JP2018515118A - コリネバクテリウムグルタミクムを用いた２’−フコシルラクトースの生産方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、α−１，２−フコース転移酵素（α−１，２−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，Ｇｍｄ）、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ−ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＷｃａＧ）及びラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ，ＬａｃＹ）が発現されるように形質転換され、ホスホマンノムターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）及びＧＴＰ−マンノース−１−フォスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を保有していることを特徴とするフコシルラクトース生産用組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）及びこれを用いたフコシルラクトースの製造方法に関する。本発明に係る組換えコリネバクテリウムグルタミクム及びこれを用いたフコシルラクトース生産方法によれば、ＧＲＡＳであるコリネバクテリウムグルタミクム菌株を使用することによって、従来の大腸菌に比べて安全であり、生産濃度が低いため産業的側面で適用不可能だった従来技術の制約を克服し、非常に高い濃度で２’−フコシルラクトースを生産することができる。

Description

本発明は、α−１，２−フコース転移酵素（α−１，２−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，Ｇｍｄ）、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ＧＤＰ−４−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ−３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ−４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＷｃａＧ）及びラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ，ＬａｃＹ）が発現されるように形質転換され、ホスホマンノムターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ，ＭａｎＢ）及びマンノース−１−フォスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＭａｎＣ）が過発現されるように形質転換された組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）及びこれを用いたフコシルラクトースの生産方法に関する。

人の母乳には約２００種以上の独特の構造を有するオリゴ糖（ｈｕｍａｎ ｍｉｌｋ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ＨＭＯ）が他の哺乳類の乳に比べて非常に高い濃度（５〜１５ｇ／Ｌ）で存在する。
ＨＭＯはプレバイオティック（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ）効果、病原菌感染予防、免疫システム調節及び頭脳発達のように乳児の発達及び健康に肯定的な影響を及ぼす様々な生物学的活性を提供するため、乳児期における母乳育児が非常に重要である。
母乳には約２００種のオリゴ糖が含まれており、中でも、特に、２’−フコシルラクトースと３’−フコシルラクトースが前述の様々な生物学的活性に関与する主要ＨＭＯであると報告されている。これによって、最近では、フコシルラクトースが乳児用粉ミルク、老人用健康機能食品素材及び医薬品素材として利用される可能性から注目されている。しかし、女性の約２０％はフコシルオリゴ糖を合成するフコース転移酵素の変異のため体内でそれらをよく合成できないと知られている。このため、フコシルラクトースの産業的生産が必要な実情である。
現在、フコシルラクトースは産業的に大量生産し難いため、それらに代えて、類似体であるガラクトオリゴ糖（ｇａｌａｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）又はフラクトオリゴ糖（ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を離乳食に添加して類似の効果を期待しているのが実情である。
一方、フコシルラクトースの生産方法には、母乳から直接抽出する方法及び化学的又は酵素的方法で合成する方法がある。
直接抽出する方法は、母乳供給の限界及び低い生産性が問題であり、化学的合成法は、高価の基質、低い異性体選択性（ｓｔｅｒｅｏ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）と生産収率、毒性有機溶媒の使用などの問題がある。また、酵素的合成法はフコースの供与体（ｄｏｎｏｒ）として利用されるＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅが非常に高価という問題及びフコース転移酵素（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の精製コストが高いという問題がある。
上記のような問題から、直接抽出、化学的又は酵素的生産法は、フコシルラクトースの大量生産に適用し難く、大量生産のための技術がほとんどないのが実情である。しかし、２’−フコシルラクトースを用いた健康機能性食品及び医薬品素材への開発は期待できるため、微生物を用いた２’−フコシルラクトースの産業的生産のためのより多い研究が切望されている。

微生物を用いた２’−フコシルラクトース生産の従来の技術は、組換え大腸菌を用いた生産技術が大部分であった。しかし、実験用に利用される大部分の大腸菌は、実際に病原菌ではないが、消費者にとっては有害な菌という認識が強い。
また、大腸菌の細胞膜成分がエンドトキシンとして作用し得ることから、２’−フコシルラクトースの生産において分離精製のコストが多くかかる。したがって、食品及び医薬品の素材であるフコシルラクトースを生産する宿主細胞として大腸菌を用いることには困難がある。

本発明は、食品及び医薬品の素材であるフコシルラクトースを生産する宿主細胞として、大腸菌より安全なコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を用いるとともに、高濃度、高収率、高生産性で２’−フコシルラクトースを生産する方法を提供することを目的とする。

本発明は、α−１，２−フコース転移酵素（α−１，２−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が発現されるように形質転換され、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）が発現されるように形質転換され、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）が発現されるように形質転換され、ラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ）が発現されるように形質転換され、ホスホマンノムターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）及びＧＴＰ−マンノース−１−フォスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を保有していることを特徴とする組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を提供する。
本発明者らは、大韓民国特許登録番号第１０−１５４４１８４号（２０１５．０８．２１）において「大腸菌を用いた２’−フコシルラクトース生産方法」の特許を受けたことがある。しかし、２’−フコシルラクトースを機能性食品添加物として用いるにあたって、それを、大腸菌を用いて生産することは、大腸菌が有する様々な安全上の心配から問題になり得るという指摘がある。したがって、本発明では食品安全上の問題がない代替菌株を用いて２’−フコシルラクトースを生産する。

本発明では、２’−フコシルラクトースを生産する宿主細胞としてコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を選定したが、この菌株は、従来使用した大腸菌とは違い、ＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ ｓａｆｅ）と認められた菌株であるだけでなく、エンドトキシンを生産せず、食品添加物であるアミノ酸及び核酸の工業生産に広く利用されている菌株である。したがって、コリネバクテリウムグルタミクムは食品及び医薬品素材の生産に適した菌株であるといえ、安全面に対する消費者の懸念を払拭させることができる。

ところが、大腸菌とコリネバクテリウムグルタミクムとは菌株自体の遺伝的特性が異なるため、大腸菌に適用した方法とは異なる方法を用いなければならない。２’−フコシルラクトースを生産するためには、大腸菌であれ、コリネバクテリウムグルタミクムであれ、基本的に外来のα−１，２−フコース転移酵素（α−１，２−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を導入しなければならないことは同一であるが、コリネバクテリウムグルタミクムは、それに加えて、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，Ｇｍｄ）、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（この酵素はＧＤＰ−４−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ−４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅとも呼ばれる。また、略語では「ＷｃａＧ」と呼ぶが、この酵素を暗号化する遺伝子を特に「ＷｃａＧ」と呼ぶ）、ラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ，ＬａｃＹ）を導入しなければならない。すなわち、大腸菌はＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，Ｇｍｄ）、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＷｃａＧ）、ラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ，ＬａｃＹ）を暗号化する遺伝子を有しているが、コリネバクテリウムグルタミクム菌株は上記酵素を暗号化する遺伝子を有しておらず、これを外部から導入して発現させなければならない。

α−１，２−フコース転移酵素（α−１，２−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を暗号化する遺伝子は、好ましくは、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）由来のものであり、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，Ｇｍｄ）、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ−ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＷｃａＧ）及びラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ，ＬａｃＹ）を暗号化する遺伝子は、大腸菌から由来したものである。

本発明の組換えコリネバクテリウムグルタミクムは、ホスホマンノムターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）が過発現されるように形質転換され、ＧＴＰ−マンノース−１−フォスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が過発現されるように形質転換されたものが好ましい。コリネバクテリウムグルタミクムは、ホスホマンノムターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ，ＭａｎＢ）、ＧＴＰ−マンノース−１−フォスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＭａｎＣ）を暗号化する遺伝子を独自で保有して発現させることができるため、必ずしもこの酵素を暗号化する遺伝子を導入する必要はないが、大量生産のためにはこの酵素を過発現させる必要がある。したがって、本発明では、これらの２つの酵素を過発現し得るようにコリネバクテリウムグルタミクムを形質転換することが好ましい。

上記酵素の作用は、図１から理解できるため、それに関する説明は省く。ただし、特筆すべきは、ラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ，ＬａｃＹ）は、菌株の外部に存在するラクトースを菌株の内部に輸送することに関与する酵素であることである。
下記の本発明の実施例では大腸菌のＬａｃオペロンからｌａｃＺが除去されたｌａｃＹＡ遺伝子を導入して実験したが、本発明においてＬａｃオペロンの導入理由がラクトースの流入に関するものであるため、必ずしもｌａｃＡ遺伝子を要せず、ｌａｃＹ遺伝子だけを導入しても十分である。
本発明で使用する「発現」という用語は、本発明のコリネバクテリウムグルタミクム菌株が独自で発現させられない酵素を人為的に発現させるために、外部由来の遺伝子を菌株内に導入して発現させることを意味する。「過発現」という用語は、本発明のコリネバクテリウムグルタミクム菌株が独自で該当の酵素を暗号化する遺伝子を備えており、独自で発現させることができるが、大量生産の目的でその発現量を増大させるために人為的に該当の酵素の発現量を増大させて過発現することを意味する。

本発明者らは上記で説明した形質転換戦略を用いて、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）から母乳オリゴ糖である２’−フコシルラクトースを大量生産し得ることが確認できた。

本発明において、上記α−１，２−フコース転移酵素（α−１，２−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコーディングする遺伝子は、一例として、ｆｕｃＴ２遺伝子であることが好ましく、野生型のｆｕｃＴ２遺伝子（例えば、配列番号４）の一部の塩基を変形した配列番号６に記載された核酸配列を有するｆｕｃＴ２遺伝子であることがより好ましい。配列番号６に記載された核酸配列を有するｆｕｃＴ２遺伝子を導入する場合、野生型ｆｕｃＴ２遺伝子に比べて２’−フコシルラクトースの生産量が増えることが確認された。

本発明は、ラクトースが添加されている培地に、本発明の組換えコリネバクテリウムグルタミクムを培養することを特徴とする２’−フコシルラクトースの生産方法を提供する。本発明の組換えコリネバクテリウムグルタミクム菌株を用いる場合、高濃度、高収率、高生産性で２’−フコシルラクトースを生産することができる。

本発明の２’−フコシルラクトースの生産方法において、上記培地は、グルコースをさらに含むことが好ましい。グルコースが培地に追加されることによって菌株の生育が活発になり、より高い生産性で２’−フコシルラクトースを生産することができる。
本発明の２’−フコシルラクトースの生産方法は、グルコース又はラクトースをさらに供給する流加式培養であることが好ましい。流加式培養によってグルコース又はラクトースを持続して供給すると、細胞の成長をより増大させ、高純度、高収率、高生産性でフコシルラクトースを生産できる。流加式培養に関する細部の枝葉的な技術も当業界の公知技術を用いることができ、それについてはその記載を省くものとする。

コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）菌株でＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ及びフコシルラクトースを生合成するために導入した代謝経路を示す図である。 ｌａｃＺが除去されたｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）の導入がコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）での２’−フコシルラクトース生産に及ぼす影響を評価して示すグラフである。 図２ａは、ＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ及びＷｃａＧだけを過発現させたコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）菌株（対照群）の培養結果である。 図２ｂは、ＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ及びＷｃａＧを過発現させ、ＦｕｃＴ２をさらに導入した菌株（比較例１）の培養結果である。 図２ｃは、ＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、ＷｃａＧ、ＦｕｃＴ２及びｌａｃＺ遺伝子が除去されたｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）を導入した菌株（実施例１）の培養結果である。 グラフ中の記号は次のとおりである。 黒丸：乾燥細胞重量、 黒四角：グルコース、 黒三角：ラクトース、 黒逆三角：ラクテート、 黒菱形：２’−フコシルラクトース。 組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴを用いた回分式培養結果を示すグラフである。 図３ａは、フラスコ回分式培養結果である。 図３ｂは、発酵器回分式培養結果である。光学密度（ＯＤ_６００）が約０．８に達すると、ＩＰＴＧとラクトースを、最終濃度がそれぞれ１．０ｍＭ、１０ｇ／Ｌ（矢印）となるように添加した。 グラフ中の記号は上記と同一である。 組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の回分式培養液をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析して２’−フコシルラクトースの生産を確認した結果である。 図４ａは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＰ ＭＳを用いて陽イオンモードで分子量にてフコシルラクトースの生成を示すグラフである。 図４ｂは、タンデム質量分析法（Ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＭＳ／ＭＳ）を用いてフコシルラクトースの構造的組成を確認したグラフである。 組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴを用いた流加式培養結果を示すグラフである。初期に投入した４０ｇ／Ｌグルコースが全て消費された後、グルコースを連続（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｅｅｄｉｎｇ）方式で供給し始め、ＩＰＴＧとラクトースを同時に添加した（大きい矢印）。 グラフ中の記号は上記と同一である。 ヘリコバクターピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）由来のｆｕｃＴ２遺伝子の翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）効率を増大させるために、ｆｕｃＴ２遺伝子をコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に合うようにｃｏｄｏｎ最適化した結果を示す図である。 コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）でｃｏｄｏｎ最適化されたｆｕｃＴ２遺伝子（ＣＯｆｕｃＴ２）の導入が２’−フコシルラクトース生産に及ぼす影響を示すグラフである。 図７ａは、組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴ（ＣＯ）を用いたフラスコ回分式培養結果であり、光学密度（ＯＤ_６００）が約０．８に達すると、ＩＰＴＧとラクトースを最終濃度がそれぞれ１．０ｍＭ、１０ｇ／Ｌ（矢印）となるように添加した。 図７ｂは、組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴ（ＣＯ）を用いた発酵器流加式培養結果を示すグラフであり、初期に投入した４０ｇ／Ｌグルコースが全て消費された後、グルコースを連続（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｅｅｄｉｎｇ）方式で供給し始め、ＩＰＴＧとラクトースを同時に添加した（大きい矢印）。 グラフ中の記号は上記と同一である。

以下、本発明の内容を下記の実施例に基づいてより詳しく説明する。ただし、本発明の権利範囲は、下記の実施例に限定されるものではなく、それと同等の技術的思想の変形も含む。

［実施例１：組換え菌株及びプラスミド製作］
プラスミド製作及び２’−フコシルラクトース（２’−ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ，２’−ＦＬ）の生産のために、それぞれ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０及びコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２を用いた。
ｐＶＢＣＬプラスミドを構築するためにコリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡから２つのＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ＿ＰｓｔＩ−ｍａｎＢとＲ＿ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ−ＸｂａＩ−ｍａｎＢ）を用いたＰＣＲ反応によってｍａｎＢ遺伝子を増幅した。その後、制限酵素ＰｓｔＩとＢａｍＨＩを処理して同制限酵素が処理されたｐＶＷＥｘ２プラスミドにこれを挿入した。構築された上記プラスミドに、再びコリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡから２つのＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ＿ＸｂａＩ−ｍａｎＣとＲ＿ＳｐｅＩ−ｍａｎＣ）を用いたＰＣＲ反応によってｍａｎＣ遺伝子を増幅し、制限酵素ＸｂａＩとＳｐｅＩを処理した後に挿入することによって、ｐＶｍＢＣを構築した。そして、先行研究（韓国登録特許第１０−１５４４１８４号）で構築されたｐＧｌａｃＹＡプラスミドから２つのＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ＿ｉｎｆ＿ＡｓｉＳＩ＿ｌａｃＹＡとＲ＿ｉｎｆ＿ＡｓｉＳＩ＿ｌａｃＹＡ）を用いたＰＣＲ反応によってｌａｃＹＡ遺伝子クラスタを増幅した後、制限酵素ＡｓｉＳＩを処理して同制限酵素が処理されたｐＶｍＢＣプラスミドにこれを挿入することによってｐＶＢＣＬプラスミドを構築した。

また、ｐＥＧＷＴプラスミドを構築するために、大腸菌であるＫ−１２ＭＧ１６５５のｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡから２つのＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ＿ＫｐｎＩ−ｇｍｄとＲ＿ＳａｃＩ−ｗｃａＧ）を用いたＰＣＲ反応によってｇｍｄ−ｗｃａＧ遺伝子クラスタを増幅した後、制限酵素ＫｐｎＩとＳａｃＩを処理して同制限酵素が処理されたｐＥＫＥｘ２プラスミドに挿入することによってｐＥＧＷを構築した。

ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）ＡＴＣＣ７００３９２のｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡから２つのＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ＿ｉｎｆ＿ＳａｃＩ＿ＲＢＳ＿ｆｕｃＴ２とＲ＿ｉｎｆ＿ＳａｃＩ＿ｆｕｃＴ２）を用いたＰＣＲ反応によってｆｕｃＴ２遺伝子を増幅した後、制限酵素ＳａｃＩを処理して同制限酵素が処理されたｐＥＧＷプラスミドに挿入することによってｐＥＧＷＴを構築した。

ｐＢＨＡ（ＣＯｆｕｃＴ２）プラスミドからデザインされた２つのＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ＿ＳａｃＩ＿ＲＢＳ＿ＣＯｆｕｃＴ２とＲ＿ＳａｃＩ＿ＣＯｆｕｃＴ２）を用いたＰＣＲ反応によってｃｏｄｏｎ最適化されたｆｕｃＴ２遺伝子（ＣＯｆｕｃＴ２）を増幅した後、増幅されたＣＯｆｕｃＴ２遺伝子に制限酵素ＳａｃＩを処理して同制限酵素が処理されたｐＥＧＷプラスミドにこれを挿入することによってｐＥＧＷＴ（ＣＯ）を構築した（図１）。図１は、コリネバクテリウムグルタミクム菌株においてＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ及びフコシルラクトースを生合成するために導入した代謝経路である。

本実施例で用いられた遺伝子配列、菌株、プラスミド及びオリゴヌクレオチドを下記の表１〜４に示す。

遺伝子及び遺伝子配列

菌株

プラスミド

プライマ

＊イタリック体で表示された配列は、ＲＢＳ（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）及びｓｐａｃｅｒを意味する。
＊太字で表示した配列は、特定制限酵素の認知部位を示す。

［実施例２：組換えコリネバクテリウムグルタミクムの培養条件及び方法］
種菌培養には適切な抗生剤（ｋａｎａｍｙｃｉｎ ２５μｇ／ｍＬ，ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ５μｇ／ｍＬ）が含まれた５ｍＬのＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地が入っている実験管を利用し、温度は３０℃、撹拌速度を２５０ｒｐｍに維持しつつ１２時間培養した。
回分式培養は１００ｍＬ又は１Ｌの最小培地（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ２０ｇ／Ｌ、ｕｒｅａ ５ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １ｇ／Ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４ ０．２５ｇ／Ｌ、ＭＯＰＳ ４２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ_２ １０ｍｇ／Ｌ、Ｂｉｏｔｉｎ ０．２ｍｇ／Ｌ、Ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕｉｃ ａｃｉｄ ３０ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ_４７Ｈ_２０ １０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ_４Ｈ_２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ_４７Ｈ_２Ｏ １ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４ ０．２ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ_２６Ｈ_２Ｏ ０．０２ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）が入っている５００ｍＬ入の生物反応器（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ，Ｋｏｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃｈｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）において３０℃で行った。撹拌速度は、フラスコは２５０ｒｐｍ、生物反応器は１０００ｒｐｍ、２ｖｖｍに維持しつつ培養した。回分式培養時には光学密度（ＯＤ_６００）が０．８に達した時点でＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、ラクトースを最終濃度がそれぞれ１．０ｍＭ、１０ｇ／Ｌになるように添加した。

高濃度細胞培養のための流加式培養は、４０ｇ／Ｌのグルコース及び適切な抗生剤（ｋａｎａｍｙｃｉｎ ２５μｇ／ｍＬ、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ５μｇ／ｍＬ）を含む１．０Ｌの最小培地を含む２．５Ｌ入の生物反応器（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ，Ｋｏｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃｈｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）で実施した。
初期に添加したグルコースが完全に枯渇した後、８００ｇ／Ｌのグルコースを含む流入溶液（ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を５．７ｇ／Ｌ／ｈの速度にて連続（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｅｅｄｉｎｇ）方式で供給した。これと同時に、ｔａｃプロモータ−媒介遺伝子発現を誘導して２’−フコシルラクトースを生産するために、ＩＰＴＧ、ラクトースを、最終濃度が１．０ｍＭ、１０ｇ／Ｌになるように添加した。

発酵中に培地のｐＨが設定ポイント（ｓｅｔ−ｐｏｉｎｔ）より低くなると自動で２８％ ＮＨ_４ＯＨが供給され、高くなると２Ｎ ＨＣｌが添加されて、ｐＨが一定範囲内（ｐＨ６．９８〜７．０２）で維持されるようにした。培地のｐＨは、ｐＨ電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ，ＵＳＡ）を用いて実時間で測定した。撹拌速度及び通気速度は酸素欠乏を防止するためにそれぞれ１０００ｒｐｍ及び２ｖｖｍに維持した。

［実施例３：細胞及び代謝産物の濃度決定］
乾燥細胞重量は、光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ，ＯＤ）にあらかじめ測定した変換定数０．３をかけて決定した。光学密度（ＯＤ）は、サンプルを適切に希釈して光学密度を０．１〜０．５の範囲に合わせた後に、分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ２０００，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）を用いて吸光度６００ｎｍで測定した。
２’−フコシルラクトース、ラクトース、ラクテート、グルコース及び酢酸の濃度は、’Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｃｏｌｕｍｎ（Ｒｅｚｅｘ ＲＯＡ−ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，ＵＳＡ）’及び’ＲＩ（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）’検出器の装着されたＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ＬＣ，ＵＳＡ）を用いて測定した。６０℃で加熱したカラムを適用して１０倍希釈された２０μlの培養培地を分析した。０．６ｍＬ／ｍｉｎ流速で５ｍＭのＨ_２ＳＯ_４溶液を移動相として用いた。

［実験例１：ｌａｃＺ遺伝子が除去されたｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）の導入がコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）での２’−フコシルラクトース生産に及ぼす影響評価］
本実験例では、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）で２’−フコシルラクトースを生合成するためにラクトース輸送体を導入し、これによる影響を調べた。
そのために、先行研究（韓国登録特許第１０−１５４４１８４号）で構築されたＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２由来のｌａｃＺ遺伝子が除去されたｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）をコリネバクテリウムグルタミクムに導入して２’−フコシルラクトースの生産を試みた。

先行研究ではベータガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）の活性がなく、ラクトース輸送体の活性だけがある大腸菌を構築するために、大腸菌の遺伝体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）上のｌａｃオペロンを除去し、ベータガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）をコーディングするｌａｃＺ遺伝子を除去したｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）を再び大腸菌の遺伝体に導入することによって２’−フコシルラクトースを生産した（大韓民国登録特許第１０−１５４４１８４号）。

ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ生合成酵素であるＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、ＷｃａＧだけを過発現させた組換えコリネバクテリウムグルタミクム菌株（対照群）、ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ生合成酵素であるＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、ＷｃａＧを過発現させ、ＦｕｃＴ２をさらに導入した菌株（比較例１）及びＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ生合成酵素であるＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、ＷｃａＧ、ＦｕｃＴ２及びｌａｃＺ遺伝子が除去されたｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）を導入した菌株（実施例１）を用いて実験した。フラスコで回分式培養によって対照群、比較例１及び実施例１を比較することによって、ｌａｃＹＡオペロン及びフコース転移酵素の導入が２’−フコシルラクトースの生産に及ぼす影響を評価した。

実験の結果、ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ生合成酵素であるＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、ＷｃａＧだけを過発現させたコリネバクテリウムグルタミクム菌株（対照群）及びＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ生合成酵素であるＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、ＷｃａＧを過発現させ、ＦｕｃＴ２をさらに導入した菌株（比較例１）では２’−フコシルラクトースが全く生産されなかった。
しかし、ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ生合成酵素であるＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、ＷｃａＧ、ＦｕｃＴ２及びｌａｃＺ遺伝子が除去されたｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）を導入した菌株（実施例１）では２’−フコシルラクトースが生産されることを確認した（表５及び図２）。
図２は、ｌａｃＺが除去されたｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）の導入がコリネバクテリウムグルタミクムでの２’−フコシルラクトース生産に及ぼす影響を評価して示すグラフである。図２ａは対照群、図２ｂは比較例１及び図２ｃは実験例１の培養結果である。

上記の結果から、ラクトース輸送体が導入されることによってラクトースが菌株内に流入して２’−フコシルラクトースを生産するのに用いられており、したがって、２’−フコシルラクトースの生産には、ｌａｃＺ遺伝子が除去されたｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）の導入が必須だということが確認できた。

ｌａｃＺが除去されたｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）の導入がコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）での２’−フコシルラクトース生産に及ぼす影響評価

［実験例２：回分式培養を用いた２’−フコシルラクトースの生産］
実験例１で構築された組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の２’−フコシルラクトース生産性能及び発酵特徴を調べるために、ＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、ＷｃａＧ、ＦｕｃＴ２及びｌａｃＺが除去されたｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）を導入した組換えコリネバクテリウムグルタミクムをそれぞれフラスコと発酵器で回分式培養した。光学密度（ＯＤ_６００）が０．８に達した時点で、ＩＰＴＧ、ラクトースを、最終濃度がそれぞれ１．０ｍＭ、１０ｇ／Ｌになるように添加した。
フラスコ回分式培養の結果、２４６ｍｇ／Ｌの２’−フコシルラクトースが生産され、この時のラクトースに対する２’−フコシルラクトースの収率は０．２２ｍｏｌｅ ２’−フコシルラクトース／ｍｏｌｅラクトース、生産性は４．９７ｍｇ／Ｌ／ｈだった（図３及び表６）。

一方、発酵器回分式培養では２７４ｍｇ／Ｌの２’−フコシルラクトースが生産され、ラクトースに対する２’−フコシルラクトースの収率は０．３４ｍｏｌｅ／ｍｏｌｅ、生産性は５．６ｍｇ／Ｌ／ｈが得られ、これは、フラスコ培養に比べて２’−フコシルラクトースの最終濃度が約１１％、収率は５５％、生産性は１２％向上した数値である。これは、発酵器において温度、ｐＨ及び酸素供給などの条件がフラスコ培養に比べてよく調節されたからだと考えられる。

上記回分式培養の結果を下記の表６に表す。図３は、組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴを用いた回分式培養結果を示すグラフである。図３ａはフラスコ回分式培養結果であり、図３ｂは発酵器回分式培養結果である。

組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴを用いた回分式培養結果

^ａラクトースと２’−フコシルラクトースの濃度は、培地にあるものだけを定量した数値である。

［実験例３：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を用いた２’−フコシルラクトース生産の確認］
上記実験例２の回分式培養で生産された２’−フコシルラクトースを確認するために、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて定性分析を実施した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＰ ＭＳを用いて陽イオンモードで分子量を測定した結果、２−フコシルラクトースに１分子のナトリウムが結合された分子量である５１１．１６４ｍ／ｚのピークの存在が確認できた。
また、このピークの構造的組成を確認するために、タンデム質量分析法（Ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＭＳ／ＭＳ）を用いて分析した結果、２’−フコシルラクトースを構成するグルコース、ガラクトース及びフコースで構成されていることを確認した（図４）。図４は、組換えコリネバクテリウムグルタミクムの培養液にＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行って２’−フコシルラクトースの生産を確認した結果である。図４ａは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＰ ＭＳを用いて培養液中の物質を陽イオンモードで分子量分析してフコシルラクトースの生成を確認したものであり、図４ｂは、タンデム質量分析法（Ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＭＳ／ＭＳ）を用いて５１１．１３４ｍ／ｚのピークが２’−フコシルラクトースであることを構造的に確認したものである。
実験の結果、上記の回分式培養で２’−フコシルラクトースが生産されたことが確認できた。

［実験例４：流加式培養を用いた２’−フコシルラクトースの生産］
高濃度の細胞培養によって高濃度２’−フコシルラクトースを生産するために、ｐＶＢＣＬ、ｐＥＧＷＴプラスミドを導入した組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を用いて２．５Ｌレベルの発酵器で流加式培養を実施した。
初期に添加した４０ｇ／Ｌのグルコースを全て消費した時点から細胞生長を維持するために流入溶液（ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を連続（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｅｅｄｉｎｇ）方式を用いて５．７ｇ／Ｌ／ｈの速度で供給した。これと同時に、２’−フコシルラクトースの生産を誘導するためにＩＰＴＧとラクトースを添加した。

実験の結果、発酵が進行される間に酢酸は全く生成されず、グルコースの代謝によって細胞は最終的に乾燥細胞重量５７．３ｇ／Ｌに到達した。また、最大２’−フコシルラクトースの濃度は５．８ｇ／Ｌ、ラクトースに対する生産収率は０．５５ｍｏｌｅ ２’−フコシルラクトース／ｍｏｌｅラクトースであり、生産性は０．０６ｇ／Ｌ／ｈが得られた（図５及び表７）。
２’−フコシルラクトースの生産のための流加式培養の結果を表７に示す。図５は、組換えコリネバクテリウムグルタミクムｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴを用いた流加式培養結果を示すグラフである。

組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴを用いた流加式培養結果

^ａ２−ＦＬ生産性はＩＰＴＧ導入以降から計算した数値である。
^ｂラクトースと２’−フコシルラクトースの濃度は、培地にあるものだけを定量した数値である。

［実験例５：コドン最適化（ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）されたｆｕｃＴ２遺伝子（ＣＯｆｕｃＴ２）の導入が組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の２’−フコシルラクトース生産に及ぼす影響評価］
（１）コドン最適化（ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）されたｆｕｃＴ２遺伝子（ＣＯｆｕｃＴ２）の製作
組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）でヘリコバクターピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）由来のα−１，２−フコース転移酵素であるｆｕｃＴ２遺伝子の翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）効率を増大させるために、ｆｕｃＴ２遺伝子をコリネバクテリウムグルタミクムのコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）によってコドン最適化を実施した。
実験の結果、既存のｆｕｃＴ２遺伝子に比べて約１７．１％の配列が変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）されたことを確認した（図６）。図６は、ｆｕｃＴ２遺伝子をコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に合うようにコドン最適化した結果である。

（２）コドン最適化（ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）されたｆｕｃＴ２遺伝子（ＣＯｆｕｃＴ２）の導入が２’−フコシルラクトース生産に及ぼす影響評価
コドン最適化されたｆｕｃＴ２遺伝子（ＣＯｆｕｃＴ２）を用いて構築された組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の２’−フコシルラクトース生産性能及び発酵特徴を調べるために、フラスコで回分式培養、発酵器で流加式培養をそれぞれ実施した。
回分式培養では、光学密度（ＯＤ_６００）が０．８に達した時点で、ＩＰＴＧ及びラクトースを、最終濃度がそれぞれ１．０ｍＭ、１０ｇ／Ｌになるように添加し、流加式培養では、初期に添加した４０ｇ／Ｌのグルコースを全て消耗した時点から、細胞生長を維持するために流入溶液（ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を連続式（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｅｅｄｉｎｇ）方法を用いて５．７ｇ／Ｌ／ｈの速度で供給した。これと同時に、２’−フコシルラクトースの生産を誘導するためにＩＰＴＧとラクトースを添加した。
回分式培養の結果、３７０ｍｇ／Ｌの２’−フコシルラクトースが生産され、この時のラクトースに対する２’−フコシルラクトースの収率は０．２８ｍｏｌｅ ２’−フコシルラクトース／ｍｏｌｅラクトース、生産性は７．１８ｍｇ／Ｌ／ｈだった（図７ａ及び表８）。これは、実験例２の結果に比べて２’−フコシルラクトースの最終濃度が約５０％、収率は２７％、生産性は４４％向上した数値である。
一方、流加式培養結果では８．１ｇ／Ｌの２’−フコシルラクトースが生産され、ラクトースに対する２’−フコシルラクトースの収率は０．４２ｍｏｌｅ／ｍｏｌｅ、生産性は０．０７ｇ／Ｌ／ｈが得られた（図７ｂ及び表８）が、これは、野生型ｆｕｃＴ２を導入した時の結果（実験例４）に比べて２’−フコシルラクトースの最終濃度が約３９％、生産性は１７％向上した数値である。

培養の結果を表８に示す。図７ａは、組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴ（ＣＯ）を用いたフラスコ回分式培養結果を示すグラフであり、図７ｂは、組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴ（ＣＯ）を用いた発酵器流加式培養結果を示すグラフである。

組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴ（ＣＯ）を用いた回分式及び流加式培養結果

^ａ２−ＦＬ生産性はＩＰＴＧ導入以降から計算した数値である。
^ｂラクトースと２’−フコシルラクトースの濃度は、培地にあるものだけを定量した数値である。

Claims (7)

1. α−１，２−フコース転移酵素（α−１，２−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が発現されるように形質転換され、
   ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）が発現されるように形質転換され、
   ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）が発現されるように形質転換され、
   ラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ）が発現されるように形質転換され、
   ホスホマンノムターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）及びＧＴＰ−マンノース−１−フォスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を保有していることを特徴とする組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）。
2. 前記α−１，２−フコース転移酵素（α−１，２−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、ｆｕｃＴ２遺伝子で暗号化されたものである請求項１に記載の組換えコリネバクテリウムグルタミクム。
3. 上記ｆｕｃＴ２遺伝子は、配列番号６の核酸配列で構成されている請求項２に記載の組換えコリネバクテリウムグルタミクム。
4. 上記組換えコリネバクテリウムグルタミクムは、ホスホマンノムターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）が過発現されるように形質転換され、
   ＧＴＰ−マンノース−１−フォスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が過発現されるように形質転換されたものである請求項１に記載の組換えコリネバクテリウムグルタミクム。
5. ラクトースが添加されている培地に、請求項１に記載の組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を培養することを特徴とする２’−フコシルラクトースの生産方法。
6. 上記培地は、グルコースをさらに含む請求項５に記載の２’−フコシルラクトースの生産方法。
7. 上記フコシルラクトースの生産方法は、
   グルコース又はラクトースをさらに供給する流加式培養である請求項６に記載の２’−フコシルラクトースの生産方法。
   

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