BR112017006295B1

BR112017006295B1 - Método para a produção de microrganismos mutantes resistentes à morte por lactose, microrganismo e usos do mesmo

Info

Publication number: BR112017006295B1
Application number: BR112017006295-0A
Authority: BR
Inventors: Joeri Beauprez; Sofie De Maeseneire; Eric TIMMERMANS
Original assignee: Inbiose N.V
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2015-11-12
Publication date: 2023-10-17
Also published as: BR112017006295A2; CN114015714A; CN107075506B; KR20170076650A; RU2017120211A; AU2015345073B2; EP3218509A1; AU2021204038B2; CA2958786A1; AU2015345073B9; AU2021204038A1; SG11201701585VA; RU2021109889A; KR102579346B1; JP2017534292A; DK3218509T3; RU2746410C2; US20210095321A1; AU2015345073A1; RU2017120211A3

Abstract

microrganismos mutantes resistentes à morte por lactose. a presente invenção refere-se a um método para produzir microrganismos mutados que resistem ao fenômeno de morte por lactose e aos microrganismos que podem ser obtidos através do referido método. tais microrganismos manipulados podem ser aplicados para a produção de produtos de especialidade, tais como, mas não se limitando a, carboidratos, glicolipídeos e compostos galactosilados de especialidade.

Description

Campo técnico da invenção

[001] A presente invenção refere-se a um método para a produção de microrganismos mutantes que resistem ao fenômeno da morte por lactose, e aos microrganismos obteníveis através do referido método. Tais microrganismos modificados podem ser aplicados para a produção de produtos de especialidade, tais como, mas não se limitando a carboidratos, glicolipídeos e compostos galactosilados de especialidade.

Antecedentes da técnica

[002] A morte por lactose é um princípio bem conhecido e bem estudado que impede o crescimento de muitos organismos na presença de lactose com outra fonte de carbono. O mecanismo exato por trás deste fenômeno no entanto, não é conhecido, embora as características necessárias para induzir ao fenômeno são muito claras. A morte por lactose ocorre quando a lactose é adicionada a uma cultura microbiana que cresce sobre outra fonte de carbono, tal como, mas não limitada ao glicerol ou sacarose. Ele, além disso, ocorre quando o transporte do gene de lactose ou é induzível ou constitutivamente expresso (33, 39, 75). A morte por lactose foi observada pela primeira vez em E. coli onde a expressão da lactose permease foi modulada com IPTG e lactose, em condições de quimiostato (28). A morte por lactose foi mais tarde também observada para Rhizobium meliloti, Kluyveromyces lactis e Zymomonas mobilis (55, 70, 77). Uma das possíveis razões para este fenômeno foi atribuída ao assim chamado “preço” da atividade de transportador de lactose para a célula, este “custo” resulta em uma redução ou inibição do crescimento e também está relacionado com a concentração de lactose extracelular (34), que é principalmente mantida elevada em processos industriais para adquirir títulos suficientemente elevados de produtos e os rendimentos. No entanto, a técnica afirma que, enquanto não há transporte de lactose sob estas condições, deve ocorrer à morte por lactose. Para resolver o problema da morte por lactose a supressão da lactose permease ou deficiência severa de absorção de lactose tem sido proposto (34). Por exemplo, Lodi et al (55) deletou (eliminou) a lactose permease em K. lactis e verificou que a morte por lactose não ocorreu mais. As mutações espontâneas durante as suas experiências mostraram ainda que as cepas negativas para morte por lactose selecionadas são severamente prejudicadas na sua absorção de lactose. No entanto, a absorção de lactose é essencial para sintetizar produtos especiais ou bioprodutos de forma eficiente. Assim, uma deleção da lactose permease ou deficiência severa na atividade da lactose permease não é claramente uma solução, conforme a produção de tais bioprodutos requer 1) uma absorção de lactose eficiente e 2) uma cassete de expressão que não conduza ao “fenótipo de morte por lactose”. A lactose permease para a produção de bioprodutos à base de lactose foi usada anteriormente, mas sem resolver “fenótipo de morte por lactose”. No passado, este problema foi resolvido por qualquer redução da absorção de lactose severamente (e, portanto, pouco ou nenhum produto de especialidade é produzido a partir de lactose) ou por desacoplamento da fase de crescimento e a fase de produção, a fim de se obter biomassa suficiente primeiro. Após esta fase de crescimento a lactose é adicionada em uma segunda fase para produzir um produto de especialidade. Nesta segunda fase o crescimento não ocorre, ou ocorre fortemente reduzido (59).

[003] Assim, o consenso atual é de que, a fim de evitar a morte por lactose, a absorção de lactose tem que ser eliminada ou severamente diminuída, conforme a absorção de lactose normal sempre levaria à morte por lactose. Em contraste, a presente invenção descreve uma metodologia de triagem para encontrar as cassetes de expressão de lactose permease que permitem a absorção eficiente de lactose sem sofrer morte por lactose. A lactose é um bloco de construção para muitos bioprodutos, mais particularmente carboidratos especiais (14), glicolipídeos e compostos galactosilado, como galactosilipídeos, galactosilceramidas e galactosilados agliconas. Em muitos casos, a porção de galactose é utilizada para direcionamento de fármacos ao órgão (28). O uso de lactose como substrato, em combinação com outros substratos não é, no entanto, como é evidente, uma vez que pode parecer devido ao fenômeno acima descrito de “morte por lactose”. Os sistemas de produção de multi-fase principalmente, sistemas de células acopladas de não crescimento são necessários para evitar a morte por lactose (32, 48).

[004] A cadeia principal estrutural de base de muitos carboidratos consiste em unidades especiais de lactose ou galactose. Mais especificamente, oligossacarídeos de leite humano e, por extensão oligossacarídeos do leite materno, um amplo grupo de sacarídeos e de oligossacarídeos, são construídos a partir de unidades de galactose e lactose (15). Estes carboidratos são adicionalmente modificados com porções de açúcar, como por exemplo, N-acetilglucosamina, N- acetilgalactosamina, ácidos siálicos (tais como N- acetilneuraminato, N-glicoilneuraminato, ácido 2-ceto-3- desoxi-D-glicero-galacto-nonulosonico, ...) (21), L-fucose, A síntese destes compostos requer então carboidratos ativados, tais como UDP-N-acetilglucosamina, UDP-N- acetilgalactosamina, ácido CMP-siálico, GDP-fucose, ..., que são moléculas muito caras e difíceis de sintetizar, e são idealmente produzidas por células crescentes vivas, devido à sua energia que a sua biossíntese requer. Os componentes de oligossacarídeos do leite humano/materno têm efeitos anti-inflamatórios e pré-bióticos, e/ou têm aplicações em terapêutica como agentes anti-inflamatórios, nutracêuticos, prebióticos, ou, farmacêuticos (15, 24, 68). No entanto, um método eficiente para produzir os últimos compostos de alto valor ainda é necessário.

[005] A presente invenção descreve sistemas de expressão sintéticos para os transportadores de lactose que não resultam na morte por lactose, mesmo em concentrações elevadas de lactose. Os organismos mutados obteníveis através dos referidos sistemas de expressão são, portanto, úteis para produzir os bioprodutos acima descritos.

Breve descrição das figuras

[006] Figura 1: Efeito de lactose em uma cepa de E. coli de tipo selvagem. Na seta, a lactose foi adicionada a uma das culturas e o crescimento desta cultura imediatamente parou, enquanto que a outra cepa continuou a crescer na outra cultura.

[007] Figura 2: Efeito de lactose em uma cepa mutante de transportador de lactose de E. coli, em que a expressão do transportador de lactose é alterada por meio de um promotor constitutivo sintético. A seta indica o momento em que a lactose foi adicionada ao meio em uma das culturas. Neste caso nenhum efeito foi observado sobre o crescimento. Assim, estas cepas mutantes podem ser selecionadas deste modo.

[008] Figura 3: Exemplo de um promotor, o RBS e a combinação de sequência de transportador de lactose (SEQ ID N°1) que não resulte na morte por lactose, quando introduzido em uma cepa mutante de E. coli.

[009] Figura 4: Exemplo de uma sequência do gene da lactose permease translacional acoplado ao gene lacZ (SEQ ID N°2).

[010] Figura 5: Exemplo de uma sequência do gene de lactose permease lacZ translacional acoplado ao gene cat (SEQ ID N°3).

[011] Figura 6: Exemplo de uma sequência do gene de lactose permease de K. maxianus translacional acoplado ao gene aph 1 (SEQ ID N° 4).

[012] Figura 7: Exemplo de uma sequência do gene de lactose permease lacy acoplado com um aptâmero que liga (Z)- 4-(3,5-difluoro-4-hidroxibenzilideno)-1,2-dimetil-lH- imidazol-5(4H)-ona (SEQ ID N° 5) e permite a detecção da expressão de lactose permease.

[013] Figura 8: Resistência ao cloranfenicol de uma cepa de referência que contém um plasmídeo de referência pSC1O1 sem uma lactose permease translacional acoplada a um gene de resistência ao cloranfenicol e uma cepa mutante com uma lactose permease translacional acoplada a um gene de resistência ao cloranfenicol. O eixo X mostra as diferentes concentrações de cloranfenicol testadas, o eixo Y mostra a densidade ótica da cultura, após 48 horas de incubação. A cepa de referência mostra o atraso de crescimento a uma triagem de cloranfenicol mais baixa do que a cepa mutante, o que prova que a expressão da lactose permease pode ser rastreada por meio de acoplamento de translação com um gene de resistência ao antibiótico. Organismos que expressam lactose permease podem, portanto, serem selecionados a partir de uma mistura de organismos não-expressantes e expressantes desta maneira.

[014] Figura 9: Resistência ao cloranfenicol de uma cepa de referência que contém um plasmídeo de referência pSC101 sem uma lactose permease translacional acoplada a um gene de resistência ao cloranfenicol e uma cepa mutante com uma lactose permease translacional acoplada a um gene de resistência ao cloranfenicol. O eixo X mostra as diferentes concentrações de cloranfenicol testadas, o eixo Y mostra a densidade ótica da cultura, após 92 horas de incubação. A cepa de referência mostra o atraso de crescimento a uma triagem cloranfenicol mais baixa do que a cepa mutante, o que prova que a expressão da lactose permease pode ser rastreada por meio de acoplamento translacional com um gene de resistência ao antibiótico. Os organismos que expressam lactose permease podem, portanto, serem selecionados a partir de uma mistura de organismos não-expressantes e expressantes desta maneira.

[015] Figura 10: pCXP14-FT_H. pylori (SEQ ID N° 6).

[016] Figura 11: Efeito de lactose em uma cepa de levedura do tipo selvagem (Kluyveromyces marxianus lactis). No seta a lactose foi adicionada a uma das culturas e o crescimento desta cultura imediatamente interrompido, enquanto que a outra cepa continuou a crescer na outra cultura.

[017] Figura 12: Efeito de lactose em cepas mutantes de levedura em transportador de lactose (Saccharomyces cerevisiae), em que a expressão do transportador de lactose é alterada por meio de um promotor constitutivo sintético. A seta indica o momento em que a lactose foi adicionada ao meio em uma das culturas. Neste caso foi observado nenhum efeito sobre o crescimento. Assim, estas cepas mutantes podem ser selecionadas deste modo.

[018] Figura 13: Exemplo de um promotor (p1), Kozak, sequência codificadora de lactose permease de K. marxianus e a combinação de terminador (SEQ ID N° 7) que não resulte na morte por lactose quando introduzido em uma cepa de levedura mutante.

[019] Figura 14: Exemplo de um promotor (p2), Kozak, sequência codificadora de lactose permease de K. marxianus e a combinação de terminador (SEQ ID N° 8) que não resulte na morte por lactose quando introduzido em uma cepa de levedura mutante.

[020] Figura 15: Exemplo de um promotor, Kozak, sequência de codificação de β-galactosidase de K. marxianus e combinação terminadora (SEQ ID N° 9).

[021] Figura 16: HR1 rDNA (SEQ ID N° 10).

[022] Figura 17: HR2 rDNA (SEQ ID N° 11).

[023] Figura 18: Os exemplos de sequências selecionadas que se originam a partir da metodologia de triagem de morte por lactose como descrito nos exemplos (SEQ ID N° 12 a 57).

[024] Figura 19: Taxa de crescimento relativo de cassetes de expressão de lactose permease, em relação ao tipo selvagem. As barras de erro são desvios padrão de pelo menos 3 medições repetidas. As sequências que se correlacionam com os números de sequência no eixo-X são apresentadas na Figura 18.

[025] Figura 20: A sequência da cassete de expressão lacIQ_lacY que foi testada em morte por lactose no exemplo 16 (SEQ ID N° 58).

[026] Figura 21: Efeito da lactose em uma cepa de E. coli do tipo selvagem e uma cepa mutante placIQ_lacY. Ambas as cepas foram cultivadas com e sem a adição da fase exponencial de meado de lactose. A seta indica o momento da adição de lactose. O crescimento de ambas as cepas foi severamente prejudicado pela adição de lactose.

Sumário da invenção

[027] A presente invenção refere-se a um método para a produção de microrganismos que resistem ao fenômeno de morte por lactose, quando cultivados em um ambiente no qual a lactose é combinado com outra fonte de carbono, em que o referido método compreende: a. mutar a expressão de transportadores de lactose dentro de microrganismos, em que a referida mutação resulta em um transportador de lactose expressa, b. cultivar os referidos microrganismos mutantes em um meio compreendendo uma fonte de carbono, que não é a lactose, c. adicionar lactose ao referido meio durante o crescimento dos referidos microrganismos mutados, e d. selecionar os microrganismos que resistem ao fenômeno da morte por lactose, crescendo no referido meio compreendendo a lactose.

[028] Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um método para a produção de microrganismos que resistem ao fenômeno de morte por lactose, quando cultivados em um ambiente no qual a lactose é combinada com outra fonte de carbono, em que o referido método compreende: a. mutar a expressão de transportadores de lactose em microrganismos, em que a referida mutação resulta na expressão do referido transportador de lactose b. cultivar os referidos microrganismos mutantes em um meio compreendendo uma fonte de carbono que não seja a lactose, c. adicionar lactose ao referido meio durante o crescimento dos referidos microrganismos mutados, e d. selecionar os microrganismos que resistem ao fenômeno da morte por lactose crescendo no referido meio compreendendo a lactose, e que retêm pelo menos 50% do influxo de lactose obtido com a cassete de expressão de tipo selvagem do referido transportador de lactose.

[029] A presente invenção diz ainda respeito a um método, tal como indicado acima, em que a etapa a) é realizada através da introdução de um promotor heterólogo na frente de um gene de transportador de lactose endógeno ou exógeno, e/ou por mutação da região não traduzida em frente da sequência codificadora que contém as sequências de ligação ao ribossomo ou Kozak e/ou por modificar a utilização de códons do gene do transportador de lactose endógeno.

[030] A presente invenção também se refere a um método como descrito, em que a referida introdução de um promotor heterólogo na frente de um gene de transportador de lactose endógeno ou exógeno é assegurada por: a) deletar os transportadores de lactose endógenos a partir do genoma e reintroduzi-los em outro local dentro do genoma do referido microrganismo, ou, b) pela introdução de um promotor heterólogo na frente dos transportadores endógenos de lactose, ou, c) por knocking out do promotor endógeno de lactose e a introdução de um promotor heterólogo, no mesmo local no genoma do referido microrganismo.

[031] A presente invenção ainda se relaciona com o método descrito acima, em que a expressão da lactose permease na etapa b) é detectada por meio de acoplamento translacional com um gene repórter e/ou através de acoplamento de aptâmero.

[032] A presente invenção relaciona-se com o método descrito acima, em que o transportador de lactose expresso é detectado através de constructos genéticos como dada pela SEQ ID N° 2, 3, 4 e/ou 5.

[033] A presente invenção diz ainda respeito a um método como descrito, acima em que o referido transportador de lactose é uma lactose permease.

[034] A presente invenção diz ainda respeito a um método como descrito acima, em que o referido microrganismo é uma bactéria, uma levedura ou um fungo.

[035] A presente invenção refere-se também a sequências de promotores, regiões não traduzidas em frente da sequência de codificação que contêm as sequências de ligação ao ribossomo ou sequências de Kozak e/ou sequências de lactose permease que conduzem à expressão de um transportador de lactose, que não resultam em fenótipo de morte por lactose, quando o microrganismo contendo tal sequência é cultivado em um ambiente no qual a lactose é combinada com outra(s) fonte(s) de carbono, e, que é obtenível através do método tal como descrito acima.

[036] A presente invenção também se refere a um microrganismo que resiste ao fenômeno de morte por lactose, quando cultivado em um ambiente no qual a lactose é combinada com outra fonte de carbono, e, é obtenível por um método tal como descrito acima.

[037] Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um microrganismo, tal como descrito acima, e, tendo uma sequência heteróloga em frente de um gene de transportador de lactose como dado pela SEQ ID N° 1, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 , 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46,47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 ou 57.

[038] A presente invenção refere-se também a um microrganismo que resiste ao fenômeno da morte por lactose, em que os genes que codificam para as enzimas a partir das vias de degradação de lactose e/ou galactose são tornados menos funcionais ou não funcionais.

[039] A presente invenção diz ainda respeito ao uso de um microrganismo como descrito acima para a produção de produtos de especialidade baseados em lactose, tais como carboidratos, glicolipídeos e compostos galactosilados de especialidade.

[040] A presente invenção também se relaciona com o uso de um microrganismo como descrito acima, em que os referidos carboidratos de especialidade são 2-fucosilactose ou 2'-fucosilactose ou 3-fucosilactose ou 2',3- difucosilactose ou lactoNtriose ou lacto-N-tetraose, ou lacto-nN-tetraose ou 3'sialilactose ou 6'sialilactose.

Descrição da invenção

[041] A presente invenção descreve uma nova maneira de evitar a morte por lactose, alterando a expressão de um transportador de lactose através de engenharia genética em um organismo, resultando em um transportador de lactose mutante expressando organismo. Para este fim, um gene transportador de lactose exógeno e/ou endógeno é expresso por um promotor heterólogo que não conduz a um fenótipo de morte por lactose e/ou o uso de códons do transportador de lactose é modificado para criar uma expressão alterada do transportador de lactose que não leva a um fenótipo de morte por lactose. Para este efeito, o controle de expressão natural dos transportadores de lactose tem que ser removido e/ou substituído de modo que a morte por lactose não ocorre. Por exemplo, a cassete de expressão de transportador de lactose ocorrência natural é excluída do genoma e reintroduzida em outro local, e/ou, um promotor heterólogo é introduzido na frente do transportador de lactose em sua posição original, e/ou o transportador de lactose é eliminado primeiro e reintroduzido com um promotor heterólogo ao mesmo e/ou em outro local no genoma, e/ou, o transportador de lactose é introduzido um operón que é expresso através de um promotor heterólogo.

[042] A presente invenção refere-se assim a um método para a produção de microrganismos que resistem ao fenômeno de morte por lactose, quando cultivados em um ambiente no qual a lactose é combinada com outra fonte de carbono, em que o referido método compreende: 1) mutar a expressão de transportadores de lactose dentro dos microrganismos, em que a referida mutação resulta na expressão do referido transportador de lactose, 2) cultivar os referidos microrganismos mutantes em um meio compreendendo uma fonte de carbono que não é a lactose, 3) adicionar lactose ao referido meio durante o crescimento dos referidos microrganismos mutantes, e 4) selecionar os microrganismos que resistem ao fenômeno da morte por lactose crescendo no referido meio compreendendo a lactose e que retêm pelo menos 50% do fluxo de lactose obtido com a cassete de expressão de tipo selvagem do referido transportador de lactose.

[043] O termo “morte por lactose” refere-se ao fenômeno do atraso no crescimento ou a paragem do crescimento de um organismo que é cultivado em um ambiente no qual a lactose ou galactosídeo é combinado com outra(s) fonte(s) de carbono. Estas fontes de carbono são, não limitativas, glicerol, maltose, glicose, frutose, sacarose, fucose, manose, ácido siálico, amido, celulose, poliois (tais como manitol, xilitol, sorbitol), ácidos orgânicos (lactato, succinato, acetato, ...), e/ou, pentoses (xilose, arabinose, ...).

[044] A presente invenção descreve um método para identificar os sistemas de expressão de lactose permease que não resultam na morte por lactose. Este método engloba uma análise de crescimento da cepa mutante para a qual a lactose é adicionada na fase de meio exponencial. Este método pode ser realizado de um modo de elevado rendimento em placas de micro-titulação ou com separadores de células, permitindo a exibição de vários promotores, locais de ligação ao ribossomo, utilização de códons, e de outros fatores que podem influenciar a expressão de lactose permease no microrganismo mutante. A presente invenção descreve um método para detectar a expressão de lactose permease através de acoplamento de translação e/ou de acoplamento de aptâmero e a seleção de sequências que conduzem à expressão através de um gene repórter, tal como, mas não limitado a um gene de resistência a antibióticos (por exemplo, mas não limitado a cloranfenicol, Geneticina G418), uma proteína fluorescente, uma hidrolase (por exemplo, mas não limitado a galactosidase, xilanase) e, ou uma sequência de aptâmero. As sequências que conduzem à expressão da lactose permease são ainda selecionadas com base no gene repórter, por crescimento em um meio com um antibiótico, um ensaio colorimétrico (tal como X-gal) e/ou por meio de um classificador de células ativadas por fluorescência que classifica as células fluorescentes e/ou um ensaio de aptâmero por exemplo, mas não limitado a, com base em (Z)-4-(3,5-difluoro-4- hidroxibenzilideno)-l,2-dimetil-lH-imidazol-5(4H)-ona(37, 64). A presente invenção descreve ainda um processo para a triagem de organismos mutantes expressando transportador de lactose que não se submetem a morte por lactose. Além disso, a presente invenção descreve como bibliotecas de cassetes de expressão de lactose permease podem ser criadas através de bibliotecas de promotor, bibliotecas de sequência RBS ou Kozak, ou bibliotecas de terminador da transcrição, e/ou variantes de usos de códons do gene da lactose permease. Estas bibliotecas são ainda criadas através de métodos, tais como, mas não se limitando a montagem de Gibson, montagem de Golden Gate, montagem de Cliva, LCR ou ligadura de restrição (25, 36, 50, 79).

[045] O termo “que retêm pelo menos 50% do fluxo de lactose obtido com a cassete de expressão do tipo selvagem do referido transportador de lactose” refere-se ao fato de que os microrganismos mutados da presente invenção devem - embora eles resistam à morte por lactose - ser ainda capaz de reter pelo menos 50% (isto é, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99%) do influxo de lactose, que é obtido quando se utiliza a cassete de expressão do tipo selvagem do referido transportador de lactose.

[046] O termo “cassete de expressão” refere-se a qualquer sequência em que uma sequência de promotor, sequência da região não traduzida (contendo uma sequência de ligação de ribozima ou uma sequência de Kozak), uma sequência de codificação (por exemplo, uma sequência do gene da lactose permease) e, opcionalmente, um terminador da transcrição (18) é presente.

[047] O termo “transportador de lactose” refere-se a qualquer proteína expressa em um microrganismo que é capaz de translocar a lactose (transportar) através da membrana citoplasmática. Tais proteínas são, por exemplo, lactose permeases (transportadores da superfamília MFS ou Superfamília Facilitadora Principal).

[048] O termo “promotor heterólogo” refere-se a qualquer promotor que não ocorre naturalmente em frente de uma sequência de codificação. Um “promotor” é o conjunto da sequência de ligação da polimerase de RNA que se encontra antes do local de início da transcrição e a região não traduzida na frente da sequência de codificação. Uma sequência de “promotor heterólogo” é assim: 1) uma variante de sequência de promotor de ocorrência natural contendo pelo menos uma mutação (isto é, 1, 2, 3, 4, ...), e/ou 2) um promotor nativo do microrganismo expressando transportador de lactose mutante que não ocorre naturalmente na frente da sequência de codificação do referido transportador, e/ou 3) uma sequência que não ocorre naturalmente no microrganismo que expressa transportador de lactose, e/ou 4) um promotor artificial que é um promotor concebido in silico. Estes promotores podem ser derivados de bibliotecas, tais como, mas não limitadas a, descrita por Alper et al. (2005), e/ou HXT7p, Hammer et al. (2006), De Mey et al. (2007), Coussement et al. (2014) ou, Mutalik et al. (2013) (3, 25, 29, 41, 60) (66), ou Blount et al. (2012), promotores, tais como, mas não se limitando a ADHlp, TEFlp, TEF2p, GPDP, PDClp, FBAlp, PGKlp, PGIlp, TDH2p, PYKlp, EN02p, GPMlp, TPIlp (13), ou concebido como descrito, por exemplo, por Rhodius et al. (2012). O termo “promotor artificial” também se refere aos promotores com sequências de dna que são diferentes da sequência de promotor nativa (autóloga) com partes de diferentes sequências promotoras (autólogas ou heterólogas). Sequências de tais “promotores artificiais” podem ser encontradas em bases de dados tais como, por exemplo, partsregistry.org (19). Os promotores heterólogos levam tanto à expressão constitutiva ou expressão regulada através de um fator de transcrição.

[049] O termo “expressão constitutiva” é definido como a expressão que não é regulada por outros fatores de transcrição além das subunidades de RNA polimerase (por exemplo, os fatores sigma bacterianos), sob certas condições de crescimento. Nenhum exemplo limitante desses fatores de transcrição são CRP, LacI, Arca, Cra, IclR, ..., em E. coli, ou, Aft2p, Crzlp, Skn7, ... em Saccharomyces cerevisiae, ou, DeoR, GntR, Fur,. .. em B. subtilis. Estes fatores de transcrição ligam-se a uma sequência específica e podem bloquear ou aumentar a expressão em determinadas condições de crescimento. A RNA polimerase se liga a uma sequência específica para iniciar a transcrição, por exemplo, através de um fator sigma em hospedeiros procarióticos.

[050] O termo “expressão regulamentada” é definido como expressão que é regulada por outros fatores de transcrição além das subunidades da RNA polimerase (por exemplo, fator sigma bacteriano), sob certas condições de crescimento. Exemplos de tais fatores de transcrição são descritos acima.

[051] O termo “região não traduzida” em frente da sequência codificadora que contém os locais de ligação ao ribossomo ou sequências de Kozak relaciona-se com a sequência entre a sequência de ligação da polimerase de RNA e a sequência de codificação. Esta região não traduzida é também a sequência de ocorrência natural na frente da sequência codificante, e/ou, uma sequência que ocorre naturalmente, em que o microrganismo que expressa transportador de lactose, e/ou, uma sequência que é derivada a partir de outros organismos (procariotas ou eucariotas), e/ou, uma sequência que é concebida artificialmente, o que diz respeito às locais de ligação de ribossomo não-naturais ou in silico concebidos com taxas de conversão conhecidas ou mensuráveis, essas sequências podem ser derivadas de bibliotecas de ligação tal como descrito por Mutalik et al (2013) (60) ou por meio de algoritmos concebidos, por exemplo, como descrito por Salis et al (2009) (67) ou podem ser encontradas em bases de dados tais como partsregistry.org (19).

[052] O termo “utilização de códon modificado” refere-se a um a alteração dos códons utilizados dentro de uma sequência de codificação de DNA, quer para códons utilizados mais frequentemente pelo organismo ou raramente utilizadas pelo organismo. A utilização de códons é definida em bases de dados tais como a base de dados de utilização de códons (61), e a utilização de códons é otimizada por meio de algoritmos de design de utilização de códons (73).

[053] O termo “acoplamento traducional” refere-se à expressão combinada de um gene de interesse e um gene repórter, tal como uma proteína verde fluorescente, genes de resistência a antibióticos, genes tóxicos, (49, 53, 58, 63). O termo “sensor de translação” refere-se a qualquer mecanismo que é um indicador para a expressão e tradução de um gene, por exemplo, marcadores fluorescentes e marcas de divisão, tal como descrito nas seguintes referências (17, 72).

[054] O termo “acoplamento de aptâmero” refere-se à introdução de uma sequência de aptâmero para o RNA mensageiro do transportador de lactose que pode ser detectado por um fluoróforo tal como, mas não limitado a (Z)-4-(3,5-difluoro- 4-hidroxibenzilideno)-l,2-dimetil-lH-imidazol-5(4H)-ona (37, 64).

[055] O termo “análise de crescimento” refere-se à análise da curva de crescimento de um organismo. Este organismo é cultivado em um meio de crescimento em um ambiente de crescimento. O ambiente de crescimento em longo prazo refere-se a todos os parâmetros ambientais tais como pH, temperatura, oxigênio dissolvido. O pH é ajustado por meio de um tampão de pH ou por controle do pH e é por exemplo, mas não limitado a pH 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, ou 8. A temperatura é fixada em, por exemplo, mas não limitada a 25, 28, 30, 32, 34, 37, 40, 42, 45°C. O oxigênio dissolvido está ou em condições anaeróbicas, micro aeróbicas (com oxigênio dissolvido abaixo de 1,5 mgl) ou aeróbicas.

[056] O termo “meio de crescimento” ou “meio” refere-se a qualquer solução contendo os substratos necessários para um organismo crescer. Estes substratos são, mas não se limitando a, fontes de nitrogênio, tais como sais de amônio, sais de nitrato, extrato de levedura, peptona, casamino, e/ou aminoácidos, fontes de fósforo, tais como, mas não limitadas a, sais de fosfato, fontes de enxofre, tais como, mas não limitadas a sais de sulfato, elementos tais como, mas não limitados ao cobre, cobalto, ferro, selênio, iodo, molibdato, magnésio, cálcio, potássio, sódio, zinco, níquel, manganês e/ou ácido bórico e/ou vitaminas, tais como, mas não se limitando a tiamina, ácido pantotênico e/ou niacina e/ou uma fonte de carbono tal como, mas não limitada a, glicerol, maltose, glicose, frutose, sacarose, fucose, manose, ácido siálico, amido, celulose, poliois (tais como manitol, xilitol, sorbitol), ácidos orgânicos (lactato, succinato, acetato,...), e/ou, pentoses (xilose, arabinose,...).

[057] O termo “organismo”, ou “célula”, tal como indicado acima se refere a um microrganismo escolhido de entre a lista consistindo de uma bactéria, uma levedura ou um fungo, ou, refere-se a uma célula vegetal ou animal. A última bactéria pertence de preferência ao filo das Proteobactérias, ou ao filo dos Firmicutes ou ao filo das Cianobactéria ou filo dos Deinococcus-Thermus. Esta última bactéria pertencente ao filo Proteobacteria pertence de preferência à família Enterobacteriaceae, de preferência à espécie Escherichia coli. Esta última bactéria se relaciona preferencialmente com qualquer uma cepa pertencente às espécies de Escherichia coli tais como, mas não se limitando a Escherichia coli B, Escherichia coli C, Escherichia coli W, Escherichia coli K12, Escherichia coli Nissle. Mais especificamente, o último termo refere-se a cepas de Escherichia coli cultivadas, designadas como cepas de E. coli K12 - que são bem adaptadas ao ambiente do laboratório, e, ao contrário de cepas do tipo selvagem, perderam a capacidade de crescer no intestino. Exemplos bem conhecidos das cepas de E. coli K12 são K12 do tipo selvagem, W3110, MG1655, M182, MC1000, MC1060, MC1061, MC4100, JM101, NZN111 e AA200. Assim, a presente invenção refere-se especificamente a uma cepa de Escherichia coli mutante e/ou transformada, como indicado acima, em que a referida cepa de E. coli é uma cepa K12. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a uma cepa de Escherichia coli mutante e/ou transformada, como indicado acima, em que a referida cepa K12é de E. coli MG1655. Esta última bactéria pertencente ao filo Firmicutes pertence de preferência à Bacilli, de preferência às espécies Bacillus. A última levedura pertence de preferência ao filo de Ascomycota, ou ao filo de Basidiomycota, ou ao filo de Deuteromycota ou ao filo de Zigomicetos. Esta última levedura pertence de preferência ao gênero Saccharomyces, Pichia, Hansunella, Kluyveromyces, Yarrowia ou Starmerella. Este último fungo pertence preferencialmente ao gênero Rhizopus, Dictyostelium ou Aspergillus.

[058] A presente invenção descreve os organismos que são capazes de captar a lactose, sem sofrer morte por lactose, e são capazes de converter a lactose ou a sua porção de galactose em um produto especial.

[059] Mais particularmente, os referidos produtos de especialidade ou bioprodutos são carboidratos da especialidade, glicolipídeos, tais como, mas não se limitando a galactolipídeos e/ou lactolipídeos, e/ou, compostos galactosilados, tais como galactosilipídeos, galactosilceramidas, e/ou em agliconas galactosiladas.

[060] A presente invenção descreve os organismos que são capazes de captar a lactose, sem sofrer morte por lactose, e converter a referida lactose em um oligossacarídeo do leite humano, tal como, mas não limitado a 3- fucosilactose, 2'-fucosilactose, 6-fucosilactose, 2',3- difucosilactose, 2',2-difucosilactose, 3,4-difucosilactose, 6'-sialilactose 3'-sialilactose, 3,6-disialilactose, 6,6'- disialilactose, 3,6-disialilacto-N-tetraose, lactodifucotetraose, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, lacto-N-fucopentose II, lacto-N-fucopentose I, lacto-N- fucopentose III, sialilacto-N-tetraose c, sialilacto-N- tetraose b, sialilacto- N-tetraose a, lacto-N-difucohexaose I, lacto-N-difucohexaose II, lacto-N-hexaose, lacto-N- neohexaose, para-lacto-N-hexaose, monofucosilmonosialilacto-N-tetraose c, monofucosil para- lacto-N-hexaose, monofucosilacto-N-hexaose III, lacto-N- hexaose III isomérico fucosilado, lacto-N-hexaose I isomérico fucosilado, sialilacto-N-hexaose, sialilacto-N- neohexaose II, difucosil-para-lacto-N-hexaose, difucosilacto-N-hexaose, difucosilacto-N-hexaose a, difucosilacto-N-hexaose c, quitosano galactosilado, oligossacarídeos fucosilaltado, e/ou oligossacarídeos sialilados...

[061] A presente invenção descreve ainda os organismos que não se submetem a morte por lactose e que sintetizar açúcares nucleotídicos, tais como, mas não se limitando a GDP-L-fucose, GDP-manose, GDP-glicose, ácido CMP-siálico, UDP-glicose, UDP-galactose, UDP-N- acetilglucosamina, UDP-N-acetilmanosamina, UDP-N- acetilgalactosamina, ácido UDP-glucurônico, ácido UDP- galacturônico, UDP-xilose, UDP-arabinose, e/ou, DTDP- ramnose. O termo “ácido siálico” é o nome do grupo para os compostos, tais como, mas não limitados a, ácido neuramico, ácido N-acetilneuramico, ou ácido N-glicoilneuramico como definido por Varki (1992) (71). A concentração de GDP-fucose intracelular ou pélete é melhorado por regulação positiva, quer pela via de novo e/ou a via de recuperação. A via de novo consiste de um GDP-4-ceto-6-deoximanose-3,5-epimerase- 4-redutase ou GDP-fucose sintase, uma GDP-manose-4,6- desidratase, uma GDP-D-manose pirofosforilase, uma isomerase fosfomanose e/ou um fosfomanomutase, de que a expressão é aumentada individualmente através de elementos genéticos, tais como, mas não limitados a promotores e/ou locais de ligação ao ribossomo e/ou utilização de códons alterados de um mono-cistrón ou poli-cistrón (estrutura operón); e/ou através dos reguladores arcA iclR em Enterobacteriaceae e/ou através do regulador de transcrição RcsA em Enterobacteriaceae ou genes homólogos em bactérias, ou, Xbpl, Spt20, Sfpl, Rpd3, Rapl, Gcrl, GCN5, CST6, Abfl, Hsfl, Rebl, Cadi, Sin4, Ashl, Ixrl, Met32, Pho2, Rgrl, Spt7, Swi4 em Saccharomyces cerevisiae ou genes homólogos em leveduras ou fungos. A via de recuperação consiste de uma cinase de L- fucose e/ou uma GDP-L-fucose pirofosforilase. O pélete de GDP-manose é reforçado por regulação positiva de genes que codificam uma GDP-D-manose pirofosforilase, uma fosfomanose isomerase e/ou uma fosfomanomutase; e/ou, genes que codificam para um manoquinase e uma GDP-D-manose pirofosforilase. O pélete de UDP-galactose é aumentado pela regulação positiva dos genes que codificam para uma galactoquinase e/ou galactose 1-fosfato uridil transferase, e/ou, uma UDP-galactose-4-epimerase, e/ou, uma UDP- galactose/glucose pirofosforilase, e/ou uma lactose sintase, e/ou uma lactose fosforilase, e/ou uma sacarose fosforilase. O pélete de UDP-glucose é aumentado pela regulação positiva dos genes que codificam para uma glucoquinase, e/ou, uma pirofosforilase UDP-glucose, e/ou uma sacarose fosforilase e/ou um fosfoglucomutase, e/ou uma sacarose sintase. O pélete de ácido CMP-siálico é reforçado por genes que codificam para a regulação positiva de L-glutamina:D-frutose-6-fosfato aminotransferase, e/ou, fosfoglucosamina mutase, e/ou, glucosamina-1-fosfato acetiltransferase e/ou N- acetilglucosamina-1-fosfato uridiltransferase, e/ou UDP-N- acetilglucosamina 2-epimerase e/ou N-acetilneuraminato sintase e/ou da citidina 5'-monofosfato N-acetilneuraminato sintetase. O pélete de UDP-N-acetilglucosamina é reforçado por genes que codificam para a regulação positiva de L- glutamina:D-frutose-6-fosfato aminotransferase, e/ou, fosfoglucosamina mutase, e/ou, glucosamina-1-fosfato acetiltransferase e/ou N-acetilglucosamina-1-fosfato uridiltransferase e/ou glucosamina-6-fosfato N- acetiltransferase e/ou, fosfoacetilglucosamina mutase, e/ou, UDP-N-acetilglucosamina pirofosforilase. O pélete de UDP-N- acetilmanosamina é reforçado por genes de regulação positiva que codificam para o reforço do pélete de UDP-N- acetilglucosamina e/ou uma UDP-N-acetilglucosamina 2- epimerase. O pélete de UDP-N-acetilgalactosamina é reforçado por genes de regulação positiva que codificam para o reforço do pélete de UDP-N-acetilglucosamina e/ou uma UDP-N- acetilglucosamina C4-epimerase. O pélete de ácido glucurônico UDP é reforçado por genes de regulação positiva que codificam para o reforço do pélete de UDP-glucose e/ou UDP-glucose desidrogenase. O pélete de UDP-xilose é reforçado por genes de regulação positiva que codificam para o reforço do pélete de UDP-glucurônico e/ou UDP-D-xilose sintetase. O pélete de ácido UDP-galacturônico é reforçado por genes de regulação positiva que codificam para o reforço do pélete de ácido UDP-glucurônico e/ou UDP-D-glucurônico ácido 4-epimerase. O pélete de UDP-arabinose é reforçado por genes que codificam para a regulação positiva para o reforço do pélete de UDP-glucurônico e/ou UDP-D-xilose 4-epimerase e/ou arabinose quinase e/ou UDP-L-arabinose pirofosforilase. O pélete de dTDP-ramnose é reforçado por genes que codificam para uma regulação positiva de dTDP-glicose pirofosforilase e/ou dTDP-glicose 4,6-desidratase e/ou dTDP-4- dehidrorhamnose 3,5-epimerase e/ou dTDP-4-dehidrorhamnose redutase e ou uma glicose-1-fosfato timidililtransferase de e/ou uma sintase de ramnose de nucleotídeo.

[062] O termo “pélete” refere-se ainda a concentrações de metabolitos que ocorrem naturalmente no organismo do tipo selvagem, por exemplo, a concentração de um pélete de açúcar de nucleotídeo. O termo “pélete melhorado” refere-se a um aumento significativo da concentração do referido pélete de metabólito, maior do que o pélete de metabólito no organismo do tipo selvagem.

[063] O termo “regulação positiva de um gene” refere-se a cada modificação genética que conduz a uma maior expressão do gene e/ou atividade do produto do referido gene. A referida modificação genética é quer uma modificação no promotor, uma região não traduzida, local de ligação ao ribossomo, à sequência de codificação, a localização do gene, a estrutura de íntron/éxon e/ou o terminador de transcrição, o que leva a que à referida expressão e/ou atividade aumentada.

[064] Além disso, a presente invenção descreve os organismos geneticamente modificados que podem transferir estes açúcares de nucleotídeos para um mono-, di- ou oligossacarídeo, tal como, mas não se limitando a, galactose, lactose, lactoNbiose, lactoNtriose, lactoNtetraose, lacto- N-neotetraose, globotriose, 2'fucosilactose, 3- fucosilactose, 3-sialilactose, 6-sialilactose, oligossacarídeos de leite humano, heparosanos, quitosanos, nod-fatores, glicolipídeos, e/ou agliconas, ..., por meio de um enzima glicosiltransferase.

[065] A presente invenção descreve também os organismos que não se submetem a morte por lactose e que podem modificar ainda mais a referida lactose com enzimas, tais como, mas não se limitando a carboidratos hidrolases, carboidratos transferases, carboidratos sintases, acetilases, aciltransferases, carboidratos fosfatases, polissacarídeo Liases, quinases, piruviiases e/ou sulfotransferase.

[066] A presente invenção descreve ainda os organismos que não se submetem à morte por lactose e não degradam a lactose mais, tornando o gene da lactose hidrolase menos funcional ou não funcional.

[067] O termo “genes que são prestados menos funcional ou não funcional” refere-se às tecnologias bem conhecidas para uma pessoa qualificada, tal como o uso de siRNA, RNAi, miRNA, asRNA, genes mutantes, genes de knockingout, mutagênese de transpóson, CrispR/CAS etc ..., que são usados para alterar os genes de tal modo que eles são menos capazes (ou seja, de forma estatisticamente significativa “menos capazes” se comparado a um gene de tipo selvagem funcional) ou completamente incapazes (tais como genes knocked-out) para produzir produtos finais funcionais. O termo “(gene) knockout” refere-se, assim, a um gene que tenha sido tornado não funcional. O termo “gene suprimido” ou “deleção do gene” também se refere a um gene que tenha sido tornado não funcional (2, 4-9, 22, 27, 30, 43, 45, 46, 51, 65, 74).

[068] A presente invenção descreve os organismos em que os genes são introduzidos/eliminados em/regulados positivamente para produzir bioprodutos, como descrito acima. Estes genes são encontrados em bases de dados de genes tais como, mas não se limitando a bases de dados GenBank ou proteínas, tais como, mas não se limitando a UniProt, ou bases de dados de enzimas, tais como, mas não se limitando a base de dados enzima Brenda (16, 23, 38) e vias para bioprodutos são encontradas em bases de dados tais como, mas não limitados a KEGG, Biocyc, Metacyc (20, 44, 47). A via para certo bioproduto descrito acima pode ser determinada por várias ferramentas matemáticas descritas na técnica (35, 54, 57, 76).

Exemplos 1. Material e métodos de Escherichia coli Cepas e plasmídeos

[069] Escherichia coli MG1655 [À-, F-, rph-l] e JM109 foram obtidas a partir da Coleção de Cultura de Bactérias dos Países Baixos (NCCB). Todas as cepas mutantes foram criadas utilizando o método de Datsenko e Wanner (27).

Meios

[070] O meio de Luria Broth (LB) consistiu em 1% de peptona triptona (Difco, Erembodegem, Bélgica), 0,5% de extrato de levedura (Disco) e 0,5% de cloreto de sódio (VWR, Leuven, Bélgica). O meio do frasco de agitação continha 2 g/l de NH4Cl, 5 g/l de (NH4)2SO4, 2,993 g/l de KH2PO4, 7,315 g/l de K2HPO4, 8,372 g/l de MOPS, 0,5 g/l de NaCl, 0,5 g/l MgSO4.7H2O, 15 g/l de glicerol (a menos que indicado de outra forma), solução de vitaminas de 1 ml/L, 100 μl/L de solução de molibdato, e solução de selênio de 1 ml/L.

[071] O meio foi ajustado para um pH de 7 com KOH 1M.

[072] Solução de vitaminas consistia de 3,6 g/l de FeCl2 . 4H2O, 5 g/l de CaCl2 . 2H2O, 1,3 g/l de MnCl2 . 2H2O, 0,38 g/l de CuCl2 . 2H2O, 0,5 g/l de CoCl2 . 6H2O, 0,94 g/l de ZnCl2, 0,0311 g/l de H3BO4, 0,4 g/l de Na2EDTA . 2H2O e 1,01 g/l de tiamina . HC1. A solução de molibdato continha 0,967 g/l de Na2 MoO4 . 2H2O. A solução de selênio continha 42 g/l de SeO2.

[073] O meio mínimo para as fermentações continha 6,75 g/l de NH4Cl, 1,25 g/l de (NH4)2SO4 , 1,15 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de NaCl, 0,5 g/l de MgSO4.7H2O, 30 g/l de lactose e 20 g/l de sacarose (ou de diferentes concentrações se indicado de outra forma), 1 ml/L de solução de vitaminas, 100 μl/l de solução de molibdato, e 1 ml/L de solução de selênio com a mesma composição como acima descrito .

Condições de cultivo

[074] Uma pré-cultura, a partir de uma única colônia em LB-placa, em meio de 5 mL de LB foi incubada durante 8 horas a 37°C num agitador orbital a 200 rpm. A partir desta cultura, 2 ml foi transferido para 100 ml de meio mínimo em um balão de agitação de 500 ml e incubou-se durante 16 horas a 37°C num agitador orbital a 200 rpm. 4% de inóculo foi usada em um recipiente de cultura 2 ou 5 1 Biostat B mais com um volume de trabalho de 1,5 L ou 4 L (Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Alemanha). As condições de cultura foram: 37°C, agitação a 800 rpm, e uma taxa de fluxo de gás de 1,5 l/min. Condições aeróbias foram mantidas por aspersão com ar. O pH foi mantido a 7 com 0,5 M de H2SO4 e solução de M amoníaco a 35%. O gás de exaustão foi arrefecido a 4°C por um arrefecedor de escape (Frigomix 1000, Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Alemanha). Solução a 10% de agente anti- espuma de silicone (BDH 331512K, VWR Int Ltd., Poole, Inglaterra) foi adicionada quando a formação de espuma surgiu durante a fermentação (aproximadamente 10 μL). O gás de escape foi medido com um analisador de gases de escape EL3020 (ABB Automation GmbH, 60488 Frankfurt am Main, Alemanha).

[075] Todos os dados foram registrados com o sistema MFCS/win Sartorius v3.0 (Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Alemanha).

Metodologia de amostragem

[076] O biorreator contém no seu interior um tubo de colheita (BD Spinal Needle, 1.2x152 mm (BDMedical Systems, Franklin Lakes, NJ - EUA) conectado a uma porta de reator, ligados fora a um tubo Masterflex-14 (Cole-Parmer, Antwerpen, Bélgica), seguido de uma porta de colheita com um septo de amostragem. O outro lado da porta de colheita é ligado de volta para o recipiente de reação com um tubo de Masterflex-16. Este sistema é referido como circuito de amostragem rápido. Durante a amostragem, o caldo do reator é bombeado em torno do circuito de amostragem. Estimou-se que, a um caudal de 150 ml/min, o caldo do reator necessita de 0,04 s para alcançar a porta de colheita e 3,2 s para reentrar no reator. A um nível de pO2 de 50%, há cerca de 3 mg/l de oxigênio no líquido a 37°C. O nível de pO2 nunca deve cair abaixo de 20% para evitar as condições micro aeróbias. Assim, 1,8 mg/l de oxigênio pode ser consumido durante o trânsito através do circuito de colheita. Assumindo uma taxa de consumo de oxigênio de 0,4 g de oxigênio/g de biomassa/h (a velocidade de absorção de oxigênio máxima encontrada em μm^x), isto dá para 5 g/l de biomassa, uma taxa de consumo de oxigênio de 2 g/l/h, ou de 0,56 mg/l/s, que multiplicado por 3,2 s (tempo de residência no circuito fechado) dá 1,8 mg/l de consumo de oxigênio.

[077] A fim de apagar o metabolismo das células durante a colheita, o caldo reator foi sugado através da porta de colheita de uma seringa cheia com 62 g de esferas de aço inoxidável pré-arrefecida a -20°C, para arrefecer 5 ml de caldo imediatamente para 4°C . A amostragem foi imediatamente seguida por centrifugação a frio (15000 g, 5 min, 4°C). Durante os experimentos de lote, uma amostra para a medição de OD600nm foi feita com o circuito de amostragem rápido, e o método de amostragem de esfera inoxidável fria.

Métodos analíticos

[078] A densidade celular da cultura foi frequentemente monitorada por medição da densidade ótica a 600 nm (espectrofotômetro Uvikom 922, BRS, Bruxelas, Bélgica). O peso celular seco foi obtido por centrifugação (15 min, 5000 g, rotor GSA, Sorvall RC-5B, Goffin Meyvis, Kapellen, Bélgica) com 20 g de caldo de reator em Falcons pré-secos e pesados. Os péletes foram subsequentemente lavados uma vez com 20 ml de solução fisiológica (9 g/l de NaCl) e secos a 70°C até um peso constante. Para ser capaz de converter medições de OD600nm às concentrações de biomassa, uma curva de correlação de OD600nm à concentração de biomassa foi feita. As concentrações de glicose e ácidos orgânicos foram determinadas com um sistema Varian Prostar HPLC (Varian, Sint-Katelijne-Waver, Bélgica), utilizando uma coluna Aminex HPX-87H (Bio-Rad, Eke, Bélgica) aquecida a 65°C, provida de 1 cm de pré-coluna, utilizando 5 mM de H2SO4 (0,6 ml/min) como fase móvel. Um detector de onda dupla de UV-VIS (210 nm e 265 nm) (Varian Prostar 325) e um detector de índice de refração diferencial (Merck LaChrom L-7490, Merck, Leuven, Bélgica) foi utilizado para detecção de pico. Ao dividir as absorções dos picos em ambos 265 e 210 nm, os picos podem ser identificados. Os resultados de divisão em um valor constante, típicos para um determinado composto (fórmula de Beer-Lambert).

[079] Glicose, frutose, sacarose, oligossacarídeos e glicose-1-fosfato foram medidos por HPLC com uma coluna Hypercarb e foram detectados com um detector de MSMS (Antonio et al, 2007;. Nielsen et al., 2006).

Métodos genéticos

[080] Os métodos utilizados para a construção de mutante são descritos abaixo.

[081] Os plasmídeos foram mantidos no hospedeiro de E. coli DH5a (F, Φ80dlacZΔM15, Δ (lacZYA-argF)U169, deoR, recAl, endAl, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44, A-, thi- 1, gyrA96, relA1).

[082] Plasmídeos. Os plasmídeos pKD46 (plasmídeo ajudante Red, resistência à ampicilina), pKD3 (contém uma resistência ao cloranfenicol flanqueado-FRT (cat) gene), pKD4 (contém um FRT-flanqueado de resistência à canamicina (kan) gene) e pCP20 (expressa à atividade de recombinase FLP) foram usados para a construção de mutantes. O plasmídeo pBluescript (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha) foi utilizado para construir os derivados de pKD3 e pKD4 com uma biblioteca de promotor, ou com alelos que transportam uma mutação pontual.

[083] Mutações. As mutações consistiram na interrupção do gene (knock-out, KO). Elas foram introduzidas utilizando o conceito de Datsenko e Wanner (27).

[084] Os transformantes que transportam um plasmídeo ajudante Red foram cultivados em 10 ml de meio LB com ampicilina (100 mg/l) e L-arabinose (10 mM) a 30°C a uma OD600nm de 0,6. As células foram feitas eletrocompetentes, lavando-se com 50 ml de água gelada, uma primeira vez, e com 1 ml de água gelada, uma segunda vez. Em seguida, as células foram ressuspensas em 50 μL de água gelada. A eletroporação foi realizada com 50 μL de células e 10-100 ng de produto de DNA de cadeia dupla linear, utilizando um Gene Pulser™ (BioRad) (600 Q, 25 μFD, e 250 volts).

[085] Após a eletroporação, as células foram adicionadas a 1 ml de meio LB incubadas 1 h a 37°C, e finalmente distribuídas em LB-ágar contendo 25 mg/l de cloranfenicol ou 50 mg/l de canamicina para selecionar os transformantes resistentes ao antibiótico. Os mutantes selecionados foram verificados por PCR com os iniciadores a montante e a jusante da região modificada e foram cultivados em LB-ágar a 42°C durante a perda do plasmídeo auxiliar. Os mutantes foram testados quanto à sensibilidade à ampicilina.

[086] DNA de cadeia dupla linear. Os amplicóns de ds-DNA lineares foram obtidos por PCR usando pKD3, pKD4 e seus derivados como molde. Os iniciadores utilizados tinham uma parte da sequência complementar ao molde e outra parte complementar para o lado sobre o DNA cromossômico em que a recombinação tem de ocorrer. Para o KO, a região de homologia foi concebida de 50 nt a montante e 50 nt a jusante do códon de início e de paragem do gene de interesse. Para o KI, o ponto de partida da transcrição (+1) tinha que ser respeitado. Os produtos de PCR foram purificados por PCR, digeridos com DpnI, repurificados a partir de um gel de agarose, e suspendeu-se em tampão de eluição (Tris 5 mM, pH 8,0).

[087] A eliminação do gene de resistência ao antibiótico. Os mutantes selecionados (resistente a cloranfenicol ou canamicina) foram transformados com plasmídeo pCP20, que é um plasmídeo resistente à ampicilina e cloranfenicol que mostra a replicação sensível à temperatura térmica e indução da síntese de FLP. Os transformantes resistentes à ampicilina foram selecionados a 30°C, após o que poucas colônias foram purificadas em meio LB a 42°C e, em seguida, testadas para a perda de toda a resistência a antibióticos e do plasmídeo auxiliar FLP. O gene de knock outs e knock in são verificados com iniciadores de controle (Fw/Rv-gene-out).

[088] Transformação. Os plasmídeos foram transformados em células competentes de CaCl2 utilizando o processo simplificado de Hanahan (42) ou através de eletroporação como descrito acima.

2. Material e métodos de levedura 2.1. Cepas

[089] Saccharomyces cerevisiae BY4742 foi obtida a partir da coleção de culturas Euroscarf. Todas as cepas mutantes foram criadas por recombinação homóloga ou transformação de plasmídeo usando o método de Gietz (40). Kluyveromyces marxianus lactis foi obtida a partir da coleção de culturas do Laboratório da biotecnologia Industrial e Biocatálise.

2.2. Meios

[090] Cepas são cultivadas em meio de levedura sintético definido com mistura completa de suplemento (SD CSM) ou CSM drop-out (SD CSM-Ura) contendo 6,7 g.L-1 de Base de Nitrogênio de Levedura sem aminoácidos (YNB w/o AA, Disco), 20 g.L-1 de ágar (Difco) (culturas sólidas), 22 g.L- 1 de glicose mono-hidrata ou 20 g.L-1 lactose e 0,79 g.L-1 de CSM ou 0,77 g.L-1 de CSM-Ura (MP Biomedicals).

2.3. Condições de cultivo

[091] As culturas de leveduras foram inoculadas em primeiro lugar em 5 mL do meio apropriado e incubadas durante a noite a 30°C e 200 rpm. A fim de se obter culturas de maior volume, 2% (ou superior) da pré-cultura é inoculado em 50200 mL de meio. Estas culturas foram novamente incubadas a 30°C e 200 rpm.

[092] As experiências de crescimento são realizadas em placas de 96 poços ou de escala de Erlenmeyer. De modo a se obter colônias simples como o material de partida para as experiências de crescimento e de produção, as cepas são plaqueadas em placas de SD CSM seletivas e incubadas durante 2-3 dias a 30°C. Uma colônia é então colhida e transferida para 5 mL de meio para os estudos de Erlenmeyer ou para 1 mL de meio para as experiências de placa de microtitulação.

[093] Para as experiências de Erlenmeyer, as pré- culturas são incubadas durante a noite a 30°C e 200 rpm e 2% destes pré-culturas são adicionados a 100 ml de meio, a fim de iniciar as experiências de crescimento.

[094] Para as experiências de crescimento de MTP, as colônias são adicionados a 150 μL de meio e incubadas durante 24 horas a 30°C. Após incubação, 2 μL de pré-culturas de MTP são adicionados a um meio fresco contendo 150μL de MTP. OD é medida a cada quinze minutos durante 48 horas com o Infinite® 200 Pro Tecan.

2.4. Metodologia de amostragem

[095] As amostras de ambos o OD (0,2 mL) e a fração celular e de sobrenadante (1 mL) da cultura são tiradas a cada duas horas até que a fase estacionária e a cada duas horas durante a fase estacionária. A amostra de 1 ml é primeiro centrifugada (11), após o que o pélete e o sobrenadante de células são separados e armazenados separadamente a -20°C. O sobrenadante é armazenado para análise de produto extracelular, enquanto que os péletes são utilizados para análise de metabólitos intracelulares.

2.5. Métodos analíticos

[096] A densidade celular da cultura foi frequentemente monitorada por medição da densidade ótica a 600 nm (espectrofotômetro Uvikom 922, BRS, Bruxelas, Bélgica) ou com o leitor de placa de microtitulação Biochrom Anthos Zenyth 340. O peso celular seco foi obtido por centrifugação (15 min, 5000 g, rotor GSA, Sorvall RC-5B, Goffin Meyvis, Kapellen, Bélgica) com 20 g de caldo de reator em falcons pré-secos e pesados. Os péletes foram subsequentemente lavados uma vez com 20 ml de solução fisiológica (9 g/l de NaCl) e secos a 70°C até um peso constante. Para ser capaz de converter medições de OD600nm às concentrações de biomassa, uma curva de correlação de OD600nm para a concentração de biomassa foi feita. As concentrações de glicose e ácidos orgânicos foram determinadas em um sistema de Varian Prostar HPLC (Varian, Sint-Katelijne- Waver, Bélgica), utilizando uma coluna Aminex HPX-87H (BioRad, Eke, Bélgica) foi aquecida a 65°C, provida de 1 cm de pré-coluna, utilizando 5 mM de H2SO4 (0,6 ml/min) como fase móvel. Um detector de onda dupla de UV-VIS (210 nm e 265 nm) (Varian Prostar 325) e um detector de índice de refração diferencial (Merck LaChrom L-7490, Merck, Leuven, Bélgica) foi utilizado para detecção de pico. Ao dividir as absorções dos picos em ambos os 265 e 210 nm, os picos podem ser identificados. A divisão resulta em um valor constante, típico para um determinado composto (fórmula de BeerLambert).

[097] Glicose, frutose, sacarose, oligossacarídeos e glicose-1-fosfato foram medidos por HPLC com uma coluna Hypercarb e foram detectados com um detector de MSMS (Antonio et al, 2007;. Nielsen et al., 2006).

2.6. Métodos genéticos

[098] Os métodos utilizados para a construção mutante são descrito abaixos.

[099] Os plasmídeos foram mantidos no hospedeiro de E. coli DH5a (F-, Φ80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA 1, endA 1, hsdR 17(rk-, mk+), phoA, supE44, À—, thi- 1, gyrA96, relA1).

[0100] Plasmídeos. Plasmídeo de expressão de levedura p2a_2μ_Lac4 disponível no Laboratório da Biotecnologia e Biocatálise Industrial foi utilizado para permitir o crescimento de Saccharomyces sobre lactose como única fonte de C. Este plasmídeo contém um gene de resistência à ampicilina e uma origem bacteriana de replicação para permitir a seleção e manutenção em E. coli. O plasmídeo contém ainda o ori de levedura 2μ e o marcador de seleção Ura3 para seleção e manutenção em levedura. Finalmente, o plasmídeo contem uma cassete de expressão de β-galactosidase (SEQ ID 9, Figura 15).

[0101] Mutações. As mutações consistiram na introdução de plasmídeo utilizando p2a_2μ_Lac4 (descrito acima) e o gene knock-in (KI) (KI no lócus de DNAr), utilizando DNA linear de cadeia dupla (acima descrito). Os transformantes foram plaqueados em SD CSM-Ura após a transformação com DNA de plasmídeo ou em SD CSM-Ura com lactose como única fonte de C após transformação com DNA linear de cadeia dupla. Os mutantes selecionados portando os plasmídeos foram verificados por PCR com os iniciadores correspondentes p2a_2μ_Lac4. Os mutantes knock-in genômicos selecionados foram verificados por PCR com primers a montante e a jusante da região modificada, e confirmados por sequenciamento (realizada a LGC Genomics (grupo LGC, Alemanha)).

[0102] DNA de cadeia dupla Linear. Os amplicóns de ds-DNA lineares foram obtidos por PCR usando o plasmídeo pJet_KI_pl_LaCl2_t@rDNAr ou pJet_KI_p2_LaCl2_t@rDNA. Estes plasmídeos contêm regiões de homologia de 2 500 pb (HR1 (SEQ ID 10, Figura 16) e HR2 (SEQ ID 11, Figura 17)) que flanqueiam SEQ ID 7 e SEQ ID 8, respectivamente, no local de multi- clonagem do vetor de clonagem de pJET (Thermo Scientific). Os iniciadores utilizados são homólogas à extremidade 5' de HR1 (iniciador direto) e a extremidade 3' de HR2 (iniciador inverso). Os produtos de PCR foram purificados por PCR antes da transformação.

[0103] Transformações. Os plasmídeos e DNA de cadeia dupla linear foram transformados utilizando o método Gietz (40).

3. Resultados

[0104] Exemplo 1: Construção de uma lactose permease de E. coli lacY knock no lócus agp

[0105] Em primeiro lugar a cepa MG1655ΔlacY foi construída de acordo com o método de Datsenko e Wanner, como descrito acima. Para este fim, MG1655 foi transformada com pKD46 e DNA linear foi construído a partir dos plasmídeos de base pKD3 e pKD4 com homologias de flanqueamento para o gene lacY. As recombinações bem sucedidas foram então pesquisadas com os antibióticos apropriados. Para garantir que nenhuma lactose poderia ser retomada nesta cepa, a cepa foi cultivada em um meio mínimo contendo apenas lactose como fonte de carbono. Nenhum crescimento foi observado durante esta experiência, portanto, esta célula não poderia transportar lactose mais sobre sua membrana.

[0106] Para construir ainda um sistema de expressão sintético, um promotor sintético e RBS foram sintetizados em combinação com o gene lacY (ordenado de IDT e Geneart). Esta sequência é apresentada na Figura 3. Esta sequência também foi introduzida no genoma no lócus do gene de agp através de uma adaptação da metodologia de Datsenko e Wanner. Resumidamente, o constructo de lactose permease foi montado em primeiro lugar com uma cassete de triagem a partir do plasmídeo pKD3, resultando em um novo plasmídeo, pCX_lacY- Kan. A partir deste plasmídeo, o DNA linear pode ser amplificado por PCR com homologias para a região genômica de agp. Este DNA linear obtido pode então ser transformado em um MG1655ΔlacY de E. coli, em que o plasmídeo pKD46está presente. Isto leva para a recombinação da cassete de expressão de transportador de lactose no genoma, resultando em um organismo de expressão de lactose permease MG1655ΔlacYΔagp::lacYsintético. Para assegurar que o crescimento na lactose foi restaurado, esta cepa foi cultivada num meio de lactose mínima, como descrito acima. Isto resultou na completa restauração do crescimento em lactose, com uma taxa de crescimento semelhante ao do tipo selvagem.

[0107] Exemplo 2: Efeito da lactose com a cepa de E. coli de tipo selvagem e uma cepa mutante de E. coli que não sofre morte por lactose

[0108] Um experimento de frasco de agitação como descrito em materiais e métodos foi criado com o tipo selvagem MG1655 e MG1655ΔlacYΔagp::lacYsintético. Estas cepas foram cultivadas em glicerol a um frasco de meio com agitação (15 g/l de glicerol, conforme descrito nos materiais e métodos) e lactose (solução de estoque de 200 g/l foi adicionada resultando em uma concentração final de 10 g/l) foi adicionada fase mid exponencial (aproximadamente a OD 0,8). Como pode ser visto na Figura 1 e Figura 2, a cepa mutante não sofre morte por lactose.

[0109] Exemplo 3: O uso de sensores de acoplamento traducionais ou traducionais para assegurar a expressão do transportador de lactose

[0110] Porque a cepa knock out de lactose permease completa também não sofreria morte por lactose e o objetivo é obter uma lactose permease funcional, ativa expressa, uma triagem é necessária para assegurar a expressão de lactose permease. Para este fim, as variantes da sequência de promotores, locais de ligação de ribozima, sequências de Kozak, a utilização de códons e terminadores de transcrição podem ser criados. No entanto, essas variantes da sequência podem levar a constructos de expressão nula, por conseguinte, levando às cepas mutantes negativas de transportador de lactose. Por conseguinte, um sistema tem de ser concebido para detectar a expressão do transportador de lactose, de um modo preferido por uma facilidade de gene repórter de triagem tais como lacZ, proteínas fluorescentes ou genes de resistência a antibióticos.

[0111] Construção de um sistema de acoplamento traducional que reinicia a tradução do gene repórter para detectar a expressão do transportador de lactose

[0112] Dois genes podem ser acoplados em translação através da introdução de uma região de reiniciação de tradução 3' do gene de interesse e a 5' do gene repórter. A tradução pode ser reiniciada por vários códons, como AUG, UUG, GUG ou AUA (63). A sequência de um tal constructo, a qual acopla o gene da lactose permease e o gene lacZ em translação é mostrada na Figura 4. Para criar esta sequência, as sequências de lacY e lacZ são amplificadas a partir do genoma de E. coli com os iniciadores com locais de restrição de porta (BsaI, obtido a partir de NEB). A região intergênica que permite o acoplamento de translação pode ser encomendada a partir de qualquer empresa de síntese de genes, tais como IDT ou Geneart. Todas as partes são então montadas através do método Golden Gate como descrito por Engler et al. (2013) (36) em um plasmídeo pUC54 em conjunto com um promotor e sequência RBS como mostrado na Figura 3 (para E. coli) ou em pGK12 que se replica em Bacillus sp. com um promotor de Bacillus e sítio de ligação ao ribossomo.

[0113] Construção de um sistema de acoplamento traducional que inicia a tradução do gene repórter para detectar a expressão do transportador de lactose através da abertura de um circuito no local de ligação

[0114] Um segundo método de ribossomo para a triagem de expressão por meio de acoplamento de translação é descrito por Mendez-Perez et al (2012) (58). Este método foi adaptado para a triagem da expressão da lactose permease com um gene repórter de cloranfenicol. Neste caso, o transportador de lactose lacY é acoplado através de uma cauda de His e local de ligação ao ribossomo ao gene de resistência ao cloranfenicol. As partes de sequências para este constructo também são ordenadas por IDT ou Geneart e montadas através de montagem de porta Golden. A sequência resultante é dada na Figura 5.

[0115] Construção de um sistema de acoplamento translacional que acopla o transportador de lactose de levedura com um gene repórter

[0116] Embora leveduras não usem cistrons, ainda é possível para triagem de expressão através de acoplamento de translação através de locais de entrada ribossômicos virais internos (as chamadas sequências IRES) (56). Um exemplo de uma tal sequência é a sequência de T2A (10), que permite que totalmente independente (que não significa como uma proteína de fusão), mas a tradução acopladas de duas proteínas em um cistrón. Isto significa que, se a última proteína do cistrón é expressa, a primeira proteína é também expressa.

[0117] Em leveduras, o gene de lactose permease de, por exemplo, Kluyveromyces marxianus, pode ser usado para transportar a lactose na célula. Este gene pode ser acoplado com a sequência de T2A ao gene aph 1, que codifica a resistência à geneticina. Esta sequência é construída de modo análogo como descrito acima. A sequência final é dada na Figura 6.

[0118] Construção de um sistema de acoplamento de aptâmero que introduz um aptâmero para o RNA mensageiro da lactose 48ermeasse

[0119] A expressão de lactose permease também pode ser detectada em um nível de RNA mensageiro. Para este fim, um aptâmero de ligação (Z)-4-(3,5-difluoro-4- hidroxibenzilideno)-l,2-dimetil-lH-imidazol-5(4H)-ona é clonado após a sequência de codificação de lactose permease como mostrado na Figura 7. A expressão deste constructo é modulada adicionalmente como descrito no exemplo 6. Após o crescimento das células, (Z)-4-(3,5-difluoro-4- hidroxibenzilideno)-l,2-dimetil-lH-imidazol-5(4H)-ona é adicionado ao meio como descrito por Pothoulakis et al (2013) (64) e as cepas mutantes expressando lactose permease são selecionadas através de um separador de células ativado por fluorescência (FACS).

[0120] Exemplo 4: Detecção da expressão de um transportador de lactose translacional juntamente com um gene de resistência ao cloranfenicol

[0121] Duas cepas foram construídas, em que lactose permease foi knockout para fora do genoma. Em ambas as linhagens, um plasmídeo pSC101 contendo um gene de resistência à canamicina foi transformado, com a diferença de que um dos plasmídeos continham uma lactose permease constitutivamente expressa como descrito no Exemplo 1 e 2, resultando em uma cepa de referência MG1655ΔlacY pSC101_kan lacY_cat e a cepa translacional acoplada MG1655ΔlacY pSC101_kan_ lacY_sintética_cat como descrito no Exemplo 4 e na Figura 5. Ambas as cepas foram cultivadas em um meio mínimo tal como descrito acima, em diferentes concentrações de cloranfenicol (entre 0 e 30 mg/l). Figuras 8 e 9 mostram que após 48 e 92 horas de crescimento, que o crescimento da cepa de referência é inibida a uma concentração de cloranfenicol menor do que a cepa mutante lacY_cat translacional acoplada, o que torna esse sistema uma excelente triagem de constructos genéticos expressando lactose permease.

[0122] Exemplo 5: Procedimento de Triagem para mutantes expressando lactose permease que não se submetem a morte por lactose

[0123] Semelhante ao exemplo 2, uma mistura de duas cepas resistentes ao cloranfenicol foram cultivadas, uma cepa que não sofre morte por lactose e translacional acoplada ao cloranfenicol, e uma cepa com a cassete de cloranfenicol, mas com o sistema de expressão natural da lactose permease. Ambas as cepas foram cultivadas em meio, tal como descrito no exemplo 2 e a fase de lactose exponencial média foi adicionada, como mostrado no exemplo 2. A cepa mutante que não sofre morte por lactose continuou a crescer, enquanto a outra cepa, que é sensível à morte por lactose, parou de crescer . No final da fase exponencial, 0,1 ml desta cultura foi inoculado em um segundo frasco de agitação com uma forma semelhante à descrita anteriormente. Mais uma vez, a lactose de OD de 0,8 foi adicionada, detendo o crescimento da cepa sensível à morte por lactose, e enriquecendo ainda mais a cepa mutante que não sofre morte por lactose. Após 5 repetições deste procedimento, obteve-se um enriquecimento de 99% da cepa mutante que não sofre morte por lactose, que é então facilmente isolado a partir da cultura.

[0124] Exemplo 6: Criação de mutantes de cassetes de expressão de lactose permease

[0125] As variantes de sequências de promotores, locais de ligação ao ribossomo, sequências de Kozak, terminadores de transcrição e variantes genéticas de lactose permease (com diferentes usos de códon) são ordenadas em vendedores de síntese de genes tais como IDT, Geneart, Genscript, Gen9, A concepção de uma biblioteca de promotor para bactérias são baseados na sequência de consenso de promotores bacterianos, com duas regiões conservadas a - 10 e -35 pb do início da transcrição. As bases de entre, antes e depois de estas regiões conservadas são então variadas aleatoriamente com A, T, G ou C, conduzindo aos promotores com diferentes dosagens de expressão. Alternativamente, as regiões conservadas são variadas e a sequência circundante é mantida fixa, que também leva à promotores com diferentes dosagens. Estas misturas de sequência são então clonadas (quer através de Gibson, Assembly, Golden Gate Assembly, Cliva Assembly, LCR ou ligadura de restrição) (25, 36, 50, 79) em frente de uma lactose permease acoplada translacional que conduz a uma biblioteca de cassetes de expressão de lactose permease que podem ser rastreados por meio do protocolo de triagem descrito no Exemplo 5.

[0126] Uma biblioteca de promotor eucariótico é criada com base em um promotor de núcleo (13). Para Saccharomyces cerevisiae, este promotor pode ser um promotor heterólogo TEF pTEFl que é reforçado com sequências UAS e é mutado para variar a força do promotor (12). Um tal promotor é ordenado e clonado como descrito acima na frente de uma lactose permease acoplada translacional, e o constructo final transformado em uma levedura tal como Saccharomyces cerevisiae, ou em um plasmídeo para a integração em um cromossomo.

[0127] A região não traduzida consiste em procariotas de um local de ligação ao ribossomo e para eucariotas de uma sequência de Kozak. Ambas as sequências são randomizados e clonadas em frente da sequência de codificação, tal como descrito acima, que conduz a uma biblioteca de cassetes de expressão com diferentes eficiências de translação. A randomização pode ser racionalizada com ferramentas, tais como calculadora RBS que calcula a correlação da eficiência de tradução de sequência, e a redução do número de variantes que têm que ser incluídas na biblioteca (67).

[0128] A utilização de códons é alterada por meio de alteração da sequência codificadora do gene, sem alterar a sequência de aminoácidos da proteína. Isso é chamado de adaptação de códon. Os usos de códon, através da sequência de códons são alterados de tal forma que mais ou menos códons raros são introduzidos em certas regiões, que conduz a eficiências de expressão alterada e eficiências de dobragem. Uma permease com apenas códons raros na sua sequência (determinada em um organismo base por meio do banco de dados de utilização de códons (61)) apresenta taxas de conversão mais baixas do que permeases com uma sequência de códon totalmente otimizada (com apenas códons com elevada ocorrência do organismo alvo). Além disso, os primeiros códons da sequência de codificação também influenciam a eficiência de Kozak ou local de ligação ao ribossomo (62, 69, 78).

[0129] A região de terminação da transcrição é variada por meio de sequências de terminação de transcrição endógena ou exógena encontradas na base de dados (18, 26). Estes terminadores de transcrição também são clonados semelhante ao método descrito acima.

[0130] Exemplo 7: Enriquecimento de cassetes de expressão que expressam lactose permease e não conduzem à morte por lactose

[0131] As cassetes de expressão são criadas de acordo com o exemplo 3 e 7. Isto conduz a uma biblioteca de cassetes de expressão da lactose permease. As cassetes de expressão que resultam na expressão de lactose permease são selecionadas de acordo com os métodos do Exemplo 3 e 4. As cassetes de expressão, expressão de lactose permease, que não levam à morte por lactose são selecionadas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 2 e 5. As cassetes de expressão selecionadas são adicionalmente analisadas por sequenciamento, e por o método descrito no exemplo 2.

[0132] Exemplo 8: Produção de 2-fucosilactose fermentativa com uma fucosiltransferase proveniente de Helicobacter pylori com E. coli

[0133] A cepa mutante em que os genes lacZ, glgC, agp, pfkA, pflcB, pgi, arcA, iclR, wcaJ são eliminados e lacY foi expressa através de expressão constitutiva, tal como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 2, para assegurar a expressão em todas as condições de cultura, foi transformada ainda com uma fucosil-transferase proveniente de Helicobacter pylori e uma fosforilase de sacarose proveniente de Bifidobacterium adolescentis, que também foram expressas constitutivamente. Os promotores constitutivos são originários a partir da biblioteca de promotor descrita por De Mey et al. 2007. Esta cepa foi cultivada num meio tal como descrito nos materiais e métodos, no entanto, com 30 g/l de sacarose e 50 g/l de lactose. Isto resultou na formação de até 1,5 g/l de 2'-fucosilactose

[0134] Exemplo 9: Produção de lotes alimentados de 2-fucosilactose com E. coli

[0135] Uma cepa mutante foi construída através das metodologias de engenharia genética descritas acima com o seguinte genótipo:

[0136] ΔlacZYAΔglgCΔagpΔpgiΔpfkA-P22- baSPΔpfkBΔarcAΔiclR::slΔwcaJΔlonΔadhE-P14-frk + pCXP14- FT_H. pylori (um vetor com a sequência SEQ ID N° 6, ver Figura 10) com expressão de lactose permease alterada conforme descrito no exemplo 1 e o exemplo 2. O promotor P22 e P14 são originários da biblioteca de promotor construída por De Mey et al (29) e foi clonado semelhante à metodologia descrita por Aerts et al (1). “::sl” marca uma deleção do gene scarless, portanto, sem um sítio FRT que permanece no cromossomo.

[0137] Esta cepa foi cultivada em um biorreator, como descrito acima em Materiais e Métodos, em meio mineral com 30 g/l de sacarose e 50 g/l de lactose. Após a fase de lote o bioreator foi alimentado com 500 g/l de sacarose, 50 g/l de lactose e 1 g/l de hepta-hidrato de sulfato de magnésio. Isto conduziu à acumulação de 27,5 g/l de fucosilactose no sobrenadante.

[0138] Exemplo 10: Produção de lactoNriose com E. coli

[0139] Uma cepa mutante foi construída por meio de engenharia genética com as metodologias descritas acima, expressão de uma UDP-N-acetilglucosamina transferase, uma sacarose fosforilase e uma L-glutamina: D-frutose-6-fosfato- aminotransferase e uma uridiltransferase glucosamina em um plasmídeo pBR322 com cada um promotor constitutivo do promotor de biblioteca de Mey et al (29) e com um marcador de seleção da beta-lactamase. Este vetor foi transformado em uma cepa mutante de E. coli com o genótipo ΔlacZYAΔglgCΔagp::P14-frk-P22-BaSPΔpgiΔpfkAΔpfkB ΔnagABCDEΔmanAΔnanATEKΔmanXYZ expressando lactose permease constitutivamente como descrito acima. Esta cepa foi cultivada em um balão de agitação tal como descrito acima, com a lactose e a sacarose como fonte de carbono, com ou sem glicerol adicional. Este hospedeiro de produção não foi submetidos à morte por lactose, e produziu 62,5 e 55,3 mg/l de lactoNriose, respectivamente, a partir da lactose adicionada.

[0140] Exemplo 11: Construção de uma levedura de K. marxianus de lactose permease (PI) knock in no lócus de rDNA.

[0141] Em primeiro lugar, o plasmídeo p2a_2μ_Lac4 foi usado para transformar a cepa de tipo selvagem de Saccharomyces cerevisiae BY4742. A transformação foi realizada utilizando um total de 4 ug de plasmídeo utilizando o protocolo Gietz (40). As células de levedura transformadas foram semeadas em placas de abandono SD-CSM (sem uracila). Após dois dias, o crescimento foi observado nas placas e as colônias de leveduras foram testadas quanto à presença do plasmídeo desejado. Colony PCR foi realizada em todas as 33 colônias. Todas colônias testadas positivas para a presença do plasmídeo p2a_2μ_Lac4. Colony 5 foi selecionado para posterior utilização. Esta colônia foi transformada com 2 ug de DNA linear de cadeia dupla obtido a partir de pJet_KI_pl_LaCl2_t@rDNA. As células transformadas foram semeadas em placas de SD-CSM-Ura com lactose como única fonte de C. Três dias após a transformação, várias colônias foram cultivadas suficientemente para serem testadas para a presença da cassete de expressão Lacl2 no rDNA de Saccharomyces. Colony PCR foi realizada em todas as colônias. Todas as colônias foram positivas para a presença da cassete de expressão Lacl2. Colony 6 foi selecionada para uso posterior (Saccharomyces KI1_pl_LaC12_t@rDNA).

[0142] Exemplo 12: Construção de uma lactose permease de levedura K. marxianus (p2) knock in no lócus de rDNA.

[0143] Em primeiro lugar, o plasmídeo p2a_2μ_Lac4 foi usada para transformar a cepa de tipo selvagem Saccharomyces cerevisiae BY4742. A transformação foi realizada utilizando um total de 4 ug de plasmídeo utilizando o protocolo Gietz (40). As células de levedura transformadas foram semeadas em placas de abandono SD-CSM (sem uracila). Após dois dias, o crescimento foi observado nas placas e as colônias de leveduras foram testadas quanto à presença do plasmídeo desejado. Colony PCR foi realizada em todas as 33 colônias. Todas colônias testadas positivas para a presença do plasmídeo p2a_2μ_Lac4. Colony 5 foi selecionada para posterior utilização. Esta colônia foi transformada com 2 ug de DNA linear de cadeia dupla obtido a partir de pJet_KI_p2_LaCl2_t@rDNA. As células transformadas foram semeadas em placas de SD-CSM-Ura com lactose como única fonte de C. Três dias após a transformação, várias colônias foram cultivadas em suficientemente para ser testadas para a presença da cassete de expressão Lac12 no rDNA de Saccharomyces. Colony PCR foi realizada em todas as colônias. Todas as colônias foram positivas para a presença da cassete de expressão Lac12. Colony 7 foi selecionada para uso posterior (Saccharomyces KI_p2_LaC12_t@rDNA).

[0144] Exemplo 13: Crescimento em lactose de uma cepa de levedura do tipo selvagem e 2 cepas de leveduras mutantes

[0145] Um experimento de frasco de agitação como descrito em materiais e métodos foi criado com o tipo selvagem Kluyveromyces, Saccharomyces KI_pl_Lac12_t@rDNA e Saccharomyces KI_p2_Lac12_t@rDNA. Estas cepas foram cultivadas num meio de frasco de agitação contendo a lactose como única fonte de C (20 g/L). Como pode ser visto na Tabela 1, as cepas mutantes de Saccharomyces crescem tão rápido quanto o tipo selvagem Kluyveromyces marcianus lactis, que é conhecido por crescimento rápido em lactose (31). A lactose permease expressa constitutivamente, assim, garante influxo rápido e eficiente de lactose na célula de levedura. Tabela 1

[0146] Exemplo 14: O efeito da lactose na cepa de levedura do tipo selvagem e cepas mutantes de levedura que não se submetem à morte por lactose

[0147] Um experimento de frasco de agitação como descrito em materiais e métodos foi criada com o tipo selvagem Kluyveromyces, Saccharomyces KI_pl_Lac12_t@rDNA e Saccharomyces KI_p2_Lac12_t@rDNA. Estas cepas foram cultivadas em um meio de frasco de agitação de glicose (20 g/L de glicose, tal como descrito nos materiais e métodos) e lactose (200 g/L de solução estoque foi adicionada resultando em uma concentração final de 10 g/L) foi adicionado fase mid exponencial. Como pode ser visto na Figura 11 e Figura 12, as cepas mutantes não sofrem morte por lactose. No entanto, o influxo rápido e eficiente de lactose nestes célula de levedura foi comprovado no exemplo 13.

[0148] Exemplo 15: O sequenciamento de cassetes de expressão de lactose permease que não se submetem à morte por lactose

[0149] 46 colônias provenientes da triagem descritas acima foram sequenciadas, resultando na SEQ ID N° 12-57 (Figura 18). Estas sequências são promotoras e variantes RBS que não resultam na morte por lactose, quando expressas em E. coli. Note-se que esta é uma seleção de uma enorme quantidade de colônias que foi sequenciada, daí, a metodologia de triagem resultou em muito mais sequências do que as mostradas na Figura 18, e metodologias alternativas de criação da biblioteca tal como descrito acima, conduzirão também outras sequências além das mostradas na Figura 18.

[0150] Exemplo 16: Determinação da μMAx das cepas mutantes de cassete de expressão de lactose permeasse. Todas as cepas foram ou iniciadas a partir de placa de LB-ágar ou a partir de criovial, e inoculadas em 5,0 mL de meio de caldo de Luria (10 g de triptona; 5g de extrato de levedura, 10 g de NaCl). Depois de crescer o/n a 37°C, 1 mL desta pré- cultura foi adicionado a um frasco agitador de 500 mL contendo 100 mL de meios de Lactose mínimo (2,0g/L de NH4Cl; 5,0g/L de (NH4)2SO4 ; 3,0g/L de KH2PO4, 7,3g/L de K2HPO4 ; 8,4 g/L de MOPS; 0,5g/L de MgSO4 x 7H2O; 0,5 g/L de NaCl, 10 g/L de lactose; 0,4 mg/L de Na2EDTA x 2H2O; 0,03mg/L de H3BO3; 1,01 mg/L de tiamina HCL; 0,94 mg/L de ZnCl2; 0,5 mg/L C0Cl2 x 6H2O; 0,38 mg/L de CuCl2 x 2H2O; 1,59 mg/L de MnCl2 x 4H2O; 3,6 mg/L de CaCl2 e 0,096 mg/L de Na2MoO4 x 2H2O); pH 7,0. Depois de crescer o/n a 37°C, ambas as pré-culturas foram diluídas com meio de lactose mínima para um OD600 de 0,050. A suspensão foi então transferida para uma placa de 96 MTP (n = 32), coberta por uma tampa easyseal. Medições de OD foram realizadas a cada 10 minutos durante 24 horas usando o Infinite M200 pro (TECAN) sob as seguintes condições: Temperatura: 37°C +/- 0,5; agitar a 597 segundos; amplitude de agitação de 2 mm; 280 rpm; comprimento de onda OD600; Flash # 10; tempo de contenção de 150 ms).

[0151] Exemplo 17: Caracterização de cassetes de expressão de lactose permease

[0152] Um método para reduzir ou eliminar a morte por lactose é para reduzir significativamente ou eliminar a atividade da lactose permease (ver Exemplo 16). No entanto, tendo em conta a produção de bioprodutos à base de lactose ou galactose, um elevado fluxo de lactose para a célula é necessário. Aqui nós provamos de que o influxo de lactose de cepas mutantes resistentes à morte por lactose matar ainda é comparável, igual ou mesmo maior do que o influxo de lactose do organismo de tipo selvagem que sofre morte por lactose. Para este fim, os novos cassetes de expressão de lactose permease foram introduzidos em uma cepa MG1655ΔlacY, que expressa ainda beta-galactosidase. A taxa de crescimento destas novas cepas são uma medida para o influxo de lactose, porque qualquer cepa que tem uma expressão reduzida significativa na expressão de lactose permease terá uma taxa de crescimento significativamente reduzida.

[0153] Os resultados desta análise são mostrados na Figura 19. Quase todas as cepas mostradas nesta figura têm uma taxa de crescimento igual ou superior ao tipo selvagem, indicando uma atividade de lactose permease e de expressão que é igual ou maior do que o tipo selvagem, no entanto, em contraste com o sistema tipo de expressão selvagem, estas cassetes de expressão não resultam em morte por lactose. Este método é no entanto limitado pela expressão do gene da beta-galactosidase que se torna a etapa limitante da velocidade para o crescimento. Portanto, a expressão do gene da lactose permease foi medida através do sistema de acoplamento descrito translacional acima descrito acima. A concentração de inibição mínima (MIC) para o cloranfenicol é indicativa para a expressão do gene da lactose permease e esta foi determinada para cada uma das cassetes. A menor MIC que ainda resultou na mesma taxa de crescimento em comparação com o tipo selvagem foi utilizada como um indicador para a expressão da expressão de lactose permease de tipo selvagem.

[0154] As cassetes com a menor MIC que têm a mesma taxa de crescimento como a cepa do tipo selvagem têm uma MIC de aproximadamente 20 mg/l de cloranfenicol. As cepas mutantes com uma taxa de crescimento ligeiramente inferior têm uma MIC que varia entre 15 e 20 mg/l, e as cepas mutantes com taxa de crescimento igual ou superior têm uma MIC entre 20 e 80 mg/l. 85% das sequências se enquadram na última categoria, o que significa que a maioria das sequências que foram identificadas como cassetes de expressão negativas para a morte por lactose têm uma maior expressão de lactose permease, ao contrário do que foi anteriormente descrito na literatura.

[0155] Exemplo 18: Construção de uma cassete de expressão de promotor laclq

[0156] Semelhante ao método descrito acima, um promotor placIQ foi clonado em frente do gene lacY de E. coli. A sequência final desta construção é mostrada na Figura 20.

[0157] Exemplo 19: Outros promotores utilizados na técnica que se submetem à morte por lactose

[0158] O promotor placIQ é um promotor que tem sido utilizado na técnica para a expressão da lactose permease em E. coli. A utilização deste promotor resultou na absorção de lactose para a célula. No entanto, o efeito de tal absorção não foi testado. A taxa de crescimento em lactose do tipo selvagem não foi significativamente diferente do promotor laclq (μmax de 0,1 e 0,11 h-1 , respectivamente), indicando, portanto, uma taxa de absorção de lactose semelhante. Uma triagem de morte por lactose desta cassete de expressão lacIQ provou que este promotor também levou à morte por lactose (ver Figura 21). Isto prova que existem sequências promotoras específicas levando à morte por lactose e outras sequências que não conduzem à morte por lactose. a racionalização das sequências não é possível, e a tentativa e erro de sequências individuais é uma tarefa trabalhosa que levaria a custos enormes, daí a metodologia descrita acima para a identidade das cassetes de expressão que não se submetem à morte por lactose é a maneira perfeita para evitar trabalho de triagem longo e custoso.

[0159] Exemplo 20: Produção de lactoNtetraose com S. cerevisiae

[0160] As cepas mutantes construídas no Exemplo 11 e 12 foram transformadas adicionalmente com uma β-1,4- galactosiltransferase e uma β 1,3-N- acetilglucosaminiltransferase proveniente de Neisseria meningitidis, que também foram expressas constitutivamente, utilizando um vetor de expressão de levedura padrão, para exemplo, como descrito por Lee et. al. (52). As cepas foram cultivadas em um meio como descrito nos materiais e métodos, no entanto, com 20 g/l de sacarose e 20 g/l de lactose. Isto resultou na formação de até 30 mg/l de lactoNtetraose.

[0161] Exemplo 21: Produção de 2-fucosilactose com S. cerevisiae

[0162] As cepas mutantes construídas no Exemplo 11 e 12 foram transformadas adicionalmente com uma GDP-fucose sintase e uma GDP-manose 4,6-desidratase de E. coli, e uma fucosil-transferase proveniente de Helicobacter pylori, que também foram expressas constitutivamente, usando um padrão vetor de expressão de levedura, por exemplo, como descrito por Lee et. al. (52). As cepas foram cultivadas em um meio como descrito nos materiais e métodos, no entanto, com 20 g/l de sacarose e 20 g/l de lactose. Isto resultou na formação de até 10 mg/l de 2 fucosilactose. Referências 1. Aerts, D., T. Verhaeghe, M. De Mey, T. Desmet, and W. Soetaert. 2010. A constitutive expression system for high throughput screening. Engineering in Life Sciences 10:DOI: 10.1002/elsc.201000065. 2. Agrawal, N., P. V. N. Dasaradhi, A. Mohmmed, P. Malhotra, R. K. Bhatnagar, and S. K. Mukherjee. 2003. RNA Interference: Biology, Mechanism, and Applications. Microbiology and Molecular Biology Reviews 67:657-685. 3. 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Claims

1. Método para a produção de microrganismos que resistem ao fenômeno de morte por lactose, quando cultivados em um ambiente no qual a lactose é combinada com outra fonte de carbono, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende: a. alterar a expressão de um transportador de lactose dentro de microrganismos por uma mutação que consiste na introdução de um promotor heterólogo na frente de um gene transportador de lactose endógeno ou exógeno, e/ou, por mutação da região não traduzida na frente da sequência codificadora que contém as sequências de ligação ao ribossomo ou sequências Kozak e/ou por modificação do uso de códons do gene transportador endógeno de lactose, em que a referida mutação resulta na expressão do referido transportador de lactose, b. cultivar os referidos microrganismos mutantes em um meio compreendendo uma fonte de carbono, que não é a lactose, c. adicionar lactose ao referido meio compreendendo uma fonte de carbono que não é lactose durante o crescimento dos referidos microrganismos mutados, e d. selecionar os microrganismos que resistem ao fenômeno da morte por lactose baseado no crescimento no referido meio compreendendo a lactose e outra fonte de carbono, e que retêm pelo menos 50% do influxo de lactose obtido com o cassete de expressão do tipo selvagem do referido transportador de lactose.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida introdução de um promotor heterólogo na frente de um gene transportador de lactose endógeno ou exógeno é realizada por: a) excluindo os transportadores de lactose endógenos do genoma e reintroduzi-los em outro local dentro do genoma do referido microrganismo, ou, b) pela introdução de um promotor heterólogo na frente dos transportadores de lactose endógenos, ou, c) por knocking out do promotor de lactose endógeno e a introdução de um promotor heterólogo, no mesmo local no genoma do referido microrganismo.

3. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que o referido transportador de lactose expresso é detectado através do acoplamento traducional com um gene repórter e/ou através de acoplamento de aptâmero.

4. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido transportador de lactose expresso é detectado através de constructos genéticos como fornecido nas SEQ ID N° 2, 3, 4 e/ou 5.

5. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido transportador de lactose é uma lactose permease.

6. Método, de acordo com as reivindicações l a 5, caracterizado pelo fato de que o referido microrganismo é uma célula de bactéria, de levedura ou de fungo.

7. Cassete de expressão de transportador de lactose que conduz à expressão de um transportador de lactose e que não resulta no fenótipo de morte por lactose caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência como dado pela SEQ ID N° 1, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19,20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 ou 57.

8. Microrganismo que resiste ao fenômeno da morte por lactose quando cultivado em um ambiente no qual a lactose é combinada com outra(s) fonte(s) de carbono caracterizado pelo fato de que o referido microrganismo é uma bactéria que possui uma cassete de expressão de transportador de lactose compreendendo uma sequência como dada pela SEQ ID N° 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 ou 57, ou em que o referido microrganismo é uma levedura tendo um cassete de expressão de transportador de lactose compreende uma sequência como dado em SEQ ID N° 7 ou 8.

9. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida bactéria é E. coli e a referida levedura é S. cerevisae.

10. Microrganismo, de acordo com as reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que os genes que codificam para as enzimas a partir das vias de degradação de lactose e/ou de galactose são tornados menos funcionais ou não funcionais.

11. Uso de um microrganismo conforme definido nas reivindicações 8 a 10 ou um cassete de expressão de transportador de lactose conforme definido na reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é para a produção de produtos de especialidade baseados em lactose e/ou em galactose.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que os referidos produtos de especialidade baseados em lactose são carboidratos, glicolipídeos e compostos galactosilados de especialidade.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os referidos carboidratos de especialidade são 2-fucosilactose ou 2'-fucosilactose ou 3-fucosilactose ou 2',3-difucosilactose ou lactoNtriose ou lacto-N-tetraose, ou lacto-nN-tetraose ou 3'sialilactose ou 6'sialilactose.