胞或者真核细胞或者其病毒基因的表达的构成和诱导的其他不同序列及其它们的各种组合。T7RNA聚合酶启动子Φ10可有效应用于大肠杆菌中蛋白质NSP表达。

当核酸与其他核酸序列以功能关系配置时，是“可操作地连接(operablylinked)”。这可以是当适当的分子(例如，转录激活蛋白质)与(多个)调控序列结合时，以能够基因表达的方式连接的基因以及(多个)调控序列。例如，当针对前序列(pre-sequence)或者分泌前导(leader)的DNA作为参与分泌多肽的全蛋白质表达时，可操作地连接于多肽DNA；当启动子或者增强子对序列的转录产生影响时，可操作地连接于编码序列；或者当核糖体结合位点对序列的转录产生影响时，可操作地连接于编码序列；或者当核糖体结合位点以容易翻译的方式配置时，可操作地连接于编码序列。一般情况下，“可操作地连接”是指接触所连接的DNA序列，另外，分泌前导的情况下，是指接触并且存在于阅读框(readingframe)内。但是，增强子(enhancer)无需接触。这些序列的连接，是在方便的限制酶位点通过结扎(连接)实施。当这种位点不存在时，使用通常方法的合成寡核苷酸适配子(oligonucleotide adaptor)或者接头(linker)。

在本说明书中使用的术语“表达载体”，通常表示插入有异种DNA片段的重组载体(recombinant carrier)，一般指双链DNA的片段。在此，异种DNA表示没有在宿主细胞中天然发现的DNA，即异形DNA。表达载体一旦存在于宿主细胞内，就可以与宿主染色体DNA无关地复制，并且可以生成载体的几个复制品以及其插入的(异种)DNA。

如在本领域中众所周知，为了提高宿主细胞中转染基因的表达水平，相应的基因需要可操作地连接于能够在所选择的表达宿主内发挥功能的转录以及解读表达调控序列。优选地，表达调控序列以及相应的基因包含在同一个表达载体内，该表达载体同时包含细菌选择标记以及复制起点(replication origin)。当表达宿主为真核细胞时，表达载体需要还包含真核表达宿主内有用的表达标记。

由上述表达载体转化或者转染的宿主细胞构成本发明的另一个侧面。本说明书中使用的术语“转化(transformation)”，是指将DNA导入宿主，从而DNA作为染色体外因子可进行复制或者根据完成染色体合并可进行复制。本说明书中使用的术语“转染(transfection)”，是指无论任意的编码序列实际上表达还是不表达，表达载体由宿主细胞收容。

应当理解并非所有的载体和表达调控序列在表达本发明的DNA序列时都同等地发挥功能。同样地，并非所有的宿主对于同一表达体系发挥相同的功能。但是，对于本领域技术人员而言，可在没有过度的实验负担且不超过本发明的范围内，在多个载体、表达调控序列以及宿主中做出适当的选择。例如，在选择载体时需要考虑宿主，这是因为载体需要在其中复制。也需要考虑载体的复制数量、能够调节复制数量的能力以及由该载体编码的其他蛋白质，例如，抗生素标记的表达。在选定表达调控序列时，也需要考虑很多因子。例如，序列的相对强度、调节可能性以及与本发明DNA序列的相容性等，尤其是，关于有可能性的二级结构也需要考虑。单细胞宿主需要考虑所选定的载体、由本发明的DNA序列编码的产物的毒性、分泌特性、能够正确折叠蛋白质的能力、培养和发酵条件、从宿主精制由本发明DNA序列编码的产物的容易性等因子而选定。在其变量范围内，本领域技术人员可以选定能够发酵本发明的DNA序列或者在大规模动物培养中表达本发明DNA的各种载体/表达调控序列/宿主的组合。作为通过表达克隆来克隆NSP蛋白质的cDNA时的筛选法，可以适用绑定法(binding法)、盘选法(panning法)、胶片乳胶法(film emulsion法)等。

本发明定义中“实际上纯的”，是指本发明的多肽以及编码多肽的DNA序列实际上不包含来自细菌的其他蛋白质。

作为用于表达重组蛋白质的宿主细胞，一直以来广泛利用能够在短时间内培养高浓度菌体，基因操作容易，且基因学、生理学的特征已被明确揭露的大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillis)等原核细胞。但是，为了解决蛋白质的翻译后修饰(post-translational modification)、分泌过程以及活性型的三维结构、蛋白质活性状态的问题，近年来，作为单细胞真核细胞的酵母系列(毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、汉逊酵母(Hansenula polymorpha)等)、丝状真菌类(filamentous fungi)、昆虫细胞(insect cells)、植物细胞、哺乳动物细胞(mammaliancells)等高等生物也被用作生产重组蛋白质的宿主细胞，因此，不仅利用实施例中举例说明的大肠杆菌，还利用其它宿主细胞，对于本领域技术人员而言是容易做到的。

另一方面，本发明涉及β-半乳糖苷酶的制造方法，包括：培养上述重组微生物生成β-半乳糖苷酶的步骤；以及，回收上述生成的β-半乳糖苷酶的步骤。

在本发明的一实施方式中，利用转化的重组大肠杆菌(DH5α/pACE-BgaI.New)制造了重组β-半乳糖苷酶，为了蛋白质表达，上述pACE(GenoFocus公司，韩国)载体在无需添加其他的诱导剂(Inducer)的情况下，仅通过微生物培养也能够在细胞生长和蛋白质表达分离的状态下重组蛋白质。通过上述方法生产的β-半乳糖苷酶用SDS-PAGE确认的结果，确认到具有120kDa大小的条带(band)(图2)。

在本发明的另一实施方式中，将上述获得的重组β-半乳糖苷酶和4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(4-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside)(SIGMA公司)作为基质，确认酶反应的最适宜温度的结果，确认到本发明的新的β-半乳糖苷酶的最适宜活性温度是40℃。

另一方面，本发明涉及低聚半乳糖的制造方法，包括：将上述β-半乳糖苷酶与含有乳糖的基质反应，从而制造低聚半乳糖的步骤；以及，回收上述制造的低聚半乳糖的步骤。

本发明中的特征在于，上述低聚半乳糖是选自于由液态奶、干燥粉末牛奶、婴幼儿牛奶、婴幼儿配方奶粉(baby formula)、冰淇淋、酸奶、奶酪、乳制品、饮料、婴幼儿食品、燕麦片、面包、饼干、糕点类、蛋糕、食品助剂、膳食补充剂、益生菌(Probiotic)食品材料、益菌素(Prebiotic)食品材料、动物饲料、家畜饲料以及药剂所组成的组中的一种的组成成分。

本发明另一实施方式中，使用乳糖作为基质，确认了本发明新的β-半乳糖苷酶的低聚半乳糖的合成能力，其结果，本发明的β-半乳糖苷酶的低聚半乳糖转换率为32％左右。

以下，通过实施例更详细说明本发明。这些实施例仅用于举例说明本发明，本领域技术人员应当明白，本发明的范围并不限定于这些实施例。

实施例1：来自环状芽胞杆菌的新的β-半乳糖苷酶的克隆

在作为基本培养基的LB(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl)培养基中培养了环状芽胞杆菌ATCC31382，从培养的细胞中分离(Genomic DNA extraction kit；RB公司)了基因组DNA 500μg。将上述分离的基因组DNA分别用23种限制酶AatII、AflII、ApaI、ApaLI、BamHI、BgalII、BsiWI、ClaI、EcoRI、EcoRV、HindIII、HpaI、KpnI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、NsiI、PciI、PsiI、PstI、PvuI、PvuII、SacI、SalI、ScaI、SpeI、SphI、StuI、XbaI、XhoI以及XmaI单一处理，将被各限制酶切割的基因组DNA片段中1～8kb DNA片段的混合物，用DNA聚合酶I(klenow fragment enzyme；TaKaRa公司)处理，钝化用限制酶切割的DNA片段的两末端，并连接(ligation)于T-blunt(SolGen公司)载体，从而制作了含有分别命名为T-gDNA.flag的载体的文库。

将上述文库转化(transformation)到大肠杆菌DH5α，培养于含有X-gal的LB agar(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、1.5％琼脂、50ug/ml X-gal)。24小时后，对在LBagar生长的转化大肠杆菌菌落(colony)中X-gal进行分解，显示绿色菌落判断为含有β-半乳糖苷酶功能的基因的菌株，并进行了回收。将回收的菌落分别在LB液体培养基进行培养，从中回收质粒载体(Plasmid mini extraction kit；Bioneer公司)，并分析了碱基序列(SolGent公司)。

结果，确认到了多个以往报告的β-半乳糖苷酶基因的碱基序列，并在单一处理HpaI限制酶而生成的载体文库中，确认到了新的β-半乳糖苷酶基因。

将含有上述新的β-半乳糖苷酶基因的片段显示于序列号3，包含β-半乳糖苷酶基因的DNA片段的总大小是6731bp，并在上述片段中发现了3个ORF(Open Reading Frames，可读框)(图1)。

其中，第三个ORF由3105bp大小的DNA(序列号2)和1035个氨基酸(序列号1)组成，并确认到具有β-半乳糖苷酶活性。

实施例2：含有β-半乳糖苷酶II基因的重组载体以及重组微生物的制造

利用实施例1中获取的环状芽胞杆菌的新的β-半乳糖苷酶基因碱基序列，制造了重组载体以及重组微生物。

基于序列号2的β-半乳糖苷酶基因的碱基序列，制作了如下序列号4和序列号5的引物(primer)。

序列号4:aaaaatgtcacaattaacgtatga

序列号5:aaaactgcagttagtgtaaggtaaatgaat

将环状芽胞杆菌ATCC31382的基因组DNA作为铸型，利用序列号4和序列号5的引物实施了PCR。精制PCR产物后，利用插入各引物的限制酶序列NdeI和PstI，向pACE(GenoFocus公司，韩国)载体的同一限制酶位点插入而制造了命名为pACE-BgaI.New的载体，并将上述制造的载体转化到大肠杆菌DH5α菌株。

实施例3：利用重组微生物的来自环状芽胞杆菌的新的β-半乳糖苷酶的制造

利用实施例2中制作的重组大肠杆菌(DH5α/pACE-BgaI.New)，制造了重组β-半乳糖苷酶。pACE(GenoFocus社，韩国)载体为了表达蛋白质无需添加其他的诱导剂(Inducer)，仅通过微生物培养也能够在细胞生长和蛋白质表达分离的状态下生产重组蛋白质。因此，装有灭菌的100ml LB(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl)培养基的1L三角瓶中，接种了前一天充分种菌培养的上述转化的重组菌株培养物5mL，在30℃、搅拌速度200rpm下培养了24小时。将完成培养的上述转化的重组菌株，通过离心分离和培养液分离，在灭菌蒸馏水中重新稀释成适当浓度。用超声波粉碎机(VibraCell公司)破碎转化的重组菌株，通过离心分离最终分离细胞残留物和β-半乳糖苷酶II，实施了蛋白质电泳(SDS-PAGE)。

结果，如图2所示，确认到了120kDa左右的β-半乳糖苷酶条带。

实施例4：新的β-半乳糖苷酶的最适宜温度活性的确认

利用实施例3中获得的重组β-半乳糖苷酶，确认了最适宜温度。决定β-半乳糖苷酶的活性时，在多种缓冲液中溶解4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(4-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside)(SIGMA公司)而用作基质，在30～60℃下反应后，利用10％(w/v)碳酸钠(Na₂CO₃)终止酶反应并显色。

作为上述酶的活性，确认了在420nm的吸光度下游离的O-硝基苯酚的浓度。β-半乳糖苷酶1单位(unit)是，上述条件下每分钟游离O-硝基苯酚1μmol的酶的量。

如图3显示，确认到了新的β-半乳糖苷酶的最适宜的活性温度是40℃。

实施例5:利用新的β-半乳糖苷酶的低聚糖的合成

确认了实施例3中获得的β-半乳糖苷酶的低聚半乳糖的合成能力。作为低聚半乳糖的基质使用了乳糖，将乳糖以500g/L的浓度在50mM磷酸缓冲液(pH 6.0)中高温加热溶解。在1L容量的反应器中添加了500g/L浓度的乳糖溶液500mL，反应温度固定为50℃，搅拌速度维持100rpm。β-半乳糖苷酶的投入量是最终浓度达到10单位(U/乳糖g)的量。合成时间为48小时。

低聚半乳糖的分析是，使用多胺II(Polyamine II；YMC公司)柱并通过附着有RI检测仪的HPLC(Agilent公司)测定。此时，移动相的乙腈(Acetoni trile)和纯净水的比率为65％/35％(v/v)。移动相的流速是1.0ml/min。将上述反应完成后的低聚半乳糖的分析结果示于表1中。

通过以下方法计算低聚半乳糖的转化率。以下显示的量表示HPLC测定的峰值(peak)面积，将乳糖基质的生成物中除了单糖类的葡萄糖、半乳糖和二糖类乳糖以外的二糖类以上的糖类，定义为低聚半乳糖。

低聚半乳糖转化率(％)

＝[全部糖的量]-[葡萄糖的量]-[半乳糖的量]-[乳糖的量]

表1

上述含量(％)是全部糖(葡萄糖、半乳糖、乳糖以及低聚糖)的和中每个糖的比率。因此，本发明的根据β-半乳糖苷酶的低聚半乳糖转化率为32％左右。

工业实用性

使用本发明的新的β-半乳糖苷酶，能够高效地大量生产低聚半乳糖。

以上，详细记述了本发明内容的特定部分，本领域技术人员应当明白上述具体的记述仅是优选的实施方式，并不能限定本发明的范围。因此，本发明的实际范围由附加的权利要求及其等价物定义。

序列目录Free Text

附加了电子文件。

<110> 杰诺福克斯公司

<120> 新的β-半乳糖苷酶

<130> PP-B1569

<150> 10-2014-0062392

<151> 2014-05-23

<160> 5

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 1035

<212> PRT

<213> 环状芽孢杆菌

<400> 1

Met Leu Lys Val Lys Glu Lys Phe Val Tyr Thr Pro Pro Lys Asn Gly

1 5 10 15

Tyr Pro Glu Trp Asn Asn Asn Pro Glu Ile Phe Gln Leu Asn Cys Leu

20 25 30

Pro Ala His Ala Thr Ser Met Pro Phe Leu Ser Val Lys Asp Ala Ile

35 40 45

Thr Leu Asp Arg Leu Glu Ser Ser Phe Cys Lys Cys Leu Asn Gly Glu

50 55 60

Trp Lys Phe Ser Phe Ser Glu Asn Pro Ala Asn Arg Asn Pro Asp Phe

65 70 75 80

Phe Lys Met Gly Phe Asp Glu Cys Glu Met Lys Pro Ile Gln Val Pro

85 90 95

Ser His Trp Gln Phe Gln Gly Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Thr Asn Val

100 105 110

Arg Tyr Pro Trp Glu Glu Gln Glu Val Leu Lys Pro Pro Phe Ala Pro

115 120 125

Thr Lys Tyr Asn Pro Val Gly Gln Tyr Ile Thr Tyr Phe Asp Ile Pro

130 135 140

Lys Asp Trp Gly Asp Gln Pro Val Tyr Ile His Phe Ala Gly Val Glu

145 150 155 160

Ser Ala Phe Tyr Val Trp Ile Asn Gly Asp Leu Val Gly Tyr Ser Glu

165 170 175

Asp Ser Phe Thr Pro Ser Glu Phe Asp Leu Thr Pro Tyr Leu Val Glu

180 185 190

Gly Thr Asn Lys Leu Ala Val Glu Val Tyr Arg Trp Ser Asp Ala Ser

195 200 205

Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe Trp Arg Leu Ser Gly Ile Phe Arg Asp

210 215 220

Val Tyr Leu Tyr Thr Thr Pro Leu Val His Val Ser Asp Tyr Phe Val

225 230 235 240

Arg Thr Asp Leu Asp Glu Asn Tyr Lys Asp Ala Glu Leu Val Val Asn

245 250 255

Met Lys Val Ser Asn Tyr Gly Ser Met Phe Glu Glu Pro Val Thr Ile

260 265 270

Glu Ala His Leu Ile Asp His Thr Gly Tyr Lys Val Phe Ser Glu Val

275 280 285

Met Val Glu Arg His Ile Gln Thr Val Glu Glu Asn Glu Leu Cys Phe

290 295 300

Leu Lys Lys Ile Ser Ser Pro Leu Leu Trp Ser Ala Glu Gln Pro Met

305 310 315 320

Leu Tyr Thr Phe Val Ile Thr Val Lys Thr Ile Asp Gly Ser Ile Leu

325 330 335

Glu Ala Gln Ser Cys Lys Val Gly Phe Arg Lys Phe Glu Leu Lys Asp

340 345 350

Gly Leu Met Leu Ile Asn Gly Lys Arg Ile Leu Phe Asn Gly Val Asn

355 360 365

Arg His Glu Phe Ser His Leu Arg Gly Arg Ser Val Thr Lys Glu Asp

370 375 380

Met Leu His Asp Val Ile Glu Met Lys Lys His Asn Ile Asn Ala Val

385 390 395 400

Arg Thr Ser His Tyr Pro Asn His Pro Tyr Trp Tyr Asp Leu Cys Asp

405 410 415

Gln Tyr Gly Leu Tyr Val Ile Asp Glu Thr Asn Leu Glu Thr His Gly

420 425 430

Thr Trp Ser Tyr Gly Gln Asn Gln Ile Gln Asn Ala Ile Pro Gly Asp

435 440 445

Lys Glu Glu Trp Thr Ala Asn Val Ile Asp Arg Cys His Ser Met Leu

450 455 460

His Arg Asp Lys Asn His Pro Cys Ile Leu Ile Trp Ser Leu Gly Asn

465 470 475 480

Glu Ser Phe Gly Gly Thr Asn Phe Ile Lys Met Lys Asp His Ile Lys

485 490 495

Lys Glu Asp Pro Thr Arg Leu Val His Tyr Glu Gly Val Ala His Tyr

500 505 510

Arg Ala Ser Ser Glu Ala Ser Glu Ile Glu Ser Met Met Tyr Glu His

515 520 525

Pro Ser Lys Leu Glu Ala Tyr Ala Leu Ser Ala Glu Ser Ser Glu Val

530 535 540

Pro Leu Lys Pro Tyr Ile Ile Cys Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn

545 550 555 560

Ser Val Gly Asn Leu Tyr Gln Tyr Thr Asp Leu Phe Asn Lys Tyr Pro

565 570 575

Ile Leu Gln Gly Gly Phe Ile Trp Asp Tyr Lys Asp Gln Ala Ile Gln

580 585 590

Thr Ile Ser Glu Thr Gly Thr Pro Tyr Leu Ala Tyr Gly Gly Asp Phe

595 600 605

Gly Glu Ser Pro Asn Asp Gly Asn Phe Cys Gly Asn Gly Leu Leu Phe

610 615 620

Ala Asp Gly Ser Leu Thr Pro Lys Ile Phe Glu Val Lys Lys Cys Tyr

625 630 635 640

Gln Pro Ile Asp Val Arg Ile Glu His Asp Val Phe Thr Val Ile Asn

645 650 655

Lys His Leu Phe Thr Asp Val Asn Glu Tyr Glu Ala Arg Trp Thr Ile

660 665 670

Leu Lys Asp Gly Glu Glu Ile Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ile Ser Cys

675 680 685

Lys Pro Leu Ser Ser Thr Leu Ile Asp Leu Lys Asn Val Leu Ser Lys

690 695 700

Tyr Val Met Asp Asp His Glu Tyr Ile Ile Thr Ile Ser Phe His Thr

705 710 715 720

Val Lys Asp Ser Leu Trp Ala Gln Lys Gly Tyr Glu Ile Ala Phe Asp

725 730 735

Gln Phe Val Leu Thr Asn Arg Ile Ile Ala Gln Arg Val Pro Ser Met

740 745 750

Ser Ile Lys Arg Ile Glu Lys Thr Asn Asp Asn Leu Lys Ile Glu Gly

755 760 765

Glu Thr Phe Ser Val Ile Val Ser Lys Thr Ser Gly Phe Ile Thr Ser

770 775 780

Phe Val Lys Gln Gly Val Glu Ile Leu Ala Glu Pro Ile Val Pro Asn

785 790 795 800

Phe Trp Arg Ala Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Asn Lys Leu Gly Glu

805 810 815

Arg Thr Gly Ile Trp Glu Gln Ala Gly Lys Thr Ala Val Leu Gln Gln

820 825 830

Met Asp Val Glu Glu Met Asp Lys Thr Val His Ile Lys Thr Val Leu

835 840 845

Gln Leu Gln Thr Ser Pro Ala Ser Val Cys Ser Ile Asp Tyr Glu Ile

850 855 860

Thr Gly Asp Gly Glu Ile His Val Ala Phe Glu Leu Gln Pro Gly Asp

865 870 875 880

Gly Leu Pro Glu Ile Pro Glu Ile Gly Met Ile Leu Pro Leu Val Lys

885 890 895

Ser Phe Glu Ala Ile Ser Trp Tyr Gly Lys Gly Pro His Glu Asn Tyr

900 905 910

Trp Asp Arg Glu Lys Gly Ala Lys Ile Gly Arg Tyr Val Ser Thr Val

915 920 925

Glu Asn Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Lys Pro Gln Glu Asn Gly Asn Lys

930 935 940

Ile Gly Val Arg Ser Phe Glu Ile Gly Asp Gly Arg Gly Ile Ile Leu

945 950 955 960

Arg Val Ser Ser Asp Ser Leu Leu Glu Ile Asn Ala Gly Ala Tyr Ser

965 970 975

Ala Thr Glu Leu Gln Glu Ala Ala His Thr Tyr Gln Leu Pro Glu Arg

980 985 990

Thr Lys Thr Tyr Leu Arg Val Asn His Lys Gln Met Gly Ile Gly Gly

995 1000 1005

Asp Asp Ser Trp Ala Ala Lys Thr His Pro Glu Phe Thr Leu Tyr Ser

1010 1015 1020

Asp His Thr Tyr Gln Tyr Ser Phe Thr Leu His

1025 1030 1035

<210> 2

<211> 3108

<212> DNA

<213> 环状芽孢杆菌

<400> 2

atgttaaaag tgaaagaaaa atttgtttat acaccaccta aaaacgggta tccggagtgg 60

aataataatc cggaaatttt ccagctcaat tgtttgcctg cacatgctac gagtatgccg 120

tttttgtcgg tgaaagatgc aataacatta gatcgattgg agtcttcgtt ctgtaaatgt 180

ttgaatgggg aatggaaatt ttcattttca gagaatccgg caaatcgaaa tcctgatttt 240

tttaaaatgg gatttgatga atgtgagatg aaaccgattc aagttccttc ccattggcaa 300

tttcagggct atgattatcc gcagtatacg aatgtccgtt atccatggga agagcaagaa 360

gttttaaagc ctccctttgc accgacaaaa tataatcccg taggtcaata cattacatat 420

tttgatatcc cgaaggattg gggagatcag ccggtatata ttcattttgc aggggtggaa 480

tccgcttttt acgtgtggat aaatggcgat ttagttggtt acagtgaaga tagttttact 540

cctagtgagt ttgatctaac tccttattta gtagaaggaa cgaataaact ggcggtagaa 600

gtttatcgct ggagtgatgc cagttggtta gaggaccagg atttttggcg attaagtggt 660

attttcaggg atgtatatct gtataccaca ccgctagtac atgtttcgga ttattttgta 720

cgtacagatc tagatgaaaa ttataaagat gcagaactag ttgtaaatat gaaagtatcg 780

aattatggca gtatgtttga ggagcctgtt actatcgaag cacatttaat tgatcataca 840

ggctacaaag tatttagcga ggttatggta gagcgacata tacaaacagt agaggaaaat 900

gagttatgct ttttaaaaaa aatatcttct cccctcctgt ggagtgcgga gcagccaatg 960

ctttatacat ttgttattac cgtgaaaact atagatggtt cgatattgga agcgcaaagc 1020

tgtaaagtgg gctttcgtaa atttgaatta aaggatggcc tgatgctgat taatggcaaa 1080

aggatattgt ttaacggtgt aaatcgtcat gagttttctc atctgcgcgg tcgctctgtc 1140

acaaaagagg atatgcttca tgatgtcatc gaaatgaaaa agcataatat taatgctgtg 1200

agaacttctc attatccaaa ccatccctat tggtatgatt tatgtgatca atatggttta 1260

tatgtaatcg atgaaactaa tttagaaacg catggtacat ggtcttatgg tcagaatcaa 1320

attcaaaatg ccattccggg agataaggaa gagtggacag ccaatgtgat cgatcgctgt 1380

cattccatgc tgcatcggga taagaatcat ccgtgcattc taatttggtc gctcggaaat 1440

gaatctttcg gcggaaccaa ttttattaaa atgaaagatc atatcaaaaa ggaggaccca 1500

actcgccttg ttcactacga aggggtagcc cattatcgtg cttcaagtga ggcttcggaa 1560

attgaaagta tgatgtacga acatccttca aaactcgaag cctatgccct aagtgcagaa 1620

agcagtgaag tgccgctgaa gccatatatt atttgtgagt atgcacatgc aatggggaat 1680

tctgtaggaa atctctatca atatactgat ctatttaata agtatccaat tttacaggga 1740

ggttttattt gggattataa agatcaagcc attcaaacca tctctgaaac cggaacaccg 1800

tatttagctt atgggggaga ttttggagaa tcgccgaacg acggtaattt ttgcggcaat 1860

ggcctgttat ttgcagatgg gtctttaaca cctaaaatct ttgaagtaaa aaaatgctat 1920

cagccaattg atgtccgaat tgagcatgat gtatttaccg tcatcaataa gcacttattc 1980

actgacgtaa acgaatatga ggcaaggtgg accatactta aagatgggga agagattgcg 2040

agtgaaagca taagtatttc ctgtaagccg ctatcatcta cattgataga tcttaaaaat 2100

gtattgtcaa aatatgtaat ggatgatcat gaatatatta taactattag ttttcacact 2160

gttaaagata gcctttgggc tcaaaagggt tatgaaatag cctttgatca atttgttcta 2220

acaaatcgaa tcattgccca gagagtaccg agcatgtcta ttaaacgtat tgaaaagaca 2280

aacgataatt tgaaaattga gggtgaaaca ttctccgtta ttgtaagtaa aacatcagga 2340

ttcataactt ctttcgtaaa acagggtgta gagattttag ctgagccaat tgttccgaat 2400

ttctggaggg ctcttaccga taatgaccgt gggaataaat taggtgagcg tacaggaatt 2460

tgggaacagg cgggaaaaac ggccgttttg caacagatgg atgtagagga aatggataaa 2520

acggttcata ttaaaaccgt acttcaatta caaacttcac ctgcttcagt ttgtagtatt 2580

gattatgaaa taactggaga cggagaaatt catgttgcgt ttgaacttca gcctggtgat 2640

gggttgccgg aaattcctga aatcgggatg atcctgcctt tagtcaaatc gtttgaggct 2700

atttcttggt acggaaaagg tcctcatgaa aattattggg accgtgaaaa gggggcaaaa 2760

attggccgct atgtatcgac agtggaaaat gagtttacac catatctaaa accacaagaa 2820

aatgggaata aaatcggagt ccgctcgttt gaaattgggg atggccgtgg aataatcctc 2880

cgtgtttcaa gtgattcatt attagaaatt aatgcaggtg cctattcggc aacagaatta 2940

caggaagcag cccatacgta tcagctgcct gaaagaacaa aaacgtattt acgcgtaaac 3000

cataagcaaa tggggattgg cggagatgat tcttgggctg caaagaccca tccggaattc 3060

actttatatt ctgatcatac ttatcaatat tcatttacct tacactaa 3108

<210> 3

<211> 6731

<212> DNA

<213> 环状芽孢杆菌

<400> 3

gttaacttca tattaatctt tactgctaac aaaatatcta aacgattctc atcatcaagc 60

ttatggtagg agggaaggat atgacgaaaa caggaaatac aagaattaaa gaatcaaaaa 120

ttgatcgcct ttttatagga gctatttatg tatttttagt tctcatttta atagctgttt 180

tatatccgct tatctatatt gtgagcgctt catttagcag tgcatctgcg gtaacatccg 240

ggagtgtttg gctgtggccg gtagaaccaa cactattagg atacacgaca gtgtttaaga 300

atccgcaaat tcttcaaggg ttttataatt cgctgtttta cactgttgtt ggaaccttta 360

ttagtgtaag tatcacgatt atgcttgcct atccgctttc aagaaaaaca ttttatgggc 420

gaaaattgat catgatttta ctggttttta cgatgatttt tgatggggga ttaataccgt 480

tgtatttggt tgtaaaaagt ttgcatttaa ttgatacaat atgggcactt ttactcccgt 540

ccgcattagc ggttttccaa gtgattattg ctagaacatt cttccaatct acgataccgg 600

atgaattagt agaagcaagt gaaatggatg gctgcagcga tattggattc atcctgaaag 660

ttgtcctgcc gttgtccaaa ccgattattg cagttcttgt cctcatgtat gcggtgatga 720

aatggaatat gtactttgat gcattgattt atttgaaatc cgaagagcta tatccattac 780

agctcatttt acgaagcatc ttaattttga atactgaccc atctgcaaat attgaagata 840

tattgaaaat gcaaggattg aaagaattaa tgaagtactc attgattgtt atttcaagtt 900

taccagtttt ggtgctgtat ccatttgttc aaaaacattt tgtaaaaggc atgttaattg 960

gatctgtaaa aggatgaaga agaagcaatc cagctaatac cagaggacgt tagaaaaaat 1020

aatataacgt taaacaaaca aaggagaggg tcaaatgaaa aagttatcaa ctagtttcat 1080

gcttttagtt ttaatgacga tgcttttcgc cggatgtgtt cctactaaga aaagttcatc 1140

cgaaggttca aaaagtgaaa gtccagatcc aaacggacca attgaagttt ccattttcac 1200

cccgagtata tcgtatgatc cagtttttga cagggataaa aatgaattca caaaaatggt 1260

tgaagagaaa tttaatatca aaattaattg gcaatttgca aaccaggatg cagcaaaaga 1320

aaaacgtcaa ttgtctctag ccagcggaga ctatccagat gcatatttgc ttgttgcatg 1380

gttagataat atttctaaag tggaagccca aaagtatggg aaagaaggtg tatttctgcc 1440

attaaataat ttaatagaaa aacatgcgcc aaatctccaa aaattaatga cagaagtccc 1500

ttatatggaa aaaggaatga ctgcaccgga tggtaatatt tatgctcttc ctccaatcaa 1560

tgaatgtttc cattgttcaa gatatgggaa gatgtggata aatacggact ggttgaaaaa 1620

attaaattta gaaatgccta aaacaacgga agaatttaaa acagtattag aagcatttaa 1680

aaataatgat ccaaatggaa acggcaagaa ggatgaaatc ccattaagcg gagaaagtac 1740

catgttaggg gatgatccaa cgatcttcct aatgaatgca tttttgccag ataatggtaa 1800

ggattatata aatgtacagg atggaaaatt agtgttagct ccgatgcagc cagcttggaa 1860

agatgggttg aaatacattc attctcttta taaagagggg ttaatcgatc aaggagcatt 1920

cacccaaaac ccggaggcgt ataagcagtt aggtactcct aaaggggatg aagtccttgg 1980

tgctggtgca gcaagtcatt tagcaattat atctgatata gcttctgaca aatcaaaagc 2040

attcgatgtt gtcccaccgt taaaaggtcc tgaaggtgct caatttacac cttctgatta 2100

tggtaatatc aataatttca cgtttgccat tacgaataaa gcaaatggga aaaaagccga 2160

agcattaatt aagttagcag atttcttata tactgaagaa ggaaccatga tgacagctag 2220

aggtaaggaa ggcgttcatt ggaaaaaggg cggtccggat gatattgatt taactggcaa 2280

acaagcaaaa tatgccatca ttcctagcga ccctaacgag aaagaggaag acaaggtaga 2340

atatggctgg ggagaaagag gtcctctggc actaactagg acacttaggg actccattgc 2400

tgcagaaaca gatgagctgt cctcaaaggg ctatgaaaga agattatata atgcaacact 2460

aaaatatgag ggatttgaac cgaaggaaca atttaatttt gaagcggcat gggttgatcc 2520

taaaaaagca gacgaagtga atctgttaaa aatcaatatt aataaataca tccaagaaaa 2580

tcttgttcaa ttcgtgacag gttcaaagaa catcgataaa gactgggata agtacgttga 2640

cggttttaaa gcattacagg ttgaccgcta tctagaaatc tatcaaaaag cgtatgatgt 2700

cggaaagtaa tacttgaaca ttacaaaaaa agaatacact taagttttat tctggcgtgt 2760

attctttttt cttttgaaaa gggggatgat gtccaatatg ttaaaagtga aagaaaaatt 2820

tgtttataca ccacctaaaa acgggtatcc ggagtggaat aataatccgg aaattttcca 2880

gctcaattgt ttgcctgcac atgctacgag tatgccgttt ttgtcggtga aagatgcaat 2940

aacattagat cgattggagt cttcgttctg taaatgtttg aatggggaat ggaaattttc 3000

attttcagag aatccggcaa atcgaaatcc tgattttttt aaaatgggat ttgatgaatg 3060

tgagatgaaa ccgattcaag ttccttccca ttggcaattt cagggctatg attatccgca 3120

gtatacgaat gtccgttatc catgggaaga gcaagaagtt ttaaagcctc cctttgcacc 3180

gacaaaatat aatcccgtag gtcaatacat tacatatttt gatatcccga aggattgggg 3240

agatcagccg gtatatattc attttgcagg ggtggaatcc gctttttacg tgtggataaa 3300

tggcgattta gttggttaca gtgaagatag ttttactcct agtgagtttg atctaactcc 3360

ttatttagta gaaggaacga ataaactggc ggtagaagtt tatcgctgga gtgatgccag 3420

ttggttagag gaccaggatt tttggcgatt aagtggtatt ttcagggatg tatatctgta 3480

taccacaccg ctagtacatg tttcggatta ttttgtacgt acagatctag atgaaaatta 3540

taaagatgca gaactagttg taaatatgaa agtatcgaat tatggcagta tgtttgagga 3600

gcctgttact atcgaagcac atttaattga tcatacaggc tacaaagtat ttagcgaggt 3660

tatggtagag cgacatatac aaacagtaga ggaaaatgag ttatgctttt taaaaaaaat 3720

atcttctccc ctcctgtgga gtgcggagca gccaatgctt tatacatttg ttattaccgt 3780

gaaaactata gatggttcga tattggaagc gcaaagctgt aaagtgggct ttcgtaaatt 3840

tgaattaaag gatggcctga tgctgattaa tggcaaaagg atattgttta acggtgtaaa 3900

tcgtcatgag ttttctcatc tgcgcggtcg ctctgtcaca aaagaggata tgcttcatga 3960

tgtcatcgaa atgaaaaagc ataatattaa tgctgtgaga acttctcatt atccaaacca 4020

tccctattgg tatgatttat gtgatcaata tggtttatat gtaatcgatg aaactaattt 4080

agaaacgcat ggtacatggt cttatggtca gaatcaaatt caaaatgcca ttccgggaga 4140

taaggaagag tggacagcca atgtgatcga tcgctgtcat tccatgctgc atcgggataa 4200

gaatcatccg tgcattctaa tttggtcgct cggaaatgaa tctttcggcg gaaccaattt 4260

tattaaaatg aaagatcata tcaaaaagga ggacccaact cgccttgttc actacgaagg 4320

ggtagcccat tatcgtgctt caagtgaggc ttcggaaatt gaaagtatga tgtacgaaca 4380

tccttcaaaa ctcgaagcct atgccctaag tgcagaaagc agtgaagtgc cgctgaagcc 4440

atatattatt tgtgagtatg cacatgcaat ggggaattct gtaggaaatc tctatcaata 4500

tactgatcta tttaataagt atccaatttt acagggaggt tttatttggg attataaaga 4560

tcaagccatt caaaccatct ctgaaaccgg aacaccgtat ttagcttatg ggggagattt 4620

tggagaatcg ccgaacgacg gtaatttttg cggcaatggc ctgttatttg cagatgggtc 4680

tttaacacct aaaatctttg aagtaaaaaa atgctatcag ccaattgatg tccgaattga 4740

gcatgatgta tttaccgtca tcaataagca cttattcact gacgtaaacg aatatgaggc 4800

aaggtggacc atacttaaag atggggaaga gattgcgagt gaaagcataa gtatttcctg 4860

taagccgcta tcatctacat tgatagatct taaaaatgta ttgtcaaaat atgtaatgga 4920

tgatcatgaa tatattataa ctattagttt tcacactgtt aaagatagcc tttgggctca 4980

aaagggttat gaaatagcct ttgatcaatt tgttctaaca aatcgaatca ttgcccagag 5040

agtaccgagc atgtctatta aacgtattga aaagacaaac gataatttga aaattgaggg 5100

tgaaacattc tccgttattg taagtaaaac atcaggattc ataacttctt tcgtaaaaca 5160

gggtgtagag attttagctg agccaattgt tccgaatttc tggagggctc ttaccgataa 5220

tgaccgtggg aataaattag gtgagcgtac aggaatttgg gaacaggcgg gaaaaacggc 5280

cgttttgcaa cagatggatg tagaggaaat ggataaaacg gttcatatta aaaccgtact 5340

tcaattacaa acttcacctg cttcagtttg tagtattgat tatgaaataa ctggagacgg 5400

agaaattcat gttgcgtttg aacttcagcc tggtgatggg ttgccggaaa ttcctgaaat 5460

cgggatgatc ctgcctttag tcaaatcgtt tgaggctatt tcttggtacg gaaaaggtcc 5520

tcatgaaaat tattgggacc gtgaaaaggg ggcaaaaatt ggccgctatg tatcgacagt 5580

ggaaaatgag tttacaccat atctaaaacc acaagaaaat gggaataaaa tcggagtccg 5640

ctcgtttgaa attggggatg gccgtggaat aatcctccgt gtttcaagtg attcattatt 5700

agaaattaat gcaggtgcct attcggcaac agaattacag gaagcagccc atacgtatca 5760

gctgcctgaa agaacaaaaa cgtatttacg cgtaaaccat aagcaaatgg ggattggcgg 5820

agatgattct tgggctgcaa agacccatcc ggaattcact ttatattctg atcatactta 5880

tcaatattca tttaccttac actaataaaa aagtagaaat gggagattta ttaaatgaat 5940

cttttaacct ataggaaagc ggcaaaggga tggacagagg ctctcccgct cggaaacggc 6000

agaattggtg caatgcactt cggaggggtg gagacagaac gatttcagtt aaatgaggac 6060

acattgtggt ctggcccgcc gcaaagcaat aaagaataca acgatcaagc atctttaaaa 6120

agggtaaggc agctgctcga tgaagagaaa tacgaagagg ccaatgacga gacaaagaat 6180

atgtttggtc cgtatacaca aagctatatg cctttgggga atttattcat tcaataccag 6240

cacggtgaca cagcacagaa ttatcatcgg acacttgata ttaaagaggc aatctccaat 6300

gtcaaatata ctattggaaa aattgactac acaagggaag cgtttatttc acatccgcat 6360

gaagtattag ctgtccggct gaccagctct gttcccaaac aattaaactt gataatttca 6420

ttggatagct tattaaaata taaaacttcg gatatatctg acgggttagt tttacaaggg 6480

gtttgtcctg aaagatgtga tcctgtttat tttcatgaga acgaacagcc tgttatttac 6540

ggtgagtttg gtgaaacaaa agcgattcat tttgagggaa ggctggctgc tgttgttgaa 6600

gatgggcaag tggaatcatc aaaagggaat ctaacgatcc agcatgcaac aacagccgtt 6660

ttatattttt ctgttgcgac atcttttaac gggtttgatc aacttccggg aacagatttc 6720

gaagagttaa c 6731

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

aaaaatgtca caattaacgt atga 24

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

aaaactgcag ttagtgtaag gtaaatgaat 30

Claims (14)

1.一种β-半乳糖苷酶，其中，其由序列号1的氨基酸序列构成。

2.一种基因，其中，其编码权利要求1所述的β-半乳糖苷酶。

3.根据权利要求2所述的基因，其中，编码上述β-半乳糖苷酶的基因由序列号2的碱基序列构成。

4.一种重组载体，其中，其包含权利要求2所述的基因。

5.一种重组微生物，其中，权利要求2所述的基因或者权利要求4所述的重组载体插入在宿主细胞中，该宿主细胞选自于由细菌和真菌所组成的组中。

6.如权利要求5所述的重组微生物，其中，所述真菌是酵母。

7.一种β-半乳糖苷酶的制造方法，其中，其包括：

培养权利要求5或6所述的重组微生物生成β-半乳糖苷酶的步骤；以及

回收上述生成的β-半乳糖苷酶的步骤。

8.一种低聚半乳糖的制造方法，其中，其包括：

将权利要求1所述的β-半乳糖苷酶和含有乳糖的基质反应制造低聚半乳糖的步骤；以及

回收上述制造的低聚半乳糖的步骤。

9.权利要求8所述的低聚半乳糖的制造方法在制造低聚半乳糖中的应用，其中，所述低聚半乳糖是选自于由液态奶、干燥粉末牛奶、冰淇淋、酸奶、奶酪、燕麦片、面包、饼干、蛋糕、动物饲料、药剂所组成的组中的一种的组成成分。

10.权利要求8所述的低聚半乳糖的制造方法在制造低聚半乳糖中的应用，其中，所述低聚半乳糖是选自于由婴幼儿牛奶、糕点类、食品助剂、家畜饲料所组成的组中的一种的组成成分。

11.权利要求8所述的低聚半乳糖的制造方法在制造低聚半乳糖中的应用，其中，所述低聚半乳糖是选自于由婴幼儿配方奶粉、饮料、膳食补充剂所组成的组中的一种的组成成分。

12.权利要求8所述的低聚半乳糖的制造方法在制造低聚半乳糖中的应用，其中，所述低聚半乳糖是选自于由乳制品、益生菌食品材料所组成的组中的一种的组成成分。

13.权利要求8所述的低聚半乳糖的制造方法在制造低聚半乳糖中的应用，其中，所述低聚半乳糖是婴幼儿食品的组成成分。

14.权利要求8所述的低聚半乳糖的制造方法在制造低聚半乳糖中的应用，其中，所述低聚半乳糖是益菌素食品材料的组成成分。