KR20170076650A - 락토스 사멸에 내성인 돌연변이 미생물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 락토스 사멸 현상에 내성인 돌연변이 미생물을 제조하는 방법과, 이 방법을 통하여 제조될 수 있는 미생물에 관한다. 이와 같이 조작된 미생물은 특수제품, 예를 들어 특수 탄수화물, 당 지질 및 갈락토실화 화합물(이에 한정되는 것은 아님)의 제조를 위해 사용될 수 있다.

Description

락토스 사멸에 내성인 돌연변이 미생물{MUTANT MICROORGANISMS RESISTANT TO LACTOSE KILLING}

본 발명은 락토스 사멸(lactose killing) 현상에 내성인 돌연변이 미생물을 제조하는 방법과, 이 방법을 통하여 제조될 수 있는 미생물에 관한 것이다. 이와 같이 조작된 미생물은 특수제품(specialty product), 예를 들어 특수 탄수화물, 당 지질 및 갈락토실화 화합물(이에 한정되는 것은 아님)의 제조를 위해 사용될 수 있다.

락토스 사멸은 다른 탄소 원과 함께 락토스가 존재할 때 다수의 유기체의 성장을 위협하는, 널리 알려지고 활발히 연구된 원리이다. 그러나 이 현상을 유도하는데 필요한 특징들은 꽤 명확하게 규명되어 있지만, 상기 현상을 뒷받침하는 정확한 기작은 알려져 있지 않다. 락토스 사멸은, 다른 탄소 원, 예를 들어 글리세롤 또는 수크로스(이에 한정되는 것은 아님)를 바탕으로 성장하는 미생물 배양액에 락토스가 첨가될 때 발생한다. 뿐만 아니라, 락토스 사멸은, 락토스 이송 유전자가 유도적으로 발현되거나 구성적으로 발현될 때 중 어느 한 가지의 경우에 발생한다(33, 39, 75). 락토스 사멸은 락토스 투과효소 발현이 화학물질환경조절장치 조건에서 IPTG 및 락토스로 조정되었던 대장균(E. Coli)에서 처음 관찰되었다(28). 이후 락토스 사멸은 또한 리조비움 멜리로티(Rhizobium meliloti), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)에서도 관찰되었다(55, 70, 77). 이 현상의 잠재적 이유들 중 하나는 세포에 대한 락토스 이송체 활성의 소위 "비용" 탓인데, 이 "비용"은 성장의 감소 또는 억제를 초래할 뿐만 아니라, 충분히 높은 생성물 역가 및 수율을 달성하기 위해 산업 공정에서 주로 높게 유지되는 세포 외 락토스 농도에 관련되어 있기도 하다(34). 그러나 당 업계는, 이러한 조건하에서 락토스가 이송되는 한 락토스 사멸이 일어날 수밖에 없음을 진술하고 있다. 락토스 사멸의 문제를 해결하기 위해서 락토스 투과효소를 결실시키는 것 또는 락토스 섭취를 대폭 감소시키는 것이 제안된바 있다(34). 예를 들어 Lodi외 다수는, 케이.락티스 내 락토스 투과효소를 결실(녹-아웃(knock-out))시켰더니, 락토스 사멸이 더 이상 발생하지 않았음을 발견하였다. Lodi외 다수의 실험이 진행되는 동안 일어난 자발적 돌연변이들을 통하여, 선택된 락토스 사멸 음성 균주들에 있어 자체의 락토스 섭취가 대폭 감소되었음도 추가로 확인되었다. 그러나, 특수 제품 또는 바이오제품을 효율적으로 합성하기 위해서는 락토스 섭취가 필수이다. 따라서, 이와 같은 바이오제품의 제조가 1) 효율적 락토스 섭취 및 2) '락토스 사멸 표현형'을 초래하지 않는 발현 카세트를 필요로 하므로, 락토스 투과효소 결실 또는 락토스 투과효소 활성의 대폭 감소는 확실히 해결책이 못된다. 락토스 기반 바이오제품의 제조를 위한 락토스 투과효소는 이전에도 사용되었지만, 이 경우에도 '락토스 사멸 표현형'을 해결하지는 못하였다. 과거 이 문제는, 락토스 섭취를 대폭 감소시키거나(이와 같이 감소시켜 특수제품이 거의 또는 아예 락토스를 기반으로 제조되지 않도록 만들거나) 또는 성장 단계와 생산 단계를 분리시켜 충분한 제1 바이오매스를 제조함으로써 해결되었다. 이러한 성장 단계 이후, 락토스는 제2단계에 도입되어 특수 제품으로 제조된다. 이와 같은 제2단계에서 성장 감소는 일어나지 않게 되거나 성장은 대폭으로 감소하게 된다(59).

그러므로 보통의 락토스 섭취는 항상 락토스 사멸을 초래할 것이므로 락토스 사멸을 피하기 위해 락토스 섭취는 억제되거나 대폭 감소하여야 한다는 점에서 현재 의견 일치를 보이고 있다. 이와는 대조적으로, 본 발명은 락토스 사멸을 진행하지 않으면서 락토스의 효율적 섭취를 허용하는 락토스 투과효소 발현 카세트를 찾기 위한 스크리닝 방법을 개시한다. 락토스는 다수의 바이오제품, 더욱 구체적으로 특수 탄수화물(14), 당 지질 및 갈락토실화 화합물, 예를 들어 갈락토실 지질, 갈락토실 세라마이드 및 갈락토실화 어글리콘에 대한 빌딩블록(building block)이다. 다수의 경우 갈락토스 기는 약품의 장기 표적화에 사용된다(28). 그러나, 다른 기질과 함께 락토스를 기질로서 사용하는 것은, 그것이 전술된 '락토스 사멸' 현상 때문인 것으로 보일 수 있을 만큼 확실한 방법이 되지는 못한다. 일반적으로 락토스 사멸을 피하기 위해서는 다단계 생산 계, 즉 비 성장성 공역 세포 계(non-growing coupled cell system)가 필요하다(32, 48).

특수 탄수화물 다수의 구조상 기본 주쇄는 락토스 또는 갈락토스 단위들로 이루어져 있다. 더욱 구체적으로, 인간 젖 올리고당류, 더욱 구체적으로 모유 올리고당류, 당류 및 올리고당류의 광범위한 군은 갈락토스 및 락토스 단위들로 이루어진다(15). 이러한 탄수화물들은 당 기, 예를 들어 N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 시알산(예를 들어 N-아세틸뉴라미네이트, N-글리코일뉴라미네이트, 2-케토-3-데옥시-D-글리세로-갈락토-노눌로소닉 산 등)(21), L-푸코스 등으로 추가 변형된다. 이후 이러한 화합물의 합성은 매우 고가이면서 합성하기 어려운 분자이자, 선택적으로는 자체의 생합성에 에너지를 필요로 하기 때문에 살아있는 성장중의 세포에 의해 생산되는, 활성화된 탄수화물, 예를 들어 UDP-N-아세틸글루코사민, UDP-N-아세틸갈락토사민, CMP-시알산, GDP-푸코스 등을 필요로 한다. 인간 젖/모유의 올리고당류 성분들은 치료법에 있어 소염 효과 및 프리바이오틱 효과(prebiotic effect)를 가지고/가지거나, 기능식품, 소염제, 프리바이오틱 또는 약품으로서 사용된다(15, 24, 68).

그러나, 기능식품, 소염제, 프리바이오틱 또는 약품과 같은 고부가가치 화합물을 제조하는 효율적 방법이 여전히 필요한 실정이다.

본 발명은 고 락토스 농도에서조차 락토스 사멸을 초래하지 않는 락토스 이송체를 위한 합성 발현 계를 기술하고 있다.

그러므로 이러한 발현 계를 통하여 제조될 수 있는 돌연변이 유기체는 전술된 바이오제품을 제조하는데 유용하다.

도 1: 대장균 야생형 균주에 대한 락토스의 영향. 화살표 표시된 시점에 배양액들 중 하나에 락토스가 첨가되었는데, 이때 해당 배양액에서의 성장은 즉시 중단되었던 반면에 다른 균주는 다른 배양액에서 계속 성장하였다.
도 2: 구성적 합성 프로모터에 의해 락토스 이송체 발현이 변경된 대장균 락토스 이송체 돌연변이 균주에 대한 락토스의 영향. 화살표는, 락토스가 배양액들 중 하나의 배지에 첨가되었던 순간을 나타낸다. 이 경우 성장에 대한 어떠한 영향도 관찰되지 않았다. 그러므로, 이와 같은 돌연변이 균주들은 이러한 방식으로 선택될 수 있다.
도 3: 대장균 돌연변이 균주에 도입될 때 락토스 사멸을 초래하지 않는, 프로모터, RBS 및 락토스 이송체 서열 조합의 일례(서열 번호 1).
도 4a 및 4b: lacZ 유전자와 번역 공역하는 락토스 투과효소 유전자 서열의 일례(서열 번호 2).
도 5: CAT 유전자와 번역 공역하는 락토스 투과효소 유전자 lacY 서열의 일례(서열 번호 3).
도 6: aph1 유전자와 번역 공역하는 케이.맥시아누스(K.maxianus) 락토스 투과효소 유전자 서열의 일례(서열 번호 4).
도 7: (Z)-4-(3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴)-1,2-디메틸-1H-이미다졸-5(4H)-온에 결합하고 락토스 투과효소 발현의 검출을 허용하는 앱타머와 공역하는 락토스 투과효소 유전자 lacy 서열의 일례(서열 번호 5).
도 8: 락토스 투과효소가 클로람페니콜 내성 유전자와 번역 공역하지 않는 기준 플라스미드 pSC101을 함유하는 기준 균주와, 락토스 투과효소가 클로람페니콜 내성 유전자와 번역 공역하는 돌연변이 균주의 클로람페니콜 내성. X축은, 시험된 상이한 클로람페니콜 농도를 보이고, Y축은, 48시간 항온 처리 후 배양액의 광학 밀도를 보인다. 기준 균주는 더 낮은 농도의 클로람페니콜 스크리닝에서 돌연변이 균주보다 성장 지연을 보이는데, 이는 락토스 투과효소의 발현이 항생제 내성 유전자와의 번역 공역을 통해 스크리닝될 수 있음을 입증한다. 따라서, 락토스 투과효소 발현 유기체는 이러한 방식으로 비 발현 유기체 및 발현 유기체의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
도 9: 락토스 투과효소가 클로람페니콜 내성 유전자와 번역 공역하지 않는 기준 플라스미드 pSC101을 함유하는 기준 균주와, 락토스 투과효소가 클로람페니콜 내성 유전자와 번역 공역하는 돌연변이 균주의 클로람페니콜 내성. X축은, 시험된 상이한 클로람페니콜 농도를 보이고, Y축은, 92시간 항온 처리 후 배양액의 광학 밀도를 보인다. 기준 균주는 더 낮은 농도의 클로람페니콜 스크리닝에서 돌연변이 균주보다 성장 지연을 보이는데, 이는 락토스 투과효소의 발현이 항생제 내성 유전자와의 번역 공역을 통해 스크리닝될 수 있음을 입증한다. 따라서, 락토스 투과효소 발현 유기체는 이러한 방식으로 비 발현 유기체 및 발현 유기체의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
도 10a 및 10b: pCXP14-FT_에이치.파일로리(H.pylori)(서열 번호 6)
도 11: 효모 야생형 균주(클루이베로마이세스 마르시아누스 락티스)에 대한 락토스의 영향. 화살표 표시된 시점에 배양액들 중 하나에 락토스가 첨가되었는데, 이때 해당 배양액에서의 성장은 즉시 중단되었던 반면에, 다른 균주는 다른 배양액에서 계속 성장하였다.
도 12: 락토스 이송체 발현이 구성적 합성 프로모터에 의해 변경된 효모 락토스 이송체 돌연변이 균주(사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae))에 대한 락토스의 영향. 화살표는, 락토스가 배양액들 중 하나의 배지에 첨가되었던 순간을 나타낸다. 이 경우 성장에 대한 어떠한 영향도 관찰되지 않았다. 그러므로, 이와 같은 돌연변이 균주들은 이러한 방식으로 선택될 수 있다.
도 13: 효모 돌연변이 균주에 도입될 때 락토스 사멸을 초래하지 않는, 프로모터(p1), Kozak, 케이. 마르시아누스 락토스 투과효소 암호화 서열 및 종결 인자 조합의 일례(서열 번호 7).
도 14: 효모 돌연변이 균주에 도입될 때 락토스 사멸을 초래하지 않는, 프로모터(p2), Kozak, 케이. 마르시아누스 락토스 투과효소 암호화 서열 및 종결 인자 조합의 일례(서열 번호 8).
도 15a 및 15b: 프로모터, Kozak, 케이. 마르시아누스 β-갈락토시다아제 암호화 서열 및 종결 인자 조합의 일례(서열 번호 9).
도 16: HR1 rDNA(서열 번호 10).
도 17: HR2 rDNA(서열 번호 11).
도 18a ~ 18at : 실시예들에 기술된 바와 같은 락토스 사멸 스크리닝 방법으로부터 기원하는 선택 서열들의 예들(서열 번호 12 내지 57).
도 19: 야생형에 비한 락토스 투과효소 발현 카세트의 상대적 성장률. 오차 막대들은 적어도 3회 반복 측정된 측정치의 표준 편차들이다. X축의 서열 번호들과 상관된 서열들은 도 18에 보인다.
도 20: 실시예 16에서 락토스 사멸에 대해 시험되었던 lacIQ_lacY 발현 카세트의 서열(서열 번호 58).
도 21: 대장균 야생형 균주 및 placIQ_lacY 돌연변이 균주에 대한 락토스의 영향. 상기 두 균주는 락토스 중간 지수기에 락토스가 첨가된 조건에서와 첨가되지 않은 조건에서 성장하였다. 화살표는 락토스가 첨가된 순간을 나타낸다. 두 균주의 성장은 락토스 첨가에 의해 대폭 억제되었다.

발명의 요약

본 발명은

a. 미생물 내 락토스 이송체 발현을 돌연변이시키는 단계로서, 상기 돌연변이는 상기 락토스 이송체 발현을 초래하는 단계;

b. 락토스가 아닌 탄소 원을 포함하는 배지에서 상기 돌연변이 미생물을 성장시키는 단계;

c. 상기 돌연변이 미생물이 성장하는 동안 상기 배지에 락토스를 첨가하는 단계; 및

d. 상기 락토스 포함 배지에서 성장할 때, 락토스 사멸 현상에 내성인 미생물을 선택하는 단계

를 포함하는, 락토스가 다른 탄소 원과 함께 존재하는 환경에서 성장할 때 락토스 사멸 현상에 내성인 미생물을 제조하는 방법에 관한다.

더욱 구체적으로, 본 발명은

a. 미생물 내 락토스 이송체 발현을 돌연변이시키는 단계로서, 상기 돌연변이는 상기 락토스 이송체 발현을 초래하는 단계;

b. 락토스가 아닌 탄소 원을 포함하는 배지에서 상기 돌연변이 미생물을 성장시키는 단계;

c. 상기 돌연변이 미생물이 성장하는 동안 상기 배지에 락토스를 첨가하는 단계; 및

d. 상기 락토스 포함 배지에서 성장할 때, 락토스 사멸 현상에 내성이며, 상기 락토스 이송체의 야생형 발현 카세트로 얻어진 락토스 유입의 적어도 50%를 유지하는 미생물을 선택하는 단계

를 포함하는, 락토스가 다른 탄소 원과 함께 존재하는 환경에서 성장할 때 락토스 사멸 현상에 내성인 미생물을 제조하는 방법에 관한다.

본 발명은 또한 이종 프로모터를 내인성 또는 외인성 락토스 이송체 유전자 앞에 도입하고/도입하거나, 리보좀 결합 서열 또는 Kozak 서열을 함유하는, 암호화 서열 앞 비번역 영역을 돌연변이시키고/돌연변이시키거나, 내인성 락토스 이송체 유전자의 코돈 선호도를 변경함으로써 단계 a)가 수행되는, 전술된 바와 같은 방법에 관한 것이기도 하다.

본 발명은 또한 추가로 이종 프로모터를 내인성 또는 외인성 락토스 이송체 유전자 앞에 도입하는 것이 a) 게놈으로부터 내인성 락토스 이송체를 결실시킨 다음, 이 내인성 락토스 이송체를 미생물의 게놈 내 다른 좌에 재도입하거나, b) 내인성 락토스 이송체 앞에 이종 프로모터를 도입하거나, 또는 c) 내인성 락토스 프로모터를 녹-아웃시킨 다음, 미생물 게놈 내 동일한 좌에 이종 프로모터를 도입함으로써 수행되는, 전술된 바와 같은 방법에 관한 것이기도 하다.

본 발명은 또한 단계 b)에서의 락토스 투과효소 발현은 리포터 유전자와의 번역 공역 및/또는 앱타머 공역을 통해 검출되는, 전술된 방법에 관한 것이기도 하다.

본 발명은 발현된 락토스 이송체가 서열 번호 2, 3, 4 및/또는 5에 의해 제시되는 바와 같은 유전자 구성물을 통해 검출되는, 전술된 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 락토스 이송체가 락토스 투과효소인, 전술된 방법에 관한 것이기도 하다.

본 발명은 또한 상기 미생물이 박테리아, 효모 또는 진균인, 전술된 바와 같은 방법에 관한 것이기도 하다.

본 발명은 또한 프로모터 서열, 리보좀 결합 서열 또는 Kozak 서열을 함유하는, 암호화 서열 앞 비번역 영역, 및/또는 락토스 이송체 발현을 초래하고, 이 서열을 함유하는 미생물이 락토스가 (또)다른 탄소 원(들)과 함께 존재하는 환경에서 성장할 때 락토스 사멸 표현형을 발현하지 않으며, 전술된 바와 같은 방법에 의해 제조될 수 있는 락토스 투과효소 서열에 관한 것이기도 하다.

본 발명은 또한 락토스가 다른 탄소 원과 함께 존재하는 환경에서 성장할 때 락토스 사멸 현상에 내성이고, 전술된 바와 같은 방법에 의해 제조될 수 있는 미생물에 관한 것이기도 하다.

더욱 구체적으로 본 발명은 서열 번호 1, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 또는 57에 의해 제시되는 바와 같이 락토스 이송체 유전자 앞에 이종 서열을 가지는, 전술된 바와 같은 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 락토스 및/또는 갈락토스 분해 경로로부터 유래하는 효소들을 암호화하는 유전자가 저 기능성(less functional)이거나 비 기능성(non-functional)이 되도록 만들어진, 락토스 사멸 현상에 내성인 미생물에 관한 것이기도 하다.

본 발명은 또한 락토스 기반 특수제품, 예를 들어 특수 탄수화물, 당 지질 및 갈락토실화 화합물을 제조하는데 있어서 전술된 바와 같은 미생물의 용도에 관한 것이기도 하다.

본 발명은 또한 상기 특수 탄수화물이 2-푸코실락토스 또는 2'-푸코실락토스 또는 3-푸코실락토스 또는 2',3-디푸코실락토스 또는 락토-N-삼당류 또는 락토-N-사당류 또는 락토-nN-사당류 또는 3'-시알릴락토스 또는 6'-시알릴락토스인, 전술된 바와 같은 미생물의 용도에 관한 것이기도 하다.

발명의 설명

본 발명은 유기체 내 유전자 조직을 통해 락토스 이송체 발현을 변경하여, 돌연변이 락토스 이송체 발현 유기체를 만듦으로써 락토스 사멸을 피하기 위한 신규 방법을 기술하고 있다. 이를 위해서, 외인성 및/또는 내인성 락토스 이송체 유전자는 락토스 사멸 표현형을 발현하지 않는 이종 프로모터에 의해 발현되고/발현되거나, 락토스 이송체의 코돈 선호도는 락토스 사멸 표현형을 발현하지 않는 락토스 이송체의 발현을 변경하도록 변경된다. 이를 위해서, 락토스 이송체의 자연 발현 제어는 억제되어야 하고/억제되어야 하거나, 락토스 사멸이 일어나지 않게 하는 것과 같은 방법으로 대체되어야 한다. 예를 들어 자연 발생 락토스 이송체 발현 카세트는 게놈으로부터 결실된 후 다른 좌에 재도입되고/재도입되거나, 이종 프로모터는 원래 있던 좌에서 락토스 이송체 앞에 도입되고/도입되거나, 락토스 이송체는 처음에는 녹-아웃되었다가, 게놈 내 동일 좌 및/또는 다른 좌에 이종 프로모터와 함께 재도입되고/재도입되거나, 락토스 이송체는 이종 프로모터를 통해 발현되는 오페론에 도입된다. 그러므로 본 발명은 1) 미생물 내 락토스 이송체의 발현을 돌연변이시키는 단계로서, 상기 돌연변이는 상기 락토스 이송체 발현을 초래하는 단계, 2) 락토스가 아닌 탄소 원을 포함하는 배지에서 상기 돌연변이 미생물을 성장시키는 단계, 3) 상기 돌연변이 미생물이 성장하는 동안 상기 배지에 락토스를 첨가하는 단계, 그리고 4) 상기 락토스 포함 배지에서 성장할 때, 락토스 사멸 현상에 내성이며, 상기 락토스 이송체의 야생형 발현 카세트로 얻어진 락토스 유입의 적어도 50%를 유지하는 미생물을 선택하는 단계를 포함하는, 락토스가 다른 탄소 원과 함께 존재하는 환경에서 성장할 때 락토스 사멸 현상에 내성인 미생물을 제조하는 방법에 관한다.

'락토스 사멸'이란 용어는, 락토스 또는 갈락토사이드가 (또)다른 탄소 원(들)과 함께 존재하는 환경에서 성장하는 유기체의 성장 지연 또는 성장 정지 현상을 지칭한다. 이와 같은 탄소 원들로서는 글리세롤, 말토스, 글루코스, 프록토스, 수크로스, 푸코스, 만노스, 시알산, 전분, 셀룰로스, 폴리올(예를 들어 만니톨, 자일리톨, 솔비톨), 유기산(락테이트, 숙시네이트, 아세테이트 등) 및/또는 오당류(자일로스, 아라비노스 등)이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은, 락토스 사멸을 초래하지 않는 락토스 투과효소 발현 계를 동정하는 방법을 기술한다. 이 방법은 락토스가 중간 지수기에 첨가된 돌연변이 균주의 성장 분석을 포함한다. 이 방법은 미세 역가 플레이트에서 고 처리량 방식으로 수행될 수 있거나, 세포 분류기를 사용하여 수행될 수 있으며, 그 결과 돌연변이 미생물 내 락토스 투과효소 발현에 영향을 미칠 수 있는 다수의 프로모터, 리보좀 결합 위치, 코돈 선호도, 그리고 기타 인자들이 스크리닝될 수 있다. 본 발명은 번역 공역 및/또는 앱타머 공역, 그리고 발현이 초래되는 서열의, 리포터 유전자, 예를 들어 항생제 내성 유전자(예를 들어 클로람페니콜, 제네티신 G418(이에 한정되는 것은 아님)), 형광 단백질, 가수분해효소(예를 들어 갈락토시다아제, 자일라나아제(이에 한정되는 것은 아님)) 및/또는 앱타머 서열을 통한 선택에 의해 락토스 투과효소 발현을 검출하는 방법을 기술하고 있다. 락토스 투과효소의 발현을 초래하는 서열들은 항생제 포함 배지 중에서의 성장, 비색 검정(예를 들어 X-gal), 및/또는 형광 세포를 분류해 내는 형광 활성화 세포 분류기, 및/또는 앱타머 검정, 예를 들어 (Z)-4-(3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴)-1,2-디메틸-1H-이미다졸-5(4H)-온을 기반으로 한 앱타머 검정(이에 한정되는 것은 아님)에 의해, 리포터 유전자를 기반으로 추가 선택된다(37, 64). 본 발명은 또한 락토스 사멸이 진행되지 않으면서, 락토스 이송체를 발현하는 돌연변이 유기체에 대해 스크리닝하는 방법도 추가로 기술하고 있다. 또한, 본 발명은 락토스 투과효소 발현 카세트 라이브러리가 프로모터 라이브러리, RBS 또는 Kozak 서열 라이브러리, 전사 종결 인자 라이브러리 및/또는 락토스 투과효소 유전자의 코돈 선호도 변이체를 통해 어떻게 제조될 수 있는지를 기술하고 있다. 이와 같은 라이브러리들은, 예를 들어 Gibson 조립, Golden Gate 조립, Cliva 조립, LCR 또는 제한 결찰(이에 한정되는 것은 아님)과 같은 방법을 통해 추가로 제조된다(25, 36, 50, 79).

'상기 락토스 이송체의 야생형 발현 카세트로 얻어지는 락토스 유입의 적어도 50%를 유지하는'이란 용어는, 본 발명의 돌연변이 미생물이 (이 미생물이 락토스 사멸에 내성일지라도) 상기 락토스 이송체의 야생형 발현 카세트가 사용될 때 얻어진 락토스 유입의 적어도 50 %(즉 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 %)를 여전히 유지하여야 한다는 사실에 관한다.

'발현 카세트'란 용어는, 프로모터 서열, (리보자임 결합 서열 또는 Kozak 서열 중 어느 하나를 함유하는) 비번역 영역 서열, 암호화 서열(예를 들어 락토스 투과효소 유전자 서열), 그리고 선택적으로는 전사 종결 인자(18)가 존재하는 임의의 서열에 관한다.

'락토스 이송체'라는 용어는, 세포질 막을 건너 락토스를 이동시킬 수 있는(이송할 수 있는) 것으로서, 미생물 내에서 발현되는 임의의 단백질을 지칭한다. 이러한 단백질은, 예를 들어 락토스 투과효소(MFS, 즉 Major Facilitator Superfamily 상과로부터 유래하는 이송체)이다.

'이종 프로모터'라는 용어는, 암호화 서열 앞에 자연 발생하지 않는 임의의 프로모터를 지칭한다. '프로모터'는, 전사 개시 위치와, 암호화 서열 앞 비번역 영역 앞에 위치하는 RNA 중합효소 결합 위치 전체이다. 그러므로 "이종 프로모터" 서열은 1) 적어도 1개(즉 1, 2, 3, 4개 등)의 돌연변이를 함유하는 자연 발생 프로모터 서열의 변이체, 및/또는 2) 돌연변이 락토스 이송체의 암호화 서열 앞에 자연 발생하지 않는, 상기 이송체 발현 미생물로부터 유래하는 원산 프로모터, 및/또는 3) 락토스 이송체 발현 미생물 내에 자연 발생하지 않는 서열, 및/또는 4) 인 실리코 디자인된 프로모터인 인공 프로모터이다. 이와 같은 프로모터들은 라이브러리, 예를 들어 Alper외 다수(2005)에 의해 기술된 것, 및/또는 HXT7p, Hammer외 다수(2006)에 의해 기술된 것, De Mey외 다수(2007)에 의해 기술된 것, Coussement외 다수(2014)에 의해 기술된 것, 또는 Mutalik외 다수(2013)에 의해 기술된 것(3, 25, 29, 41, 60)(66), 또는 Blount외 다수(2012)에 의해 기술된 것(이에 한정되는 것은 아님)으로부터 유도될 수 있거나, 프로모터, 예를 들어 ADH1p, TEF1p, TEF2p, GPDp, PDC1p, FBA1p, PGK1p, PGI1p, TDH2p, PYK1p,ENO2p, GPM1p, TPI1p(이에 한정되는 것은 아님)일 수 있거나(13), 또는, 예를 들어 Rhodius외 다수(2012)에 의해 기술된 바와 같이 디자인된 것일 수 있다. '인공 프로모터'란 용어는 또한 원산(자기 유래) 프로모터 서열과, 상이한(자기 유래 또는 이종) 프로모터 서열 일부들의 조합인, DNA 서열을 가지는 프로모터를 지칭한다. 이러한 '인공 프로모터' 서열은 데이터베이스, 예를 들어 partsregistry.org에서 발견될 수 있다(19). 이종 프로모터는 전사 인자를 통한 조절 발현 또는 구성적 발현 중 어느 하나를 초래한다.

'구성적 발현'이란 용어는, 임의의 성장 조건 하에 RNA 중합효소의 서브유닛(예를 들어 박테리아 시그마 인자) 이외의 전사 인자에 의해 조절되지 않는 발현으로서 정의된다. 이러한 전사 인자의 비 제한적 예들로서는, 대장균의 경우 CRP, LacI, ArcA, Cra, IclR 등, 또는 사카로마이세스 세레비지아에의 경우 Aft2p, Crz1p, Skn7 등, 또는 비.서브틸리스(B. subtilis)의 경우 DeoR, GntR, Fur 등이 있다. 이와 같은 전사 인자들은 특이 서열에 결합하여, 임의의 성장 조건에서 발현을 억제 및 증가시킬 수 있다. RNA 중합효소는 특이 서열에 결합하여, 예를 들어 원핵생물 숙주의 경우 시그마 인자를 통해 전사를 개시한다.

'조절 발현'이란 용어는, 임의의 성장 조건 하에서 RNA 중합효소 서브유닛(예를 들어 박테리아 시그마 인자) 이외의 전사 인자에 의해 조절되는 발현으로서 정의된다. 이러한 전사 인자의 예들은 전술되어 있다.

리보좀 결합 위치 또는 Kozak 서열을 함유하는, 암호화 서열 앞 '비번역 영역'이란 용어는, RNA 중합효소 결합 서열과 암호화 서열 사이의 서열에 관한다. 이 비번역 영역은 또한 암호화 서열 앞에 자연 발생하는 서열, 및/또는 락토스 이송체 발현 미생물 내에 자연 발생하는 서열, 및/또는 기타 유기체(원핵생물 또는 진핵생물 중 어느 하나)로부터 유래하는 서열, 및/또는 인공적으로 디자인된 서열이기도 한데, 이는 공지되었거나 측정 가능한 번역 속도를 보이는 비 자연 또는 인 실리코 디자인된 리보좀 결합 위치와 관련되어 있고, 이와 같은 서열들은 Mutalik외 다수(2013)(60)에 의해 기술된 바와 같은 라이브러리로부터 유도될 수 있거나, 또는, 예를 들어 Salis외 다수(2009)(67)에 의해 기술된 바와 같은 알고리즘을 통해 디자인될 수 있거나, 또는 partsregistry.org(19)와 같은 데이터베이스에서 발견될 수 있다.

'변경된 코돈 선호도'라는 용어는, DNA 암호화 서열 내에 사용되는 코돈의, 유기체에 의해 더 자주 사용되는 코돈 또는 유기체에 의해 드물게 사용되는 코돈 중 어느 하나로의 변경에 관한다. 코돈 선호도는 데이터베이스, 예를 들어 코돈 선호도 데이터베이스에 정의되어 있고(61), 코돈 선호도는 코돈 선호도 디자인 알고리즘에 의해 최적화된다(73).

'번역 공역'이라는 용어는, 관심 유전자와 리포터 유전자, 예를 들어 녹색 형광 단백질, 항생제 내성 유전자, 독소 유전자의 공역 발현을 지칭한다(49, 53, 58, 63). '번역 센서(translational sensor)'란 용어는, 유전자의 발현 및 번역에 대한 지표인 임의의 기작, 예를 들어 이하 참고문헌(17, 22)에 기술된 바와 같은 형광 태그 및 스플릿 태그(split tag)를 지칭한다.

'앱타머 공역(aptamer coupling)'이란 용어는, 형광 단, 예를 들어 (Z)-4-(3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴)-1,2-디메틸-1H-이미다졸-5(4H)-온(이에 한정되는 것은 아님)에 의해 검출될 수 있는, 앱타머 서열의 락토스 이송체 메신저 RNA로의 도입을 지칭한다(37, 64).

'성장 분석'이란 용어는, 유기체 성장 곡선의 분석을 지칭한다. 이 유기체는 성장 환경 하에 성장 배지 중에서 배양된다. '성장 환경'이란 용어는, 모든 환경 매개변수, 예를 들어 pH, 온도, 용존 산소에 관한다. pH는 pH 완충제 또는 pH 제어에 의해 설정되고, 예를 들어 pH 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5 또는 8(이에 한정되는 것은 아님)이다. 온도는, 예를 들어 25, 28, 30, 32, 34, 37, 40, 42, 45 ℃(이에 한정되는 것은 아님)로 설정된다. 용존 산소는 혐기성, 미 호기성(용존 산소 1.5 ㎎/l 이하) 또는 혐기성 조건과 관련된다.

'배지' 또는 '성장 배지'란 용어는, 유기체가 성장하는데 필요한 기질을 함유하는 임의의 용액에 관한다. 이러한 기질로서는 질소원, 예를 들어 암모늄염, 질산염, 효모 추출물, 펩톤, 카사미노 및/또는 아미노산(이에 한정되는 것은 아님), 인 원, 예를 들어 인산염(이에 한정되는 것은 아님), 황 원, 예를 들어 황산염(이에 한정되는 것은 아님), 원소, 예를 들어 구리, 코발트, 철, 셀레늄, 요오듐, 몰리브데이트, 마그네슘, 칼슘, 칼륨, 나트륨, 아연, 니켈, 망간(이에 한정되는 것은 아님), 및/또는 붕산, 및/또는 비타민, 예를 들어 티아민, 판토텐산 및/또는 니아신(이에 한정되는 것은 아님), 및/또는 탄소 원, 예를 들어 글리세롤, 말토스, 글루코스, 프록토스, 수크로스, 푸코스, 만노스, 시알산, 전분, 셀룰로스, 폴리올(예를 들어 만니톨, 자일리톨, 솔비톨), 유기산(락테이트, 숙시네이트, 아세테이트 등), 및/또는 오당류(자일로스, 아라비노스 등)(이에 한정되는 것은 아님)이 있다.

상기 지정된 바와 같은 '유기체' 또는 '세포'라는 용어는, 박테리아, 효모 또는 진균으로 이루어진 목록으로부터 선택되는 미생물을 지칭하거나, 또는 식물 또는 동물 세포를 지칭한다. 후자인 박테리아는 바람직하게 프로테오박테리아(Proteobacteria) 문, 또는 피르미큐테스(Firmicutes) 문, 또는 시아노박테리아(Cyanobacteria) 문, 또는 데이노코커스-테르무스(Deinococcus-Thermus) 문에 속한다. 프로테오박테리아 문에 속하는 후자인 박테리아는 바람직하게 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 바람직하게는 대장균(Escherichia coli) 종에 속한다. 후자인 박테리아는 바람직하게 대장균 종에 속하는 임의의 균주, 예를 들어 대장균 B, 대장균 C, 대장균 W, 대장균 K12, 대장균 니슬레(Nissle)(이에 한정되는 것은 아님)에 관한다. 더욱 구체적으로 후자인 용어는 실험실 환경에 잘 적응하고, 야생형 균주와는 달리 소장 내에서 잘 자라는 능력을 상실한, 배양 대장균 균주(대장균 K12 균주로서 명명됨)에 관한다. 대장균 K12 균주의 널리 공지된 예들로서는 K12 야생형, W3110, MG1655, M182, MC1000, MC1060, MC1061, MC4100, JM101, NZN111 및 AA200이 있다. 그러므로 본 발명은 구체적으로 전술된 바와 같은 돌연변이 및/또는 형질전환 대장균 균주에 관한 것인데, 상기 대장균 균주는 K12 균주이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 상기 지정된 바와 같은 돌연변이 및/또는 형질전환 대장균 균주에 관한 것인데, 상기 K12 균주는 대장균 MG1655이다. 피르미큐테스 문에 속하는 후자의 박테리아는 바람직하게 바실리, 바람직하게 바실러스 종에 속한다. 후자인 효모는 바람직하게 아스코마이코타(Ascomyota) 문 또는 바시디오마이코타(Basidiomycota) 문 또는 듀테로마이코타(Deuteromycota) 문 또는 자이고마이세테스(Zygomycetes) 문에 속한다. 후자인 효모는 바람직하게 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia), 한수넬라(Hansunella), 클루이베로마이세스, 야로위아(Yarrowia) 또는 스타르메렐라(Starmerella) 속에 속한다. 후자인 진균은 바람직하게 리조푸스(Rhizopus), 딕티오스텔리움(Dictyostelium) 또는 아스퍼질러스(Aspergillus) 속에 속한다.

본 발명은 락토스 사멸을 진행하지 않고 락토스를 섭취할 수 있으며, 락토스 또는 이의 갈락토스 기를 특수제품으로 전환할 수 있는 유기체를 기술하고 있다. 더욱 구체적으로 상기 특수제품 또는 바이오제품으로서는 특수 탄수화물, 당 지질, 예를 들어 갈락토지질 및/또는 락토지질, 및/또는 갈락토실화 화합물, 예를 들어 갈락토실 지질, 갈락토실 세라마이드 및/또는 갈락토실화 어글리칸(이에 한정되는 것은 아님)이 있다.

본 발명은 락토스 사멸을 진행하지 않고 락토스를 섭취할 수 있으며, 상기 락토스를 모유(인간) 올리고당류, 예를 들어 3-푸코실락토스, 2'-푸코실락토스, 6-푸코실락토스, 2',3-디푸코실락토스, 2',2-디푸코실락토스, 3,4-디푸코실락토스, 6'-시알릴락토스, 3'-시알릴락토스, 3,6-디시알릴락토스, 6,6'-디시알릴락토스, 3,6-디시알릴락토-N-사당류, 락토디푸코사당류, 락토-N-사당류, 락토-N-네오사당류, 락토-N-푸코오당류 II, 락토-N-푸코오당류 I, 락토-N-푸코오당류 III, 시알릴락토-N-사당류 c, 시알릴락토-N-사당류 b, 시알릴락토-N-사당류 a, 락토-N-디푸코육당류 I, 락토-N-디푸코육당류 II, 락토-N-육당류, 락토-N-네오육당류, 파라-락토-N-육당류, 모노푸코실모노시알릴락토-N-사당류 c, 모노푸코실 파라-락토-N-육당류, 모노푸코실락토-N-육당류 III, 이성질성 푸코실화 락토-N-육당류 III, 이성질성 푸코실화 락토-N-육당류 I, 시알릴락토-N-육당류, 시알릴락토-N-네오육당류 II, 디푸코실 파라-락토-N-육당류, 디푸코실락토-N-육당류, 디푸코실락토-N-육당류 a, 디푸코실락토-N-육당류 c, 갈락토실화 키토산, 푸코실화 올리고당류 및/또는 시알릴화 올리고당류 등(이에 한정되는 것은 아님)으로 전환할 수 있는 유기체를 기술한다.

본 발명은 락토스 사멸을 진행하지 않고, 뉴클레오티드 당, 예를 들어 GDP-L-푸코스, GDP-만노스, GDP-글루코스, CMP-시알산, UDP-글루코스, UDP-갈락토스, UDP-N-아세틸글루코사민, UDP-N-아세틸만노사민, UDP-N-아세틸갈락토사민, UDP-글루쿠론산, UDP-갈락투론산, UDP-자일로스, UDP-아라비노스, 및/또는 dTDP-람노스(이에 한정되는 것은 아님)를 합성하는 유기체를 추가로 기술한다. "시알산"이란 용어는, 화합물, 예를 들어 뉴라민산, N-아세틸뉴라민산, 또는 N-글리코일뉴라민산(Varki(1992)에 의해 정의됨(71))(이에 한정되는 것은 아님)에 대한 군 명칭이다. 세포 내 GDP-푸코스 농도 또는 풀(pool)은 신생 경로 및/또는 재생 경로) 중 어느 하나에 의한 상향 조절에 의해 증가된다. 신생 경로는 GDP-4-케토-6-데옥시만노스-3,5-에피머라아제-4-환원효소 또는 GDP-푸코스 합성효소, GDP-만노스 4,6-탈수소효소, GDP-D-만노스 피로인산분해효소, 포스포만노스 이성체화효소 및/또는 포스포만노뮤타아제로 이루어지는데, 이것들의 발현은 모노-시스트론 또는 폴리시스트론(오페론 구조) 내 유전 요소, 예를 들어 프로모터 및/또는 리보좀 결합 위치 및/또는 변경된 코돈 선호도(이에 한정되는 것은 아님); 및/또는 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 내 조절인자 arcA iclR, 및/또는 엔테로박테리아세아에 내 전사 조절인자 RscA 또는 박테리아 내 상동성 유전자들, 또는 사카로마이세스 세레비지아에 내 Xbp1 , Spt20 , Sfp1 , Rpd3 , Rap1 , Gcr1 , Gcn5 , Cst6 , Abf1 , Hsf1 , Reb1, Cad1 , Sin4 , Ash1 , Ixr1 , Met32 , Pho2 , Rgr1 , Spt7 , Swi4, 또는 효모나 진균 내 상동성 유전자들을 통해 개별적으로 증가한다. 재생 경로는 L-푸코스 키나아제 및/또는 GDP-L-푸코스 피로인산분해효소로 이루어져 있다. GDP-만노스 풀은 GDP-D-만노스 피로인산분해효소, 포스포만노스 이성체화효소 및/또는 포스포만노뮤타아제를 암호화하는 유전자; 및/또는 만노키나아제 및 GDP-D-만노스 피로인산분해효소를 암호화하는 유전자를 상향조절함으로써 증가한다. UDP-갈락토스 풀은 갈락토키나아제 및/또는 갈락토스 1-포스페이트 우리딜 전이효소, 및/또는 UDP-갈락토스-4-에피머라아제, 및/또는 UDP-갈락토스/글루코스 피로인산분해효소, 및/또는 락토스 합성효소, 및/또는 락토스 인산분해효소, 및/또는 수크로스 인산분해효소를 암호화하는 유전자를 상향조절함으로써 증가한다. UDP-글루코스 풀은 글루코키나아제, 및/또는 UDP-글루코스 피로인산분해효소, 및/또는 수크로스 인산분해효소, 및/또는 포스포글루코뮤타아제, 및/또는 수크로스 합성효소를 암호화하는 유전자를 상향조절함으로써 증가한다. CMP-시알산 풀은 L-글루타민:D-프록토스-6-포스페이트 아미노전이효소, 및/또는 포스포글루코사민 뮤타아제, 및/또는 글루코사민-1-포스페이트 아세틸전이효소, 및/또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜전이효소, 및/또는 UDP-N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제, 및/또는 N-아세틸뉴라미네이트 합성효소, 및/또는 시티딘 5'-모노포스페이트 N-아세틸뉴라미네이트 합성효소를 암호화하는 유전자를 상향조절함으로써 증가한다. UDP-N-아세틸글루코사민 풀은 L-글루타민:D-프록토스-6-포스페이트 아미노전이효소, 및/또는 포스포글루코사민 뮤타아제, 및/또는 글루코사민-1-포스페이트 아세틸전이효소, 및/또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜전이효소, 및/또는 글루코사민-6-포스페이트 N-아세틸전이효소, 및/또는 포스포아세틸글루코사민 뮤타아제, 및/또는 UDP-N-아세틸글루코사민 피로인산분해효소를 암호화하는 유전자를 상향조절함으로써 증가한다. UDP-N-아세틸만노사민 풀은 UDP-N-아세틸글루코사민 풀 증가 및/또는 UDP-N-아세틸글루코사민 2-에피머라아제를 암호화하는 유전자를 상향조절함으로써 증가한다. UDP-N-아세틸갈락토사민 풀은 UDP-N-아세틸글루코사민 풀 증가 및/또는 UDP-N-아세틸글루코사민 C4-에피머라아제를 암호화하는 유전자를 상향조절함으로써 증가한다. UDP-글루쿠론산 풀은 UDP-글루코스 풀 증가 및/또는 UDP-글루코스 탈수소효소를 암호화하는 유전자를 상향조절함으로써 증가한다. UDP-자일로스 풀은 UDP-글루쿠론산 풀 증가 및/또는 UDP-D-자일로스 합성효소를 암호화하는 유전자를 상향조절함으로써 증가한다. UDP-갈락투론산 풀은 UDP-글루쿠론산 풀 증가 및/또는 UDP-D-글루쿠론산 4-에피머라아제를 암호화하는 유전자를 상향조절함으로써 증가한다. UDP-아라비노스 풀은 UDP-글루쿠론산 풀 증가 및/또는 UDP-D-자일로스 4-에피머라아제 및/또는 아라비노스 키나아제 및/또는 UDP-L-아라비노스 피로인산분해효소를 암호화하는 유전자를 상향조절함으로써 증가한다. dTDP-람노스 풀은 dTDP-글루코스 피로인산분해효소 및/또는 dTDP-글루코스 4,6-탈수소효소 및/또는 dTDP-4-데하이드로람노스 3,5-에피머라아제 및/또는 dTDP-4-데하이드로람노스 환원효소 및/또는 글루코스-1-포스페이트 티미딜일전이효소 및/또는 뉴클레오티드 람노스 합성효소를 암호화하는 유전자를 상향조절함으로써 증가한다.

'풀'이란 용어는 또한 야생형 유기체에서 자연 발생하는 대사물질의 농도, 예를 들어 뉴클레오티드 당 풀의 농도에 관한다. "증가한 풀"이란 용어는, 야생형 유기체 내 대사물질 풀보다 높은, 상기 대사물질 풀의 유의적으로 증가한 농도에 관한다.

"유전자를 상향조절함"이란 용어는, 각각의 유전자 변형이 해당 유전자의 발현 및/또는 상기 유전자 생성물의 활성 상승을 초래하는 것에 관한다. 상기 유전자 변형은 프로모터, 비번역 영역, 리보좀 결합 위치, 암호화 서열, 유전자 좌 결정, 인트론/엑손 구조, 및/또는 전사 종결 인자의 변형 중 어느 하나로서, 이를 통하여 상기 발현 및/또는 활성의 증가가 초래되는 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명은 글리코실전이효소에 의해 이러한 뉴클레오티드 당들을 단당류, 이당류 또는 올리고당류, 예를 들어 갈락토스, 락토스, 락토N이당류, 락토N삼당류, 락토N사당류, 락토-N-네오사당류, 글로보삼당류, 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 3-시알릴락토스, 6-시알릴락토스, 모유(인간) 올리고당류, 헤파로산, 키토산, nod-인자, 당 지질 및/또는 어글리콘 등(이에 한정되는 것은 아님) 상에 운반할 수 있는 유전자 변형 유기체를 기술한다.

본 발명은 또한 락토스 사멸을 진행하지 않고, 이 락토스를 효소, 예를 들어 탄수화물 가수분해효소, 탄수화물 전이효소, 탄수화물 합성효소, 아세틸화효소, 아실전이효소, 탄수화물 인산가수분해효소, 다당류 분해효소, 키나아제, 피루빌라아제 및/또는 설포전이효소(이에 한정되는 것은 아님)로 추가 변형할 수 있는 유기체를 기술한다.

본 발명은 락토스 사멸을 진행하지 않고, 락토스 가수분해효소 유전자를 저 기능성 또는 비 기능성으로 만듦으로써 더 이상 락토스를 분해하지 않게 된 유기체를 추가로 기술한다.

'저 기능성 또는 비 기능성으로 만들어진 유전자'란 용어는, siRNA, RNAi, miRNA, asRNA를 사용하는 것, 유전자를 돌연변이시키는 것, 유전자를 녹-아웃시키는 것, 트랜스포손 돌연변이유발, CrispR/CAR 등과 같이 숙련자에게 널리 공지되었고, 유전자가 기능성 최종 생성물을 생산할 가능성이 작아지거나(즉 기능성 야생형 유전자와 비교되었을 때 통계학상 유의적으로 '가능성이 작아지거나') 또는 기능성 최종 생성물 생산이 완전히 불가능하게 되는(예를 들어 유전자가 녹-아웃되는) 방식으로 유전자를 변이시키는데에 사용되는 기술에 의해 변이된 유전자를 지칭한다. 그러므로 '(유전자) 녹-아웃'이란 용어는, 유전자를 비 기능성으로 만드는 것을 지칭한다. '결실된 유전자' 또는 '유전자 결실'이란 용어는 또한 비 기능성이 된 유전자 또는 유전자를 비 기능성으로 만드는 것을 지칭하기도 한다(2, 4-9, 22, 27, 30, 43, 45, 46, 51, 65, 74).

본 발명은 전술된 바와 같이 유전자가 도입/녹-아웃/상향조절되어 바이오제품을 생산하게 된 유기체를 기술하고 있다. 이러한 유전자들은 유전자 데이터베이스, 예를 들어 유전자 은행(이에 한정되는 것은 아님), 또는 단백질 데이터베이스, 예를 들어 유니포트(uniport)(이에 한정되는 것은 아님), 또는 효소 데이터베이스, 예를 들어 Brenda 효소 데이터베이스(이에 한정되는 것은 아님)에서 발견되고(16, 23, 38), 바이오제품 지향 경로는 데이터베이스, 예를 들어 KEGG, Biocyc, Metacyc(이에 한정되는 것은 아님)에서 발견된다(20, 44, 47). 전술된 임의의 바이오제품 지향 경로는 당 업계에 기술된 몇 가지 수학적 도구에 의해 분석될 수 있다(35, 54, 57, 76).

실시예

1.재료 및 방법: 대장균

균주 및 플라스미드

대장균 MG1655 MG1655[λ^-, F^-, rph-1] 및 JM109를 네덜란드 박테리아 배양 수집소(Netherlands Culture Collection of Bacteria; NCCB)로부터 입수하였다. Datsenko & Wanner 방법을 이용하여 모든 돌연변이 균주들을 제조하였다(27).

배지

Luria Broth(LB) 배지는 1% 트립톤 펩톤(Difco, Erembodegem, Belgium), 0.5 % 효모 추출물(Difco) 및 0.5 % 염화나트륨(VWR, Leuven, Belgium)으로 이루어졌다. 진탕 플라스크 배지는 2g/ℓ NH₄Cl, 5g/ℓ (NH₄)₂SO₄, 2.993g/ℓ KH₂PO₄, 7.315g/ℓ K₂HPO₄, 8.372g/ℓ MOPS, 0.5g/ℓ NaCl, 0.5g/ℓ MgSO₄·7H₂O, 15g/ℓ 글리세롤(달리 진술하지 않은 경우), 1㎖/ℓ 비타민 용액, 100㎕/ℓ 몰리브덴산염 용액, 그리고 1㎖/ℓ 셀레늄 용액을 함유하였다. 1M KOH를 사용하여 이 배지의 pH를 7로 설정하였다.

비타민 용액은 3.6g/ℓ FeCl₂·4H₂O, 5g/ℓ CaCl₂·2H₂O, 1.3g/ℓ MnCl₂·2H₂O, 0.38g/ℓ CuCl₂·2H₂O, 0.5g/ℓ CoCl₂·6H₂O, 0.94g/ℓ ZnCl₂, 0.0311g/ℓ H₃BO₄, 0.4g/ℓ Na₂EDTA·2H₂O 및 1.01g/ℓ 티아민·HCl을 함유하였다. 몰리브덴산염 용액은 0.967g/ℓ Na₂MoO₄·2H₂O를 함유하였다. 셀레늄 용액은 42g/ℓ SeO₂를 함유하였다.

발효용 최소 배지는 6.75g/ℓ NH₄Cl, 1.25g/ℓ (NH₄)₂SO₄, 1.15g/ℓ KH₂PO₄, 0.5g/ℓ NaCl, 0.5g/ℓ MgSO₄·7H₂O, 30g/ℓ 락토스 및 20g/ℓ(또는 달리 진술되어 있으면 상이한 농도) 수크로스, 전술된 바와 동일한 조성의 1㎖/ℓ 비타민 용액, 100 ㎕/ℓ 몰리브덴산염 용액, 그리고 1㎖/ℓ 셀레늄 용액을 함유하였다.

배양 조건

LB 평판 상 단일 콜로니로부터 유래한, LB 배지 5 ㎖ 중 전 배양액을 37 ℃에서 8시간 동안 궤도 진탕기(orbital shaker)(200 rpm) 상에서 항온처리하였다. 이 배양액으로부터 2㎖를 덜어내어 500㎖들이 진탕 플라스크 내 최소 배지 100㎖에 첨가하고 이를 200rpm으로 회전하는 궤도 진탕기 상에서 16시간 동안 항온처리하였다(37 ℃). 4% 접종물을 2ℓ 또는 5ℓ Biostat B Plus 배양 용기(작업 부피, 1.5ℓ 또는 4ℓ)(Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Germany))에서 사용하였다. 배양 조건은 다음과 같았다: 37℃, 800 rpm에서 교반, 가스 유속 1.5ℓ/분. 공기를 주입하여 호기 조건을 유지하였다. 0.5M H₂SO₄ 및 35% 암모니아 용액을 사용하여 pH를 7로 유지하였다. 배기 냉각장치(Frigomix 1000, Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Germany)를 사용하여 배기가스를 4℃로 냉각하였다. 발효 진행중 거품이 발생할 때 실리콘 소포제(BDH 331512K, VWR Int Ltd., Poole, England)(약 10 ㎕)를 첨가하였다. EL3020 오프가스 분석 장치(ABB Automation GmbH, 60488 Frankfurt am Main, Germany)를 사용하여 오프가스를 측정하였다. 모든 데이터를 Sartorius MFCS/win v3.0 시스템(Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Germany)으로 기록하였다.

시료채취 방법

생체반응기는 자체의 내부에 수집 파이프(BD Spinal Needle, 1.2 x 152 mm) (BDMedical Systems, Franklin Lakes, NJ - USA)를 가지고 있으며, 이 파이프는 반응기 포트에 연결되어 있고, 또한 바깥쪽은, Masterflex-14 배관(Cole-Parmer, Antwerpen, Belgium)과 연결되어 있고, 또한 이 배관은 시료채취를 위한 격벽을 가지는 수집 포트와 연결되어 있다. 이 수집 포트의 다른 쪽은 다시 거슬러 반응기의 용기를 향하면서 Masterflex-14 배관과 함께 연결되어 있다. 이 시스템은 급속 시료채취 루프라고 지칭된다. 시료채취 중 반응기 내 브로스를 펌핑하여 시료채취 루프 주변으로 돌렸다. 유속 150㎖/분으로 반응기 내 브로스가 수집 포트에 도달하는데에는 0.04초가 필요하고, 반응기에 다시 도입되는 데에는 3.2초가 필요한 것으로 추정되었다. pO₂ 수준 50%일 때, 37℃의 액체 중에는 산소가 약 3㎎/ℓ 존재하였다. 미 호기 조건이 되는 것을 피하기 위해서 pO₂ 수준은 20% 이하로 떨어져서는 안 된다. 그러므로 수집 루프를 통해 이송될 때 산소 1.8㎎/ℓ가 소모될 수 있다. 산소 섭취 속도(μ_max에서 관찰되는 최대 산소 섭취 속도)가 1시간에 바이오매스 1g 당 산소 0.4g인 것으로 가정할 때, 이는 바이오매스 1ℓ를 기준으로 하면 산소 5g이며, 산소 섭취 속도는 2g/ℓ/h 또는 0.56 ㎎/ℓ/s가 되는데, 이 값을 3.2 초(루프 내 정체 시간)로 곱하였을 때 산소 소모량 1ℓ당 1.8㎎이 된다. 시료채취 중 세포 대사를 중지시키기 위해 -20℃로 예비 냉각한 스테인레스 강 62g으로 채워진 시린지로 반응기 내 브로스를 수집 포트를 통해 흡인하자마자 바로 브로스 5㎖는 4℃로 냉각되었다. 시료채취 직후 냉각 원심분리(15000g, 5분, 4℃)를 실시하였다. 회분 실험 중, 급속 시료채취 루프와 냉각 스테인레스 비드 시료채취 방법을 이용하여 OD_600nm측정용 시료를 취하였다.

분석 방법

600nm에서의 광학 밀도를 측정하여 배양액의 세포 밀도를 자주 모니터링하였다(Uvikom 922 분광분석계, BRS, Brussel, Belgium). 예비 건조 및 계량 팔콘 내에서 반응기 내 브로스 20g을 원심분리(15분, 5000g, GSA 로터, Sorvall RC-5B, Goffin Meyvis, Kapellen, Belgium)하여 세포의 건조 중량을 구하였다. 이후 펠릿을 생리 용액(9g/ℓ NaCl) 20㎖로 1회 세정한 다음, 70℃에서 건조하여 중량을 일정하도록 만들었다. OD_600nm 측정값들을 바이오매스 농도로 전환할 수 있도록 만들기 위해서, 바이오매스 농도에 대한 OD_600nm의 상관 곡선을 작성하였다. 글루코스 및 유기산의 농도를, 1cm 전치 컬럼이 장착되고 65℃로 가열된 Aminex HPX-87H 컬럼(Bio-Rad, Eke, Belgium)을 사용하여 Varian Prostar HPLC 시스템(Varian, Sint-Katelijne-Waver, Belgium) 상에서 측정하였다(이때, 이동 상으로서는 5mM H₂SO₄(0.6 ㎖/min)를 사용함). 이중 파장 UV-VIS(210 nm 및 265 nm) 검출장치(Varian Prostar 325) 및 시차 굴절률 검출장치(Merck LaChrom L-7490, Merck, Leuven, Belgium)를 사용하여 피크를 검출하였다. 265nm 및 210nm 둘 다에서의 피크들의 흡광도를 분리하여 피크들을 확인할 수 있었다. 분리를 통해 임의의 화합물에 전형적인 상수 값을 얻었다(Beer-Lambert 식).

Hypercarb 컬럼을 사용하는 HPLC에 의해 글루코스, 프록토스, 수크로스, 올리고당류 및 글루코스-1-포스페이트를 측정하고 나서, MSMS 검출장치(Antonio et al., 2007; Nielsen et al., 2006)로 검출하였다.

유전학적 방법

돌연변이 구성을 위해 사용된 방법들을 이하에 기술하였다.

플라스미드를 숙주 대장균 DH5α(F^-, φ80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk^-, mk⁺), phoA, supE44, λ^-, thi-1, gyrA96, relA1) 내에 유지하였다.

플라스미드. pKD46(Red 조력자 플라스미드, 암피실린 내성), pKD3(FRT-측접 클로람페니콜 내성 유전자(cat) 함유), pKD4(FRT-측접 카나마이신 내성 유전자(kan) 함유), 및 pCP20(FLP 재조합효소 활성 발현) 플라스미드들을 사용하여 돌연변이체를 구성하였다. 플라스미드 pBluescript(Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)를 사용하여 프로모터 라이브러리, 또는 점 돌연변이를 운반하는 대립형질들과 함께 pKD3 및 pKD4의 유도체들을 구성하였다.

돌연변이. 돌연변이들은 유전자 파괴(녹-아웃, KO)로 이루어졌다. Datsenko 및 Wanner의 컨셉을 이용하여 이 돌연변이들을 도입하였다(27).

Red 조력자 플라스미드를 운반하는 형질전환체를 암피실린(100㎎/ℓ) 및 L-아라비노스(10mM)를 함유하는 10㎖ LB 배지에서 OD_600nm가 0.6이 될 때까지 성장시켰다(30℃). 세포를 처음에 얼음 냉각수 50㎖로 세정하고 나서, 두 번째 얼음 냉각수 1㎖로 다시 세정하여 전기수용성 세포(electrocompetent cell)를 제조하였다. 그 다음, 세포를 얼음 냉각수 50㎕ 중에 재현탁하였다. Gene Pulser^TM(BioRad)(600 Ω, 25μFD 및 250볼트)를 사용하여 세포 50㎕와 선형 이중 가닥 DNA 생성물 10~100ng으로 전기천공을 수행하였다. 전기천공 후, 세포를 LB 배지 1㎖에 첨가한 다음, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하고 나서, 마지막으로 LB-아가(25㎎/ℓ 클로람페니콜 및 50㎎/ℓ 카나마이신 포함) 상에 도말하여, 항생체 내성 형질전환체를 선택하였다. 선택된 돌연변이체들을, 변형된 영역의 상류 및 하류에 프라이머를 사용하는 PCR로 확인한 다음, 이 돌연변이체들을 42℃ LB-아가에서 성장시켜 조력자 플라스미드를 소실시켰다. 돌연변이체들을 암피실린 감수성에 대해 시험하였다.

선형 이중 가닥 DNA. pKD3, pKD4 및 이것들의 유도체를 주형으로 사용하는 PCR에 의해 선형 dsDNA 앰플리콘을 구하였다. 사용된 프라이머는 주형에 상보성인 서열 부분과, 재조합이 일어나야 할 염색체 DNA 쪽에 상보성인 다른 부분을 가졌다. KO에 있어서, 상동성 영역은 관심 유전자의 개시 코돈과 종결 코돈의 50 nt 상류와 50 nt 하류로 디자인되었다. K1에 있어서, 전사 개시 점(+1)은 준수되어야 했다. PCR 생성물을 PCR 정제한 다음, DpnI으로 분해하고 나서, 아가로스 겔로부터 다시 정제한 후, 용리 완충액(5 mM Tris, pH 8) 중에 현탁하였다.

항생제 내성 유전자의 제거. 선택된 돌연변이체(클로람페니콜 또는 카나마이신 내성 돌연변이체)를, 온도 감수성 복제 및 FLP 합성의 열 유도를 보이는 암피실린 및 클로람페니콜 내성 플라스미드인 pCP20 플라스미드로 형질전환하였다. 30℃에서 암피실린 내성 형질전환체를 선택한 다음, 42℃에서 LB 중에 소수개의 콜로니를 정제하고 나서, 모든 항생제 내성 및 FLP 조력자 플라스미드의 소실에 대해 시험하였다. 유전자의 녹-아웃 및 녹-인(knock-in)을 대조군 프라이머(Fw/Rv-gene-out)를 사용하여 조사하였다.

형질전환. Hanahan의 간편화된 방법을 이용하거나(42) 또는 전술된 바와 같은 전기천공법을 통해 플라스미드들을 CaCl₂ 수용성 세포들 내에 도입하여 이 세포들을 형질전환하였다.

2. 재료 및 방법: 효모

2.1 균주

Euroscarf 배양 수집소로부터 사카로마이세스 세레비지아에 BY4742를 입수하였다. 돌연변이 균주 모두를, Gietz(40)의 방법을 이용하여 상동성 재조합 또는 플라스미드 형질전환에 의해 제조하였다. 산업 생명공학 및 생체촉매 실험실(Laboratory of Industrial Biotechnology and Biocatalysis)의 배양 수집소로부터 클루이베로마이세스 마르시아누스 락티스를 입수하였다.

2.2 배지

아미노산 불포함 6.7 g.L^-1 효모 질소 베이스(YNB w/o AA, Difco), 20 g.L^-1 아가(Difco)(고체 배양), 22 g.L^-1 글루코스 일수화물 또는 20 g.L^-1 락토스 및 0.79 g.L^-1 CSM 또는 0.77 g.L^-1 CSM-Ura(MP Biomedicals)를 함유하는 CSM 드롭아웃(SD CSM-Ura) 포함 합성 한정 효모 배지 또는 완전 보충 혼합물 포함 합성 한정 효모 배지(SD CSM) 상에서 균주들을 성장시켰다.

2.3. 배양 조건

처음에 효모 배양액을 적절한 배지 5㎖에 접종한 다음, 이를 30℃ 및 200 rpm에서 밤새도록 항온처리하였다. 더 많은 용적의 배양액을 얻기 위해, 전 배양액 중 2 %(또는 이 이상만큼)를 50~200㎖ 배지 중에 접종하였다. 이 배양액을 다시 30 ℃ 및 200 rpm에서 항온처리하였다.

96-웰 평판 또는 Erlenmeyer 스케일로 성장 실험을 수행하였다. 성장 실험 및 생산 실험을 위한 출발 재료로서 단일 콜로니를 얻기 위해 균주를 선택적 SD CSM 평판 상에 도말하고 나서, 이를 30℃에서 2 ~ 3일 동안 항온처리하였다. 그 다음, 하나의 콜로니를 찍어서 Erlenmeyer 연구를 위한 배지 5㎖ 또는 미세역가 평판 실험을 위한 배지 1 ㎖에 옮겼다.

Erlenmeyer 실험을 위해, 전 배양액을 밤새도록 30℃ 및 200rpm에서 항온처리한 다음, 이 전 배양액의 2%를 배지 100㎖에 첨가하여 성장 실험을 개시하였다.

MTP 성장 실험을 위해, 콜로니들을 150㎕ 배지에 첨가한 다음, 이를 30℃에서 24시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, MTP 전 배양액 2㎕를, 150㎕ 신선 배지를 함유하는 MTP에 첨가하였다. Infinite® 200 Pro Tecan으로 총 48시간에 걸쳐 15분 마다 OD를 측정하였다.

2.4. 시료채취 방법

정상 기에 이를 때까지 OD 측정용 시료(0.2 ㎖)와, 배양액의 세포 및 상청액 분획 시료(1㎖)를 2시간마다 취하였으며, 정상 기에 이르러서도 2시간마다 시료를 취하였다. 시료 1㎖를 처음에 원심분리하였으며(11), 이후에 세포 펠릿과 상청액을 분리한 다음, 이것들을 -20℃에 별도로 보관하여 두었다. 상청액을 세포 외 생성물 분석을 위해 보관하였으며, 이때 펠릿은 세포 내 대사물질 분석을 위해 사용하였다.

2.5. 분석 방법

600nm에서의 광학 밀도를 측정하거나(Uvikom 922 분광분석계, BRS, Brussel, Belgium), 또는 Biochrom Anthos Zenyth 340 미세역가평판 판독기를 사용하여 배양액의 세포 밀도를 자주 모니터링하였다. 예비 건조 및 계량 팔콘에서 반응기 내 브로스 20g을 원심분리(15분, 5000g, GSA 회전자, Sorvall RC-5B, Goffin Meyvis, Kapellen, Belgium)하여 세포의 건조 중량을 구하였다. 추후 펠릿을 생리 용액(9g/ℓ NaCl) 20㎖로 1회 세정하고 나서, 70℃에서 중량이 일정해질 때까지 건조하였다. OD_600nm 측정값들을 바이오매스 농도로 전환할 수 있도록 만들기 위해서, 바이오매스 농도에 대한 OD_600nm의 상관 곡선을 작성하였다. 글루코스 및 유기산의 농도를, 1cm 전치 컬럼이 장착되고 65℃로 가열된 Aminex HPX-87H 컬럼(Bio-Rad, Eke, Belgium)을 사용하여 Varian Prostar HPLC 시스템(Varian, Sint-Katelijne-Waver, Belgium) 상에서 측정하였다(이때, 이동 상으로서는 5 mM H₂SO₄(0.6 ㎖/min)를 사용함). 이중 파장 UV-VIS(210 nm 및 265 nm) 검출장치(Varian Prostar 325) 및 시차 굴절률 검출장치(Merck LaChrom L-7490, Merck, Leuven, Belgium)를 사용하여 피크를 검출하였다. 265nm 및 210nm 둘 다에서의 피크들의 흡광도를 분리하여 피크들을 확인할 수 있었다. 분리를 통하여 임의의 화합물에 전형적인 상수 값을 얻었다(Beer-Lambert 식). Hypercarb 컬럼을 사용하는 HPLC에 의해 글루코스, 프록토스, 수크로스, 올리고당류 및 글루코스-1-포스페이트를 측정하고 나서, MSMS 검출장치(Antonio et al., 2007; Nielsen et al., 2006)로 검출하였다.

2.6. 유전학적 방법

돌연변이 구성을 위해 사용된 방법들을 이하에 기술하였다.

플라스미드를 숙주 대장균 DH5α(F^-, φ80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk^-, mk⁺), phoA, supE44, λ^-, thi-1, gyrA96, relA1) 내에 유지하였다.

플라스미드. 산업 생명공학 및 생체 촉매 실험실에서 입수할 수 있는 효모 발현 플라스미드 p2a_2μ_Lac4를 사용하여, 사카로마이세스가 단독 C원으로서 락토스를 기반으로 성장할 수 있도록 만들었다. 이 플라스미드는 암피실린 내성 유전자와 박테리아의 복제 기원을 함유하고 있어서, 대장균 내에서의 선택 및 유지가 허용된다. 이 플라스미드는 효모 내에서의 선택 및 유지를 위해 2μ 효모 ori와 Ura3 선택 마커를 추가로 함유하였다. 마지막으로, 이 플라스미드는 β-갈락토시다아제 발현 카세트(서열 번호 9, 도 15)를 함유하였다.

돌연변이. 돌연변이는 p2a_2μ_Lac4를 사용하는 플라스미드 도입(전술됨)과, 이중 가닥 선형 DNA를 사용하는 유전자 녹-인(KI)(rDNA 좌에서의 KI)(전술됨)으로 이루어졌다. 플라스미드 DNA로 형질전환을 수행한 후 형질전환체들을 SD CSM-Ura상에 도말하였거나, 또는 이중 가닥 선형 DNA로 형질전환을 수행한 후에는 형질전환체들을 유일한 C원으로서 락토스를 함유하는 SD CSM-Ura상에 도말하였다. 돌연변이체들을 보유하는 선택된 플라스미드를, p2a_2μ_Lac4와 매칭되는 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 확인하였다. 선택된 게놈 녹-인 돌연변이체들을, 변형된 영역의 상류 및 하류에 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 확인하고, 서열 결정(LGC Genomics(LGC group, Germany)에서 수행)을 통해 확인하였다.

선형 이중 가닥 DNA. 플라스미드 pJet_KI_p1_Lac12_t@rDNA 또는 pJet_KI_p2_Lac12_t@rDNA를 사용하는 PCR에 의해 선형 ds-DNA 앰플리콘을 얻었다. 이들 플라스미드는 2,500 bp 상동성 영역(HR1(서열 번호 10, 도 16) 및 HR2(서열 번호 11, 도 17))을 함유하고, 이 영역에 측접하여 pJET 클로닝 벡터(Thermoscientific)의 다중 클로닝 위치에는 서열 번호 7 및 서열 번호 8의 서열들이 각각 존재한다. 사용한 프라이머들은 HR1(정방향 프라이머)의 5' 말단과 HR2(역방향 프라이머)의 3' 말단에 상동성이다. PCR 생성물을 PCR 정제한 다음, 형질전환에 사용하였다.

형질전환. Gietz의 방법(40)을 사용하여 플라스미드 및 선형 이중 가닥 DNA를 형질전환에 사용하였다.

3. 결과

실시예 1: agp 좌에서의 대장균 락토스 투과효소 lacY 녹-인의 구성

우선, 전술된 바와 같이 Datsenko 및 Wanner의 방법에 따라 균주 MG1655ΔlacY를 구성하였다. 이를 위해 MG1655를 pKD46으로 형질전환한 다음, 베이스 플라스미드인 pKD3 및 pKD4(lacY 유전자에 대한 측접 상동성(flanking homology)을 가짐)로부터 선형 DNA를 구성하였다. 그 다음, 적절한 항생제를 사용하여 성공적 재조합을 스크리닝하였다. 이 균주에 락토스가 섭취될 수 없도록 보장하기 위해, 균주를 탄소 원으로서 락토스만을 함유하는 최소 배지 상에서 성장시켰다. 이 실험 중 성장은 관찰되지 않았으므로, 상기 세포는 자체의 막을 통과하여 락토스를 더 이상 이송할 수 없었다.

합성 발현 계를 추가로 구성하기 위해, 합성 프로모터와 RBS를 lacY 유전자(IDT 및 Geneart로부터 주문)와 함께 합성하였다. 이 서열을 도 3에 보였다. 이 서열은 또한 Datsenko 및 Wanner 방법의 수정 적용을 통해 게놈의 agp 유전자 좌에 도입되었다. 간단히 말해서, 처음에 락토스 투과효소 구성물을 pKD3 플라스미드로부터 유래하는 스크리닝 카세트와 함께 조립하여, 신규 플라스미드인 pCX_lacY-kan을 만들었다. 이 플라스미드로부터 agp 게놈 영역에 대한 상동성을 가지는 선형 DNA를 PCR 증폭할 수 있었다. 그 다음, 이처럼 얻어진 선형 DNA를, pKD46 플라스미드가 존재하는 대장균 MG1655ΔlacY에 도입하여 형질전환을 수행할 수 있었다. 이로써 락토스 이송체 발현 카세트가 게놈으로 재조합되어 들어가서, 락토스 투과효소 발현 유기체인 MG1655ΔlacYΔagp::lacY_synthetic이 생산되었다. 락토스를 가빈으로 한 성장이 회복되도록 보장하기 위해, 이 균주를 전술된 바와 같이 락토스 최소 배지 상에서 성장시켰다. 이로써 야생형의 성장률과 유사한 성장률로 락토스를 기반으로 하는 성장의 완전한 회복이 초래되었다.

실시예 2: 락토스 사멸을 진행하지 않는 돌연변이 대장균 균주 및 야생형 대장균 균주에 대한 락토스의 영향

"재료 및 방법"에 기술된 바와 같이 야생형 MG1655 및 MG1655ΔlacYΔagp::lacY_synthetic을 사용하여 진탕 플라스크 실험을 준비하였다. 이와 같은 균주들을 글리세롤 진탕 플라스크 배지(15g/ℓ 글리세롤, "재료 및 방법"에 기술됨) 중에서 성장시키고 나서, 중간 지수 기(OD 약 0.8)에 락토스(200g/ℓ의 스톡 용액이 첨가되어, 최종 농도 10g/ℓ)를 첨가하였다. 도 1 및 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 돌연변이 균주는 락토스 사멸을 진행하지 않았다.

실시예 3: 락토스 이송체 발현을 보장함에 있어서 번역 공역 또는 번역 센서의 사용

전 락토스 투과효소 녹-아웃 균주는 또한 락토스 사멸도 진행하지 않고, 목표는 기능성, 활성, 발현 락토스 투과효소를 얻는 것이기 때문에, 스크리닝은 락토스 투과효소 발현을 보장하기 위해 필요하였다. 이를 위해서 프로모터의 서열 변이체, 리보자임 결합 위치, Kozak 서열, 코돈 선호도 및 전사 종결 인자를 마련할 수 있었다. 그러나 이와 같은 서열 변이체는 무효 발현(null-expression) 구성물을 이루어 락토스 이송체 음성 돌연변이 균주를 만들 수 있었다. 그러므로 시스템은 락토스 이송체의 발현을, 바람직하게는 스크리닝이 용이한 리포터 유전자, 예를 들어 lacZ, 형광 단백질 또는 항생제 내성 유전자에 의해 검출하도록 디자인될 필요가 있었다.

락토스 이송체 발현을 검출하기 위해 리포터 유전자의 번역을 재개하는, 번역 공역 계의 구성

관심 유전자로부터 유래한 번역 재개 영역 3'와 리포터 유전자로부터 유래한 5'가 도입되어 2개의 유전자가 번역 공역할 수 있었다. 몇 개의 코돈들, 예를 들어 AUG, UUG, GUG 또는 AUA에 의해 번역을 재개할 수 있었다(63). 이와 같이 락토스 투과효소 유전자와 lacZ 유전자가 번역상 공역하는 구성물의 서열을 도 4에 보였다. 이 서열을 제조하기 위해, Golden Gate 제한 위치(NEB로부터 얻은 BsaI)를 가지는 프라이머를 사용하여 대장균 게놈으로부터 lacY 및 lacZ 서열을 증폭하였다. 번역 공역을 허용하는 유전자 간 영역을 임의의 유전자 합성 회사, 예를 들어 IDT 또는 Geneart에 주문할 수 있었다. 그 다음, 도 3에 보인 바와 같이 모든 부분을 프로모터 및 RBS 서열과 함께 Golden Gate 방법(Engler et al.(2013)(36)에 기술됨)을 통해 pUC54 플라스미드로 조립하거나(대장균의 경우), 또는 바실러스 프로모터 및 리보좀 결합 위치와 함께 바실러스 종 내에서 복제하는 pGK12로 조립하였다.

리보좀 결합 위치상 루프의 개환을 통해 락토스 이송체 발현을 검출하기 위하여 리포터 유전자의 번역을 개시하는 번역 공역 계의 구성

번역 공역을 통한 발현에 대해 스크리닝하기 위한 제2의 방법은 Mendez-Perez외 다수(2012)에 의해 기술되었다(58). 이 방법은 클로람페니콜 리포터 유전자를 사용하여 락토스 투과효소 발현을 스크리닝하기 위해 수정하였다. 이 경우, 락토스 이송체 유전자 lacY를 HIS-태그 및 리보좀 결합 위치를 통해 클로람페니콜 내성 유전자와 공역시켰다. 이 구성물에 대한 서열 부분들도 또한 IDT 또는 Geneart에 주문하였으며, Golden Gate 조립을 통해 조립하였다. 얻어진 서열을 도 5에 제시하였다.

리포터 유전자와 효모 락토스 이송체를 공역시키는 번역 공역 계의 구성

비록 효모는 시스트론을 사용하지 않지만, 바이러스 내부 리보좀 도입 위치들(소위 IRES 서열)을 통한 번역 공역에 의해 발현에 대하여 스크리닝하는 것은 여전히 가능하다(56). 이러한 서열의 일례로서는 T2A 서열(10)이 있는데, 이 서열은 완전히 독립적이되(단백질 융합을 의미하는 것은 아님), 하나의 시스트론 내 2개의 단백질의 공역된 번역을 허용한다. 이는, 만일 시스트론의 마지막 단백질이 발현되면 처음 단백질도 발현됨을 의미한다.

효모에 있어서, 예를 들어 클루이베로마이세스 마르시아누스의 락토스 투과효소 유전자는 세포 내에서 락토스를 이송하는데 사용될 수 있다. 이 유전자는, 제네티신에 대한 내성을 암호화하는 aph 1 유전자에 대하여 T2A 서열과 공역할 수 있다. 이 서열은 전술된 바와 유사하게 구성된다. 최종 서열을 도 6에 제시하였다.

락토스 투과효소의 메신저 RNA로 앱타머를 도입하는 앱타머 공역 계의 구성

락토스 투과효소 발현도 또한 메신저 RNA 수준으로 검출할 수 있다. 이를 위해서, 도 7에 보인 바와 같이 락토스 투과효소 암호화 서열 뒤에 (Z)-4-(3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴)-1,2-디메틸-1H-이미다졸-5(4H)-온 결합 앱타머를 클로닝하였다. 이 구성물의 발현을 실시예 6에 기술된 바와 같이 추가로 조정하였다. 세포가 성장한 후, Pothoulakis외 다수(2013)(64)에 의해 기술된 바와 같이 배지에 (Z)-4-(3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴)-1,2-디메틸-1H-이미다졸-5(4H)-온을 첨가하였으며, 락토스 투과효소 발현 돌연변이 균주를 형광-활성화 세포 분류기(FACS)를 통해 선택하였다.

실시예 4: 클로람페니콜 내성 유전자와 번역 공역하는 락토스 이송체 발현의 검출

락토스 투과효소가 게놈으로부터 녹-아웃된 균주 2개를 구성하였다. 이 두 개의 균주를 카나마이신 내성 유전자를 함유하는 pSC101 플라스미드로 형질전환하였는데, 다만 실시예 1 및 2에 기술된 바와는 달리 상기 플라스미드들 중 하나는 구성적으로 발현된 락토스 투과효소를 함유하였으며, 그 결과 실시예 4 및 5에 기술된 바와 같이 기준 균주 MG1655DlacY pSC101_kan 및 lacY_cat 번역 공역 균주 MG1655ΔlacY pSC101_kan_ lacY_synthetic_cat이 생산되었다. 상기 두 균주를 전술된 바와 같이 (0 ㎎/ℓ 내지 30 ㎎/ℓ 사이로) 클로람페니콜 농도를 달리하면서 최소 배지 중에서 성장시켰다. 도 8 및 9는, 성장 48시간 및 92시간 후, 기준 균주의 성장은 돌연변이체 lacY_cat 번역 공역 균주에 작용된 클로람페니콜 농도보다 더 낮은 클로람페니콜 농도에서 억제되었음을 보이는데, 이는 상기와 같은 계를 락토스 투과효소 발현 유전자 구성물에 대한 탁월한 스크리닝 수단이 되도록 만든다.

실시예 5: 락토스 사멸을 진행하지 않는, 락토스 투과효소 발현 돌연변이체에 대한 스크리닝 방법

실시예 2와 유사하게, 클로람페니콜에 내성인 균주 2개의 혼합물을 성장시켰는데, 이 균주들 중 하나는 락토스 사멸뿐만 아니라, 클로람페니콜에 대해 번역 공역도 진행하지 않았으며, 다른 하나는 클로람페니콜 카세트는 보유하였을 뿐더러, 락토스 투과효소의 자연 발현 계도 가졌다. 상기 두 균주를 실시예 2에 기술된 바와 같은 배지 중에서 성장시켰으며, 실시예 2에 보인 바와 같이 중간 지수 기에 락토스를 첨가하였다. 락토스 사멸을 진행하지 않았던 돌연변이 균주는 계속해서 성장하였던 반면에, 다른 균주, 즉 락토스 사멸 감수성인 균주는 성장을 멈추었다. 지수 기의 막바지에 이 배양액 0.1 ㎖를, 전술된 바와 유사한 배지와 함께 제2 진탕 플라스크에 접종하였다. 다시 OD가 0.8일 때 락토스를 첨가하여, 락토스 사멸 감수성 균주의 성장을 중지시키고, 락토스 사멸을 진행하지 않는 돌연변이 균주를 더 증식시켰다. 이 과정을 5회 반복 수행한 결과, 락토스 사멸을 진행하지 않는 돌연변이 균주 99% 증식이 달성되었는데, 이 돌연변이 균주는 이후 배양액으로부터 용이하게 분리되었다.

실시예 6. 락토스 투과효소 발현 카세트 돌연변이체의 제조

프로모터 서열 변이체, 리보좀 결합 위치, Kozak 서열, 전사 종결 인자, 그리고 (코돈 선호도가 상이한) 락토스 투과효소 유전자 변이체를 유전자 합성 업체, 예를 들어 IDT, Geneart, Genscript, Gen9 등에 주문하였다. 박테리아용 프로모터 라이브러리의 디자인은, 전사 개시점의 -10 bp 및 -35 bp에 있는 보존 영역 2개와 함께, 박테리아 프로모터의 공통 서열을 기반으로 한다. 그 다음, 이러한 보존 영역들 사이, 앞, 그리고 뒤에 있는 염기들을 A, T, G 또는 C로 무작위로 변경하여, 발현 강도가 상이한 프로모터들을 만들었다. 대안적으로, 보존 영역들을 변경하되, 주변 서열은 일정하게 유지하였는데, 이 또한 상이한 길이를 가지는 프로모터들을 만들었다. 이후, 이러한 서열 혼합물을 (Gibson 조립, Golden Gate 조립, Cliva 조립, LCR 또는 제한 결찰을 통해) 번역 공역 락토스 투과효소 앞에 클로닝하여, 실시예 5에 기술된 스크리닝 프로토콜에 의해 스크리닝될 수 있는 락토스 투과효소의 발현 카세트 라이브러리를 만들었다.

코어 프로모터(core promoter)를 기반으로 진핵생물 프로모터 라이브러리를 제조하였다(13). 사카로마이세스 세레비지아에에 있어서, 이 프로모터는 UAS 서열로 증강되고, 프로모터 강도가 다양해지도록 돌연변이된 이종 TEF 프로모터 pTEF1일 수 있다(12). 이러한 프로모터를 주문하여, 전술된 바와 같이 번역 공역 락토스 투과효소 앞에 클로닝하였으며, 최종 구성물을 플라스미드에 삽입하여 효모, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에에 도입해 이 효모를 형질전환시키거나, 또는 이 효모의 염색체에 통합시킴으로써 이와 같은 효모를 형질전환시켰다.

비번역 영역은, 원핵생물의 경우 리보좀 결합 위치로 이루어져 있으며, 진핵생물의 경우에는 Kozak 서열로 이루어져 있다. 상기 두 서열을 무작위로 절단하여, 전술된 바와 같이 암호화 서열 앞에 클로닝함으로써, 번역 효율이 상이한 발현 카세트 라이브러리를 제조하였다. 상기 무작위 절단은 도구, 예를 들어 서열 번역 효율 상관관계를 계산하여 라이브러리에 포함되어야 할 변이체의 수를 줄이는 RBS 계산 프로그램으로 합리화할 수 있다(67).

코돈 선호도는 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않고 유전자의 암호화 서열을 변경함으로써 변경된다. 이를 코돈 적응(codon adaptation)이라 칭한다. 코돈 서열을 통한 코돈 선호도는, 다소간의 희귀 코돈을 임의의 영역에 도입함으로써 변경된 발현 효율과 폴딩 효율을 달성하는 방식으로 변경된다.

(코돈 선호도 데이터베이스에 의해 유기체를 기반으로 측정되었을 때(61)) 자체의 서열에 오로지 희귀 코돈들만으로 유도된 것으로 밝혀진 투과효소는, 전체가 코돈 최적화된 서열(표적 유기체 내 빈번하게 발생하는 코돈들만으로 이루어진 서열)로 유도된 투과효소보다 더 낮은 번역률을 보였다. 뿐만 아니라, 암호화 서열의 제1 코돈은 또한 Kozak 또는 리보좀 결합 위치 효율에 영향을 미쳤다(62, 69, 78).

전사 종결 인자 영역은, 데이터베이스에서 발견되는 내인성 또는 외인성 전사 종결 인자 서열에 의해 바뀌었다(18, 26). 이와 같은 전사 종결 인자도 또한 전술된 방법과 유사하게 클로닝하였다.

실시예 7: 락토스 투과효소를 발현하면서, 락토스 사멸은 유도하지 않는 발현 카세트의 증식

실시예 3 및 7에 따라서 발현 카세트를 제조하였다. 이로써 락토스 투과효소의 발현 카세트 라이브러리가 제조되었다. 락토스 투과효소의 발현을 초래하는 발현 카세트를 실시예 3 및 4의 방법에 따라서 선택하였다. 락토스 사멸을 유도하지 않는 발현 카세트, 발현 락토스 투과효소를 실시예 2 및 5에 기술된 방법에 따라서 선택하였다. 선택된 발현 카세트를 서열결정에 의해, 그리고 실시예 2에 기술된 방법에 의해 더 분석하였다.

실시예 8: 대장균와 함께, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)로부터 기원하는 푸코실전이효소를 사용하는 발효에 의한 2-푸코실락토스의 생산

모든 배양 조건에서의 발현을 보장하기 위해, 실시예 1 및 실시예 2에 기술된 바와 같이 유전자 lacZ , glgC , agp , pfkA , pfkB , pgi , arcA , iclR , wcaJ 가 녹-아웃되고, lacY가 구성적 발현을 통해 발현되었던 돌연변이 균주를, 구성적으로 발현되었던 헬리코박터 파일로리로부터 기원하는 푸코실전이효소와, 비피도박테리움 어돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis)로부터 기원하는 수크로스 인산분해효소로 추가 형질전환하였다. 구성적 프로모터는 De Mey외 다수(2007)에 의해 기술된 프로모터 라이브러리로부터 기원한다.

이 균주를, 수크로스 30g/ℓ 및 락토스 50g/ℓ를 함유한다는 것을 제외하고 "재료 및 방법"에 기술된 바와 같은 배지 중에 배양하였다. 이로써 2'-푸코실전이효소가 1.5g/ℓ 이하 생성되었다.

실시예 9: 대장균가 사용되는 2-푸코실락토스의 유가식 생산

전술된 바와 같은 유전자 조작 방법을 통해 하기 유전자형으로 돌연변이 균주를 구성하였다:

ΔlacZYAΔglgCΔagpΔpgiΔpfkA -P22- baSPΔpfkBΔarcAΔiclR :: slΔwcaJΔlonΔadhE -P14-frk + pCXP14-FT_H. pylori(서열 번호 6을 가지는 벡터, 도 10 참조). 이때, 락토스 투과효소 발현은 실시예 1 및 실시예 2에 기술된 바와 같이 변경되었다. 프로모터 P22 및 P14는 De Mey외 다수(29)에 의해 구성된 프로모터 라이브러리로부터 기원하는데, 이를 Aerts외 다수(1)에 의해 기술된 방법과 유사하게 클로닝하였다. "::sl"은 비 상흔 유전자 결실(scarless gene deletion)을 상징하는 것으로서, 염색체 내에 유지되는 FRT 위치를 포함하지 않게 된다.

상기 "재료 및 방법"에 기술된 바와 같이, 상기 균주를 수크로스 30g/ℓ 및 락토스 50g/ℓ를 함유하는 무기 배지가 담긴 생물반응기 내에서 배양하였다. 회분 단계 후, 생물반응기에 수크로스 500g/ℓ, 락토스 50g/ℓ 및 황산마그네슘 7수화물 1g/ℓ를 채웠다. 이로써 상청액 중에 푸코실락토스 27.5g/ℓ가 축적되었다.

실시예 10: 대장균를 사용하는 락토N삼당류 제조

각각 De Mey외 다수(29)의 프로모터 라이브러리로부터 유래하는 구성적 프로모터와 베타-락타마아제 선택 마커를 가지는 pBR322 플라스미드 상에 UDP-N-아세틸글루코사민 전이효소, 수크로스 인산분해효소 및 L-글루타민:D-프록토스-6-포스페이트 아미노전이효소 및 글루코사민 우리딜전이효소를 발현시키는 전술된 방법들과 유전자 조작을 통하여 돌연변이 균주를 구성하였다. 이 벡터를, 전술된 바와 같이 락토스 투과효소를 구성적으로 발현하는 유전자형 ΔlacZYAΔglgCΔagp::P14-frk-P22-BaSPΔpgiΔpfkAΔpfkB ΔnagABCDEΔmanAΔnanATEKΔmanXYZ와 함께 대장균 돌연변이체에 도입하여 형질전환을 수행하였다. 이 균주를 전술된 바와 같이 탄소 원으로서 락토스 및 수크로스를 사용하고, 추가로 글리세롤을 포함하거나 포함하지 않는 조건 하에 진탕 플라스크 내에서 배양하였다. 이러한 생산 숙주는 락토스 사멸을 진행하지 않았고, 첨가된 락토스로부터 락토N삼당류를 각각 62.5 ㎎/ℓ 및 55.3 ㎎/ℓ 생성하였다.

실시예 11: rDNA 좌에서의 효모 케이.마르시아누스 락토스 투과효소(p1) 녹-인의 구성

우선, 플라스미드 p2a_2μ_Lac4를 사용하여 사카로마이세스 세레비지아에 BY4742 야생형 균주를 형질전환시켰다. Gietz 프로토콜(40)에 따라서 플라스미드 총 4 ㎍을 사용하여 형질전환을 수행하였다. 형질전환된 효모 세포들을 SD-CSM 드롭-아웃 평판(우라실 불포함) 상에 도말하였다. 2일 후, 평판 상에서는 성장이 관찰되었고, 효모 콜로니를 대상으로 원하는 플라스미드가 존재하는지에 대해 시험하였다. 33개 콜로니 모두를 대상으로 콜로니 PCR을 수행하였다. 시험된 모든 콜로니는 플라스미드 p2a_2μ_Lac4의 존재에 대해 양성인 것으로 확인되었다. 콜로니 5를 추가 사용을 위해 선택하였다. 이 콜로니를, pJet_KI_p1_Lac12_t@rDNA로부터 유래하는 이중 가닥 선형 DNA 2㎍으로 형질전환하였다. 형질전환된 세포를 SD-CSM-Ura 평판 상에 도말하였는데, 이때 락토스가 유일한 C원이었다. 형질전환 후 3일 경과시, 몇몇 콜로니가 사카로마이세스 rDNA 내 Lac12 발현 카세트의 존재에 대해 시험 될 수 있을 정도로 충분히 성장하였다. 모든 콜로니를 대상으로 콜로니 PCR을 수행하였다. 시험된 모든 콜로니는 Lac12 발현 카세트의 존재에 대해 양성인 것으로 확인되었다. 콜로니 6을 추가의 사용을 위해 선택하였다(사카로마이세스 KI_p1_Lac12_t@rDNA).

실시예 12: rDNA 좌에서의 효모 케이.마르시아누스 락토스 투과효소(p2) 녹-인의 구성

우선, 플라스미드 p2a_2μ_Lac4를 사용하여 사카로마이세스 세레비지아에 BY4742 야생형 균주를 형질전환시켰다. Gietz 프로토콜(40)에 따라서 플라스미드 총 4 ㎍을 사용하여 형질전환을 수행하였다. 형질전환된 효모 세포들을 SD-CSM 드롭-아웃 평판(우라실 불포함) 상에 도말하였다. 2일 후, 평판 상에는 성장이 관찰되었고, 효모 콜로니를 대상으로 원하는 플라스미드가 존재하는지에 대해 시험하였다. 33개 콜로니 모두를 대상으로 콜로니 PCR을 수행하였다. 시험된 모든 콜로니는 플라스미드 p2a_2μ_Lac4의 존재에 대해 양성인 것으로 확인되었다. 콜로니 5를 추가의 사용을 위해 선택하였다. 이 콜로니를, pJet_KI_p2_Lac12_t@rDNA로부터 유래하는 이중 가닥 선형 DNA 2㎍으로 형질전환하였다. 형질전환된 세포를 SD-CSM-Ura 평판 상에 도말하였는데, 이때 락토스가 유일한 C원이었다. 형질전환 후 3일 경과시, 몇몇 콜로니가 사카로마이세스 rDNA 내 Lac12 발현 카세트의 존재에 대해 시험 될 수 있을 정도로 충분히 성장하였다. 모든 콜로니를 대상으로 콜로니 PCR을 수행하였다. 시험된 모든 콜로니는 Lac12 발현 카세트의 존재에 대해 양성인 것으로 확인되었다. 콜로니 7을 추가의 사용을 위해 선택하였다(사카로마이세스 KI_p2_Lac12_t@rDNA).

실시예 13: 야생형 효모 균주 및 돌연변이체 효모 균주 2개의 락토스를 기반으로 한 성장

야생형 클루이베로마이세스, 사카로마이세스 KI_p1_Lac12_t@rDNA 및 사카로마이세스 KI_p2_Lac12_t@rDNA로 "재료 및 방법"에 기술된 바와 같은 진탕 플라스크 실험을 준비하였다. 이 균주들을, 유일한 C원으로서 락토스(20g/ℓ)를 함유하는 진탕 플라스크 매질 중에서 성장시켰다. 표 1에서 살펴볼 수 있는 바와 같이, 돌연변이체 사카로마이세스 균주는, 락토스를 기반으로 빨리 성장하는 것으로 공지된(31) 야생형 클루이베로마이세스 마르시아누스 락티스만큼 빨리 성장하였다. 그러므로 구성적으로 발현된 락토스 투과효소는 효모 세포 내로의 락토스의 빠르고 효율적인 유입을 보장한다.

실시예 14: 락토스 사멸을 진행하지 않는 돌연변이체 효모 균주와 야생형 효모 균주에 대한 락토스의 영향

야생형 클루이베로마이세스, 사카로마이세스 KI_p1_Lac12_t@rDNA 및 사카로마이세스 KI_p2_Lac12_t@rDNA를 사용하여 "재료 및 방법"에 기술된 바와 같이 진탕 플라스크 실험을 준비하였다. 이와 같은 균주들을 글루코스 진탕 플라스크 배지(20g/ℓ 글루코스, "재료 및 방법"에 기술됨) 중에서 성장시키고 나서, 중간 지수 기에 락토스(200g/ℓ 스톡 용액이 첨가되어, 최종 농도 10g/ℓ)를 첨가하였다. 도 11 및 도 12에서 볼 수 있는 바와 같이, 돌연변이 균주는 락토스 사멸을 진행하지 않았다. 그러나 이러한 효모 세포 내에 락토스가 빠르고 효율적으로 유입되었음이 실시예 13에서 입증되었다.

실시예 15: 락토스 사멸을 진행하지 않는 락토스 투과효소 발현 카세트의 서열결정

전술된 바와 같은 스크리닝으로부터 유래하는 콜로니 46개를 대상으로 서열결정을 실시하였으며, 그 결과 서열 번호 12 내지 57의 서열이 얻어졌다(도 18a~18au). 이와 같은 서열들은 대장균 내에서 발현될 때 락토스 사멸을 초래하지 않는 RBS 변이체 및 프로모터이다. 이는 서열결정된 콜로니들 다수를 엄선한 것으로서, 스크리닝 방법은 도 18에 보인 서열보다 더 많은 서열을 획득하였고, 전술된 바와 같은 대안적 라이브러리 제조 방법은 또한 도 18에 보인 서열들 이외의 서열들을 획득하였음에 주목하시오.

실시예 16: 락토스 투과효소 발현 카세트 돌연변이 균주의 μ_MAX 측정

모든 균주는 LB-아가 평판으로부터 구하였거나, 또는 냉동 바이알로부터 구하였고, 이를 Luria 브로스 배지(트립토판 10 g; 효모 추출물 5 g; NaCl 10 g) 5.0 ㎖ 중에 접종하였다. 상기 전 배양액을 37 ℃에서 밤새도록 성장시킨 후, 이를 최소 락토스 배지(2,0g/ℓ NH₄Cl; 5,0g/ℓ; (NH₄)₂SO₄; 3,0g/ℓ KH₂PO₄, 7,3g/ℓ K₂HPO₄; 8,4 g/ℓ MOPS; 0,5g/ℓ MgSO₄ x 7H₂O; 0,5g/ℓ NaCl; 10g/ℓ 락토스; 0,4㎎/ℓ Na₂EDTA x 2H₂O; 0,03㎎/ℓ H₃BO₃; 1,01㎎/ℓ 티아민 HCL; 0,94㎎/ℓ ZnCL₂; 0,5㎎/ℓ C_OCL₂ x 6H₂0; 0,38㎎/ℓ CuCl₂ x 2H₂0; 1,59㎎/ℓ MnCl₂ x 4H₂O; 3,6㎎/ℓ CaCL₂ 및 0,096㎎/ℓ Na₂MoO₄ x 2H₂O; pH 7.0) 100㎖를 함유하는 500㎖들이 진탕기 플라스크에 넣었다. 이를 37℃에서 밤새도록 성장시킨 다음, OD₆₀₀이 0.050이 될 때까지 두 전 배양액을 최소 락토스 배지로 희석하였다. 그 다음, 현탁액을 96 MTP 평판에 옮긴 다음(n = 32), 이지실 커버(easyseal cover)로 덮었다. 다음과 같은 조건들, 즉 온도 37℃ ± 0.5; 진탕 시간 597초; 진탕 진폭 2mm; 280rpm; 파장 OD₆₀₀; 플래시 10회; 침강 시간 150분에서 Infinite M200 pro(TECAN)를 사용하여 총 24 시간 동안 10분마다 OD 측정을 수행하였다.

실시예 17: 락토스 투과효소 발현 카세트의 특성규명

락토스 사멸을 감소시키거나 방지하기 위한 한 가지 방법은, 락토스 투과효소의 활성을 유의적으로 감소시키거나 억제하는 것이다(실시예 16 참조). 그러나, 락토스 또는 갈락토스 기반 바이오제품의 제조를 비추어 보았을 때, 세포에는 다량의 락토스가 유입되어야 한다. 이에 본 발명자들은 락토스 사멸 내성 돌연변이 균주로의 락토스 유입은 여전히, 락토스 사멸이 진행되는 야생형 유기체로의 락토스 유입과 거의 동일하거나, 동일하거나 또는 심지어 더 많음을 입증하였다. 이를 위해, 베타-갈락토시다아제를 여전히 발현하는 MG1655ΔDlacY 균주에 신규 락토스 투과효소 발현 카세트를 도입하였다. 이와 같은 신규 균주의 성장률은 락토스 유입에 대한 척도인데, 그 이유는 락토스 투과효소 발현이 유의적으로 감소한 임의의 균주는 성장률도 유의적으로 감소할 것이기 때문이다.

본 분석의 결과들을 도 19에 보였다. 이 도면에 보인 거의 모든 균주가 야생형 균주의 성장률와 동일하거나 더 빠른 성장률을 보였는데, 이는 락토스 투과효소 활성 및 발현이 야생형의 락토스 투과효소 활성 및 발현과 동일하거나 더 크되, 다만 야생형 발현 계와는 달리 돌연변이 발현 카세트는 락토스 사멸을 진행하지 않음을 말해주는 것이다. 그러나 이 방법은 성장에 있어서 율속 단계가 되는 베타 갈락토시다아제 유전자 발현에 의해 제한된다. 그러므로 락토스 투과효소 유전자의 발현을 전술된 번역 공역 계를 통해 전술된 바와 같이 분석하였다. 클로람페니콜에 대한 최소 억제 농도(MIC)는 락토스 투과효소 유전자 발현에 대한 지표로서, 카세트 각각에 대해 측정하였다. 야생형의 성장률과 비교되었을 때 동일한 성장률을 여전히 보이는 최저 MIC를, 야생형 락토스 투과효소 발현의 발현 여부에 대한 지표로서 사용하였다.

성장률이 야생형 균주의 성장률과 동일한, 최저 MIC를 보이는 카세트의 MIC는 약 20 ㎎/ℓ 클로람페니콜이었다. 성장률이 약간 느린 돌연변이 균주의 MIC는 15 ㎎/ℓ 내지 20 ㎎/ℓ의 범위였고, 성장률이 동일하거나 더 빠른 돌연변이 균주의 MIC는 20 ㎎/ℓ 내지 80 ㎎/ℓ였다. 서열들 중 85 %는 후자의 카테고리에 속하였는데, 이는 락토스 사멸 음성 발현 카세트로서 동정된 대부분의 서열이, 이미 문헌에 기술된 바와 대조적으로 더 높은 락토스 투과효소 발현 수준을 달성함을 의미한다.

실시예 18: lacIq 프로모터 발현 카세트의 구성

전술된 방법과 유사하게, placIQ 프로모터를 대장균의 lacY 유전자 앞에 클로닝하였다. 이 구성물의 최종 서열을 도 20에 보였다.

실시예 19: 락토스 사멸을 진행하는, 당 업계에서 사용되는 기타 프로모터

프로모터 placIQ는 대장균 내에서의 락토스 투과효소 발현을 위해 당 업계에서 사용되고 있는 프로모터이다. 이 프로모터가 사용되면 세포 내로의 락토스 섭취를 초래한다. 그러나 이와 같은 섭취의 영향은 시험하지 않았다. 락토스를 기반으로 하였을 때 야생형의 성장률은 lacIq 프로모터로 말미암은 성장률과 유의적으로 상이하지 않았는데(이 경우, μmax는 각각 0.1 h^-1 및 0.11 h^-1임), 이는 곧 락토스 섭취율이 유사함을 말해준다. 이 lacIQ 발현 카세트의 락토스 사멸 스크리닝은 상기 프로모터도 또한 락토스 사멸을 초래함을 입증하였다(도 21 참조). 이는, 락토스 사멸을 초래하는 특이 프로모터 서열과, 락토스 사멸을 초래하지 않는 기타 서열이 존재함을 입증해준다. 서열들의 합리화는 불가능하며, 개별 서열에 대한 시행착오는 막대한 비용 지출을 초래하는 힘든 작업이므로, 락토스 사멸을 진행하지 않는 발현 카세트를 동정하기 위한 전술된 방법은 스크리닝 작업에 시간이 오래 걸리고 비용이 많이 드는 것을 막아주는 완벽한 방법이다.

실시예 20: 에스.세레비지아에를 사용하는 락토N사당류의 제조

실시예 11 및 12에서 구성된 돌연변이 균주를, 예를 들어 Lee외 다수(52)에 의해 기술된 바와 같이 표준 효모 발현 벡터를 사용하여, 구성적으로 발현되는 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) 기원 β-1,4-갈락토실전이효소 및 β-1,3-N-아세틸글루코사미닐전이효소로 추가 형질전환하였다. 이 균주들을 "재료 및 방법"에 기술된 바와 같되, 다만 수크로스 20g/ℓ와 락토스 20g/ℓ를 포함하는 배지 중에 배양하였다. 이를 통하여 30 ㎎/ℓ 이하의 락토N사당류가 생성되었다.

실시예 21: 에스.세레비지아에를 사용하는 2-푸코실락토스의 제조

실시예 11 및 12에서 구성된 돌연변이 균주를, 예를 들어 Lee외 다수(52)에 의해 기술된 바와 같이 표준 효모 발현 벡터를 사용하여, 구성적으로 발현되는 대장균의 GDP-푸코스 합성효소 및 GDP-만노스-4,6-탈수소효소와, 헬리코박터 파일로리 기원 푸코실전이효소로 추가 형질전환하였다. 이 균주들을 "재료 및 방법"에 기술된 바와 같되, 다만 수크로스 20g/ℓ와 락토스 20g/ℓ를 포함하는 배지 중에 배양하였다. 이를 통하여 10 ㎎/ℓ 이하의 2-푸코실락토스가 생성되었다.

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1558 <210> 13 <211> 1551 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Heterologous sequences in front of a lactose transporter gene <400> 13 cccgtcttac tgtcgggaat tcgcgttggc cgattcatta atggtataag gttcttgaca 60 tcttacaatc aatatggtat aataatttag ttagggccca agttcactta aaaaggagat 120 caacacttac tgtcgggaat tcgcgttggc caattaatta atggtataag gttcttgaca 180 tcttacaatc aatatggtat aataatttag ttagggccca agttcactta aaaaggagat 240 caacaatgaa agcaattttc gtactgaaac atcttaatca tgcgtaggat tttttctatg 300 tactatttaa aaaacacaaa cttttggatg ttcggtttat tctttttctt ttactttttt 360 atcatgggag cctacttccc gtttttcccg atttggctac atgacatcaa ccatatcagc 420 aaaagtgata cgggtattat ttttgccgct atttctctgt tctcgctatt attccaaccg 480 ctgtttggtc tgctttctga caaactcggg ctgcgcaaat acctgctgtg gattattacc 540 ggcatgttag tgatgtttgc gccgttcttt atttttatct tcgggccact gttacaatac 600 aacattttag taggatcgat tgttggtggt atttatctag gcttttgttt taacgccggt 660 gcgccagcag tagaggcatt tattgagaaa gtcagccgtc gcagtaattt cgaatttggt 720 cgcgcgcgga 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ttagggccca agttcactta aaaaggagat 120 caacaatgaa agcttactgt cgggaattcg cgttggccga ttcattaatg gtataaggtt 180 cttgacatct tacaatcaat atggtataat aatttagtta gggcccaagt tcacttaaaa 240 aggagatcaa caatgaaagc aattttcgta ctgaaacatc ttaatcatgc gtaggatttt 300 ttctatgtac tatttaaaaa acacaaactt ttggatgttc ggtttattct ttttctttta 360 cttttttatc atgggagcct acttcccgtt tttcccgatt tggctacatg acatcaacca 420 tatcagcaaa agtgatacgg gtattatttt tgccgctatt tctctgttct cgctattatt 480 ccaaccgctg tttggtctgc tttctgacaa actcgggctg cgcaaatacc tgctgtggat 540 tattaccggc atgttagtga tgtttgcgcc gttctttatt tttatcttcg ggccactgtt 600 acaatacaac attttagtag gatcgattgt tggtggtatt tatctaggct tttgttttaa 660 cgccggtgcg ccagcagtag aggcatttat tgagaaagtc agccgtcgca gtaatttcga 720 atttggtcgc gcgcggatgt ttggctgtgt tggctgggcg ctgtgtgcct cgattgtcgg 780 catcatgttc accatcaata atcagtttgt tttctggctg ggctctggct gtgcactcat 840 cctcgccgtt ttactctttt tcgccaaaac ggatgcgccc tcttctgcca cggttgccaa 900 tgcggtaggt gccaaccatt cggcatttag ccttaagctg gcactggaac tgttcagaca 960 gccaaaactg tggtttttgt cactgtatgt tattggcgtt tcctgcacct acgatgtttt 1020 tgaccaacag tttgctaatt tctttacttc gttctttgct accggtgaac agggtacgcg 1080 ggtatttggc tacgtaacga caatgggcga attacttaac gcctcgatta tgttctttgc 1140 gccactgatc attaatcgca tcggtgggaa aaacgccctg ctgctggctg gcactattat 1200 gtctgtacgt attattggct catcgttcgc cacctcagcg ctggaagtgg ttattctgaa 1260 aacgctgcat atgtttgaag taccgttcct gctggtgggc tgctttaaat atattaccag 1320 ccagtttgaa gtgcgttttt cagcgacgat ttatctggtc tgtttctgct tctttaagca 1380 actggcgatg atttttatgt ctgtactggc gggcaatatg tatgaaagca tcggtttcca 1440 gggcgcttat ctggtgctgg gtctggtggc gctgggcttc accttaattt ccgtgttcac 1500 gcttagcggc cccggcccgc tttccctgct gcgtcgtcag gtgaatgaag tcgcttaa 1558 <210> 16 <211> 1558 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Heterologous sequences in front of a lactose transporter gene <400> 16 cccgtcttac tgtcgggaat tcgcgttggc cgattcatta atggtataag gttcttgaca 60 tcttacaatc aatatggtat aataatttag ttagggccca agttcactta 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240 atggtataag gttcttgaca tcttacaatc aatatggtat aaataattta gttagggccc 300 aagttcactt aaaaaggaga tcaacaatga aagcaatttt cgtactgaaa catcttaatc 360 atgcgtagga ttttttctat gtactattta aaaaacacaa acttttggat gttcggttta 420 ttctttttct tttacttttt tatcatggga gcctacttcc cgtttttccc gatttggcta 480 catgacatca accatatcag caaaagtgat acgggtatta tttttgccgc tatttctctg 540 ttctcgctat tattccaacc gctgtttggt ctgctttctg acaaactcgg gctgcgcaaa 600 tacctgctgt ggattattac cggcatgtta gtgatgtttg cgccgttctt tatttttatc 660 ttcgggccac tgttacaata caacatttta gtaggatcga ttgttggtgg tatttatcta 720 ggcttttgtt ttaacgccgg tgcgccagca gtagaggcat ttattgagaa agtcagccgt 780 cgcagtaatt tcgaatttgg tcgcgcgcgg atgtttggct gtgttggctg ggcgctgtgt 840 gcctcgattg tcggcatcat gttcaccatc aataatcagt ttgttttctg gctgggctct 900 ggctgtgcac tcatcctcgc cgttttactc tttttcgcca aaacggatgc gccctcttct 960 gccacggttg ccaatgcggt aggtgccaac cattcggcat ttagccttaa gctggcactg 1020 gaactgttca gacagccaaa actgtggttt ttgtcactgt atgttattgg cgtttcctgc 1080 acctacgatg 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cttgacatct tacaatcaat atggtataat aatttagtta gggcccaagt tcacttaaaa 240 aggagatcaa caatgaaagc aattttcgta ctgaaacatc ttaatcatgc gtaggatttt 300 ttctatgtac tatttaaaaa acacaaactt ttggatgttc ggtttattct ttttctttta 360 cttttttatc atgggagcct acttcccgtt tttcccgatt tggctacatg acatcaacca 420 tatcagcaaa agtgatacgg gtattatttt tgccgctatt tctctgttct cgctattatt 480 ccaaccgctg tttggtctgc tttctgacaa actcgggctg cgcaaatacc tgctgtggat 540 tattaccggc atgttagtga tgtttgcgcc gttctttatt tttatcttcg ggccactgtt 600 acaatacaac attttagtag gatcgattgt tggtggtatt tatctaggct tttgttttaa 660 cgccggtgcg ccagcagtag aggcatttat tgagaaagtc agccgtcgca gtaatttcga 720 atttggtcgc gcgcggatgt ttggctgtgt tggctgggcg ctgtgtgcct cgattgtcgg 780 catcatgttc accatcaata atcagtttgt tttctggctg ggctctggct gtgcactcat 840 cctcgccgtt ttactctttt tcgccaaaac ggatgcgccc tcttctgcca cggttgccaa 900 tgcggtaggt gccaaccatt cggcatttag ccttaagctg gcactggaac tgttcagaca 960 gccaaaactg tggtttttgt cactgtatgt tattggcgtt tcctgcacct acgatgtttt 1020 tgaccaacag 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transporter gene <400> 40 tgtctttttc gtgacattca gttcgctgcg ctcacggctc tggcagtgaa tgggggtaaa 60 tggcactaca ggcgcctttt atggattcat gcaaggaaac tacccataat acaagaaaag 120 cccgtcacgg gcttctcagg gcgttttatg gcgggtctgc tatgtggtgc tatctgactt 180 tttgctgttc agcagttcct gccctctgat tttccagtct gaccacttcg gattatcccg 240 tgacaggtca ttcagactgg ctaatgcacc cagtaaggca gcggtatcat caacaggctt 300 acccgtctta ctgtcgggaa ttcgcgttgg ccgattcatt aatggtataa ggttcttgac 360 atcttacaat caatatggta taataattta gttagggccc aagttcactt aaaaaggaga 420 tcaacaatga aagcttactg tcgggaattc gcgttggccg attcattaat ggtataaggt 480 tcttgacatc ttacaatcaa tatggtataa taatttagtt agggcccaag ttcacttaaa 540 aaggagatca acaatgaaag cactgtcggg aattcgcgtt ggccgattca ttaatggtat 600 aaggttcttg acatcttaca atcaatatgg tataataatt tagttagggc ccaagttcac 660 ttaaaaagga gatcaacaat gaaagcttac tgtcgggaat tcgcgttggc cgattcatta 720 atggtataag gttcttgaca tcttacaatc aatatggtat aataatttag ttagggccca 780 agttcactta aaaaggagat caacacttta ctgtcgggga attcgccgtt gggccaattt 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tcggcagaat gcttaatgaa ttacaacagt actgcgatga gtggcagggc 2040 ggggcgtaag gatccaaagg tacctctaga gtcgacctgc aggccttcgt aaatctggcg 2100 agtggggaac tgccagacat caaataaaac aaaaggctca gtcggaagac tgggcctttt 2160 gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacactc tcccgtgtag gctggagctg 2210

Claims (14)

1. a. 미생물 내 락토스 이송체 발현을 돌연변이시키는 단계로서, 상기 돌연변이는 상기 락토스 이송체 발현을 초래하는 단계;
   b. 락토스가 아닌 탄소 원을 포함하는 배지에서 상기 돌연변이 미생물을 성장시키는 단계;
   c. 상기 돌연변이 미생물이 성장하는 동안 상기 배지에 락토스를 첨가하는 단계; 및
   d. 상기 락토스 포함 배지에서 성장할 때, 락토스 사멸 현상에 내성이며, 상기 락토스 이송체의 야생형 발현 카세트로 얻어진 락토스 유입의 적어도 50%를 유지하는 미생물을 선택하는 단계
   를 포함하는, 락토스가 다른 탄소 원과 함께 존재하는 환경에서 성장할 때 락토스 사멸 현상에 내성인 미생물을 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 단계 a)는 이종 프로모터를 내인성 또는 외인성 락토스 이송체 유전자 앞에 도입하고/도입하거나, 리보좀 결합 서열 또는 Kozak 서열을 함유하는, 암호화 서열 앞 비번역 영역을 돌연변이시키고/돌연변이시키거나, 내인성 락토스 이송체 유전자의 코돈 선호도를 변경함으로써 수행되는 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 이종 프로모터를 내인성 또는 외인성 락토스 이송체 유전자 앞에 도입하는 것은 a) 게놈으로부터 내인성 락토스 이송체를 결실시킨 다음, 이 내인성 락토스 이송체를 상기 미생물의 게놈 내 다른 좌에 재도입하거나, b) 내인성 락토스 이송체 앞에 이종 프로모터를 도입하거나, 또는 c) 내인성 락토스 프로모터를 녹-아웃시킨 다음, 상기 미생물 게놈 내 동일한 좌에 이종 프로모터를 도입함으로써 수행되는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 발현된 락토스 이송체는 리포터 유전자와의 번역 공역 및/또는 앱타머 공역을 통해 검출되는 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 발현된 락토스 이송체는 서열 번호 2, 3, 4 및/또는 5에 의해 제시되는 바와 같은 유전자 구성물을 통해 검출되는 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 락토스 이송체는 락토스 투과효소인 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 효모 또는 진균 세포인 방법.
8. 프로모터 서열, 리보좀 결합 서열 또는 Kozak 서열을 함유하는, 암호화 서열 앞 비번역 영역, 및/또는 락토스 이송체 발현을 초래하고, 락토스 사멸 표현형을 발현하지 않으며, 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 의한 방법에 의해 제조될 수 있는 락토스 투과효소 서열.
9. 락토스가 (또)다른 탄소 원(들)과 함께 존재하는 환경에서 성장할 때 락토스 사멸 현상에 내성인, 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 의한 방법에 의해 제조될 수 있는 미생물.
10. 제9항에 있어서, 서열 번호 1, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 또는 57에 의해 제시된 바와 같이 락토스 이송체 유전자 앞에 이종 서열을 가지는 미생물.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 락토스 및/또는 갈락토스 분해 경로로부터 유래하는 효소들을 암호화하는 유전자가 저 기능성 또는 비 기능성이 되도록 만들어진 미생물.
12. 락토스- 및/또는 갈락토스-기반 특수 제품의 제조에 있어서 제9항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 의한 미생물 및/또는 제8항에 의한 서열 각각의 용도.
13. 제12항에 있어서, 상기 락토스-기반 특수제품은 특수 탄수화물, 당 지질 및 갈락토실화 화합물인 용도.
14. 제13항에 있어서, 상기 특수 탄수화물은 2-푸코실락토스 또는 2'-푸코실락토스 또는 3-푸코실락토스 또는 2',3-디푸코실락토스 또는 락토-N-삼당류 또는 락토-N-사당류 또는 락토-nN-사당류 또는 3'-시알릴락토스 또는 6'-시알릴락토스인 용도.

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