KR102577779B1 - 배양 배지 조성 및 배양 방식 변화에 따른 2'-푸코실락토오스의 생산성 증대 방법 - Google Patents

배양 배지 조성 및 배양 방식 변화에 따른 2'-푸코실락토오스의 생산성 증대 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기질인 유당 (lactose)을 기반으로 다양한 배양 배지 조성 및 배양 방식 변화에 따른 2'-푸코실락토오스의 생산성을 증대시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 배양방법을 통해 발견한 최적 유당 농도에서 2'-푸코실락토오스를 고수율로 지속적인 생산이 가능하게 된다.

Description

배양 배지 조성 및 배양 방식 변화에 따른 2'-푸코실락토오스의 생산성 증대 방법{Method for increasing productivity of 2'-fucosyllactose by changing medium composition and culture method}
본 발명은 배양 배지 조성 및 배양 방식 변화에 따른 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose, 2'-FL)의 생산성 증대 방법에 관한 것으로, 기질인 유당 (lactose)을 기반으로 다양한 배양 배지 조성 및 배양 방식 변화에 따른 2'-푸코실락토오스의 생산성을 증대시키는 방법에 관한 것이다.
모유올리고당 (Human milk oligosaccharides, HMOs)은 모유에 함유되어 있는 올리고당으로, 유당 및 지방 다음으로 모유에서 세 번째로 많은 성분이다. 모유올리고당의 종류는 약 200여종으로 다양하며, 면역 기능을 강화시키거나, 아이의 발달과 행동에 좋은 영향을 주는 등의 다양한 이점을 가진다.
주요 HMO 중 가장 많은 양으로 존재하는 2'-푸코실락토오스는 다양한 생물학적 활성에 관여한다. 기존 연구에서 2'-푸코실락토오스를 생산하는 방법은 직접 모유로부터 추출하는 방법과 화학적 또는 효소적 방법으로 추출하는 방법이 있다. 하지만 직접 모유로부터 추출하는 방법은 비윤리적이라는 것과, 모유 수급이 제한적이고 낮은 생산성이라는 문제가 있다. 또한, 화학적 합성법은 고가의 기질, 낮은 이성체 선택성과 생산수율, 그리고 독성시약의 사용 등의 문제가 있고, 효소적 합성법은 전구체가 되는 GDP-L-푸코오스가 매우 고가라는 점과 푸코오스 전이효소의 정제비용이 많이 든다는 문제점이 있다.
이같은 문제를 해결하기 위한 해결책으로 미생물을 이용하는 2'-푸코실락토오스의 생산이 있으나, 종래의 기술은 대부분 재조합 대장균을 이용한 생산기술이었다. 하지만 이는 소비자들에게 해로운 균이라는 인식이 있으며, 대장균 세포의 경우 유당 투과효소 (Lactose permease)의 작용에 의해 유당 제한 배양상태에서 '락토오스 킬링 (Lactose killing)'이라는 대장균 세포가 사멸되는 현상(Daniel dykhuizen and daniel hartl, 1987, "Transport by the lactose permease of Escherichia coli as the basis of lactose killing", 10.1128/JB.135.3.876-882, 1978, Journal of bacteiology)이 나타나므로 사용하는 것이 다소 제한적이다. 이에 안전하게 2-푸코실락토오스를 생산하면서 효율적으로 생산성을 증대시키기 위한 새로운 생산 방법이 필요한 실정이다.
대한민국등록특허 제10-1731263호 (등록일자: 2017.04.24)에는 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용한 2'-푸코실락토오스의 생산방법에 관한 것으로, α-1,2-푸코오스 전이효소, GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제, GDP-L-푸코오스 신타아제 및 락토오즈 퍼미아제가 발현되도록 형질전환되며, 포스포만노뮤타아제 및 GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라아제를 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 푸코실락토오스 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (C. glutamicum) 및 이를 이용한 푸코실락토오스의 제조방법에 관해 기재되어 있다.
본 발명은 기질인 유당 (lactose) 농도를 이용한 배양 배지 조성과 배양 방식 변화에 따른 2'-푸코실락토오스의 생산성을 증대시키는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 α-1,2-푸코오스 전이효소 (α-1,2-fucosyltransferase)가 발현되도록 형질전환되고, GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (GDP-D-mannose-4,6-dehydratase)가 발현되도록 형질전환되며, GDP-L-푸코오스 신타아제 (GDP-L-fucose synthase)가 발현되도록 형질전환되고, 락토오스 퍼미아제 (lactose permease)가 발현되도록 형질전환되며, 포스포만노뮤타아제 (phosphomannomutase) 및 GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (GTPmannose-1-phosphate guanylyltransferase)를 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 재조합 코리네박테리움 속 (Corynebacterium SP.) 미생물을 락토오스가 첨가된 배지에 배양하여 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose)를 생산함에 있어서, 상기 락토오스는 30 ~ 150 g/L의 농도로 유지하면서 배양하는 것을 특징으로 하는 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose)의 생산방법을 제공한다.
한편, 본 발명의 2'-푸코실락토오스의 생산방법에 있어서, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은, 바람직하게 포스포만노뮤타아제 (Phosphomannomutase)가 과발현되도록 형질전환되고, GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라아제 (GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase)가 과발현되도록 형질전환된 것이 좋다.
한편, 본 발명의 2'-푸코실락토오스의 생산방법에 있어서, 상기 배지는, 바람직하게 글루코오스를 더 포함하는 것이 좋다.
한편, 본 발명의 2'-푸코실락토오스의 생산방법에 있어서, 상기 2'-푸코실락토오스의 생산방법은, 바람직하게 글루코오스 또는 락토오스를 추가로 공급하는 유가식 배양인 것이 좋다.
본 발명에서는 하기의 실험을 통해 2'-푸코실락토오스의 생성량을 증대시킬 수 있는 최적의 유당 농도를 확인할 수 있었다. 또한, 유당분해효소를 배양 후기에 첨가함으로써, 유당의 분해에 따라 생성된 포도당을 이용해 2'-푸코실락토오스의 전구체인 구아노신이인산-L-푸코스를 생산하고, 분해되지 않은 유당과의 반응을 유도함으로써, 배양 후기 잔존하는 유당을 2'-푸코실락토오스의 생산에 최대한 활용할 수 있었다.
도 1은 재조합 코리네박테리움 균주에 대한 2'-푸코실락토오스의 생산 경로를 나타낸 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 유당 농도에 따른 2'-푸코실락토오스의 생산성을 나타낸 결과 그래프이다.
도 3은 베타-갈락토시다아제에 의한 유당 분해를 나타낸 모식도이다.
도 4는 유당 분해를 통한 2'-푸코실락토오스의 생산성을 나타낸 결과 그래프이다.
주요 모유올리고당 중 하나인 2'-푸코실락토오스는 다양한 생물학적 활성에 관여하는 등의 건강 기능적 이점을 가지므로 이를 생산하는 방법에 대한 다양한 방법이 시도되고 있다. 하지만 기존의 직접 모유에서부터 추출하는 방법이나, 화학적, 효소적 합성법은 낮은 생산성, 고가의 비용, 낮은 생산수율, 독성 등의 문제가 있어 대체하기 위한 방법이 필요하다. 이를 위해 미생물을 이용하는 생산 기술이 제안되었으나 대부분 재조합 대장균을 이용한 기술이며, 대장균 세포의 경우 유당 투과효소(Lactose permease)의 작용에 의해 대장균 세포가 사멸되는 현상('락토오스 킬링')이 나타나므로 사용하는 것이 다소 제한적이다. 이에 본 발명에서는 일정 수준의 락토오스 킬링을 보임에도 기질인 유당을 이용하여 2'-푸코실락토오스를 다량으로 생산하기 위한 배양 배지 조성 및 배양 방식을 최적화하였으며, 안전하면서 효율적으로 2'-푸코실락토오스를 생산하는 방법에 대해 제공하고자 한다.
본 발명은 α-1,2-푸코오스 전이효소 (α-1,2-fucosyltransferase)가 발현되도록 형질전환되고, GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (GDP-D-mannose-4,6-dehydratase)가 발현되도록 형질전환되며, GDP-L-푸코오스 신타아제 (GDP-L-fucose synthase)가 발현되도록 형질전환되고, 락토오스 퍼미아제 (lactose permease)가 발현되도록 형질전환되며, 포스포만노뮤타아제 (phosphomannomutase) 및 GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (GTPmannose-1-phosphate guanylyltransferase)를 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 재조합 코리네박테리움 속 (Corynebacterium SP.) 미생물을 락토오스가 첨가된 배지에 배양하여 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose)를 생산함에 있어서, 상기 락토오스는 30 ~ 150 g/L의 농도로 유지하면서 배양하는 것을 특징으로 하는 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose)의 생산방법을 제공한다. 본 발명의 균주를 사용하여 2'-푸코실락토오스를 생산하는 경로는 도 1에 나타내었다.
본 발명자들은 이전 등록특허 10-1731263호(등록일자: 2017.04.24)와 제10-2014925호(등록일자: 2019.08.21)에서 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)을 이용하여 2'-FL을 생산하는 기술에 대해 제안한 바가 있다. 이 선행특허에서는 2'-푸코실락토오스를 최적으로 생산하기 위해 글루코오스의 공급량을 rate-limiting 인자로 설정하고, 락토오스는 10 g/L의 초기농도로 설정하여 배양을 진행한 바가 있었다. 그런데, 본 발명에서는 한편으로 락토오스의 공급량이 rate-limiting 인자일 수 있겠다는 아이디어를 착안하였으며, 하기 실험 결과 락토오스 농도를 높일 경우 특정 농도에서 2'-푸코실락토오스의 생산량이 증가함을 확인할 수 있었다.
본 발명에서는 재조합 코리네박테리움 속 미생물을 락토오스 30 ~ 150 g/L의 농도의 조건으로 배양함으로써, 2'-푸코실락토오스를 고수율로 생산할 수 있음을 확인하였으며, 더욱 바람직하게는 락토오스 40 ~ 100 g/L의 농도의 조건으로 배양함으로써, 2'-푸코실락토오스를 고수율로 생산할 수 있음을 확인하였다. 40 g/L 이상의 2'-푸코실락토오스 생산성을 보이는 실험군들 중, 직전 실험군 또는 직후 실험군과 유의성 있는 차이를 보이는 범위를 각각 하한 (40 g/L) 및 상한 (100 g/L)으로 설정하여 2'-푸코실락토오스의 최적 생산을 위한 락토오스 농도로 40~100 g/L를 설정한 것이었다.
한편, 본 발명의 2'-푸코실락토오스의 생산방법에 있어서, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은, 바람직하게 포스포만노뮤타아제 (Phosphomannomutase)가 과발현되도록 형질전환되고, GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라아제 (GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase)가 과발현되도록 형질전환된 것이 좋다. 코리네박테리움 글루타미쿰은 포스포만노뮤타아제 (Phosphomannomutase, ManB), GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라아제 (GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase, ManC)를 암호화하는 유전자를 자체적으로 보유하여 발현시킬 수 있기 때문에, 굳이 이 효소를 암호화하는 유전자를 도입시켜줄 필요는 없으나, 대량 생산을 위해서는 이 효소를 과발현시켜줄 필요가 있다. 따라서, 본 발명에서는 바람직하게 이들 두 효소를 과발현할수 있도록 코리네박테리움 글루타미쿰을 형질전환하는 것이 필요한 것이다.
한편, 본 발명에서 사용하는 '발현'이라는 용어는, 본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주가 자체적으로 발현시킬 수 없는 효소를, 인위적으로 발현시키기 위해 외부 유래의 유전자를 균주 내로 도입하여 발현시키는 것을 의미하고, '과발현'이라는 용어는 본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주가 자체적으로 해당 효소를 암호화하는 유전자를 가지고 있어, 스스로 발현시킬 수 있으나, 대량생산을 위한 목적으로 이의 발현량을 증대시키기 위해 인위적으로 해당 효소의 발현량을 증대시켜 과발현한 것을 의미한다.
한편, 본 발명의 2'-푸코실락토오스의 생산방법에 있어서, 상기 배지는, 바람직하게 글루코오스를 더 포함하는 것이 좋다. 글루코오스가 배지에 추가됨으로써 균주의 생육이 활발해져 더욱 높은 생산성으로 2'-푸코실락토오스를 생산할 수 있다.
한편, 본 발명의 2'-푸코실락토오스의 생산방법에 있어서, 상기 2'-푸코실락토오스의 생산방법은, 바람직하게 글루코오스 또는 락토오스를 추가로 공급하는 유가식 배양인 것이 좋다. 유가식 배양을 통해 글루토오스 또는 락토오스를 지속적으로 공급하면, 세포의 성장을 더욱 증대시키고, 고순도, 고수율, 고생산성으로 2'-푸코실락토오스를 생산할 수 있기 때문이다. 유가식 배양에 관한 세부 지엽적 기술들은 당업계의 공지 기술을 사용할 수 있으므로, 이에 대해서는 그 기재를 생략하기로 한다.
한편, 본 발명의 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose)의 생산방법에 있어서, 상기 배지는, 배양 정지기 (stationary phase) 구간 후반부에 유당 분해 효소를 첨가하는 것이 좋다. 이때, 상기 유당 분해 효소는 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase)인 것이 좋으며, 이에 의해 유당이 분해되어 갈락토오스와 포도당이 생성된다. 생성된 포도당으로부터 2'-푸코실락토오스 합성반응의 최종 기질인 구아노신이인산-L-푸코오스 (GDP-L-fucose)가 생산되고, 분해되지 않은 유당의 반응으로 인해 2'-푸코실락토오스가 생산된다. 결국 발효후기에 부산물 (By-product)이 되는 유당을 최대한 활용하여 2'-푸코실락토오스의 생산량을 증가시킬수 있게 되는 것이다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[제조예 1: 재조합 플라스미드의 제조]
플라스미드 제작 및 2'-푸코실락토오스 (fucosyllactose, 2'-FL)의 생산을 위해 각각 대장균 (Escherichia coli) K-12 MG1655와 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032를 이용하였다.
pFGW(Ps) 플라스미드를 구축하기 위해 대장균인 K-12 MG1655의 유전체 (genomic) DNA로부터 두 개의 DNA 프라이머(primer) GW-F 와 GW-R를 이용한 PCR 반응을 통해 gmd-wcaG 유전자 클러스터(cluster)를 증폭하고, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032의 유전체 DNA로부터 두 개의 DNA 프라이머 Sod-F와 Sod-R를 이용한 PCR 반응을 통해 Sod 유전자의 프로모터를 증폭 한 후, 두 개의 DNA 프라이머 Sod-F와 GW-R를 이용하여 오버랩 (overlap) PCR 반응을 통해 pSod-Gmd-WcaG DNA 절편을 합성하였다.
또한, pXMJ19 플라스미드 (plasmid)로부터 두 개의 DNA 프라이머 Ter-F와 Ter-R를 이용한 PCR 반응을 통해 전사종결 서열을 증폭한 후, 상기 합성한 pSod-Gmd-WcaG와 전사종결 서열을 주형으로 두 개의 DNA 프라이머 Sod-F와 Ter-R를 이용한 PCR 반응을 통해 pSod-Gmd-WcaG-ter 서열을 합성한 후, 제한효소 BamHⅠ으로 잘려진 pCES208 플라스미드에 이를 삽입하여 pGW 플라스미드를 구축하였다.
또한, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 유전체 DNA로부터 두 개의 DNA 프라이머 Tuf-F1와 Tuf-R1를 이용한 PCR 반응을 통해 Tuf 유전자 프로모터를 증폭하고 합성된 슈도페도박터 살탄스 (Pseudopedobacter saltans) DSM 12145 유래 α-1,2-푸코오스 전이효소 (α-1,2-fucosyltransferase)로부터 두 개의 DNA 프라이머 FT(Ps)-F와 FT(Ps)-R를 이용한 PCR 반응을 통해 α-1,2-푸코오스 전이효소를 증폭한 후, 두 개의 프라이머 Tuf-F와 FT(Ps)-R를 이용하여 오버랩 (overlap) PCR 반응을 통해 pTuf-FT(Ps) DNA 절편을 합성하였다. 상기 구축된 pGW 플라스미드에 제한효소 NotⅠ을 처리하여 pTuf-FT(Ps)를 삽입함으로써 pFGW(Ps) 플라스미드를 구축하였다.
한편, pXIL 플라스미드를 구축하기 위해, 대장균 K-12 MG1655의 유전체 DNA로부터 두 개의 DNA 프라이머 ilvC-lacY-F와 lacY pX-R을 이용한 PCR 반응을 통해 lacY 유전자를 증폭하고 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 유전체 DNA로부터 두 개의 DNA 프라이머 pX-ilvC-F와 ilvC-lacY-R을 이용한 PCR 반응을 통해 ilvC 유전자의 프로모터를 증폭한 후 두 개의 DNA 프라이머 pX-ilvC-F와 lacY pX-R을 이용하여 오버랩 (overlap) PCR 반응을 통해 pilvC-lacY DNA 절편을 합성한 후 제한효소 NotⅠ과 EcoRⅠ이 처리된 pX 플라스미드 (pXMJ19)에 이를 삽입하여 pXIL 플라스미드를 구축하였다.
본 제조예에서 사용한 균주(strain), 프라이머(primer), 플라스미드(plasmid), 핵산 및 아미노산 서열은 하기 표 1 내지 4에 기재하였다.
균주
E.Coli K-12 MG1655 F-, lambda-, rph-1
C. glutamicum Wild-type strain, ATCC13032
핵산 및 아미노산 서열
gmd 핵산 서열 서열번호 1
wcaG 핵산 서열 서열번호 2
lacY 핵산 서열 서열번호 3
FT(Ps) 핵산 서열 서열번호 4
FT(Ps) 아미노산 서열 서열번호 5
프라이머
프라이머 서열 (5'→3')
pX-ilvC-F GTCATATGATGGTCGCGGATCCGAATTCCCAGGCAAGCTCCGC
ilvC-lacY-R GTTTTTTAAATAGTACATAATCTCGCCTTTCGTAAAAATTTTGGT
ilvC-lacY-F TTACGAAAGGCGAGATTATGTACTATTTAAAAAACACAAACTTTTGGATGTTCGG
lacY pX-R GCCTTTCGTTTTATTTGCTCGAGTGCGGCCGCTTAAGCGACTTCATTCACCTGACGAC
Tuf-F1 TGGAGCTCCACCGCGGTGGCTGGCCGTTACCCTGCGAA
Tuf-R1 CAAATATCATTGTATGTCCTCCTGGACTTCG
FT(ps)-F AGGACATACAATGATATTTGTAACCGGATATG
FT(ps)-R CGCTTCACTAGTTCTAGAGCTTAAATAATGTGTCGAAACAGATTC
Sod-F TTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGAAGCGCCTCATCAGCG
Sod-R TACACCGGTGATGAGAGCGACTTTTGACATGGTAAAAAATCCTTTCGTAGGTTTCCGCAC
GW-F ATGTCAAAAGTCGCTCTCATCACCGGTGTA
GW-R CAAGCTGAATTCTTACCCCCGAAAGCGGTC
ter-F GACCGCTTTCGGGGGTAAGAATTCAGCTTG
ter-R GGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGAAAAGGCCATCCGTCAGGAT
플라스미드
Plasmid Related features Ref.
pCES208 KmR, C.glutamicum/ E.coli shuttle vector J. Microbiol. Biotechnol. (2008), 18(4), 639647
pXMJ19 CmR, C.glutamicum/ E.coli shuttle vector Biotechnology Techniques (1999), 13, 437441
pGW pCES208 + Sod-gmd-wcaG 특허 제10-2014925호
pFGW(Ps) pCES208 + Tuf-FT(Ps) + Sod-gmd-wcaG 특허 제10-2014925호
pXIL pXMJ19 + ilvC-lacY 특허 제10-2014925호
[실시예 1: 유당 농도에 따른 2'-푸코실락토오스 생산성]
배양 중 배지에 잔존하는 유당의 농도를 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 g/L를 유지하면서 배양하여 유당의 농도를 기준 농도의 ±5 g/L를 유지하면서 실험을 진행하였고, 유당 농도에 따른 2'-푸코실락토오스의 생산농도를 시간대별로 측정하여 배양을 진행하였다. 배양결과 도 2와 같이 2'-푸코실락토오스 생산은 40~100 g/L구간에서 가장 높은 농도를 보였다.
[실시예 2: 유당분해효소 처리에 따른 2'-푸코실락토오스 생산성]
효소 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase)에 의해서 유당이 분해되면 포도당과 갈락토오스가 생기게 된다(도 3). 배양 정지기 (stationary phase) 구간 후반부에서 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase) 효소를 투입하였으며, 그 결과 도 4와 같이 2'-푸코실락토오스의 생산량이 다시 늘어나는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 유당 분해로 얻어진 포도당 (Glucose)으로부터 2'-푸코실락토오스 합성반응의 최종 기질인 구아노신이인산-L-푸코스 (GDP-L-Fucose)가 생산되고, 이것이 분해되지 않은 유당과 반응하여 2'-푸코실락토오스가 생산된 것으로 해석할 수 있었다. 결국 배양 정지기 (stationary phase) 구간 후반부에서 부산물로 존재하는 유당을 유당분해효소 처리에 의해 최대한 활용하여 2'-푸코실락토오스를 추가적으로 더 생산할 수 있었다.
<110> AP Technologies Corp. <120> Method for increasing productivity of 2'-fucosyllactose by changing medium composition and culture method <130> YP-21-171 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1122 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atgtcaaaag tcgctctcat caccggtgta accggacaag acggttctta cctggcagag 60 tttctgctgg aaaaaggtta cgaggtgcat ggtattaagc gtcgcgcatc gtcattcaac 120 accgagcgcg tggatcacat ttatcaggat ccgcacacct gcaacccgaa attccatctg 180 cattatggcg acctgagtga tacctctaac ctgacgcgca ttttgcgtga agtacagccg 240 gatgaagtgt acaacctggg cgcaatgagc cacgttgcgg tctcttttga gtcaccagaa 300 tataccgctg acgtcgacgc gatgggtacg ctgcgcctgc tggaggcgat ccgcttcctc 360 ggtctggaaa agaaaactcg tttctatcag gcttccacct ctgaactgta tggtctggtg 420 caggaaattc cgcagaaaga gaccacgccg ttctacccgc gatctccgta tgcggtcgcc 480 aaactgtacg cctactggat caccgttaac taccgtgaat cctacggcat gtacgcctgt 540 aacggaattc tcttcaacca tgaatccccg cgccgcggcg aaaccttcgt tacccgcaaa 600 atcacccgcg caatcgccaa catcgcccag gggctggagt cgtgcctgta cctcggcaat 660 atggattccc tgcgtgactg gggccacgcc aaagactacg taaaaatgca gtggatgatg 720 ctgcagcagg aacagccgga agatttcgtt atcgcgaccg gcgttcagta ctccgtgcgt 780 cagttcgtgg aaatggcggc agcacagctg ggcatcaaac tgcgctttga aggcacgggc 840 gttgaagaga agggcattgt ggtttccgtc accgggcatg acgcgccggg cgttaaaccg 900 ggtgatgtga ttatcgctgt tgacccgcgt tacttccgtc cggctgaagt tgaaacgctg 960 ctcggcgacc cgaccaaagc gcacgaaaaa ctgggctgga aaccggaaat caccctcaga 1020 gagatggtgt ctgaaatggt ggctaatgac ctcgaagcgg cgaaaaaaca ctctctgctg 1080 aaatctcacg gctacgacgt ggcgatcgcg ctggagtcat aa 1122 <210> 2 <211> 966 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 atgagtaaac aacgagtttt tattgctggt catcgcggga tggtcggttc cgccatcagg 60 cggcagctcg aacagcgcgg tgatgtggaa ctggtattac gcacccgcga cgagctgaac 120 ctgctggaca gccgcgccgt gcatgatttc tttgccagcg aacgtattga ccaggtctat 180 ctggcggcgg cgaaagtggg cggcattgtt gccaacaaca cctatccggc ggatttcatc 240 taccagaaca tgatgattga gagcaacatc attcacgccg cgcatcagaa cgacgtgaac 300 aaactgctgt ttctcggatc gtcctgcatc tacccgaaac tggcaaaaca gccgatggca 360 gaaagcgagt tgttgcaggg cacgctggag ccgactaacg agccttatgc tattgccaaa 420 atcgccggga tcaaactgtg cgaatcatac aaccgccagt acggacgcga ttaccgctca 480 gtcatgccga ccaacctgta cgggccacac gacaacttcc acccgagtaa ttcgcatgtg 540 atcccagcat tgctgcgtcg cttccacgag gcgacggcac agaatgcgcc ggacgtggtg 600 gtatggggca gcggtacacc gatgcgcgaa tttctgcacg tcgatgatat ggcggcggcg 660 agcattcatg tcatggagct ggcgcatgaa gtctggctgg agaacaccca gccgatgttg 720 tcgcacatta acgtcggcac gggcgttgac tgcactatcc gcgagctggc gcaaaccatc 780 gccaaagtgg tgggttacaa aggccgggtg gtttttgatg ccagcaaacc ggatggcacg 840 ccgcgcaaac tgctggatgt gacgcgcctg catcagcttg gctggtatca cgaaatctca 900 ctggaagcgg ggcttgccag cacttaccag tggttccttg agaatcaaga ccgctttcgg 960 gggtaa 966 <210> 3 <211> 1254 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 atgtactatt taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt cttttacttt 60 tttatcatgg gagcctactt cccgtttttc ccgatttggc tacatgacat caaccatatc 120 agcaaaagtg atacgggtat tatttttgcc gctatttctc 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taccagccag 1020 tttgaagtgc gtttttcagc gacgatttat ctggtctgtt tctgcttctt taagcaactg 1080 gcgatgattt ttatgtctgt actggcgggc aatatgtatg aaagcatcgg tttccagggc 1140 gcttatctgg tgctgggtct ggtggcgctg ggcttcacct taatttccgt gttcacgctt 1200 agcggccccg gcccgctttc cctgctgcgt cgtcaggtga atgaagtcgc ttaa 1254 <210> 4 <211> 807 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Pseudopedobacter saltans <400> 4 atgatatttg taaccggata tggccagatg tgtaacaaca tccttcaatt tgggcatttc 60 tttgcttatg caaaaagaaa tggtttaaaa acggttggct tacgtttttg ctacaaatac 120 acttttttca agattagtaa cgaaaaaggc tataattggc cgacctatct ttatgcaaaa 180 tatggggcaa aaataggact tataaagtct gttgattttg acgaatcatt cgaaggtaca 240 aatgtagatt ctcttcaatt agacaaacaa accgtgttag ccaaaggctg gtattttaga 300 gactaccagg gatttcttaa ttaccgtaat gagcttaaag cacttttcga ctttaaagag 360 catattaaga aaccggtaga acagtttttt tcaacgttat caaaagacac catcaaagta 420 ggcctgcata taagacgtgg tgattataag acctggcacc agggtaaata cttttttagc 480 gacgaagaat acggtcaaat cgtaaattct tttgctaaaa gtttagataa 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115 120 125 Phe Phe Ser Thr Leu Ser Lys Asp Thr Ile Lys Val Gly Leu His Ile 130 135 140 Arg Arg Gly Asp Tyr Lys Thr Trp His Gln Gly Lys Tyr Phe Phe Ser 145 150 155 160 Asp Glu Glu Tyr Gly Gln Ile Val Asn Ser Phe Ala Lys Ser Leu Asp 165 170 175 Lys Pro Val Glu Leu Ile Ile Val Ser Asn Asp Pro Lys Leu Asn Ser 180 185 190 Lys Ser Phe Glu Asn Leu Thr Ser Cys Lys Val Ser Met Leu Asn Gly 195 200 205 Asn Pro Ala Glu Asp Leu Tyr Leu Leu Ser Lys Cys Asp Tyr Ile Ile 210 215 220 Gly Pro Pro Ser Thr Phe Ser Leu Met Ala Ala Phe Tyr Glu Asp Arg 225 230 235 240 Pro Leu Tyr Trp Ile Phe Asp Lys Glu Lys Gln Leu Leu Ala Glu Asn 245 250 255 Phe Asp Lys Phe Glu Asn Leu Phe Arg His Ile Ile 260 265

Claims (4)

  1. α-1,2-푸코오스 전이효소 (α-1,2-fucosyltransferase)가 발현되도록 형질전환되고, GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (GDP-D-mannose-4,6-dehydratase)가 발현되도록 형질전환되며, GDP-L-푸코오스 신타아제 (GDP-L-fucose synthase)가 발현되도록 형질전환되고, 락토오스 퍼미아제 (lactose permease)가 발현되도록 형질전환되며, 포스포만노뮤타아제 (phosphomannomutase) 및 GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (GTPmannose-1-phosphate guanylyltransferase)를 보유하고 있는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)을 락토오스가 첨가된 배지에 배양하여 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose)를 생산함에 있어서,
    상기 락토오스는 40 ~ 100 g/L의 농도로 유지하면서 배양하여 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose)를 고수율로 생산하는 것을 특징으로 하는 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose)의 생산방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은,
    포스포만노뮤타아제 (Phosphomannomutase)가 과발현되도록 형질전환되고, GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라아제 (GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase)가 과발현되도록 형질전환된 것을 특징으로 하는 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose)의 생산방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 배지는,
    글루코오스를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 2'-푸코실락토오스의 생산방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 2'-푸코실락토오스의 생산방법은,
    글루코오스 또는 락토오스를 추가로 공급하는 유가식 배양인 것을 특징으로 하는 2'-푸코실락토오스의 생산방법.
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