CN103987841A - 用于合成可拉酸、甘露糖基化和/或岩藻糖基化寡糖的突变微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于合成多种化合物的突变和/或转化的微生物。更特别地，本发明公开了在编码调节因子ArcA和IclR的基因中突变的微生物。后者所述造成作为可拉酸操纵子一部分之基因的显著上调。因此，所述微生物可用于合成作为可拉酸途径一部分的任何化合物(例如GDP-岩藻糖、GDP-甘露糖和可拉酸)，和/或还可用于(从作为前体的GDP-岩藻糖开始)合成岩藻糖基化的寡糖或用于(从作为前体的GDP-甘露糖开始)合成甘露糖基化的寡糖。此外，在编码转录调节因子ArcA和IclR之基因中的突变导致在指数生长期中的酸抗性表型，从而允许合成pH敏感分子或有机酸。

Description

用于合成可拉酸、甘露糖基化和/或岩藻糖基化寡糖的突变微生物
技术领域
本发明涉及用于合成多种化合物的突变和/或转化的微生物。更特别地，本发明公开了在编码调节因子ArcA和IclR的基因中突变的微生物。后者所述造成作为可拉酸(colanic acid)操纵子一部分之基因的显著上调。因此，所述微生物可用于合成作为可拉酸途径一部分的任何化合物(例如GDP-岩藻糖、GDP-甘露糖和可拉酸)，和/或还可用于(从作为前体的GDP-岩藻糖开始)合成岩藻糖基化的寡糖或用于(从作为前体的GDP-甘露糖开始)合成甘露糖基化的寡糖。此外，在编码转录调节因子ArcA和IclR之基因中的突变导致允许在合成pH敏感分子或有机酸的指数生长期中的酸抗性表型。
背景技术
已知编码需氧呼吸调控蛋白(aerobic respiration control protein)的基因arcA和编码异柠檬酸裂合酶调节因子(isocitratelyase regulator)的基因iclR调节中心碳代谢(central carbon metabolism)。ArcA是调节很多种基因的全局转录调节因子(global transcriptional regulator)，而IclR为调节乙醛酸途径(glyoxylate pathway)的局部转录调节因子。已知ArcA调节响应于缺氧的中心碳代谢(central carbon metabolism)，并且除了其也调节乙醛酸途径之外与IclR无联系(24、28、29、37、38)。在之前的研究中，已经观察到ΔiclRΔarcA突变菌株对中心碳代谢的组合作用。在三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循环和乙醛酸途径中显示出提高的通量，且当这两个基因被敲除时出现了令人感兴趣和出人意料的表型，即双突变菌株以接近最大理论产率的产率形成生物质(4、39)。
对一些化合物(例如GDP-岩藻糖)有很高的需要。后一种化合物实际上是岩藻糖基化寡糖(例如岩藻糖基乳糖、岩藻糖基乳糖N二糖(fucosyllactoNbiose)和Lewis X寡糖)或岩藻糖基化蛋白的前体。这些糖是人母乳的组分，其中它们具有抗炎及益生作用(prebiotic effect)和/或作为营养品、抗炎剂或益生素在治疗中有应用，此外，岩藻糖基化蛋白可用于制药(5、8、27)。然而，仍需要产生后一种高价值化合物的高效方法。
此外，GDP-甘露糖也是针对GDP-岩藻糖之途径的中间体。过早地中断该途径导致该化合物的积累，其为甘露糖基化寡糖的前体。这些寡糖可用于例如治疗革兰氏阴性细菌感染，此外，GDP-甘露糖对于蛋白质糖基化的人源化是重要的，其对于某些治疗性蛋白质的产生是必不可少的(18、30)。甘露糖基化寡糖和甘露糖基化复合糖还用于药物靶向，例如，甘露糖基化抗病毒剂可特异性地靶向肝和肾(7)。
本发明提供了遗传上改变的微生物，以这种方式，它们可以高效地产生后一种化合物。
而且，pH敏感分子(例如但不限于葡糖胺和有机酸(例如但不限于丙酮酸、琥珀酸、己二酸、唾液酸、唾液酸化寡糖...))的合成优选地在低pH下产生以稳定产物或为了下游处理的原因(4、12、40)。因此，可在低pH下生长的菌株对于这些产生方法是有益的。大肠杆菌(E.coli)是可容易地适应多种条件的生物体，例如其可容易地适应胃中严酷的pH条件(其为约pH2)(14)。虽然如此，大肠杆菌似乎不在这些条件下生长，但是在静止期诱导了其酸抗性机制(40)。在该阶段期间，细胞不再增殖并因此妨碍了生产率。目前为止，对于这个问题还没有发现解决方法。然而，在本发明中，提供了遗传改造的微生物，其可以诱导在指数生长期(其是主要用于产生有机酸和pH不稳定产物的阶段)的酸抗性机制。
附图简述
图1：野生型、ΔiclR和ΔarcA突变菌株相对于分批发酵条件下参与可拉酸生物合成之基因的ΔarcAΔiclR突变菌株的基因表达模式。参与可拉酸生物合成的基因在图3和4中呈现。
图2：在恒化器(chemostat)发酵条件下野生型、ΔiclR和ΔarcA突变菌株相对于ΔarcAΔiclR突变菌株的可拉酸操纵子基因表达模式。
图3：可拉酸操作子的基因组构以及这些基因之功能的概览：
基因： 功能：
wza 荚膜多糖输出器的组分
wzb 酪氨酸磷酸酶
wzc 酪氨酸激酶
wcaA 糖基转移酶
wcaB 酰基转移酶
wcaC 糖基转移酶
wcaD 可拉酸聚合酶
wcaE 糖基转移酶
wcaF 酰基转移酶
gmd GDP-甘露糖-4，6-脱水酶
fcl GDP-岩藻糖合酶
gmm GDP-甘露糖水解酶
wcaI 糖基转移酶
cpsB 甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶
cpsG 磷酸甘露糖变位酶
wcaJ UDP-葡萄糖脂质载体转移酶
wzxC 推定的转运蛋白
wcaK 丙酮酰转移酶(Pyruvyltransferase)
wcaL 糖基转移酶
wcaM 在可拉酸生物合成中预测的蛋白
图4：可拉酸生物合成途径。
图5：可拉酸操纵子的调控网络。用Pathway工具v13.0构建该网络。
图6：ΔarcAΔiclR突变对GDP-岩藻糖生物合成途径的影响。
图7：增强从作为底物之葡萄糖开始的岩藻糖基乳糖和岩藻糖基化寡糖产生所需的基因修饰的概览。
图8：从蔗糖开始，产生岩藻糖基化糖衍生物(例如岩藻糖基乳糖)，且更特别地产生1，2-岩藻糖基乳糖。修饰菌株以迫使细胞产生果糖-6-磷酸(frucose-6-phosphate)，其为GDP-岩藻糖合成的中间体。然后将葡萄糖或葡萄糖-1-磷酸(如果起始酶为蔗糖酶或蔗糖磷酸化酶)经由戊糖磷酸途径供给中心碳代谢。
图9：在分裂代谢(split metabolism)中增强从作为底物之葡萄糖开始的岩藻糖基乳糖和岩藻糖基化寡糖产生所需的基因修饰的概览。
图10：菌株中戊糖磷酸途径通量(flux)的细节，其中敲除了编码磷酸葡萄糖异构酶和磷酸果糖激酶的基因。
图11：从蔗糖开始，产生甘露糖基化糖的衍生物。修饰菌株以迫使细胞产生果糖-6-磷酸，其为GDP-岩藻糖合成的中间体。然后将葡萄糖或葡萄糖-1-磷酸(如果起始酶为蔗糖酶或蔗糖磷酸化酶)经由戊糖磷酸途径供给中心碳代谢。
图12：在分批培养条件下野生型、ΔiclR和ΔarcA突变菌株相对于ΔarcAΔiclR突变菌株之酸抗性相关基因的基因表达模式。
图13：培养液(culture broth)和2-岩藻糖基乳糖标准物的LC MSMS分析色谱。A.该标准物的LC MSMS分析，B.表达幽门螺杆菌(H.pylori)岩藻糖基转移酶突变菌株培养液之样品的LC MSMS分析，C.表达幽门螺杆菌岩藻糖基转移酶突变菌株培养液之样品的LC MSMS分析。
图14：来自图13示出的培养液和2-岩藻糖基乳糖标准物之色谱的LC MSMS分析质谱。A.标准物的质量(m/z)，B.表达幽门螺杆菌岩藻糖基转移酶之突变菌株培养液样品的质量(m/z)，C.表达幽门螺杆菌岩藻糖基转移酶之突变菌株培养液样品的质量(m/z)。
图15：如由SEQ ID N°6给出的人工杂合启动子的序列(天然和人工启动子的组合)，其克隆在可拉酸操纵子之前。
发明详述
本发明提供了遗传改变的微生物(例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae))，以这种方式它们可高效地产生作为可拉酸途径一部分的化合物。特别的目标化合物是GDP-岩藻糖，其用作合成岩藻糖基化寡糖的前体。后者具有如上所指明的改善健康作用，但无可用的产生所述化合物的高效产生方法。
因此，本发明提供了突变和/或转化的微生物用于上调可拉酸操纵子的至少一种基因的用途，所述微生物包含导致转录调节因子需氧呼吸调控蛋白ArcA和异柠檬酸裂合酶调节因子IclR的修饰表达和/或活性的遗传改变，其中所述操纵子包含分别编码磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶、GDP-甘露糖4，6-脱水酶和GDP-岩藻糖合酶的基因cpsG、cpsB、gmd和fcl。后一操纵子还可包含基因cpsG、cpsB、gmd、fcl和wza。此外，基因rcsA的表达提高。该基因是可拉酸操纵子的转录调节因子。该基因表达的增强提高了可拉酸操纵子的转录(13、36)。
因此，本发明涉及突变和/或转化的微生物用于上调可拉酸操纵子基因rcsA的用途，所述微生物包含导致转录调节因子需氧呼吸调控蛋白ArcA及异柠檬酸裂合酶调节因子IclR的修饰表达和/或活性的遗传改变，这继而上调可拉酸操纵子的至少一种基因。
因此，本发明涉及突变和/或转化的微生物，例如但不限于肠杆菌科(例如大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli))菌株，其包含导致转录调节因子(需氧呼吸调控蛋白ArcA和异柠檬酸裂合酶调节因子IclR)之修饰表达的遗传改变。
如本文使用的突变和/或转化的微生物(例如大肠杆菌)可通过本领域技术人员已知的任何方法获得，包括但不限于UV诱变和化学诱变。一种获得后面微生物的优选方式为通过破坏(敲除)编码蛋白ArcA和IclR的基因(arcA和iclR)，或者通过由人工启动子替代所述基因的内源启动子或通过由人工核糖体结合位点替代内源核糖体结合位点。术语“人工启动子”涉及异源或非天然或在计算机上(in silico)设计的具有已知表达强度的启动子，这些启动子可来源于由Alper等(2005)、Hammer等(2006)或De Mey等(2007)(3、11、15)所描述的文库。术语异源启动子指不是在基因前面天然出现的任何启动子。术语“人工启动子”还可指具有这样的DNA序列的启动子，所述DNA序列是天然(自体)启动子序列组合与一部分不同(自体或异源)启动子序列的组合，例如进一步在实例中所示。这样的“人工启动子”的序列可在例如partsregistry.org的数据库中找到(6)。术语“人工核糖体结合位点”涉及异源或非天然或在计算机上设计的具有已知或可测量之翻译率的核糖体结合位点，这些文库可来自于由Salis等(2009)(26)所描述的文库或经由算法设计的文库。因此，本发明特别地涉及如上所指明的突变和/或转化的微生物，其中所述遗传改变为破坏编码ArcA和IclR的基因，或者通过在编码ArcA和IclR之基因的编码序列中的突变来降低或消除ArcA和IclR的功能，或者以人工启动子替代编码ArcA和IclR之基因的内源启动子；或者以人工核糖体结合位点替代内源核糖体结合位点。更清楚地是，根据本发明的突变体和/或转化体还可包含另外的在一个或更多个其他基因中其基因组的遗传改变，如还将进一步描述的。术语微生物特别地涉及细菌，更特别地，涉及属于肠杆菌科的细菌。后一细菌优选地涉及任何属于物种大肠杆菌的菌株，例如但不限于大肠杆菌B、大肠杆菌C、大肠杆菌w、大肠杆菌K12、大肠杆菌Nissle。更特别地，后一术语涉及培养的大肠杆菌菌株(定名为大肠杆菌K12菌株)，其很好地适应实验室环境，且不同于野生型菌株，失去了其在肠中繁荣生长(thrive)的能力。大肠杆菌K12公知的实例为K12野生型、W3110、MG1655、M182、MC1000、MC1060、MC1061、MC4100、JM101、NZN111和AA200。因此，本发明特别地涉及如上所指明的突变和/或转化的大肠杆菌菌株，其中所述大肠杆菌菌株为K12菌株。更特别地，本发明涉及如上所指明的突变和/或转化的大肠杆菌菌株，其中所述K12菌株为大肠杆菌MG1655。
术语“导致修饰表达或活性”表示上述的突变/转化影响所述基因(arcA和iclR)向本发明之转录调节因子蛋白(ArcA和IclR)的转录和/或翻译和/或翻译后修饰，与野生型菌株(其对于本发明的两个特定基因都没有突变或转化)相比，以这种方式后一种转录显著的降低或被完全地取消(abolish)。因此，本发明涉及如上所指明的突变和/或转化的微生物(例如大肠杆菌菌株)，其中所述修饰的表达为降低表达，并且涉及如上所指明的突变和/或转化的微生物(例如大肠杆菌菌株)，其中所述降低表达为取消表达。
术语“上调可拉酸操纵子的至少一种基因”表示当在对应的与突变和/或转化的微生物在相同条件下培养之野生型微生物中的所述基因表达相比时，属于可拉酸操纵子之基因的至少1、2、3、4种...或所有的基因表达显著地(＝P＞0.05)被上调。属于可拉酸操纵子的基因为图3所指明的和/或(35)中所描述的wza、wzb、wzc、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、gmd、fcl、gmm、wcaI、cpsB、cpsG、wcaJ、wzxC、wcaK、wcaL和wcaM。此外，编码可拉酸操纵子之转录调节因子的基因rcsA也被上调(13、36)。更特别地，术语“上调可拉酸操纵子的至少一种基因”或可拉酸操纵子的转录调节因子表示与在对应的野生型微生物中可拉酸操纵子之基因的表达相比，至少一种可拉酸操纵子的基因为6至8倍的上调。此外，本发明涉及通过由“人工启动子”替代天然启动子上调如上所述之可拉酸操纵子的基因。更特别地，本发明涉及天然启动子序列和其他人工启动子序列的组合。天然启动子序列和其他人工启动子序列的组合更特别地为用更强的σ因子结合位点替代天然自动子的σ因子结合位点。(41)描述了σ因子(例如但不限于σ70、σS、σ24...)，其为决定启动子序列亲和力和基因转录率的RNA聚合酶的亚基。本发明提供了遗传改变的微生物，以这种方式它们可以高效地产生作为可拉酸途径一部分的化合物。术语“作为可拉酸途径一部分的化合物”指图4中所指明的所有化合物，开始于果糖-6-P并产生胞外可拉酸。更特别地，后一术语指化合物甘露糖-6-P、甘露糖-1-P、GDP-甘露糖、GDP-4-脱氢-6脱氧-甘露糖、GDP-岩藻糖和可拉酸。因此，本发明特别地涉及对于可拉酸合成和/或GDP-岩藻糖合成所指明的用途。由于GDP-岩藻糖是岩藻糖基化寡糖(例如岩藻糖基乳糖、岩藻糖基乳糖N二糖和Lewis X寡糖)或岩藻糖基化蛋白的前体，且因为这些糖具有治疗性、营养性、抗炎性和益生作用，本发明特别地涉及如上所述的对于岩藻糖基寡糖合成的用途。换言之，本发明涉及用于合成包含遗传改变的转录调节因子需氧呼吸调控蛋白ArcA和异柠檬酸裂合酶调节因子IclR以上调可拉酸操纵子的至少一种基因的可拉酸和/或岩藻糖基寡糖的方法，其中所述操纵子包含基因cpsG、cpsB、gmd和fcl或基因cpsG、cpsB、gmd、fcl和wza。更特别地，本发明涉及所描述的方法，其中ArcA和IclR的突变与至少一种提高岩藻糖基化化合物产生之突变组合应用。为了高效地产生岩藻糖基化寡糖(参见图1、2和5至10)，可与其他进一步提高岩藻糖基化化合物产生的突变组合应用在arcA和iclR中的上述突变。这些中的一些非限制性突变为：a)wcaJ从可拉酸操纵子缺失，阻止可拉酸生物合成的起始并因此允许GDP-岩藻糖的积累；b)岩藻糖基转移酶的引入以将岩藻糖与不同的接纳体(acceptor)分子(例如乳糖)连接；c)为了GDP-岩藻糖生物合成途径前体的积累且除了wcaJ的缺失，敲除以下不编码GDP-岩藻糖生物合成的可拉酸操纵子基因中的至少一个：gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaJ、wcaK、wcaL、wzx、wza、wzb、wzc和/或wcaM；d)对于岩藻糖基乳糖的产生，敲除编码β-半乳糖苷酶的lacZ以避免乳糖降解；e)为积累前体果糖和果糖-6-磷酸，引入蔗糖磷酸化酶或转化酶；f)因为果糖-6-磷酸在糖酵解中易于降解，所以必须干扰糖酵解以引导所有的果糖-6-磷酸向GDP-岩藻糖的方向，因此敲除基因pgi、pfkA和pfkB(编码葡萄糖-6-磷酸异构酶以及磷酸果糖激酶A和B)；g)通过敲除由基因(例如lon)编码的蛋白酶降低蛋白质降解；h)通过组成性表达乳糖通透酶，在产生方法中避免亚群(subpopulation)，这在乳糖诱导的基因表达系统中是普遍的(19)。换言之，本发明涉及上述的用于岩藻糖基化寡糖合成的方法，其中所述至少一种提高岩藻糖基化化合物产生的突变为：wcaJ基因的缺失，和/或敲除可拉酸操纵子基因gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaJ、wcaK、wcaL、wzx、wza、wzb、wzc和/或wcaM，和/或敲除lacZ，和/或引入蔗糖磷酸化酶或转化酶，和/或敲除基因pgi、pfkA和pfkB，和/或敲除基因lon，和/或引入岩藻糖基转移酶和/或乳糖通透酶。术语“引入岩藻糖基转移酶”涉及上调或异源表达岩藻糖基转移酶，其处于但不限于酶类EC2.4.1.65、2.4.1.68、2.4.1.69、2.4.1.152、2.4.1.214和/或2.4.1.221，和/或糖基转移酶家族GT1、GT2、GT10GT11、GT23、GT37、GT65、GT68和/或GT74，和/或起源于但不限于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)、盘基网柄菌(Dictyostellium discoideum)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)...中的酶，且这些岩藻糖基转移酶催化α(1，2)、α(1，3)、α(1，4)或α(1，6)键在其他糖上的形成，例如但不限于半乳糖、乳糖、乳糖N二糖、乳糖N四糖、乳糖胺、乳糖N四糖、唾液酰乳糖(sialyllactose)、二唾液酰乳糖(disialyllactose)、或岩藻糖基化蛋白、或岩藻糖基化脂肪酸，或者岩藻糖基化糖苷配基，例如但不限于抗病毒剂、抗生素、...。
本发明提供了突变和/或转化的微生物用于上调可拉酸操纵子的至少一种基因的用途，所述微生物包含导致转录调节因子需氧呼吸调控蛋白ArcA和异柠檬酸裂合酶调节因子IclR的修饰表达和/或活性的遗传改变，其中所述操纵子包含编码磷酸甘露糖变位酶和甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶的基因cpsG和cpsB，其是GDP-甘露糖的生物合成所需要的。由于GDP-甘露糖是甘露糖基化寡糖和甘露糖基复合糖的前体。这些寡糖和复合糖可例如用于治疗革兰氏阴性细菌感染，此外，GDP-甘露糖对于蛋白质糖基化的人源化是重要的，其对于某些治疗性蛋白质的产生是必不可少的(18、30)。甘露糖基化寡糖和甘露糖基化复合糖(glycoconjugate)还用于药物靶向，例如，甘露糖基化抗病毒剂可特定地靶向肝和肾(7)。为了有效地产生甘露糖基化寡糖(参见图1、2、5、6和11)，可与其他进一步提高甘露糖基化化合物产生的突变组合应用在arcA和iclR中的上述突变。这些中的一些非限制性其他突变为：a)可拉酸操纵子的基因gmd缺失，和/或，b)其中编码GDP-甘露糖水解酶的基因gmm缺失，和/或c)其中以下不编码GDP-甘露糖生物合成反应的可拉酸操纵子基因缺失：基因gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaJ、wcaK、wcaL、fcl、gmd、wzx、wza、wzb和/或wcaM，和/或d)其中引入编码蔗糖磷酸化酶或转化酶的基因，和/或e)其中分别编码磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶A和磷酸果糖激酶B的基因pgi、pfkA和pfkB缺失，和/或f)敲除编码蛋白酶的基因lon，和/或f)其中引入编码甘露糖基转移酶的基因。换言之，本发明涉及上述的用于合成可拉酸和/或GDP-岩藻糖和/或岩藻糖基化寡糖、用于合成GDP-甘露糖和/或用于合成甘露糖基化寡糖的方法。本发明还涉及其中可拉酸操纵子的基因cpsG和cpsB被上调的所述方法，并且其中：a)可拉酸操纵子的基因gmd缺失，和/或b)其中基因gmm缺失，和/或c)其中敲除以下可拉酸操纵子基因：fcl、gmd、gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaJ、wcaK、wcaL、wzx、wza、wzb、wzc和/或wcaM，和/或d)其中引入编码蔗糖磷酸化酶或转化酶的基因，和/或e)其中基因pgi、pfkA和pfkB缺失，和/或f)敲除基因lon，和/或g)其中引入编码甘露糖基转移酶的基因。术语“引入甘露糖基转移酶”涉及上调或异源表达甘露糖基转移酶，其处于但不限于酶类EC2.4.1.32、2.4.1.B27、2.4.1.B44、2.4.1.48、2.4.1.54、2.4.1.57、2.4.1.83、2.4.1.109、2.4.1.110、2.4.1.119、2.4.1.130、2.4.1.131、2.4.1.132、2.4.1.142、2.4.1.199、2.4.1.217、2.4.1.232、2.4.1.246、2.4.1.251、2.4.1.252、2.4.1.257、2.4.1.258、2.4.1.259、2.4.1.260、2.4.1.265和/或2.4.1.270，和/或糖基转移酶家族GT1、GT2、GT4、GT15、GT22、GT32、GT33、GT39、GT50和/或GT58，和/或起源于但不限于幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、盘基网柄菌、小鼠、人...中的酶，并且这些甘露糖基转移酶催化α(1，2)、α(1，3)、α(1，4)或α(1，6)键在其他糖上的形成，例如但不限于半乳糖、N-乙酰葡糖胺、鼠李糖、乳糖、乳糖N二糖、乳糖N四糖、乳糖胺、乳糖N四糖、唾液酸乳糖、二唾液酸乳糖、或甘露糖基化蛋白、或甘露糖基化脂肪酸，或者甘露糖基化糖苷配基，例如但不限于抗病毒剂、抗生素...。
术语“异源表达”涉及非自然存在于产生宿主中之基因的表达，可以添加化学合成或从其自然宿主通过PCR选取的基因、可为对于产生宿主进行密码子优化或可在其中添加点突变以增强酶活性或表达。表达异源和/或天然基因可在染色体、人工染色体或质粒上完成，且可通过可诱导的组成型天然或人工启动子控制转录，且可通过天然或人工核糖体结合位点控制翻译。
因此，本发明还涉及突变和/或转化的生物体，其中敲除与编码磷酸葡萄糖异构酶和磷酸果糖激酶的基因组合的如上所述的调节因子ArcA和IclR，或者使得功能降低。更特别地，本发明涉及后一生物体，其中基因pgi编码酶磷酸葡萄糖异构酶并且其中酶果糖磷酸激酶由基因pfkA和/或pfkB编码。
术语“使得基因功能降低或无功能”指技术人员公知的技术，例如使用siRNA、RNAi、miRNA、asRNA、突变基因、敲除基因、转座子诱变等，其用来改变基因，以这种方式它们低能(即与功能性野生型基因相比统计学上显著的“低能”)或完全不能(例如敲除基因)产生功能性最终产物。因此，术语“(基因)敲除”指使基因无功能。术语“缺失的基因”或“基因缺失”也指使基因无功能。
本发明还涉及如后面段所述的突变和/或转化的生物体，其中所述生物体还用编码蔗糖磷酸化酶的基因转化。
本发明还涉及如上所述的突变和/或转化的生物体，此外其中使得编码乳糖通透酶之基因的活性和/或表达成为组成型和/或提高。所述活性可通过过表达所述基因和/或通过用编码乳糖通透酶的基因转化所述生物体来提高。
本发明还涉及如上所述的任何突变和/或转化的生物体，其中敲除以下基因中的至少一种或使其功能降低：
编码β-半乳糖苷酶的基因、编码葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶的基因、编码葡萄糖-1-磷酸酶的基因、编码磷酸葡糖酸脱水酶的基因、编码2-酮基-3-脱氧葡糖酸-6-磷酸醛缩酶的基因、编码葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的基因、编码UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的基因、编码UDP-葡萄糖：半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的基因、编码UDP-吡喃半乳糖变位酶的基因、编码UDP-半乳糖：(葡糖基)脂多糖-1，6-半乳糖基转移酶的基因、编码UDP-半乳糖基转移酶的基因、编码UDP-葡糖基转移酶的基因、编码UDP-葡糖醛酸转移酶的基因、编码UDP-葡萄糖脂质载体转移酶的基因、编码GDP-甘露糖水解酶的基因、编码UDP-糖水解酶的基因、编码甘露糖-6-磷酸异构酶的基因、编码UDP-N-乙酰葡糖胺烯酰基丙酮酰基转移酶的基因、编码UDP-N-乙酰葡糖胺乙酰转移酶的基因、编码UDP-N乙酰葡糖胺-2-差向异构酶的基因、编码十一异戊烯基(undecaprenyl)-磷酸-α-N-乙酰葡糖胺基转移酶的基因、编码葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶的基因和/或编码L-谷氨酰胺：D-果糖-6-磷酸氨基转移酶的基因、编码甘露糖-6-磷酸异构酶的基因、编码山梨醇-6-磷酸脱氢酶的基因、编码甘露醇-1-磷酸5-脱氢酶的基因、编码阿洛酮糖-6-磷酸3-差向异构酶的基因、编码转化酶的基因、编码麦芽糖酶的基因、编码海藻糖酶的基因、编码糖转运磷酸转移酶的基因(gene encoding for a sugar transporting phosphotransferase)、编码蛋白酶的基因或编码己糖激酶的基因。术语“至少一个”表示至少1个，也可2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或全部33种基因被敲除或使其功能降低。
本发明还涉及突变和/或转化的微生物(例如大肠杆菌菌株)用于上调以下酸抗性相关基因中至少一种的用途：ydeP、ydeO、hdeA、hdeD、gadB、gadC、gadE、gadX、gadW和/或slp，所述微生物包含导致转录调节因子需氧呼吸调控蛋白ArcA和异柠檬酸裂合酶调节因子IclR之修饰表达的遗传改变(17、22)。这些基因通常在静止期情况下表达；然而，本发明之突变和/或转化的微生物能够增强这些酸抗性相关基因在指数生长期中的表达。因此，本发明涉及如上所述用于合成酸或pH敏感分子(例如但不限于pH敏感的且应当在低pH下产生的葡糖胺)的用途(12)。有机酸(例如但不限于丙酮酸、琥珀酸、己二酸、唾液酸、唾液酸化寡糖(例如唾液酰乳糖、唾液酰Lewis X糖...)、乙酰化寡糖(壳多糖(chitin)、壳聚糖(chitosan)...)、磺酰化寡糖(类肝素(heparan)和肝素前体(heparosan))...)为了下游处理的目的而优选地在低pH下产生(4)。换言之，本发明涉及用于合成酸、唾液酸、唾液酸化寡糖或葡糖胺的方法，其包括遗传改变转录调节因子需氧呼吸调控蛋白ArcA和异柠檬酸裂合酶调节因子IclR以上调以下酸抗性相关基因中的至少一种：ydeP、ydeO、hdeA、hdeD、gadB、gadC、gadE、gadX、gadW和/或slp。
本发明现将通过以下非限制性实施例来举例说明。
实施例
本发明之微生物的高通量RT-qPCR筛选已经用Biotrove技术建立。在该实验中，在4种菌株(野生型、ΔarcA、ΔiclR、ΔarcAΔiclR)中于两个条件下(恒化器和分批)测量1800种基因的转录。所述数据使用R(25、34)中的曲线拟合工具箱处理并分位数标准化(Quantile Normalization)，使用贝叶斯统计(Bayesian statistics)计算数据的误差(20、21、31)。
材料和方法
菌株和质粒
从荷兰细菌培养物保藏中心(Netherlands Culture Collection ofBacteria，NCCB)获得大肠杆菌MG1655[-，F-，rph-1]。从Novagen获得大肠杆菌BL21(DE3)。在遗传和微生物学实验室(Laboratory of Geneticsand Microbiology，MICR)使用Datsenko和Wanner的方法(9)构建大肠杆菌MG1655ackA-pta、poxB、Pppc ppc-p37(10)、单独敲除大肠杆菌MG1655arcA和大肠杆菌MG1655iclR以及双敲除大肠杆菌MG1655arcA、iclR。
培养基
Luria Broth(LB)培养基由1％胰化蛋白胨蛋白胨(Difco，Erembodegem，比利时)、0.5％酵母提取物(Difco)和0.5％氯化钠(VWR，Leuven，比利时)组成。摇瓶培养基包含2g/lNH4Cl、5g/l(NH4)2SO4、2.993g/l KH2PO4、7.315g/l K2HPO4、8.372g/l MOPS、0.5g/l NaCl、0.5g/lMgSO4·7H2O、16.5g/l葡萄糖·H2O、1ml/l维生素溶液、100μl/l钼酸盐溶液和1ml/l硒溶液。用1M KOH将培养基设置到pH7。
维生素溶液由3.6g/lFeCl2·4H2O、5g/lCaCl2·2H2O、1.3g/lMnCl2·2H2O、0.38g/l CuCl2·2H2O、0.5g/lCoCl2·6H2O、0.94g/lZnCl2、0.0311g/l H3BO4、0.4g/l Na2EDTA·2H2O和1.01g/l硫胺·HCl组成。钼酸盐溶液含有0.967g/l Na2MoO4·2H2O。硒溶液含有42g/l SeO2。
用于发酵的最低限度培养基含有6.75g/l NH4Cl、1.25g/l(NH4)2SO4、1.15g/l KH2PO4、0.5g/l NaCl、0.5g/l MgSO4·7H2O、16.5g/l葡萄糖·H2O，与上述组成相同的1ml/l维生素溶液、100μl/l钼酸盐溶液和1ml/l硒溶液。
培养条件
将来自LB板上单菌落的在5ml LB培养基中的预培养物在轨道摇床上以200rpm在37℃孵育8小时。从所述培养物，将2ml转移至在500ml摇瓶中的100ml最低限度培养基中，并且在定轨摇床上以200rpm在37℃孵育16小时。在2I Biostat B Plus培养容器(Sartorius StedimBiotech，Melsungen，德国)中以1.5l工作体积使用4％接种物。培养条件为：37℃，以800rpm搅拌，1.5l/分钟的气体流速。通过喷射空气保持有氧条件，通过用3％CO2和97％N2的混合物冲刷所述培养基来获得厌氧条件。用0.5M H2SO4和4M KOH将pH保持在7。通过排气冷却器(Frigomix1000，Sartorius Stedim Biotech，Melsungen，德国)将排出的气体冷却至4℃。在发酵期间当泡沫产生时添加10％硅酮消泡剂(BDH331512K，VWR Int Ltd.，Poole，英格兰)的溶液(大约10μl)。用EL3020废气分析仪(ABB Automation GmbH，60488Frankfurt am Main，德国)测量废气。
用Sartorius MFCS/win v3.0系统(Sartorius Stedim Biotech，Melsungen，德国)记录所有数据。
将所有菌株培养至少两尢并且给出的关于产率和速率的标准偏差是基于在重复的实验期间采集的至少10个数据点。
取样方法
生物反应器在其内部包含收集管(harvest pipe)(BD Spinal Needle，1.2×152mm(BDMedical Systems，Franklin Lakes，NJ一美国)，所述收集管与反应器端口相连，向外连接到Masterflex-14管道(Cole-Parmer，Antwerpen，比利时)，之后是带有隔膜用于取样的收集端口。所述收集端口的另一侧通过Masterflex-16管道向回连接到反应容器。所述系统被称为快速取样环。在取样期间，反应器培养液环绕地泵入所述取样环。估计以150ml/分钟的流速，反应器培养液需要0.04秒以到达收集端口并且需要3.2秒以再进入反应器。在50％的pO2水平下，在37℃的液体中有大约3mg/l的氧。pO2水平应当从不低于20％以避免微有氧条件。因此在通过收集环的运输期间可能消耗1.8mg/l的氧。推定0.4g氧/g生物质/小时的氧摄取速率(oxygen uptake rate)(在μmax处发现的最大氧摄取速率)，这产生5g/l生物质、2g/l/小时或0.56mg/l/秒的氧摄取速率，其乘以3.2秒(在环中的滞留时间)得到1.8mg/l氧消耗。
为了在取样期间使细胞的代谢猝灭，通过收集端口将反应器培养液吸入用在-20℃预冷的62g不锈钢珠填充的注射器中，以将5ml培养液立即冷却至4℃。取样之后立即进行冷离心(15000g，5分钟，4℃)。在分批实验期间，使用快速取样环以及冷不锈珠取样方法采集样品以用于OD600nm和RT-qPCR测量。
RT-qPCR
用RNeasy试剂盒(Qiagen，Venlo，荷兰)提取mRNA。用nanodropND-1000分光光度计(Nanodrop technologies，Wilmingto，美国)检查RNA的质量和数量。260：280(nm)与260：230(nm)的比值在1.8至2之间，且需要至少100ng/μl进行进一步分析。用RevertAidTM H minus第一链cDNA合成试剂盒(Fermentas，St.Leon-Rot，德国)使用随机引物合成cDNA。最后，用Biotrove OpenArray实时PCR平台测量1800种基因的基因表达。用来自引物数据库(23)的引物设计工具来设计RT-PCR测定的引物。
反应混合物如Biotrove OpenArrayTM实时qPCR系统用户手册所描述的构成。简言之，用26.4μlDNA MasterGreen I(Roche applied Science)、1.1μl SYBR GREEN I(100×储备溶液，SigmaS9430)、8.8μl甘油(Sigma G5150)、5.3μlF68(10％原液，Invitrogen)、2.64μl BSA(Sigma A7906)、26.4μl氯化镁(25mM储备溶液，在Roche applied Science的试剂盒中提供)、21.1μlHiDiTM甲酰胺(Applied biosystems)和94.66μl RNA酶无菌水制成mastermix，产生186.4μl matermix，其足够加样1次OpenArrayTM。对于1次SubArray(将每一个OpenAppay细分为48个SubArray，其上可加样1份样品)，将1.5μl样品(浓度为100ng/μl)与3.5μl的matermind混合作为无模板对照，使用水作为空白。将样品-mastermix混合物在无RNA酶的罩下加样在加样板(Loader plate)(MatriPlateTM384孔黑色低容量聚丙烯板，Biotrove)中。全加样板用AutoLoader(Biotrove)和加样枪头(Loader tip)加至OpenArray上。然后在OpenArrayTM实时qPCR箱中，这些OpenArray淹没在OpenArrayTM浸液中。用箱密封胶密封所述箱并在箱密封站中孵育，其用UV灯聚合胶。
分析方法
通过测量600nm下的光密度(Uvikom922分光光度计，BRS，Brussel，比利时)频繁地监测培养物的细胞密度。通过离心在预干燥和称重的falcon中的20g反应器培养液(15分钟，5000g，GSA转子，Sorvall RC-5B，Goffin Meyvis，Kapellen，比利时)获得细胞干重。随后将沉淀用20ml生理溶液(9g/lNaCl)洗涤一次，并在70℃干燥至恒重。为了能够将OD600nm测量值转化为生物质浓度，制作OD600nm对生物质浓度的相关曲线。通过以下方式确定葡萄糖和有机酸的浓度：在Varian Prostar HPLC系统(Varian，Sint-Kateliine-Waver，比利时)上，使用于65℃被加热并配备有1cm前置柱的Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad，Eke，比利时)，使用5mM H2SO4(0.6ml/分钟)作为流动相。将双波长UV--VIS(210nm和265nm)检测器(Varian Prostar325)和示差折光率检测器(MerckLaChrom L-7490，Merck，Leuven，比利时)用于峰检测。通过区分在265和210nm处的峰的吸收，可以对峰进行鉴定。所述区分产生对于特定化合物典型的恒定值(Beer-Lambert的公式)。
通过HPLC用Hypercarb柱测量并用MSMS检测器检测葡萄糖、果糖、蔗糖、岩藻糖基乳糖和葡萄糖-1-磷酸(Antonio等，2007；Nielsen等，2006)。
遗传方法
所有突变菌株都通过下面描述的方法构建。
在宿主大肠杆菌DH5α(F-、Δ(lacZYA-argF)U169、deoR、recA1、endA1、hsdR17(rk-，mk+)、phoA、supE44、λ-、thi-1、gyrA96、relA1)中维持质粒。
质粒。使用pKD46(Red辅助质粒，氨苄青霉素抗性)、pKD3(含侧翼有FRT的(FRT-flanked)氯霉素抗性(cat)基因)、pKD4(含侧翼有FRT的卡那霉素抗性(kan)基因)和pCP20(表达FLP重组酶活性)质粒用于突变体构建。将质粒pBluescript(Fermentas，St.Leon-Rot，德国)用来构建具有启动子文库或者具有带有点突变之等位基因的pKD3和pKD4的衍生物。
突变。突变存在于基因破坏(敲除，KO)中。使用Datsenko和Wanner的概念(9)将其引入。用于突变策略的引物在表1中描述。
在30℃，使载有Red辅助质粒的转化体在含氨苄青霉素(100mg/l)和L-阿拉伯糖(10mM)的10ml LB培养基中生长至OD600nm为0.6。通过第一次用50ml冰冷的水以及第二次用1ml冰冷的水清洗它们，使细胞处于电感受态(electrocompetent)。然后，将细胞重悬于50μl冰冷的水中。通过使用Gene PulserTM(BioRad)(600Ω，25μFD和250伏)，使用50μl的细胞和10-100ng的线性双链DNA产物进行电穿孔。
在电穿孔后，将细胞添加至1ml LB培养基中，在37C温育1小时，并且最后涂抹在LB-琼脂上，所述LB-琼脂含有25mg/l的氯霉素或50mg/l的卡那霉素以选择抗生素抗性转化体。通过PCR使用在修饰区域上游和下游的引物检验所选择的突变体，并使其在42℃下生长在LB-琼脂中以丧失辅助质粒。测试突变体的氨苄青霉素敏感性。
线性双链DNA。通过PCR使用pKD3、pKD4及其衍生物作为模板获得线性ds-DNA扩增子。使用的引物具有与模板互补的序列的一部分和与在发生重组之染色体DNA侧互补的另一部分(表1)。对于KO，同源区域为设计的目标基因起始和终止密码子的50nt上游和50nt下游。对于KI，必须考虑转录起始点(+1)。PCR产物以PCR纯化、用Dpnl消化、从琼脂糖凝胶再纯化并在洗脱缓冲液(5mM Tris，pH8.0)中悬浮。
抗生素抗性基因的消除。用pCP20质粒转化所选择的突变体(具有氯霉素或卡那霉素抗性)，所述pCP20质粒是具有氨苄青霉素或氯霉素抗性的质粒，其显示温度敏感性复制和FLP合成的热诱导。在30℃下选择具有氨苄青霉素抗性的转化体，其后一些在LB中于42℃下进行菌落纯化并且然后检验所有抗生素抗性和FLP辅助质粒的丧失。用对照引物校验基因敲除和敲入(Fw/Rv-基因敲除)。在表1中给出这些引物。
表1：用来创造大肠杆菌MG1655arcA、大肠杆菌MG1655iclR和双敲除 的大肠杆菌MG1655arcA、iclR以及所有其他基因的敲除和敲入的引物
转化。使用Hanahan(16)的简化程序或者通过上述的电穿孔将质粒转化入CaCl2感受态细胞。
计算方法
说明
进行了用不同菌株的不同实验。在8种不同的条件下进行检验。遗传背景(WT、iclR敲除、arcA敲除和组合的iclR-arcA敲除)和发酵模式(分批和恒化器)有变化。每个实验重复两次。
当通过BioTrove设备跑样时，对每个样品获得qPCR曲线(荧光与循环数呈函数)和熔点曲线(melt curve)(荧光与温度呈函数)。从BioTrove软件输出那些数据并在R中进一步分析。所述分析分为两个步骤：首先拟合qPCR曲线并计算Ct值，且在第二步中将Ct值转换为表达数据。
计算qPCR曲线
从BioTrove软件提取原始qPCR曲线数据并输入R(1)。用R包qPCR将曲线拟合为5参数S形曲线模型(sigmoidal model)(25、34)。将这些曲线二次导数的最大值用作Ct值。在曲线拟合前不对这些数据进行标准化。然而，除去离群值。使用以下程序进行离群值的检测：
■将模型相对于数据进行拟合。
■计算余差(residual)(定义为测量的荧光减去模型计算的荧光)。
■假设余差为正态分布的，计算余差的平均值和标准偏差。
■使用所述平均值和标准偏差计算95％的区间。
■认为所有在所述95％区间外的余差数据点为离群值。
■无离群值下再拟合曲线。
■重复该程序直至不再检测到离群值。使用该程序，在拟合前不一定
要标准化，也不一定必须移除第一数据点。
需要拟合许多曲线(1次实验1800个基因)。因此，手工检查每条曲线是不可行的，且不得不应用自动化方法来拒绝坏的曲线。对于以下提取自曲线的不同参数：一次导数最大值出现时的循环数值(D1)、二次导数最大值出现时的循环数值(D2)、最小荧光(Fmin)和最大荧光(Fmax)。将这些参数的值组合，评估曲线的可靠性和表达的程度。在接下来的部分中解释如何进行评估。
过滤数据
对于一些基因实验的组合，未检测到扩增。这可能是由于以下的多种原因：
■表达太低且32个循环(对于所有BioTrove测定的循环数都设定为32)不足以检测表达。在此情况下，不能确定实际Ct且不确定地在32至无穷大之间。
■无表达。在此情况下，实际Ct为无穷大。
■技术故障：引物不合适，错误加载(非常困难地均匀加载BioTrove测定，特别在测定侧的孔经常是空的)等。在此情况下，实际Ct可在0至无穷大之间变化。
一些基因确实不表达且将它们的Ct值设定成不为无穷大的值是不正确的。对于表达的基因，但是其表达值由于技术障碍或限制而未知的，设定Ct值为无穷大是不正确的。此外，使用表达范围外的任意值使得计算例程(routine)和可视化例程复杂。因此，选择移除未检测到正确表达数据的基因实验组合。
对于未检测到表达之基因实验对的一个明显情况是对于其没有曲线可以对qPCR数据进行拟合。不太明显的情况在下面详述。
通常对于表达的基因，为荧光值覆盖一定范围。放弃对于所述范围不够高的数据点，因为它们表明非常不佳的拟合曲线和通常坏的数据。将最小荧光范围设定为400(因此Fmax-Fmin＞400)。
在良好的扩增曲线中，一次(D1)和二次(D2)导数很相近(参见在qpcR包中SOD函数的文件(25))。因此，放弃对于其D1和D2间差异大于任意值(使用7)的所有数据点。
对于每个引物对，在无DNA添加下进行qPCR实验。仅添加水。通常在那些样品中不应当观察到表达。然而，对于一些引物对在水中检测到扩增。放弃对于其Ct值(如之前所提到的，使用D2)大于水Ct值减5的基因，因为其不能排除荧光来自引物而非添加的DNA的扩增。
标准化和计算对比
在计算表达差异前，必须标准化Ct值。因为测量了如此多的基因(1800个)，可使用分位数标准化(33)。将测量的1800个基因分为阵列的3种类型，每种含有600个基因。分别对每种类型的阵列进行分位数标准化。构建了表，其中行代表不同的基因，并且列代表不同的实验(T1，参见等式1)。每一列独自分类(T2)并保存要素的原始位置。用不同行的平均值替换此新表中的值(T3)。并且最终将此表变换以使得所述值的位置对应原始位置(T4)。
T 1 = 2 4 6 8 4 12 T 2 = 2 4 6 8 4 12 T 3 = 3 3 6 6 9 9 T 4 = 3 3 6 6 9 9
等式1：分位数标准化的实例
用经标准化的数据计算差异表达。所述方法用R包limma进行，其使用贝叶斯方法(Bayesian approach)来计算差异的统计相关性(31、32)。Limma适合于能够处理缺失数据：当在一次实验中的一个数据不可得时，原始limma包放弃了来自不同实验中基因的所有表达值。这妨碍了当一个基因有许多不同条件时的分析，因为对于在实验条件之一下未产生表达值的每个基因，必须产生忽略该实验条件的不同对比矩阵(contrastmatrix)。因此，所述拟合对比的函数适合于丢弃缺失数据的数据点。
对于特定基因在Ct值和平均Ct值间计算差异表达。因此，值越高，表达越低。对于每个基因，产生图来示出那些差异。然而，在那些图中，Ct值是反转的，因此值越高，表达越高。
实施例1：arcA和iclR基因缺失对可拉酸生物合成之基因表达的影响
图1和2示出参与可拉酸生物合成之基因的表达模式(35)。单独arcA或iclR敲除突变在分批和恒化器条件下与野生型菌株相比不影响操作子的表达。然而，在恒化器和分批两个条件下，与野生型和单独突变菌株相比双突变菌株ΔarcAΔiclR都上调可拉酸操纵子的基因6至8倍。因此，这两个调节因子独立于应用的培养条件具有对所述操纵子表达出人意料的合作效应。查看所述操纵子的调控网络，未发现ArcA和IclR二者与控制操纵子的转录因子RcsA之间有直接联系(图5)。只有ArcA经由3个其他转录因子与RcsA连接，其也都被上调。然而，ΔarcA单个基因缺失突变体不影响操纵子的转录。
实施例2：arcA和iclR基因缺失对可拉酸生物合成基因的基因表达的影响
图4和6示出GDP-岩藻糖生物合成与可拉酸操纵子的关系。在图6中示出了GDP-岩藻糖生物合成特异基因的上调。因此，这些突变提高了GDP-岩藻糖的生物合成，其是岩藻糖基化寡糖(例如岩藻糖基乳糖、岩藻糖基乳糖N二糖和lewis X寡糖)或岩藻糖基化蛋白的前体。如已经在上文指明的这些糖和蛋白质作为营养品、作为人母乳中的组分(在其中它们具有抗炎性和益生作用)在治疗中有应用(5、8、27)。
实施例3：GDP-岩藻糖和岩藻糖基化寡糖生物合成的提高
与其他突变组合应用的突变ΔarcAΔiclR提高了岩藻糖基化化合物的产生。首先，提高所述产生的“其他”遗传修饰为wcaJ从可拉酸操纵子的缺失，阻止了可拉酸生物合成的起始和因此的GDP-岩藻糖的积累。而且，必须引入岩藻糖基转移酶来连接岩藻糖与不同的接纳体分子(例如乳糖)。然后进一步改造代谢以积累GDP-岩藻糖生物合成途径的前体。这些修饰在图7中示出。除了wcaJ，敲除不编码GDP-岩藻糖生物合成反应的可拉酸操纵子基因，例如gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaK、wcaL和/或wcaM。对于岩藻糖基乳糖的产生，敲除编码β-半乳糖苷酶的lacZ以避免乳糖降解，并通过强组成型启动子来增强编码乳糖通透酶之lacY的表达。
实施例4：通过以蔗糖作为底物的分裂代谢提高GDP-岩藻糖和岩藻糖基化寡糖产生
为积累GDP-岩藻糖前体果糖和果糖-6-磷酸，引入蔗糖磷酸化酶或转化酶。因为果糖-6-磷酸在糖酵解中易于降解，所以干扰糖酵解以引导所有的果糖-6-磷酸向GDP-岩藻糖的方向。因此敲除编码葡萄糖-6-磷酸异构酶以及磷酸果糖激酶A和B的基因pgi、pfkA和pfkB。最后引入岩藻糖基转移酶来连接岩藻糖与接纳体分子。
当于蔗糖磷酸化酶(BaSP)(具有序列SEQ ID N°2的质粒)引入后在蔗糖上生长时，野生型菌株的生长率稍微受到影响(表2)，然而pgi突变以及pfkA和pfkB双突变的引入导致生长率的显著降低，后者极低(0.02h-1)。所有突变(Δpgi和ΔpfkA和ΔpfkB)的组合导致最低的生长率，然而，在蔗糖和葡萄糖二者上的生长率出人意料地类似于pgi单独突变体的生长率。
表2：糖酵解敲除菌株在有葡萄糖和蔗糖的最低限度培养基上的特异生长 率
SEQ ID N°2：具有蔗糖磷酸化酶BaSP的质粒序列
AATTCGGAGGAAACAAAGATGGGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGC ATGAAAAACAAGGTGCAGCTCATCACTTACGCCGACCGCCTTGGCGACGGCACCATCAAG TCGATGACCGACATTCTGCGCACCCGCTTCGACGGCGTGTACGACGGCGTTCACATCCTG CCGTTCTTCACCCCGTTCGACGGCGCCGACGCAGGCTTCGACCCGATCGACCACACCAAG GTCGACGAACGTCTCGGCAGCTGGGACGACGTCGCCGAACTCTCCAAGACCCACAACATC ATGGTCGACGCCATCGTCAACCACATGAGTTGGGAATCCAAGCAGTTCCAGGACGTGCTG GCCAAGGGCGAGGAGTCCGAATACTATCCGATGTTCCTCACCATGAGCTCCGTGTTCCCG AACGGCGCCACCGAAGAGGACCTGGCCGGCATCTACCGTCCGCGTCCGGGCCTGCCGTTC ACCCACTACAAGTTCGCCGGCAAGACCCGCCTCGTGTGGGTCAGCTTCACCCCGCAGCAG GTGGACATCGACACCGATTCCGACAAGGGTTGGGAATACCTCATGTCGATTTTCGACCAG ATGGCCGCCTCTCACGTCAGCTACATCCGCCTCGACGCCGTCGGCTATGGCGCCAAGGAA GCCGGCACCAGCTGCTTCATGACCCCGAAGACCTTCAAGCTGATCTCCCGTCTGCGTGAG GAAGGCGTCAAGCGCGGTCTGGAAATCCTCATCGAAGTGCACTCCTACTACAAGAAGCAG GTCGAAATCGCATCCAAGGTGGACCGCGTCTACGACTTCGCCCTGCCTCCGCTGCTGCTG CACGCGCTGAGCACCGGCCACGTCGAGCCCGTCGCCCACTGGACCGACATACGCCCGAAC AACGCCGTCACCGTGCTCGATACGCACGACGGCATCGGCGTGATCGACATCGGCTCCGAC CAGCTCGACCGCTCGCTCAAGGGTCTCGTGCCGGATGAGGACGTGGACAACCTCGTCAAC ACCATCCACGCCAACACCCACGGCGAATCCCAGGCAGCCACTGGCGCCGCCGCATCCAAT CTCGACCTCTACCAGGTCAACAGCACCTACTATTCGGCGCTCGGGTGCAACGACCAGCAC TACATCGCCGCCCGCGCGGTGCAGTTCTTCCTGCCGGGCGTGCCGCAAGTCTACTACGTC GGCGCGCTCGCCGGCAAGAACGACATGGAGCTGCTGCGTAAGACGAATAACGGCCGCGAC ATCAATCGCCATTACTACTCCACCGCGGAAATCGACGAGAACCTCAAGCGTCCGGTCGTC AAGGCCCTGAACGCGCTCGCCAAGTTCCGCAACGAGCTCGACGCGTTCGACGGCACGTTC TCGTACACCACCGATGACGACACGTCCATCAGCTTCACCTGGCGCGGCGAAACCAGCCAG GCCACGCTGACGTTCGAGCCGAAGCGCGGTCTCGGTGTGGACAACGCTACGCCGGTCGCC ATGTTGGAATGGGAGGATTCCGCGGGAGACCACCGTTCGGATGATCTGATCGCCAATCCG CCTGTCGTCGCCTGACTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCAG GCATGCAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAA TCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTC CCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGG TCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAA AGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAA TCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACG CCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTT TGCGTTTCTACAAACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTC ATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATT CAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCT CACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGT TACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGT TTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGAC GCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTAC TCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCT GCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCG AAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGG GAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTACAGCA ATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAA CAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTT CCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATC ATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGG AGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATT AAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTT CATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATC CCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCT TCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTA CCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGC TTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCAC TTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCT GCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGAT AAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACG ACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAA GGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGG GAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGA CTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGC AACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCT GCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCT CGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTG ATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTC AGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTG ACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTT GTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGAGCTCGATATC CCGGGCGGCCGCTTCATTTATAAATTTCTTGACATTTTGGAATAGATGTGATATAATGTG TACATATCCATGGCGGCCGCTCTAGAAGAAGCTTGGGATCCGTCGACCTCG
在图8中示出分裂代谢中GDP-岩藻糖和岩藻糖基化寡糖生物合成的通量改向及突变，二者都是对于表达异源转化酶和蔗糖磷酸化酶之菌株的。除了wcaJ，敲除不编码GDP-岩藻糖生物合成反应的可拉酸操纵子基因，例如gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaK、wcaL和/或wcaM。对于岩藻糖基乳糖的产生，敲除编码β-半乳糖苷酶的lacZ以避免乳糖降解，并通过强组成型启动子来增强编码乳糖通透酶之lacY的表达。
实施例5：通过以葡萄糖作为底物的分裂代谢提高GDP-岩藻糖和岩藻糖基化寡糖产生
当敲除pgi、pfkA和pfkB基因时，以葡萄糖摄取的碳仅可经由戊糖磷酸途径代谢。由于所述途径的生物化学性质，形成了果糖-6-磷酸(图9和10)。为形成生物质，必须生成甘油醛-3-磷酸，其通过大肠杆菌中由tktA和tktB编码的转羟乙醛酶反应形成。所述甘油醛-3-磷酸与果糖-6-磷酸一起由木酮糖-5-磷酸和赤藓糖-5-磷酸形成。后者继而通过由talA和talB编码的转醛酶反应与来自甘油醛-3-磷酸和景天庚酮糖-7-磷酸的果糖-6-磷酸依次一起形成。为了平衡所有这些一起的反应，通量需在木酮糖-5-磷酸和核糖-5-磷酸间分布，因此形成来自1摩尔葡萄糖的2/3摩尔木酮糖-5-磷酸和1/3摩尔核糖-5-磷酸。为驱动这些平衡反应，通过GDP-岩藻糖和岩藻糖基化寡糖生物合成途径将果糖-6-磷酸拉出戊糖磷酸途径。除了wcaJ，敲除不编码GDP-岩藻糖生物合成反应的可拉酸操纵子基因，例如gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaK、wcaL和/或wcaM。对于岩藻糖基乳糖的产生，敲除编码β-半乳糖苷酶的lacZ以避免乳糖降解，并通过强组成型启动子来增强编码乳糖通透酶之lacY的表达。
实施例6：用源自幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶产生发酵性2-岩藻糖基乳糖
将其中敲除lacZ、glgC、agp、pfkA、pfkB、pgi、arcA、iclR、wcaJ基因且lacY通过组成型表达而表达以确保在所有培养条件下表达的突变菌株进一步与源自幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶和源自青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)的蔗糖磷酸化酶转化，其也是组成型表达。组成型启动子源自由De Mey等，2007描述的启动子文库。所述菌株在如材料和方法中所描述的培养基中培养，但用30g/l的蔗糖和50g/l的乳糖。这造成如图13和14所示出的2-岩藻糖基乳糖的形成。
实施例7：用源自盘基网柄菌的岩藻糖基转移酶产生发酵性岩藻糖基乳糖
将其中敲除lacZ、glgC、agp、pfkA、pfkB、pgi、arcA、iclR、wcaJ基因且lacy通过组成型表达而表达以确保在所有培养条件下表达的突变菌株进一步用源自盘基网柄菌的岩藻糖基转移酶和源自青春双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶转化，其也为组成型表达。组成型启动子源自由De Mey等，2007描述的启动子文库。所述菌株在如材料和方法中所描述的培养基中培养，但用30g/l的蔗糖和50g/l的乳糖。这造成如图13和14所示出的2-岩藻糖基乳糖的形成。
实施例8：通过分裂代谢以蔗糖作为底物的GDP-甘露糖和甘露糖基化寡糖产生的提高
为积累GDP-甘露糖前体果糖和果糖-6-磷酸，引入蔗糖磷酸化酶或转化酶。因为果糖-6-磷酸在糖酵解中易于降解，所以干扰糖酵解以引导所有的果糖-6-磷酸向GDP-岩藻糖的方向。因此敲除编码葡萄糖-6-磷酸异构酶以及磷酸果糖激酶A和B的基因pgi、pfkA和pfkB。最后引入甘露糖基转移酶来连接甘露糖与接纳体分子。为避免GDP-甘露糖降解，必须敲除可拉酸操纵子中的gmm和gmd基因。此外，敲除不编码GDP-甘露糖生物合成反应的基因，例如wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaJ、wcaK、wcaL和/或wcaM。
实施例9：酸抗性相关基因的上调
类似于可拉酸操纵子上调，相比于野生型菌株和单个突变菌株，酸抗性相关基因也在ΔarcAΔiclR双突变菌株中上调。这些基因使得菌株对于低pH更有抗性，这对于酸的产生(4)或葡糖胺的产生(12)是有益的，其在中性和高pH下是不稳定的。图12呈现了这些酸抗性相关基因的基因表达模式并标明在所述双突变菌株中高达8倍的表达上升。
实施例10：2-岩藻糖基乳糖的进料分批产生
通过上述的遗传改造方法构建突变菌株，其具有以下的基因型：
ΔlacZYΔ::P22-lac YΔglgCΔagpΔpgiΔpfkΔ-P22-
baSPΔpfkBΔarcAΔiclR::slΔwcaJΔlonΔadhE-P14-frk+pCXP14-FT_幽门螺杆菌(具有序列SEQ ID N°1的载体)。启动子P22和P14源自由De Mey等(11)构建的启动子文库，并以类似于由Aerts等(2)描述的方法克隆。“：：sl”标记了无痕基因缺失(scarless gene deletion)，因此没有保持在染色体中的FRT位点。
所述菌株在上文材料和方法中所述的生物反应器中于有30g/l蔗糖和50g/l乳糖的矿物培养基中培养。在分批阶段后，用500g/l的蔗糖、50g/l乳糖和1g/l七水硫酸镁对所述生物反应器进料。这导致在上清液中27.5g/l岩藻糖基乳糖的积累。
SEQ ID N°1：pCXP14-FT_幽门螺杆菌
CGCGTTGGATGCAGGCATGCAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCC TGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCA GTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCG ATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGA AAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTC CTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGG TGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTG ACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAA ATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGA AGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCC TTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGG GTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTC GCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTAT TATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATG ACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAG AATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAA CGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTC GCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCA CGATGCCTACAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTC TAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTC TGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTG GGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTA TCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAG GTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGA TTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATC TCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAA AGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAA AAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTC CGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGT AGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCC TGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGAC GATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCA GCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCG CCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAG GAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGT TTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTAT GGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTC ACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGT GAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAG CGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCA TATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCC GCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGC GCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGG GAGAGCTCGATATCCCGGGCGGCCGCCTTCATTCTATAAGTTTCTTGACATCTTGGCCGG CATATGGTATAATAGGGAAATTTCCATGGCGGCCGCTCTAGAAGAAGCTTGGGATCCGTC GACCTCGAATTCGGAGGAAACAAAGATGGCCTTTAAAGTTGTTCAGATTTGTGGTGGTCT GGGCAATCAGATGTTTCAGTATGCATTTGCAAAAAGCCTGCAGAAACATAGCAATACACC GGTTCTGCTGGATATTACCAGCTTTGATTGGAGCAATCGTAAAATGCAGCTGGAACTGTT TCCGATTGATCTGCCGTATGCAAGCGAAAAAGAAATTGCAATTGCCAAAATGCAGCATCT GCCGAAACTGGTTCGTAATGTTCTGAAATGCATGGGTTTTGATCGTGTGAGCCAAGAAAT CGTGTTTGAATATGAACCGAAACTGCTGAAAACCAGCCGTCTGACCTATTTTTATGGCTA TTTTCAGGATCCGCGTTATTTTGATGCAATTAGTCCGCTGATCAAACAGACCTTTACCCT GCCTCCGCCTCCGGAAAATGGTAATAACAAAAAAAAAGAAGAAGAGTATCATCGTAAACT GGCACTGATTCTGGCAGCAAAAAATAGCGTGTTTGTGCATATTCGTCGCGGTGATTATGT TGGTATTGGTTGTCAGCTGGGCATCGATTATCAGAAAAAAGCACTGGAATACATGGCAAA ACGTGTTCCGAATATGGAACTGTTTGTGTTTTGCGAGGACCTGGAATTTACCCAGAATCT GGATCTGGGCTATCCGTTTATGGATATGACCACCCGTGATAAAGAGGAAGAGGCATATTG GGATATGCTGCTGATGCAGAGCTGTAAACATGGTATTATTGCCAACAGCACCTATAGTTG GTGGGCAGCATATCTGATTAATAACCCGGAAAAAATCATTATTGGTCCGAAACATTGGCT GTTTGGCCATGAAAACATCCTGTGTAAAGAATGGGTGAAAATCGAAAGCCACTTTGAAGT GAAAAGCCAGAAATATAATGCCTAATAAGAGCTCCCAA
实施例11：用杂合可拉酸启动子的2-岩藻糖基乳糖的进料分批产生
基于来自由De Mey等(11)描述的启动子文库的基因组信息和序列构建杂合可拉酸启动子。
ΔlacZYA::P22-lacYΔglgCΔagpΔpgiΔpfkA::P22-BaSPΔpfkB ΔarcAΔiclR:sl ΔwcaJ ΔlonΔadhE-P14-frkΔldhA::P14-FT_幽门螺杆菌ΔpromCA:P14
所述菌株在上文材料和方法中所述的生物反应器中于有30g/l蔗糖和20g/l乳糖的矿物培养基中培养。在分批阶段后，用500g/l的蔗糖、20g/l乳糖和1g/l七水硫酸镁对所述生物反应器进料。这导致在上清液中26g/l岩藻糖基乳糖的积累，且具有近化学计量转化的乳糖。提高乳糖进料浓度还导致最终岩藻糖基乳糖效价和化学计量乳糖转化的提高。
参考文献：
1.2006.R:A Language and Environment for Statistical Computing.R Foundation forStatistical Computing.R-Development Core Team，Vienna，Austria.
2.Aerts，D.，T.Verhaeghe，M.De Mey，T.Desmet，and W.Soetaert.2010.Aconstitutive expression system for high throughput screening.Engineering in LifeSciences10:DOI:10.1002/elsc.201000065.
3.Alper，H.，C.Fischer，E.Nevoigt，and G.Stephanopoulos.2005.Tuning geneticcontrol through promoter engineering.Proceedings of the national academy ofsciences of the United States of America102:12678-12683.
4.Beauprez，J.2010.Metabolic modelling and engineering of Escherichia coli forsuccinate production.PhD.Ghent University，Ghent.
5.Bode，L.2006.Recent Advances on Structure，Metabolism，and Function ofHuman Milk Oligosaccharides.The Journal of Nutrition136:2127-2130.
6.Canton，B.，A.Labno，and D.Endy.2008.Refinement and standardization ofsynthetic biological parts and devices.Nat Biotech26:787-793.
7.Cavallaro，G.，L.Maniscalco，P.Caliceti，S.Salmaso，A.Semenzato，and G.Giammona.2004.Glycosilated Macromolecular Conjugates of Antiviral Drugs witha Polyaspartamide.Journal of Drug Targeting12:593-605.
8.Coppa，G.V.，L.Zampini，T.Galeazzi，and O.Gabrielli.2006.Prebiotics in humanmilk:a review.Digestive and Liver Disease38:S291-S294.
9.Datsenko，K.A.，and B.L.Wanner.2000.One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proceedings of the nationalacademy of sciences of the United States of America97:6640-6645.
10.De Mey，M.，G.J.Lequeux，J.J.Beauprez，J.Maertens，E.Van Horen，W.K.Soetaert，P.A.Vanrolleghem，and E.J.Vandamme.2007.Comparison of differentstrategies to reduce acetate formation in Escherichia coli.Biotechnology Progress.
11.De Mey，M.，J.Maertens，G.J.Lequeux，W.K.Soetaert，and E.J.Vandamme.2007.Construction and model-based analysis of a promoter library for E.coli:anindispensable tool for metabolic engineering.BMC Biotechnology7:34-48.
12.Deng，M.-D.，D.K.Severson，A.D.Grund，S.L.Wassink，R.P.Burlingame，A.Berry，J.A.Running，C.A.Kunesh，L.Song，T.A.Jerrell，and R.A.Rosson.2005.Metabolic engineering of Escherichia coli for industrial production of glucosamineand N-acetylglucosamine.Metabolic Engineering7:201-214.
13.Ebel，W.，and J.E.Trempy.1999.Escherichia coli RcsA，a Positive Activator ofColanic Acid Capsular Polysaccharide Synthesis，Functions To Activate Its OwnExpression.Journal of bacteriology181:577-584.
14.Foster，J.W.2004.Escherichia coli acid resistance:Tales of an amateuracidophile.Nature Reviews Microbiology2:898-907.
15.Hammer，K.，I.Mijakovic，and P.R.Jensen.2006.Synthetic promoter libraries-tuning of gene expression.TRENDS in Biotechnology24:53-55.
16.Hanahan，D.，J.Jessee，and F.R.Bloom.1991.Plasmid transformation ofEscherichia coli and other bacteria.Methods in Enzymology204:63-113.
17.Hommais，F.，E.Krin，J.-Y.Coppée，C.Lacroix，E.Yeramian，A.Danchin，and P.Bertin.2004.GadE(YhiE):a novel activator involved in the response to acidenvironment in Escherichia coli.Microbiology150:61-72.
18.Jigami，Y.2008.Yeast Glycobiology and Its Application.Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry72:637-648.
19.Keasling，J.D.1999.Gene-expression tools for the metabolic engineering ofbacteria.Trends in Biotechnology17:452-460.
20.Lequeux，G.2008.Metabolic modelling and analysis for the optimization ofEscherichia coli as a production host.Ghent University，Ghent.
21.Lequeux，G.，L.Johansson，J.Maertens，P.Vanrolleghem，and G.Liden.2005.Metabolic flux analysis of C-and P-limited shikimic acid producing E.coli.Journalof Biotechnology118:S121-S121.
22.Masuda，N.，and G.M.Church.2003.Regulatory network of acid resistance genesin Escherichia coli.Molecular Microbiology48:699-712.
23.Pattyn，F.，F.Speleman，A.De Paepe，and J.Vandesompele.2003.RTPrimerDB:The Real-Time PCR primer and probe database.Nucleic Acids Research31:122-123.
24.Perrenoud，A.，and U.Sauer.2005.Impact of global transcriptional regulation byArcA，ArcB，Cra，Crp，Cya，Fnr，and Mlc on glucose catabolism in Escherichia coli.Journal of Bacteriology187:3171-3179.
25.Ritz，C.，and A.-N.Spiess.2008.qpcR:an R package for sigmoidal modelselection in quantitative real-time polymerase chain reaction analysis.Bioinformatics24:1549-1551.
26.Salis，H.M.，E.A.Mirsky，and C.A.Voigt.2009.Automated design of syntheticribosome binding sites to control protein expression.Nat Biotech27:946-950.
27.Seed，B.，and J.Holgersson.1999.Fucosyltransferase genes and uses thereofpatent US5858752.
28.Shalel-Levanon，S.，K.Y.San，and G.N.Bennett.2005.Effect of ArcA and FNRon the expression of genes related to the oxygen regulation and glycolysispathway in Escherichia coli under growth conditions.Biotechnology andBioengineering92:147-159.
29.Shalel-Levanon，S.，K.Y.San，and G.N.Bennett.2005.Effect of oxygen on theEscherichia coli ArcA and FNR regulation systems and metabolic responses.Biotechnology and Bioengineering89:556-564.
30.Smith，S.，A.D.Elbein，and Y.T.Pan.1999.Inhibition of Pathogenic BacterialBinding by High Mannose Oligosaccharides patent US5939279.
31.Smyth，G.K.2005.limma:Linear models for microarray data.，p.397-420.In R.Gentleman，V.Carey，W.Huber，R.A.Irizarry，and S.Dudoit(ed.)，Bioinformaticsand Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor.Springer.
32.Smyth，G.K.2004.Linear Models and Empirical Bayes Methods for AssessingDifferential Expression in Microarray Experiments.Statistical Applications inGenetics and Molecular Biology3:3.
33.Smyth，G.K.，and T.Speed.2003.Normalization of cDNA microarray data.Methods31:265-273.
34.Spiess，A.-N.，C.Feig，and C.Ritz.2008.Highly accurate sigmoidal fitting of real-time PCR data by introducing a parameter for asymmetry.BMC Bioinformatics9:221.
35.Stevenson，G.，K.Andrianopoulos，M.Hobbs，and P.R.Reeves.1996.Organization of the Escherichia coli K-12gene cluster responsible for productionof the extracellular polysaccharide colanic acid.Journal of Bacteriology178:4885-4893.
36.Stout，V.，A.Torres-Cabassa，M.R.Maurizi，D.Gutnick，and S.Gottesman.1991.RcsA，an unstable positive regulator of capsular polysaccharide synthesis.Journalof bacteriology173:1738-1747.
37.Sunnarbor9，A.，D.Klumpp，T.Chung，and D.C.Laporte.1990.Regulation oftheglyoxylate bypass operon:cloning and characterization of IclR.Journal ofBacteriology172:2642-2649.
38.Waegeman，H.J.，J.Beauprez，H.Moens，J.Maertens，M.De Mey，M.R.Foulquie-Moreno，J.J.Heijnen，D.Charlier，and W.Soetaert.2010.Effect of iclRand arcA knockouts on biomass formation and metabolic fluxes in Escherichia coliK12and its implications on understandin9the metabolism of Escherichia coli BL21(DE3).BMC microbiology11:1-17.
39.Waegeman，H.J.，J.Beauprez，H.Moens，J.Maertens，M.De Mey，M.R.Foulquie-Moreno，J.J.Heijnen，D.Charlier，and W.Soetaert.2011.Effect of iclRand arcA knockouts on biomass formation and metabolic fluxes in Escherichia coilK12and its implications on understanding the metabolism of Escherichia coil BL21(DE3).BMC microbiology11:1-17.
40.Warnecke，T.，and R.T.Gill.2005.Organic acid toxicity，tolerance，and productionin Escherichia coli biorefining applications.Microbial Cell Factories4.

Claims (19)

1.突变和/或转化的微生物用于上调可拉酸操纵子的至少一种基因的用途，所述微生物包含导致转录调节因子需氧呼吸调控蛋白ArcA和异柠檬酸裂合酶调节因子IclR之修饰表达的遗传改变，其中所述操纵子包含分别编码磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶、GDP-甘露糖4，6-脱水酶和GDP-岩藻糖合酶的基因cpsG、cpsB、gmd和fcl。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述上调可拉酸操纵子的至少一种基因在上调所述可拉酸操纵子的转录调节因子rcsA之后。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述微生物为大肠杆菌(Escherichia coli)菌株，其中所述大肠杆菌菌株特别地为K12菌株，或其中所述K12菌株更特别地为大肠杆菌MG1655。
4.根据权利要求1至3所述的用途，其中所述遗传改变，是破坏编码ArcA和IclR的基因，是以人工启动子替代编码ArcA和IclR之基因的内源启动子，或者是以人工核糖体结合位点替代内源核糖体结合位点。
5.根据权利要求1至4所述的用途，其中所述修饰表达是降低表达，或者其中所述降低表达特别地是取消表达。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述可拉酸操纵子的至少一种基因与在对应的野生型微生物中可拉酸操纵子的表达相比被上调6至8倍。
7.用于合成可拉酸和/或GDP-岩藻糖和/或岩藻糖基化寡糖的方法，其包括：遗传地改变转录调节因子需氧呼吸调控蛋白ArcA和异柠檬酸裂合酶调节因子IclR以上调可拉酸操纵子的至少一种基因，其中所述操纵子包含基因cpsG、cpsB、gmd和fcl。
8.根据权利要求7所述的方法，其中根据权利要求1所述的突变与至少一种提高岩藻糖基化化合物之产生的突变组合应用。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种提高岩藻糖基化化合物之产生的突变选自：wcaJ基因的缺失；敲除可拉酸操纵子基因gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaJ、wcaK、wcaL、wzx、wza、wzb、wzc和/或wcaM；敲除lacZ；引入蔗糖磷酸化酶或转化酶；敲除基因pgi、pfkA和pfkB；敲除基因lon；引入岩藻糖基转移酶和/或乳糖通透酶；或者其组合。
10.根据权利要求7所述的方法，其用于合成GDP-甘露糖和/或用于合成甘露糖基化寡糖。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述可拉酸操纵子的基因cpsG和cpsB被上调，并且其中
a)所述可拉酸操纵子的基因gmd被缺失，和/或，
b)其中所述基因gmm被缺失，和/或，
c)其中所述可拉酸操纵子基因fcl、gmd、gmm、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaJ、wcaK、wcaL、wzx、wza、wzb、wzc和/或wcaM被敲除，和/或，
d)其中编码蔗糖磷酸化酶或转化酶的基因被引入，和/或，
e)其中所述基因pgi、pfkA和pfkB被缺失，和/或，
f)敲除所述基因lon，和/或
g)其中编码甘露糖基转移酶的基因被引入。
12.突变和/或转化的生物体，其中调节因子ArcA和IclR连同编码酶磷酸葡萄糖异构酶和磷酸果糖激酶的基因被敲除，或者其功能被降低。
13.根据权利要求12所述的突变和/或转化的生物体，其中所述酶磷酸葡萄糖异构酶由基因pgi编码，并且其中所述酶磷酸果糖激酶由基因pfkA和/或pfkB编码。
14.根据权利要求12或13所述的突变和/或转化的生物体，其中所述生物体还以编码蔗糖磷酸化酶或转化酶的基因转化。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的突变和/或转化的生物体，其中编码乳糖通透酶之基因的活性提高。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的突变和/或转化的生物体，其中以下基因的至少一种被敲除或其功能被降低：
编码β-半乳糖苷酶的基因、编码葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶的基因、编码葡萄糖-1-磷酸酶的基因、编码磷酸葡糖酸脱水酶的基因、编码2-酮基-3-脱氧葡糖酸-6-磷酸醛缩酶的基因、编码葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的基因、编码UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的基因、编码UDP-葡萄糖：半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的基因、编码UDP吡喃半乳糖变位酶的基因、编码UDP-半乳糖：(葡糖基)脂多糖-1，6-半乳糖基转移酶的基因、编码UDP-半乳糖基转移酶的基因、编码UDP-葡糖基转移酶的基因、编码UDP-葡糖醛酸转移酶的基因、编码UDP-葡萄糖脂质载体转移酶的基因、编码GDP-甘露糖水解酶的基因、编码UDP-糖水解酶的基因、编码甘露糖-6-磷酸异构酶的基因、编码UDP-N-乙酰葡糖胺烯酰基丙酮酰基转移酶的基因、编码UDP-N乙酰葡糖胺乙酰转移酶的基因、编码UDP-N乙酰葡糖胺-2-差向异构酶的基因、编码十一异戊烯基-磷酸a-N-乙酰葡糖胺基转移酶的基因、编码葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶的基因和/或编码L-谷氨酰胺：D-果糖-6-磷酸氨基转移酶的基因、编码甘露糖-6-磷酸异构酶的基因、编码山梨醇-6-磷酸脱氢酶的基因、编码甘露醇-1-磷酸5-脱氢酶的基因、编码阿洛酮糖-6-磷酸3-差向异构酶的基因、编码转化酶的基因、编码麦芽糖酶的基因、编码海藻糖酶的基因、编码糖转运磷酸转移酶的基因、编码蛋白酶的基因或编码己糖激酶的基因。
17.突变和/或转化的大肠杆菌菌株用于上调以下酸抗性相关基因中至少一种的用途：ydeP、ydeO、hdeA、hdeD、gadB、gadC、gadE、gadX、gadw和/或slp，所述菌株包含导致转录调节因子需氧呼吸调控蛋白ArcA和异柠檬酸裂合酶调节因子IclR之修饰表达的遗传改变。
18.根据权利要求17所述的用途，其用于合成酸、唾液酸、唾液酸化寡糖或葡糖胺。
19.用于合成酸、唾液酸、唾液酸化寡糖或葡糖胺的方法，其包括遗传地改变转录调节因子需氧呼吸调控蛋白ArcA和异柠檬酸裂合酶调节因子IclR以上调以下酸抗性相关基因中的至少一种：ydeP、ydeO、hdeA、hdeD、gadB、gadC、gadE、gadX、gadW和/或slp。
CN201280061882.1A 2011-12-16 2012-12-14 用于合成可拉酸、甘露糖基化和/或岩藻糖基化寡糖的突变微生物 Active CN103987841B (zh)

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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108013306A (zh) * 2017-10-28 2018-05-11 中国科学院天津工业生物技术研究所 富含阿洛酮糖的果汁饮品的制备方法
CN108018216A (zh) * 2017-12-26 2018-05-11 天津科技大学 提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的方法及应用
CN109439708A (zh) * 2018-11-15 2019-03-08 中国科学院上海高等研究院 一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌生产可拉酸的方法
CN109468244A (zh) * 2018-11-15 2019-03-15 中国科学院上海高等研究院 一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌及其应用
CN109852648A (zh) * 2019-04-11 2019-06-07 广西大学 酶法制备右旋糖酐硒聚物的方法
CN110741073A (zh) * 2017-06-09 2020-01-31 曾根农场股份公司 新乳酸菌及其用途
CN111304228A (zh) * 2020-03-18 2020-06-19 中国热带农业科学院橡胶研究所 一种橡胶树线粒体型己糖激酶基因及其编码蛋白和应用
CN111893150A (zh) * 2020-09-16 2020-11-06 南开大学 一种蔗糖诱导细菌固态发酵生产可拉酸及纯化方法
CN112574936A (zh) * 2020-12-21 2021-03-30 中国科学院合肥物质科学研究院 一种重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN113637620A (zh) * 2021-07-27 2021-11-12 西宝生物科技（上海）股份有限公司 一种克拉酸高产菌株构建方法和应用

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2791367T3 (da) * 2011-12-16 2019-07-01 Inbiose Nv Mutante mikroorganismer til syntetisering af colansyre, mannosylerede og/eller fucosylerede oligosaccharider
WO2015021147A1 (en) * 2013-08-06 2015-02-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Acid-resistant, attenuated microbial vector for improved oral delivery of multiple targeted antigens
EP3041946B1 (en) * 2013-09-06 2021-05-26 Glycom A/S Fermentative production of oligosaccharides
CA2938583A1 (en) * 2014-02-07 2015-08-13 Basf Se Modified microorganism with improved biomass separation behaviour
US11926858B2 (en) 2014-06-27 2024-03-12 Glycom A/S Oligosaccharide production
WO2015197082A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Glycom A/S Oligosaccharide production
WO2016040531A1 (en) * 2014-09-09 2016-03-17 Glycosyn LLC Alpha (1,3) fucosyltransferases for use in the production of fucosylated oligosaccharides
CN107075506B (zh) * 2014-11-14 2022-06-03 因比奥斯公司 抵抗乳糖杀伤的突变体微生物
KR101731263B1 (ko) * 2016-04-25 2017-05-02 서울대학교 산학협력단 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용한 2'-푸코실락토오스의 생산방법
ES2856749T3 (es) 2016-10-29 2021-09-28 Chr Hansen Hmo Gmbh Proceso para la producción de oligosacáridos fucosilados
WO2018198298A1 (ja) * 2017-04-27 2018-11-01 日本電気株式会社 パラメータ推定装置、パラメータ推定方法、及びコンピュータ読み取り可能な記録媒体
ES2965229T3 (es) * 2018-09-06 2024-04-11 Chr Hansen Hmo Gmbh Producción fermentativa de oligosacáridos mediante fermentación total usando una materia prima mixta
KR102254548B1 (ko) * 2019-04-26 2021-05-24 고려대학교 산학협력단 돌연변이 대장균을 이용한 콜라닉 산 생산
JP6917434B2 (ja) * 2019-10-25 2021-08-11 長瀬産業株式会社 好気性菌の代謝酵素破壊株およびその培養法
CN114829579A (zh) * 2019-12-16 2022-07-29 协和发酵生化株式会社 具有改造后的乳糖渗透酶的微生物和含乳糖寡糖的制造方法
WO2021123113A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 Inbiose N.V. Production of sialylated oligosaccharide in host cells
WO2021160830A1 (en) 2020-02-14 2021-08-19 Inbiose N.V. Glycominimized bacterial host cells
US20220396817A1 (en) 2020-02-14 2022-12-15 Inbiose N.V. Production of glycosylated product in host cells
CN116171329A (zh) 2020-08-10 2023-05-26 因比奥斯公司 通过细胞培养或微生物发酵产生的寡糖溶液的纯化方法
WO2022155554A1 (en) * 2021-01-17 2022-07-21 Genomatica, Inc. Methods and compositions for making amide compounds
KR102568773B1 (ko) * 2021-02-16 2023-08-23 고려대학교 산학협력단 재조합 대장균을 이용한 콜라닉 산 생산 방법
WO2023111140A1 (en) 2021-12-15 2023-06-22 Inbiose N.V. Novel drying method for oligosaccharides
WO2023122641A1 (en) * 2021-12-22 2023-06-29 Zymergen Inc. Compositions and methods for producing acetic acid and polysaccharides
WO2024042235A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Dsm Ip Assets B.V. Hybrid method for producing complex hmos
WO2024110667A1 (en) 2022-11-25 2024-05-30 Dsm Ip Assets B.V. Two-strain system for producing oligosaccharides
CN117646048A (zh) * 2023-12-08 2024-03-05 重庆智合生物医药有限公司 一种缩短岩藻多糖发酵时间的生产方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101044245A (zh) * 2004-08-27 2007-09-26 莱斯大学 具有增加的琥珀酸产量的突变大肠杆菌菌株

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5858752A (en) 1995-06-07 1999-01-12 The General Hospital Corporation Fucosyltransferase genes and uses thereof
US5939279A (en) 1997-09-18 1999-08-17 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Inhibition of bacterial binding by high-mannose oligosaccharides
MXPA01004982A (es) * 1998-11-18 2004-09-27 Neose Technologies Inc Manufactura de bajo costo de oligosacaridos.
JP2001546898A (en) * 1999-12-21 2003-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Kk MODIFIED alpha -1,2-FUCOSYLTRANSFERASE GENE AND PROCESS FOR PRODUCING alpha -1,2-FUCOSYLTRANSFERASE AND FUCOSE-CONTAINING SUGAR CHAIN
CN105039464A (zh) 2002-07-01 2015-11-11 阿基昂生命科学公司,以生物技术资源部的名义经营 用于生产葡糖胺和n-乙酰氨基葡糖的方法和物质
EP1789569A2 (en) * 2004-09-17 2007-05-30 Rice University High succinate producing bacteria
NZ593448A (en) * 2008-12-19 2012-06-29 Jennewein Biotechnologie Gmbh Synthesis of fucosylated compounds
EP2233562A1 (en) 2009-03-24 2010-09-29 Metabolic Explorer Method for producing high amount of glycolic acid by fermentation
WO2011083059A1 (en) * 2010-01-06 2011-07-14 Universiteit Gent Bacterial mutants and uses thereof in protein production
DK2791367T3 (da) * 2011-12-16 2019-07-01 Inbiose Nv Mutante mikroorganismer til syntetisering af colansyre, mannosylerede og/eller fucosylerede oligosaccharider

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101044245A (zh) * 2004-08-27 2007-09-26 莱斯大学 具有增加的琥珀酸产量的突变大肠杆菌菌株

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DENG MD 等: "Metabolic engineering of Escherichia coli for industrial production of glucosamine and N-acetylglucosamine", 《METAB ENG.》 *
GORDON STEVENSON 等: "Organization of the Escherichia coli K-12 Gene Cluster Responsible for Production of the Extracellular Polysaccharide Colanic Acid", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 *
WAEGEMAN HENDRIK 等: "Effect of iclR and arcA knockouts on biomass formation and metabolic fluxes in Escherichia coli K12 and its implications on understanding the metabolism of Escherichia coli BL21(DE3)", 《BMC MICROBIOLOGY》 *
WAEGEMAN HENDRIK 等: "Effect of iclR and arcA knockouts on biomass formation and metabolic fluxes in Escherichia coli K12 and its implications on understanding the metabolism of Escherichia coli BL21(DE3)", 《BMC MICROBIOLOGY》, vol. 11, 11 April 2011 (2011-04-11), pages 1, XP002686228, DOI: doi:10.1186/1471-2180-11-70 *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110741073A (zh) * 2017-06-09 2020-01-31 曾根农场股份公司 新乳酸菌及其用途
CN108013306A (zh) * 2017-10-28 2018-05-11 中国科学院天津工业生物技术研究所 富含阿洛酮糖的果汁饮品的制备方法
CN108018216B (zh) * 2017-12-26 2021-06-18 天津科技大学 提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的方法及应用
CN108018216A (zh) * 2017-12-26 2018-05-11 天津科技大学 提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸产量的方法及应用
CN109439708A (zh) * 2018-11-15 2019-03-08 中国科学院上海高等研究院 一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌生产可拉酸的方法
CN109468244A (zh) * 2018-11-15 2019-03-15 中国科学院上海高等研究院 一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌及其应用
CN109439708B (zh) * 2018-11-15 2021-11-30 中国科学院上海高等研究院 一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌生产可拉酸的方法
CN109468244B (zh) * 2018-11-15 2021-10-22 中国科学院上海高等研究院 一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌及其应用
CN109852648A (zh) * 2019-04-11 2019-06-07 广西大学 酶法制备右旋糖酐硒聚物的方法
CN109852648B (zh) * 2019-04-11 2022-08-09 广西大学 酶法制备右旋糖酐硒聚物的方法
CN111304228A (zh) * 2020-03-18 2020-06-19 中国热带农业科学院橡胶研究所 一种橡胶树线粒体型己糖激酶基因及其编码蛋白和应用
CN111304228B (zh) * 2020-03-18 2022-02-22 中国热带农业科学院橡胶研究所 一种橡胶树线粒体型己糖激酶基因及其编码蛋白和应用
CN111893150A (zh) * 2020-09-16 2020-11-06 南开大学 一种蔗糖诱导细菌固态发酵生产可拉酸及纯化方法
CN112574936A (zh) * 2020-12-21 2021-03-30 中国科学院合肥物质科学研究院 一种重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN113637620A (zh) * 2021-07-27 2021-11-12 西宝生物科技（上海）股份有限公司 一种克拉酸高产菌株构建方法和应用
CN113637620B (zh) * 2021-07-27 2023-07-18 西宝生物科技（上海）股份有限公司 一种克拉酸高产菌株构建方法和应用

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US9719119B2 (en) 2017-08-01
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AU2012351501B2 (en) 2018-06-14
JP2015504654A (ja) 2015-02-16
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DK2791367T3 (da) 2019-07-01
CA2859056A1 (en) 2013-06-20
JP6530365B2 (ja) 2019-06-12
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ES2733307T3 (es) 2019-11-28
EP2791367A1 (en) 2014-10-22
AU2012351501A1 (en) 2014-07-03
CN103987841B (zh) 2016-09-28
JP6084985B2 (ja) 2017-02-22
JP2019150051A (ja) 2019-09-12
NZ625199A (en) 2015-07-31
EP2791367B1 (en) 2019-04-24
CA2859056C (en) 2022-12-13
WO2013087884A1 (en) 2013-06-20
EP3517631B1 (en) 2023-06-07
US9951362B2 (en) 2018-04-24
JP6889205B2 (ja) 2021-06-18

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