JP6944886B2

JP6944886B2 - フコシル化オリゴ糖の生産における使用に適したアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ

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Publication number: JP6944886B2
Application number: JP2018018760A
Authority: JP
Inventors: マシューイアンハイトマン; マッシモメリーギ; ジョンエム．マッコイ
Original assignee: グリコシンリミテッドライアビリティーカンパニー
Priority date: 2012-07-25
Filing date: 2018-02-06
Publication date: 2021-10-06
Anticipated expiration: 2033-07-24
Also published as: AU2019203433B2; AU2019226246A1; AU2019203433C1; JP2018093883A; AU2013293116A8; US11236376B2; WO2014018596A3; CA2879677C; JP2020127403A; US20200087691A1; ES2738589T3; US20140031541A1; AU2013293116A1; AU2019203433A1; US20170081689A1; EP2877574A4; EP3587567A1; JP6355632B2; JP2015529453A; DK2877574T3

Description

関連出願
本願は、2012年7月25日出願の米国特許出願第13/557,655号からの優先権および恩典を主張し、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる。

発明の分野
本発明は、精製されたオリゴ糖、特に、典型的にはヒト乳中で見出される特定のフコシル化オリゴ糖を生産するための組成物および方法を提供する。

発明の背景
ヒト乳は、多種で豊富な中性および酸性オリゴ糖群を含んでいる。130を超える異なる複合オリゴ糖がヒト乳において同定されており、それらの構造の多様さおよび豊富さは、ヒトに特有である。これらの分子は、栄養分としては乳児によって直接利用されないかもしれないが、そうであったとしてもそれらは健康な腸内微生物環境の確立、疾患の予防および免疫機能において重要な役割を果たしている。本明細書に記載される本発明より以前は、ヒト乳オリゴ糖（HMOS）を安価で生産する能力に問題があった。例えば、化学合成を通じたそれらの生産は立体特異性の問題、前駆体の入手性、生産物の不純度およびかさむ総費用によって制限されていた。そのため、多量のHMOSを安価で生産する新しい戦略が切に求められている。

本発明は、効率的かつ経済的なフコシル化オリゴ糖生産方法を特徴とする。そのようなフコシル化オリゴ糖生産は、細菌、例えば大腸菌（Escherichia coli (E.coli)）において組み換えフコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物の生産を誘導する1つまたは複数の異種制御配列に機能的に連結された、ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）をコードする配列を含む単離された核酸を用いて達成される。1つの例において、細菌は腸内細菌である。ラクトース受容性（lactose-accepting）α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物のアミノ酸配列は、好ましくはFutC（SEQ ID NO:2）に対して少なくとも10％かつ40％未満同一である。

ラクトース受容性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする、宿主細菌生産株において該酵素の生産を誘導する1つまたは複数の異種制御配列に機能的に連結された単離された核酸を含む核酸コンストラクトであって、該核酸によってコードされる遺伝子産物（酵素）のアミノ酸配列がSEQ ID NO:2に対して約70％の同一性を有するコンストラクト、も本発明の範囲内である。例えば、このコンストラクトは、FutLタンパク質をコードするSEQ ID NO:7を含む。「異種」は、制御配列とタンパク質コード配列が異なる細菌株由来であることを意味する。適当な生産宿主細菌株は、そのフコシルトランスフェラーゼコード核酸配列が同定された元の細菌株と同一細菌株ではないものである。

細菌においてフコシル化オリゴ糖、例えばHMOSを生産する方法は、低減されたレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性、不完全なコラン酸（colonic acid）合成経路、ATP依存性細胞内プロテアーゼの変異、lacA遺伝子の変異および外因性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子によって特徴づけられる細菌、例えば生産宿主株、大腸菌を提供することによって実施される。好ましくは、宿主細菌のthyA遺伝子の変異が、選択マーカー遺伝子としてthyAを保有するプラスミドの維持を可能にする。例示的な代替選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子、例えばBLA（ベータ-ラクタマーゼ）またはproBA遺伝子（proAB宿主株のプロリン要求性を補完するため）もしくはpurC（purC宿主株のアデニン要求性を補完するため）を含む。これらの特徴を含む細菌がラクトースの存在下で培養され、そしてフコシル化オリゴ糖が細菌からまたは細菌の培養上清から回収される。いくつかの例において、この方法はさらに、トリプトファンの存在下およびチミジンの非存在下での細菌の培養を含む。好ましい態様において、生産宿主株は、大腸菌K12を含む。他の生産宿主生物は、以下に列挙されている。

本発明は、本明細書に記載される方法によって生産された、精製されたフコシル化オリゴ糖を提供する。治療用もしくは栄養補給用製品において使用するためにフコシル化オリゴ糖を精製するか、またはそのような製品において細菌を直接使用する。改変された細菌によって生産されるフコシル化オリゴ糖は、2'-フコシルラクトース（2'-FL）またはラクトジフコテトラオース（LDFT）である。新規のアルファ1,2-フコシルトランスフェラーゼはまた、アルファ1,2フコース部分を保有するより高分子量のHMOS、例えばラクト-N-フコペンタオース（LNFI）およびラクト-N-ジフコヘキサオース（LDFH I）を合成するのにも有用である。

オリゴ糖の生産に使用される細菌は、（野生型と比較して）増大した細胞内グアノシン二リン酸（GDP）-フコースプール、（野生型と比較して）増大した細胞内ラクトースプールを含むよう、およびフコシルトランスフェラーゼ活性を含むよう遺伝子改変される。したがって、大腸菌の内因性lacZ遺伝子および内因性lacI遺伝子は、β-ガラクトシダーゼ活性のレベルを低下させるよう欠失または機能的に不活性化される。細菌はまた、lacA遺伝子に変異を含み得る。単離された大腸菌はまた、lacY遺伝子のすぐ上流にlacIq遺伝子プロモーターを含む。いくつかの例において、単離された大腸菌は、大腸菌の内因性wcaJ遺伝子の欠失または機能的不活性化に起因する不完全なコラン酸合成経路を含む。細菌はまた、アデノシン-5'-三リン酸（ATP）依存性細胞内プロテアーゼに変異を含む。例えば、細菌は、lon遺伝子にヌル（null）変異を含む。細菌はまた、thyA遺伝子に変異を含む。好ましくは、細菌は、増大した細胞内ラクトースプールおよび増大した細胞内GDP-フコースプールを蓄積する。1つの局面において、大腸菌は、遺伝子型ΔampC::P_trp ^BcI, Δ(lacI-lacZ)::FRT, P_lacIqlacY⁺, ΔwcaJ::FRT, thyA::Tn10, Δlon:(npt3, lacZ⁺), ΔlacAを含む。

細菌は、フコシルトランスフェラーゼ活性を有する。例えば、細菌は、外因性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。好ましくは、外因性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）26695アルファ-(1,2)フコシルトランスフェラーゼ（futC）に対してアミノ酸レベルで少なくとも10％かつ40％未満の相同性／同一性、例えば少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％の同一性を有する。他の例において、配列は、ヘリコバクター・ピロリ26695アルファ-(1,2)フコシルトランスフェラーゼ（futC）に対して少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％相同／同一である。1つの例において、FutLは、アミノ酸レベルでFutCに対して70％同一である。

2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列との関係で言う「％同一性」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いてまたは目視検査によって測定した場合に、最大一致条件で比較および整列させたときに2つまたはそれ以上の配列または部分配列が同一であることまたは同一である特定比率のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有することを表す。例えば、％同一性は、比較される配列のコード領域の全長に基づくものである。

配列比較を行う場合、典型的には1つの配列が、試験配列と比較する参照配列として使用される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピュータに入力され、必要な場合、部分配列の座標が指定され、そして配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。配列比較アルゴリズムは、その後、指定されたプログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。

パーセント同一性は、検索アルゴリズム、例えばBLASTおよびPSI-BLAST（Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215:3, 403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res 25:17, 3389-402）を用いて決定される。PSI-BLAST検索の場合、以下の例示的なパラメータが用いられる：（1）期待値（Expect threshold）は10とした：（2）ギャップコスト（Gap cost）は、存在（Existence）：11および拡張（Extension）：1とした；（3）用いる行列はBLOSUM62とした；（4）低複雑度領域のフィルターを「オン」にした。細菌は、futCと同一でない配列によってコードされるフコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物を発現する。

例示的なα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、大腸菌O126 wbgL、ヘリコバクター・ムステラエ（Helicobacter mustelae）12198（ATCC 43772）アルファ-1,2-フコシルトランスフェラーゼ（futL）およびバクテロイデス・ブルガタス（Bacteroides vulgatus）ATCC 8482グリコシルトランスフェラーゼファミリータンパク質（futN）を含む。外因性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、大腸菌O126 wbgL、ヘリコバクター・ムステラエ12198（ATCC 43772）アルファ-1,2-フコシルトランスフェラーゼ（futL）、バクテロイデス・ブルガタスATCC 8482グリコシルトランスフェラーゼファミリータンパク質（futN）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）（NCTC）9343フコシルトランスフェラーゼ（bft3/wcfB）、大腸菌O55:H7（CB9615株）フコシルトランスフェラーゼ（wbgN）、ヘリコバクター・ビリス（Helicobacter bilis）ATCC 437879 futD、コレラ菌（Vibrio cholera）O22 wblA、バクテロイデス・フラジリス（NCTC）9343アルファ-1,2-フコシルトランスフェラーゼ（bft1）、バクテロイデス・オバタス（Bacteroides ovatus）ATCC 8483 futOおよびヘリコバクター・シネディ（Helicobacter cinaedi）CCUG 18818アルファ-1,2-フコシルトランスフェラーゼ（futE）からなる群より選択される。

本発明はまた、ベクター、例えば核酸を含むベクターを特徴とする。ベクターはさらに、1つまたは複数の調節エレメント、例えば異種プロモーターを含み得る。調節エレメントは、融合タンパク質を発現するよう、タンパク質をコードする遺伝子、融合タンパク質遺伝子をコードする遺伝子コンストラクトまたはオペロン内で連結された遺伝子群に機能的に連結され得る。さらに別の局面において、本発明は、単離された組み換え細胞、例えば上記の核酸分子またはベクターを含む細菌細胞を含む。核酸は、任意で、ゲノムに組み込まれる。

バクテリオファージλ、大腸菌rcsA遺伝子、bla遺伝子およびネイティブthyA遺伝子のプロモーターの少なくとも1つを含む核酸コンストラクトもまた提供される。そのようなコンストラクトの例として、pG171のプラスミドマップが図5に示されている。

pG171の配列を、個々の特徴に関するGenBankの注釈と共に、以下に示す（SEQ ID NO:1）。

核酸コンストラクトはさらに、例えばヘリコバクター・ピロリ26695アルファ-(1,2)フコシルトランスフェラーゼ（futC）に対してアミノ酸レベルで少なくとも10％かつ40％未満の同一性を有する、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。例えば、外因性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、ヘリコバクター・ピロリ26695アルファ-(1,2)フコシルトランスフェラーゼ（futC）、コレラ菌O22 wblA、大腸菌O126 wbgL、ヘリコバクター・ビリスATCC 437879 futD、ヘリコバクター・シネディCCUG 18818アルファ-1,2-フコシルトランスフェラーゼ（futE）、ヘリコバクター・ムステラエ12198（ATCC 43772）アルファ-1,2-フコシルトランスフェラーゼ（futL）、バクテロイデス・ブルガタスATCC 8482グリコシルトランスフェラーゼファミリータンパク質（futN）、バクテロイデス・オバタスATCC 8483 futO、大腸菌O55:H7（CB9615株）フコシルトランスフェラーゼ（wbgN）、バクテロイデス・フラジリス（NCTC）9343アルファ-(1,2)フコシルトランスフェラーゼ（bft1）およびバクテロイデス・フラジリス（NCTC）9343フコシルトランスフェラーゼ（bft3/wcfB）からなる群より選択される。pG171の図には、一例であるアルファ1,2FT遺伝子futCが示されている。

上記の、かつ低減されたレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性、不完全なコラン酸合成経路、lacA遺伝子の変異、ATP依存性細胞内プロテアーゼの変異、およびthyA遺伝子の変異を含むことで特徴づけられる単離された大腸菌もまた、本発明の範囲内である。本発明はまた、大腸菌において2'-フコシルラクトース（2'-FL）を合成することができるα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を同定する方法も提供する。非FutCラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素を同定する方法は、以下の工程を含む：
1）配列データベースのコンピュータ検索を行い、任意の公知のラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼの単純配列ホモログ（simple sequence homolog）の大グループを定義する工程；
2）工程（1）からのリストを使用して、リストのメンバーによって共有されている共通配列および／または構造モチーフを含む検索プロフィールを導出する工程；
3）工程（2）で導出された共通配列または構造モチーフに基づく検索プロフィールをクエリーとして使用して配列データベースを検索し、参照ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼに対する配列相同性が40％またはそれ未満である候補配列を同定する工程；
4）自然状態でα(1,2)フコシル-グリカンを発現することで特徴づけられる候補生物のリストをコンパイルする工程；
5）候補生物由来である候補配列を選択し、候補ラクトース利用性酵素のリストを生成する工程；
6）宿主生物において候補ラクトース利用性酵素を発現させる工程；ならびに
7）ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ活性について試験する工程であって、生物における2'-FLの検出が、候補配列が非FutCラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼを含むことを示す、工程。例えば、参照ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼに対する配列相同性は、40％またはそれ未満である。

上記の方法によって生産された精製されたフコシル化オリゴ糖もまた、本発明の範囲内である。このプロセスの最後に得られる精製されたオリゴ糖（2'-FL）は、白色／ややオフホワイト色で結晶性の甘い粉末である。FutCを用いるオリゴ糖生産方法と異なり、この特定の非FutC酵素（例えば、FutL）を用いる方法は、副反応を引き起こすα(1,3)フコシルトランスフェラーゼ活性を有さない。FutLにおけるα(1,3)フコシルトランスフェラーゼ活性の欠如は、2'FL生産の効率に寄与し、そしてこれはFutCと比較して有利な点である。FutLは、アルファ1,3フコシルトランスフェラーゼ活性を有さない。例えば、本発明にしたがう改変された大腸菌細胞、大腸菌培養上清または大腸菌細胞溶解産物は、組み換え2'-FLを含み、かつ細胞、培養上清または溶解産物からの2'-FLの精製の前に1,3フコシル化ラクトースを実質的に含まない。FutNおよびWbgLは両方とも、（FutCと同様）アルファ1,3フコシルトランスフェラーゼ活性を有するようである。しかし、一般的な事項として、この方法によって生産されるフコシル化オリゴ糖は、2'-FLを含む細胞、細胞溶解産物もしくは培養物または上清中に、無視できる量、例えば、2'-FLのレベルの１％未満または2'-FLのレベルの0.5%未満の3-FLを含む。

精製されたオリゴ糖、例えば2'-FLまたはLDFTは、重量で少なくとも90％、95％、98％、99％または100％（w/w）が所望のオリゴ糖であるものである。純度は、任意の公知の方法、例えば薄層クロマトグラフィーまたは当技術分野で公知のその他のクロマトグラフィー技術によって評価される。本発明は、上記の遺伝子改変された細菌により生産されたフコシル化オリゴ糖を精製する方法であって、所望のフコシル化オリゴ糖（例えば、2'-FL）を、細菌の細菌細胞溶解産物または細菌細胞培養上清中の混在物質から分離する工程を含む方法、を含む。

オリゴ糖は、精製され、そしてヒトおよび動物、例えばコンパニオンアニマル（イヌ、ネコ）ならびに家畜（ウシ類、ウマ類、ヒツジ類、ヤギ類またはブタ類動物および家禽）によって消費される多くの製品において使用される。例えば、薬学的組成物は、精製された2'-FLおよび経口投与に適した薬学的に許容される賦形剤を含む。多量の2'-FLが細菌宿主、例えば外因性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む大腸菌において生産される。

ラクトースおよびGDP-フコースの細胞質プールが増強された大腸菌は、そのような生産システムにおいて有用である。内因性大腸菌代謝経路および遺伝子は、野生型大腸菌において見出されるレベルと比較して高い細胞質濃度のラクトースおよび／またはGDP-フコースを生成するよう操作される。例えば、細菌は、上記の遺伝子修飾を欠く対応する野生型細菌と比較して少なくとも10％、20％、50％もしくは2倍、5倍、10倍またはそれ以上のレベルを含む。

精製されたヒト乳オリゴ糖（HMOS）を含む薬学的組成物を生産する方法は、上記の細菌を培養し、細菌によって生産されるHMOSを精製し、そしてHMOSを賦形剤または担体と組み合わせて経口投与用栄養補助製品を生成することによって実施される。これらの組成物は、乳児および成人における腸および／または呼吸器疾患を予防または処置する方法において有用である。したがって、組成物は、そのような疾患を患っているまたはそのような疾患を発症する危険がある対象に投与される。

本発明はまた、ラクトース取り込み、排出および異化に関与する内因性大腸菌遺伝子の操作を用いることによって、ラクトースの存在下での細胞成長のために、大腸菌においてラクトースの細胞内濃度を増大させる方法を提供する。特に、内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）およびラクトースオペロンリプレッサー遺伝子（lacI）の同時欠失によってヒト乳オリゴ糖を生産するよう遺伝子改変された大腸菌において細胞内ラクトースレベルを増大させる方法が本明細書に記載されている。この欠失を構築する際に、lacIqプロモーターはラクトースパーミアーゼ遺伝子lacYのすぐ上流に（と連続するよう）配置される、すなわち、lacY遺伝子がlacIqプロモーターによる転写調節下に置かれるように、lacIqプロモーターの配列はlacY遺伝子をコードする配列の開始点のすぐ上流にありかつそれと隣接する。この修飾株は、培養培地から（LacYを介して）ラクトースを輸送する能力を維持しているが、ラクトース異化を担う（β-ガラクトシダーゼをコードする）lacZ遺伝子の野生型染色体コピーが欠失されている。したがって、この修飾株が外因性ラクトースの存在下で培養される場合、細胞内ラクトースプールが形成される。大腸菌においてラクトースの細胞内濃度を増大させる別の方法は、lacA遺伝子の欠失を利用する。lacA変異は、細胞内アセチル-ラクトースの形成を妨げ、この分子を混在物質としてその後の精製物から除去するだけでなく、過剰なラクトースを細胞質から排出する大腸菌の能力も消滅させ（Danchin A. Cells need safety valves. Bioessays 2009, Jul;31(7):769-73.）、それによって大腸菌の細胞内ラクトースプールの意図的な操作を大いに推進する。

本発明はまた、その生物の内因性コラン酸生合成経路を操作することによって大腸菌におけるGDP-フコースの細胞内レベルを増大させる方法を提供する。この増大は、コラン酸前駆体の生合成またはコラン酸合成のレギュロンの全体的制御のいずれかに直接的に関与する多くの内因性大腸菌遺伝子の遺伝子修飾を通じて達成される。特に、UDP-グルコース脂質担体トランスフェラーゼをコードするwcaJ遺伝子の欠失によってヒト乳オリゴ糖を生産するよう遺伝子改変された大腸菌において細胞内GDP-フコースレベルを増大させる方法が、本明細書に記載されている。wcaJヌルの背景で、GDP-フコースは大腸菌の細胞質に蓄積する。

1つの局面において、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼをコードする外因性核酸分子を含む改変された細菌によって生産されるヒト乳オリゴ糖は、2'-FL（2'-フコシルラクトース）である。好ましくは、使用されるα(1,2)フコシルトランスフェラーゼは、2'-FL合成の糖アクセプター基質としてラクトースを使用することができる任意のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼである。好ましくは、外因性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、ヘリコバクター・ピロリ26695アルファ-(1,2)フコシルトランスフェラーゼ（FutC）に対してアミノ酸レベルで少なくとも10％かつ約40％未満の同一性を有する。

本発明はまた、ヒト乳四糖ラクトジフコテトラオース（LDFT）を生産するよう遺伝子改変された大腸菌を含む組成物を提供する。この例において、大腸菌は、α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ活性も有するα(1,2)フコシルトランスフェラーゼをコードする外因性核酸分子を含む。

本発明は、対象において感染を処置する、予防するまたはその危険を低下させる方法であって、精製された組み換えヒト乳オリゴ糖を含む組成物を対象に投与する工程を含み、ここでHMOSは病原体に結合し、対象は病原体に感染しているまたは感染する危険がある、方法を提供する。1つの局面において、感染は、ノーウォーク様（Norwalk-like）ウイルスまたはカンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）によって引き起こされる。対象は、好ましくはそのような処置を必要とする哺乳動物である。哺乳動物は、例えば、任意の哺乳動物、例えばヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマまたはブタである。好ましい態様において、哺乳動物はヒトである。例えば、組成物は、動物用飼料（例えば、ペレット、キブル、マッシュ）またはコンパニオンアニマル、例えばイヌもしくはネコならびに食用で飼育される家畜または動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリおよびヤギのための動物用栄養補助製品に配合される。好ましくは、精製されたHMOSは、粉末（例えば、各々消費前に液体、例えば水もしくはジュースと混合される、乳児用の配合粉末もしくは成人用の栄養補助粉末）にもしくは錠剤、カプセルもしくはペーストの形態で配合されるか、または乳製品、例えば乳、クリーム、チーズ、ヨーグルトもしくはケフィアの一成分としてもしくは任意の飲料の一成分として組み込まれるか、またはプロバイオティクスの役割を果たすことが意図されている生菌培養物を含む調製物もしくはインビトロもしくはインビボのいずれかで有益な微生物の成長を高めるプレバイオティクス調製物に組み入れられる。

本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびオリゴ糖は、精製および／または単離される。精製は、ヒト対象への投与に関して安全である低不純物性（sterility）の程度、例えば感染性または毒性の作用物質の欠如、を定義する。詳細には、本明細書で使用される場合、「単離」または「精製」された核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質またはオリゴ糖は、他の細胞物質または、組み換え技術によって生産される場合は培養培地、または化学合成される場合は化学前駆体もしくは他の化合物を、実質的に含まない。例えば、精製されたHMOS組成物は、重量（乾燥重量）で少なくとも60％が関心対象の化合物である。好ましくは、調製物は、重量で、少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも99％が関心対象の化合物である。純度は、任意の適切な標準的方法によって、例えばカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーまたは高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）分析によって測定される。例えば、「精製されたタンパク質」は、自然界では付随する他のタンパク質、脂質および核酸から分離されたタンパク質を表す。好ましくは、タンパク質は、精製された調製物の乾燥重量で、少なくとも10、20、50、70、80、90、95、99〜100％を構成する。

同様に、「実質的に純粋」は、オリゴ糖が自然界では付随する成分から分離されていることを意味する。典型的に、オリゴ糖は、自然界では付随するタンパク質および天然有機分子を重量で少なくとも60％、70％、80％、90％、95％さらには99％含まない場合に、実質的に純粋である。

「単離された核酸」は、本発明のDNAの由来となった生物の天然に存在するゲノムにおいてその遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸を意味する。この用語は、例えば：（a）天然に存在するゲノムDNA分子の一部分であるが、自然界でそれを生成する生物のゲノムにおいてその分子の一部分に隣接している両方の核酸配列によって隣接されていないDNA；（b）生成される分子が任意の天然に存在するベクターまたはゲノムDNAと同一とならない様式でベクターまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた核酸；（c）分離された分子、例えばcDNA、ゲノムフラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生成されたフラグメントまたは制限フラグメント；および（d）ハイブリッド遺伝子、すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子の一部分である組み換えヌクレオチド配列、を包含する。本発明にしたがう単離された核酸分子はさらに、合成により生産された分子ならびに化学的に変更されたおよび／または修飾された骨格を有する任意の核酸を含む。

「異種プロモーター」は、遺伝子または核酸配列が本来機能的に連結されているプロモーターとは異なるプロモーターである。

「過剰発現（overexpressまたはoverexpression）」という用語は、同一条件下で野生型細胞によるよりも多量の因子が遺伝子改変された細胞によって発現される状態を表す。同様に、未改変の細胞が、遺伝子改変され生産されるようになる因子を発現しない場合は、「発現」という用語（「過剰発現」と区別される」が使用され、野生型細胞が遺伝子操作以前にその因子を全く発現しなかったことが示される。

本明細書で使用される「処置（treatingおよびtreatment）」という用語は、有害な状態、障害または疾患を患っている臨床症候を示す個体に薬剤または配合物を投与し、症状の重症度および／もしくは頻度を軽減する、症状および／もしくはその根底にある原因を取り除く、ならびに／または損傷の改善もしくは治療を促進することを表す。「予防（preventingおよびprevention）」という用語は、特定の有害な状態、障害または疾患にかかりやすい臨床症候を示していない個体への薬剤または組成物の投与を表し、したがって症状および／またはそれらの根底にある原因の発生の予防に関する。

「有効量」および「治療有効量」の配合物または配合成分という用語は、非毒性であるが、所望の効果を提供するのに十分な量の配合物または成分を意味する。

「含む（including、containing）」または「により特徴づけられる」と同義の「含む」という用語は、包含的またはオープンエンド型であり、追加の、言及されていない要素または方法の工程を排除しない。対照的に、「からなる」というフレーズは、請求項の中で指定されていないあらゆる要素、工程または成分を排除する。「から本質的になる」というフレーズは、請求項の範囲を、指定されている物質または工程および請求項記載の発明の基本的かつ新規の特徴に実質的な悪影響を及ぼさないそれらに制限する。

非FutCラクトース受容性フコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物を発現させるために使用される宿主生物は、典型的に、腸内細菌である大腸菌K12である。大腸菌K-12は、ヒトまたは動物の病原体であるまたは毒発生性であるとみなされていない。大腸菌K-12は、標準的な細菌生産株であり、結腸でコロニー形成し感染する能力の乏しさに由来するその安全性が報告されている（例えば、epa.gov/oppt/biotech/pubs/fra/fra004.htmを参照のこと）。しかし、様々な細菌種が、オリゴ糖生合成法において使用され得る、例えば、エルウィニア・ヘルビコラ（Erwinia herbicola）（パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans））、シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）、ペクトバクテリウム・カロトボルム（Pectobacterium carotovorum）またはザントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）。バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーモフィルス（Bacillus thermophilus）、バチルス・ラテロスポールス（Bacillus laterosporus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・ミコイデス（Bacillus myocoides）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）およびバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）を含むバチルス属の細菌もまた使用され得る。同様に、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・クリスパータス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・イエンセニイ（Lactobacillus jensenii）およびラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）を含むがこれらに限定されないラクトバチルス（Lactobacillus）およびラクトコッカス（Lactococcus）属の細菌が、本発明の方法を用いて修飾され得る。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophiles）およびプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Proprionibacterium freudenreichii）もまた、本明細書に記載される発明に適した細菌種である。本明細書に記載されるように修飾された、エンテロコッカス（Enterococcus）（例えば、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）およびエンテロコッカス・サーモフィルス（Enterococcus thermophiles））、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）（例えば、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）およびビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum））属、スポロラクトバチルス（Sporolactobacillus）種、ミクロモノスポラ（Micromomospora）種、ミクロコッカス（Micrococcus）種、ロドコッカス（Rhodococcus）種およびシュードモナス（Pseudomonas）（例えば、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）およびシュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa））由来の菌株もまた本発明の一部として含まれる。本明細書に記載される特徴を含む細菌は、ラクトースの存在下で培養され、そしてフコシル化オリゴ糖が、細菌自体または細菌の培養上清のいずれかから回収される。フコシル化オリゴ糖は、治療用もしくは栄養補給用製品において使用するために精製され、または細菌がそのような製品において直接使用される。

本発明の他の特徴および利点は、以下のその好ましい態様の説明からおよび特許請求の範囲から明らかとなるであろう。それ以外のことが定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験には本明細書に記載されているのと類似または等価な方法および材料が使用され得るが、以下では適当な方法および材料が説明されている。本明細書で言及されているすべての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で引用されているアクセッション番号によって示されるGenbankおよびNCBI提出物は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で引用されているすべての他の公開された参考文献、文書、原稿および科学文献は、参照により本明細書に組み入れられる。齟齬が生じる場合は、定義を含めて本明細書が優先される。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定を意図したものではない。

図1は、ヒト乳のフコシルオリゴ糖合成経路を示す概略図である。SeおよびLeは、それぞれ、分泌およびルイス遺伝子のフコシルトランスフェラーゼによる合成を示している。短縮された生化学名［角括弧内にはそれに代わる生化学構造］が示されている（丸括弧内は組織血液型抗原アナログ）。図2は、代謝経路および大腸菌において2'-フコシルラクトース（2'-FL）合成を行うためにそれらに導入された変更点を示す概略図である。図3は、大腸菌株において候補α(1,2)フコシルトランスフェラーゼによって生産された2'-FLの薄層クロマトグラフィー分析を示す一連の写真である。図3Aは、WbgLによる2'-FLの有意な生産を示している。図3Bは、FutLによる2'-FLの有意な生産を示している。図3Cは、FutNによる2'-FLの有意な生産を示している。図4は、WbgLによる真正の2'-FLの合成がフコシダーゼ消化により確認されたことを示す薄層クロマトグラフィー分析のチャートおよび写真である。wbgLを発現する大腸菌株により生産されたオリゴ糖を単離し、異なるフコシダーゼによる一晩の消化に供した。反応生産物をTLCにより分析した。α(1,2)フコシダーゼ処理によるフコースおよびラクトースの生産が、レーン2に示されている。図5は、プラスミドpG171の略図である。図6は、P_lacIq lacY⁺染色体コンストラクトの略図である。図7は、wcaJの染色体欠失の略図である。図8は、lon座へのkan、lacZ⁺挿入の略図である。図9は、プラスミドpG204の略図である。図10は、プラスミドpG216の略図である。図11は、プラスミドpG217の略図である。

発明の詳細な説明
いくつかの研究はヒト乳グリカンが抗菌性抗接着剤として使用され得ることを示唆しているが、ヒトが消費するのに適した品質のこれらの剤を十分量生産する困難さおよび費用の高さがそれらのフルスケールの試験および想定されている用途を制限している。必要とされていることは、妥当な費用で十分量の適当なグリカンを生産する適切な方法である。本明細書に記載される本発明より以前に、グリカン合成に関して様々な異なる合成アプローチを使用する試みがなされていた。いくつかの化学的アプローチは、オリゴ糖を合成することができる（Flowers,H.M. Methods Enzymol 50, 93-121 (1978); Seeberger,P.H. Chem Commun (Camb) 1115-1121 (2003)）が、これらの方法のための試薬は高価でありかつ潜在的に毒性である（Koeller,K.M. & Wong,C.H. Chem Rev 100, 4465-4494 (2000)）。改変された生物から発現される酵素（Albermann,C., Piepersberg,W. & Wehmeier,U.F. Carbohydr Res 334, 97-103 (2001); Bettler,E., Samain,E., Chazalet,V., Bosso,C., et al. Glycoconj J 16, 205-212 (1999); Johnson,K.F. Glycoconj J 16, 141-146 (1999); Palcic,M.M. Curr Opin Biotechnol 10, 616-624 (1999); Wymer,N. & Toone,E.J. Curr Opin Chem Biol 4, 110-119 (2000)）は正確かつ効率的な合成を提供する（Palcic,M.M. Curr Opin Biotechnol 10, 616-624 (1999); Crout,D.H. & Vic,G. Curr Opin Chem Biol 2, 98-111 (1998)）が、試薬、特に糖ヌクレオチドの費用の高さが、低費用大規模生産におけるそれらの利用を制限している。微生物は、その細菌の生まれつきのヌクレオチド糖プールからオリゴ糖を合成するのに必要とされるグリコシルトランスフェラーゼを発現するよう遺伝子改変される（Endo,T., Koizumi,S., Tabata,K., Kakita,S. & Ozaki,A. Carbohydr Res 330, 439-443 (2001); Endo,T., Koizumi,S., Tabata,K. & Ozaki,A. Appl Microbiol Biotechnol 53, 257-261 (2000); Endo,T. & Koizumi,S. Curr Opin Struct Biol 10, 536-541 (2000); Endo,T., Koizumi,S., Tabata,K., Kakita,S. & Ozaki,A. Carbohydr Res 316, 179-183 (1999); Koizumi,S., Endo,T., Tabata, K. & Ozaki,A. Nat Biotechnol 16, 847-850 (1998)）。しかし、本明細書に記載される本発明より以前には、代謝的に改変された細菌宿主におけるHMOS合成に有用なさらなるグリコシルトランスフェラーゼを同定および特徴づける要望が高まっていた。

すべてのα(1,2)フコシルトランスフェラーゼがアクセプター糖としてラクトースを利用することができるわけではない。望ましい酵素はドナーとしてGDP-フコースを利用し、ラクトースはそのドナーのアクセプターである。以下の工程を用いて、アクセプターとしてラクトースを利用することができる新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素を同定する方法を実施した：1）配列データベースのコンピュータ検索を行い、任意の公知のラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼの単純配列ホモログの大グループを定義する工程；2）工程1からのホモログのリストを使用して、例えばMEME（http://meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgiで利用可能なMultiple Em for Motif Elicitation）またはPSI-BLAST（ncbi.nlm.nih.gov/blastで利用可能であり、cnx.org/content/m11040/latest/に追加情報が掲載されているPosition-Specific Iterated BLAST）等のコンピュータプログラムを用いることによって、この大グループのメンバーによって共有されている共通配列および／または構造モチーフを含む検索プロフィールを導出する工程；3）これによって導出された検索プロフィールをクエリーとして使用して配列データベースを（例えばPSI-BLASTまたはMAST（http://meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/mast.cgiで利用可能なMotif Alignment Search Tool）等のコンピュータプログラムを用いて）検索し、その単純配列相同性が元のラクトース受容性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼに対して40％またはそれ未満である「候補配列」を同定する工程；4）科学文献を調査し、α(1,2)フコシル-グリカンを発現することが公知の「候補生物」のリストを作製する工程；5）「候補生物」由来である「候補配列」のみを選択し、「候補ラクトース利用性酵素」のリストを生成する工程；ならびに6）各「候補ラクトース利用性酵素」を発現させ、ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ活性について試験する工程。

配列分析ツールのMEMEスイート（meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgi）もまた、PSI-BLASTの代替物として使用され得る。配列モチーフは、プログラム「MEME」を用いて発見される。これらのモチーフは、その後、プログラム「MAST」を用いて配列データベースを検索するために使用され得る。BLASTおよびPHI-BLAST検索アルゴリズムは、その他の周知の代替物である。

ラクトース利用活性を試験するために、2'-FLの生産が、候補酵素を発現しGDP-フコースおよびラクトースの両方の細胞質プールを含む宿主生物において評価される。2'-FLの生産は、候補酵素をコードする配列がラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼとして機能することを示す。

FutCと同等の酵素を発見するために、FutCの全アミノ酸をPSI-BLASTにおけるクエリーとして使用した。本発明のラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ同定法の結果は、同定されたいくつかのラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼの%同一性が参照FutC配列の40％未満である点で、驚くべきものである。この研究の別の最も驚くべき局面は、試験した10個の候補のうちの8個がアクセプターとしてラクトースを利用することができ、そのうちの3個が「ゴールドスタンダード」酵素であるFutCに非常に近いレベルで利用したことである。これは、予想されていたよりも高い「ヒット率」であった。10個の候補酵素のうちの6個は、α(1,2)フコースをそれらのLPS構造に組み込む細菌において見出され、フコースが付加されたオリゴ糖は、各々の候補酵素がクエリーの中でその利用について問い合わせられていたラクトースと大きく異なるものである。さらに、WblAおよびWbgNの両方がアクセプターとしてラクトースを使用できることは、これらの両酵素はフコースをそれらのLPS構造に組み込まない細菌において見出されることから、驚くべきことであった。それらはむしろコリトースという名の関連する糖を利用する。

ヒト乳グリカン
ヒト乳は、多種で豊富な中性および酸性オリゴ糖群を含んでいる（Kunz,C., Rudloff,S., Baier,W., Klein,N., and Strobel,S. (2000). Annu Rev Nutr 20, 699-722; Bode,L. (2006). J Nutr 136, 2127-130）。130を超える異なる複合オリゴ糖がヒト乳において同定されており、それらの構造の多様さおよび豊富さは、ヒトに特有である。これらの分子は、栄養分としては乳児によって直接利用されないかもしれないが、そうであったとしてもそれらは健康な腸内微生物環境の確立（Marcobal,A., Barboza,M., Froehlich,J.W., Block,D.E., et al. J Agric Food Chem 58, 5334-5340 (2010)）、疾患の予防（Newburg,D.S., Ruiz-Palacios,G.M. & Morrow,A.L. Annu Rev Nutr 25, 37-58 (2005)）および免疫機能（Newburg,D.S. & Walker,W.A. Pediatr Res 61, 2-8 (2007)）において重要な役割を果たしている。ヒト乳オリゴ糖（HMOS）との接触が数百年に及んでいるにもかかわらず、病原体は今もなお、標的細胞への接着を妨げ感染を阻害するHMOSの能力を回避する方法を開発しなければならない。病原体接着阻害物質としてHMOSを利用する能力は、現在の急増する抗生物質耐性の危機に取り組む上で有用である。生合成により生産されたヒト乳オリゴ糖は、社会の最も対処困難な問題のいくつかに対する新規クラスの治療剤のリード化合物となる。

効率的、工業規模のHMOS合成の1つの代替戦略は、細菌の代謝改変である。このアプローチでは、細菌サイトゾルへの前駆体糖の取り込みのための膜輸送体である異種グリコシルトランスフェラーゼを過剰発現し、生合成前駆体として使用される再生ヌクレオチド糖の増強されたプールを有する微生物株が構築される（Dumon,C., Samain,E., and Priem,B. (2004). Biotechnol Prog 20, 412-19; Ruffing,A., and Chen, R.R. (2006). Microb Cell Fact 5, 25）。このアプローチの重要な局面は、微生物宿主において過剰発現ために選択される異種グリコシルトランスフェラーゼである。グリコシルトランスフェラーゼの選択は、酵素がキネティクス、基質特異性、ドナーおよびアクセプター分子に対する親和性、安定性ならびに可溶性に関して大きく異なり得るため、所望の合成されるオリゴ糖の最終的な収量に大きく影響し得る。異なる細菌種由来のいくつかのグリコシルトランスフェラーゼが同定され、そして大腸菌宿主株においてHMOSの生合成を触媒するそれらの能力に関して特徴づけられている（Dumon,C., Bosso,C., Utille,J.P., Heyraud,A., and Samain,E. (2006). Chembiochem 7, 359-365; Dumon,C., Samain,E., and Priem,B. (2004). Biotechnol Prog 20, 412-19; Li,M., Liu,X.W., Shao,J., Shen,J., Jia,Q., Yi,W., Song,J.K., Woodward,R., Chow,C.S., and Wang,P.G. (2008). Biochemistry 47, 378-387）。より速いキネティクス、ヌクレオチド糖ドナーおよび／もしくはアクセプター分子に対するより高い親和性または細菌宿主内でのより高い安定性を示すさらなるグリコシルトランスフェラーゼの同定は、治療的に有用なHMOSの収量を大きく改善する。本明細書に記載される本発明以前から、HMOSの化学合成が可能であったが、立体特異性の問題、前駆体の入手性、生産物の不純度およびかさむ総費用によって制限されていた（Flowers,H.M. Methods Enzymol 50, 93-121 (1978); Seeberger,P.H. Chem Commun (Camb) 1115-1121 (2003); Koeller,K.M. & Wong,C.H. Chem Rev 100, 4465-4494 (2000)）。本発明は、栄養補助製品として使用するために多量のヒト乳オリゴ糖（HMOS）を安価に生産する新しい戦略を提供することによって、これらの以前の取り組みの欠点を克服する。利点は、酵素の効率的発現、遺伝子産物（2'-FL）の改善された安定性および／または可溶性ならびに宿主生物に対する低い毒性を含む。例えば、大腸菌株由来のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ（例えば、WbgL）は、FutCと比較して、より安定であり、大腸菌生産宿主株内でより高レベルで発現される。別の例において、より高い活性のフコシルトランスフェラーゼ（futN）が、病原体ではなく共生微生物（バクテロイデス（Bacteroides））から得られる。多くの改変された生産株は病原体から得られるフコシルトランスフェラーゼを使用するものなので、安全性および／または高い消費者承認がこの配列／酵素の利点に追加される。

以下に詳細に記載されるように、大腸菌（またはその他の細菌）は、商業的に有益なレベルで2'-FLを生産するよう改変される。例えば、収量は、細菌発酵プロセスにおいて＞5グラム／リットルである。

感染病におけるヒト乳グリカンの役割
非結合オリゴ糖およびそれらの複合多糖の両方を含むヒト乳グリカンは、乳児の胃腸（GI）管の保護および発達において重要な役割を果たしている。2'-フコシルラクトース（2'-FL）を含む中性フコシル化オリゴ糖は、様々な重要な病原体から乳児を保護する。様々な哺乳動物において見出される乳オリゴ糖は大きく異なっており、ヒトの組成は特有である（Hamosh M., 2001 Pediatr Clin North Am, 48:69-86; Newburg D.S., 2001 Adv Exp Med Biol, 501:3-10）。さらに、ヒト乳におけるグリカンレベルは、授乳期を通じて変化し、個体間でも大きく異なる（Morrow A.L. et al., 2004 J Pediatr, 145:297-303; Chaturvedi P et al., 2001 Glycobiology, 11:365-372）。およそ200個の異なるヒト乳オリゴ糖が同定されており、単エピトープの組み合わせがこの多様性を担っている（Newburg D.S., 1999 Curr_Med Chem, 6:117-127; Ninouevo M. et al., 2006 J Agric Food Chem, 54:7471-74801）。

ヒト乳オリゴ糖は、5個の単糖：D-グルコース（Glc）、D-ガラクトース（Gal）、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、L-フコース（Fuc）およびシアル酸（N-アセチルノイラミン酸、Neu5Ac、NANA）、から構成される。ヒト乳オリゴ糖は、通常、それらの化学構造にしたがい2つのグループ：ラクトース（Galβ1-4Glc）コアに連結されたGlc、Gal、GlcNAcおよびFucを含む中性化合物、ならびに同じ糖およびしばしば同じコア構造プラスNANAを含む酸性化合物に分類される（Charlwood J. et al., 1999 Anal Biochem, 273:261-277; Martin-Sosa et al., 2003 J Dairy Sci, 86:52-59; Parkkinen J. and Finne J., 1987 Methods Enzymol, 138:289-300; Shen Z. et al., 2001 J Chromatogr A, 921:315-321）。

ヒト乳中のオリゴ糖のおよそ70〜80％はフコシル化されており、それらの合成経路は図1に示されるように進行すると考えられている（I型およびII型経路は異なる前駆体分子から開始される）。少数のオリゴ糖はシアル化されるかまたはフコシル化されかつシアル化されるが、それらの合成経路は完全に定義されていない。酸性（シアル化）オリゴ糖の理解は、一部、これらの化合物を測定する能力によって制限されている。中性および酸性の両方のオリゴ糖を分析する高感度かつ再現性のある方法が設計されている。クラスとしてのヒト乳オリゴ糖は、乳児の腸を通じた移動を非常に効果的に生き延び、本質的に非消化性である（Chaturvedi,P., Warren,C.D., Buescher, C.R., Pickering, L.K. & Newburg, D.S. Adv Exp Med Biol 501, 315-323 (2001)）。

ヒト乳グリカンは腸管病原体がそれらの受容体に対して結合するのを阻害する
ヒト乳グリカンは、腸管病原体の細胞受容体に対する構造的相同性を有し、受容体のデコイとして機能する。例えば、カンピロバクター（Campylobacter）の病原性株は、H-2を含むグリカン、すなわち2'-フコシル-N-アセチルラクトサミンまたは2'-フコシルラクトース（2'FL）に特異的に結合し；カンピロバクターの結合性および感染性は2'-FLおよびこのH-2エピトープを含む他のグリカンによって阻害される。同様に、いくつかの下痢性大腸菌病原体は、インビボで、2結合型フコース部分を含むヒト乳オリゴ糖によって強く阻害される。ヒトカリシウイルスのいくつかの主要株、特にノロウイルスもまた2結合型フコシル化グリカンに結合し、そしてこの結合はヒト乳2結合型フコシル化グリカンによって阻害される。これらの2結合型フコシルオリゴ糖を高レベルで有するヒト乳の摂取は、ノロウイルス、カンピロバクター、大腸菌関連下痢のSTおよびメキシコ人乳児集団におけるすべての原因の中等度〜重度の下痢の危険の低下に関連した（Newburg D.S. et al., 2004 Glycobiology, 14:253-263; Newburg D.S. et al., 1998 Lancet, 351:1160-1164）。いくつかの病原体、例えばインフルエンザ（Coucerio,J.N., Paulson,J.C. & Baum,L.G. Virus Res 29, 155-165 (1993)）、パラインフルエンザ（Amonsen,M., Smith,D.F., Commings,R.D. & Air,G.M. J Virol 81, 8341-8345 (2007)）およびロタウイルス（rotovirus）（Kuhlenschmidt,T.B., Hanafin,W.P., Gelberg,H.B. & Kuhlenschmidt,M.S. Adv Exp Med Biol 473, 309-317 (1999)）は、それらの宿主受容体としてシアル化グリカンを利用する。シアリル-ルイスXエピトープは、ヘリコバクター・ピロリ（Mahdavi,J., Sonden,B., Hurtig,M., Olfat,F.O., et al. Science 297, 573-578 (2002)）、シュードモナス・アエルギノーサ（Scharfman,A., Delmotte,P., Beau,J., Lamblin,G., et al. Glycoconj J 17, 735-740 (2000)）およびノロウイルスのいくつかの株（Rydell,G.E., Nilsson,J., Rodriguez-Diaz, J., Ruvoen-Clouet,N., et al. Glycobiology 19, 309-320 (2009)）によって使用される。

ヒト乳オリゴ糖2'-FLの生産のための大腸菌の改変
本明細書には、代謝的に改変された大腸菌におけるフコシル結合オリゴ糖の合成のために新規のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ（α(1,2)FT）を同定するのに使用した遺伝子スクリーニングアプローチが記載されている。HMOS 2'-フコシルラクトース（2'-FL）を合成することができるα(1,2)FTが、特に関心対象である。2'-FLは、ヒト乳中に存在する最も豊富なフコシル化オリゴ糖であり、このオリゴ糖は、細菌病原体、例えばカンピロバクター・ジェジュニにより引き起こされる感染性下痢に対する保護を新生児に提供する（Ruiz-Palacious,G.M., et al. (2003). J Biol Chem 278, 14112-120; Morrow,A.L. et al. (2004). J Pediatr 145, 297-303; Newburg,D.S. et al. (2004). Glycobiology 14, 253-263）。

ヒト乳のフコシルオリゴ糖の合成経路は、図1に示されている。構造的に、2'-FLは、ラクトースのガラクトース部分にα1,2結合したフコース分子からなる（Fucα1-2Galβ1-4Glc）。FutCと呼ばれるH.ピロリ株26695由来のα(1,2)FTは、代謝的に改変された大腸菌において2'-FLの合成を触媒するために利用されている（Drouillard,S. et al. (2006). Angew Chem Int Ed Engl 45, 1778-780）。したがって、大腸菌における2'-FLの生産のための新規の候補α(1,2)FTを同定するために、FutCのアミノ酸配列を検索アルゴリズムPSI-BLAST（Position Specific Iterated Basic Local Alignment Search Tool）においてクエリーとして使用した。PSI-BLASTを用いて、クエリー配列に基づき関係の近いタンパク質配列のリストを作製する。次いで、これらの配列中に存在する重要なモチーフを要約したプロフィール配列をアルゴリズムに作製させる。次いで、このプロフィールを、大きな候補配列グループを同定するための新規クエリーとして使用し、そしてこのプロセスを、さらに大きな候補グループを生成するよう繰り返す。

FutCのアミノ酸配列をクエリーとして使用し、PSI-BLAST検索アルゴリズムを2回繰り返した。この検索により、その一部がより近い関係にある（25％を超えるアミノ酸同一性を共有している）FutCに対する類似性を有する277個の候補のグループ、およびFutCに対してより遠い関係にある（25％未満のアミノ酸同一性を共有している）グループを得た。より近い関係のグループの中で、フコースをそれらのリポ多糖（LPS)のO抗原または細胞表面莢膜を構成する多糖サブユニットに取り込む細菌種由来の推定α(1,2)FTを分析した。これらのタイプの生物由来のα(1,2)FTは、それらの表面炭水化物構造におけるフコースの存在から、基質としてフコースを利用する可能性が高い。共生体または病原体のいずれかの公知の腸内細菌種由来のα(1,2)FTも分析した。そのような生物はときどき、それらの細胞表面上に、フコースを含みかつ高等生物において見出される様々な2'-フコシル含有ルイス抗原構造を模倣する炭水化物構造体を提示する（Appelmelk,B.J. et al. (1998). Infect Immun 66, 70-76; Coyne,M.J. et al. (2005). Science 307, 1778-781）。これらのタイプの生物由来の候補α(1,2)FTは、基質としてフコースを利用しかつ有用なアクセプターオリゴ糖へのフコースの連結も触媒する可能性が高い。

スクリーンから同定された、FutCに対してアミノ酸レベルで25％を超える相同性を有する10個のα(1,2)FTを分析した（表1）。

（表１）改変大腸菌株において2'-FLを促進する能力について試験した候補α(1,2)フコシルトランスフェラーゼの概要。各候補の活性をFutCと比較し、それを、最後のカラムにおいて、FutCを4「+」の記号で表す最高活性と評価する「+」記号を用いて準定量的に表した。

ヘリコバクター・ピロリ26695アルファ-(1,2)フコシルトランスフェラーゼ（FutC）のアミノ酸配列を以下に示す（SEQ ID NO:2；参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NP_206893およびNP_206894（GI:15644723および15644724））。

コレラ菌O22 WblAのアミノ酸配列を以下に示す（SEQ ID NO:3；参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号BAA33632（GI:3721682））。

大腸菌O126 WbgLのアミノ酸配列を以下に示す（SEQ ID NO:4；参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号ADN43847（GI:307340785））。

ヘリコバクター・ビリスATCC 437879 FutDのアミノ酸配列を以下に示す（SEQ ID NO:5；参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号ZP_04580654（GI:237750174））。

ヘリコバクター・シネディCCUG 18818アルファ-1,2-フコシルトランスフェラーゼ（FutE）のアミノ酸配列を以下に示す（SEQ ID NO:6；参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号ZP_07805473（GI:313143280））。

ヘリコバクター・ムステラエ12198（ATCC 43772）アルファ-1,2-フコシルトランスフェラーゼ（FutL）のアミノ酸配列を以下に示す（SEQ ID NO:7；参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号YP_003517185（GI:291277413））。

このスクリーンを通じて同定された、FutCに匹敵する酵素活性を有する1つのα(1,2)フコシルトランスフェラーゼを、FutLと命名した。FutLは、代謝的に改変された大腸菌生産株において、FutCのおよそ75％のレベルで2'-FLの合成を誘導することが分かった（表1および図3）。加えて、データは、FutLが、他のα(1,2)FTでは観察された副産物であるLDFTの合成の促進に関して有意に低い効果を有することを示した。したがって、FutLは、他を上回る利点、例えば同時に生産される他の望ましくない混在オリゴ糖の心配なく2'-FLを確実に生産する能力、を提供する。FutLは、ヘリコバクター・ムステラエ由来であり、アミノ酸レベルでFutCと70％同一である。

バクテロイデス・ブルガタスATCC 8482グリコシルトランスフェラーゼファミリータンパク質（FutN）のアミノ酸配列を以下に示す（SEQ ID NO:8；参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号YP_001300461（GI:150005717））。

バクテロイデス・オバタスATCC 8483 FutOのアミノ酸配列を以下に示す（SEQ ID NO:9；参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号ZP_02065239（GI:160884236））。

大腸菌O55:H7（CB9615株）フコシルトランスフェラーゼ（WbgN）のアミノ酸配列を以下に示す（SEQ ID NO:10；参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号YP_003500093（GI:291283275））。

バクテロイデス・フラジリス（NCTC）9343アルファ-1,2-フコシルトランスフェラーゼ（Bft1）のアミノ酸配列を以下に示す（SEQ ID NO:11；参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号CAH09369（GI:60494568））。

バクテロイデス・フラジリス（NCTC）9343フコシルトランスフェラーゼ（Bft3/WcfB）のアミノ酸配列を以下に示す（SEQ ID NO:12；参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号CAH06753（GI:60491992））。

本研究において試験したフコシルトランスフェラーゼの相同性比較表

これらのタンパク質はすべて、高等生物の胃腸系と相互作用する細菌において見出される。加えて、選択された10個のうちの6個は、フコースをそれらの細胞表面グリカンに組み込む。そのような遺伝子は、フコシルオリゴ糖合成において最も強い活性を有すると予想された。この10個の候補のグループには、フコースを細胞表面グリカンに組み込まない細菌株において見出される2個の酵素（WblAおよびWbgN）も含まれていた。これらの候補はほとんどまたは全くフコシルオリゴ糖合成活性を有さないであろうこと、したがってこのスクリーニングアプローチを検証するための有用な陰性対照として機能し得ることが予想された。

標準的な分子生物学技術によって、候補α(1,2)FTを発現プラスミドにクローニングした。このプラスミドは、候補遺伝子の発現を誘導するためにバクテリオファージλの強力な左方向プロモーター（P_Lと呼ばれる）を利用する（Sanger,F. et al. (1982). J Mol Biol 162, 729-773）。このプロモーターは制御可能であり、例えば、trp-cIコンストラクトは大腸菌宿主のゲノム（のampC座）に安定的に組み込まれ、そして制御は成長培地にトリプトファンを添加することによって行われる。タンパク質発現の段階的誘導は、温度感受性cIリプレッサーを用いて達成される。別の同様の制御戦略（温度依存的発現系）も記載されている（Mieschendahl et al., 1986, Bio/Technology 4: 802-808）。このプラスミドもまた、フコシル結合型オリゴ糖合成における重要な前駆体であるGDP-フコースの合成を上方調節する大腸菌rcsA遺伝子を有している。加えて、このプラスミドは、（研究室での利便性のために）このプラスミドをアンピシリン選択により宿主株中で維持するためのβ-ラクタマーゼ（bla）遺伝子およびthyA^-宿主における代替選択手段としてのネイティブthyA（チミジル酸シンターゼ）遺伝子を有している。代替選択マーカーは、プロリン栄養性を補完するproBA遺伝子（Stein et al., (1984), J Bacteriol 158:2, 696-700 (1984)）またはアデニン栄養性を補完するpurC（Parker,J., (1984), J Bacteriol 157:3, 712-7）を含む。プラスミド選択マーカーとして機能させるために、これらの遺伝子は各々、最初に宿主細胞の染色体において不活性化され、次いでこの遺伝子の野生型コピーがプラスミド上に提供される。あるいは、薬物耐性遺伝子、例えばベータ-ラクタマーゼ（この遺伝子は上記の発現プラスミド上にすでに存在しており、それによってアンピシリン選択を可能にしている）がプラスミド上で使用され得る。アンピシリン選択は当技術分野で周知であり、標準的な参考書、例えばManiatis et al., (1982) Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, N.Y.に記載されている。

この発現コンストラクトで、2'-FLの生産に有用な宿主株を形質転換した。2'-FLの生合成のために、ラクトースおよびGDP-フコースの両方の増強された細胞プールを生成する必要がある（図2）。2'-FL生産を触媒する候補の能力を試験する背景となる親として、野生型大腸菌K12原栄養株W3110を選択した（Bachmann,B.J. (1972). Bacteriol Rev 36, 525-557）。使用したこのW3110派生株は、GI724として公知の大腸菌株を生成するトリプトファン誘導性P_trpBcI+リプレッサーカセットの（ampC座への）導入によって事前に修飾されたものであった（LaVallie,E.R. et al. (2000). Methods Enzymol 326, 322-340）。GI724の他の特徴は、lacIqおよびlacPL8プロモーターの変異を含む。大腸菌株GI724は、低レベルの外因性トリプトファンによる誘導後のファージλP_Lプロモーターからの組み換えタンパク質の経済的生産に適している（LaVallie,E.R. et al. (1993). Biotechnology (NY)11, 187-193; Mieschendahl,et al. (1986). Bio/Technology 4, 802-08）。この株に対して、2'-FLの生合成を促進するさらなる遺伝的変更を行った。これは、GI724株において、λRed再結合（recombineering）を用いる染色体の数回の操作（Court,D.L. et al. (2002). Annu Rev Genet 36, 361-388）および汎用P1ファージ形質導入を通じて行った。

第1に、細胞内ラクトースを蓄積する大腸菌宿主株の能力を、内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）およびラクトースオペロンリプレッサー遺伝子（lacI）の同時欠失によって改変した。この欠失を構築する際に、lacIqプロモーターをラクトースパーミアーゼ遺伝子lacYのすぐ上流に配置させた。修飾株は、培養培地から（lacYを通じて）ラクトースを輸送する能力を維持しているが、ラクトース異化を担うlacZ（β-ガラクトシダーゼ）遺伝子の野生型コピーを欠いている。したがって、この修飾株を外因性ラクトースの存在下で培養したとき、細胞内ラクトースプールが形成される。P_lacIqlacY⁺染色体コンストラクトの概略は、図6に示されている。

P_lacIqlacY⁺染色体コンストラクトのゲノムDNA配列を以下に示す（SEQ ID NO:13）（ATG開始コドンを下線で示す）。

第2に、細胞外莢膜多糖であるコラン酸を合成する宿主大腸菌株の能力を、UDP-グルコース脂質担体トランスフェラーゼをコードするwcaJ遺伝子の欠失により除去した（Stevenson,G. et al. (1996). J Bacteriol 178, 4885-893）。wcaJヌルの背景の下で、GDP-フコースは大腸菌の細胞質に蓄積される（Dumon,C. et al. (2001). Glycoconj J 18, 465-474）。wcaJの染色体欠失の概略が図7に示されている。

ΔwcaJ::FRT変異を有する染色体領域の配列を以下に示す（SEQ ID NO:14）（変位を下線で示す）。

第3に、細胞質GDP-フコースプールの大きさを、lon遺伝子へのヌル変異の導入によって拡張した。lonは、大腸菌におけるコラン酸生合成の正の転写レギュレーターであるRcsAの分解を担うATP依存性細胞内プロテアーゼである（Gottesman,S. & Stout,V. Mol Microbiol 5, 1599-1606 (1991)）。lonヌル背景の下で、RcsAは安定化され、RcsAレベルが上昇し、大腸菌においてGDP-フコース合成を担う遺伝子が上方調節され、そして細胞内GDP-フコース濃度が向上する。lon遺伝子をほぼ完全に欠失させ、挿入された機能的な野生型であるがプロモーターを有さない大腸菌lacZ⁺遺伝子によって置き換えた（Δlon::(kan,lacZ⁺)）。λRed再結合を使用してその構築を行った。lon座へのkan,lacZ⁺挿入の概略が図8に示されている。

大腸菌株におけるlon領域へのlacZ+挿入部周囲のゲノムDNA配列を以下に示す（SEQ ID NO:15）。

好ましくは、大腸菌株におけるlon領域へのlacZ⁺挿入部周囲のゲノムDNA配列は以下に示されるようなものである（SEQ ID NO:19）（リボソーム結合部位を小文字で示し、5' ATG開始コドンlacZに相補的なコドンおよび停止コドンに相補的なコドンを太字および下線で示す）。

lacZタンパク質をコードする核酸配列を以下に示す（SEQ ID NO:20）（ATG開始コドンを下線で示し、停止コドンを太字および下線で示す）。

第4に、thyA（チミジル酸シンターゼ）変異をP1形質導入によりこの菌株に導入した。外因性チミジンの非存在下で、thyA株はDNAを生成することができず死亡する。この欠陥は、野生型thyA遺伝子をマルチコピープラスミド上に供給することによってイントランスで補完することができる（Belfort,M., Maley,G.F., and Maley,F. (1983). Proc Natl Acad Sci USA 80, 1858-861）。この補完を、ここでは、プラスミド維持の手段として使用した。

遊離ラクトースの細胞質プール（したがって2'-FLの最終的な収量）を増大させるのに有用なさらなる修飾は、lacA変異の組み込みである。lacAは、高レベルのラクトースが大腸菌の細胞質に蓄積しているときにのみ活性を示すラクトースアセチルトランスフェラーゼである。（例えば、高い細胞内ラクトースプールによって引き起こされる）高い細胞内モル浸透圧濃度は、細菌の成長を阻害し得、大腸菌は、過剰な細胞内ラクトースをLacAを用いてアセチル基で「タグ付け」し次いでこのアセチル-ラクトースを細胞から能動的に排出することによってラクトースにより引き起こされる高い細胞内モル浸透圧濃度から自身を保護する機構を進化させた（Danchin,A. Bioessays 31, 769-773 (2009)）。2'-FLまたは他のヒト乳オリゴ糖を生産するよう改変された大腸菌におけるアセチル-ラクトースの生産は、したがって、望ましくなく、それは総収量を減少させる。さらに、アセチル-ラクトースは、オリゴ糖精製スキームを複雑化する副産物である。lacA変異の組み込みは、これらの問題を解消する。フコシル化オリゴ糖の準最適な生産は、コラン酸経路およびlonプロテアーゼのいずれかまたは両方における変異を欠く菌株において見られる。ラクトースから副産物（アセチル-ラクトース）への転換は、lacA変異を含まない菌株において見られる。lacA欠失の概略および対応するゲノム配列は、上に提供されている（SEQ ID NO:13）。

異なるα(1,2)FT候補を試験するために使用する菌株は、上記の遺伝子修飾の全てを含み、以下の遺伝子型を有する：
ΔampC::P_trp ^BcI, Δ(lacI-lacZ)::FRT, P_lacIqlacY⁺, ΔwcaJ::FRT, thyA::Tn10, Δlon:(npt3,lacZ⁺), ΔlacA

異なるα(1,2)FT候補発現プラスミドを保持する大腸菌株を分析した。菌株を、（チミジンを欠く）選択培地において初期指数関数期まで成長させた。次いでラクトースを終濃度1％となるよう添加し、P_Lプロモーターからの各候補α(1,2)FTの発現の誘導のためにトリプトファン（200μM）を添加した。誘導期間（およそ20h）の最後に、等しいOD600単位の各菌株を収集した。溶解産物を調製し、薄層クロマトグラフィー（TLC）によって2'-FLの存在について分析した。図3Aに示されるように、FutC-Mycを産生する株は、2'-FLの生合成に関して有効であり、かつ少量の四糖ラクトジフコテトラオース（LDFT）も生産した。大腸菌O128:B12由来の以前に特徴づけられたα(1,2)FTであるWbsJもまた、2'-FL合成を触媒することができたが、FutC-Mycにより生産されるレベルのおよそ30％のみであった（図3A、レーン5および6）。Wb1A（コレラ菌O22由来）は、2'-FL合成を促進することができたが、FutCと比較して有意に低いレベルであった（図3A、レーン7および8）。コレラ菌O22はフコースを細胞表面グリカンに取り込まないので、この結果は予想外のものではなかった（Cox,A.D. et al. (1997). Carbohydr Res 304, 191-208）。プラスミドpG204からWbgL（大腸菌株O126由来）を産生する菌株は、FutC-Mycにより生産される量のおよそ75％という有意な量の2'-FLを合成した（図3A、レーン9および10）。WbgLはまた、LDFTを合成することもできた。プラスミドpG216からFutL（H.ムステラエATCC 43772由来）を産生する菌株は、FutC-MycおよびWbgLを用いて得られたレベルに匹敵する確実な量の2'-FLの合成を誘導することができた（図3B、レーン7および8）。さらに、プラスミドpG217からFutN（B.ブルガタスATCC 8482由来）を産生する菌株もまた、FutC-Mycにより生産される量のおよそ50％という有意な量の2'-FLを生産した（図3C、レーン5および6）。FutNは、共生細菌であるB.ブルガタス由来であり、したがって食品添加物の生産における病原性細菌由来のα(1,2)FTの利用に関するのと同じ懸念の対象とならずにすむ可能性がある。

プラスミドpG204のマップを図11に示す。プラスミドpG204の配列を以下に示す（SEQ ID NO:16）（大腸菌O126 WbgLのATG開始コドンに相補的なコドンを下線で示し、停止コドンに相補的なコドンを下線および太字で示す）。

プラスミドG204からの大腸菌O126 WbgLタンパク質をコードする核酸配列を以下に示す（SEQ ID NO:21）（ATG開始コドンを下線で示し、停止コドンを太字および下線で示す）。

プラスミドpG216のマップを図9に示す。プラスミドpG216の配列を以下に示す（SEQ ID NO:17）（H.ムステラエFutLの5'ATG開始コドンに相補的なコドンを下線で示し、停止コドンに相補的なコドンを太字および下線で示す）。

プラスミドpG216からのH.ムステラエFutLタンパク質をコードする核酸配列を以下に示す（SEQ ID NO:22）（ATG開始コドンを下線で示し、停止コドンを太字および下線で示す）。

プラスミドpG217のマップを図10に示す。プラスミドpG217の配列を以下に示す（SEQ ID NO:18）（B.ブルガタスFutNの5'ATG開始コドンに相補的なコドンを下線で示し、停止コドンに相補的なコドンを太字および下線で示す）。

プラスミドpG217からB.ブルガタスFutNタンパク質をコードする核酸配列を以下に示す（SEQ ID NO:23）（ATG開始コドンを下線で示し、停止コドンを太字および下線で示す）。

代謝的に改変された大腸菌細胞によって生産されるフコシル化オリゴ糖は、発酵後に培養ブロスから精製される。例示的な手順は、5つの工程を含む。（1）浄化：発酵ブロスを収集し、6000 x gで30分間の予備的遠心分離による沈降によって細胞を除去する。各バイオリアクタで実施することにより約5〜7Lの部分浄化上清が得られる。（2）粗カーボンによる生産物の捕捉：およそ1000ml容積の粗カーボン（Calgon 12x40 TR）を充填したカラム（直径5cm x 長さ60cmの寸法）を1カラム容積（CV）の水で平衡化し、そして浄化した培養上清を40ml/分の流速で投入する。このカラムは、糖約120g分の総積載能力を有する。投入および糖の捕捉の後、カラムを1.5CVの水で洗浄し、次いで2.5CVの50％エタノールまたは25％イソプロパノールで溶出させる（この工程では、生産物の溶出に低濃度のエタノール（25〜30％）で十分であり得る）。この溶媒溶出工程により、カラムに結合した糖全体の約95％および少量の有色物質（color body）が放出される。この第1工程においては、最大量の糖の捕捉が主目的である。混在物質の解明は目的ではない。（3）蒸発：捕捉カラムからの2.5L容積のエタノールまたはイソプロパノール溶出液を56℃で回転蒸発させ、水中で糖シロップを生成する。この工程で使用することができる代替法は、凍結乾燥または噴霧乾燥を含む。（4）微細カーボンおよびイオン交換媒体上でのフラッシュクロマトグラフィー：Biotage Isolera One FLASH Chromatography Systemに接続されたカラム（GE Healthcare HiScale50/40、5x40cm、最大圧20バール）に750mlのDarco Activated Carbon G60（100メッシュ）：Celite 535（粗）1：1混合物を充填する（両カラム充填物をSigmaから入手した）。このカラムを5CVの水で平衡化し、そして、セライトローディングカートリッジまたは直接注射のいずれかを用いて工程3からの糖（2'-FL 対混在ラクトースの比に依存して10〜50g）を投入する。このカラムを蒸発光散乱（ELSD）検出器に接続し、クロマトグラフィー中に溶出する糖のピークを検出する。2'-FLを単糖（存在する場合）、ラクトースおよび有色物質から分離するため、イソプロパノール、エタノールまたはメタノールの4段階勾配を行う。糖のピークに対応する画分を120mlボトルに自動回収し、プールし、そして工程5に送る。通常より長い発酵からの特定の精製作業では、2'-FL含有画分をアニオン交換およびカチオン交換カラムに通すことで、余分なタンパク質／DNA／カラメル物質の混在物を除去することができる。この目的で試験に合格した樹脂は、Dowex 22である。

WbgLによって合成された主要なオリゴ糖の正体を試験し、これが真正の2'-FLであることを確認した。WbgL株において合成されたオリゴ糖をカーボンカラムに固定し、溶出させ、そして蒸留水で再懸濁した。この物質を、異なる特異性のフコシダーゼを用いた一晩の消化に供し、その反応物をTLCによって分析した。図4に示されるように、未処理の物質は、主に、2'-FL標準と同じ移動度のオリゴ糖からなっていた（レーン1）。α1,2フコシダーゼ処理は、ラクトースおよびフコースの両方を生じ、推定2'-FLスポットの染色度が有意に低下した（レーン2）。α1,3-4フコシダーゼによるオリゴ糖の処理は、効果がなかった。これらの結果は、代謝的に改変された大腸菌においてWbgLが真正の2'-FLの生合成を行うことができることを実証している。

遺伝子スクリーニングアプローチを用いることで、代謝的に改変された大腸菌宿主株における2'-FLの効率的な生合成のための新規のα(1,2)FTの同定に成功した。このスクリーンの結果が表1にまとめられている。詳細には、WbgLおよびFutLは、両方とも、以前に特徴づけられたα(1,2)FT FutCにより達成されるレベルのおよそ75％の2'-FLの合成を誘導する。加えて、WbgLはまた、別の治療上有用なHMOであるLDFTを合成することができた。さらに、共生腸内細菌B.ブルガタス由来のFutNを、フコシル化オリゴ糖の合成に有用な別のα(1,2)FTとして同定した。本明細書に記載されるアプローチは、さらなる候補α(1,2)FTの分析に有用であり、HMOSの大規模生産に有用なさらなる酵素を同定する。

生産宿主株
大腸菌K-12は、微生物生理学および遺伝学における幅広い研究の対象であり、様々な工業利用において商業的に利用されている、よく研究された細菌である。その親種である大腸菌の自然生息場所は、哺乳動物の大腸である。大腸菌K-12は、安全使用の歴史があり、その派生株は、ヒトに投与およびヒトが消費するための化合物および薬物の生産を含む多くの工業用途で使用されている。大腸菌K-12は、1922年に、回復期のジフテリア患者から最初に単離された。それは毒性を有さず、一般的な研究用培地で容易に成長し、そして微生物生理学および遺伝学の研究において広く使用されているので、微生物学の研究、教育ならびに工業用および医薬用製品の生産において使用される標準的な細菌株となっている。大腸菌K-12は、現在、実験環境で70年を超えて維持された結果として弱体化された生物であるとみなされている。その結果、K-12株は、通常の条件下でヒトおよび他の動物の腸にコロニーを形成することができない。この周知の菌株に関するさらなる情報は、http://epa.gov/oppt/biotech/pubs/fra/fra004.htmで入手可能である。大腸菌K12に加えて、他の細菌株も生産宿主株として使用され、例えば、様々な細菌種、例えばエルウィニア・ヘルビコラ（パントエア・アグロメランス）、シトロバクター・フロインディ、パントエア・シトレア、ペクトバクテリウム・カロトボルムまたはザントモナス・カンペストリス、がオリゴ糖生合成法において使用され得る。バチルス・サブチリス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーモフィルス、バチルス・ラテロスポールス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ミコイデス、バチルス・プミルス、バチルス・レンタス、バチルス・セレウスおよびバチルス・サーキュランスを含むバチルス属の細菌もまた使用され得る。同様に、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ヘルベティクス、ラクトバチルス・デルブリュッキイ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ブルガリクス、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・イエンセニイおよびラクトコッカス・ラクティスを含むがこれらに限定されないラクトバチルスおよびラクトコッカス属の細菌が、本発明の方法を用いて修飾され得る。ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイもまた、本明細書に記載される発明に適した細菌種である。本明細書に記載されるように修飾された、エンテロコッカス（例えば、エンテロコッカス・フェシウムおよびエンテロコッカス・サーモフィルス）、ビフィドバクテリウム（例えば、ビフィドバクテリウム・ロングム、ビフィドバクテリウム・インファンティスおよびビフィドバクテリウム・ビフィダム）属、スポロラクトバチルス種、ミクロモノスポラ種、ミクロコッカス種、ロドコッカス種およびシュードモナス（例えば、シュードモナス・フルオレッセンスおよびシュードモナス・アエルギノーサ）由来の株もまた本発明の一部として含まれる。

適当な宿主株は、遺伝子操作が可能なものである、例えば、それらは発現コンストラクトを維持し、所望の最終産物の前駆体を蓄積し、例えばそれらはラクトースおよびGDP-フコースのプールを維持し、そして最終産物、例えば2'-FLを蓄積する。そのような菌株は、単塩および一般的に単一の炭素源を含む定義された最小培地において十分に成長する。上記のように所望のフコシル化オリゴ糖を生産するよう改変された菌株は、最少培地において生育される。バイオリアクタにおいて使用される例示的な最少培地である、最小「FERM」培地について、以下で詳述する。

Ferm（10リットル）：以下を含む最少培地：
40g (NH₄)₂HPO₄
100g KH₂PO₄
10g MgSO₄.7H₂O
40g NaOH
微量元素：
1.3g NTA（ニトリロ三酢酸）
0.5g FeSO₄.7H₂O
0.09g MnCl₂.4H₂O
0.09g ZnSO₄.7H₂O
0.01g CoCl₂.6H₂O
0.01g CuCl₂.2H₂O
0.02g H₃BO₃
0.01g Na₂MoO₄.2H₂O（pH 6.8）
水で10リットルに
DF204消泡剤（0.1ml/L）
150g グリセロール（初期バッチ生育）、その後に様々な時間、様々な速度で90％グリセロール-1％ MgSO₄-1X 微量元素を供給する流加モード。

適当な生産宿主細菌株は、そのフコシルトランスフェラーゼコード核酸配列が同定された元の細菌株と同一細菌株ではないものである。例えば、フコシルトランスフェラーゼコード核酸配列FutLは、ヘリコバクター・ムステラエにおいて同定され、適当な宿主株は、ヘリコバクター・ムステラエ以外の細菌であり、例えば、FutLは、生産宿主株大腸菌K12または上記の他の菌株のいずれかにおいて生産される。

本明細書に記載される特徴を有する細菌はラクトースの存在下で培養され、そしてフコシル化オリゴ糖は細菌自体または細菌の培養上清のいずれかから回収される。フコシル化オリゴ糖は、治療用もしくは栄養補給用製品において使用するために精製され、または細菌がそのような製品において直接使用される。

他の態様
本発明はその詳細な説明に関連して説明されているが、これまでの説明は例示を意図したものであり、発明の範囲を限定するものではなく、発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義されるものである。他の局面、利点および変更も添付の特許請求の範囲に包含される。

本明細書で言及されている特許および科学文献は、当業者が入手可能な知見を示すものである。本明細書で引用されているすべての米国特許および公開または未公開の米国特許出願は、参照により組み入れられる。本明細書で引用されているすべての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で引用されているアクセッション番号によって示されるGenBankおよびNCBI提出物は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で引用されているすべての他の公開された参考文献、書類、原稿および科学文献は、参照により本明細書に組み入れられる。

本発明は、その好ましい態様を参照して具体的に示され説明されているが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなくその中で形式および詳細に関する様々な変更がなされ得ることが当業者に理解されるであろう。

Claims

2'-FLを含む大腸菌細胞または大腸菌細胞溶解産物であって、該細胞または溶解産物は、該細胞または溶解産物からの2'-FLの精製の前に1,3フコシル化ラクトースを実質的に含まず、該大腸菌細胞は、ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む核酸コンストラクトを含み、該核酸は、宿主細菌生産株において該酵素の産生を誘導する1つまたは複数の異種制御配列に機能的に連結されており、該核酸によってコードされる該酵素のアミノ酸配列がSEQ ID NO:3、5、10または12に記載の配列を含む、大腸菌細胞または大腸菌細胞溶解産物。
ラクトース利用性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む核酸コンストラクトを含む単離された大腸菌であって、該核酸は、宿主細菌生産株において該酵素の産生を誘導する1つまたは複数の異種制御配列に機能的に連結されており、該核酸によってコードされる該酵素のアミノ酸配列がSEQ ID NO:3、5、10または12に記載の配列を含む、大腸菌。
低減されたレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性、不完全なコラン酸（colonic acid）合成経路、アデノシン-5'-三リン酸（ATP）依存性細胞内プロテアーゼの変異、lacA遺伝子の変異、及びthyA遺伝子の変異に特徴づけられ、SEQ ID NO:3、5、10または12に記載のアミノ酸配列を含む外因性ラクトース受容性α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸を含む、大腸菌。
前記大腸菌の内因性lacZ遺伝子および内因性lacI遺伝子が欠失または機能的に不活性化されている、請求項3記載の単離された大腸菌。
lacY遺伝子の上流にlacIq遺伝子プロモーターを含む、請求項4記載の単離された大腸菌。
大腸菌の内因性wcaJ遺伝子が欠失または機能的に不活性化されている、請求項3記載の単離された大腸菌。
ATP依存性細胞内プロテアーゼの変異が、lon遺伝子の変異である、請求項3記載の単離された大腸菌。
外因性ラクトースの存在下で細胞内ラクトースを蓄積する、請求項3記載の単離された大腸菌。
細胞内グアノシン二リン酸（GDP)-フコースを蓄積する、請求項3記載の単離された大腸菌。
遺伝子型ΔampC::P_trp ^BcI, Δ(lacI-lacZ)::FRT, P_lacIqlacY⁺, ΔwcaJ::FRT, thyA::Tn10, Δlon:(npt3,lacZ⁺)を有する、請求項3記載の単離された大腸菌。
大腸菌でフコシル化オリゴ糖を生産する方法であって、
請求項2〜10のいずれかに記載の大腸菌を提供する工程、
ラクトースの存在下で該大腸菌を培養する工程、および
該大腸菌または該大腸菌の培養上清からフコシル化オリゴ糖を回収する工程、
を含む、方法。
(a)前記大腸菌をトリプトファンの存在下およびチミジンの非存在下で培養する工程をさらに含む、
(b)ATP依存性細胞内プロテアーゼの変異が、lon遺伝子のヌル変異である、または
(c)前記大腸菌が、細胞内GDP-フコースを蓄積する、請求項11記載の方法。
前記大腸菌の内因性lacZ遺伝子および内因性lacI遺伝子が欠失している、任意で、前記大腸菌が、lacY遺伝子のすぐ上流にlacIq遺伝子プロモーターを含む、または、前記大腸菌の内因性wcaJ遺伝子が欠失している、請求項11記載の方法。
前記大腸菌が、外因性ラクトースの存在下で細胞内ラクトースを蓄積する、請求項11記載の方法。
フコシル化オリゴ糖が、2'-フコシルラクトース（2'-FL）またはラクトジフコテトラオース（LDFT）、ラクト-N-フコペンタオースI（LNF I）もしくはラクト-N-ジフコヘキサオースI（LDFH I）を含む、請求項11記載の方法。