ES2856749T3 - Proceso para la producción de oligosacáridos fucosilados - Google Patents

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Abstract

método para la producción de oligosacáridos fucosilados utilizando una célula hospedante procariota modificada genéticamente, comprendiendo el método las etapas de: - proporcionar una célula hospedante procariota que ha sido modificada genéticamente, de modo que al menos (i) se reduce o se elimina la actividad de una enzima de conversión en fructosa-6-fosfato, que en la célula hospedante sin modificar tiene un nivel regular, en donde dicha enzima de conversión en fructosa-6-fosfato se selecciona del grupo que consiste en fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, fructosa-6-fosfato aldolasa, una transcetolasa o una transaldolasa, y/o aumentando la actividad de una fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa; (ii) al menos se sobreexpresa un gen que codifica una enzima necesaria para la síntesis de novo de GDP-fucosa en la célula hospedante, en donde el al menos un gen que codifica una enzima necesaria para la síntesis de novo de GDP-fucosa es un gen que codifica una enzima ManA que cataliza la isomerización de fructosa-6-fosfato en manosa-6-fosfato, un gen que codifica fosfomanomutasa, un gen que codifica manosa-1-fosfato guanosiltransferasa, un gen que codifica GDP-manosa-4,6-dehidratasa o un gen que codifica GDP-L-fucosa sintasa; (iii) se expresa un gen exógeno que codifica una alfa-1,2-fucosiltransferasa y/o alfa-1,3-fucosiltransferasa en la célula hospedante; - cultivar y/o desarrollar dicha célula hospedante modificada genéticamente en un medio de cultivo a partir de una fuente de carbono y/o energía, que se selecciona de entre al menos uno de los siguientes: glicerol, succinato, malato, piruvato, lactato, etanol, citrato; y - proporcionar lactosa al medio de cultivo; produciendo así el oligosacárido fucosilado que se puede obtener del medio en el que se cultiva la célula hospedante.

Description

DESCRIPCIÓN
Proceso para la producción de oligosacáridos fucosilados
La presente invención se refiere a un método para la producción de oligosacáridos fucosilados utilizando una célula hospedante procariota modificada genéticamente.
Antecedentes de la invención
La leche humana representa una mezcla compleja de carbohidratos, grasas, proteínas, vitaminas, minerales y elementos traza. La fracción predominante con diferencia es la representada por carbohidratos, que pueden dividirse además en lactosa y oligosacáridos más complejos (oligosacáridos de leche humana (OLH). Mientras que la lactosa se utiliza como fuente de energía, los oligosacáridos complejos no son metabolizados por el lactante. La fracción de oligosacáridos complejos representa hasta un 20% del total de la fracción de carbohidratos y consiste en más de 200 oligosacáridos diferentes. La existencia y concentración de estos oligosacáridos complejos son específicos de los seres humanos y por lo tanto no se pueden encontrar en grandes cantidades en la leche de otros mamíferos.
Se han identificado aproximadamente 200 OLH estructuralmente diversos hasta ahora y se han reseñado numerosas propiedades beneficiosas. Los OLH no son digeridos por los lactantes alimentados con leche materna, pero representan una fuente de carbono y energía valiosa para bacterias beneficiosas del género Bifidobacteria, Lactobacillus y Bacteroides en el intestino, que hacen que se conviertan en dominantes en el intestino y permiten desplazar patógenos, evitando de este modo infecciones del epitelio intestinal. Sin embargo, los OLH también se unen directamente a bacterias, protozoos y virus patógenos, bloqueando las interacciones entre el patógeno y el hospedante imitando los receptores de superficie celular de glicano y protegiendo así al bebé alimentado con leche materna de enfermedades infecciosas.
El oligosacárido más prominente es 2’-fucosil-lactosa. Otros OLS presentes en la leche humana prominentes son 3-fucosil-lactosa, lacto-W-tetraosa, lacto-W-neotetraosa y las lacto-W-fucopentaosas. Además de estos oligosacáridos neutros, también se pueden encontrar en la leche humana OLH ácidos, como p. ej., 3’sialil-lactosa, 6’-silail-lactosa y sialil-lacto-W-tetraosa, a, b y c, o sialil-lacto-W-fucopentaosa II etc. Estas estructuras están íntimamente relacionadas con epítopos de glicoconjugados de superficie celular epitelial, los antígenos histo-grupo sanguíneo de Lewis y la homología estructural de OLS con epítopos epiteliales explica las propiedades protectoras contra patógenos bacterianos.
Debido a sus propiedades beneficiosas, los OLH son apreciados para su inclusión como ingredientes en las fórmulas para lactantes y otros productos alimentarios que necesitan la producción de OLH en grandes cantidades, hasta escala de varias toneladas.
Debido al suministro limitado y las dificultades para obtener fracciones puras de oligosacáridos de leche humana individuales, se han desarrollado rutas químicas para algunas de estas moléculas complejas. Sin embargo, no se ha demostrado que los planteamientos químicos y biocatalíticos sean comercialmente sostenibles y, además, particularmente las rutas de síntesis químicas para obtener oligosacáridos lácteos humanos implican varias sustancias químicas nocivas, lo cual impone el riesgo de contaminar el producto final.
Debido a los retos que implica la síntesis química de oligosacáridos lácteos humanos, se han desarrollado varios métodos enzimáticos y planteamientos fermentativos. Hoy en día, se han desarrollado planteamientos fermentativos para varios OLH, como puedan ser 2'-fucosil-lactosa, 3-fucosil-lactosa, lacto-W-tetraosa, lacto-W-neotetraosa, lacto-W-fucopentaosa I, lacto-W-difucohexaosa II, 3'-sialil-lactosa y 6'-sialil-lactosa, utilizando principalmente cepas bacterianas obtenidas por ingeniería genética, como por ejemplo Escherichia coli recombinante.
Sin embargo, incluso los procesos más eficientes basados en fermentación bacteriana que están disponibles hoy no consiguen, o apenas consiguen titulaciones de OLH superiores a 20 g/l en el caldo de cultivo. Los procesos a escala industrial deben exceder típicamente titulaciones de 50 g/l, si bien 100 g/l es más deseable.
Chin et al., ("Metabolic Engineering of Escherichia co lito Produce 2'-Fucosyllactose via Salvage Pathway of Guanosine 5'-Diphosphate (GDP)-L-Fucose", Biotechnology y Bioengineering (2016) 113(11 ):2443-2452) describe el uso de la ruta de recuperación de biosíntesis guanosine 5'-difosfato (GDP)-L-fucosa para producir 2-fucosil-lactosa de fucosa.
Chin et al., ("Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum to produce GDP-L-fucose from glucose y mannose", Bioprocess Biosyst Eng (2013) 36:749-756) describe la modificación genética de Corynebacterium glutamicum de tipo silvestre para convertir glucosa y manosa en 5’-difosfato (GDP)-L-fucosa.
Engels et al., ("WbgL: a novel bacterial a1,2-fucosyltransferase for the synthesis of 2'-fucosyllactose", Glycobiology (2014) 24:170-178) describe una bacteria a1,2-FucT de la familia glicosiltransferasa codificada en 11 por el gen wbgL en el genoma E. coli O126.
Lee et al., ("Whole cell biosynthesis of a functional oligosaccharide, 2'-fucosyllactose, using engineered Escherichia coli", Microbial Cell Factories (2012) 11:1-9) se refiere, entre otros, a la sobreexpresión de genes que codifican enzimas biosintéticas de GDP-L-fucosa endógenas y fucosiltransferasa heteróloga.
Las publicaciones internacionales WO 2012/007481, WO 2013/087884 y WO 2016/075243 son solicitudes de patente de la Universidad de Gantes y describen microorganismos mutantes y obtenidos por ingeniería metabólica similares.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un proceso de fermentación mejorado por medio del cual se da capacidad para una biosíntesis de oligosacáridos fucosilados, en particular, 2'-fucosil-lactosa, a una titulación de más de 100 g/l.
Compendio de la invención
Éste y otros objetos se resuelven mediante un método para la producción de oligosacáridos fucosilados utilizando una célula hospedante procariota modificada genéticamente, comprendiendo el método las etapas de:
- proporcionar una célula hospedante que ha sido modificada genéticamente, de modo que al menos (i) se reduce o se elimina la actividad de una enzima de conversión en fructosa-6-fosfato, que en la célula hospedante sin modificar tiene un nivel regular, en donde dicha enzima de conversión en fructosa-6-fosfato se selecciona del grupo que consiste en fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, fructosa-6-fosfato aldolasa, una transcetolasa y una transaldolasa, y/o aumentando la actividad de una fructosa-1,6-bifosfato fosfatasa; (ii) al menos se sobreexpresa un gen que codifica una enzima necesaria para la síntesis de novo de GDP-fucosa en la célula hospedante, en donde el al menos un gen que codifica una enzima necesaria para la síntesis de novo de GDP-fucosa es un gen que codifica una enzima ManA que cataliza la isomerización de fructosa-6-fosfato en manosa-6-fosfato, un gen que codifica fosfomanomutasa, un gen que codifica manosa-1-fosfato guanosiltransferasa, un gen que codifica GDP-manosa-4,6-dehidratasa o un gen que codifica GDP-L-fucosa sintasa; (iii) se expresa, preferiblemente, se sobreexpresa, un gen exógeno que codifica una fucosiltransferasa, preferiblemente una alfa-1,2-fucosiltransferasa y/o alfa-1,3-fucosiltransferasa en la célula hospedante;
- cultivar dicha célula hospedante genéticamente modificada en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono y energía que se selecciona de entre al menos uno de los siguientes: glucosa, sacarosa, glicerol, succinato, citrato, piruvato, malato, lactato o etanol; y
- proporcionar lactosa al medio de cultivo con lactosa.
En una etapa posterior, se puede recuperar u obtener el oligosacárido fucosilado así producido del medio en el que se cultiva la célula hospedante.
La etapa de crecimiento y cultivo de la célula hospedante genéticamente modificada y la etapa de adición de lactosa al medio de cultivo se puede realizar de tal modo que se cultiva primero la célula hospedante genéticamente modificada durante determinado período de tiempo y, en una etapa posterior después de este primer período de cultivo, se proporciona lactosa añadiéndola al medio en el que se cultiva la célula hospedante; alternativamente, se puede proporcionar la lactosa desde el inicio del período de cultivo de la célula hospedante genéticamente modificada, en una cantidad determinada y se puede añadir constantemente en una cantidad determinada. Alternativamente se puede generar internamente lactosa.
En la presente memoria se describe una célula hospedante procariota genéticamente modificada para su uso en un método para la producción de un oligosacárido fucosilado, célula hospedante que ha sido genéticamente modificada de modo que al menos (i) se reduce o se elimina la actividad de una enzima de conversión en fructosa-6-fosfato, que en la célula hospedante sin modificar está a un nivel regular, en donde dicha enzima de conversión en fructosa-6-fosfato se selecciona del grupo que consiste en fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, fructosa-6-fosfato aldolasa, una transcetolasa y una transaldolasa, y/o aumentando la actividad de una fructosa-1,6-bifosfato fosfatasa; y/o habiendo aumentado la actividad de una enzima que genera fructosa-6-fosfato en la célula hospedante; (ii) al menos se sobreexpresa un gen que codifica una enzima necesaria para la síntesis de novo de GDP-fucosa, en donde el al menos un gen que codifica una enzima necesaria para la síntesis de novo de GDP-fucosa es un gen que codifica una enzima ManA que cataliza la isomerización de fructosa-6-fosfato en manosa-6-fosfato, un gen que codifica fosfomanomutasa, un gen que codifica manosa-1-fosfato guanosiltransferasa, un gen que codifica GDP-manosa-4,6-dehidratasa o un gen que codifica GDP-L-fucosa sintasa; (iii) se expresa, preferiblemente, se sobreexpresa un gen exógeno que codifica una fucosiltransferasa, preferiblemente una alfa-1,2-fucosiltransferasa y/o alfa-1,3-fucosiltransferasa, en la célula hospedante.
Opcionalmente, la célula hospedante ha sido modificada genéticamente adicionalmente (iv) para expresar un gen que codifica una proteína que permite o facilita el transporte del oligosacárido fucosilado deseado al medio en el que se cultiva la célula hospedante; y/o (v) para expresar un gen exógeno que codifica una L-fucoquinasa/L-fucosa 1-fosfato guanililtransferasa bifuncional; y/o (vi) para tener inactivados o suprimidos genes que codifican una L-fucosaisomerasa y L-fuculosa-quinasa; y/o (vii) para tener inactivados o alterados genes que codifican enzimas de la síntesis de ácido colánico; y/o (viii) para expresar una a lactosa permeasa; y/o (ix) para tener inactivados o suprimidos genes de beta-galactosidasa endógenos; y/o (x) para expresar un gen de beta-galactosidasa regulable exógeno; y/o (xi) para sobreexpresar genes exógenos para metabolizar galactosa, y/o (xii) para expresar un gen exógeno que codifica una enzima que presenta actividad fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa.
Asimismo, se proporciona en la presente memoria un método para la producción de oligosacárido fucosilados utilizando una célula hospedante procariota modificada genéticamente, tal como se define en las reivindicaciones, comprendiendo el método las etapas de:
- proporcionar una célula hospedante procariota que ha sido modificada genéticamente, de modo que al menos (i) se aumenta la combinación de fructosa-6-fosfato en dicha célula hospedante modificada genéticamente habiendo reducido o eliminado la actividad de enzima de conversión en fructosa-6-fosfato, que en la célula hospedante sin modificar tiene un nivel regular, o habiendo aumentado la actividad de una fructosa-6-fosfato que genera en
se sobreexpresa síntesis de GDP-fucosa en la célula hospedante; (iii) se sobreexpresa un gen exógeno que codifica una alfa-1,2-fucosiltransferasa y/o alfa-1,3-fucosiltransferasa en la célula hospedante;
- cultivar dicha célula hospedante modificada genéticamente en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono y energía que se selecciona de entre al menos uno de los siguientes: glucosa, sacarosa, glicerol, succinato, citrato, piruvato, malato, lactato o etanol; y
- proporcionar lactosa al medio de cultivo con lactosa.
Los objetos que sostiene la invención se resuelven completamente de esta forma.
Con el método según la invención es posible producir oligosacáridos fucosilados a una titulación por encima de 50 g/l e incluso 100 g/l e incluso más 150 g/l, proporcionando así una herramienta lograda para la producción fermentativa a gran escala y, por tanto, a escala industrial, de oligosacárido fucosilados.
En la presente invención, y tal como se entiende generalmente en el estado de la técnica, un "oligosacárido fucosilado'' es un oligosacárido fucosilado tal como se encuentra en la leche humana, es decir, un oligosacárido que transporta un resto fucosa. Preferiblemente, el oligosacárido fucosilado es uno seleccionado de entre 2'-fucosil-lactosa, 3-fucosillactosa o difucosil-lactosa.
Asimismo, una "célula hospedante procariota modificada genéticamente" significa en la presente invención una célula procariota cuyo material genético ha sido alterado utilizando técnicas de ingeniería genética. P. ej., la célula hospedante ha sido modificada genéticamente de modo que cualquiera de sus secuencias nucleicas endógenas que existen de manera natural en dicha célula hospedante ha sido suprimida, alterada o afectada de otra forma de tal modo que se modifica su expresión, es decir, se elimina, reduce, suprime, potencia o similar, y/o se han introducido en la célula hospedante ácidos nucleicos exógenos, es decir ácidos nucleicos que son extraños a dicha célula hospedante, que se va a expresar, p.ej., bajo el control de un promotor controlable, en la célula hospedante. En conexión con esto, dichas células hospedantes modificadas genéticamente se denominan también “células hospedantes recombinantes”. Por ejemplo, una célula hospedante procariota materia objeto de la invención es una célula hospedante procariota genéticamente modificada, en virtud de la introducción en una célula hospedante procariota adecuada de un ácido nucleico heterólogo, p.ej., un ácido nucleico exógeno que es extraño para la célula hospedante procariota o un ácido nucleico recombinante que no se encuentra normalmente en la célula hospedante procariota.
Por consiguiente, el término "recombinante", tal como se utiliza en la presente memoria por referencia a una célula hospedante bacteriana indica que la célula bacteriana replica un ácido nucleico heterólogo o expresa un péptido o proteína codificada por un ácido nucleico heterólogo (es decir, una secuencia “extraña para dicha célula”). Las células recombinantes pueden contener genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula. Las células recombinantes también pueden contener genes que se encuentran en la forma nativa de la célula en donde los genes se modifican y se reintroducen en la célula a través de medios artificiales. El término abarca también células que contienen un ácido nucleico endógeno para la célula que ha sido modificado sin eliminar el ácido nucleico de la célula; dichas modificaciones incluyen las obtenidas por reemplazamiento génico, mutación específica de sitio y técnicas relacionadas. Por consiguiente, un “polipéptido recombinante” es aquel que ha sido producido mediante una célula recombinante. Una “secuencia heteróloga” o un “ácido nucleico heterólogo”, tal como se utiliza en la presente memoria, es aquel que se origina a partir de una fuente extraña para la célula hospedante particular (p.ej., a partir de diferentes especies), o si es de la misma fuente, está modificada con respecto a su forma original. Por tanto, un ácido nucleico heterólogo unido operativamente a un promotor es de una fuente diferente de aquella de la que se deriva el promotor o, si es de la misma fuente, está modificado con respecto a su forma original. La secuencia heteróloga puede introducirse establemente, p.ej., por transfección, transformación, conjugación o transducción en el genoma de la célula del microorganismo hospedante, en donde pueden aplicarse técnicas que dependerán de la célula hospedante y la secuencia que se vaya a introducir. Entre las personas expertas en la técnica se conocen diversas técnicas y se describen p. ej., en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
Por consiguiente, en la presente invención se entiende por "célula hospedante procariota modificada genéticamente” una célula procariota que ha sido transformada o transfectada o que es capaz de transformación o transfección mediante una secuencia de polinucleótidos exógena.
Las secuencias de ácidos nucleicos, tal como se utilizan en la presente invención, pueden estar comprendidas p.ej., en un vector que ha de transformarse/transfectarse establemente o introducirse de otro modo en células del microorganismo hospedante.
Es posible utilizar una gran variedad de sistemas de expresión para expresar genes para su uso en la invención. Dichos vectores incluyen, entre otros, vectores cromosómicos, episómicos o derivados de virus, p. ej., vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, como puedan ser los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, como puedan ser cósmidos y fagémidos. Las construcciones del sistema de expresión pueden contener regiones de control que regulan y generan la expresión. Generalmente, puede utilizarse cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y para sintetizar un polipéptido en un hospedante para la expresión a este respecto. Se puede insertar la secuencia de ADN apropiada en el sistema de expresión a través de cualquiera entre una variedad de técnicas muy conocidas y de rutina, como por ejemplo las expuestas en Sambrook .et al., supra.
En la técnica abundan las publicaciones de patente y la bibliografía relacionadas con metodologías de "ADN recombinante" para el aislamiento, síntesis, purificación y amplificación de materiales genéticos para su uso en la transformación de organismos hospedantes seleccionados. Por lo tanto, se conoce comúnmente la transformación de organismos hospedantes con ADN de plásmido circular o vírico "híbrido" que incluye secuencias de ADN exógenas (es decir, extrañas o "heterólogas") seleccionadas. Las personas expertas en la técnica conocerán una variedad de métodos para conseguir vectores "híbridos" para su uso en la transformación de un organismo hospedante seleccionado.
La expresión "secuencia de ácido nucleico que codifica..." se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado y, generalmente, representa un gen que codifica un determinado polipéptido o proteína. La expresión incluye, sin limitación, ADN monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias o regiones monocatenarias, bicatenarias y de cadena triple, ARN monocatenario y bicatenario y a Rn que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser regiones monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias o de cadena triple, o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. El término también abarca polinucleótidos que incluyen una región continua simple o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo, interrumpidas por un fago integrado o una secuencia de inserción o edición) en combinación con regiones adicionales que también pueden contener secuencias codificantes y no codificantes.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "cultivar" significa desarrollar y/o incubar una célula bacteriana en un medio y en condiciones permisivas y adecuadas para la producción del/los oligosacárido(s) deseados. Un par de células hospedantes bacterianas adecuadas, así como los medios y las condiciones para su cultivo, serán fácilmente asequibles para un experto en la técnica tras la lectura de la descripción de la presente invención en conexión con los antecedentes técnicos y especializados de los expertos en la técnica.
Debe entenderse que con el método de la invención es posible la producción de uno o más oligosacáridos, tal como se definen en la presente memoria, siempre y cuando los correspondientes ácidos nucleicos que codifican las proteínas/enzimas pertinentes, tal como se describen en la presente memoria, estén comprendidas en la(s) célula(s).
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "recuperar" significa aislar, recoger, purificar, recolectar o separar de otro modo del cultivo de microorganismos hospedantes el oligosacárido producido por el microorganismo hospedante según la invención.
Según una realización del método de la invención, el oligosacárido fucosilado que se va a producir se selecciona de entre al menos uno de entre 2'-fucosil-lactosa, 3-fucosil-lactosa o difucosil-lactosa.
Según una realización del método de la invención, la célula hospedante procariota se selecciona del grupo que consiste en células hospedantes bacterianas, preferiblemente, seleccionadas de entre una cepa de Escherichia coli, una especie de Lactobacillus o una cepa de Corynebacterium glutamicum.
Preferiblemente, la célula hospedante es una célula hospedante bacteriana seleccionada de entre una célula de Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Lactococcus lactis. Las personas expertas en la técnica tendrán en cuenta otras cepas bacterianas al leer la presente descripción.
En la presente invención y tal como se entiende generalmente, la expresión "fucosiltransferasa" se entiende como una enzima que transfiere un azúcar L-fucosa desde un sustrato donador de GDP-fucosa (guanosina difosfato-fucosa) a un sustrato aceptor para formar el oligosacárido fucosilado. El sustrato aceptor, en el método de la presente invención, es un oligosacárido. Asimismo, las fucosiltransferasas no solo catalizan la fucosilación en presencia de aceptores de glucanos, sino que también pueden hidrolizar la GDP-L-fucosa cuando no está disponible un sustrato aceptor.
Por consiguiente, los términos "alfa-1,2-fucosiltransferasa" o "fucosiltransferasa" o un ácido nucleico/polinucleótido que codifica una "alfa-1,2-fucosiltransferasa" o "fucosiltransferasa" se refieren a una glicosiltransferasa que cataliza la transferencia del resto fucosa desde un sustrato donador, por ejemplo, GDP-fucosa, a una molécula aceptora en un enlace alfa-1,2. Los términos "alfa-1,3-fucosiltransferasa" o "fucosiltransferasa" o un ácido nucleico/polinucleótido que codifica una "alfa-1,3-fucosiltranferasa" o "fucosiltransferasa" se refieren a una glicosiltransferasa que cataliza la transferencia del resto fucosa de una sustrato donador, por ejemplo, GDP-fucosa, a una molécula aceptora en un enlace alfa-1,3. La molécula aceptora puede ser, por ejemplo, lactosa, 2'-fucosil-lactosa, 3-fucosil-lactosa, 3’-sialillactosa, 6’-sialil-lactosa, lacto-W-tetraosa, lacto-W-neotetraosa o un derivado de los mismos.
De acuerdo con el método de la invención, el gen exógeno que codifica una fucosiltransferasa se selecciona de entre un gen que expresa una proteína que presenta una actividad alfa-1,2-fucosiltransferasa, un gen que expresa una proteína que presenta una actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa o un gen que expresa una actividad alfa-1,2-fucosiltransferasa, así como una actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa.
Según la invención, para la síntesis de 2'-fucosil-lactosa se expresa una alfa-1,2-fucosiltransferasa adecuada, para la síntesis de 3-fucosil-lactosa se expresa una alfa-1,3-fucosiltransferasa adecuada, para la síntesis de 2',3-difucosillactosa, se expresa tanto una alfa-1,2-fucosiltransferasa como una alfa-1,3-fucosiltransferasa adecuada o al menos un gen que codifica una proteína que presenta una actividad alfa-1,2-, así como una actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa.
Entre los ejemplos no exhaustivos de fucosiltransferasas que se pueden utilizar según el método de la invención se incluyen p. ej., fucosiltransferasas bacterianas y, preferiblemente, una alfa-1,2-fucosiltransferasa y, más preferiblemente, la alfa-1,2- fucosiltransferasa codificada por el gen wbgL de E. coli: O126, o la alfa-1,2-fucosiltransferasa codificada por el gen fucT de Helicobacter pylori, o una alfa-1,3-fucosiltransferasa y, más preferiblemente, una alfa-1,3 -fucosiltransferasa de Akkermansia muciniphila, Bacteroides fragilis, H. pylori o H. hepaticus. Preferiblemente, se utiliza una fucosiltransferasa o una variante de la misma, tal como se describe en las patentes europeas EP 2479 263 A1 o EP 2439 264 o la publicación internacional WO 2010/142305.
Una "variante", tal como se utiliza el término en la presente memoria, es un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, en particular una enzima, tal como se menciona y se utiliza en la presente memoria, respectivamente, pero que retiene las propiedades esenciales (enzimáticas) del polinucleótido o polipéptido de referencia. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden alterar o no la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se comenta más adelante. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias están limitadas de modo que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son estrechamente similares globalmente y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, supresiones en cualquier combinación. Un resto de aminoácido sustituido o insertado puede estar codificado o no por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser una variante que existe de manera natural, como pueda ser una variante alélica, o puede ser una variante no conocida por existir de manera natural. Las variantes de polinucleótidos y polipéptidos que existen de manera no natural pueden prepararse a través de técnicas de mutagénesis, síntesis directa y otros métodos recombinantes conocidos entre las personas expertas en la técnica.
Son útiles también variantes polimórficas de ácido nucleico/polinucleótido y polipéptido, alelos, mutantes y homólogos entre especies que tienen una secuencia de aminoácidos/secuencia de ácidos nucleicos que tiene más de aproximadamente un 60% de identidad de la secuencia de aminoácidos, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, preferiblemente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más de identidad de la secuencia de aminoácidos, preferiblemente a lo largo de una región de al menos aproximadamente 25, 50, 100, 200, 500, 1000 o más aminoácidos, con respecto al polipéptido, tal como se menciona en la presente memoria, p. ej., una enzima de conversión en fructosa-6-fosfato, en particular, fosfofructoquinasa A, glucosa-6-fosfato isomerasa, fructosa-6-fosfato aldolasa, una transcetolasa, p. ej. tktA, tktB, o una transaldolasa, p.ej., talA, talB, una fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa, tal como se utiliza en la presente memoria, para la fosfomanomutasa, preferiblemente manB, una manosa-1-fosfato guanosiltransferasa, preferiblemente manC, una GDP-manosa-4,6-dehidratasa, preferiblemente gmd y una GDP-L-fucosa sintasa, preferiblemente wcaG, para una fucosiltransferasa tal como se utiliza en la presente memoria, para una fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa, preferiblemente la variante activa funcional de la fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa (fbpasa) de Pisum sativum, para el transportador de eflujo de azúcar, p.ej., yberc0001_9420 o SetA y para la lactosa permeasa, p.ej., LacY.
Por consiguiente, un "fragmento funcional" de cualquiera de los genes/proteínas descritos en la presente memoria, tiene por objeto designar variantes de secuencia de los genes/proteínas que aún retienen la misma actividad o algo menor del gen o proteína del que se deriva el fragmento correspondiente.
Tal como se define en la presente memoria, el término "endógeno", en la presente memoria y generalmente dentro del campo, significa que el ácido nucleico que codifica una enzima de interés se origina desde la célula hospedante bacteriana y no se ha introducido en dicha célula hospedante, mientras que un ácido nucleico “exógeno” o “recombinante” ha sido introducido en dicha célula hospedante y no se origina desde dicha célula hospedante.
Según otra realización, el ácido nucleico/gen es homólogo o heterólogo. En la presente invención, y tal como se entiende generalmente en el campo correspondiente, la expresión "homólogo" se refiere a una secuencia de ácido nucleico/gen que codifica un producto o productos específicos y se deriva de la misma especie, en la que se inserta dicha secuencia de ácido nucleico. En consecuencia, el término "heterólogo" se refiere a una secuencia de ácido nucleico/gen que codifica un producto o productos específicos y que se deriva de una especie distinta de aquellas en las que se inserta dicha secuencia de ácido nucleico/gen.
Según otra realización del método, la célula hospedante comprende además secuencias de control que permiten la sobreexpresión controlada de secuencias de ácido nucleico/genes endógenos o exógenos/recombinantes. Tal como se ha definido anteriormente, el término "secuencia de control" que, en la presente memoria, se utiliza como sinónimo de la expresión "secuencia de control de la expresión de ácido nucleico/gen", comprende secuencias promotoras, secuencia señal o matriz de sitios de unión de factor de transcripción, secuencias que afectan la transcripción y/o traducción de una secuencia de ácido nucleico o gen unida operativamente a las secuencias de control.
La expresión "unida operativamente" tal como se utiliza en la presente memoria, significará un enlace funcional entre una secuencia de control de expresión de ácido nucleico/gen (como pueda ser un promotor, una secuencia señal o una matriz de sitios de unión de factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico o gen, en donde la secuencia de control de expresión afecta a la transcripción y/o traducción del ácido nucleico que corresponde a la segunda secuencia. Por consiguiente, el término "promotor" designa secuencias de ADN que "preceden" normalmente a un gen en un polímero de ADN y proporcionan un sitio para el inicio de la transcripción en ARNm. Las secuencias de ADN "reguladoras", también “situadas en dirección 5’” normalmente (es decir, que preceden) de un gen en un polímero de ADN dado, se unen a proteínas que determinan la frecuencia (o velocidad) de inicio transcripcional. Denominadas de forma colectiva secuencias de ADN “promotoras/reguladoras” o de “control”, estas secuencias que preceden a un gel seleccionado (o una serie de genes) en un polímero de ADN funcional cooperan para determinar si tendrá lugar o no la transcripción (o expresión final) de un gen. Las secuencias de ADN que “siguen” a un gen en un polímero de ADN y proporcionan una señal para la terminación de la transcripción en ARNm se denominan secuencias “terminadoras” de transcripción.
Tal como se ha señalado anteriormente, la secuencia de ácido nucleico/gen que se utiliza según el método de la invención puede estar comprendida p.ej., en un vector que se va a transformar/transfectar establemente en células hospedantes bacterianas.
En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico/gen se coloca bajo el control de un promotor inducible, que es un promotor que dirige la expresión de un gen cuando el nivel de expresión es alterable por factores ambientales o de desarrollo como, por ejemplo, temperatura, pH, condiciones anaeróbicas o aeróbicas, luz, factores de transcripción y químicos. Dichos promotores se denominan en la presente memoria promotores "inducibles", que permiten controlar el tiempo de expresión de las proteínas utilizadas en la presente invención. Los expertos en la técnica conocen promotores inducibles para E. coli y otras células hospedantes bacterianas.
La expresión "gen" tiene por objeto representar una secuencia de nucleótidos lineal (o una secuencia de ácido nucleico; véase lo anterior) a lo largo de un segmento de ADN que proporciona las instrucciones codificadas para la síntesis de ARN, que, cuando se traduce en proteína, conduce a la expresión de una proteína/péptido. Al igual que en el método de la invención, la proteína/péptido puede tener ciertas funciones enzimáticas. Un "ácido nucleico" se refiere a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido ya sea en forma monocatenaria o bicatenaria y, a no ser que se limite de otro modo, abarca análogos conocidos de nucleótidos naturales que se hibridan con ácidos nucleicos de una manera similar a los nucleótidos que existen de manera natural. A no ser que se indique de otro modo, una secuencia de ácido nucleico particular incluye su secuencia complementaria.
La expresión "secuencia de ácido nucleico que codifica..." o "gen(es) codificante(s)/que codifica(n)...” se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado y representa generalmente un gen que codifica un determinado polipéptido o proteína. El término incluye, sin limitarse a, ADN monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias o regiones monocatenarias, bicatenarias y de triple cadena, ARN monocatenario y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser regiones monocatenarias o, más típicamente, regiones bicatenarias o de cadena triple, o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. El término abarca también polinucleótidos que incluyen una región continua simple o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo interrumpidas por un fago integrado o una secuencia de inserción o edición) junto con regiones adicionales que también contienen secuencias codificantes y/o no codificantes.
Por consiguiente, los términos "gen" y "secuencia de ácido nucleico" se utilizan indistintamente.
Asimismo, tal como se utiliza en la presente memoria, el término "actividad" cuando se refiere a una enzima tiene por objeto comprender cualquier molécula que despliegue actividad enzimática, en particular una proteína, y que actúe como catalizador para provocar una reacción bioquímica específica al tiempo que permanece sin cambios por la reacción. En particular, se pretende que queden comprendidas en este término las proteínas con actividades enzimáticas que sean capaces convertir un sustrato en un producto.
En las reacciones enzimáticas, se convierten las moléculas al comienzo del proceso, llamadas sustratos, en diferentes moléculas, denominadas productos. Prácticamente todas las reacciones químicas en una célula biológica necesitan enzimas para tener lugar a velocidades suficientes para la vida. Dado que las enzimas son selectivas para sus sustratos y aceleran sólo unas pocas reacciones entre muchas posibilidades, el conjunto de enzimas producidas en una célula determina qué vías metabólicas tienen lugar en esa célula.
En consecuencia, cuando, según el método de la invención, se "elimina" o "reduce" la actividad de una enzima, la enzima no tiene la actividad que tiene si no se modifica la enzima o su expresión, es decir, en ese caso, se elimina o reduce la actividad en comparación con la expresión de enzima/enzima sin modificar.
Los autores de la presente invención pudieron proporcionar un método mediante el cual se pudieron producir oligosacáridos fucosilados con una titulación del producto superior a 100 g/l.
Según la invención, se elimina o reduce la actividad de una enzima de conversión en fructosa-6-fosfato, que está a un nivel regular en la célula hospedante sin modificar, cuando es aplicable. Cuando se utiliza E. coli como célula hospedante, es preferible en el método según la invención seleccionar la enzima de conversión en fructosa-6-fosfato del grupo que consiste en fosfofructoquinasa, preferiblemente fosfofructoquinasa A (PfKA), glucosa- 6-fosfato isomerasa, fructosa-6-fosfato aldolasa, una transcetolasa, preferiblemente tktA, tktB o una transaldolasa, preferiblemente talA, talB, enzima de conversión en fructosa-6-fosfato, que de lo contrario está presente y activa en la célula hospedante de E. coli sin modificar, que ha sido modificada de modo que se elimina o se reduce su actividad.
PfkA fosforila eficazmente la fructosa-6-fosfato en fructosa-1,6-bisfosfato. La fructosa-6-fosfato es el punto de ramificación en las vías glicolítica y gluconeogénica, y en la síntesis de GDP-L-fucosa que se inicia con la isomerización catalizada por ManA de fructosa-6-fosfato en manosa-6-fosfato. Al cultivar E. coli sobre un sustrato gluconeogénico como el glicerol, la fosforilación de fructosa-6-fosfato mediante PfkA es una reacción de rutina de alto consumo de ATP y, además, compite con ManA por el sustrato.
Según una realización del método de la invención, la enzima generadora de fructosa-6-fosfato es fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa, cuya actividad aumenta para aumentar la cantidad de fructosa-6-fosfato.
Según otra realización del método de la invención, se sobreexpresa al menos un gen que codifica una enzima necesaria para la síntesis de novo de GDP-fucosa en la célula hospedante.
La GDP-fucosa, tal como se ha mencionado anteriormente, sirve como donador de L-fucosa para la reacción de la fucosiltransferasa que transfiere la L-fucosa a un sustrato aceptor para formar el oligosacárido fucosilado.
Habiendo modificado genéticamente la célula hospedante procariota para producir internamente GDP-fucosa, no se necesita una adición externa de L-fucosa, que puede convertirse en GDP-fucosa a través de la vía de recuperación, ya que la célula hospedante produce eficazmente GDP-fucosa necesaria para el proceso de fucosilación del oligosacárido deseado.
El al menos un gen que codifica una enzima necesaria para la síntesis de novo de GDP-fucosa y que se sobreexpresa en la célula hospedante puede ser un gen endógeno o un gen exógeno, que puede integrarse en el genoma de la célula hospedante.
En una realización del método de la invención, los genes exógenos que codifican las enzimas necesarias para la síntesis de novo de GDP-fucosa son un gen que codifica una fosfomanomutasa, preferiblemente manB, un gen que codifica una manosa-1-fosfato guanosiltransferasa, preferiblemente manC, un gen que codifica una GDP-manosa-4,6-deshidratasa, preferiblemente gmd, y un gen que codifica una GDP-L-fucosa sintasa, preferiblemente wcaG.
Según una realización del método y tal como se ha mencionado anteriormente, se selecciona al menos un gen exógeno que codifica una fucosiltransferasa de entre un gen que expresa una proteína que presenta actividad alfa-1,2-fucosiltransferasa y/o actividad alfa-1,3-fucosiltransferasa. En conexión con esto, se prefiere particularmente seleccionar la alfa-1,2-fucosiltransferasa del grupo que consiste en wbgL de E. coli: O126 o la alfa-1,2-fucosiltransferasa codificada por el gen fucT 2 de Helicobacter pylori, y seleccionar el gen que codifica una alfa-1,3-fucosiltransferasa del grupo que consiste en alfa-1,3-fucosiltransferasas de la especie Akkermansia muciniphila y Bacteroides fragilis, Helicobacter pylori o Helicobacter hepaticus.
Según otra realización del método, se prefiere modificar genéticamente la célula hospedante adicionalmente: (i) para expresar un gen, preferiblemente un gen exógeno, que codifica una proteína que permite o facilita la exportación del oligosacárido fucosilado deseado al medio de cultivo; y/o (ii) para expresar un gen exógeno que codifica una L-fucoquinasa/L-fucosa 1-fosfato guanililtransferasa bifuncional; y/o (iii) para presentar genes mutados o suprimidos fucI y fucK lo cual conduce a la eliminación o reducción de las actividades de la L-fucosa-isomerasa (FucI) y L-fuculosaquinasa (FucK), (iv) y/o para tener inactivados o alterados genes que codifican enzimas de la síntesis del ácido colónico; y/o (v) para expresar, preferiblemente sobreexpresar, una permeasa endógena y/o exógena para la importación de lactosa; y/o (vi) para tener inactivados o suprimidos genes de beta-galactosidasa endógenos; y/o (vii) para expresar un gen que codifica la beta-galactosidasa, preferiblemente una beta-galactosidasa regulable exógena; y/o (viii) para sobreexpresar un gen endógeno y/o exógeno que codifica una fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa.
Con la modificación genética adicional tal como se ha indicado anteriormente, podría mejorarse aún más el método para producir un oligosacárido fucosilado.
Con la supresión o inactivación de los genes que codifican L-fucosa isomerasa (p.ej., FucI) y L-fuculosa-quinasa (p.ej., FucK), se puede evitar el catabolismo de la fucosa intracelular.
Con la alteración, supresión o inactivación de genes que codifican enzimas de la biosíntesis del ácido colónico (p. ej., en E. co licomo célula hospedante, el gen wcaJque cataliza la primera etapa de la síntesis de ácido colánico), se evita la producción intracelular de ácido colánico, que de lo contrario podría competir con la reacción de fucosiltransferasa por el sustrato GDP-L-fucosa.
Según una realización preferida, la proteína que permite o facilita la exportación del oligosacárido fucosilado deseado al medio de cultivo es un transportador de eflujo de azúcar seleccionado preferiblemente de entre yberc0001_9420 y SetA de E. coli.
Según una realización preferida, el gen que codifica una L-fucoquinasa/L-fucosa 1-fosfato guanililtransferasa bifuncional es fkp de Bacteroides fragilis.
Según una realización preferida, la fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa está codificada por un gen que es una variante activa funcional de la fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa (fbpasa ) de Pisum sativum.
Según una realización preferida, la lactosa permeasa es LacY de E. coli.
Con la expresión de un gen que codifica una L-fucoquinasa/L-fucosa 1-fosfato guanililtransferasa bifuncional que cataliza la síntesis de GDP-L-fucosa, p. ej., del gen fkp de Bacteroides fragilis, se evita la formación de L-fucosa libre que podría acumularse como un subproducto tras la hidrólisis de GDP-L-fucosa, rescatando así la L-fucosa libre para la síntesis del oligosacárido fucosilado deseado.
Según una realización preferida, los genes exógenos para metabolizar galactosa son los genes que comprenden el operón galETKM y/o galP de E. coli.
Según una realización del método de la invención, los genes en los que se modifica o con los que se modifican la célula hospedante son genes endógenos o exógenos.
A lo largo de la descripción, y aplicándose para cada gen/ácido nucleico que se ha introducido exógenamente en la célula hospedante, se prefiere sobreexpresar al menos uno de los genes exógenos, preferiblemente integrados en el genoma de la célula hospedante, preferiblemente tras la inducción endógena o exógena, o de manera constitutiva. Según el método de la invención, se sobreexpresa al menos un gen que codifica la síntesis de novo de GDP-fucosa en la célula hospedante, tal como se define en las reivindicaciones.
Por consiguiente, se prefiere que esté(n) sobreexpresado(s) al menos uno de los siguientes genes: (i) genes exógenos que codifican las enzimas necesarias para la síntesis de novo de GDP-fucosa, tal como se requiere según las reivindicaciones; (ii) un gen exógeno que codifica una fucosiltransferasa; (iii) un gen exógeno que codifica un transportador de eflujo de azúcar; (iv) un gen exógeno que codifica una L-fucoquinasa/L-fucosa 1-fosfato guanililtransferasa bifuncional; (v) una lactosa permeasa; (vi) un gen regulable exógeno que codifica una betagalactosidasa; y/o (vii) genes exógenos para metabolizar galactosa; (viii) un gen exógeno que codifica una fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa; la sobreexpresión se puede efectuar, p. ej., por medio de un promotor regulable que inicia la transcripción del/los gen(es), ya sea en un determinado punto temporal o período durante el cultivo o durante todo el período de cultivo.
Asimismo, según una realización preferida, se integran en el genoma de la célula hospedante los genes exógenos que se van a introducir en la célula hospedante empleados en el método según la invención.
Asimismo, según un aspecto del método de la invención, y a no ser que se defina de otro modo, los genes en los que se modifica o con los que se modifica la célula hospedante también pueden ser genes endógenos, y su expresión se puede potenciar o aumentar o sobreexpresar o, por el contrario, eliminar o reducir.
Con la inactivación o supresión del gen o los genes endógenos de beta-galactosidasa, se evita la degradación de la lactosa añadida externamente; sin embargo, dado que es deseable degradar la lactosa que no se metaboliza y que de otro modo impediría la purificación del oligosacárido fucosilado deseado, también se prefiere que se sobreexprese un gen regulable exógeno que codifica una beta-galactosidasa o una forma mutada de la beta-galactosidasa en la célula hospedante. P. ej., puede expresarse el fragmento lacZQ del gen lacZ, cuya expresión, puede regularse p. ej., por medio de un represor, p. ej., mediante un represor transcripcional sensible a la temperatura, p. ej. cl857. En este caso, la síntesis del fragmento Q de beta-galactosidasa puede iniciarse elevando la temperatura a 42°C.
Un represor, tal como se entiende en la presente invención y generalmente en el estado de la técnica, es una proteína de unión a ADN o ARN que inhibe la expresión de uno o más genes uniéndose al operador o silenciadores asociados. Un represor de unión a ADN bloquea la fijación de la ARN polimerasa al promotor, evitando así la transcripción de los genes en ARN mensajero.
Como promotor para el fragmento alfa exógeno beta-galactosidasa, por ejemplo, puede utilizarse el promotor de PgbA BL21 (DE3) de E. coli. Los fragmentos a y Q de beta-galactosidasa se combinan para dar como resultado una betagalactosidasa activa en la célula.
En una realización preferida, se proporciona la lactosa añadiendo lactosa desde el inicio del cultivo en una concentración de al menos 5 mM, más preferiblemente en una concentración de más de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 , 90 o 100 mM, o incluso más en una concentración de 300 mM o superior a 300, o 400 mM.
Según incluso otra realización, la lactosa se proporciona añadiendo lactosa al medio de cultivo en una concentración, tal que durante la fase de producción del cultivo, se obtiene una concentración de lactosa de al menos 5 mM, más preferiblemente de al menos 10, 20 o 30 mM.
Alternativamente, se puede producir lactosa mediante la célula hospedante intracelularmente, tal como se describe en la patente europea EP 1927316 A1.
En el método según la invención, se prefiere cultivar las células hospedantes durante al menos aproximadamente 60, 80, 100 o aproximadamente 120 horas o de manera continua.
Por lo tanto, según un aspecto de la invención, es decir, en un método continuo, se añade constantemente una fuente de carbono al medio durante la etapa de cultivo de la célula hospedante. Al añadir de forma constante la fuente de carbono durante la etapa de cultivo, se consigue una producción constante y eficaz del oligosacárido.
Según otro aspecto, el método según la invención es o incluye un método de fermentación de alimentación discontinua, ya sea con un volumen constante de cultivo de alimentación discontinua, en el que se introduce el sustrato sin diluir el cultivo, o un volumen variable de cultivo de alimentación discontinua, en el que cambia el volumen de fermentación con el tiempo de fermentación debido a la alimentación del sustrato.
Tal como se ha mencionado anteriormente, la presente invención también se refiere a un método para la producción de un oligosacárido fucosilado utilizando una célula hospedante procariota modificada genéticamente, célula hospedante que ha sido modificada genéticamente de tal manera que (i) se elimina o se reduce la actividad de una enzima de conversión en fructosa-6-fosfato, que en la célula hospedante no modificada está en un nivel regular; (ii) al menos se sobreexpresa un gen que codifica una enzima necesaria para la síntesis de novo de GDP-fucosa; (iii) se expresa en la célula un gen exógeno que codifica una fucosiltransferasa, preferiblemente un gen que codifica una alfa-1,2-fucosiltransferasa y/o una alfa-1,3-fucosiltransferasa.
Tal como se ha mencionado para el método anterior, la célula hospedante se selecciona preferiblemente de entre una cepa de Escherichia coli, una cepa de Lactobacillus o una cepa de Corynebacterium.
En lo que concierne a la célula hospedante para su uso en el método, se aumenta la cantidad intracelular de fructosa-6-fosfato (i) reduciendo o eliminando la actividad de una enzima de conversión en fructosa-6-fosfato que se selecciona del grupo fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, fructosa-6-fosfato aldolasa, una transcetolasa, p. ej., tktA, tktB o una transaldolasa, p. ej. , talA , talB, o (ii) aumentando la actividad de fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa.
En una realización preferida, se sobreexpresan los genes que codifican las enzimas necesarias para la síntesis de novo de GDP-fucosa. Según la invención, se sobreexpresa al menos uno de dichos genes.
En incluso otra realización preferida, los genes exógenos que codifican al menos una fucosiltransferasa son genes que codifican alfa-1,2-fucosiltransferasas y/o alfa-1,3-fucosiltransferasas y se seleccionan de entre wbgL de E. coli O126 o fucT2de Helicobacterpylori, en relación con alfa-1,2-fucosiltransferasas, y genes de las especies Akkermansia muciniphila, Bacteroides fragilis, Helicobacter pylori o Helicobacter hepaticus, en relación con alfa-1,3-fucosiltransferasas.
Según una realización del método, se modifica genéticamente la célula hospedante adicionalmente, tal como se ha descrito anteriormente (iv) para expresar un gen exógeno que codifica un transportador de eflujo de azúcar; y/o (v) para expresar un gen exógeno que codifica una L-fucoquinasa/L-fucosa 1-fosfato guanililtransferasa bifuncional; y/o (vi) para tener inactivados o suprimidos genes que codifican una L-fucosa-isomerasa y L-fuculosa-quinasa; y/o (vii) para tener inactivados o alterados genes que codifican la UDP-glucosa: undecaprenil fosfato glucosa-1-fosfato transferasa; y/o (viii) para expresar una permeasa de lactosa exógena; y/o (ix) tener inactivados o suprimidos genes de beta-galactosidasa endógenos; y/o (x) para expresar un gen regulable exógeno que codifica una betagalactosidasa; y/o (xi) para expresar genes exógenos para metabolizar galactosa; y/o para expresar un gen exógeno que codifica una fructosa-1,6-bifosfato fosfatasa.
La presente invención también se refiere al uso de la célula hospedante procariota modificada genéticamente según la invención para la producción de un oligosacárido fucosilado.
Breve descripción de las figuras
Figura 1 Ejemplo de ilustración esquemática de una célula hospedante modificada genéticamente para su uso en el método según la invención.
Figura 2 Análisis HPLC de sobrenadantes de cultivos de crecimiento en glicerol de cepas de E. c o lique producen 2’-fucosil-lactosa por HPLC; y
Figura 3 Nos. ID SEQ 1 a 7
Descripción detallada de las figuras
La Figura 1 muestra un ejemplo ilustrativo de célula hospedante para su empleo en el método según la invención, con ejemplos de vías para la fermentación de los ejemplos de oligosacáridos fucosilados, representándose 2’-fucosillactosa. En la Figura 1, se muestra un ejemplo de célula hospedante bacteriana que ha sido modificada genéticamente con respecto a la producción de 2’-fucosil-lactosa.
Tal como se puede observar en la Figura 1, se utiliza glicerol como ejemplo de fuente de carbono, al tiempo que se añade externamente lactosa. Se transporta lactosa a la célula hospedante a través de una permeasa (p. ej., LacY). Glicerol accede a la célula hospedante por difusión facilitada a través de GIpF. Dentro de la célula hospedante procariota, glicerol se convierte en gliceraldehído-3-fosfato, que se convierte en fructosa-6-fosfato, (i) favorecido por la sobreexpresión de un gen exógeno que codifica Fbpasa e (ii) inhibiéndose la reacción inversa por inactivación de fosfofructoquinasa A (PfkA). A través de la sobreexpresión de enzimas exógenas necesaria para la síntesis de novo de GDP-fucosa, es decir, fosfomanomutasa ManB, manosa-1-fosfato guanosiltransferasa ManC, GDP-manosa-4,6-dehidratasa Gmd y GDP-L-fucosa sintasa WcaG, se produce GDP-L-fucosa.
En la siguiente etapa, GDP-L-fucosa, por acción de una alfa-1,2-fucosiltransferasa, p. ej., WbgL, reacciona con la lactosa internalizada para producir 2-fucosilactosa, que se exporta a través de un transportador de eflujo, p. ej., TPYb, al medio en el que se cultiva la célula hospedante.
En la Figura 2, se muestran los resultados de los análisis de HPLC de sobrenadantes desde cultivos desarrollados en glicerol de cepas de E. coli por HPLC que produce 2’-fucosil-lactosa.
En la figura 2 se representa el perfil de HPLC del caldo de cultivo de fermentación para la cepa que produce 2’-fucosillactosa que alberga el gen que codifica el transportador heterólogo yberc0001_9420 (negro) y el perfil de HPLC del caldo de cultivo de fermentación de la misma cepa tras la supresión del gen que codifica el transportador heterólogo yberc0001_9420 (gris). Se llevó a cabo la fermentación de ambas cepas durante 111 horas a 28°C, utilizando glicerol como fuente de carbono y de energía.
Ejemplo 1
Obtención por ingeniería genética de una cepa de E. coli BL21 (DE3) para la producción de 2'-fucosil-lactosa
Utilizando E. coli BL21 (DE3) como hospedante parental se construyó una cepa para la producción de 2'-fucosil-lactosa en un planteamiento de biosíntesis de célula entera. La ingeniería genómica de la cepa incluyó eventos de alteración y supresión de gen de los genes heterólogos.
Dado que 2’-fucosil-lactosa se sintetiza a partir de lactosa, que se aplica al cultivo bacteriano, y a partir de GDP-L-fucosa que se produce a partir de células vivas, primero se inactivó la copia de tipo silvestre del gen lacZ que codifica p-galactosidasa endógena por mutagénesis utilizando oligonucleótidos mal emparejados (véase Ellis et al., "High efficiency mutagenesis, repair and engineering of chromosomal DNA using single-stranded oligonucleotides", Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 98: 6742-6746 (2001). Utilizando el mismo método, se alteró el gen para la arabinosaisomerasa araA.
Se introdujo un fragmento del gen lacZQ bajo el control del represor transcripcional cI857 sensible a la temperatura. El gen de fragmento lacZa se expresa bajo el control del promotor PgbA de E. coli BL21 (DE3) en la cepa, lo cual revela una cepa LacZ+.
Se realizaron supresiones genómicas por recombinación mediada por A Red según el método de Datsenko y Warner (véase "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products'', Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 97:6640-6645 (2000)). Se han suprimido los genes fu c Iy fucK, que codifican la L-fucosa isomerasa y la L-fuculosa quinasa, respectivamente para impedir la degradación de L-fucosa. Asimismo, se suprimieron los genes wzxC-wcaJ. WcaJ codifica probablemente una UDP-glucosa:undecaprenil fosfato glucosa-1-fosfato transferasa que cataliza la primera etapa de la síntesis de ácido colánico (véase Stevenson et al., "Organization of the Escherichia coli K-12 gene cluster responsible for production of the extracellular polysaccharide colonic acid", J. Bacteriol. 178:4885-4893; (1996)); la producción de ácido colánico competiría por GDP-fucosa con la reacción de fucusiltransferasa.
Se llevó a cabo la integración genómica de genes heterólogos por transposición. Se integraron grandes grupos de genes en el genoma mediado por el mutante C9 hiperactivo de la transposasa mariner H im arl (véase Lampe et al., "Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon", Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 96:11428-11433 (1999)), que se insertó en el plásmido pEcomar bajo el control transcripcional del promotor Para. Para potenciar la síntesis de novo de GDP-fucosa, se sobreexpresaron genes que codifican fosfomanomutasa (manB), manosa-1-fosfato guanosiltransferasa (manC), GDP-manosa-4,6-dehidratasa (gmd) y GDP-L-fucosa sintasa (wcaG) de E. coli K12 DH5a en la cepa E. coli BL21 (DE3); se estableció el operón manCB bajo el control del promotor constitutivo Ptet, el operón gmd, wcaG se transcribe a partir del promotor constitutivo Pt5. Se insertó el casete de transposón <PtetmanCB-PT5-gmd, wcaG-FRT-dhfr-FRT> (SEQ Id No. 1), que incluye el gen para dihidrofolato reductasa para resistencia a trimetoprim, flanqueado por repeticiones de terminal invertida específicamente reconocidas por el elemento de tipo mariner Himar1 transposasa en el genoma de E. coli a partir de pEcomar C9-manCB-gmd, wcaG-dhfr.
Para la integración cromosómica de genes simples, se utilizó transposasa EZ-Tn5™ (Epicentre, EE.UU.). Para producir transposomas EZ-Tn5 se amplificó el gen de interés junto con un casete de resistencia a antibióticos flanqueado con sitio FRT con cebadores que llevaban en ambos sitios los sitios de reconocimiento de extremo mosaico de 19 pb (5'-CTGTCTCTTATACACATCT (SEQ ID No. 8)) para transposasa EZ-Tn5. Utilizando la transposasa EZ-Tn5™, se integraron el gen para el importador de lactosa LacY de E. coli K12 TG1 (no. acc. ABN72583), el gen de 2-fucosiltransferasa wbgL de E. coli:O126 (no. acc. ADN43847) y el gen yberc0001_9420 que codifica un transportador de eflujo de azúcar de la superfamilia de facilitadores principales de Yersinia bercovieri ATCC 43970 (no. acc. EEQ08298) utilizando los correspondientes casetes de integración: <Ptet-lacY-FRT-aadA-FRT> (SEQ ID No. 2), <PtetwbgLco-FRT-neo-FRT> (SEQ iD No. 3) y <Ptet- yberc0001_9420co-FRT-cat-FRT> (SEQ ID No. 4), cepa productora. Se sintetizaron sintéticamente los genes wbgL e yberc0001_9420 y se sometieron a optimización de codones según GenScript Cooperation (EE.UU.). Después de la integración con éxito del gen lacY, se eliminó el gen de resistencia de clones resistentes a estreptomicina mediante la FLP recombinasa codificada en el plásmido pCP20 (Datsenko y Warner, "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products", Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 97:6640-6645 (2000)).
Dado que E. coli BL21 (DE3) carece de operón gal funcional, se integró una copia nativamente regulada del operón galETKMde E. coli K en la cepa B por transposición EZ utilizando el casete de integración <Pgal-galE-galT-galK-galM> (SEQ ID No. 5). Se seleccionaron los integrantes de agar MacConkey que contenía 1% galactosa como colonias rojas. La cepa resultante es capaz de metabolizar los monosacáridos glucosa y galactosa que se originan a partir de la hidrólisis de lactosa.
Ejemplo 2
Verificación de exportación de 2'-fucosil-lactosa mejorada mediante transportador de eflujo de azúcar de Yersinia bercovieri ATCC 43970
Inactivación de yberc0001 9420
Para demostrar la funcionalidad del transportador de azúcar heterólogo de Yersinia bercovieri ATCC 43970, se suprimió el gen yberc0001_9420 de la cepa E. coli BL21 (DE3) lacZ~, araA-, fucl-, fucK-, wcaJ-, que contenía integraciones cromosómicas de manB, manC, gmd, wcaG, lacY, wbgL; e yberc0001_9420 por recombinación homóloga según Datsenko y Wanner (2000; véase lo anterior) utilizando el casete de resistencia a gentamicina aacC1 del plásmido pBBR-MCS5 (Kovach, Elzer et al. 1995, "Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes", Gene 166, 175-176), que se insertó en el gen yberc0001_9420, cepa productora Ayberc0001_9420.
Condiciones de cultivo para la producción de 2'-fucosil-lactosa
Se cultivaron la cepa E. coli BL21 (DE3) que alberga el exportador heterólogo yberc0001_9420 y la cepa Ayberc0001_9420 a 28°C en fermentadores de 3 litros (New Brunswick, Edison, EE.UU.) partiendo de 800 ml de medio de sales minerales que contenía 7 g/l NH4H2PO4, 7 g/l K2HPO4, 2 g/l KOH, 0,3 g/l ácido cítrico, 2 g/l MgSO4 x 7H2O y 0,015 g/l CaCl2 x 6H2O, suplementado con 1 ml/l de disolución de elemento traza (54,4 g/l citrato férrico de amonio, 9,8 g/l MnCl2 x 4H2O, 1,6 g/l CoCl2 x 6H2O, 1 g/l CuCl2 x 2H2O, 1,9 g/l H3BO3, 9 g/l ZnSO4 x 7H2O, 1,1 g/l Na2MoO4 x 2H2O, 1,5 g/l Na2SeO3, 1,5 g/l NiSO4 x 6H2O) que contenía 1,5% de glicerol como fuente de carbono y los antibióticos trimetoprim 10 gg/ml y kanamicina 15 gg/ml. Se inició el cultivo con 2,5% (v/v) de inóculo de un pre-cultivo desarrollado en el mismo medio con contenido en glicerol. Se añadió lactosa como aceptor en la reacción de fucosiltransferasa en el espacio de siete horas para obtener una concentración de 30 mM en el cultivo, partiendo de una DO660nm de aproximadamente 10. A continuación se ajustó manualmente la lactosa para mantener el exceso de la molécula aceptora; se añadió glicerol de forma continua.
Análisis de sobrenadante de cultivo y detección de 2'-fucosil-lactosa por HPLC
Se llevó a cabo el análisis por cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) utilizando un detector del índice de difracción (RID-10A) (Shimadzu, Alemania) y un carbohidrato ReproSil, 5 gm (250 mm x 4,6 mm) (Dr. Maisch GmbH, Alemania) conectado a un sistema de HPLC (Shimadzu, Alemania). Se llevó a cabo la elución isocráticamente con acetonitrilo: H2O (68/32 (v/v)) como eluyente a 35°C y un caudal de 1,4 ml/min. Se aplicaron 20 gl de la muestra a la columna. Se calculó la concentración de 2’-fucosil-lactosa a partir de una curva patrón. Por lo tanto, se añadió 10% (v/v) de sacarosa 100 mM a las muestras de HPLC como patrón interno antes de su filtración (0,22 gm tamaño de poro) y se eliminó por extracción en fase sólida en una matriz de intercambio iónico (Strata ABW, Phenomenex).
Detección de 2'-fucosil-lactosa en sobrenadantes de cultivos de E. coli BL21 (DE3)
Una vez transcurridas 111 h de fermentación a 28°C en medio de cultivo de sales minerales con glicerol como fuente de carbono, se detectaron por HPLC 73 mM (35,6 g/l) y 25 mM (12,2 g/l) de 2'-fucosil-lactosa en el sobrenadante de cultivo de cepas que contenían y carecían de gen transportador yberc0001_9420, véase Figura 2: En la Figura 2, se representa el perfil de HPLC del caldo de cultivo de fermentación de una cepa que produce 2’-fucosil-lactosa que alberga el gen que codifica el transportador heterólogo yberc0001_9420 (negro) y el perfil de HPLC del caldo de fermentación de la misma cepa después de la supresión del gen que codifica el transportador heterólogo yberc0001_9420 (gris). La supresión del exportador de azúcar heterólogo yberc0001_9420 en la cepa disminuye la cantidad de 2’-fucosil-lactosa detectada en el sobrenadante. Esto da evidencia de que efectivamente la proteína transportadora potencia la producción de 2’-fucosil-lactosa por un transporte más rápido del trisacárido fuera de la célula, ya que el fondo genético a pesar del gen yberc0001_9420 es idéntico en ambas cepas. Además, se consiguió una menor densidad celular en las células que carecían de exportador de 2’-fucosil-lactosa, probablemente debido a la tensión osmótica causada por una fuerte acumulación de azúcar dentro de las células. Tal como se muestra en la Figura 2, la cantidad de 2',3-difucosil-lactosa detectada en el cultivo de Ayberc0001_9420 es aproximadamente el doble que en el caldo de cultivo de la cepa original. La mayor producción de 2',3-difucosil-lactosa, cuando se transfiere L-fucosa a 2’-fucosil-lactosa a través de una reacción catalizada con fucosiltransferasa, también indica concentraciones intracelulares más altas de la molécula aceptora 2'-fucosil-lactosa en la cepa en la que se ha inactivado yberc0001_9420 en comparación con la cepa de sobreexpresión de yberc0001_9420.
En la Figura 2, las líneas más claras, es decir, las líneas grises, presentan el sobrenadante Ayberc0001_9420 de la cepa de E. coli BL21 (DE3), Ayberc0001_9420, las líneas negras presentan el sobrenadante de cultivo de E. coli BL21 (DE3) que contiene yberc0001_9420. Se tomaron muestras al cabo de 111 h de fermentación a 28°C en medio de sales minerales utilizando glicerol como fuente de carbono.
Ejemplo 3
Producción de 2'-fucosil-lactosa en un proceso fermentativo
Se llevaron a cabo fermentaciones en fermentadores de 3 litros a 30°C y a un pH 7,0; se reguló el pH por titulación con 25% amoníaco. Se cultivó la cepa descrita en el ejemplo 2 en el medio de sales minerales descrito en el ejemplo 2 utilizando glicerol como fuente de carbono y energía. Se inoculó el fermentador con un volumen de partida de 1 l con un pre-cultivo cultivado en el mismo medio. Una vez consumido un 2% del glicerol contenido dentro de la tanda, se introdujo glicerol (60% v/v) de forma continua. Se añadió lactosa en una concentración de 0,66 M en tres porciones (en el intervalo de una hora) de 10 ml cada una cuando se alcanzó una DO600nm de 6. Después, se proporcionó la lactosa en un flujo continuo para retener una concentración de lactosa de al menos 10 mM en el fermentador. Al cabo de 86 h de cultivo, se alcanzó una titulación final de 91,3 mM (44,6 g/l) de 2'-fucosil-lactosa. Al cambiar la temperatura a 42°C, se expresa el gen de p-galactosidasa y se metabolizan lactosa y sus productos de degradación glucosa y galactosa mediante la cepa de producción de 2'-fucosil-lactosa.
Ejemplo 4
Análisis de HPLC de sobrenadante de cultivo
Se llevó a cabo el análisis de HPLC utilizando un detector del índice de refracción (RID-10A) (Shimadzu, Alemania) y una columna Waters XBridge Amida 3,5 gm (250 x 4,6 mm) (Eschborn, Alemania) conectada a un sistema de HPLC (Shimadzu, Alemania). Se llevó a cabo la elución isocráticamente con 30% A: 50% (v/v) ACN en H2Odd, 0,1% (v/v) NH4OH y 70% B: 80% (v/v) ACN en H2Odd, 0,1% (v/v) NH4OH (v/v) como eluyente a 35°C y a un caudal de 1,4 ml/min. Se aplicaron 10 gl de la muestra a la columna y se calculó la concentración de 2’-fucosil-lactosa a partir de la curva patrón. Por lo tanto, se añadió 10% (v/v) de disolución de sacarosa 100 mM a las muestras de HPLC como patrón interno antes de su filtración (0,22 gm tamaño de poro) y eliminó por extracción en fase sólida en una matriz de intercambio iónico (Strata ABW, Phenomenex). También se detectaron subproductos como L-fucosa, 3-fucosil-lactosa, 2',3-difucosil-lactosa y fucosilgalactosa utilizando las mismas condiciones de análisis.
Ejemplo 5
Mejora de la cepa de producción de 2'-fucosil-lactosa por ingeniería metabólica
Se consiguió una mayor mejora con respecto a la síntesis de 2’-fucosil-lactosa a través de la cepa de E. coli por supresión del gen pfkA gene, que codifica la fosfofructoquinasa A. Cuando se cultiva E. coli sobre un sustrato gluconeogénico como glicerol, la fosforilación de fructosa-6-fosfato mediante Pfka es una reacción de rutina que consume mucho ATP y, además, se completa con ManA para el sustrato. Se suprimió el gen pfkA por recombinación homóloga según Datsenko y Wanner (2000, véase lo anterior) utilizando un casete de resistencia a gentamicina (aacCI) que estaba flanqueado por sitios fox71/66 (véase Lambert, Bongers et al. 2007 "Cre-lox-based system for multiple gene deletions and selectable-marker removal in Lactobacillus plantarum", Appl. Environ. Microbial. 73, 1126­ 113). Tras la supresión con éxito del gen pfkA, se eliminó el gen de resistencia a antibiótico del genoma de E. coli utilizando una recombinasa Cre (véase Abremski, Hoess et al. 1983, "Studies on the properties of P1 site-specific recombination: evidence for topologically unlinked products following recombination'', Cell 32, 1301-1311) que se clonó bajo el control del promotor Para en el armazón de pKD46 (véase Datsenko y Wanner, 2000).
Se demostró para diferentes fucosiltransferasas, además de la actividad transferasa, una actividad GDP-L-fucosa hidrolasa. Asimismo, se demostró esta actividad hidrolítica para wbgL, la alfa-1,2-fucosiltransferasa utilizada en este caso para la síntesis de 2'-fucosil-lactosa (véase patente europea EP3050973 A1). Para rescatar L-fucosa libre para la producción de 2’-fucosil-lactosa y para eliminar la L-fucosa contaminante del caldo de cultivo, se integró cromosómicamente el gen fkp, que codifica la L-fucoquinasa/L-fucosa 1-fosfato guanililtransferasa bifuncional de Bacteroides fragilis, bajo el control transcripcional del promotor Ptet junto con el gen aacC1 flanqueado por lox71/66 en la cepa descrita en el ejemplo 1 por transposición utilizando transposasa EZ-Tn5™, <Ptet-fkp-lox-aacC1-lox> (Seq ID 6). Tras la integración con éxito, se eliminó el gen de resistencia a gentamicina del genoma, tal como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo 6
Proceso de fermentación optimizado para la producción de 2'-fucosil-lactosa
Utilizando un medio de sales minerales optimizado que contenía 3 g/l KH2PO4, 12 g/l K2HPO4, 5 g/l (NH4)2SO4, 0,3 g/l ácido cítrico, 2 g/l MgSO4 x 7H2O, 0,1 g/l NaCl y 0,015 g/l CaCl2 x 6H2O con 1 ml/l de disolución de elemento traza (54,4 g/l citrato férrico de amonio, 9,8 g/l MnCl2 x 4H2O, 1,6 g/l CoCl2 x 6H2O, 1 g/l CuCl2 x 2H2O, 1,9 g/1H3BO3, 9 g/l ZnSO4 x 7H2O, 1,1 g/l Na2MoO4 x 2H2O, 1,5 g/l Na2SeO3, 1,5 g/l NiSO4 x 6H2O) y 2% glicerol como tanda de fuente de carbono, se cultivó la cepa E. coli descrita en el ejemplo 5 en un fermentador de 3 litros a 33°C. Se mantuvo el pH a 7,0 por titulación con 25% de amoníaco. Se inoculó en el fermentador a una DO600nm de 0,1 un precultivo desarrollado en el mismo medio. Se añadió lactosa cuando el cultivo obtuvo una DO600nm de 5 para obtener una concentración de 30 mM. Se mantuvo una concentración de 20-30 mM de lactosa a lo largo de todo el proceso de fermentación, regulado según los análisis de HPLC. Se inició la alimentación de glicerol (60% v/v) una vez que se hubo consumido el glicerol de la tanda con caudales de 4,5 ml/l/h durante 20 horas, seguido de alimentación durante 33 horas con 5,7 ml/l/h y 18 horas para 7,1 ml/l/h durante un período de 18 horas (las velocidades de alimentación son en relación con el volumen de partida). Globalmente, al cabo de 93 h se obtuvo una titulación de 2'-fucosil-lactosa de 106,5 g/l (217 mM).
Ejemplo 7
Obtención por ingeniería genética de una cepa de producción 2'-fucosil-lactosa mejorada por estimulación metabólica
Para mejorar el flujo de la fuente de carbono metabolizada a través de la vía gluconeogénica a partir de triosa-fosfatos en fructosa-6-fosfato para alimentar la biosíntesis de GDP-L-fucosa, se sobreexpresaron genes que codifican la fructosa-1,6-bisfosfato aldolasa (fbaB) y una fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa (fbpasa) heteróloga de Pisum sativum en la cepa descrita en el ejemplo 5. Se condensó el gen fbaB de E. coli BL21 (DE3) con el promotor Ptet. La actividad de la FBPasa de P. sativum cloroplásica es regulada alostéricamente mediante un intercambio disulfuro-ditiol debido a la reducción mediante tiorredoxinas. El intercambio del resto 153 cisteína en serina tiene como resultado una enzima constitutivamente activa. Se adquirió con optimización de codones el gen que codifica la FBPasa cloroplástica de P. sativum (No. acc. AAD10213) para la expresión en E. coli, se etiquetó N-terminalmente con una etiqueta hexahistidina y se modificó para codificar la variante C153S de la enzima desde Genescript. Se transcribe el gen fbpasa desde un promotor T7. Se utilizó el casete <Ptet-fbaB-PT7-His6-fbpasa-lox-aacC1-lox> (Seq ID 7) para la integración mediada por transposasa EZ-Tn5™ en la cepa hospedante. Tras la eliminación del gen de resistencia a gentamicina del genoma de E. coli, se utilizó la cepa para la producción de 2'-fucosil-lactosa.
Ejemplo 8
Producción de 150 g/l 2'-fucosil-lactosa mediante un proceso de fermentación
Se cultivó la cepa de producción de 2’-fucosil-lactosa modificada genéticamente, tal como se ha descrito en el ejemplo 7, en el mismo medio a 33°C, tal como se ha descrito en el ejemplo 5. Adicionalmente, se añadieron a la tanda de glicerol al 2% 60 mM de lactosa inicialmente al medio de fermentación. Se inició la alimentación continua de lactosa con 0,66 M de lactosa a una DO600nm de aproximadamente 10. Adicionalmente, se llevó a cabo la suplementación de

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. método para la producción de oligosacáridos fucosilados utilizando una célula hospedante procariota modificada genéticamente, comprendiendo el método las etapas de:
- proporcionar una célula hospedante procariota que ha sido modificada genéticamente, de modo que al menos (i) se reduce o se elimina la actividad de una enzima de conversión en fructosa-6-fosfato, que en la célula hospedante sin modificar tiene un nivel regular, en donde dicha enzima de conversión en fructosa-6-fosfato se selecciona del grupo que consiste en fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, fructosa-6-fosfato aldolasa, una transcetolasa o una transaldolasa, y/o aumentando la actividad de una fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa; (ii) al menos se sobreexpresa un gen que codifica una enzima necesaria para la síntesis de novo de GDP-fucosa en la célula hospedante, en donde el al menos un gen que codifica una enzima necesaria para la síntesis de novo de GDP-fucosa es un gen que codifica una enzima ManA que cataliza la isomerización de fructosa-6-fosfato en manosa-6-fosfato, un gen que codifica fosfomanomutasa, un gen que codifica manosa-1-fosfato guanosiltransferasa, un gen que codifica GDP-manosa-4,6-dehidratasa o un gen que codifica GDP-L-fucosa sintasa; (iii) se expresa un gen exógeno que codifica una alfa-1,2-fucosiltransferasa y/o alfa-1,3-fucosiltransferasa en la célula hospedante;
- cultivar y/o desarrollar dicha célula hospedante modificada genéticamente en un medio de cultivo a partir de una fuente de carbono y/o energía, que se selecciona de entre al menos uno de los siguientes: glicerol, succinato, malato, piruvato, lactato, etanol, citrato; y
- proporcionar lactosa al medio de cultivo;
produciendo así el oligosacárido fucosilado que se puede obtener del medio en el que se cultiva la célula hospedante.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el oligosacárido fucosilado se selecciona del grupo que consiste en 2'-fucosil-lactosa, 3-fucosil-lactosa o difucosil-lactosa.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la célula hospedante se selecciona del grupo que consiste en células hospedantes bacterianas.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde se aumenta la cantidad de fructosa-6-fosfato en la célula aumentando la actividad de una fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el gen que codifica la fosfomanomutasa es manB, la manosa-1-fosfato guanosiltransferasa es manC, la GDP-manosa-4,6-dehidratasa es gm dy la GDP-L-fucosa sintasa es wcaG.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el gen que codifica al menos una fucosiltransferasa presenta una actividad alfa-1,2-fucosiltransferasa y/o alfa-1,3 fucosiltransferasa.
7. El método de la reivindicación 6, en donde el gen que codifica una alfa-1,2-fucosiltransferasa se selecciona del grupo que consiste en wbgL de E. coli O126 o fucT2 de Helicobacterpylori.
8. El método de la reivindicación 6, en donde el gen que codifica una alfa-1,3-fucosiltransferasa se selecciona del grupo que consiste en genes de alfa-1,3-fucosiltransferasa de las especies Akkermansia muciniphila, Bacteroides fragilis, Helicobacter pylori o Helicobacter hepaticus.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula hospedante está modificada genéticamente adicionalmente para expresar un gen que codifica una proteína que permite o facilita la exportación del oligosacárido fucosilado deseado al medio de cultivo.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se sobreexpresa una permeasa endógena o exógena para la importación de lactosa.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los genes en los que se modifica o con los que se modifica la célula hospedante son endógenos o exógenos.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se sobreexpresa al menos uno de los genes en el que se modifica o con el que se modifica la célula hospedante tras la inducción endógena o exógena o de manera constitutiva.
13. El método de la reivindicación 9, en donde el gen que codifica una proteína que permite o facilita la exportación del oligosacárido fucosilado deseado es un transportador de eflujo de azúcar.
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13, en donde se codifica la fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa está codificada por un gen que es una variante activa funcional de la fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa (fbpasa) de Pisum sativum.
15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde la lactosa permeasa es LacY de E. coli.
16. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la provisión de la lactosa se lleva a cabo añadiendo lactosa desde el inicio del cultivo en una concentración de al menos 5 mM.
17. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la provisión de lactosa se lleva a cabo añadiendo lactosa al medio de cultivo en una concentración tal que a lo largo de la fase de producción del cultivo se obtiene una concentración de lactosa de al menos 5 mM.
18. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se cultivan las células hospedantes durante al menos 60 horas.
19. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se integran los genes exógenos en el genoma de la cepa hospedante.
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