CN107586806A - 高效利用木质纤维素水解液生产海藻糖的方法 - Google Patents
高效利用木质纤维素水解液生产海藻糖的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107586806A CN107586806A CN201711001771.2A CN201711001771A CN107586806A CN 107586806 A CN107586806 A CN 107586806A CN 201711001771 A CN201711001771 A CN 201711001771A CN 107586806 A CN107586806 A CN 107586806A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- trehalose
- gene
- otsb
- otsa
- host
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
高效利用木质纤维素水解液生产海藻糖的方法涉及生物技术和代谢工程领域，所述海藻糖生产宿主中的碳源代谢途径经重新改造，使两种碳源的代谢相互偶联，从而实现碳源的高效利用和海藻糖的高产。更确切的说，宿主中葡萄糖的主要代谢途径(糖酵解途径和磷酸戊糖途径)被阻断，使其只作为海藻糖生产的底物，同时利用木糖作为第二碳源支持宿主生长。在此基础上，通过改造磷酸烯醇式丙酮酸的消耗途径，使大部分磷酸烯醇式丙酮酸通过葡萄糖的磷酸转移酶系统生成丙酮酸，从而在细胞的正常生长的同时也为葡萄糖的转运提供了充足的磷酸基团，即为海藻糖的生物合成提供了充足的底物；随后在经代谢途径和生产条件进一步优化后，实现了海藻糖的高产。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和代谢工程领域，更确切的说，本发明涉及生物合成海藻糖的代谢途径及培养的方法，通过调节宿主中碳源利用途径，增强海藻糖合成相关基因的表达，优化宿主的培养条件，最终提高了海藻糖的产量。
背景技术
海藻糖作为一种非还原二糖，对生物大分子的独特保护作用，因此被广泛地应用在食品、医药及化妆品领域。尤其是在医药领域里，海藻糖可以作为细胞、血液制剂、疫苗和器官的保护剂，为这些医疗必需品的保存和运输提供了安全的保障。此外，近些年DeBosc等人还发现海藻糖可以减少肝脏细胞中脂肪的积累，这说明海藻糖对于人类脂肪肝的预防将起到一定的作用。目前工业生产中多以淀粉或麦芽糖为底物，采用酶法进行海藻糖的生产，但这种生产方法在酶表达纯化和产物分离提取阶段都存在一定的限制，从而增加了生产成本。本发明主要目的在于以木质纤维素水解液作为碳源实现海藻糖的高效生物合成。即以代谢工程理论为基础，通过设计并改造宿主中的碳源代谢途径，使廉价的木质纤维素水解液中的葡萄糖和木糖能够被宿主高效利用，同时通过优化海藻糖的合成途径及培养条件，实现海藻糖的高产。实验结果表明，海藻糖的最终产量为5.5g/L。
发明内容
本发明提供了一个高效生产海藻糖的方法，即通过阻断宿主中的糖酵解途径和磷酸戊糖途径，使葡萄糖只作为海藻糖的生产底物，同时利用木糖作为支持细胞生长的碳源；随后进一步敲除糖酵解途径中的编码丙酮酸激酶的pykA和pykF基因，使木糖代谢产生的磷酸烯醇式丙酮酸大量地通过磷酸转移酶系统生成丙酮酸，同时促进了葡萄糖的转运；在此基础上，通过导入质粒表达海藻糖合成的相关酶基因：海藻糖-6-磷酸合成酶的基因otsA和编码海藻糖-6-磷酸磷酸化酶的基因otsB，实现海藻糖的高效生产。
一种利用木质纤维素水解液中的葡萄糖和木糖高效生产海藻糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步反应是葡萄糖-6-磷酸和UDP-葡萄糖通过海藻糖-6-磷酸合成酶的催化作用生产海藻糖-6-磷酸；第二步反应是海藻糖-6-磷酸经海藻糖-6-磷酸磷酸化酶的作用生成海藻糖；
海藻糖合成途径中的两种酶，从大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、酵母菌或嗜热细菌中得到；用PCR获得片段，接着进行酶切，将酶切后的片段进行胶回收或柱回收，之后将目的基因插入到质粒pCS27上，获得pCS-otsA-otsB重组质粒；
在宿主上阻断海藻糖的降解途径，得到宿主WT1；
在WT1的基础上进一步敲除了编码磷酸葡萄糖异构酶的基因pgi和编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因zwf，获得菌株WT2；
在WT2的基础上敲除了编码丙酮酸激酶的pykA和pykF基因，获得菌株WT3；
在WT3的基础上敲除了编码UDP-葡萄糖水解酶的基因ushA,获得菌株WT4；
同时，PCR获取UDP-葡萄糖合成途径的相关基因：编码葡萄糖磷酸变位酶的基因pgm和编码葡萄糖-1-磷酸尿苷基转移酶的基因galU；将酶切后的片段进行胶回收或柱回收，之后将目的基因插入到质粒pCS-otsA-otsB上，获得pCS-otsA-otsB-pgm-galU重组质粒；
取构建好的质粒pCS-otsA-otsB电转到菌株WT4中，将转化有质粒pCS-otsA-otsB的菌株WT4，定义宿主为WT4K；同时将质粒pCS-otsA-otsB-pgm-galU 1μL电转到菌株WT4中，将转化有质粒pCS-otsA-otsB-pgm-galU的菌株WT4，宿主定义为WT4K’；
菌株WT4通过导入质粒表达海藻糖合成的相关酶基因：海藻糖-6-磷酸合成酶的基因otsA和编码海藻糖-6-磷酸磷酸化酶的基因otsB，实现海藻糖的生产。
所述的方法在不同宿主中进行应用，其中，所述宿主为下述1)，2)和3)中的一种:
1)大肠杆菌；
2)酵母菌；
3)谷氨酸棒杆菌。
通过调整宿主内碳源利用途径实现碳源的利用与海藻糖的生物合成，同时在宿主内通过转入质粒加强了海藻糖合成基因的表达，基因表达元件为下述1)和2)中的一种:
1)表达海藻糖合成途径，来源于宿主自身的海藻糖合成途径相关基因，编码海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)的基因otsA，编码海藻糖-6-磷酸磷酸化酶(TPP)的基因otsB；
2)表达海藻糖合成途径，来源于嗜热细菌Thermus thermophilus HB8的海藻糖合成途径相关基因，编码海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)的基因otsA，编码海藻糖-6-磷酸磷酸化酶(TPP)的基因otsB。
本发明提供了一种木质纤维素水解液中碳源高效利用的新方法，这种方法通过阻断葡萄糖的主要利用途径和利用木糖辅助生长，不仅可以实现木质纤维素水解液中的两种主要糖类的同时利用，更能通过两种碳源的协同利用实现较高的碳源转化或利用效率。
如上文所述，本发明涉及利用木质纤维素水解液中的两种主要糖类生物合成海藻糖的方法，所述方法的特征在于：通过设计和改造宿主中的碳源代谢途径，同时表达海藻糖的合成相关酶基因，实现了海藻糖的高效率生物合成。
附图说明
图1利用葡萄糖和木糖生物合成海藻糖的代谢途径示意
图2海藻糖生物合成途径的构建后的生产及生长情况
图3在葡萄糖和木糖的共利用下的海藻糖生产情况
图4在葡萄糖和木糖的协同利用下的海藻糖生产情况
图5优化后的海藻糖生产菌株的比较
图6培养条件优化后的海藻糖生产情况
具体实施方式
具体实施例1
海藻糖生物合成途径的构建
许多细菌可以自然合成海藻糖。本发明中主要利用海藻糖的磷酸化酶合成途径。该途径的第一步反应是葡萄糖-6-磷酸和UDP-葡萄糖通过海藻糖-6-磷酸合成酶的催化作用生产海藻糖-6-磷酸；第二步反应是海藻糖-6-磷酸经海藻糖-6-磷酸磷酸化酶的作用生成海藻糖。
海藻糖合成途径中的两种酶，可以从大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、酵母菌或某些嗜热细菌中得到。用PCR获得片段，接着用合适的酶对片段和载体进行酶切，将酶切后的片段进行胶回收或柱回收，之后将目的基因插入到质粒pCS27(中拷贝)上，获得pCS-otsA-otsB重组质粒(表1)；同时阻断野生大肠杆菌中的海藻糖的降解途径，得到宿主WT1。
电转法感受态的制备：将WT1的单菌落分别接种到3mL的液体LB培养基中，37℃，250rpm过夜培养。之后接种500μL菌液到50mL的LB培养基中，37℃，250rpm振荡培养至OD600＝0.4-0.6。将菌液于4℃，5000rpm离心10min，弃掉上清，沉淀用3mL 10％的甘油重悬混匀。接着将菌液于4℃，5000rpm离心10min，弃掉上清，沉淀用3mL 10％甘油重悬混匀。之后将菌液于4℃，5000rpm离心10min，用400μL 10％的甘油重悬细胞，分装成100μL的小管用于转化。
取构建好的中拷贝质粒pCS-otsA-otsB 1μL，加入到含有100μL感受态细胞的1.5mL离心管中，混合均匀。接着将混合物转移到电转杯中。设置电压为1800V，将电转杯放入卡槽中，按电击按钮一次。电击完成后，加入500μL LB培养基，并将混合物转移到1.5mL离心管中，复苏45min。之后取适量菌液涂到含有相应抗生素的平板上，37℃过夜培养。
将转化有质粒pCS-otsA-otsB的WT1定义为WT1K，在WT1K的平板上挑取单菌落，接到3mL的带有相应抗性的液体LB中，37℃，250rpm振荡培养8小时，之后将菌液转接到20mL的带有相应抗性的以10g/L葡萄糖作为单一碳源的M9培养基中，同时加入0.5mM的IPTG进行30℃诱导48小时。之后每隔12小时取一次样品进行菌体浓度测定(OD600)，并用高效液相色谱测定海藻糖的浓度(图2)。
培养结果显示，在诱导48小时后检测得到的海藻糖产量达1.64g/L。
具体实施例2
葡萄糖和木糖共利用途径的初步构建及海藻糖的生产
葡萄糖和木糖是木质纤维素水解液中的两种主要存在的单糖。为了避免“葡萄糖效应”，宿主中的葡萄糖的主要代谢途径，即糖酵解途径和磷酸戊糖途径被阻断。更确切的说，是在WT1的基础上进一步敲除了编码磷酸葡萄糖异构酶的基因pgi和编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因zwf，获得菌株WT2(表1)。
取构建好的中拷贝质粒pCS-otsA-otsB 1μL，电转到大肠杆菌WT2中，将转化有质粒pCS-otsA-otsB的大肠杆菌WT2，定义宿主为WT2K。之后取适量菌液涂到含有相应抗生素的平板上，37℃过夜培养。在大肠杆菌基因工程中的平板上挑取单菌落，接到3mL的带有相应抗性的液体LB中，37℃，250rpm振荡培养8小时，之后将菌液转接到20mL的带有相应抗性的以10g/L葡萄糖和10g/L木糖为混合碳源的M9培养基中，同时加入0.5mM的IPTG进行30℃诱导48小时。之后每隔12小时取一次样品进行菌体浓度测定(OD600)，并用高效液相色谱测定海藻糖的浓度(图3)。
培养结果显示，在诱导48小时后检测得到的海藻糖产量达1.92g/L。
具体实施例3
葡萄糖和木糖协同利用代谢途径的构建及海藻糖的生产
为了实现葡萄糖和木糖的协同利用，糖酵解途径中磷酸烯醇式丙酮酸到丙酮酸的反应被阻断，即在WT2的基础上敲除了编码丙酮酸激酶的pykA和pykF基因，获得菌株WT3(表1)。
取构建好的中拷贝质粒pCS-otsA-otsB 1μL，电转到大肠杆菌WT3中，将转化有质粒pCS-otsA-otsB的大肠杆菌WT3，定义宿主为WT3K。之后取适量菌液涂到含有相应抗生素的平板上，37℃过夜培养。在大肠杆菌基因工程中的平板上挑取单菌落，接到3mL的带有相应抗性的液体LB中，37℃，250rpm振荡培养8小时，之后将菌液转接到20mL的带有相应抗性的以10g/L葡萄糖和10g/L木糖为混合碳源的M9培养基中，同时加入0.5mM的IPTG进行30℃诱导48小时。之后每隔12小时取一次样品进行菌体浓度测定(OD600)，并用高效液相色谱测定海藻糖的浓度(图4)。
培养结果显示，在诱导48小时后检测得到的海藻糖产量达3.47g/L。
具体实施例4
葡萄糖和木糖高效利用宿主的优化
在以上构建的代谢途径基础上，为了进一步提高海藻糖的产量，海藻糖的合成前体之一UDP-葡萄糖的含量需要进一步提高。因此，在WT3的基础上敲除了编码UDP-葡萄糖水解酶的基因ushA,获得菌株WT4(表1)。同时，PCR获取UDP-葡萄糖合成途径的相关基因：编码葡萄糖磷酸变位酶的基因pgm和编码葡萄糖-1-磷酸尿苷基转移酶的基因galU。将酶切后的片段进行胶回收或柱回收，之后将目的基因插入到质粒pCS-otsA-otsB上，获得pCS-otsA-otsB-pgm-galU重组质粒(表1)。
取构建好的质粒pCS-otsA-otsB电转到大肠杆菌WT4中，将转化有质粒pCS-otsA-otsB的大肠杆菌WT4，定义宿主为WT4K；同时将质粒pCS-otsA-otsB-pgm-galU 1μL电转到大肠杆菌WT3和WT4中，将转化有质粒pCS-otsA-otsB-pgm-galU的大肠杆菌WT3和WT4，分别定义宿主为WT3K’和WT4K’。之后取适量菌液涂到含有相应抗生素的平板上，37℃过夜培养。在大肠杆菌基因工程中的平板上挑取单菌落，接到3mL的带有相应抗性的液体LB中，37℃，250rpm振荡培养8小时，之后将菌液转接到20mL的带有相应抗性的以10g/L葡萄糖和10g/L木糖为混合碳源的M9培养基中，同时加入0.5mM的IPTG进行30℃诱导48小时。取48小时的样品进行菌体浓度测定(OD600)，并用高效液相色谱测定海藻糖的浓度，随后对比以上三种菌株的海藻糖产量(图5)。
对比结果显示，在诱导48小时后WT4K可以得到最多的海藻糖产量，即为3.44g/L，此时葡萄糖的转化效率为0.69g海藻糖/g葡萄糖，木糖的转化效率为0.55g海藻糖/g木糖，比WT3K的碳源转化效率分别提高了13％和72％。
因此，WT4K作为最终优化菌株进行培养条件的优化实验，即将WT4K菌液涂到含有相应抗生素的平板上，37℃过夜培养。在大肠杆菌基因工程中的平板上挑取单菌落，接到3mL的带有相应抗性的液体LB中，37℃，250rpm振荡培养8小时，之后将菌液转接到20mL的带有相应抗性的以10g/L葡萄糖和15g/L木糖为混合碳源的M9培养基中，同时加入0.5mM的IPTG进行30℃诱导120小时。每隔12小时或24小时的取一次样品，进行菌体浓度测定(OD600)，并用高效液相色谱测定海藻糖的浓度(图6)。
培养结果显示，在诱导120小时后检测得到的海藻糖产量达5.5g/L。
表1宿主和质粒
Claims (3)
1.一种利用木质纤维素水解液中的葡萄糖和木糖高效生产海藻糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步反应是葡萄糖-6-磷酸和UDP-葡萄糖通过海藻糖-6-磷酸合成酶的催化作用生产海藻糖-6-磷酸；第二步反应是海藻糖-6-磷酸经海藻糖-6-磷酸磷酸化酶的作用生成海藻糖；
海藻糖合成途径中的两种酶，从大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、酵母菌或嗜热细菌中得到；用PCR获得片段，接着进行酶切，将酶切后的片段进行胶回收或柱回收，之后将目的基因插入到质粒pCS27上，获得pCS-otsA-otsB重组质粒；
在宿主上阻断海藻糖的降解途径，得到宿主WT1；
在WT1的基础上进一步敲除了编码磷酸葡萄糖异构酶的基因pgi和编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因zwf，获得菌株WT2；
在WT2的基础上敲除了编码丙酮酸激酶的pykA和pykF基因，获得菌株WT3；
在WT3的基础上敲除了编码UDP-葡萄糖水解酶的基因ushA,获得菌株WT4；
同时，PCR获取UDP-葡萄糖合成途径的相关基因：编码葡萄糖磷酸变位酶的基因pgm和编码葡萄糖-1-磷酸尿苷基转移酶的基因galU；将酶切后的片段进行胶回收或柱回收，之后将目的基因插入到质粒pCS-otsA-otsB上，获得pCS-otsA-otsB-pgm-galU重组质粒；
取构建好的质粒pCS-otsA-otsB电转到菌株WT4中，将转化有质粒pCS-otsA-otsB的菌株WT4，定义宿主为WT4K；同时将质粒pCS-otsA-otsB-pgm-galU 1μL电转到菌株WT4中，将转化有质粒pCS-otsA-otsB-pgm-galU的菌株WT4，宿主定义为WT4K’；
菌株WT4通过导入质粒表达海藻糖合成的相关酶基因：海藻糖-6-磷酸合成酶的基因otsA和编码海藻糖-6-磷酸磷酸化酶的基因otsB，实现海藻糖的生产。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在不同宿主中进行应用，其中，所述宿主为下述1)，2)和3)中的一种:
1)大肠杆菌；
2)酵母菌；
3)谷氨酸棒杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，通过调整宿主内碳源利用途径实现碳源的利用与海藻糖的生物合成，同时在宿主内通过转入质粒加强了海藻糖合成基因的表达，基因表达元件为下述1)和2)中的一种:
1)表达海藻糖合成途径，来源于宿主自身的海藻糖合成途径相关基因，编码海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)的基因otsA，编码海藻糖-6-磷酸磷酸化酶(TPP)的基因otsB；
2)表达海藻糖合成途径，来源于嗜热细菌Thermus thermophilus HB8的海藻糖合成途径相关基因，编码海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)的基因otsA，编码海藻糖-6-磷酸磷酸化酶(TPP)的基因otsB。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711001771.2A CN107586806A (zh) | 2017-10-24 | 2017-10-24 | 高效利用木质纤维素水解液生产海藻糖的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711001771.2A CN107586806A (zh) | 2017-10-24 | 2017-10-24 | 高效利用木质纤维素水解液生产海藻糖的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107586806A true CN107586806A (zh) | 2018-01-16 |
Family
ID=61043558
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711001771.2A Pending CN107586806A (zh) | 2017-10-24 | 2017-10-24 | 高效利用木质纤维素水解液生产海藻糖的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107586806A (zh) |
-
2017
- 2017-10-24 CN CN201711001771.2A patent/CN107586806A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111712570B (zh) | 一种生产阿洛酮糖及其衍生物的工程菌株及其构建方法和应用 | |
| Zhang et al. | Microbial production of sialic acid and sialylated human milk oligosaccharides: Advances and perspectives | |
| Dong et al. | Modular pathway engineering of key precursor supply pathways for lacto-N-neotetraose production in Bacillus subtilis | |
| JP2022517903A (ja) | フコシル化オリゴ糖の合成 | |
| CN114480240B (zh) | 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法 | |
| CN112625990B (zh) | 一种合成2`-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法 | |
| CN103025874A (zh) | 用于生产附加值生物产品的代谢改造的生物 | |
| RU2009145274A (ru) | Мезофильные и термофильные организмы с нокаутом генов и способы их использования | |
| Zhang et al. | Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of Lacto-N-neotetraose (LNnT) | |
| CN114774343A (zh) | 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用 | |
| Zhang et al. | The effect of optimized carbon source on the synthesis and composition of exopolysaccharides produced by Lactobacillus paracasei | |
| CN104593308A (zh) | 一种基因工程菌及其构建方法和在生产木糖醇中的应用 | |
| CN112662604B (zh) | 一种合成3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法 | |
| WO2023208146A1 (zh) | 生物合成麦角硫因的方法及载体 | |
| CN104046586B (zh) | 一株基因工程菌及其在生产(2r,3r)-2,3-丁二醇中的应用 | |
| Hu et al. | Biosynthesis of lacto-N-fucopentaose I in Escherichia coli by metabolic pathway rational design | |
| Kim et al. | High-level production of lycopene in metabolically engineered E. coli | |
| Ji et al. | De novo synthesis of 2'-fucosyllactose in engineered Bacillus subtilis ATCC 6051a | |
| Liao et al. | High-yield synthesis of lacto-N-neotetraose from glycerol and glucose in engineered Escherichia coli | |
| CN111411066B (zh) | 一种双途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及构建方法 | |
| CN115948314B (zh) | 一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的地衣芽孢杆菌工程菌株 | |
| CN107460152A (zh) | 产红景天苷及其类似物的重组菌、构建方法及用途 | |
| CN104878059B (zh) | 一种制备s-腺苷蛋氨酸的方法 | |
| Hu et al. | Engineering Escherichia coli for high-titer biosynthesis of lacto-N-difucohexaose II | |
| CN107586806A (zh) | 高效利用木质纤维素水解液生产海藻糖的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20180116 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |