WO2010098561A2 - 고당전이 활성의 신규한 베타-갈락토시다제 및 그 용도 - Google Patents

고당전이 활성의 신규한 베타-갈락토시다제 및 그 용도 Download PDF

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WO2010098561A2
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반재구
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase

Definitions

  • the present invention provides Bagalus circulans- derived beta galactosidase II, a gene encoding the same, a recombinant vector containing the gene, a recombinant microorganism transformed with the gene or the recombinant vector, and a beta- using the recombinant microorganism. It relates to a method for producing galactosidase II and a method for producing galacto-oligosaccharides using the beta-galactosidase II.
  • Beta-galactosidase hydrolyzes non-reducing terminal beta-D-galactose from beta-D-galactopyranoside, such as lactose Or catalyze the transfer reaction of galactose.
  • the enzyme has two properties, hydrolytic activity and sugar transfer activity, both of which are industrially applicable.
  • Hydrolytic activity hydrolyzes lactose in milk and dairy products to prevent lactose intolerance and enhances sweetness.
  • Sugar transfer activity is used to prepare galactooligosaccharides that promote the growth of lactobacillus, a useful microorganism in the human intestine. .
  • Beta-galactosidase is found in a variety of microorganisms, plants, and animals, but the majority of beta-galactosidase currently used industrially is isolated from microorganisms. Beta-galactosidase with different specificity of sugar transfer reaction was isolated from Bacillus genus, Aspergillus genus, Saccharomyces genus and other heat-resistant enzymes. Various studies have been conducted.
  • beta-galactosidase used in the production of galactooligosaccharides worldwide is mostly derived from Bacillus or Aspergillus, especially from Bacillus, specifically, from beta-galactosidase derived from Bacillus Circulans. It is one of the most used commercially because of the activity temperature of 60 °C and high sugar transfer activity, in particular, beta-galactosidase derived from Bacillus Circulans ATCC 31382 is sold under the name BIOLACTA (Daiwa Kasei) .
  • BIOLACTA Dia Kasei
  • beta-galactosidase II has been found to have the best sugar transfer activity (Amedeo V., et al., Biochim Biophys Acta ., 10; 1380 (2): 223-31., 1998 ).
  • beta-galactosidase III of the three subtypes has been identified (Ito Y., et al., Biosci Biotechnol Biochem ., 61 (8): 1270-6., 1997). The base sequences of the genes of galactosidase I and II have not been reported yet.
  • the present inventors have made diligent efforts to develop beta-galactosidase having excellent galactooligosaccharide production ability from lactose.
  • the gene sequence of beta-galactosidase II having excellent sugar transfer activity in Bacillus circus ATCC 31382 has been studied. It was confirmed that the present invention was completed.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing beta-galactosidase II and a method for preparing galactooligosaccharide using the recombinant microorganism.
  • the present invention provides a beta-galactosidase II having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and genes or fragments thereof.
  • the present invention also provides a recombinant vector containing the gene encoding the beta-galactosidase II or a fragment thereof.
  • the present invention also provides a recombinant microorganism into which the gene or recombinant vector is inserted.
  • the present invention also comprises the steps of culturing the recombinant microorganism to express beta-galactosidase II; And it provides a method for producing beta galactosidase comprising the step of recovering the expressed beta-galactosidase II.
  • the present invention also comprises the steps of reacting the beta-galactosidase II with a lactose-containing substrate to produce galactoligosaccharides; And it provides a method for producing galactoligosaccharides comprising the step of recovering the prepared galactoligosaccharides.
  • Figure 1 shows the results of SDS-PAGE of BIOLACTA N5 (Daiwa Kasei) to identify beta-galactosidase II protein fragments (B: BIOLACTA N5, M: protein size marker, arrow: putative 145kDa position) .
  • Figure 2 is an electrophoresis picture of PCR performed with degenerate primers (M: DNA 1kb plus ladder, 1: degenerated PCR product).
  • Figure 3 is an electrophoresis picture after inverse PCR to secure beta-galactosidase II gene (M: DNA 1kb plus ladder, 1: MluI , 2: NotI , 3: SacI , 4: XmaI , 5: XhoI , 6: SpeI , 7: AflII , 8: AgeI , 9: ApaI , 10: ApaLI , 11: AscI , 12: BamHI , 13: BclI , 14: MfeI , 15: PvuI , 16: SphI , arrows: inverse PCR product).
  • M DNA 1kb plus ladder, 1: MluI , 2: NotI , 3: SacI , 4: XmaI , 5: XhoI , 6: SpeI , 7: AflII , 8: AgeI , 9: ApaI , 10: ApaLI , 11: AscI
  • Figure 4 is a schematic diagram showing the size and location of the ORF in the beta-galactosidase II gene sequence according to the present invention confirmed by inverse PCR.
  • FIG. 5 shows the results of SDS-PAGE confirming the protein expression profile of recombinant beta-galactosidase II produced in the transformed recombinant strain E. coli JM109 / pACE-BgaII (M: protein size marker, 1: E. coli JM109 / None 2: E. coli JM109 / pACE-BgaII, 3: BIOLACTA N5 (Daiwa Kasei), arrow: beta-galactosidase II).
  • Figure 6 shows the optimal temperature of recombinant beta-galactosidase II produced in the transformed recombinant strain E. coli JM109 / pACE-BgaII.
  • beta-galactosidase II having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and genes encoding the same, preferably beta-galactosidase II derived from Bacillus circulans and It relates to a gene encoding it.
  • Bacillus Circulans (specifically, Bacillus Circus ATCC 31382) reports the presence of three structural isoforms, beta-galactosidase I, beta-galactosidase II, and beta-galactosidase III Among these subtypes, beta-galactosidase II is known to have the best sugar transfer activity.
  • an electrophoretic band of a protein presumed to be beta-galactosidase II is obtained from the Bacillus Circus (ATCC 31382), an amino acid sequence is obtained from an electrospray ionization (ESI) analysis, and the amino acid sequence is used.
  • Degenerate primers are prepared and gene fragments are obtained by PCR using the primers.
  • a gene different from the known beta-galactosidase is selected and inverse PCR method.
  • the species of the beta-galactosidase II gene isolated from the present invention A comparison of amino acid sequence homology with the beta-galactosidase gene was performed using the BLASTN program. As a result, the amino acid sequences of the first ORF inferred to be beta-galactosidase were compared. Sequences with over 100 homology were retrieved. The highest homology was 47% with Streptococcus pneumoniae , 47% with Streptococcus gordonii , and 46% with Streptomyces coelicolor .
  • Fig. 47 The homology with beta-galactosidase reported in Fig. 47 indicates that the beta-galactosidase II gene of Bacillus circulose ATCC 31382 according to the present invention was previously reported beta-galactosidase. It was confirmed that the novel sequence has an amino acid sequence that is very different from the gene.
  • beta-galactosidase II may not only have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, which is a gene encoding the same, but any one of these sequences Mutation, resulting in substitution, deletion, insertion and addition of an amino acid or base sequence of at least 70%, 80%, 90%, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or An amino acid sequence or nucleotide sequence having at least 95% sequence identity is also a variant having the activity of the beta-galactosidase II, and is included in the scope of the present invention.
  • sequence identity refers to sequence similarity of two polynucleotide residues.
  • sequence identity can be determined by comparing two nucleotide sequences aligned optimally over a region of the base sequence to be compared.
  • the polynucleotide to be compared may have additions or deletions (for example, gaps, overhangs, etc.) as compared with reference sequences (for example, consensus sequences, etc.) for optimal alignment of two sequences.
  • the numerical value of sequence identity determines the same nucleic acid base which exists in both sequences, determines the number of suitable sites, and then divides the number of suitable sites by the total number of bases in the sequence region to be compared, By multiplying 100, it can be calculated.
  • Sequence identity between nucleic acids is measured using, for example, sequence analysis software, specifically BLASTN, FASTA, and the like. The BLASTN is generally available at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
  • the present invention relates to a recombinant vector comprising a gene encoding the beta galactosidase II.
  • vector refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing DNA in a suitable host.
  • Vectors can be plasmids, phage particles or simply potential genomic inserts. Once transformed into the appropriate host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are currently the most commonly used form of vectors, “plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably in the context of the present invention. For the purposes of the present invention, it is preferred to use plasmid vectors.
  • Typical plasmid vectors that can be used for this purpose include (a) a replication initiation point that allows for efficient replication to include hundreds of plasmid vectors per host cell, and (b) host cells transformed with the plasmid vector. It has a structure comprising an antibiotic resistance gene and a restriction enzyme cleavage site (c) allows foreign DNA fragments to be inserted. Although no suitable restriction enzyme cleavage site is present, the use of synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods can facilitate ligation of the vector and foreign DNA.
  • the gene is "operably linked" when placed in a functional relationship with other nucleic acid sequences.
  • This may be genes and regulatory sequence (s) linked in such a way as to enable gene expression when appropriate molecules (eg, transcriptional activating proteins) bind to regulatory sequence (s).
  • DNA for a pre-sequence or secretory leader is operably linked to DNA for a polypeptide when expressed as a shear protein that participates in the secretion of the polypeptide;
  • a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when positioned to facilitate translation.
  • "operably linked” means that the linked DNA sequences are in contact, and in the case of a secretory leader, are in contact and present within the reading frame. Linking of these sequences is performed by ligation (linking) at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods are used.
  • the present invention relates to a recombinant microorganism into which the gene or the recombinant vector is inserted, that is, a gene encoding the beta-galactosidase II is inserted on a chromosome or transformed with the recombinant vector.
  • the transformed recombinant microorganism host cells having high DNA introduction efficiency and high expression efficiency of introduced DNA are commonly used, and all microorganisms including prokaryotic and eukaryotic cells can be used such as bacteria, yeast, and fungi.
  • E. coli is used, but not limited thereto, and any kind of microorganism may be used as long as the beta-galactosidase II can be sufficiently expressed.
  • the transformed recombinant microorganism may be prepared according to any transformation method.
  • transformation of the present invention introduces DNA into a host cell so that the DNA can be reproduced as a factor of a chromosome or by completion of chromosome integration. It means a phenomenon.
  • transformation methods include electroporaton, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, lithium acetate-DMSO method, and the like.
  • vectors function equally to express the DNA sequences of the present invention
  • hosts function equally for the same expression system.
  • one of ordinary skill in the art may, without departing from the scope of the present invention without undue experimental burden, select appropriately among other vectors, expression control sequences and hosts.
  • a host should be considered, since the vector must be replicated therein, and the number of copies of the vector, the ability to control the number of copies and other proteins encoded by the vector, e.g. Expression of antibiotic markers should also be considered.
  • a commonly known gene manipulation method may be used as a method of inserting the gene on the chromosome of the host cell.
  • a commonly known gene manipulation method may be used.
  • a retroviral vector an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, and herpes simplex.
  • the present invention relates to a method for preparing beta-galactosidase II using the transformed recombinant microorganism, and specifically, to culture beta-galactosidase II by culturing the recombinant microorganism. step; And it relates to a method for producing beta-galactosidase II comprising the step of recovering the expressed beta-galactosidase II.
  • Cultivation of the transformed recombinant microorganism is carried out according to well-known methods, conditions such as the culture temperature and time, the pH of the medium can be appropriately adjusted.
  • Beta-galactosidase II from the cultured recombinant microorganisms can be accomplished by conventional biochemical separation techniques such as treatment with protein precipitants (salting), centrifugation, ultrasonic disruption, ultrafiltration, dialysis, molecular sieves.
  • Various chromatography such as chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. can be used, and these are usually used in combination to separate proteins of high purity.
  • the present invention comprises the steps of preparing the galactooligosaccharide by reacting the beta-galactosidase II prepared above with a lactose-containing substrate; And it relates to a method for producing galacto-oligosaccharides comprising the step of recovering the prepared galacto-oligosaccharides.
  • Beta-galactosidase but it is not limited to, Bacillus (Bacillus) genus Bifidobacterium (Bifidobacterium), A Streptococcus (Streptococus) genus Aspergillus (Aspergillus), A penny room Solarium (Penicillium) in , an enzyme in the generation, secretion of intracellular or cell when cultured in the my process (Saccharomyces) genus, Cryptococcus Rhodococcus (Cryptococus) in Chloe Vero my three microorganisms such as (Kluyveromyces) in a saccharose lactose as a carbon source, usually It acts on lactose to combine 1 to 3 galactose to produce galactoligosaccharides, and concomitantly produces glucose and small amounts of galactose.
  • Bacillus Bacillus (Bacillus) genus Bifidobacterium
  • the galactoligosaccharide of the present invention defines a galactoligosaccharide more than the disaccharides other than lactose of glucose, galactose and disaccharides, which are monosaccharides, in the product from the lactose substrate.
  • O-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside O-Nitrophenyl- ⁇ -D-Galactopyra
  • Beta galactosidase of has a substrate specificity has the advantage that can be easily and quickly determined.
  • the activity of the enzyme can confirm the concentration of free O-nitrophenol at absorbance at 420 nm
  • beta-galactosidase 1 unit is an enzyme that releases 1 ⁇ mol of O-nitrophenol per minute under the above conditions Determined by the amount.
  • the dose of beta-galactosidase II for galactoligosaccharide synthesis is an activity using O-nitrophenol relative to the lactose substrate, which is final when beta-galactosidase II is mixed with the substrate.
  • the concentration should be 1 ⁇ 3U / ml.
  • the lactose-containing substrate refers to a lactose solution of 30 to 60% (w / v), preferably 45 to 55%, most preferably 50%.
  • the galactooligosaccharide is liquid milk, dry powder milk, infant milk, baby formula, ice cream, yogurt, cheese, dairy products, beverages, baby food, cereals, bread, biscuits, confectionery, cakes, food supplements, Dietary supplements, probiotic foodstuffs, prebiotic foodstuffs, animal feed, livestock feed, pharmaceuticals and the like.
  • probiotic means a dietary supplement containing lactic acid bacteria, which are most commonly used by the most common pathogens, and which contain potentially beneficial bacteria or yeasts.
  • Probiotics have long been used in the food industry because they can convert other carbohydrates and sugars into lactic acid.
  • Probiotics not only provide the sour taste of fermented dairy products such as yogurt, but also rebuild damaged tissue for growth and lower the pH to act as a preservative.
  • the most common forms of probiotics are fermented dairy products and foods fortified with probiotics. Lactic acid bacteria such as Kefir (milk fermented beverages), yogurt, Sauerkraut (fermented German kimchi), and Korean kimchi have been shown to be similar to the health effects of probiotics.
  • Prebiotics also limit the number of bacteria in the colon and selectively stimulate the growth of bacteria, which are beneficial to the human body and are composed of small sugars that are not digested in the body.
  • Prebiotics are anticancer, antimicrobial, hypolipidemic and glucose-modulating.
  • Prebiotics limit the number of bacteria in the colon and can optionally be defined as food components that are beneficial to the human body by stimulating their growth and are not digested by the body.
  • oligosaccharides contains fructo-oligosaccharides, inulin, Isomalto-oligosaccharides, Lactilol, Lactosucrose, Lactulose, Pyrodextrins, Soy oligosaccharides, Xylo-oligosaccharides. They are mainly called bifidogenic factors and stimulate the growth of bifidobacteria.
  • Example 1 Securing the beta-galactosidase II gene sequence according to the present invention
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
  • SDS-PAGE buffer 25 mM Tris-base, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3.
  • Diluted samples were mixed with 5 ⁇ sample buffer (60 mM Tris-HCl pH 6.8, 25% glycerol, 2% SDS, 14.4mM 2-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue) and used for heat treatment at 100 ° C. for 5 minutes.
  • the electrophoresis device was a Bio-Rad, Mini-Protean II apparatus. Samples developed on acrylamide gel were decolorized after performing Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining.
  • CBB Coomassie Brilliant Blue
  • Bacillus Circus ATCC 31382 was cultured in a basal medium of LB (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) medium and 500 ⁇ g of genomic DNA was isolated from the cultured cells (Genomic DNA extraction kit; RBC). .
  • PCR was performed using the isolated genomic DNA as a template and degenerate primers of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, and as shown in FIG. 2, PCR products of approximately 1600 bp and 300 bp were identified.
  • the PCR products were ligated to TOPcloner TA (Enzynomics) vector and then transformed into E. coli JM109 strain by heat shock at 42 ° C.
  • Inverse (inverse) PCR is a PCR method capable of determining the entire nucleotide sequence of a target gene in a simple process and short time based on the base sequence of the gene fragment, Bacillus circulator pullulans ATCC 31382 MluI genomic DNA, NotI, SacI, XmaI , XhoI, SpeI, AflII, AgeI, ApaI, ApaLI, AscI, BamHI, BclI, MfeI, PvuI and SphI , respectively, cut and purified (Gel / PCR DNA Extraction Kit) RBC) By self ligation, the DNA fragments are changed from linear DNA to circular DNA. The ligation mixture was purified (Gel / PCR DNA Extraction Kit; RBC) and used as a template for inverse PCR.
  • Inverse PCR primers of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 were prepared based on the 1600 bp gene sequence of the beta-galactosidase II derived from Bacillus circus ATCC 31382 obtained above. PCR was performed.
  • the product obtained through the PCR process was confirmed by agarose electrophoresis.
  • approximately 6000 bp and 2000 bp of inverse PCR products were observed only in the restriction enzyme treatment groups of SpeI and ApaLI (FIG. 3).
  • the DNA size can be thought of as 4000 bp or more. Therefore, the 6000 bp inverse PCR product generated from SpeI restriction enzyme treatment was cloned into TOPcloner TA (Enzynomics) vector to determine the nucleotide sequence.
  • Recombinant vectors and recombinant microorganisms were prepared using the beta-galactosidase II gene sequence of Bacillus circus ATCC 31382 obtained in Example 1 above. Based on the nucleotide sequence of the beta-galactosidase II gene, primers of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 were prepared as follows.
  • the genomic DNA of Bacillus circus ATCC 31382 was used as a template, and PCR was performed using primers of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11. After purification of the PCR product, the restriction enzyme sequences XmaI and KpnI inserted into the respective primers were inserted into the same restriction enzyme site in the pACE (GenoFocus) vector to prepare a vector named pACE-BgaII. The vector was transformed into E. coli JM109 strain.
  • Recombinant beta-galactosadase II was prepared using the recombinant strain transformed in Example 2 ( E. coli JM109 / pACE-BgaII).
  • the pACE (GenoFocus) vector can produce recombinant protein with cell growth and protein expression separated by microbial culture without the need for the addition of an additional inducer for protein expression.
  • 1 ml Erlenmeyer flask containing sterile 100 ml LB (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) medium was inoculated with 5 ml of the transformed recombinant strain culture which had been fully seeded the day before. And incubated at 30 ° C. at 200 rpm for 24 hours.
  • the transformed recombinant strain was cultured was separated from the culture by centrifugation, and diluted again to the appropriate concentration in sterile distilled water.
  • Recombinant strain transformed with an ultrasonic mill (VibraCell) was disrupted and centrifuged to finally separate cell debris and beta-galactosidase II.
  • a band of about 145 kDa beta-galactosidase II was confirmed.
  • Hanging BIOLACTA N5 in lane 3 was walked together to demonstrate that the band at 145kDa position, which was not seen in the control (lane 1), was a beta-galactosidase II band.
  • Beta-galactosidase activity was determined by dissolving O-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside in various buffers and using it as a substrate. The reaction was stopped and developed using 10% (w / v) sodium carbonate (Na 2 CO 3 ) after the reaction.
  • the activity of the enzyme confirmed the concentration of free O-nitrophenol at absorbance at 420 nm.
  • One unit of beta-galactosidase was determined by the amount of enzyme that liberates 1 ⁇ mol of O-nitrophenol per minute under these conditions.
  • Each substrate and sample was prepared with 0.1 M citric acid buffer at pH 3, 4, and 5, and 0.1 M phosphoric acid buffer at pH 6, 7, 8, and pH 9, 10 for optimal pH.
  • Conditions were prepared with Tris buffer.
  • the optimum temperature of the beta-galactosidase II prepared in Example 3 was 30-80 ° C., the optimum active temperature was 50 ° C., and as shown in FIG. 7, the optimum pH was 6.0. (FIG. 6 and FIG. 7).
  • Galactooligosaccharide was synthesized using beta-galactosidase II obtained in Example 3.
  • lactose was dissolved by applying high temperature to 50 mM phosphate buffer (pH 6.0) at a concentration of 500 g / L.
  • 500 ml of 500 g / L lactose solution was added to a 1 L reactor, the reaction temperature was fixed at 60 ° C., and the stirring speed was maintained at 100 rpm.
  • the dose of beta-galactosidase II was administered so that the final concentration was 2 units (U / lactose g). Synthesis time was performed for 24 hours.
  • the analysis of galactoligosaccharides was determined by HPLC (Agilent) with RI detector using a Polyamine II (YMC) column. At this time, the mobile phase was used so that the ratio of acetonitrile and purified water was 65% / 35% (v / v). The flow rate of the mobile phase was 1.0 ml / min.
  • the analysis results of galactooligosaccharide after the reaction was completed are shown in Table 2, and the HPLC chromatogram was as shown in FIG. 8.
  • the conversion rate of galactooligosaccharide was calculated as follows. The amount expressed below represents the peak area measured by HPLC and defines the galactoligosaccharide as the sugar or more sugars except for the monosaccharides glucose, galactose and disaccharide lactose in the product from the lactose substrate.
  • Conversion rate refers to the ratio of the generated oligosaccharide concentration to the injected lactose concentration.
  • The% content is the ratio for each sugar in the sum of the total sugars (glucose, galactose, lactose and oligosaccharides). Therefore, the conversion rate of galactooligosaccharide by beta-galactosidase II according to the present invention was found to be excellent as 63.4%.
  • beta-galactosidase II derived from Bacillus circulans according to the present invention and a gene encoding the same, by producing beta-galactosidase II having excellent sugar transfer activity in beta-galactosidase This is useful because it enables efficient mass production of galactooligosaccharides.

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Abstract

본 발명은 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans) 유래 베타갈락토시다제 II, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 상기 유전자 또는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제 II의 제조방법 및 상기 베타-갈락토시다제 II를 이용한 갈락토올리고당의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바실러스 서큘란스 유래 베타-갈락토시다제 II 및 이를 코딩하는 유전자를 이용하여 베타-갈락토시다제 중 당 전이 활성이 우수한 베타-갈락토시다제 II를 생산함으로써, 갈락토올리고당의 효율적인 대량 생산이 가능함으로 유용하다.

Description

고당전이 활성의 신규한 베타-갈락토시다제 및 그 용도
본 발명은 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans) 유래 베타갈락토시다제 II, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 상기 유전자 또는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제 II의 제조방법 및 상기 베타-갈락토시다제 II를 이용한 갈락토올리고당의 제조방법에 관한 것이다.
베타-갈락토시다제(β-galactosidase)는 유당과 같은 베타-D-갈락토피라노사이드(β-D-galactopyranoside)에서 비환원 말단 베타-D-갈락토스(β-D-galactose)를 가수분해하거나, 갈락토스(Galactose)의 전이반응을 촉매한다. 일반적으로 이 효소는 가수분해 활성과 당 전이 활성의 두 가지 특성을 가지고 있는데, 모두 산업적으로 응용성이 있다. 가수분해 활성은 우유와 유제품의 유당을 가수분해하여 유당 불내증을 막아주며 감미도를 높여 주고, 당 전이 활성은 인간의 장내 유용미생물인 유산균의 성장을 증진시키는 갈락토올리고당(Galactooligosaccharide)의 제조에 이용된다.
베타-갈락토시다제는 여러 종류의 미생물, 식물, 그리고 동물에서 발견되나, 현재 산업적으로 이용되는 대다수의 베타-갈락토시다제는 미생물에서 분리된 것이다. 당 전이 반응의 특이성이 다른 베타-갈락토시다제가 바실러스(Bacillus) 속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 등에서 분리되었으며, 그 외의 고온성 미생물에서 분리된 내열성 효소에 관한 연구도 다양하게 진행되었다.
현재 전세계적으로 갈락토올리고당 생산에 사용되는 베타-갈락토시다제는 바실러스 또는 아스퍼질러스 유래의 것이 대다수이며, 특히 바실러스 유래, 구체적으로, 바실러스 서큘란스 유래의 베타-갈락토시다제는 50~60℃의 활성온도와 높은 당 전이 활성 때문에 상업적으로 가장 많이 사용되는 것 중의 하나이고, 특히, 바실러스 서큘란스 ATCC 31382 유래의 베타-갈락토시다제는 BIOLACTA(Daiwa Kasei사)라는 제품명으로 판매되고 있다. 상기 효소는 적절한 배양배지에 바실러스 서큘란스를 배양시킨 후, 세포파쇄 또는 배양배지로부터 회수하는 방법으로 생산된다고 알려져 있다.
또한, 바실러스 서큘란스 ATCC 31382 유래의 베타-갈락토시다제의 특성은 여러 문헌에 보고되어 있다. 상기 미생물에는 3개의 구조적 아형(Isoform)의 베타-갈락토시다제가 존재한다고 보고 하였으며, 단백질 크기에 따라 212 kDa의 베타-갈락토시다제 I, 145 kDa의 베타-갈락토시다제 II, 그리고 86 kDa의 베타-갈락토시다제 III로 명명된다. 상기 3가지 아형 중에서 베타-갈락토시다제 II가 당 전이 활성이 가장 우수한 것으로 판명되고 있다(Amedeo V., et al., Biochim Biophys Acta., 10;1380(2):223-31., 1998). 또한, 상기 3가지 아형 중 베타-갈락토시다제 III의 유전자 염기 서열은 밝혀졌으나(Ito Y., et al., Biosci Biotechnol Biochem., 61(8):1270-6., 1997), 베타-갈락토시다제 I과 II의 유전자의 염기 서열은 아직까지 보고된 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 락토스로부터 갈락토올리고당 생산능이 우수한 베타-갈락토시다제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 바실러스 서큘란스 ATCC 31382에서 당 전이 활성이 매우 뛰어난 베타-갈락토시다제 II의 유전자 염기 서열을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 베타-갈락토시다제 II, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제 II의 제조방법 및 갈락토올리고당의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 베타-갈락토시다제 II 및 이를 코딩하는 유전자 또는 그 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 베타-갈락토시다제 II를 코딩하는 유전자 또는 그 단편을 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 삽입된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 베타-갈락토시다제 II를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-갈락토시다제 II를 회수하는 단계를 포함하는 베타갈락토시다제의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 베타-갈락토시다제 II를 락토스 함유 기질과 반응시켜 갈락토올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 갈락토올리고당을 회수하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.
도 1은 베타-갈락토시다제 II 단백질 단편을 확인하기 위하여, BIOLACTA N5(Daiwa Kasei사)의 SDS-PAGE 수행 결과이다 (B: BIOLACTA N5, M: 단백질 사이즈 마커, 화살표: 추정상의 145kDa 위치).
도 2는 디제너레이트 프라이머로 PCR을 수행한 전기영동 사진이다 (M: DNA 1kb 플러스 래더, 1: 디제너레이트된 PCR 산물).
도 3은 베타-갈락토시다제 II 유전자 확보를 위한 인버스 PCR 후 전기영동 사진이다 (M: DNA 1kb 플러스 래더(ladder), 1: MluI, 2: NotI, 3: SacI, 4: XmaI, 5: XhoI, 6: SpeI, 7: AflII, 8: AgeI, 9: ApaI, 10: ApaLI, 11: AscI, 12: BamHI, 13: BclI, 14: MfeI, 15: PvuI, 16: SphI, 화살표: 인버스 PCR 산물).
도 4는 인버스 PCR로 확인된 본 발명에 따른 베타-갈락토시다제 II 유전자 염기서열 내 ORF의 크기 및 위치를 나타낸 모식도이다.
도 5는 형질전환된 재조합 균주 E. coli JM109/pACE-BgaII에서 생산된 재조합 베타-갈락토시다제 II의 단백질 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다 (M: 단백질 사이즈 마커, 1: E. coli JM109/None 2: E. coli JM109/pACE-BgaII, 3: BIOLACTA N5(Daiwa Kasei사), 화살표: 베타-갈락토시다제 II).
도 6은 형질전환된 재조합 균주 E. coli JM109/pACE-BgaII에서 생산된 재조합 베타-갈락토시다제 II의 최적 온도를 나타낸 것이다.
도 7은 형질전환된 재조합 균주 E. coli JM109/pACE-BgaII에서 생산된 재조합 베타-갈락토시다제 II의 최적 pH를 나타낸 것이다.
도 8은 형질전환된 재조합 균주 E. coli JM109/pACE-BgaII에서 생산된 재조합 베타-갈락토시다제 II를 이용하여 갈락토올리고당의 합성후, HPLC로 분석한 크로마토그램이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은, 일 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 베타-갈락토시다제 II 및 이를 코딩하는 유전자, 바람직하게는, 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans) 유래의 베타-갈락토시다제 II 및 이를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
바실러스 서큘란스 (구체적으로, 바실러스 서큘란스 ATCC 31382)에는 3개의 구조적 아형(Isoform), 베타-갈락토시다제 I, 베타-갈락토시다제 II, 베타-갈락토시다제 III가 존재하는 것으로 보고되어 있고, 이들 아형 중 베타-갈락토시다제 II가 당 전이 활성이 가장 우수한 것으로 알려져있다.
본 발명에서는, 상기 바실러스 서큘란스(ATCC 31382)로부터 베타-갈락토시다제 II로 추측되는 단백질의 전기 영동 밴드를 얻어, ESI (electrospray ionization) 분석으로부터 아미노산 서열을 수득하고, 상기 아미노산 서열을 이용하여 디제너레이트(degenerate) 프라이머를 제작한 다음, 상기 프라이머를 이용하여 PCR 함으로써 유전자 단편을 얻는다. 이렇게 얻어진 유전자 단편의 염기서열을 유전자 은행 (GenBank)에 등록된 베타-갈락토시다제의 염기서열과 비교함으로써 기존에 알려진 베타-갈락토시다제와 상이한 유전자를 선별하고, 인버스(inverse) PCR법을 이용해 상기 베타-갈락토시다제 II 단편으로부터 전체 염기서열을 얻음으로써, 본 발명에 따른 베타-갈락토시다제 II를 코딩하는 유전자를 획득한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 베타 갈락토시다제 II 유전자의 아미노산 서열이 기존에 보고된 것과 다른 신규한 아미노산 서열임을 확인하기 위해, 본 발명에서 분리된 베타-갈락토시다제 II 유전자와 다른 종의 베타-갈락토시다제 유전자와의 아미노산 서열 상동성(homology) 비교분석을 BLASTN 프로그램을 이용하여 수행한 결과, 상기의 베타-갈락토시다제라고 유추되는 첫 번째 ORF의 아미노산 서열을 비교한 결과, 100 여개의 상동성을 가지는 서열이 검색되었다. 그 중 상동성이 가장 높은 것은 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)와 47%, 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii)와 47%, 스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor)와 46% 정도였으며, 기존에 보고된 베타-갈락토시다제와의 상동성이 47%를 나타내는 것으로 보아, 본 발명에 따른 바실러스 서큘란스 ATCC 31382의 베타-갈락토시다제 II 유전자는 기존에 보고된 베타-갈락토시다제 유전자와 아주 상이한 아미노산 서열을 가지는 신규한 서열임을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 베타-갈락토시다제 II는, 서열번호 1의 아미노산 서열과 이를 코딩하는 유전자인 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열을 가질 수 있는 것 뿐만 아니라, 이들 서열 중 어느 하나의 아미노산 또는 염기 서열이 치환, 결실, 삽입 및 부가되어 돌연변이가 일어남으로써, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 상기 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열 또는 염기서열 또한 상기 베타-갈락토시다제 II의 활성을 가지는 변이체로써, 본 발명의 범주에 포함된다.
상기 “서열 동일성”이란, 2개의 폴리뉴클레오티드간 잔기의 서열 유사성을 말한다. 상기 “서열 동일성”은 비교대상의 염기서열의 영역에 걸쳐, 최적한 상태로 얼라인먼트된 2개의 염기서열을 비교함으로써 결정될 수 있다. 여기에서, 비교대상의 폴리뉴클레오티드는, 2개의 서열의 최적한 얼라인먼트를 위한 참고서열 (예컨대 컨센서스 서열 등)과 비교하여, 부가 또는 결실 (예컨대, 갭, 오버행 등)을 갖고 있어도 된다. 서열 동일성의 수치는 양방의 서열에 존재하는 동일한 핵산염기를 결정하여, 적합부위의 수를 결정하고, 이어서, 비교대상의 서열영역 내의 염기의 총수로, 상기 적합부위의 수를 나누어, 얻어진 수치에 100을 곱함으로써, 산출될 수 있다. 핵산 사이의 서열 동일성은, 예컨대, 서열 해석 소프트, 구체적으로는 BLASTN, FASTA 등을 사용하여 측정된다. 상기 BLASTN은, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 일반적으로 이용할 수 있다.
본 발명은, 다른 관점에서, 상기 베타갈락토시다제 II를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서, “벡터 (vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현 시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물 일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드(plasmid)” 및 “벡터(vector)”는 때로 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백개의 플라스미드벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있도록 하는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation) 할 수 있다.
아울러, 상기 유전자는 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결(operably linked)” 된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들) 일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션 (연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본 발명은, 다른 관점에서, 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 삽입된, 다시말해, 상기 베타-갈락토시다제 II를 코딩하는 유전자가 염색체 상에 삽입되거나, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다.
상기 형질전환된 재조합 미생물은, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 통상 사용되며, 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 모든 미생물로서, 박테리아, 효모, 곰팡이 등이 이용가능하고, 본 발명의 실시예에서는 E. coli를 사용하였으나, 이에 한정되지 않고, 상기 베타-갈락토시다제 II가 충분히 발현될 수 있는 것이라면 어떠한 종류의 미생물이라도 무방하다.
상기 형질전환된 재조합 미생물은 임의의 형질전환 방법에 따라 제조할 수 있다. 본 발명의 “형질전환(transformation)”은 DNA를 숙주세포로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 일반적으로 형질전환방법에는 전기천공법(electroporaton), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 초산 리튬-DMSO법 등이 있다.
물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않고, 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 상태에서, 다른 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택하여 적용할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이고, 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
또한, 본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.
본 발명은, 또 다른 관점에서, 상기 형질전환된 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제 II의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로, 상기 재조합 미생물을 배양하여 베타-갈락토시다제 II를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-갈락토시다제 II를 회수하는 단계를 포함하는 베타-갈락토시다제 II의 제조방법에 관한 것이다.
상기 형질전환된 재조합 미생물의 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행되고, 배양 온도 및 시간, 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다.
상기 배양된 재조합 미생물로부터의 베타-갈락토시다제 II의 회수는 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.
본 발명은, 또 다른 관점에서, 상기 제조된 베타-갈락토시다제 II를 락토스 함유 기질과 반응시켜 갈락토올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 갈락토올리고당을 회수하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법에 관한 것이다.
베타-갈락토시다제는 이에 제한되는 것은 아니나, 바실러스 (Bacillus) 속, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속, 스트렙토코커스 (Streptococus) 속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 크립토코커스(Cryptococus) 속, 클로이베로마이세(Kluyveromyces) 속 등의 미생물을 락토스를 탄소원으로하여 배양할 경우 생성, 분비되는 세포내 또는 세포의 효소로서, 통상 락토스에 작용하여 갈락토스를 1-3개 결합시켜 갈락토올리고당을 생성하고, 부수적으로 포도당과 소량의 갈락토스를 생성한다.
본 발명의 갈락토올리고당은 락토스 기질로부터의 생성물에서 단당인 글루코스, 갈락토스와 이당류의 락토스를 제외한 이당류 이상의 당류를 갈락토올리고당으로 정의한다.
베타-갈락토시다제의 활성을 결정하는 일 예로, 다양한 완충액 중에 O-니트로페닐-베타-D-갈락토피라노사이드(O-Nitrophenyl-β-D-Galactopyra
noside)를 용해시켜 기질로 사용할 수 있고, 기질로써 이것 이외에도, 락토스, 셀로비오스(cellobiose) 등을 기질로 사용할 수 있으나, 상기 O-니트로페닐-베타-D-갈락토피라노사이드의 경우, 대부분의 베타 갈락토시다제가 기질 특이성을 나타내고 있어 쉽고 빠르게 결정할 수 있는 장점이 있다. 또한, 효소의 활성은 420 nm에서의 흡광도에서 유리된 O-니트로페놀의 농도를 확인할 수 있으며, 베타-갈락토시다제 1 unit는 상기 조건에서 1분당 1 μmol의 O-니트로페놀을 유리시키는 효소의 양으로 결정한다. 본 발명에서 갈락토올리고당 합성을 위한 베타-갈락토시다제 II의 투여량은 락토스 기질 대비 O-니트로페놀(O-nitrophenol)을 이용한 활성으로, 베타-갈락토시다제 II가 기질과 혼합시 최종 농도 1~3U/ml이 되도록한다.
상기 락토스 함유 기질은 30~60%(w/v), 바람직하게는 45~55%, 가장 바람직하게는 50%농도의 락토스 용액을 의미한다. 락토스는 함량이 높아질수록 용해도가 떨어지므로, 50% 락토스 용액의 제조는 고온하에 이루어지며, 갈락토올리고당 합성 온도 또한 고농도 락토스 용액 이용시에 50℃ 이상, 바람직하게는 60 내지 70℃ 이다.
또한, 상기 갈락토올리고당은 액상유, 건조분말우유, 유아 우유, 유아 조제식(baby formula), 아이스크림, 요거트, 치즈, 유제품, 음료, 유아 식품, 시리얼, 빵, 비스켓, 제과류, 케이크, 식품보조제, 식이보충제, 프로바이오틱 식료품, 프리바이오틱 식료품, 동물 사료, 가축 사료, 약제 등의 구성성분일 수 있다.
여기서, 프로바이오틱(probiotic)이란 대부분 가장 흔한 병원균이 사용하는 젖산균을 가지고 있으며 잠재적으로 이익이 있는 박테리아 또는 효모를 포함한 식이 보충제를 의미한다. 프로바이오틱스는 젖산으로 다른 탄수화물과 설탕으로 전환할 수 있기 때문에 오랫동안 식품산업에서 사용되어져 왔다. 프로바이오틱스는 요구르트와 같은 발효 유제품의 신맛을 제공할 뿐만 아니라, 성장을 위해 손상된 조직을 재건하기도 하며 pH를 낮추어 부식방지제로서 작용한다. 프로바이오틱스의 가장 흔한 형태는 발효된 유제품과 프로바이오틱스가 강화된 식품이며, Kefir (우유 발효 음료), 요구르트, Sauerkraut (발효된 독일식 김치), 한국김치 등의 젖산균도 프로바이오틱스의 건강효과와 유사한 것으로 나타났다.
또한, 프리바이오틱스(prebiotics)란 결장에 있는 박테리아의 수를 한정하며 선택적으로 박테리아의 성장을 자극하여 인체에 유리한 영향을 주는 물질로 인체 내에서 소화되지 않는 소당류로 구성되어 있다. 프리바이오틱스는 항암작용, 항균작용, Hypolipidemic 및 포도당 변조를 일으키는 활동을 한다. 프리바이오틱스는 결장에 있는 박테리아의 수를 한정하며 선택적으로 박테리아의 성장을 자극하여 인체에 유리한 영향을 주는 물질이며 인체 내에서 소화되지 않는 식품 구성요소로서 정의할 수 있다. 주로 소당류(oligosaccharides)이며, 프락토 올리고당(Fructo-oligosaccharides), 이눌린, Isomalto-oligosaccharides, Lactilol, 유과올리고당(Lactosucrose), 락툴로스(Lactulose), Pyrodextrins, Soy oligosaccharides, Xylo-oligosaccharides을 포함하고 있다. 이들은 주로 bifidogenic 요인으로서 불리워지며, bifidobacteria의 성장을 자극한다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 본 발명에 따른 베타-갈락토시다제 II 유전자 염기서열의 확보
단백질 전기영동 단편으로부터 아미노산 서열의 일부를 획득하기 위하여, 상업적으로 판매되는 바실러스 서큘란스 ATCC 31382 유래의 베타-갈락토시다제인 BIOLACTA N5(Daiwa Kasei사)를 적정량 0.01g/ml로 희석하여 단백질 전기영동의 시료로 사용하였다.
SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)는 세퍼레이팅 젤이 아크릴아미드 (acrylamide)의 농도가 10%가 되도록 만들었고, 스태킹 젤은 아크릴아미드의 농도가 8%가 되도록 만들었다. SDS-PAGE 완충액은 25 mM Tris-base, 192 mM 글리신, 0.1% SDS, pH 8.3을 사용하였다. 희석 시료는 5×샘플 버퍼 (60mM Tris-HCl pH 6.8, 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4mM 2-머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)와 혼합하여 100℃, 5분간 열처리하여 사용하였다. 전기영동장치는 Bio-Rad, Mini-ProteanⅡ apparatus를 이용하였다. 아크릴아미드 겔에서 전개된 시료는 CBB(Coomassie Brilliant Blue) 염색 수행 후, 탈색하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 아메데오(Amedeo V., et al., Biochim Biophys Acta., 10;1380(2):223-31., 1998) 등의 보고에서 제시한 145 kDa 부근에 위치한 단백질 밴드를 베타-갈락토시다제 II라고 예상하고, ESI(Electrospray ionization) 분석을 위해 이 단편을 오려내어 한국기초과학지원연구소에 분석 의뢰하였다. 분석 결과로, 하기와 같은 서열번호 4와 서열번호 5의 일부 아미노산 서열을 획득하였다.
서열번호 4: YSDESAAAK
서열번호 5: FGAVDTAG
상기의 아미노산 서열들을 NCBI의 블라스트 프로그램(NCBI Blast search) 검색을 통하여 유전자은행(GenBank)에 저장된 다양한 베타-갈락토시다제와 일부 유사함을 확인하였고, 상기에 획득한 2개의 일부 아미노산 서열을 토대로 디제너레이트(degenerate) PCR 프라이머를 제작하였다.
표 1
Figure PCTKR2010001085-appb-T000001
바실러스 서큘란스 ATCC 31382는 기본 배지인 LB(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% NaCl)배지에서 배양하였으며, 배양된 세포로부터 게놈 DNA 500㎍을 분리(Genomic DNA extraction kit; RBC사)하였다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 6과 서열번호 7의 디제너레이트 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 대략 1600 bp와 300 bp의 PCR 산물이 확인되었다. 이 PCR 산물들을 TOPcloner TA (Enzynomics사) 벡터에 라이게이션(Ligation)한 후, 42℃에서 열충격(Heat shock) 방법으로 E. coli JM109 균주에 형질전환하였다. 1600 bp와 300 bp의 유전자 단편의 염기서열을 결정하고, 이 염기서열을 유전자 은행의 것들과 NCBI의 블라스트 프로그램(NCBI Blast search)을 통해 비교하여 기존에 알려진 베타-갈락토시다제 유전자와 비교하여 1600 bp 유전자 단편이 베타-갈락토시다제의 일부인 것을 확인하였다.
인버스(inverse) PCR은 유전자 단편의 염기서열을 기반으로 간단한 과정과 빠른 시간 내에 목적 유전자의 전체 염기서열을 결정할 수 있는 PCR 기법으로, 바실러스 서큘란스 ATCC 31382의 게놈 DNA를 MluI, NotI, SacI, XmaI, XhoI, SpeI, AflII, AgeI, ApaI, ApaLI, AscI, BamHI, BclI, MfeI, PvuI, SphI의 제한효소(Restriction enzyme; New England Biolab사)로 각각 자르고, 정제한 후(Gel/PCR DNA Extraction Kit; RBC사) 라이게이션(Self ligation)함으로써, 상기 DNA 단편들은 선형 DNA에서 원형 DNA로 변화된다. 라이게이션 혼합물은 정제한 후(Gel/PCR DNA Extraction Kit; RBC사) 인버스 PCR의 주형(Template)으로 사용되었다.
상기에서 확보된 바실러스 서큘란스 ATCC 31382 유래의 베타-갈락토시다제 II의 1600 bp 유전자 염기서열을 기준으로 하기와 같은 서열번호 8과 서열번호 9의 인버스 PCR 프라이머를 제작하였고, 상기 인버스 PCR 주형을 이용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 8: 5’-GGCAGCTGCAAATCATGAAA-3’
서열번호 9: 5’-TTTCCACAGCCCGTGCATTA-3’
상기 PCR 과정을 통해 얻은 산물은 아가로스 전기영동을 통해 확인하였다. 총 16종의 제한 효소 처리군 중에서 SpeI과 ApaLI의 제한효소 처리군에서만 대략 6000 bp와 2000 bp의 인버스 PCR 산물이 나타났다 (도 3). 바실러스 서큘란스 ATCC 31382 유래의 베타-갈락토시다제 II의 145 kDa의 단백질 크기로 유추해 보았을 때 DNA 크기는 4000 bp 이상으로 생각할 수 있다. 따라서, SpeI 제한효소 처리로부터 생성된 6000 bp의 인버스 PCR 산물을 TOPcloner TA (Enzynomics사) 벡터에 클로닝하여 염기서열을 결정하였다. 그 결과로, 바실러스 서큘란스 ATCC 31382 유래의 베타-갈락토시다제 II의 전체 염기서열을 결정하였고, 서열번호 2에 제시한 바와 같이, 베타-갈락토시다제 II 유전자로 추정되는 DNA의 전체크기는 5,897 bp이고, 도 4의 모식도에 나타난 바와 같이, 2개의 ORFs(Open Reading Frames)가 발견되었다. 그 중 첫번째 ORF가 4191 bp의 DNA 크기(서열번호 3)와 1396개의 아미노산(서열번호 1)으로 이루어진 것으로 확인되어, 목적한 145 kDa 정도의 단백질 크기와 일치하는 것으로 판명하였다. 따라서, 이것을 바실러스 서큘란스 ATCC 31382 유래의 베타-갈락토시다제 II라고 판명하였다.
실시예 2: 베타-갈락토시다제 II 유전자를 함유한 재조합 벡터 및 재조합 미생물의 제조
상기 실시예 1에서 확보된 바실러스 서큘란스 ATCC 31382의 베타-갈락토시다제 II 유전자 염기서열을 이용하여 재조합 벡터 및 재조합 미생물을 제조하였다. 상기 베타-갈락토시다제 II 유전자의 염기서열을 토대로 하기와 같은 서열번호 10와 서열번호 11의 프라이머를 제작하였다.
서열번호 10: 5’-AACCCGGGATGAGACGAATTAATTTTAA-3’
서열번호 11: 5’-AAGGTACCTCATTCTGTAAAACGAATGT-3’
바실러스 서큘란스 ATCC 31382의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 10와 서열번호 11의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 정제 후, 각각의 프라이머에 삽입한 제한효소 서열 XmaI과 KpnI을 이용하여, pACE(GenoFocus사) 벡터에 동일 제한효소 부위에 삽입하여 pACE-BgaII로 명명한 벡터를 제조하였고, 상기 제조된 벡터를 E. coli JM109 균주에 형질전환시켰다.
실시예 3: 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제 II 제조
실시예 2에서 형질전환된 재조합 균주(E. coli JM109/pACE-BgaII)를 이용하여 재조합 베타-갈락토사다제 II를 제조하였다. pACE(GenoFocus사) 벡터는 단백질 발현을 위해 별도의 유도제(Inducer) 첨가가 필요 없이 미생물 배양만으로 세포성장과 단백질 발현이 분리된 상태로 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 따라서, 멸균된 100 ml LB(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% NaCl)배지가 들어있는 1 L의 삼각플라스크에 전날 충분히 종 배양한 상기 형질전환된 재조합 균주 배양물 5 ml을 접종하였고, 30℃에서 교반속도 200 rpm으로 24시간 배양하였다. 배양이 완료된 상기 형질전환된 재조합 균주는 원심분리에 의해 배양액과 분리되었으며, 멸균 증류수에 적정 농도로 다시 희석하였다. 초음파분쇄기(VibraCell사)로 형질전환된 재조합 균주를 파쇄하고 원심분리로 세포 찌꺼기와 베타-갈락토시다제 II를 최종적으로 분리하였다. 이를 실시예 1에서 기술한 방법으로 단백질 전기영동을 실시한 결과, 도 5에서 표시된 화살표가 가리키는 바와 같이, 약 145kDa 정도의 베타-갈락토시다제 II의 밴드를 확인하였다. 3번 레인에 BIOLACTA N5를 걸어준 것은 대조군(1번레인)에서 보이지 않았던 145kDa 위치의 밴드가 베타-갈락토시다제 II의 밴드임을 입증하기 위해 함께 걸어준 것이다.
실시예 4: 재조합 베타-갈락토시다제 II의 특성 확인
상기 실시예 3에서 얻어진 베타-갈락토시다제 II를 이용해 최적 온도와 pH를 확인하였다. 베타-갈락토시다제의 활성 결정은 다양한 완충액 중에 O-니트로페닐-베타-D-갈락토피라노사이드(O-Nitrophenyl-β-D-Galac topyranoside)를 용해시켜 기질로 사용하였으며, 30~80℃에서 반응후 10% (w/v) 소디움 카보네이트(Na2CO3)를 이용하여 효소 반응을 중지시키고 발색시켰다.
상기 효소의 활성은 420 nm에서의 흡광도에서 유리된 O-니트로페놀의 농도를 확인하였다. 베타-갈락토시다제 1 unit는 상기 조건에서 1분당 1 μmol의 O-니트로페놀을 유리시키는 효소의 양으로 결정하였다. 최적 pH 확인을 위해 각각의 기질과 시료는 pH 3, 4, 5의 조건은 0.1 M 시트르산 완충액으로 제조하였고, pH 6, 7, 8의 조건은 0.1 M 인산 완충액으로 제조하였으며, pH 9, 10의 조건은 트리스(Tris) 완충액으로 제조하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 실시예 3에서 제조된 베타-갈락토시다제 II의 최적온도는 30~80℃ 중 최적 활성 온도는 50℃에서 나타났고, 도 7에 나타난 바와 같이, 최적 pH는 6.0으로 나타났다 (도 6 및 도 7).
실시예 5: 베타-갈락토시다제 II를 이용한 올리고당의 합성
상기 실시예 3에서 얻어진 베타-갈락토시다제 II를 이용해 갈락토올리고당을 합성하였다. 갈락토올리고당의 기질로서 락토스는 500 g/L의 농도로 50 mM 인산 완충액(pH 6.0)에 고온을 가해 용해시켰다. 1 L 용량의 반응기에 500 g/L 농도의 락토스 용액 500 ml을 첨가하였으며, 반응온도는 60℃로 고정하고, 교반속도는 100 rpm을 유지하였다. 베타-갈락토시다제 II의 투입양은 최종 농도가 2 units(U/락토스 g)가 되도록 투여하였다. 합성시간은 24시간을 수행하였다.
갈락토올리고당의 분석은 폴리아민 II(Polyamine II; YMC사) 컬럼을 사용하여 RI 검출기가 부착된 HPLC(Agilent사)로 측정하였다. 이때 이동상은 아세토니트릴(Acetonitrile)과 정제수의 비율이 65%/35%(v/v)가 되도록 사용하였다. 이때 이동상의 흐름속도는 1.0 ml/min이었다. 상기 반응 완료 후의 갈락토올리고당의 분석결과는 표 2에 나타내었으며, HPLC 크로마토그램은 도 8에 나타난 바와 같았다.
갈락토올리고당의 전환율은 다음과 같이 계산하였다. 이하에 표현하는 양은 HPLC에 측정된 피크(peak) 면적을 나타내며, 락토스 기질로부터의 생성물에서 단당류인 글루코스, 갈락토스와 이당류의 락토스를 제외한 이당류 이상의 당류를 갈락토올리고당으로 정의한다.
갈락토올리고당 전환율(%)
=[전체 당의 양]-[글루코스 양]-[갈락토스 양]-[락토스 양]
표 2
Figure PCTKR2010001085-appb-T000002
전환율이란, 투입된 락토스 농도에 대한 생성된 올리고당 농도의 비율을 말하는 것이다. 상기 함량(%)은 전체 당 (글루코스, 갈락토스, 락토스 및 올리고당)의 합에서 각각의 당에 대한 비율이다. 따라서, 본 발명에 따른 베타-갈락토시다제 II에 의한 갈락토올리고당 전환율은 63.4%으로 우수한 것으로 나타났다.
바실러스 서큘란스 (ATCC 31382)으로부터의 3개의 베타 갈락토시다제 중, I과 III의 경우는 전환율이 아주 약하므로, 이에 비해 우수한 전환율을 나타내고 있는 것이다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 바실러스 서큘란스 유래 베타-갈락토시다제 II 및 이를 코딩하는 유전자를 이용하여 베타-갈락토시다제 중 당 전이 활성이 우수한 베타-갈락토시다제 II를 생산함으로써, 갈락토올리고당의 효율적인 대량 생산이 가능하므로 유용하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 베타-갈락토시다제 II.
  2. 제1항의 베타-갈락토시다제 II를 코딩하는 유전자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 베타-갈락토시다제 II를 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
  4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제2항의 유전자 및 제4항의 재조합 벡터가 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  7. 제5항의 재조합 미생물을 배양하여 베타-갈락토시다제 II를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 베타-갈락토시다제 II를 회수하는 단계를 포함하는 베타-갈락토시다제 II의 제조방법.
  8. 제1항의 베타-갈락토시다제 II를 락토스 함유 기질과 반응시켜 갈락토올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 갈락토올리고당을 회수하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 갈락토올리고당은 액상유, 건조분말우유, 유아 우유, 유아 조제식 (baby formula), 아이스크림, 요거트, 치즈, 유제품, 음료, 유아 식품, 시리얼, 빵, 비스켓, 제과류, 케이크, 식품보조제, 식이보충제, 프로바이오틱 식료품, 프리바이오틱 식료품, 동물 사료, 가축 사료 및 약제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 구성성분인 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조방법.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015046408A1 (ja) 2013-09-30 2015-04-02 天野エンザイム株式会社 改変型β－ガラクトシダーゼ
CN106459946A (zh) * 2014-05-23 2017-02-22 杰诺福克斯公司 新的β‑半乳糖苷酶
WO2018210820A1 (en) * 2017-05-15 2018-11-22 Novozymes A/S Glycosylated beta-galactosidase compositions having improved transgalactosylating activity

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160141123A (ko) 2015-05-28 2016-12-08 주식회사 제노포커스 고당전이 활성의 베타-갈락토시다제 변이체 및 그 용도
KR101825456B1 (ko) * 2017-03-07 2018-03-22 주식회사 제노포커스 고당전이 활성의 베타-갈락토시다제 변이체 및 그 용도
KR102030033B1 (ko) 2018-09-17 2019-10-08 주식회사 제노포커스 베타-갈락토시다제 생산성이 증가된 바실러스 서큘란스 변이 균주

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5032509A (en) * 1988-10-06 1991-07-16 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Method of preparing galcatooligosaccharide
US20070274955A1 (en) * 2003-06-30 2007-11-29 Glenn Gibson Novel Galactooligosaccharide Composition and the Preparation Thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5032509A (en) * 1988-10-06 1991-07-16 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Method of preparing galcatooligosaccharide
US20070274955A1 (en) * 2003-06-30 2007-11-29 Glenn Gibson Novel Galactooligosaccharide Composition and the Preparation Thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GENBANK 08 May 2002 'beta-galactosidase [Streptococcus pneumoniae]' Database accession no. BAB91370 *
HYUN-JAE SHIN ET AL.: 'Continuous production of galacto-oligosaccharides from lactose by Bullera singularis 0-galactosidase immobilized in chitosan beads.' PROCESS BIOCHEMISTRY vol. 33, no. 8, 1998, pages 787 - 792 *
JAE-HO KIM ET AL.: 'Production of galactooligosaccharide by beta-galactosidase from Kluyveromyces maxianus var lactis OE-20.' BIOTECHNOL. BIOPROCESS ENG. vol. 6, no. 5, 2001, pages 337 - 340 *
SHUICHI YANAHIRA ET AL.: 'Structures of novel acidic galactooligosaccharides synthesized by Bacillus circulans Beta-galactosidase.' BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM. vol. 62, no. 9, 1998, pages 1791 - 1794 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015046408A1 (ja) 2013-09-30 2015-04-02 天野エンザイム株式会社 改変型β－ガラクトシダーゼ
EP4279604A2 (en) 2013-09-30 2023-11-22 Amano Enzyme Inc. Modified beta-galactosidase
CN106459946A (zh) * 2014-05-23 2017-02-22 杰诺福克斯公司 新的β‑半乳糖苷酶
CN106459946B (zh) * 2014-05-23 2019-10-29 杰诺福克斯公司 新的β-半乳糖苷酶
WO2018210820A1 (en) * 2017-05-15 2018-11-22 Novozymes A/S Glycosylated beta-galactosidase compositions having improved transgalactosylating activity
WO2018210821A1 (en) * 2017-05-15 2018-11-22 Novozymes A/S Milk products comprising high amounts of galactooligosaccharides (gos) and their production
CN110621163A (zh) * 2017-05-15 2019-12-27 诺维信公司 包含高含量低聚半乳糖(gos)的乳产品及其生产
US11304425B2 (en) 2017-05-15 2022-04-19 Novozymes A/S Glycosylated beta-galactosidase compositions having improved transgalactosylating activity
US11896024B2 (en) 2017-05-15 2024-02-13 Novozymes A/S Method of glycation of a polypeptide
AU2018267948B2 (en) * 2017-05-15 2024-03-14 Kerry Group Services International Ltd Glycosylated beta-galactosidase compositions having improved transgalactosylating activity

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