JP2015504654A - コラン酸、マンノシル化及び／又はフコシル化オリゴ糖を合成するための変異体微生物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、種々の化合物の合成のための変異及び/又は形質転換した微生物に関する。より具体的には、本発明は、調節因子ArcA及びIclRをコードする遺伝子が変異した微生物を開示する。この変異は、コラン酸オペロンの一部である遺伝子の顕著なアップレギュレーションをもたらす。よって、前記微生物は、コラン酸経路の一部である任意の化合物(例えば、GDP-フコース、GDP-マンノース及びコラン酸)の合成に有用であり、そして/又は(前駆体としてGDP-フコースから出発して)フコシル化オリゴ糖を合成するため若しくは(前駆体としてGDP-マンノースから出発して)マンノシル化オリゴ糖を合成するために更に使用できる。加えて、転写調節因子であるArcA及びIclRをコードする遺伝子の変異は、対数増殖期に酸耐性表現型を導き、pH感受性分子又は有機酸の合成を可能にする。【選択図】なし
Description
発明の分野
本発明は、種々の化合物の合成のための変異及び/又は形質転換した微生物に関する。具体的には、本発明は、調節因子ArcA及びIclRをコードする遺伝子が変異した微生物を開示する。この変異は、コラン酸オペロンの一部である遺伝子の顕著なアップレギュレーションをもたらす。よって、前記微生物は、コラン酸経路の一部である任意の化合物(例えば、GDP-フコース、GDP-マンノース及びコラン酸)の合成に有用であり、そして/又は(前駆体としてGDP-フコースから出発して)フコシル化オリゴ糖を合成するため若しくは(前駆体としてGDP-マンノースから出発して)マンノシル化オリゴ糖を合成するために更に使用できる。加えて、転写調節因子であるArcA及びIclRをコードする遺伝子の変異は、対数増殖期に酸耐性表現型を導き、pH感受性分子及び有機酸の合成を可能にする。
本発明は、種々の化合物の合成のための変異及び/又は形質転換した微生物に関する。具体的には、本発明は、調節因子ArcA及びIclRをコードする遺伝子が変異した微生物を開示する。この変異は、コラン酸オペロンの一部である遺伝子の顕著なアップレギュレーションをもたらす。よって、前記微生物は、コラン酸経路の一部である任意の化合物(例えば、GDP-フコース、GDP-マンノース及びコラン酸)の合成に有用であり、そして/又は(前駆体としてGDP-フコースから出発して)フコシル化オリゴ糖を合成するため若しくは(前駆体としてGDP-マンノースから出発して)マンノシル化オリゴ糖を合成するために更に使用できる。加えて、転写調節因子であるArcA及びIclRをコードする遺伝子の変異は、対数増殖期に酸耐性表現型を導き、pH感受性分子及び有機酸の合成を可能にする。
発明の背景
有気呼吸制御タンパク質をコードする遺伝子arcA及びイソクエン酸リアーゼ調節因子をコードする遺伝子iclRは、中心炭素代謝を調節することが知られている。ArcAは広範な種々の遺伝子を調節するグローバルな転写調節因子である一方、IclRはグリオキシレート経路を調節するローカルな転写調節因子である。ArcAは酸素欠乏に応答して中心炭素代謝を調節することが知られており、IclRとは、IclRもまたグリオキシレート経路を調節すること以外は無関係である(24，28，29，37，38)。初期の研究において、中心炭素代謝に対するΔiclRΔarcA変異体株の組合せ効果が観察された。トリカルボン酸(TCA)回路及びグリオキシレート経路の増大した流れが明らかにされ、両遺伝子をノックアウトすると驚くべき興味深い表現型が出現した。すなわち、この二重変異体株は最大理論的収率に近い収率でバイオマスを形成した(4，39)。
有気呼吸制御タンパク質をコードする遺伝子arcA及びイソクエン酸リアーゼ調節因子をコードする遺伝子iclRは、中心炭素代謝を調節することが知られている。ArcAは広範な種々の遺伝子を調節するグローバルな転写調節因子である一方、IclRはグリオキシレート経路を調節するローカルな転写調節因子である。ArcAは酸素欠乏に応答して中心炭素代謝を調節することが知られており、IclRとは、IclRもまたグリオキシレート経路を調節すること以外は無関係である(24，28，29，37，38)。初期の研究において、中心炭素代謝に対するΔiclRΔarcA変異体株の組合せ効果が観察された。トリカルボン酸(TCA)回路及びグリオキシレート経路の増大した流れが明らかにされ、両遺伝子をノックアウトすると驚くべき興味深い表現型が出現した。すなわち、この二重変異体株は最大理論的収率に近い収率でバイオマスを形成した(4，39)。
幾つかの化合物(例えばGDP-フコース)は需要が多い。GDP-フコースは、実際、フコシル化オリゴ糖(例えば、フコシルラクトース、フコシルラクトＮビオース及びルイスＸオリゴ糖)又はフコシル化タンパク質の前駆体である。これら糖はヒト母乳の成分であり、母乳中で、抗炎症性及びプレバイオティック(prebiotic)効果を有し、そして/又は薬物療法(therapeutics)で栄養補助食品、抗炎症剤又はプレバイオティクスとして利用され、加えて、フコシル化タンパク質は医薬品での応用が見出されている(5，8，27)。しかし、これら高価値化合物の効率的製造方法は依然として必要とされている。
加えて、GDP-マンノースはまた、GDP-フコースへの経路の中間体である。この経路を最終段階の前で遮断すると、(マンノシル化オリゴ糖の前駆体である)この化合物の蓄積がもたらされる。これらオリゴ糖は、例えばグラム陰性菌感染の治療での応用が見出されており、加えて、GDP-マンノースは、(或る種の治療用タンパク質の製造に必須である)グリコシル化タンパク質のヒト化に重要である(18，30)。また、マンノシル化オリゴ糖及びマンノシル化複合糖質は薬剤の標的化に使用され、例えばマンノシル化抗ウイルス薬は、肝臓及び腎臓を特異的に標的することができる(7)。
本発明は、これら化合物を効率的に産生することができるように遺伝的改変した微生物を提供する。
更に、pH感受性分子(例えば、グルコサミン；これに限定されない)及び有機酸(例えば、ピルビン酸、コハク酸、アジピン酸、シアル酸、シアル酸付加オリゴ糖…；これらに限定されない)の合成は、生成物を安定化するため又は下流での加工処理上の理由から、好ましくは低pHで行われる(4，12，40)。したがって、低pHで増殖できる株は、このような製造方法に有益である。イー・コリ(E. coli)は、種々の条件に容易に適応できる生物である。例えば、イー・コリは、胃の過酷なpH条件(約pH２)に容易に順応できる(14)。にもかかわらず、イー・コリは、これら条件で増殖しないようであるが、静止期に酸耐性機序を誘導する(40)。この静止期の間に細胞は増殖せず、したがって生産性が妨げられる。これまでに、この問題の解決法は見出されていない。しかし、本発明では、有機酸及びpH不安定生成物の産生に大抵使用される期である対数増殖期に酸耐性機序を誘導できる遺伝子操作微生物が提供される。
発明の説明
本発明は、コラン酸経路の一部である化合物を効率的に産生できるように遺伝的に改変した微生物(例えば、腸内細菌科；Enterobacteriaceae)を提供する。興味対象の特定の化合物は、フコシル化オリゴ糖合成の前駆体として使用するGDP-フコースである。フコシル化オリゴ糖は、上記のとおり健康促進効果を有するが、この化合物の製造に利用可能な効率的な製造方法は存在しない。
本発明は、コラン酸経路の一部である化合物を効率的に産生できるように遺伝的に改変した微生物(例えば、腸内細菌科；Enterobacteriaceae)を提供する。興味対象の特定の化合物は、フコシル化オリゴ糖合成の前駆体として使用するGDP-フコースである。フコシル化オリゴ糖は、上記のとおり健康促進効果を有するが、この化合物の製造に利用可能な効率的な製造方法は存在しない。
よって、本発明は、コラン酸オペロンの少なくとも１つの遺伝子をアップレギュレートするように改変された、転写調節因子である有気呼吸制御タンパク質ArcA及びイソクエン酸リアーゼ調節因子IclRの発現及び/又は活性を導く遺伝的改変を含む変異及び/又は形質転換した微生物の使用を提供する。ここで、前記オペロンは、ホスホマンノムターゼ、マンノース-1-リン酸グアニリルトランスフェラーゼ、GDP-マンノース4,6-デヒドラターゼ及びGDP-フコースシンターゼをそれぞれコードする遺伝子cpsG、cpsB、gmd及びfclを含んでなる。このオペロンは、遺伝子cpsG、cpsB、gmd、fcl及びwzaを含んでなってもよい。加えて、遺伝子rcsAの発現が増大している。この遺伝子は、コラン酸オペロンの転写調節因子である。この遺伝子の発現増強は、コラン酸オペロンの転写を増大させる(13，36)。
よって、本発明は、コラン酸オペロンの転写調節因子rcsAをアップレギュレートするように改変された、転写調節因子である有気呼吸制御タンパク質ArcA及びイソクエン酸リアーゼ調節因子IclRの発現及び/又は活性を導く遺伝的改変を含む変異及び/又は形質転換した微生物の使用に関する。ここで、転写調節因子rcsAのアップレギュレーションは、次に、コラン酸オペロンの少なくとも１つの遺伝子をアップレギュレートする。
よって、本発明は、転写調節因子：有気呼吸制御タンパク質ArcA及びイソクエン酸リアーゼ調節因子IclRの改変された発現を導く遺伝的改変を含む変異及び/又は形質転換した微生物(例えば、腸内細菌科、例えばエシェリキア・コリ(Escherichia coli)(イー・コリ)株；ただしこれらに限定されない)に関する。
よって、本発明は、転写調節因子：有気呼吸制御タンパク質ArcA及びイソクエン酸リアーゼ調節因子IclRの改変された発現を導く遺伝的改変を含む変異及び/又は形質転換した微生物(例えば、腸内細菌科、例えばエシェリキア・コリ(Escherichia coli)(イー・コリ)株；ただしこれらに限定されない)に関する。
本発明で使用する変異及び/又は形質転換した微生物(例えば、イー・コリ)は、当業者に公知の任意の方法(UV変異誘発及び化学的変異誘発を含むがこれらに限定されない)で取得できる。このような微生物の好適な取得方法は、タンパク質ArcA及びIclRをコードする遺伝子(arcA及びiclR)の破壊(ノックアウト)又は該遺伝子の内因性プロモーターの人工プロモーターでの置換又は内因性リボソーム結合部位の人工リボソーム結合部位での置換による。用語「人工プロモーター」は、既知の発現強度を有する、異種の又は非天然の又はコンピュータで設計したプロモーターに関し、これらプロモーターは、Alperら(2005)、Hammerら(2006)又はDe Meyら(2007)(3，11，15)に記載されるようなライブラリに由来し得る。用語 異種プロモーターとは、当該遺伝子の前に天然には存在しない任意のプロモーターをいう。用語「人工プロモーター」はまた、例えば実施例で更に明らかにされるような、天然型(自家)プロモーター配列と異なる(自家又は異種)プロモーター配列の部分との組合せであるDNA配列を有するプロモーターのことであってもよい。このような「人工プロモーター」の配列は、例えばpartsregistry.org(6)のようなデータベースに見出すことができる。用語「人工リボソーム結合部位」は、既知の又は測定可能な翻訳速度を有する、異種の又は非天然の又はコンピュータで設計されたリボソーム結合部位に関し、これらはライブラリに由来し得、又はSalisら(2009)(26)が記載するようなアルゴリズムにより設計することができる。
よって、本発明は、具体的には、遺伝的改変がArcA及びIclRをコードする遺伝子の破壊、又はArcA及びIclRをコードする遺伝子のコーディング配列中の変異によるArcA及びIclRの機能の低下若しくは消失；又はArcA及びIclRをコードする遺伝子の内因性プロモーターの人工プロモーターでの置換；又は内因性リボソーム結合部位の人工リボソーム結合部位での置換である、上記の変異及び/又は形質転換した微生物に関する。更に、本発明による変異体及び/又は形質転換体は、更に下記でも説明されるように、ゲノム内の１以上の他の遺伝子中に追加の遺伝的改変を更に含んでもよいことは明らかである。用語 微生物は、具体的には細菌に関し、より具体的には腸内細菌科に属する細菌に関する。この細菌は、好ましくは、エシェリキア・コリ種に属する任意の株(例えば、エシェリキア・コリＢ株、エシェリキア・コリＣ株、エシェリキア・コリＷ株、エシェリキア・コリK12株、エシェリキア・コリ ニッスル株；ただしこれらに限定されない)に関する。より具体的には、この用語は、研究室環境に十分に適合し、野生型株とは異なって腸内で繁殖する能力を喪失した(イー・コリK12株と名付けられた)培養エシェリキア・コリ株に関する。イー・コリK12株の周知例は、K12野生型、W3110、MG1655、M182、MC1000、MC1060、MC1061、MC4100、JM101、NZN111及びAA200である。よって、本発明は、具体的には、イー・コリ株がK12株である、上記の変異及び/又は形質転換したエシェリキア・コリ株に関する。より具体的には、本発明は、K12株がイー・コリMG1655である、上記の変異及び/又は形質転換したエシェリキア・コリ株に関する。
用語「改変された発現又は活性を導く(こと)」は、上記の変異/形質転換が前記遺伝子(arcA及びiclR)の本発明の転写調節因子タンパク質(ArcA及びIclR)への転写及び/又は翻訳及び/又は翻訳後修飾に、該転写が(本発明の特定遺伝子のいずれに関しても変異も形質転換もしていない)野生型株と比較して顕著に減少し又は完全に消失するように影響を及ぼすことを表す。よって、本発明は、改変された発現が発現減少である上記の変異及び/又は形質転換した微生物(例えば、エシェリキア・コリ株)及び発現減少が発現消失である上記の変異及び/又は形質転換した微生物(例えば、エシェリキア・コリ株)に関する。
用語「コラン酸オペロンの少なくとも１つの遺伝子をアップレギュレートする(こと)」は、コラン酸オペロンに属する少なくとも１、２、３、４、...又は全ての遺伝子の発現が、該変異及び/又は形質転換した微生物と同条件下で培養した対応する野生型微生物内での当該遺伝子の発現と比較したときに有意(＝Ｐ＞0.05)にアップレギュレートされていることを表す。コラン酸オペロンに属する遺伝子は、図３に示され且つ/又は(35)に記載されるようなwza、wzb、wzc、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、gmd、fcl、gmm、wcaI、cpsB、cpsG、wcaJ、wzxC、wcaK、wcaL及びwcaMである。更に、コラン酸オペロンの転写調節因子をコードする遺伝子rcsAがアップレギュレートされる(13，36)。より具体的には、用語「(コラン酸オペロンの転写調節因子又は)コラン酸オペロンの少なくとも１つの遺伝子をアップレギュレートする(こと)」は、コラン酸オペロンの少なくとも１つの遺伝子が対応する野生型微生物中でのコラン酸オペロンの当該遺伝子の発現と比較して６〜８倍アップレギュレートされることを表す。加えて、本発明は、天然型プロモーターの「人工プロモーター」での置換により、上記のコラン酸オペロンの遺伝子をアップレギュレートすることに関する。より具体的には、本発明は、天然型プロモーター配列と他の人工プロモーター配列との組合せに関する。天然型プロモーター配列と他の人工プロモーター配列との組合せは、より具体的には、天然型プロモーターのσ因子結合部位の、より強力なσ因子結合部位での置換である。σ因子(例えば、σ70、σS、σ24、…；ただし、これらに限定されない)は(41)に記載されており、遺伝子のプロモーター配列に対する親和性及び転写速度を決定するRNAポリメラーゼのサブユニットである。本発明は、コラン酸経路の一部である化合物を効率的に産生できるよう遺伝的に改変した微生物を提供する。
用語「コラン酸経路の一部である化合物」とは、図４に示すような、フルクトース-6-Pから出発し、細胞外コラン酸を生じる全ての化合物をいう。より具体的には、この用語は、化合物マンノース-6-P、マンノース-1-P、GDP-マンノース、GDP-4-デヒドロ-6デオキシ-マンノース、GDP-フコース及びコラン酸をいう。よって、本発明は、具体的には、コラン酸の合成及び/又はGDP-フコースの合成のための上記の使用に関する。GDP-フコースは、フコシル化オリゴ糖(例えば、フコシルラクトース、フコシルラクトＮビオース及びルイスＸオリゴ糖)又はフコシル化タンパク質の前駆体であり、また、これら糖は、薬物療法的、栄養補助食品的、抗炎症性及びプレバイオティック効果を有するので、本発明は、具体的には、フコシル化オリゴ糖の合成のための上記の使用に関する。換言すれば、本発明は、コラン酸オペロンの少なくとも１つの遺伝子をアップレギュレートするように転写調節因子である有気呼吸制御タンパク質ArcA及びイソクエン酸リアーゼ調節因子IclRを遺伝的に改変することを含んでなる、コラン酸及び/又はGDP-フコース及び/又はフコシル化オリゴ糖の合成方法に関する。ここで、前記オペロンは、遺伝子cpsG、cpsB、gmd及びfclを含んでなるか、又は遺伝子cpsG、cpsB、gmd、fcl及びwzaを含んでなる。より具体的には、本発明は、ArcA及びIclRについての変異がフコシル化化合物の産生を増強する少なくとも１つの変異との組合せで適用される上記の方法に関する。フコシル化オリゴ糖を効率的に産生するためには(図１、２及び５〜10を参照)、arcA及びiclRの上記変異は、フコシル化化合物の産生を更に増強する他の変異との組合せで適用することができる。(非限定的な)これら他の変異の幾つかは：ａ)コラン酸生合成の開始を止め、よってGDP-フコースの蓄積を可能にする、コラン酸オペロンからのwcaJの欠失；ｂ)フコースを異なるアクセプター分子(例えば、ラクトース)と連結するフコシルトランスフェラーゼの導入；ｃ)GDP-フコース生合成経路の前駆体の蓄積のため、wcaJの欠失に加え、GDP-フコース生合成をコードしない以下のコラン酸オペロン遺伝子：gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaJ、wcaK、wcaL、wzx、wza、wzb、wzc及び/又はwcaMの少なくとも１つをノックアウトすること；ｄ)フコシルラクトースの産生のため、β-ガラクトシダーゼをコードするlacZをノックアウトしてラクトースの分解を回避すること；ｅ)前駆体であるフルクトース及びフルクトース-6-リン酸を蓄積させるため、スクロースホスホリラーゼ又はインベルターゼを導入すること；ｆ)フルクトース-6-リン酸は解糖で容易に分解するので、全てのフルクトース-6-リン酸がGDP-フコースの方向に導かれるように解糖を妨げ、(グルコース-6-リン酸イソメラーゼ並びにホスホフルクトキナーゼＡ及びＢをコードする)遺伝子pgi、pfkA及びpfkBをノックアウトすること；ｇ)遺伝子(例えばlon)によりコードされるプロテアーゼをノックアウトすることでタンパク質分解を低減させること；ｈ)ラクトースパーミアーゼの構成的発現により、この産生方法においてラクトース誘導遺伝子発現系に一般的である亜集団(19)を回避することである。
換言すれば、本発明は、フコシル化化合物の産生を増強する少なくとも１つの変異が：wcaJ遺伝子の欠失、及び/又はコラン酸オペロン遺伝子gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaJ、wcaK、wcaL、wzx、wza、wzb、wzc及び/又はwcaMのノックアウト、及び/又はlacZのノックアウト、及び/又はスクロースホスホリラーゼ又はインベルターゼの導入、及び/又は遺伝子pgi、pfkA及びpfkBのノックアウト、及び/又は遺伝子lonのノックアウト、及び/又はフコシルトランスフェラーゼ及び/又はラクトースパーミアーゼの導入である、フコシル化オリゴ糖の合成のための上記の方法に関する。用語「フコシルトランスフェラーゼを導入する(こと)」は、酵素分類で、クラスEC2.4.1.65、2.4.1.68、2.4.1.69、2.4.1.152、2.4.1.214及び/又は2.4.1.221の酵素、及び/又はグリコシルトランスフェラーゼファミリーGT1、GT2、GT10 GT11、GT23、GT37、GT65、GT68及び/又はGT74、及び/又はヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、ディクチオステリウム・ディスコイデウム(Dictyostellium discoideum)、ハツカネズミ(Mus musculus)、ヒト(Homo sapiens)、…(ただしこれらに限定されない)に由来するものに含まれるがこれらに限定されないフコシルトランスフェラーゼをアップレギュレートすること又は該酵素の異種発現に関し、これらフコシルトランスフェラーゼは、他の糖(例えば、ガラクトース、ラクトース、ラクトＮビオース、ラクトＮテトラオース、ラクトサミン、ラクトＮテトラオース、シアリルラクトース、ジシアリルラクトース；ただしこれらに限定されない)又はフコシル化タンパク質又はフコシル化脂肪酸又はフコシル化アグリコン(例えば、抗ウイルス薬、抗菌剤、…；これらに限定されない)でのα(1,2)、α(1,3)、α(1,4)又はα(1,6)結合の形成を触媒する。
本発明は、コラン酸オペロンの少なくとも１つの遺伝子をアップレギュレートするように改変された、転写調節因子である有気呼吸制御タンパク質ArcA及びイソクエン酸リアーゼ調節因子IclRの発現及び/又は活性を導く遺伝子変化を含む、変異及び/又は形質転換した微生物の使用を提供する。ここで、前記オペロンは、GDP-マンノースの生合成に必要であるホスホマンノムターゼ及びマンノース-1-リン酸グアニリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子cpsG及びcpsBを含んでなる。GDP-マンノースは、マンノシル化オリゴ糖及びマンノシル化複合糖質の前駆体である。これらオリゴ糖及び複合糖質は、例えばグラム陰性菌感染の治療での応用が見出されており、加えて、GDP-マンノースは、(或る種の治療用タンパク質の製造に必須である)グリコシル化タンパク質のヒト化に重要である(18，30)。また、マンノシル化オリゴ糖及びマンノシル化複合糖質は薬剤の標的化に使用され、例えばマンノシル化抗ウイルス薬は、肝臓及び腎臓を特異的に標的することができる(7)。マンノシル化オリゴ糖を効率的に産生するためには(図１、２及び５、６及び11を参照)、arcA及びiclRの上記変異は、マンノシル化化合物の産生を更に増強する他の変異との組合せで適用することができる。(非限定的な)これら他の変異の幾つかは：ａ)コラン酸オペロンの遺伝子gmdを欠失させること、及び/又はｂ)GDP-マンノースヒドロラーゼをコードする遺伝子gmmを欠失させること、及び/又はｃ)GDP-マンノース生合成反応をコードしないコラン酸オペロン遺伝子gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaJ、wcaK、wcaL、fcl、gmd、wzx、wza、wzb及び/又はwcaMを欠失させること、及び/又はｄ)スクロースホスホリラーゼ又はインベルターゼをコードする遺伝子を導入すること、及び/又はｅ)ホスホグルコースイソメラーゼ並びにホスホフルクトキナーゼＡ及びホスホフルクトキナーゼＢをそれぞれコードする遺伝子pgi、pfkA及びpfkBを欠失させること、及び/又はｆ)プロテアーゼをコードする遺伝子lonをノックアウトすること、及び/又はｆ)マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を導入することである。換言すれば、本発明は、コラン酸及び/又はGDP-フコース及び/又はフコシル化オリゴ糖及び/又はGDP-マンノース及び/又はマンノシル化オリゴ糖の合成のための上記の方法に関する。
本発明は更に、コラン酸オペロンの遺伝子cpsG及びcpsBがアップレギュレートされ、且つａ)コラン酸オペロンの遺伝子gmdが欠失し、及び/又はｂ)遺伝子gmmが欠失し、及び/又はｃ)コラン酸オペロン遺伝子fcl、gmd、gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaJ、wcaK、wcaL、wzx、wza、wzb、wzc及び/又はwcaMがノックアウトされ、及び/又はｄ)スクロースホスホリラーゼ又はインベルターゼをコードする遺伝子が導入され、及び/又はｅ)遺伝子pgi、pfkA及びpfkBが欠失し、及び/又はｆ)遺伝子lonがノックアウトされ、及び/又はｇ)マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が導入されている前記方法に関する。用語「マンノシルトランスフェラーゼを導入する(こと)」は、酵素分類で、クラスEC 2.4.1.32、2.4.1.B27、2.4.1.B44、2.4.1.48、2.4.1.54、2.4.1.57、2.4.1.83、2.4.1.109、2.4.1.110、2.4.1.119、2.4.1.130、2.4.1.131、2.4.1.132、2.4.1.142、2.4.1.199、2.4.1.217、2.4.1.232、2.4.1.246、2.4.1.251、2.4.1.252、2.4.1.257、2.4.1.258、2.4.1.259、2.4.1.260、2.4.1.265及び/又は2.4.1.270の酵素、及び/又はグリコシルトランスフェラーゼファミリーGT1、GT2、GT4、GT15、GT22、GT32、GT33、GT39、GT50及び/又はGT58、及び/又はヘリコバクター・ピロリ、カンピロバクター・ジェジュニ、ディクチオステリウム・ディスコイデウム、ハツカネズミ、ヒト、…(ただしこれらに限定されない)に由来するものに含まれるがこれらに限定されないマンノシルトランスフェラーゼをアップレギュレートすること又は該酵素の異種発現に関し、これらマンノシルトランスフェラーゼは、他の糖(例えば、ガラクトース、Ｎ-アセチルグルコサミン、ラムノース、ラクトース、ラクトＮビオース、ラクトＮテトラオース、ラクトサミン、ラクトＮテトラオース、シアリルラクトース、ジシアリルラクトース；ただしこれらに限定されない)又はマンノシル化タンパク質又はマンノシル化脂肪酸又はマンノシル化アグリコン(例えば、抗ウイルス薬、抗菌剤、…；これらに限定されない)でのα(1,2)、α(1,3)、α(1,4)又はα(1,6)結合の形成を触媒する。
用語「異種発現」は、産生宿主に天然には存在しない遺伝子、化学合成されたか又はPCRにより天然宿主から採取された遺伝子、コドンが産生宿主に最適化されている遺伝子又は酵素活性又は発現が増強されるよう点変異が付加されている遺伝子の発現に関する。異種及び/又は天然型遺伝子の発現は、染色体上、人工染色体上又はプラスミド上で行うことができ、転写は、誘導性、構成性、天然型又は人工のプロモーターにより制御でき、翻訳は、天然型又は人工のリボソーム結合部位により制御できる。
結果として、本発明は更に、上記の調節因子ArcA及びIclRが、酵素ホスホグルコースイソメラーゼ及びホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子との組合せで、ノックアウトされているか又は機能を低下させられている、変異及び/又は形質転換した生物に関する。より具体的には、本発明は、酵素ホスホグルコースイソメラーゼが遺伝子pgiによりコードされ、酵素ホスホフルクトキナーゼが遺伝子pfkA及び/又はpfkBによりコードされる前記生物に関する。
結果として、本発明は更に、上記の調節因子ArcA及びIclRが、酵素ホスホグルコースイソメラーゼ及びホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子との組合せで、ノックアウトされているか又は機能を低下させられている、変異及び/又は形質転換した生物に関する。より具体的には、本発明は、酵素ホスホグルコースイソメラーゼが遺伝子pgiによりコードされ、酵素ホスホフルクトキナーゼが遺伝子pfkA及び/又はpfkBによりコードされる前記生物に関する。
用語「機能を低下させられているか又は非機能的にさせられた遺伝子」とは、機能的最終産物を産生する能力が低下し(すなわち、機能的野生型遺伝子と比較して該能力が統計学的に有意に「低下している」)又はそのような産生が全くできない(例えば、遺伝子ノックアウト)ように遺伝子を改変するために使用する、当業者に周知の技術、例えば、siRNA、RNAi、miRNA、asRNA、遺伝子の変異誘発、遺伝子ノックアウト、トランスポゾン変異誘発などの利用をいう。よって、用語「(遺伝子)ノックアウト」とは、非機能的にされている遺伝子をいう。用語「欠失遺伝子」又は「遺伝子欠失」もまた、非機能的にされた遺伝子をいう。
更に、本発明は、スクロースホスホリラーゼをコードする遺伝子で更に形質転換されている、上記の変異及び/又は形質転換した生物に関する。
本発明はまた、追加的に、ラクトースパーミアーゼをコードする遺伝子の活性及び/又は発現が構成的であり及び/又は増大している、上記の変異及び/又は形質転換した生物に関する。前記活性は、前記遺伝子を過剰発現させ及び/又は前記生物をラクトースパーミアーゼをコードする遺伝子で形質転換させることにより増大させることができる。
更に、本発明は、スクロースホスホリラーゼをコードする遺伝子で更に形質転換されている、上記の変異及び/又は形質転換した生物に関する。
本発明はまた、追加的に、ラクトースパーミアーゼをコードする遺伝子の活性及び/又は発現が構成的であり及び/又は増大している、上記の変異及び/又は形質転換した生物に関する。前記活性は、前記遺伝子を過剰発現させ及び/又は前記生物をラクトースパーミアーゼをコードする遺伝子で形質転換させることにより増大させることができる。
本発明は更に、以下の遺伝子の少なくとも１つがノックアウトされているか又は機能を低下させられている上記のいずれかの変異及び/又は形質転換した生物に関する：
β-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、グルコース-1-リン酸アデニリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、グルコース-1-ホスファターゼをコードする遺伝子、ホスホグルコン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子、2-ケト-3-デオキシグルコネート-6-リン酸アルドラーゼをコードする遺伝子、グルコース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-グルコース-4-エピメラーゼをコードする遺伝子、UDP-グルコース:ガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-ガラクトピラノースムターゼをコードする遺伝子、UDP-ガラクトース:(グルコシル)リポ多糖-1,6-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-グルコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-グルクロネートトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-グルコース脂質担体トランスフェラーゼをコードする遺伝子、GDP-マンノースヒドロラーゼをコードする遺伝子、UDP-糖ヒドロラーゼをコードする遺伝子、マンノース-6-リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子、UDP-N-アセチルグルコサミンエノイルピルボイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-N-アセチルグルコサミンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-Nアセチルグルコサミン-2-エピメラーゼをコードする遺伝子、ウンデカプレニル-リン酸α-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、及び/又は、L-グルタミン:D-フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子、マンノース-6-リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子、ソルビトール-6-リン酸 デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、マンニトール-1-リン酸5-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼをコードする遺伝子、インベルターゼをコードする遺伝子、マルターゼをコードする遺伝子、トレハラーゼをコードする遺伝子、糖輸送ホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子、プロテアーゼをコードする遺伝子、又はヘキソキナーゼをコードする遺伝子。用語「少なくとも１つ」は、少なくとも１つの遺伝子(ただし、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は全33の遺伝子であり得る)がノックアウトされているか又は機能を低下させられていることを表す。
β-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、グルコース-1-リン酸アデニリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、グルコース-1-ホスファターゼをコードする遺伝子、ホスホグルコン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子、2-ケト-3-デオキシグルコネート-6-リン酸アルドラーゼをコードする遺伝子、グルコース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-グルコース-4-エピメラーゼをコードする遺伝子、UDP-グルコース:ガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-ガラクトピラノースムターゼをコードする遺伝子、UDP-ガラクトース:(グルコシル)リポ多糖-1,6-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-グルコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-グルクロネートトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-グルコース脂質担体トランスフェラーゼをコードする遺伝子、GDP-マンノースヒドロラーゼをコードする遺伝子、UDP-糖ヒドロラーゼをコードする遺伝子、マンノース-6-リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子、UDP-N-アセチルグルコサミンエノイルピルボイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-N-アセチルグルコサミンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-Nアセチルグルコサミン-2-エピメラーゼをコードする遺伝子、ウンデカプレニル-リン酸α-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、及び/又は、L-グルタミン:D-フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子、マンノース-6-リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子、ソルビトール-6-リン酸 デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、マンニトール-1-リン酸5-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼをコードする遺伝子、インベルターゼをコードする遺伝子、マルターゼをコードする遺伝子、トレハラーゼをコードする遺伝子、糖輸送ホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子、プロテアーゼをコードする遺伝子、又はヘキソキナーゼをコードする遺伝子。用語「少なくとも１つ」は、少なくとも１つの遺伝子(ただし、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は全33の遺伝子であり得る)がノックアウトされているか又は機能を低下させられていることを表す。
更に、本発明は、以下の酸耐性関連遺伝子：ydeP、ydeO、hdeA、hdeD、gadB、gadC、gadE、gadX、gadW及び/又はslp(17，22)の少なくとも１つをアップレギュレートするように改変された、転写調節因子である有気呼吸制御タンパク質ArcA及びイソクエン酸リアーゼ調節因子IclRの発現を導く遺伝子改変を含む、変異及び/又は形質転換した微生物(例えば、エシェリキア・コリ株)の使用に関する。これら遺伝子は、通常、静止期条件で発現する；しかし、本発明の変異及び/又は形質転換した微生物は、これら酸耐性関連遺伝子の発現を対数増殖期に増強させることができる。よって、本発明は、酸又はpH感受性分子(例えば、pH感受性であり、低pHで製造すべきであるグルコサミン(12)；ただし、これに限定されない)の合成のための上記の使用に関する。有機酸(例えば、ピルビン酸、コハク酸、アジピン酸、シアル酸、シアル酸付加オリゴ糖(例えば、シアリルラクトース、シアリルルイスＸ糖、…；ただしこれらに限定されない)、アセチル化オリゴ糖(キチン、キトサン、…)、スルホン化オリゴ糖(ヘパラン及びヘパロサン)…は、好ましくは、下流での加工処理目的のために低pHで製造される(4)。換言すれば、本発明は、以下の酸耐性関連遺伝子：ydeP、ydeO、hdeA、hdeD、gadB、gadC、gadE、gadX、gadW及び/又はslpの少なくとも１つをアップレギュレートするように、転写調節因子である有気呼吸制御タンパク質ArcA及びイソクエン酸リアーゼ調節因子IclRを遺伝的に変化させることを含んでなる、酸、シアル酸、シアル酸付加オリゴ糖又はグルコサミンの合成方法に関する。
以下で、下記の非限定的実施例により本発明を説明する。
実施例
本発明の微生物の高スループットRT-qPCRスクリーニングは、Biotrove OpenArray(登録商標)技術で構築した。本実験では、1800遺伝子の転写を４種の株(野生型、ΔarcA、ΔiclR、ΔarcAΔiclR)において２条件(ケモスタット及びバッチ)で測定した。データは、Ｒ(25，34)及びQuantile Normalizationの曲線フィッティングツールボックスを用いて加工処理し、データの誤差は、Bayesian statisticsを用いて算出した(20，21，31)。
本発明の微生物の高スループットRT-qPCRスクリーニングは、Biotrove OpenArray(登録商標)技術で構築した。本実験では、1800遺伝子の転写を４種の株(野生型、ΔarcA、ΔiclR、ΔarcAΔiclR)において２条件(ケモスタット及びバッチ)で測定した。データは、Ｒ(25，34)及びQuantile Normalizationの曲線フィッティングツールボックスを用いて加工処理し、データの誤差は、Bayesian statisticsを用いて算出した(20，21，31)。
材料及び方法
株及びプラスミド
エシェリキア・コリMG1655[ -，F-，rph-1]は、the Netherlands Culture Collection of Bacteria(NCCB)から入手した。エシェリキア・コリBL21(DE3)はNovagenから入手した。エシェリキア・コリMG1655 ackA-pta, poxB, pppc ppc-p37(10)、単一ノックアウトイー・コリMG1655 arcA及びイー・コリMG1655 iclR並びに二重ノックアウトイー・コリMG1655 arcA, iclRは、the Laboratory of Genetics and Microbiology(MICR)でDatsenko & Wanner(9)の方法を使用して作製した。
株及びプラスミド
エシェリキア・コリMG1655[ -，F-，rph-1]は、the Netherlands Culture Collection of Bacteria(NCCB)から入手した。エシェリキア・コリBL21(DE3)はNovagenから入手した。エシェリキア・コリMG1655 ackA-pta, poxB, pppc ppc-p37(10)、単一ノックアウトイー・コリMG1655 arcA及びイー・コリMG1655 iclR並びに二重ノックアウトイー・コリMG1655 arcA, iclRは、the Laboratory of Genetics and Microbiology(MICR)でDatsenko & Wanner(9)の方法を使用して作製した。
培地
ルリアブロス(LB)培地は、１％トリプトンペプトン(Difco，Erembodegem，ベルギー)、0.5％酵母抽出物(Difco)及び0.5％塩化ナトリウム(VWR，Leuven，ベルギー)からなるものであった。振盪フラスコ培地は、２g/l NH4Cl、５g/l (NH4)2SO4、2.993g/l KH2PO4、7.315g/l K2HPO4、8.372g/l MOPS、0.5g/l NaCl、0.5g/l MgSO4・7H2O、16.5g/lグルコース・H2O、１ml/lビタミン溶液、100μl/lモリブテン酸溶液及び１ml/lセレン溶液を含んでいた。この培地を１ＭのKOHでpH７に設定した。
ビタミン溶液は、3.6g/l FeCl2・4H2O、５g/l CaCl2・2H2O、1.3g/l MnCl2・2H2O、0.38 g/l CuCl2・2H2O、0.5g/l CoCl2・6H2O、0.94g/l ZnCl2、0.0311g/l H3BO4、0.4g/l Na2EDTA・2H2O及び1.01g/lチアミン・HClからなるものであった。モリブテン酸溶液は、0.967g/l Na2MoO4・2H2Oを含んでいた。セレン溶液は42g/l SeO2を含んでいた。
発酵用の最少培地は、6.75g/l NH4Cl、1.25g/l (NH4)2SO4、1.15g/l KH2PO4、0.5g/l NaCl、0.5g/l MgSO4・7H2O、16.5g/lグルコース・H2O、１ml/lビタミン溶液、100μl/lモリブテン酸溶液及び１ml/lセレン溶液(上記と同じ組成)を含んでいた。
ルリアブロス(LB)培地は、１％トリプトンペプトン(Difco，Erembodegem，ベルギー)、0.5％酵母抽出物(Difco)及び0.5％塩化ナトリウム(VWR，Leuven，ベルギー)からなるものであった。振盪フラスコ培地は、２g/l NH4Cl、５g/l (NH4)2SO4、2.993g/l KH2PO4、7.315g/l K2HPO4、8.372g/l MOPS、0.5g/l NaCl、0.5g/l MgSO4・7H2O、16.5g/lグルコース・H2O、１ml/lビタミン溶液、100μl/lモリブテン酸溶液及び１ml/lセレン溶液を含んでいた。この培地を１ＭのKOHでpH７に設定した。
ビタミン溶液は、3.6g/l FeCl2・4H2O、５g/l CaCl2・2H2O、1.3g/l MnCl2・2H2O、0.38 g/l CuCl2・2H2O、0.5g/l CoCl2・6H2O、0.94g/l ZnCl2、0.0311g/l H3BO4、0.4g/l Na2EDTA・2H2O及び1.01g/lチアミン・HClからなるものであった。モリブテン酸溶液は、0.967g/l Na2MoO4・2H2Oを含んでいた。セレン溶液は42g/l SeO2を含んでいた。
発酵用の最少培地は、6.75g/l NH4Cl、1.25g/l (NH4)2SO4、1.15g/l KH2PO4、0.5g/l NaCl、0.5g/l MgSO4・7H2O、16.5g/lグルコース・H2O、１ml/lビタミン溶液、100μl/lモリブテン酸溶液及び１ml/lセレン溶液(上記と同じ組成)を含んでいた。
培養条件
５mlのLB培地中の予備培養物(LBプレート上の単一コロニー由来)を、200rpmのオービタル振盪器で37℃にて８時間インキュベートした。この培養物から、２mlを500ml振盪フラスコ中100mlの最少培地に移し、200rpmのオービタル振盪器で37℃にて16時間インキュベートした。４％の種菌を、1.5Ｌの作業容量を有する２ＬのBiostat B Plus培養容器(Sartorius Stedim Biotech，Melsungen，ドイツ)で使用した。培養条件は次のとおりであった：37℃、撹拌800rpm及び気体流量1.5l/分。空気散布により好気条件を維持し、嫌気条件は、培養物に３％のCO2及び97％のN2の混合物をフラッシュして達成した。pHは0.5Ｍ H2SO4及び４Ｍ KOHで７に維持した。排気は、排気冷却装置(Frigomix 1000，Sartorius Stedim Biotech，Melsungen，ドイツ)で４℃に冷却した。発酵の間に泡が生じたらシリコーン消泡剤(BDH 331512K，VWR Int Ltd.，Poole，英国)の10％溶液を添加した(約10μl)。オフガスは、EL3020オフガス分析器(ABB Automation GmbH，60488 Frankfurt am Main，ドイツ)で測定した。
全てのデータを、Sartorius MFCS/win v3.0システム(Sartorius Stedim Biotech，Melsungen，ドイツ)で記録した。
全ての株を少なくとも２回培養した。収量及び速度について示した標準偏差は反復実験の間に採取した少なくとも10点のデータに基づく。
５mlのLB培地中の予備培養物(LBプレート上の単一コロニー由来)を、200rpmのオービタル振盪器で37℃にて８時間インキュベートした。この培養物から、２mlを500ml振盪フラスコ中100mlの最少培地に移し、200rpmのオービタル振盪器で37℃にて16時間インキュベートした。４％の種菌を、1.5Ｌの作業容量を有する２ＬのBiostat B Plus培養容器(Sartorius Stedim Biotech，Melsungen，ドイツ)で使用した。培養条件は次のとおりであった：37℃、撹拌800rpm及び気体流量1.5l/分。空気散布により好気条件を維持し、嫌気条件は、培養物に３％のCO2及び97％のN2の混合物をフラッシュして達成した。pHは0.5Ｍ H2SO4及び４Ｍ KOHで７に維持した。排気は、排気冷却装置(Frigomix 1000，Sartorius Stedim Biotech，Melsungen，ドイツ)で４℃に冷却した。発酵の間に泡が生じたらシリコーン消泡剤(BDH 331512K，VWR Int Ltd.，Poole，英国)の10％溶液を添加した(約10μl)。オフガスは、EL3020オフガス分析器(ABB Automation GmbH，60488 Frankfurt am Main，ドイツ)で測定した。
全てのデータを、Sartorius MFCS/win v3.0システム(Sartorius Stedim Biotech，Melsungen，ドイツ)で記録した。
全ての株を少なくとも２回培養した。収量及び速度について示した標準偏差は反復実験の間に採取した少なくとも10点のデータに基づく。
サンプリング方法
バイオリアクターは、その内部に、リアクターポートに接続する採集パイプ(BD Spinal Needle，1.2×152mm (BDMedical Systems，Franklin Lakes，NJ - 米国)を含み、この採集パイプは、外部のMasterflex-14チューブ(Cole-Parmer，Antwerpen，ベルギー)に、続いてサンプリング用の隔壁を有する採集ポートに繋がる。採集ポートの他方の側は、Masterflex-16チューブで、リアクター容器に戻るように接続している。この系は、迅速サンプリングループと呼ばれる。サンプリングの間、リアクターブロスは、サンプリングループに送り込まれる。150ml/分の流量で、リアクターブロスは採集ポートに達するまで0.04秒を要し、リアクターに再進入するまで3.2秒を要すると見積もれられた。50％のpO2レベルで、37℃の液体には約３mg/lの酸素が存在する。このpO2レベルは、微小好気条件を回避するため、決して20％を下回って低下させるべきではない。よって、採集ループを通過する間に1.8mg/lの酸素が消費されてもよい。酸素摂取率を0.4ｇ酸素/ｇバイオマス/h(μmaxで観察される最大酸素摂取率)と仮定すると、５g/lのバイオマスについて、酸素摂取率２g/l/h又は0.56mg/l/sが得られる。この値に3.2秒(ループ内滞留時間)を乗算すると1.8mg/lの酸素消費が得られる。
バイオリアクターは、その内部に、リアクターポートに接続する採集パイプ(BD Spinal Needle，1.2×152mm (BDMedical Systems，Franklin Lakes，NJ - 米国)を含み、この採集パイプは、外部のMasterflex-14チューブ(Cole-Parmer，Antwerpen，ベルギー)に、続いてサンプリング用の隔壁を有する採集ポートに繋がる。採集ポートの他方の側は、Masterflex-16チューブで、リアクター容器に戻るように接続している。この系は、迅速サンプリングループと呼ばれる。サンプリングの間、リアクターブロスは、サンプリングループに送り込まれる。150ml/分の流量で、リアクターブロスは採集ポートに達するまで0.04秒を要し、リアクターに再進入するまで3.2秒を要すると見積もれられた。50％のpO2レベルで、37℃の液体には約３mg/lの酸素が存在する。このpO2レベルは、微小好気条件を回避するため、決して20％を下回って低下させるべきではない。よって、採集ループを通過する間に1.8mg/lの酸素が消費されてもよい。酸素摂取率を0.4ｇ酸素/ｇバイオマス/h(μmaxで観察される最大酸素摂取率)と仮定すると、５g/lのバイオマスについて、酸素摂取率２g/l/h又は0.56mg/l/sが得られる。この値に3.2秒(ループ内滞留時間)を乗算すると1.8mg/lの酸素消費が得られる。
サンプリングの間に細胞代謝を止めるため、リアクターブロスを、採集ポートより−20℃に予め冷却した62ｇのステンレス鋼ビーズを充填したシリンジに吸引して、５mlのブロスを急速に４℃に冷却した。サンプリングの直後に冷却遠心分離(15000ｇ、５分間、４℃)を行った。バッチ実験の間、迅速サンプリングループ及び冷却ステンレスビーズサンプリング法を用いて、OD600nm及びRT-qPCR測定用のサンプルを採取した。
RT-qPCR
mRNAはRNeasyキット(Qiagen,Venlo，オランダ)を用いて抽出した。RNAの質及び量は、nanodrop ND-1000分光光度計(Nanodrop technologies，Wilmingto，米国)で検査した。比260:280(nm)及び260:230(nm)は1.8と２の間であった。更なる分析のためには少なくとも100ng/μlが必要であった。RevertAidTM H minus first strand cDNA合成キット(Fermentas，St. Leon-Rot，ドイツ)を用いてランダムプライマーでcDNAを合成した。最後に、1800遺伝子の遺伝子発現を、Biotrove OpenArray Real time PCRプラットフォームで測定した。RT-PCRアッセイ用プライマーは、Primer database社のPrimer design toolsを用いて設計した(23)。
mRNAはRNeasyキット(Qiagen,Venlo，オランダ)を用いて抽出した。RNAの質及び量は、nanodrop ND-1000分光光度計(Nanodrop technologies，Wilmingto，米国)で検査した。比260:280(nm)及び260:230(nm)は1.8と２の間であった。更なる分析のためには少なくとも100ng/μlが必要であった。RevertAidTM H minus first strand cDNA合成キット(Fermentas，St. Leon-Rot，ドイツ)を用いてランダムプライマーでcDNAを合成した。最後に、1800遺伝子の遺伝子発現を、Biotrove OpenArray Real time PCRプラットフォームで測定した。RT-PCRアッセイ用プライマーは、Primer database社のPrimer design toolsを用いて設計した(23)。
反応混合物は、 Biotrove OpenArrayTM Real-Time qPCRシステムのユーザーズマニュアルに記載されているとおりに構成した。簡潔には、マスターミックスは、26.4μlのLightCycler(登録商標) DNA Master SYBR(登録商標) Green I (Roche applied Science)、1.1μlのSYBR GREEN I (100×ストック溶液，Sigma S9430)、8.8μlのグリセロール(Sigma G5150)、5.3μlのPluronic(登録商標) F68(10％ストック，Invitrogen)、2.64μlのBSA (Sigma A7906)、26.4μlの塩化マグネシウム(25mMストック溶液、Roche applied ScienceのLightCycler(登録商標)キットに供給されているもの)、21.1μlのHiDiTM ホルムアミド(Applied biosystems)及び94.66μlのRNaseフリー滅菌水で調製し、(１つのOpenArrayTMにロードするに十分な)186.4μlのマスターミックスを得た。１つのSubArray(各OpenArrayは48のSubArraysに分割され、それらに１サンプルをロードすることができる)につき、1.5μlのサンプル(濃度100ng/μl)を、テンプレートなしコントロールとして、3.5μlのマスターミックスと混合した。水をブランクとして使用した。サンプル-マスターミックス混合物を、RNaseフリーフード内でローダープレート(MatriPlateTM 384ウェルブラック低容量ポリプロピレンプレート，Biotrove)にロードした。ローダープレートの全てをAutoLoader(Biotrove)及びローダーチップを用いてOpenArraysにロードした。次いで、これらOpenArraysを、OpenArrayTM Real-Time qPCRケース中のOpenArrayTM浸漬液に浸した。ケースをケース密封糊で密封し、ケース密封ステーションにおいてインキュベートし、UV光で糊を重合させた。
分析方法
培養物の細胞密度を、600nmの光学密度を測定することにより頻繁にモニターした(Uvikom 922 spectrophotometer，BRS，Brussel，ベルギー)。予め乾燥させ秤量したファルコン中20ｇのリアクターブロスの遠心分離(15分間、5000ｇ、GSAローター、Sorvall RC-5B，Goffin Meyvis，Kapellen，ベルギー)により細胞乾燥重量を得た。その後、ペレットを20mlの生理学的溶液(９g/l NaCl)で１回洗浄し、70℃で乾燥させ一定重量にした。OD600nm測定値のバイオマス濃度への変換を可能にするため、OD600nmとバイオマス濃度との相関曲線を作成した。グルコース及び有機酸の濃度を、Varian Prostar HPLCシステム(Varian，Sint-Katelijne-Waver，ベルギー)で、１cmプレカラムを備える65℃に加温したAminex HPX-87Hカラム(Bio-Rad，Eke，ベルギー)を用い、移動相として５mM H2SO4(0.6ml/分)を使用して測定した。ピーク検出には、二波UV-VIS(210nm及び265nm)検出器(Varian Prostar 325)及び差分屈折率検出器(Merck LaChrom L-7490，Merck，Leuven，ベルギー)を使用した。265nm及び210nmのピークの吸光度を除算することで、ピークは同定することができた。この除算は特定の化合物に典型的な一定値をもたらす(ランベルト‐ベールの式)。
グルコース、フルクトース、スクロース、フコシルラクトース及びグルコース-1-リン酸は、HPLCでHypercarbカラムを用いて測定し、MSMS検出器で検出した(Antonioら，2007；Nielsenら，2006)。
培養物の細胞密度を、600nmの光学密度を測定することにより頻繁にモニターした(Uvikom 922 spectrophotometer，BRS，Brussel，ベルギー)。予め乾燥させ秤量したファルコン中20ｇのリアクターブロスの遠心分離(15分間、5000ｇ、GSAローター、Sorvall RC-5B，Goffin Meyvis，Kapellen，ベルギー)により細胞乾燥重量を得た。その後、ペレットを20mlの生理学的溶液(９g/l NaCl)で１回洗浄し、70℃で乾燥させ一定重量にした。OD600nm測定値のバイオマス濃度への変換を可能にするため、OD600nmとバイオマス濃度との相関曲線を作成した。グルコース及び有機酸の濃度を、Varian Prostar HPLCシステム(Varian，Sint-Katelijne-Waver，ベルギー)で、１cmプレカラムを備える65℃に加温したAminex HPX-87Hカラム(Bio-Rad，Eke，ベルギー)を用い、移動相として５mM H2SO4(0.6ml/分)を使用して測定した。ピーク検出には、二波UV-VIS(210nm及び265nm)検出器(Varian Prostar 325)及び差分屈折率検出器(Merck LaChrom L-7490，Merck，Leuven，ベルギー)を使用した。265nm及び210nmのピークの吸光度を除算することで、ピークは同定することができた。この除算は特定の化合物に典型的な一定値をもたらす(ランベルト‐ベールの式)。
グルコース、フルクトース、スクロース、フコシルラクトース及びグルコース-1-リン酸は、HPLCでHypercarbカラムを用いて測定し、MSMS検出器で検出した(Antonioら，2007；Nielsenら，2006)。
遺伝学的方法
全ての変異体株は下記の方法で構築した。
プラスミドを宿主イー・コリDH5α(F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1)で維持した。
プラスミド。pKD46(レッドヘルパープラスミド、アンピシリン耐性)、pKD3(FRTに隣接するクロラムフェニコール耐性(cat)遺伝子を含有)、pKD4(FRTに隣接するカナマイシン耐性(kan)遺伝子を含有)及びpCP20(FLPリコンビナーゼ活性を発現)プラスミドを変異体構築に使用した。プラスミドpBluescript(Fermentas，St. Leon-Rot，ドイツ)を用いて、プロモーターライブラリを有するか又は点変異を保持する対立遺伝子を有するpKD3及びpKD4の誘導体を構築した。
全ての変異体株は下記の方法で構築した。
プラスミドを宿主イー・コリDH5α(F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1)で維持した。
プラスミド。pKD46(レッドヘルパープラスミド、アンピシリン耐性)、pKD3(FRTに隣接するクロラムフェニコール耐性(cat)遺伝子を含有)、pKD4(FRTに隣接するカナマイシン耐性(kan)遺伝子を含有)及びpCP20(FLPリコンビナーゼ活性を発現)プラスミドを変異体構築に使用した。プラスミドpBluescript(Fermentas，St. Leon-Rot，ドイツ)を用いて、プロモーターライブラリを有するか又は点変異を保持する対立遺伝子を有するpKD3及びpKD4の誘導体を構築した。
変異。変異は遺伝子破壊(ノックアウト、KO)から本質的になった。変異は、Datsenko及びWanner(9)の概念を用いて導入した。変異ストラテジ用プライマーを表１に記載する。
レッドヘルパープラスミドを保持する形質転換体を、アンピシリン(100mg/l)及びL-アラビノース(10mM)を含む10mlのLB培地(30℃)でOD600nm 0.6まで増殖させた。細胞を、50mlの氷冷水(１回目)及び１mlの氷冷水(２回目)で洗浄することにより、エレクトロコンピテントにした。その後、細胞を50μlの氷冷水に再懸濁させた。Gene PulserTM(BioRad)(600Ω、25μFD及び250ボルト)を用い、50μlの細胞及び10〜100ngの線状二本鎖DNA産物でエレクトロポレーションを行った。
エレクトロポレーション後、細胞を１mlのLB培地に加え、37℃にて１時間インキュベートし、最後に25mg/lのクロラムフェニコール又は50mg/lのカナマイシンを含有するLBアガーで拡大させ、抗生物質耐性形質転換体を選択した。選択した変異体は、改変領域の上流及び下流のプライマーを用いるPCRで検証し、ヘルパープラスミドを喪失させるためLBアガーで42℃にて増殖させた。変異体をアンピシリン感受性について試験した。
レッドヘルパープラスミドを保持する形質転換体を、アンピシリン(100mg/l)及びL-アラビノース(10mM)を含む10mlのLB培地(30℃)でOD600nm 0.6まで増殖させた。細胞を、50mlの氷冷水(１回目)及び１mlの氷冷水(２回目)で洗浄することにより、エレクトロコンピテントにした。その後、細胞を50μlの氷冷水に再懸濁させた。Gene PulserTM(BioRad)(600Ω、25μFD及び250ボルト)を用い、50μlの細胞及び10〜100ngの線状二本鎖DNA産物でエレクトロポレーションを行った。
エレクトロポレーション後、細胞を１mlのLB培地に加え、37℃にて１時間インキュベートし、最後に25mg/lのクロラムフェニコール又は50mg/lのカナマイシンを含有するLBアガーで拡大させ、抗生物質耐性形質転換体を選択した。選択した変異体は、改変領域の上流及び下流のプライマーを用いるPCRで検証し、ヘルパープラスミドを喪失させるためLBアガーで42℃にて増殖させた。変異体をアンピシリン感受性について試験した。
線状二本鎖DNA。線状ds-DNAアンプリコンを、pKD3、pKD4及びそれらの誘導体をテンプレートとして用いるPCRにより得た。使用したプライマーは、テンプレートに対する相補的配列の部分と染色体DNA上で組換えが生じるべき部位に相補的な別の部分とを有する(表１)。KO用には、相同性の領域を、目的の遺伝子の開始コドン及び停止コドンの50nt上流及び50nt下流に設計した。KI用には、転写開始点(＋１)に留意しなければならなかった。PCR産物をPCR精製し、DpnIで消化し、アガロースゲルから再精製し、溶出緩衝液(５mM Tris、pH8.0)に再懸濁した。
抗生物質耐性遺伝子の消去。選択した変異体(クロラムフェニコール又はカナマイシン耐性)をpCP20プラスミド(温度感受性の複製及びFLP合成の熱誘導を示すアンピシリン及びクロラムフェニコール耐性プラスミドである)で形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体を30℃にて選択し、その後、数個をLB中42℃にてコロニー精製した後、全ての抗生物質耐性及びFLPヘルパープラスミドの喪失について試験した。遺伝子のノックアウト及びノックインは、コントロールプライマーで検証する(Fw/Rv-gene-out)。これらプライマーを表１に示す。
抗生物質耐性遺伝子の消去。選択した変異体(クロラムフェニコール又はカナマイシン耐性)をpCP20プラスミド(温度感受性の複製及びFLP合成の熱誘導を示すアンピシリン及びクロラムフェニコール耐性プラスミドである)で形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体を30℃にて選択し、その後、数個をLB中42℃にてコロニー精製した後、全ての抗生物質耐性及びFLPヘルパープラスミドの喪失について試験した。遺伝子のノックアウト及びノックインは、コントロールプライマーで検証する(Fw/Rv-gene-out)。これらプライマーを表１に示す。
表１：イー・コリMG1655 arcA、イー・コリMG1655 iclR及び二重ノックアウトイー・コリMG1655 arcA, iclR並びに他の全ての遺伝子ノックアウト及びノックインを作製するために使用したプライマー
形質転換。Hanahan(16)の単純化手順を用いるか又は上記のエレクトロポレーションにより、プラスミドをCaCl2コンピテント細胞に形質転換した。
計算方法
はじめに
種々の株を用いる種々の実験を行った。計８つの異なる条件で試験した。遺伝的背景(WT、iclRノックアウト、arcAノックアウト及びiclR-arcA組合せノックアウト)及び発酵態様(バッチ及びケモスタット)にバリエーションが存在した。各実験を２回繰り返した。
サンプルをBioTrove装置に通すと、qPCR曲線(サイクル数の関数としての蛍光)及び融解曲線(温度の関数としての蛍光)が各サンプルについて得られる。このデータをBioTroveソフトウェアから出力し、Ｒで更に分析した。この分析は２工程に分割した：第１の工程で、qPCR曲線をフィットさせてCt値を算出し、第２工程で、Ct値を発現データに変換した。
はじめに
種々の株を用いる種々の実験を行った。計８つの異なる条件で試験した。遺伝的背景(WT、iclRノックアウト、arcAノックアウト及びiclR-arcA組合せノックアウト)及び発酵態様(バッチ及びケモスタット)にバリエーションが存在した。各実験を２回繰り返した。
サンプルをBioTrove装置に通すと、qPCR曲線(サイクル数の関数としての蛍光)及び融解曲線(温度の関数としての蛍光)が各サンプルについて得られる。このデータをBioTroveソフトウェアから出力し、Ｒで更に分析した。この分析は２工程に分割した：第１の工程で、qPCR曲線をフィットさせてCt値を算出し、第２工程で、Ct値を発現データに変換した。
qPCR曲線の算出
生qPCR曲線データをBioTroveソフトウェアから取り出し、Ｒ(1)に取り込んだ。曲線をRパッケージqPCRで５パラメータシグモイドモデルにフィットさせた(25，34)。この曲線の二次導関数の最大値をCt値として使用した。曲線フィッティングの前にデータを正規化しなかった。しかし、外れ値は除いた。外れ値の検出は、以下の手順で行った：
* モデルをデータにフィットさせる。
* (測定した蛍光−モデル算出値と定義する)残差を算出する。
* 残差が正規分布すると仮定し、残差の平均及び標準偏差を算出する。
* この平均及び標準偏差を用い、95％区間を算出する。
* 残差がこの95％区間の範囲外となる全てのデータ点を外れ値とみなす。
* 外れ値を除いて曲線を再度フィットさせる
* 外れ値がもはや検出されなくなるまでこれを繰り返す。この手順を用いて、フィッティングの前にデータを正規化してはならないし、最初にデータ点を除いてもならない。
生qPCR曲線データをBioTroveソフトウェアから取り出し、Ｒ(1)に取り込んだ。曲線をRパッケージqPCRで５パラメータシグモイドモデルにフィットさせた(25，34)。この曲線の二次導関数の最大値をCt値として使用した。曲線フィッティングの前にデータを正規化しなかった。しかし、外れ値は除いた。外れ値の検出は、以下の手順で行った：
* モデルをデータにフィットさせる。
* (測定した蛍光−モデル算出値と定義する)残差を算出する。
* 残差が正規分布すると仮定し、残差の平均及び標準偏差を算出する。
* この平均及び標準偏差を用い、95％区間を算出する。
* 残差がこの95％区間の範囲外となる全てのデータ点を外れ値とみなす。
* 外れ値を除いて曲線を再度フィットさせる
* 外れ値がもはや検出されなくなるまでこれを繰り返す。この手順を用いて、フィッティングの前にデータを正規化してはならないし、最初にデータ点を除いてもならない。
多くの曲線をフィットさせなければならない(１実験につき1800遺伝子)。したがって、各曲線を手作業で検査することは不可能であり、不良曲線を排斥する自動化法を適用しなければならない。このため、曲線から種々のパラメータを抽出する：一次導関数(D1)が最大となるサイクル数の値、二次導関数(D2)が最大となるサイクル数の値、最小蛍光(Fmin)及び最大蛍光(Fmax)。これらパラメータの値を組み合わせて、曲線及び発現の程度の妥当性を評価する。これをどのように行うかは次章で説明する。
データのフィルタリング
幾つかの遺伝子-実験の組合せについては、増幅が検出されない。これは、種々の理由に起因し得る：
* 発現が低すぎて、32サイクル(全BioTroveアレイについてサイクル数を32に設定した)が発現の検出に十分でない。この場合、真のCtは決定できず、32と無限大との間である。
* 発現なし。この場合、真のCtは無限大である。
* 技術的失敗：プライマーが適切でなかった、ローディングを誤った(BioTroveアレイへの均一なローディングは非常に困難であり、特にアレイの側端部のホールはしばしば空である)など。この場合、真のCtは０から無限大であり得る。
幾つかの遺伝子は、真に発現せず、Ct値を無限大以外の別の値に設定することは正確でない。発現するがその発現値が技術的失敗又は限界に起因して不知である遺伝子については、Ct値を無限大に設定することは正確でない。更に、発現範囲外の自由裁量の値の使用は、算出ルーチン及び視覚化ルーチンを複雑にする。したがって、正確な発現データが検出できなかった遺伝子-実験の組合せは除去するという選択をした。
幾つかの遺伝子-実験の組合せについては、増幅が検出されない。これは、種々の理由に起因し得る：
* 発現が低すぎて、32サイクル(全BioTroveアレイについてサイクル数を32に設定した)が発現の検出に十分でない。この場合、真のCtは決定できず、32と無限大との間である。
* 発現なし。この場合、真のCtは無限大である。
* 技術的失敗：プライマーが適切でなかった、ローディングを誤った(BioTroveアレイへの均一なローディングは非常に困難であり、特にアレイの側端部のホールはしばしば空である)など。この場合、真のCtは０から無限大であり得る。
幾つかの遺伝子は、真に発現せず、Ct値を無限大以外の別の値に設定することは正確でない。発現するがその発現値が技術的失敗又は限界に起因して不知である遺伝子については、Ct値を無限大に設定することは正確でない。更に、発現範囲外の自由裁量の値の使用は、算出ルーチン及び視覚化ルーチンを複雑にする。したがって、正確な発現データが検出できなかった遺伝子-実験の組合せは除去するという選択をした。
発現が検出されない遺伝子-実験ペアの明白なケースは、qPCRデータに曲線をフィットできないものである。明白性が低いケースは下記で詳述する。
発現遺伝子について代表的は、蛍光値が或る特定の範囲をカバーすることである。この範囲が十分に高くないデータ点は、曲線へのフィット性が非常に乏しく、概して不良データであることが示されたので、廃棄した。最小蛍光範囲を400に設定した(よって、Fmax−Fmin＞400)。
良好な増幅曲線では、一次導関数(D1)及び二次導関数(D2)は、互いに極めて近い(qpcRパッケージのSOD関数の資料(25)を参照)。したがって、D1とD2との差が自由裁量の値(７を使用)より大きい全てのデータ点を廃棄した。
各プライマー対について、DNAを添加することなくqPCR実験を行った。水のみを添加した。通常、このようなサンプルでは発現は観察されない。しかし、幾つかのプライマー対については水で増幅が検出される。Ct値(上記のとおり、D2を使用)が水のCt値−５より大きい遺伝子は、蛍光が添加したDNAではなくプライマーの増幅に起因することを排除できないので、廃棄した。
発現遺伝子について代表的は、蛍光値が或る特定の範囲をカバーすることである。この範囲が十分に高くないデータ点は、曲線へのフィット性が非常に乏しく、概して不良データであることが示されたので、廃棄した。最小蛍光範囲を400に設定した(よって、Fmax−Fmin＞400)。
良好な増幅曲線では、一次導関数(D1)及び二次導関数(D2)は、互いに極めて近い(qpcRパッケージのSOD関数の資料(25)を参照)。したがって、D1とD2との差が自由裁量の値(７を使用)より大きい全てのデータ点を廃棄した。
各プライマー対について、DNAを添加することなくqPCR実験を行った。水のみを添加した。通常、このようなサンプルでは発現は観察されない。しかし、幾つかのプライマー対については水で増幅が検出される。Ct値(上記のとおり、D2を使用)が水のCt値−５より大きい遺伝子は、蛍光が添加したDNAではなくプライマーの増幅に起因することを排除できないので、廃棄した。
対比の正規化及び算出
発現の差を算出する前に、Ct値を正規化しなければならない。非常に多くの遺伝子(1800)を測定したので、分位数正規化(quantile normalisation)を使用した(33)。測定した1800遺伝子を、各々600遺伝子を含む３タイプのアレイに分けた。各タイプのアレイについて別々に分位数正規化を行った。行が異なる遺伝子を表し、列が異なる実験を表す表を作成した(T1、等式１を参照)。各列を独立にソートし(T2)、要素の元の位置を保存した。この新たな表中の値を、異なる行の平均値で置換した(T3)。最後に、この表を、値の位置が元の位置に対応するように変換した(T4)。
等式１：分位数正規化の例
発現の差を算出する前に、Ct値を正規化しなければならない。非常に多くの遺伝子(1800)を測定したので、分位数正規化(quantile normalisation)を使用した(33)。測定した1800遺伝子を、各々600遺伝子を含む３タイプのアレイに分けた。各タイプのアレイについて別々に分位数正規化を行った。行が異なる遺伝子を表し、列が異なる実験を表す表を作成した(T1、等式１を参照)。各列を独立にソートし(T2)、要素の元の位置を保存した。この新たな表中の値を、異なる行の平均値で置換した(T3)。最後に、この表を、値の位置が元の位置に対応するように変換した(T4)。
差分発現は、この正規化データを用いて算出した。これは、差の統計学的関連性を算出するベイズ法を使用するRパッケージlimmaを用いて行った(31，32)。Limmaは、欠けているデータに対処できるように適合させた：本来のlimmaパッケージは、１実験につき１つの値が利用可能でないときには、異なる実験についての当該遺伝子からの全ての発現値を廃棄する。このことにより、多くの異なる条件が存在する場合には分析が妨げられる。なぜならば、１つの実験条件で発現値が得られない遺伝子については各々、その実験条件を省略して異なる対比行列を作成しなければならないからである。したがって、対比にフィットさせる関数を、データが欠けているデータ点を落とすように適合させた。
差分発現は、Ct値と或る特定の遺伝子についての平均Ct値とから算出した。よって、値が高ければ高いほど、発現は低い。各遺伝子について、この差を示すプロットを作成した。しかし、このプロットでは、値が高いほど、発現が高くなるようにCt値を逆数にした。
差分発現は、Ct値と或る特定の遺伝子についての平均Ct値とから算出した。よって、値が高ければ高いほど、発現は低い。各遺伝子について、この差を示すプロットを作成した。しかし、このプロットでは、値が高いほど、発現が高くなるようにCt値を逆数にした。
実施例１：コラン酸生合成の遺伝子発現に対するarcA及びiclR遺伝子欠失の効果
図１及び２は、コラン酸生合成に関与する遺伝子の発現パターンを示す(35)。単一arcA又はiclRノックアウト変異は、バッチ及びケモスタット条件で、野生型株と比較して、当該オペロンの発現に影響しなかった。しかし、二重変異体株ΔarcAΔiclRは、ケモスタット及びバッチの両条件で、コラン酸オペロンの遺伝子を、野生型及び単一変異体株と比較して６〜８倍アップレギュレートした。よって、両調節因子は、適用される培養条件とは独立して、このオペロンの発現に対して驚くべき協働効果を有する。このオペロンの調節ネットワークに着目すると、ArcA及びIclRの両方と当該オペロンを制御する転写因子RcsAとの間に直接的な連関は見出せなかった(図５)。ArcAのみが、他の３つの転写因子(全て同様にアップレギュレートされる)を介してRcsAと関係している。しかし、ΔarcA単一遺伝子欠失変異体株は、該オペロンの転写に影響しなかった。
図１及び２は、コラン酸生合成に関与する遺伝子の発現パターンを示す(35)。単一arcA又はiclRノックアウト変異は、バッチ及びケモスタット条件で、野生型株と比較して、当該オペロンの発現に影響しなかった。しかし、二重変異体株ΔarcAΔiclRは、ケモスタット及びバッチの両条件で、コラン酸オペロンの遺伝子を、野生型及び単一変異体株と比較して６〜８倍アップレギュレートした。よって、両調節因子は、適用される培養条件とは独立して、このオペロンの発現に対して驚くべき協働効果を有する。このオペロンの調節ネットワークに着目すると、ArcA及びIclRの両方と当該オペロンを制御する転写因子RcsAとの間に直接的な連関は見出せなかった(図５)。ArcAのみが、他の３つの転写因子(全て同様にアップレギュレートされる)を介してRcsAと関係している。しかし、ΔarcA単一遺伝子欠失変異体株は、該オペロンの転写に影響しなかった。
実施例２：GDP-フコース生合成遺伝子の遺伝子発現に対するarcA及びiclR遺伝子欠失の効果
図４及び６は、コラン酸オペロンとGDP-フコース生合成との関係を示す。図６に、GDP-フコース生合成特異的遺伝子のアップレギュレーションを示す。よって、これら変異は、フコシル化オリゴ糖(例えば、フコシルラクトース、フコシルラクトＮビオース及びルイスＸオリゴ糖)又はフコシル化タンパク質の前駆体であるGDP-フコースの生合成を増強する。これら糖及びタンパク質は、上記で既に示したように、薬物療法での栄養補助食品として、ヒト母乳中の抗炎症及びプレバイオティック効果を有する成分として用途を有する(5，8，27)。
図４及び６は、コラン酸オペロンとGDP-フコース生合成との関係を示す。図６に、GDP-フコース生合成特異的遺伝子のアップレギュレーションを示す。よって、これら変異は、フコシル化オリゴ糖(例えば、フコシルラクトース、フコシルラクトＮビオース及びルイスＸオリゴ糖)又はフコシル化タンパク質の前駆体であるGDP-フコースの生合成を増強する。これら糖及びタンパク質は、上記で既に示したように、薬物療法での栄養補助食品として、ヒト母乳中の抗炎症及びプレバイオティック効果を有する成分として用途を有する(5，8，27)。
実施例３：GDP-フコース及びフコシル化オリゴ糖生合成の増強
他の変異との組合せで適用される変異ΔarcAΔiclRは、フコシル化化合物の産生を増強する。第１に、前記産生を増強する「他の」遺伝子改変は、コラン酸オペロンからのwcaJの欠失である(この欠失は、コラン酸生合成の開始を止め、よってGDP-フコースを蓄積させる)。更に、フコシルトランスフェラーゼを導入して、フコースを異なるアクセプター分子(例えば、ラクトース)と連結させなければならない。次いで、GDP-フコース生合成経路の前駆体が蓄積されるように代謝を更に操作する。これら改変を図７に示す。wcaJに加えて、GDP-フコース生合成反応をコードしないコラン酸オペロン遺伝子(例えば、gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaK、wcaL及び/又はwcaM)をノックアウトする。フコシルラクトースの産生については、ラクトース分解を回避するためにβ-ガラクトシダーゼをコードするlacZをノックアウトし、ラクトースパーミアーゼをコードするlacYの発現を強力な構成性プロモーターにより増強する。
他の変異との組合せで適用される変異ΔarcAΔiclRは、フコシル化化合物の産生を増強する。第１に、前記産生を増強する「他の」遺伝子改変は、コラン酸オペロンからのwcaJの欠失である(この欠失は、コラン酸生合成の開始を止め、よってGDP-フコースを蓄積させる)。更に、フコシルトランスフェラーゼを導入して、フコースを異なるアクセプター分子(例えば、ラクトース)と連結させなければならない。次いで、GDP-フコース生合成経路の前駆体が蓄積されるように代謝を更に操作する。これら改変を図７に示す。wcaJに加えて、GDP-フコース生合成反応をコードしないコラン酸オペロン遺伝子(例えば、gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaK、wcaL及び/又はwcaM)をノックアウトする。フコシルラクトースの産生については、ラクトース分解を回避するためにβ-ガラクトシダーゼをコードするlacZをノックアウトし、ラクトースパーミアーゼをコードするlacYの発現を強力な構成性プロモーターにより増強する。
実施例４：スクロースを基質とする分割代謝によるGDP-フコース及びフコシル化オリゴ糖の産生の増強
GDP-フコース前駆体であるフルクトース及びフルクトース-6-リン酸の蓄積のため、スクロースホスホリラーゼ又はインベルターゼを導入する。フルクトース-6-リン酸は解糖で容易に分解するため、全てのフルクトース-6-リン酸がGDP-フコースの方向に導かれるように解糖を妨げる。よって、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ並びにホスホフルクトキナーゼＡ及びＢをコードする遺伝子pgi、pfkA及びpfkBをノックアウトする。最後に、フコシルトランスフェラーゼを導入して、フコースをアクセプター分子と連結させる。
野生型株の増殖速度は、スクロースホスホリラーゼ(BaSP)(配列番号２の配列を有するプラスミド)の導入後にスクロースで増殖するとき、幾らか影響を受ける(表２)が、pgi変異並びにpfkA及びpfkB二重変異の導入により増殖速度は有意に低下し、後者については極端に低くなった(0.02h-1)。全ての変異の組合せ(Δpgi及びΔpfkA及びΔpfkB)により、増殖速度は最も低くなったが、スクロース及びグルコースでの増殖速度は共に、驚くべきことに、pgi単一変異体のものと類似していた。
GDP-フコース前駆体であるフルクトース及びフルクトース-6-リン酸の蓄積のため、スクロースホスホリラーゼ又はインベルターゼを導入する。フルクトース-6-リン酸は解糖で容易に分解するため、全てのフルクトース-6-リン酸がGDP-フコースの方向に導かれるように解糖を妨げる。よって、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ並びにホスホフルクトキナーゼＡ及びＢをコードする遺伝子pgi、pfkA及びpfkBをノックアウトする。最後に、フコシルトランスフェラーゼを導入して、フコースをアクセプター分子と連結させる。
野生型株の増殖速度は、スクロースホスホリラーゼ(BaSP)(配列番号２の配列を有するプラスミド)の導入後にスクロースで増殖するとき、幾らか影響を受ける(表２)が、pgi変異並びにpfkA及びpfkB二重変異の導入により増殖速度は有意に低下し、後者については極端に低くなった(0.02h-1)。全ての変異の組合せ(Δpgi及びΔpfkA及びΔpfkB)により、増殖速度は最も低くなったが、スクロース及びグルコースでの増殖速度は共に、驚くべきことに、pgi単一変異体のものと類似していた。
表２：グルコース及びスクロースを有する最少培地での解糖ノックアウト株の比増殖速度
配列番号２：スクロースホスホリラーゼBaSPを有するプラスミド配列
AATTCGGAGGAAACAAAGATGGGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGC
ATGAAAAACAAGGTGCAGCTCATCACTTACGCCGACCGCCTTGGCGACGGCACCATCAAG
TCGATGACCGACATTCTGCGCACCCGCTTCGACGGCGTGTACGACGGCGTTCACATCCTG
CCGTTCTTCACCCCGTTCGACGGCGCCGACGCAGGCTTCGACCCGATCGACCACACCAAG
GTCGACGAACGTCTCGGCAGCTGGGACGACGTCGCCGAACTCTCCAAGACCCACAACATC
ATGGTCGACGCCATCGTCAACCACATGAGTTGGGAATCCAAGCAGTTCCAGGACGTGCTG
GCCAAGGGCGAGGAGTCCGAATACTATCCGATGTTCCTCACCATGAGCTCCGTGTTCCCG
AACGGCGCCACCGAAGAGGACCTGGCCGGCATCTACCGTCCGCGTCCGGGCCTGCCGTTC
ACCCACTACAAGTTCGCCGGCAAGACCCGCCTCGTGTGGGTCAGCTTCACCCCGCAGCAG
GTGGACATCGACACCGATTCCGACAAGGGTTGGGAATACCTCATGTCGATTTTCGACCAG
ATGGCCGCCTCTCACGTCAGCTACATCCGCCTCGACGCCGTCGGCTATGGCGCCAAGGAA
GCCGGCACCAGCTGCTTCATGACCCCGAAGACCTTCAAGCTGATCTCCCGTCTGCGTGAG
GAAGGCGTCAAGCGCGGTCTGGAAATCCTCATCGAAGTGCACTCCTACTACAAGAAGCAG
GTCGAAATCGCATCCAAGGTGGACCGCGTCTACGACTTCGCCCTGCCTCCGCTGCTGCTG
CACGCGCTGAGCACCGGCCACGTCGAGCCCGTCGCCCACTGGACCGACATACGCCCGAAC
AACGCCGTCACCGTGCTCGATACGCACGACGGCATCGGCGTGATCGACATCGGCTCCGAC
CAGCTCGACCGCTCGCTCAAGGGTCTCGTGCCGGATGAGGACGTGGACAACCTCGTCAAC
ACCATCCACGCCAACACCCACGGCGAATCCCAGGCAGCCACTGGCGCCGCCGCATCCAAT
CTCGACCTCTACCAGGTCAACAGCACCTACTATTCGGCGCTCGGGTGCAACGACCAGCAC
TACATCGCCGCCCGCGCGGTGCAGTTCTTCCTGCCGGGCGTGCCGCAAGTCTACTACGTC
GGCGCGCTCGCCGGCAAGAACGACATGGAGCTGCTGCGTAAGACGAATAACGGCCGCGAC
ATCAATCGCCATTACTACTCCACCGCGGAAATCGACGAGAACCTCAAGCGTCCGGTCGTC
AAGGCCCTGAACGCGCTCGCCAAGTTCCGCAACGAGCTCGACGCGTTCGACGGCACGTTC
TCGTACACCACCGATGACGACACGTCCATCAGCTTCACCTGGCGCGGCGAAACCAGCCAG
GCCACGCTGACGTTCGAGCCGAAGCGCGGTCTCGGTGTGGACAACGCTACGCCGGTCGCC
ATGTTGGAATGGGAGGATTCCGCGGGAGACCACCGTTCGGATGATCTGATCGCCAATCCG
CCTGTCGTCGCCTGACTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCAG
GCATGCAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAA
TCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTC
CCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGG
TCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAA
AGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAA
TCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACG
CCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTT
TGCGTTTCTACAAACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTC
ATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATT
CAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCT
CACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGT
TACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGT
TTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGAC
GCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTAC
TCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCT
GCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCG
AAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGG
GAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTACAGCA
ATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAA
CAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTT
CCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATC
ATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGG
AGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATT
AAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTT
CATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATC
CCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCT
TCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTA
CCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGC
TTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCAC
TTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCT
GCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGAT
AAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACG
ACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAA
GGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGG
GAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGA
CTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGC
AACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCT
GCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCT
CGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTG
ATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTC
AGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTG
ACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTT
GTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGAGCTCGATATC
CCGGGCGGCCGCTTCATTTATAAATTTCTTGACATTTTGGAATAGATGTGATATAATGTG
TACATATCCATGGCGGCCGCTCTAGAAGAAGCTTGGGATCCGTCGACCTCG
AATTCGGAGGAAACAAAGATGGGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGC
ATGAAAAACAAGGTGCAGCTCATCACTTACGCCGACCGCCTTGGCGACGGCACCATCAAG
TCGATGACCGACATTCTGCGCACCCGCTTCGACGGCGTGTACGACGGCGTTCACATCCTG
CCGTTCTTCACCCCGTTCGACGGCGCCGACGCAGGCTTCGACCCGATCGACCACACCAAG
GTCGACGAACGTCTCGGCAGCTGGGACGACGTCGCCGAACTCTCCAAGACCCACAACATC
ATGGTCGACGCCATCGTCAACCACATGAGTTGGGAATCCAAGCAGTTCCAGGACGTGCTG
GCCAAGGGCGAGGAGTCCGAATACTATCCGATGTTCCTCACCATGAGCTCCGTGTTCCCG
AACGGCGCCACCGAAGAGGACCTGGCCGGCATCTACCGTCCGCGTCCGGGCCTGCCGTTC
ACCCACTACAAGTTCGCCGGCAAGACCCGCCTCGTGTGGGTCAGCTTCACCCCGCAGCAG
GTGGACATCGACACCGATTCCGACAAGGGTTGGGAATACCTCATGTCGATTTTCGACCAG
ATGGCCGCCTCTCACGTCAGCTACATCCGCCTCGACGCCGTCGGCTATGGCGCCAAGGAA
GCCGGCACCAGCTGCTTCATGACCCCGAAGACCTTCAAGCTGATCTCCCGTCTGCGTGAG
GAAGGCGTCAAGCGCGGTCTGGAAATCCTCATCGAAGTGCACTCCTACTACAAGAAGCAG
GTCGAAATCGCATCCAAGGTGGACCGCGTCTACGACTTCGCCCTGCCTCCGCTGCTGCTG
CACGCGCTGAGCACCGGCCACGTCGAGCCCGTCGCCCACTGGACCGACATACGCCCGAAC
AACGCCGTCACCGTGCTCGATACGCACGACGGCATCGGCGTGATCGACATCGGCTCCGAC
CAGCTCGACCGCTCGCTCAAGGGTCTCGTGCCGGATGAGGACGTGGACAACCTCGTCAAC
ACCATCCACGCCAACACCCACGGCGAATCCCAGGCAGCCACTGGCGCCGCCGCATCCAAT
CTCGACCTCTACCAGGTCAACAGCACCTACTATTCGGCGCTCGGGTGCAACGACCAGCAC
TACATCGCCGCCCGCGCGGTGCAGTTCTTCCTGCCGGGCGTGCCGCAAGTCTACTACGTC
GGCGCGCTCGCCGGCAAGAACGACATGGAGCTGCTGCGTAAGACGAATAACGGCCGCGAC
ATCAATCGCCATTACTACTCCACCGCGGAAATCGACGAGAACCTCAAGCGTCCGGTCGTC
AAGGCCCTGAACGCGCTCGCCAAGTTCCGCAACGAGCTCGACGCGTTCGACGGCACGTTC
TCGTACACCACCGATGACGACACGTCCATCAGCTTCACCTGGCGCGGCGAAACCAGCCAG
GCCACGCTGACGTTCGAGCCGAAGCGCGGTCTCGGTGTGGACAACGCTACGCCGGTCGCC
ATGTTGGAATGGGAGGATTCCGCGGGAGACCACCGTTCGGATGATCTGATCGCCAATCCG
CCTGTCGTCGCCTGACTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCAG
GCATGCAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAA
TCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTC
CCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGG
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TGCGTTTCTACAAACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTC
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GCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTAC
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GCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCG
AAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGG
GAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTACAGCA
ATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAA
CAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTT
CCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATC
ATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGG
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AAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTT
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CCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCT
TCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTA
CCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGC
TTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCAC
TTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCT
GCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGAT
AAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACG
ACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAA
GGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGG
GAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGA
CTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGC
AACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCT
GCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCT
CGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTG
ATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTC
AGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTG
ACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTT
GTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGAGCTCGATATC
CCGGGCGGCCGCTTCATTTATAAATTTCTTGACATTTTGGAATAGATGTGATATAATGTG
TACATATCCATGGCGGCCGCTCTAGAAGAAGCTTGGGATCCGTCGACCTCG
分割代謝におけるGDP-フコース及びフコシル化オリゴ糖生合成のための流れの再方向付け及び変異を、異種のインベルターゼ及びスクロースホスホリラーゼを発現する株の両方について図８に示す。wcaJに加えて、GDP-フコース生合成反応をコードしないコラン酸オペロン遺伝子(例えば、gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaK、wcaL及び/又はwcaM)をノックアウトする。フコシルラクトースの産生のためには、β-ガラクトシダーゼをコードするlacZをノックアウトしてラクトース分解を回避し、ラクトースパーミアーゼをコードするlacYの発現を強力な構成性プロモーターで増強する。
実施例５：グルコースを基質とする分割代謝によるGDP-フコース及びフコシル化オリゴ糖産生の増強
遺伝子pgi、pfkA及びpfkBをノックアウトすると、グルコースとして取り込まれる炭素は、ペントースリン酸経路を介してのみ代謝され得る。この経路の生化学的性質に起因して、フルクトース-6-リン酸が生成される(図９及び10)。バイオマスを生成するためには、グリセルアルデヒド-3-リン酸が生成されなければならず、これはイー・コリにおいてはtktA及びtktBがコードするトランスケトラーゼ反応により生成される。このグリセルアルデヒド-3-リン酸は、キシルロース-5-リン酸及びエリスロース-5-リン酸から、フルクトース-6-リン酸と共に生成される。エリスロース-5-リン酸は、グリセルアルデヒド-3-リン酸及びセドヘプツロース-7-リン酸から、talA及びtalBがコードするトランスアルドラーゼ反応により、フルクトース-6-リン酸と共に生成される。この反応の全てをまとめて平衡させるため、１モルのグルコースから、2/3モルのキシルロース-5-リン酸及び1/3モルのリボース-5-リン酸が生成されるように、流れをキシルロース-5-リン酸とリボース-5-リン酸とに分配しなければならない。この平衡反応を駆動させるため、フルクトース-6-リン酸を、GDP-フコース及びフコシルラクト化オリゴ糖の生合成経路を介してペントースリン酸経路から引き抜く。wcaJに加えて、GDP-フコース生合成反応をコードしないコラン酸オペロン遺伝子(例えば、gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaK、wcaL及び/又はwcaM)をノックアウトする。フコシルラクトースの産生のためには、β-ガラクトシダーゼをコードするlacZをノックアウトしてラクトース分解を回避し、ラクトースパーミアーゼをコードするlacYの発現を強力な構成性プロモーターで増強する。
遺伝子pgi、pfkA及びpfkBをノックアウトすると、グルコースとして取り込まれる炭素は、ペントースリン酸経路を介してのみ代謝され得る。この経路の生化学的性質に起因して、フルクトース-6-リン酸が生成される(図９及び10)。バイオマスを生成するためには、グリセルアルデヒド-3-リン酸が生成されなければならず、これはイー・コリにおいてはtktA及びtktBがコードするトランスケトラーゼ反応により生成される。このグリセルアルデヒド-3-リン酸は、キシルロース-5-リン酸及びエリスロース-5-リン酸から、フルクトース-6-リン酸と共に生成される。エリスロース-5-リン酸は、グリセルアルデヒド-3-リン酸及びセドヘプツロース-7-リン酸から、talA及びtalBがコードするトランスアルドラーゼ反応により、フルクトース-6-リン酸と共に生成される。この反応の全てをまとめて平衡させるため、１モルのグルコースから、2/3モルのキシルロース-5-リン酸及び1/3モルのリボース-5-リン酸が生成されるように、流れをキシルロース-5-リン酸とリボース-5-リン酸とに分配しなければならない。この平衡反応を駆動させるため、フルクトース-6-リン酸を、GDP-フコース及びフコシルラクト化オリゴ糖の生合成経路を介してペントースリン酸経路から引き抜く。wcaJに加えて、GDP-フコース生合成反応をコードしないコラン酸オペロン遺伝子(例えば、gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaK、wcaL及び/又はwcaM)をノックアウトする。フコシルラクトースの産生のためには、β-ガラクトシダーゼをコードするlacZをノックアウトしてラクトース分解を回避し、ラクトースパーミアーゼをコードするlacYの発現を強力な構成性プロモーターで増強する。
実施例６：ヘリコバクター・ピロリに由来するフコシルトランスフェラーゼを用いる2-フコシルラクトースの発酵産生
遺伝子lacZ、glgC、agp、pfkA、pfkB、pgi、arcA、iclR、wcaJがノックアウトされ、全ての培養条件下で確実に発現するようにlacYを構成的発現により発現させた変異体株を、ヘリコバクター・ピロリに由来するフコシルトランスフェラーゼ及びビフィドバクテリウム・アドレセンティス(Bifidobacterium adolescentis)に由来するスクロースホスホリラーゼ(これらも構成的に発現する)で更に形質転換した。構成性プロモーターは、De Meyら 2007に記載されるプロモーターライブラリに由来する。この株を、「材料及び方法」に記載した培地であるが30g/lのスクロース及び50g/lのラクトースを含む培地で培養した。これにより、図13及び14に示すように、2-フコシルラクトースの生成がもたらされた。
遺伝子lacZ、glgC、agp、pfkA、pfkB、pgi、arcA、iclR、wcaJがノックアウトされ、全ての培養条件下で確実に発現するようにlacYを構成的発現により発現させた変異体株を、ヘリコバクター・ピロリに由来するフコシルトランスフェラーゼ及びビフィドバクテリウム・アドレセンティス(Bifidobacterium adolescentis)に由来するスクロースホスホリラーゼ(これらも構成的に発現する)で更に形質転換した。構成性プロモーターは、De Meyら 2007に記載されるプロモーターライブラリに由来する。この株を、「材料及び方法」に記載した培地であるが30g/lのスクロース及び50g/lのラクトースを含む培地で培養した。これにより、図13及び14に示すように、2-フコシルラクトースの生成がもたらされた。
実施例７：ディクチオステリウム・ディスコイデウムに由来するフコシルトランスフェラーゼを用いるフコシルラクトースの発酵産生
遺伝子lacZ、glgC、agp、pfkA、pfkB、pgi、arcA、iclR、wcaJがノックアウトされ、全ての培養条件下で確実に発現するようにlacYを構成的発現により発現させた変異体株を、ディクチオステリウム・ディスコイデウムに由来するフコシルトランスフェラーゼ及びビフィドバクテリウム・アドレセンティスに由来するスクロースホスホリラーゼ(これらも構成的に発現する)で更に形質転換した。構成性プロモーターは、De Meyら 2007に記載されるプロモーターライブラリに由来する。この株を、「材料及び方法」に記載した培地であるが30g/lのスクロース及び50g/lのラクトースを含む培地で培養した。これにより、図13及び14に示すように、2-フコシルラクトースの生成がもたらされた。
遺伝子lacZ、glgC、agp、pfkA、pfkB、pgi、arcA、iclR、wcaJがノックアウトされ、全ての培養条件下で確実に発現するようにlacYを構成的発現により発現させた変異体株を、ディクチオステリウム・ディスコイデウムに由来するフコシルトランスフェラーゼ及びビフィドバクテリウム・アドレセンティスに由来するスクロースホスホリラーゼ(これらも構成的に発現する)で更に形質転換した。構成性プロモーターは、De Meyら 2007に記載されるプロモーターライブラリに由来する。この株を、「材料及び方法」に記載した培地であるが30g/lのスクロース及び50g/lのラクトースを含む培地で培養した。これにより、図13及び14に示すように、2-フコシルラクトースの生成がもたらされた。
実施例８：スクロースを基質とする分割代謝によるGDP-マンノース及びマンノシル化オリゴ糖産生の増強
GDP-マンノース前駆体であるフルクトース及びフルクトース-6-リン酸を蓄積させるため、スクロースホスホリラーゼ又はインベルターゼを導入する。フルクトース-6-リン酸は解糖で容易に分解するため、全てのフルクトース-6-リン酸がGDP-フコースの方向に導かれるように解糖を妨げる。よって、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ並びにホスホフルクトキナーゼＡ及びＢをコードする遺伝子pgi、pfkA及びpfkBをノックアウトする。最後に、マンノシルトランスフェラーゼを導入して、マンノースをアクセプター分子と連結させる。GDP-マンノース分解を回避するため、コラン酸オペロンで遺伝子gmm及びgmdをノックアウトしなければならない。加えて、GDP-マンノース生合成反応をコードしない遺伝子(例えば、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaJ、wcaK、wcaL及び/又は wcaM)をノックアウトする。
GDP-マンノース前駆体であるフルクトース及びフルクトース-6-リン酸を蓄積させるため、スクロースホスホリラーゼ又はインベルターゼを導入する。フルクトース-6-リン酸は解糖で容易に分解するため、全てのフルクトース-6-リン酸がGDP-フコースの方向に導かれるように解糖を妨げる。よって、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ並びにホスホフルクトキナーゼＡ及びＢをコードする遺伝子pgi、pfkA及びpfkBをノックアウトする。最後に、マンノシルトランスフェラーゼを導入して、マンノースをアクセプター分子と連結させる。GDP-マンノース分解を回避するため、コラン酸オペロンで遺伝子gmm及びgmdをノックアウトしなければならない。加えて、GDP-マンノース生合成反応をコードしない遺伝子(例えば、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaJ、wcaK、wcaL及び/又は wcaM)をノックアウトする。
実施例９：酸耐性関連遺伝子のアップレギュレーション
コラン酸オペロンのアップレギュレーションと同様、酸耐性関連遺伝子も、ΔarcAΔiclR二重変異体株において、野生型株及び単一変異体株と比較してアップレギュレートする。これら遺伝子は変異体株を低pHに耐性とする。このことは酸の産生(4)又は(中性及び高pHで安定でない)グルコサミンの産生(12)に有益である。図12は、これら酸耐性関連遺伝子の遺伝子発現パターンを表し、二重変異体株における最高８倍の発現増大を示す。
コラン酸オペロンのアップレギュレーションと同様、酸耐性関連遺伝子も、ΔarcAΔiclR二重変異体株において、野生型株及び単一変異体株と比較してアップレギュレートする。これら遺伝子は変異体株を低pHに耐性とする。このことは酸の産生(4)又は(中性及び高pHで安定でない)グルコサミンの産生(12)に有益である。図12は、これら酸耐性関連遺伝子の遺伝子発現パターンを表し、二重変異体株における最高８倍の発現増大を示す。
実施例10：2-フコシルラクトースの流加バッチ産生
以下の遺伝子型を有する変異体株を、上記の遺伝子操作法により構築した：ΔlacZYA::P22-lacYΔglgCΔagpΔpgiΔpfkA-P22-baSPΔpfkBΔarcAΔiclR::slΔwcaJΔlonΔadhE-P14-frk + pCXP14-FT_H. pylori(配列番号１の配列を有するベクター)。プロモーターP22及びP14はDe Meyら 2007(11)により構築されたプロモーターライブラリに由来し、Aertsら(2)が記載した方法と同様にクローニングした。「::sl」は無痕跡の遺伝子欠失(よって、染色体に残るFRT部位がない)を表す。
この株を、上記「材料及び方法」のとおりバイオリアクター中、30g/lのスクロース及び50g/lのラクトースを有する無機培地で培養した。バッチ期の後、バイオリアクターに500g/lのスクロース、50g/lのラクトース及び１g/lの硫酸マグネシウム・７水和物を供給した。これにより、上清中に27.5g/lのフコシルラクトースの蓄積がもたらされた。
以下の遺伝子型を有する変異体株を、上記の遺伝子操作法により構築した：ΔlacZYA::P22-lacYΔglgCΔagpΔpgiΔpfkA-P22-baSPΔpfkBΔarcAΔiclR::slΔwcaJΔlonΔadhE-P14-frk + pCXP14-FT_H. pylori(配列番号１の配列を有するベクター)。プロモーターP22及びP14はDe Meyら 2007(11)により構築されたプロモーターライブラリに由来し、Aertsら(2)が記載した方法と同様にクローニングした。「::sl」は無痕跡の遺伝子欠失(よって、染色体に残るFRT部位がない)を表す。
この株を、上記「材料及び方法」のとおりバイオリアクター中、30g/lのスクロース及び50g/lのラクトースを有する無機培地で培養した。バッチ期の後、バイオリアクターに500g/lのスクロース、50g/lのラクトース及び１g/lの硫酸マグネシウム・７水和物を供給した。これにより、上清中に27.5g/lのフコシルラクトースの蓄積がもたらされた。
配列番号１：pCXP14-FT_H. pylori
CGCGTTGGATGCAGGCATGCAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCC
TGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCA
GTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCG
ATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGA
AAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTC
CTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGG
TGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTG
ACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAA
ATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGA
AGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCC
TTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGG
GTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTC
GCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTAT
TATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATG
ACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAG
AATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAA
CGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTC
GCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCA
CGATGCCTACAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTC
TAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTC
TGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTG
GGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTA
TCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAG
GTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGA
TTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATC
TCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAA
AGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAA
AAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTC
CGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGT
AGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCC
TGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGAC
GATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCA
GCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCG
CCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAG
GAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGT
TTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTAT
GGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTC
ACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGT
GAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAG
CGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCA
TATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCC
GCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGC
GCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGG
GAGAGCTCGATATCCCGGGCGGCCGCCTTCATTCTATAAGTTTCTTGACATCTTGGCCGG
CATATGGTATAATAGGGAAATTTCCATGGCGGCCGCTCTAGAAGAAGCTTGGGATCCGTC
GACCTCGAATTCGGAGGAAACAAAGATGGCCTTTAAAGTTGTTCAGATTTGTGGTGGTCT
GGGCAATCAGATGTTTCAGTATGCATTTGCAAAAAGCCTGCAGAAACATAGCAATACACC
GGTTCTGCTGGATATTACCAGCTTTGATTGGAGCAATCGTAAAATGCAGCTGGAACTGTT
TCCGATTGATCTGCCGTATGCAAGCGAAAAAGAAATTGCAATTGCCAAAATGCAGCATCT
GCCGAAACTGGTTCGTAATGTTCTGAAATGCATGGGTTTTGATCGTGTGAGCCAAGAAAT
CGTGTTTGAATATGAACCGAAACTGCTGAAAACCAGCCGTCTGACCTATTTTTATGGCTA
TTTTCAGGATCCGCGTTATTTTGATGCAATTAGTCCGCTGATCAAACAGACCTTTACCCT
GCCTCCGCCTCCGGAAAATGGTAATAACAAAAAAAAAGAAGAAGAGTATCATCGTAAACT
GGCACTGATTCTGGCAGCAAAAAATAGCGTGTTTGTGCATATTCGTCGCGGTGATTATGT
TGGTATTGGTTGTCAGCTGGGCATCGATTATCAGAAAAAAGCACTGGAATACATGGCAAA
ACGTGTTCCGAATATGGAACTGTTTGTGTTTTGCGAGGACCTGGAATTTACCCAGAATCT
GGATCTGGGCTATCCGTTTATGGATATGACCACCCGTGATAAAGAGGAAGAGGCATATTG
GGATATGCTGCTGATGCAGAGCTGTAAACATGGTATTATTGCCAACAGCACCTATAGTTG
GTGGGCAGCATATCTGATTAATAACCCGGAAAAAATCATTATTGGTCCGAAACATTGGCT
GTTTGGCCATGAAAACATCCTGTGTAAAGAATGGGTGAAAATCGAAAGCCACTTTGAAGT
GAAAAGCCAGAAATATAATGCCTAATAAGAGCTCCCAA
CGCGTTGGATGCAGGCATGCAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCC
TGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCA
GTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCG
ATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGA
AAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTC
CTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGG
TGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTG
ACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAA
ATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGA
AGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCC
TTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGG
GTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTC
GCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTAT
TATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATG
ACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAG
AATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAA
CGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTC
GCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCA
CGATGCCTACAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTC
TAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTC
TGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTG
GGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTA
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TGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGAC
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GCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCG
CCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAG
GAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGT
TTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTAT
GGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTC
ACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGT
GAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAG
CGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCA
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GCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGC
GCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGG
GAGAGCTCGATATCCCGGGCGGCCGCCTTCATTCTATAAGTTTCTTGACATCTTGGCCGG
CATATGGTATAATAGGGAAATTTCCATGGCGGCCGCTCTAGAAGAAGCTTGGGATCCGTC
GACCTCGAATTCGGAGGAAACAAAGATGGCCTTTAAAGTTGTTCAGATTTGTGGTGGTCT
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GCCGAAACTGGTTCGTAATGTTCTGAAATGCATGGGTTTTGATCGTGTGAGCCAAGAAAT
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GAAAAGCCAGAAATATAATGCCTAATAAGAGCTCCCAA
実施例11：ハイブリッドコラン酸プロモーターを用いる2-フコシルラクトースの流加バッチ産生
ハイブリッドコラン酸プロモーターを、ゲノム情報及びDe Meyら(11)に記載されたプロモーターライブラリからの配列に基づいて構築した。
ΔlacZYA::P22-lacYΔglgCΔagpΔpgiΔpfkA::P22-BaSPΔpfkB ΔarcAΔiclR:sl ΔwcaJ Δlon ΔadhE-P14-frk ΔldhA::P14- FT_H. pylori ΔpromCA:P14
この株を、上記「材料及び方法」のとおりバイオリアクター中、30g/lのスクロース及び20g/lのラクトースを有する無機培地で培養した。バッチ期の後、バイオリアクターに500g/lのスクロース、20g/lのラクトース及び１g/lの硫酸マグネシウム・７水和物を供給した。これにより、上清中に、化学量論的ラクトース変換に近い26g/lのフコシルラクトースの蓄積がもたらされた。ラクトースの供給濃度を上昇させることで、最終的なフコシルラクトース価及び化学量論的ラクトース変換の更なる増大がもたらされる。
ハイブリッドコラン酸プロモーターを、ゲノム情報及びDe Meyら(11)に記載されたプロモーターライブラリからの配列に基づいて構築した。
ΔlacZYA::P22-lacYΔglgCΔagpΔpgiΔpfkA::P22-BaSPΔpfkB ΔarcAΔiclR:sl ΔwcaJ Δlon ΔadhE-P14-frk ΔldhA::P14- FT_H. pylori ΔpromCA:P14
この株を、上記「材料及び方法」のとおりバイオリアクター中、30g/lのスクロース及び20g/lのラクトースを有する無機培地で培養した。バッチ期の後、バイオリアクターに500g/lのスクロース、20g/lのラクトース及び１g/lの硫酸マグネシウム・７水和物を供給した。これにより、上清中に、化学量論的ラクトース変換に近い26g/lのフコシルラクトースの蓄積がもたらされた。ラクトースの供給濃度を上昇させることで、最終的なフコシルラクトース価及び化学量論的ラクトース変換の更なる増大がもたらされる。
参考文献
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Claims (19)
- 転写調節因子である好気呼吸制御タンパク質ArcA及びイソクエン酸リアーゼ調節因子IclRの改変された発現を導く遺伝子変化を含んでなる変異及び/又は形質転換した微生物の、ホスホマンノムターゼ、マンノース-1-リン酸グアニリルトランスフェラーゼ、GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ及びGDP-フコースシンターゼをそれぞれコードする遺伝子cpsG、cpsB、gmd及びfclを含んでなるコラン酸オペロンの少なくとも１つの遺伝子をアップレギュレートするための使用。
- コラン酸オペロンの少なくとも１つの遺伝子のアップレギュレーションが、コラン酸オペロンの転写調節因子rcsAのアップレギュレーションの後に続く請求項１に記載の使用。
- 微生物がエシェリキア・コリ(Escherichia coli)株であり、具体的にはイー・コリ(E. coli)株はK12株であり、より具体的にはK12株はイー・コリMG1655である請求項１又は２に記載の使用。
- 遺伝子変化が、ArcA及びIclRをコードする遺伝子の破壊、ArcA及びIclRをコードする遺伝子の内因性プロモーターの人工プロモーターでの置換、又は内因性リボソーム結合部位の人工リボソーム結合部位での置換である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
- 改変された発現が発現減少であり、具体的には発現減少は発現消失である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
- コラン酸オペロンの少なくとも１つの遺伝子が、対応する野生型微生物中のコラン酸オペロンの発現と比較して６〜８倍アップレギュレートされる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
- 転写調節因子である有気呼吸制御タンパク質ArcA及びイソクエン酸リアーゼ調節因子IclRを遺伝的に改変して、遺伝子cpsG、cpsB、gmd及びfclを含んでなるコラン酸オペロンの少なくとも１つの遺伝子をアップレギュレートすることを含んでなる、コラン酸及び/又はGDP-フコース及び/又はフコシル化オリゴ糖の合成方法。
- 請求項１による変異が、フコシル化化合物の産生を増強する少なくとも１つの変異との組合せで適用される、請求項７に記載の方法。
- フコシル化化合物の産生を増強する少なくとも１つの変異が以下：wcaJ遺伝子の欠失；コラン酸オペロン遺伝子gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaJ、wcaK、wcaL、wzx、wza、wzb、wzc及び/又はwcaMのノックアウト；lacZのノックアウト；スクロースホスホリラーゼ又はインベルターゼの導入；遺伝子pgi、pfkA及びpfkBのノックアウト；遺伝子lonのノックアウト；フコシルトランスフェラーゼ及び/又はラクトースパーミアーゼの導入；又はそれらの組合せからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
- GDP-マンノースの合成及び/又はマンノシル化オリゴ糖の合成のための、請求項７に記載の方法。
- コラン酸オペロンの遺伝子cpsG及びcpsBがアップレギュレートされ、且つ
ａ)コラン酸オペロンの遺伝子gmdが欠失され、及び/又は、
ｂ)遺伝子gmmが欠失され、及び/又は
ｃ)コラン酸オペロン遺伝子fcl、gmd、gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaJ、wcaK、wcaL、wzx、wza、wzb、wzc及び/又はwcaMがノックアウトされ、及び/又は、
ｄ)スクロースホスホリラーゼ又はインベルターゼをコードする遺伝子が導入され、及び/又は、
ｅ)遺伝子pgi、pfkA及びpfkBが欠失され、及び/又は、
ｆ)遺伝子lonがノックアウトされ、及び/又は
ｇ)マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が導入されている、請求項１０に記載の方法。 - 調節因子ArcA及びIclRが、酵素ホスホグルコースイソメラーゼ及びホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子との組合せで、ノックアウトされているか又は機能を低下させられている、変異及び/又は形質転換した生物。
- 酵素ホスホグルコースイソメラーゼが遺伝子pgiによりコードされ、酵素ホスホフルクトキナーゼが遺伝子pfkA及び/又はpfkBによりコードされている、請求項１２に記載の変異及び/又は形質転換した生物。
- スクロースホスホリラーゼ又はインベルターゼをコードする遺伝子で更に形質転換されている、請求項１２又は１３に記載の変異及び/又は形質転換した生物。
- ラクトースパーミアーゼをコードする遺伝子の活性が増大している、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の変異及び/又は形質転換した生物。
- 以下の遺伝子：
β-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、グルコース-1-リン酸アデニリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、グルコース-1-ホスファターゼをコードする遺伝子、ホスホグルコン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子、2-ケト-3-デオキシグルコネート-6-リン酸アルドラーゼをコードする遺伝子、グルコース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-グルコース-4-エピメラーゼをコードする遺伝子、UDP-グルコース:ガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDPガラクトピラノースムターゼをコードする遺伝子、UDP-ガラクトース:(グルコシル)リポ多糖-1,6-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-グルコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-グルクロネートトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-グルコース脂質担体トランスフェラーゼをコードする遺伝子、GDP-マンノースヒドロラーゼをコードする遺伝子、UDP-糖ヒドロラーゼをコードする遺伝子、マンノース-6-リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子、UDP-N-アセチルグルコサミンエノイルピルボイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-Nアセチルグルコサミンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、UDP-Nアセチルグルコサミン-2-エピメラーゼをコードする遺伝子、ウンデカプレニル-リン酸α-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、及び/又は、L-グルタミン:D-フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子、マンノース-6-リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子、ソルビトール-6-リン酸 デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、マンニトール-1-リン酸5-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼをコードする遺伝子、インベルターゼをコードする遺伝子、マルターゼをコードする遺伝子、トレハラーゼをコードする遺伝子、糖輸送ホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子、プロテアーゼをコードする遺伝子、又はヘキソキナーゼをコードする遺伝子
の少なくとも１つがノックアウトされているか又は機能を低下させられている、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の変異及び/又は形質転換した生物。 - 転写調節因子である有気呼吸制御タンパク質ArcA及びイソクエン酸リアーゼ調節因子IclRの改変された発現を導く遺伝子変化を含んでなる変異及び/又は形質転換したエシェリキア・コリ(Escherichia coli)株の、以下の酸耐性関連遺伝子：ydeP、ydeO、hdeA、hdeD、gadB、gadC、gadE、gadX、gadW及び/又はslpの少なくとも１つをアップレギュレートするための使用。
- 酸、シアル酸、シアル酸付加オリゴ糖又はグルコサミンの合成のための、請求項１７に記載の使用。
- 転写調節因子である有気呼吸制御タンパク質ArcA及びイソクエン酸リアーゼ調節因子IclRを遺伝的に改変して、以下の酸耐性関連遺伝子：ydeP、ydeO、hdeA、hdeD、gadB、gadC、gadE、gadX、gadW及び/又はslpの少なくとも１つをアップレギュレートすることを含んでなる、酸、シアル酸、シアル酸付加オリゴ糖又はグルコサミンの合成方法。
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