JP6047505B2 - 操作された細菌におけるヒト乳オリゴ糖の生合成 - Google Patents
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Description
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下で、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2011年2月16日に提出された米国特許仮出願第61/443,470号に対する優先権の恩典を主張する。
本発明は、精製オリゴ糖、特にヒト乳中に典型的に見いだされるある種のフコシル化および/またはシアリル化オリゴ糖を産生するための組成物および方法を提供する。
ヒト乳は、多様で豊富な一連の中性および酸性オリゴ糖(ヒト乳オリゴ糖、HMOS)を含む。これらの分子の多くは、乳児によって栄養として直接利用されないが、とはいえ健康な腸マイクロビオームの確立、疾患の予防、および免疫機能において重要な役割を果たす。本明細書において記述される本発明より前では、HMOSを大規模で安価に産生する能力には問題があった。たとえば、化学合成によるHMOS産生は、立体特異性の問題、前駆体の利用能、生成物の不純物、および総じて高い費用により制限された。そのため、多様な商業的応用のために大量のHMOSを安価に製造するための新規戦略が緊急に必要である。
機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子、外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子、GDP-フコース合成経路、機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子を含む細菌を提供する段階;
ラクトースの存在下で該細菌を培養する段階;および
該細菌からまたは該細菌の培養上清からフコシル化オリゴ糖を回収する段階、
を含む、細菌においてフコシル化オリゴ糖を産生する方法。
[本発明1002]
β-ガラクトシダーゼ遺伝子が大腸菌(E. coli)lacZ遺伝子を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
β-ガラクトシダーゼ遺伝子が内因性のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子または外因性のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記細菌が、増加した細胞内ラクトースプールを蓄積し、かつ低レベルβ-ガラクトシダーゼを産生する、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子がα(1,2)フコシルトランスフェラーゼまたはα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子がバクテロイデス・フラギリス(Bacteroides fragilis)wcfW遺伝子を含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)26695 futA遺伝子を含む、本発明1005の方法。
[本発明1008]
前記細菌が、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼをコードする外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子およびα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子の両方を含む、本発明1005の方法。
[本発明1009]
前記GDP-フコース合成経路が内因性の酵素または外因性の酵素を含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記ラクトースパーミアーゼ遺伝子が、内因性のラクトースパーミアーゼ遺伝子または外因性のラクトースパーミアーゼ遺伝子である、本発明1001の方法。
[本発明1011]
機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子、外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子、コラン酸合成遺伝子における変異、および機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子を含む腸内細菌を提供する段階;
ラクトースの存在下で該細菌を培養する段階;および
該細菌からまたは該細菌の培養上清からフコシル化オリゴ糖を回収する段階、
を含む、細菌においてフコシル化オリゴ糖を産生する方法。
[本発明1012]
前記β-ガラクトシダーゼ遺伝子が、大腸菌lacZ遺伝子を含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子がα(1,2)フコシルトランスフェラーゼまたはα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする、本発明1011の方法。
[本発明1014]
前記腸内細菌が大腸菌を含む、本発明1011の方法。
[本発明1015]
前記コラン酸合成遺伝子がwcaJ遺伝子を含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記細菌がlon遺伝子における変異をさらに含む、本発明1014の方法。
[本発明1017]
前記細菌が内因性のlon遺伝子に挿入された機能的な野生型大腸菌lacZ + 遺伝子を含む、本発明1014の方法。
[本発明1018]
前記大腸菌の内因性のlacZ遺伝子が欠失している、本発明1014の方法。
[本発明1019]
前記細菌が外因性のrcsAまたはrcsB遺伝子をさらに含む、本発明1014の方法。
[本発明1020]
前記細菌がlacA遺伝子における変異をさらに含む、本発明1014の方法。
[本発明1021]
機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子、外因性のシアリル-トランスフェラーゼ遺伝子、外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子、GDP-フコース合成経路、欠陥(deficient)シアル酸異化経路、シアル酸合成能、および機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子を含む細菌において、3'-シアリル-3-フコシルラクトース(3'-S3FL)を産生する方法:
ラクトースの存在下で該細菌を培養する段階;および
該細菌からまたは該細菌の培養上清から3'-S3FLを回収する段階。
[本発明1022]
前記外因性のシアリル-トランスフェラーゼ遺伝子がα(2,3)シアリル-トランスフェラーゼをコードする、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、α(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする、本発明1021の方法。
[本発明1024]
前記欠陥シアル酸異化経路が内因性のN-アセチルノイラミネートリアーゼまたはN-アセチルマンノサミンキナーゼ遺伝子においてヌル変異を含む、本発明1021の方法。
[本発明1025]
前記シアル酸合成能が、外因性のUDP-GlcNAc 2-エピメラーゼ遺伝子、外因性のNeu5Acシンターゼ遺伝子、または外因性のCMP-Neu5Acシンテターゼ遺伝子を含む、本発明1021の方法。
[本発明1026]
機能的lacZ遺伝子、外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子、外因性のシアリルトランスフェラーゼ遺伝子、内因性のコラン酸合成遺伝子における変異、機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子、欠陥シアル酸異化経路、およびシアル酸合成能を含む腸内細菌において、3'-シアリル-3-フコシルラクトース(3'-S3FL)を産生する方法:
ラクトースの存在下で該細菌を培養する段階;および
該細菌からまたは該細菌の培養上清から3'-S3FLを回収する段階。
[本発明1027]
前記外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子がα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記外因性のシアリルトランスフェラーゼ遺伝子がα(2,3)シアリルトランスフェラーゼをコードする、本発明1026の方法。
[本発明1029]
前記欠陥シアル酸異化経路が、内因性のN-アセチルノイラミネートリアーゼまたはN-アセチルマンノサミンキナーゼ遺伝子においてヌル変異を含む、本発明1026の方法。
[本発明1030]
前記シアル酸合成能が外因性のUDP-GlcNAc 2-エピメラーゼ遺伝子、外因性のNeu5Acシンターゼ遺伝子、または外因性のCMP-Neu5Acシンテターゼ遺伝子を含む、本発明1026の方法。
[本発明1031]
低いが検出可能なレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を生じるように操作されている挿入された組み換え型β-ガラクトシダーゼ遺伝子を利用することによる、その本来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子が欠失しているかまたは不活化されている宿主細胞における遺伝子座の表現型標識(phenotypic marking)法。
[本発明1032]
低いが検出可能なレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を生じるように操作されている挿入された組み換え型β-ガラクトシダーゼ遺伝子を利用することによって、その本来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子が欠失しているかまたは不活化されているβ-ガラクトシダーゼ陰性宿主細胞において残留ラクトースを細菌培養から枯渇させる方法。
[本発明1033]
低いが検出可能なレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を生じるように操作されている挿入された組み換え型β-ガラクトシダーゼ遺伝子を利用することによって、その本来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子が欠失しているかまたは不活化されているβ-ガラクトシダーゼ陰性宿主細胞の培養物において細菌細胞の溶解を検出する方法。
[本発明1034]
細菌細胞溶解物または細菌の細菌細胞培養上清からのフコシル化オリゴ糖をカーボンカラムに結合させる段階、および該カラムからフコシル化オリゴ糖を溶出させる段階を含む、本発明1001の方法によって産生されたフコシル化オリゴ糖を精製する方法。
[本発明1035]
欠陥コラン酸合成経路、低減されたレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性、および外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む、単離された大腸菌細菌。
[本発明1036]
本発明1001の方法によって産生された精製フコシル化オリゴ糖。
[本発明1037]
欠失した内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子、低活性の置換機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子、GDP-フコース合成経路、機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子、および欠失したラクトースアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む細菌宿主株に形質転換された外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む核酸構築物。
[本発明1038]
前記外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼまたはα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする、本発明1037の核酸構築物。
本発明の他の特色および利点は、好ましい態様に関する以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。それ以外であると明記している場合を除き、本明細書において用いられる全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において記述される方法および材料と類似または同等の方法および材料を、本発明の実践または試験において用いることができるが、適した方法および材料を以下に記述する。本明細書において引用された公開された外国の特許および特許出願は全て、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において引用されたアクセッション番号によって示されるGenbankおよびNCBI提出物は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において引用された他の全ての公開された参考文献、文書、原稿および科学論文は、参照により本明細書に組み入れられる。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先するであろう。さらに、材料、方法、および実施例は説明するために限られ、制限的であると意図されない。
オリゴ糖(HMOS)とその複合糖質の両方を含むヒト乳グリカンは、ヒト乳児の保護および発育、ならびに特に乳児の消化管(GI)において有意な役割を果たす。様々な哺乳動物において見いだされる乳オリゴ糖は大きく異なり、ヒトにおけるその組成は独自である(Hamosh M., 2001 Pediatr Clin North Am, 48:69-86; Newburg D.S., 2001 Adv Exp Med Biol, 501 :3-10)。その上、ヒト乳中のグリカンレベルは、授乳期間のあいだでも変化して、また個体間でも広く変化する(Morrow A.L. et al., 2004 J Pediatr, 145:297-303; Chaturvedi P et al., 2001 Glycobiology, 11 :365-372)。これまで、HMOSの役割を完全に調べることは、これらの化合物を適切に特徴付けして測定することができなかったために限られていた。近年、中性および酸性HMOSの両方を分析するための感度のよい再現性のよい定量的方法が開発されている(Erney, R., Hilty, M., Pickering, L., Ruiz-Palacios, G., and Prieto, P. (2001) Adv Exp Med Biol 501, 285-297. Bao, Y., and Newburg, D. S. (2008) Electrophoresis 29, 2508-2515)。およそ200個の別個のオリゴ糖がヒト乳中において同定されており、この多様性の原因となっているのは少数の単純なエピトープの組み合わせである(Newburg D.S., 1999 Curr Med Chem, 6:117-127; Ninonuevo M. et al, 2006 J Agric Food Chem, 54:7471-74801)。HMOSは、5種類の単糖類、すなわちD-グルコース(Glc)、D-ガラクトース(Gal)、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、L-フコース(Fuc)、およびシアル酸(N-アセチルノイラミン酸、Neu5Ac、NANA)で構成される。HMOSは、通常、その化学構造に従って2つの群、すなわちGlc、Gal、GlcNAcおよびFucを含み、ラクトース(Galβ1-4 Glc)コアに結合した中性化合物と、同じ糖を含み、しばしば同じコア構造に加えてNANAを含む酸性化合物とに分けられる(Charlwood J. et al, 1999 Anal Biochem, 273:261-277; Martin-Sosa et al, 2003 J Dairy Sci, 86:52-59; Parkkinen J. and Finne J., 1987 Methods Enzymol, 138:289-300; Shen Z. et al, 2001 J Chromatogr A, 921:315-321)。ヒト乳中のオリゴ糖のおよそ70〜80%がフコシル化され、その合成経路は、図1に示される経路と類似の様式で進行すると考えられる(タイプIおよびタイプII亜群は、異なる前駆体分子によって始まる)。ヒト乳中のオリゴ糖のより小さい割合がシアリル化されるか、またはフコシル化されてシアリル化される。図2は、シアリル化(酸性)HMOSに関して可能性がある生合成経路を概要するが、ヒトにおける実際の合成経路はまだ完全には定義されていない。
大腸菌K12原栄養体W3110を、フコシル化HMOS生合成のための親バックグラウンドとして選択した。この株は、トリプトファン誘導PtrpB-cI+リプレッサー構築物の導入によってampC座で既に改変されており(McCoy, J. & Lavallie, E. Current protocols in molecular biology/edited by Frederick M. Ausubel...[et al.] (2001))、ミリモル濃度のトリプトファンによる誘導(Mieschendahl, M., Petri, T. & Hanggi, U. Nature Biotechnology 4, 802-808 (1986))を通して、ファージλPLプロモーターからの組み換え型タンパク質の経済的産生を可能にする(Sanger, F., Coulson, A. R., Hong, G. F., Hill, D. F. & Petersen, G. B. J Mol Biol 162, 729-773 (1982))。ampCにおいてトリプトファン誘導PtrpB-cI+リプレッサー構築物を含む大腸菌W3110誘導体である株GI724を、さらなる大腸菌株操作の基礎として用いた(図14)。
ampC::(PtrpBλcI+), PlacI q(ΔlacI-lacZ)158lacY+, ΔwcaJ, thyA748::Tn10, Δlon::(kan, lacZ+)
ampC::(PtrpBλcl+), PlacI q(ΔlacI-lacZ)158lacY+, ΔwcaJ, thyA748::Tn10, Δlon::(kan, lacZ+)ΔlacA
様々な代替α(1,2)フコシルトランスフェラーゼが糖アクセプターとしてラクトースを利用することができ、大腸菌E214、E390、またはE403において適切な培養条件で発現させる場合、2'-FL合成の目的にとって利用可能である。たとえば、プラスミドpG175(ColE1, thyA+, bla+, PL2-wbsJ, rcsA+)(SEQ ID NO: 1、図7)は、大腸菌株O128:B12のwbsJα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を有し、大腸菌株E403において2'-FLの産生を指示することができる。もう1つの例において、プラスミドpG171(ColE1, thyA+, bla+, PL2-futC, rcsA+)(SEQ ID NO: 5)は、H.ピロリ26695. futCα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子(Wang, G., Rasko, D. A., Sherburne, R. & Taylor, D. E. Mol Microbiol 31, 1265-1274 (1999))を有し、同様に株E403において2'-FLの産生を指示するであろう。好ましい例において、プラスミドpG180(ColE1, thyA+, bla+, PL2-wcfW, rcsA+)(SEQ ID NO: 6)は、本発明のこれまで特徴付けされていないバクテロイデス・フラギリスNCTC 9343 wcfWα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を有し、大腸菌株E403において2'-FLの産生を指示する。
2'-FLは、プラスミドpG171、pG175、またはpG180のいずれか1つによって形質転換された、宿主大腸菌株E214、E390、またはE403のいずれか1つによってバイオリアクターにおいて産生することができる。形質転換株の生育は、10 L作業容量のバイオリアクターにおいて、溶存酸素、pH、ラクトース基質、消泡剤、および栄養レベルの制御下で最少の培地中で行われる。最少の「FERM」培地をバイオリアクターにおいて用い、これを以下に詳細に記述する。
Ferm(10リットル):以下を含む最少培地
40g (NH4)2HPO4
lOOg KH2PO4
lOg MgSO4.7H2O
40g NaOH
微量元素:
1.3g NTA
0.5g FeSO4.7H2O
0.09g MnCl2.4H2O
0.09g ZnSO4.7H2O
O.Olg CoCl2.6H2O
O.Olg CuCl2.2H2O
O.O2g H3BO3
O.Olg Na2MoO4.2H2O(pH 6.8)
水を加えて10リットルにする
DF204消泡剤(O.lml/L)
グリセロール150 g(初回バッチ生育)の後に流加培養モードで90%グリセロール-1%MgSO4-1×微量元素を、様々な速度で様々な時間に与える。
大腸菌発酵ブロスからの2'-FL精製は、5つの段階を通して行われる。
発酵ブロスを回収して、細胞を6000×gで30分の分取遠心分離機での沈降によって除去する。各バイオリアクター実行は、部分的清澄化上清約5〜7 Lを生じる。清澄化上清は、発酵の過程で生じたカラメル化糖の分画により、特に発酵培地に存在するアンモニウムイオンによって促進される副反応により、茶色/オレンジ色の着色を有する。
粗目カーボン(Calgon 12×40 TR)を充填した容積〜1000 mlのカラム(寸法は、直径5 cm×長さ60 cm)を1カラム容積(CV)の水によって平衡にして、清澄化培養上清を流速40 ml/分でロードする。このカラムは、糖(ラクトース)約120 gの全容量を有する。ローディングおよび糖の捕捉後、カラムを1.5 CVの水によって洗浄した後、50%エタノールまたは25%イソプロパノール(この段階では、生成物を溶出するためにはエタノールの低濃度(25〜30%)で十分でありうる)の2.5 CVによって溶出する。この溶媒溶出段階は、カラム上の総結合糖の約95%および少量の着色体(カラメル)を放出する。この最初の段階では、糖の最大量を捕捉することが主目的である。混入物の分離は目的ではない。カラムは、5 CVの水による洗浄によって再生することができる。
捕捉カラムからのエタノールまたはイソプロパノール溶出物の2.5 L量を56℃でロータリーエバポレートして、糖シロップ水を作製する(これは典型的に黄色-茶色である)。この段階のために用いられうる代替法には、凍結乾燥または噴霧乾燥が挙げられる。
Biotage Isolera One FLASH Chromatography Systemに接続したカラム(GE Healthcare HiScale50/40、5×40 cm、最大圧20 bar)にDarco活性炭G60(100メッシュ):celite 535(粗目)の1:1混合物750 mlを充填する(いずれのカラム充填剤もSigmaから得た)。カラムを5 CVの水によって平衡にして、Celiteローディングカートリッジまたは直接注射のいずれかを用いて、段階3からの糖(混入ラクトースに対する2'-FLの比率に応じて10〜50 g)をロードする。クロマトグラフィーの際に溶出する糖のピークを検出するために、カラムを蒸発光散乱(ELSD)検出器に接続する。2'-FLを単糖(存在すれば)、ラクトース、および着色体から分離するために、イソプロパノール、エタノール、またはメタノールの4段階勾配を行い、たとえばB=エタノールに関して:段階1、2.5 CV 0%B;段階2、4 CV 10%B(単糖類およびラクトース混入物を溶出);段階3、4 CV 25%B(2'-FLを溶出);段階4、5 CV 50%B(いくつかの着色体を溶出および部分的にカラムを再生する)である。さらなるカラム再生は、50%メタノールおよび50%イソプロパノールを用いて行われる。糖のピークに対応する分画を、120 mLボトルに自動的に採取して、プールし、段階5に向ける。通常より長い発酵からのある精製実行において、2'-FL含有分画を陰イオン交換および陽イオン交換カラムに通過させると、過剰なタンパク質/DNA/カラメル体混入物を除去することができる。この目的のために試験して成功した樹脂は、陰イオン交換樹脂に関してDowex 22およびToyopearl Mono-Qであり、陽イオン交換樹脂に関してDowex 88である。Mixed bed Dowex樹脂は、それらが疎水性相互作用を介して高い親和性で糖を吸着する傾向があることから不適であることが証明された。図19は、フラッシュクロマトグラフィーモードで用いた場合に2'-フコシルラクトースからのラクトースの分離におけるDarco G60:celiteの1:1混合物の性能を図示する。
25%B溶媒分画3.0 Lを、乾燥するまで56℃でロータリーエバポレートする。固形糖の塊を最少量の水に溶解して、溶液を凍結した後、凍結乾燥する。プロセス終了時に、白色、結晶の甘い粉末(2'-FL)が得られる。得られた2'-FLの純度は、95から99%のあいだである。
大腸菌宿主株E214、E390、またはE403の任意の1つを、糖アクセプター基質としてラクトースを用いることができるα(1,3)フコシルトランスフェラーゼを発現するプラスミドによって形質転換すると、ヒト乳オリゴ糖生成物、3-フコシルラクトース(3FL)を産生するであろう。図9は、3FLの産生を得るために本発明の操作された大腸菌株において利用される経路を図解する。たとえば、プラスミドpG176(ColE1, thyA+, bla+, PL2-futA, rcsA+)(SEQ ID NO: 2)は、α(1,2)FT(wbsJ)配列がヘリコバクター・ピロリfutA遺伝子に置換されているpG175の誘導体である(Dumon, C, Bosso, C, Utille, J. P., Heyraud, A. & Samain, E. Chembiochem 7, 359-365 (2006))。pG176を、宿主大腸菌株E214、E390、またはE403の任意の1つにおいて形質転換すると、3FLの産生を指示するであろう。図11は、pG176によって形質転換したE403の3FL産生のTLC分析を示す。さらに、3FLの合成を指示するために用いることができるヘリコバクター・ピロリにおいて同定されたいくつかの他の関連する細菌型α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ、たとえば「11639 FucTa」(Ge, Z., Chan, N. W., Palcic, M. M. & Taylor, D. E. J Biol Chem 272, 21357-21363 (1997); Martin, S. L., Edbrooke, M. R., Hodgman, T. C, van den Eijnden, D. H. & Bird, M. I. J Biol Chem 272, 21349-21356 (1997))および「UA948 FucTa」(Rasko, D. A., Wang, G., Palcic, M. M. & Taylor, D. E. J Biol Chem 275, 4988-4994 (2000))が存在する。H.ピロリのα(1,3)フコシルトランスフェラーゼのほかに、ヘリコバクター・へパティクスから単離されたα(1,3)フコシルトランスフェラーゼ(Hh0072、配列アクセッションAAP76669)は、非シアリル化およびシアリル化タイプ2オリゴ糖アクセプター基質の両方に対して活性を示す(Zhang, L., Lau, K., Cheng, J., Yu, H., et al. Glycobiology (2010))。さらに、本発明の方法に従って3FLを作製するために用いられうるいくつかのさらなる細菌α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼが存在する。たとえば、 Hh0072の近縁の相同体は、H. H. ビリス(HRAG_01092遺伝子、配列アクセッション番号EEO24035)、およびC. ジェジュニ(C1336_000250319遺伝子、配列アクセッション番号EFC31050)において見いだされる。
大腸菌株E214、E390、およびE403は、先に考察したように、ラクトースおよびGDP-フコースの両方の細胞質プールを蓄積し、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼまたはα(1,3)フコシルトランスフェラーゼのいずれかを発現するプラスミドによって形質転換すると、それぞれ、ヒト乳オリゴ糖2'-FLまたは3FLを合成することができる。四糖類であるラクトジフコテトロース(LDFT)は、ヒト乳中に見いだされるもう1つの主要なフコシル化オリゴ糖であり、α(1,2)-およびα(1,3)-結合フコース残基の両方を含む。pG177(図10、SEQ ID NO:3)は、wbsJ遺伝子がヘリコバクター・ピロリfutA遺伝子およびヘリコバクター・ピロリfutC遺伝子を含む2つの遺伝子オペロン(すなわち、α(1,3)-およびα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼの両方を含むオペロン)に置換されているpG175の誘導体である。大腸菌株E214、E390、およびE403は、プラスミドpG177によって形質転換され、上記のように小規模でまたはバイオリアクターにおいて生育させると、LDFTを産生する。図11において(レーンpG177)、pG177によって指示され、大腸菌において作製されるLDFTは、薄層クロマトグラフィーによる細胞抽出物の分析において観察された。
大腸菌における3'-シアリルラクトース(3'-SL)産生の第一段階は、ラクトースおよびCMP-Neu5Ac(CMP-シアル酸)の両方の細胞質プールを蓄積する宿主バックグラウンド株の生成である。細胞質ラクトースの蓄積は、lacパーミアーゼであるlacYに対する極性効果を最小限にするように注意しながら、ラクトースの存在下での生育および内因性の大腸菌β-ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)の不活化によって得られる。ラクトースプールのこの蓄積は、2'-FL、3FL、およびLDFTを産生するよう操作されている大腸菌宿主において既に得られており、上記で記述されている。
本明細書において記述される本発明より前では、同じ細菌株において任意の特定のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子と任意の特定のシアリルトランスフェラーゼ遺伝子を組み合わせることによって、3'-S3FLを生じることができるとは予想できなかった。以下に、同じLacZ+大腸菌株におけるフコシルトランスフェラーゼ遺伝子とシアリルトランスフェラーゼ遺伝子の組み合わせによって、3'-S3FLの産生が起こったことを証明する結果を記述する。これらの予想外の結果は、おそらく利用される特定のフコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ酵素の驚くほど緩い基質特異性による可能性がある。
本発明は、その詳細な説明と共に記述してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される、本発明の範囲を例証するのであって、制限すると意図されない。他の局面、長所、および変更は以下の特許請求の範囲の範囲内である。
Claims (41)
- (i)内因性のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の欠損または機能的不活性化、
(ii)野生型細菌のそれと比較して検出可能な低減されたレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を含む外因性の機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子、
(iii)外因性のラクトース-アクセプティング(lactose-accepting)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、および
(iv)GDP-フコース合成経路
を含む細菌を提供する段階;
ラクトースの存在下で該細菌を培養する段階;および
該細菌からまたは該細菌の培養上清からフコシル化オリゴ糖を回収する段階、
を含む、細菌においてフコシル化オリゴ糖を産生する方法。 - 外因性の機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子が大腸菌(E. coli)lacZ遺伝子を含む、請求項1記載の方法。
- 前記細菌が腸内細菌を含む、請求項1記載の方法。
- 前記細菌が、増加した細胞内ラクトースプールを蓄積し、該増加した細胞内ラクトースプールが少なくとも野生型細菌におけるラクトースレベルの10%よりも多い、請求項1記載の方法。
- 前記外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子がα(1,2)フコシルトランスフェラーゼまたはα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする、請求項1記載の方法。
- 前記α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子がバクテロイデス・フラギリス(Bacteroides fragilis)wcfW遺伝子を含む、請求項5記載の方法。
- 前記α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)26695 futA遺伝子を含む、請求項5記載の方法。
- 前記細菌が、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼをコードする外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子およびα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子の両方を含む、請求項5記載の方法。
- 前記GDP-フコース合成経路が内因性の酵素または外因性の酵素を含む、請求項1記載の方法。
- 前記細菌が機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子を含む、請求項1記載の方法であって、該機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子が、内因性のラクトースパーミアーゼ遺伝子または外因性のラクトースパーミアーゼ遺伝子である、請求項1記載の方法。
- (i)内因性のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の欠損または機能的不活性化、
(ii)野生型細菌のそれと比較して検出可能な低減されたレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を含む外因性の機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子、
(iii)外因性のラクトース-アクセプティング(lactose-accepting)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、および
(iv)コラン酸合成遺伝子における変異
を含む腸内細菌を提供する段階;
ラクトースの存在下で該細菌を培養する段階;および
該細菌からまたは該細菌の培養上清からフコシル化オリゴ糖を回収する段階、
を含む、細菌においてフコシル化オリゴ糖を産生する方法。 - 前記外因性の機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子が、大腸菌lacZ遺伝子を含む、請求項11記載の方法。
- 前記外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子がα(1,2)フコシルトランスフェラーゼまたはα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする、請求項11記載の方法。
- 前記腸内細菌が大腸菌細菌を含む、請求項11記載の方法。
- 前記コラン酸合成遺伝子がwcaJ、wzxC、wcaD、wza、wzbまたはwzc遺伝子を含む、請求項14記載の方法。
- 前記細菌がlon遺伝子における変異をさらに含む、請求項14記載の方法。
- 前記細菌が内因性のlon遺伝子に挿入された機能的な野生型大腸菌lacZ+遺伝子を含む、請求項14記載の方法。
- 前記内因性のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子が大腸菌の内因性のlacZ遺伝子である、請求項14記載の方法。
- 前記細菌が外因性のrcsAまたはrcsB遺伝子をさらに含む、請求項14記載の方法。
- 前記細菌がlacA遺伝子における変異をさらに含む、請求項14記載の方法。
- (i) 内因性のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の欠損または機能的不活性化、
(ii) 野生型細菌のそれと比較して検出可能な低減されたレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を含む外因性の機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子、
(iii)外因性のシアリル-トランスフェラーゼ遺伝子、外因性のラクトース-アクセプティング(lactose-accepting)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、
(iv)GDP-フコース合成経路、
(v) 欠陥(deficient)シアル酸異化経路、および
(vi) シアル酸合成能
を含む細菌を提供する段階;
ラクトースの存在下で該細菌を培養する段階;および
該細菌からまたは該細菌の培養上清から3'-S3FLを回収する段階、
を含む、細菌において3'-シアリル-3-フコシルラクトース(3'-S3FL)を産生する方法。 - 前記外因性のシアリル-トランスフェラーゼ遺伝子がα(2,3)シアリル-トランスフェラーゼをコードする、請求項21記載の方法。
- 前記外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、α(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする、請求項21記載の方法。
- 前記欠陥シアル酸異化経路が内因性のN-アセチルノイラミネートリアーゼまたはN-アセチルマンノサミンキナーゼ遺伝子においてヌル変異を含む、請求項21記載の方法。
- 前記シアル酸合成能が、外因性のUDP-GlcNAc 2-エピメラーゼ遺伝子、外因性のNeu5Acシンターゼ遺伝子、または外因性のCMP-Neu5Acシンテターゼ遺伝子を含む、請求項21記載の方法。
- 前記外因性の機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子が大腸菌lacZ遺伝子を含む、請求項21記載の方法。
- 前記細菌が内因性のコラン酸合成遺伝子における変異をさらに含む、請求項21記載の方法。
- 前記細菌が、機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子をさらに含む、請求項21記載の方法。
- 細菌細胞溶解物または細菌の細菌細胞培養上清からのフコシル化オリゴ糖をカーボンカラムに結合させる段階、および該カラムからフコシル化オリゴ糖を溶出させる段階を含む、請求項1記載の方法によって産生されたフコシル化オリゴ糖を精製する方法。
- (i)内因性のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の欠損または機能的不活性化、
(ii)野生型細菌のそれと比較して検出可能な低減されたレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を含む外因性の機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子、
(iii)欠陥コラン酸合成経路、および
(iv)外因性のラクトースアクセプティング(lactose-accepting)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子
を含む、単離された大腸菌細菌。 - 機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子をさらに含む、請求項30記載の単離された大腸菌細菌。
- 前記β-ガラクトシダーゼ活性のレベルが低レベルβ-ガラクトシダーゼ活性であって、該低レベルβ-ガラクトシダーゼが0.05から200単位、0.05から5単位、0.05から4単位、0.05から3単位、または0.05から2単位を含む、請求項30記載の単離された大腸菌細菌。
- プラスミド発現ベクターを含む、請求項30記載の単離された大腸菌細菌。
- 外因性のシアリル-トランスフェラーゼ遺伝子をさらに含む、請求項30記載の単離された大腸菌細菌。
- 前記外因性のシアリル-トランスフェラーゼ遺伝子がα(2,3)シアリル-トランスフェラーゼをコードする、請求項30記載の単離された大腸菌細菌。
- 内因性のN-アセチルノイラミネートリアーゼまたはN-アセチルマンノサミンキナーゼ遺伝子においてヌル変異を含む欠陥シアル酸異化経路をさらに含む、請求項30記載の単離された大腸菌細菌。
- 前記細菌を培養する段階が抗生物質を含まない、請求項1記載の方法。
- 前記腸内細菌が大腸菌細菌を含む、請求項3記載の方法。
- 前記細菌を培養する段階および/または前記フコシル化オリゴ糖を回収する段階がβ-ガラクトシダーゼ活性を有する細菌において残留ラクトースを細菌培養から枯渇させる工程を含む、請求項1記載の方法。
- 前記フコシル化オリゴ糖がヒト乳において見出される、請求項1記載の方法。
- 前記細菌がlacA遺伝子において変異をさらに含む、請求項1記載の方法。
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