CN112961888B - 一种重组酶在合成含有α-(1,2)糖苷键的葡聚糖中的应用 - Google Patents

一种重组酶在合成含有α-(1,2)糖苷键的葡聚糖中的应用 Download PDF

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Abstract

一种新型重组酶在合成含有α‑(1,2)糖苷键的葡聚糖中的应用，属于酶工程领域，该新型重组酶与UniProt数据库中编号为tll1591蛋白的序列一致性≥40％。温度‑20‑120℃条件下将浓度为0.001‑2000μg/ml的新型重组酶、浓度为0.0001‑1.5M的蔗糖和浓度为0.0001‑1.5M的UDP‑葡萄糖在pH1‑14的反应溶液中反应0.01‑960小时，反应过程中新型重组酶催化二磷酸尿苷葡萄糖上的葡萄糖以α键的形式转移到蔗糖上的葡萄糖的2号位，形成α‑(1,2)糖苷键，形成α‑(1,2)‑葡聚糖。本发明的新型重组酶可以广泛应用于工业生产含有α‑(1,2)糖苷键的葡聚糖。

Description

一种重组酶在合成含有α-(1,2)糖苷键的葡聚糖中的应用
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种重组酶在合成含有α-(1,2)糖苷键的葡聚糖中的应用。
背景技术
UniProt数据库中编号为tll1591的蛋白，其氨基酸序列为：MRIAQVAPLWERVPPPAYGGVELVVSLLTEELVKRGHEVTLFASGDSMTQAKLVSTYPHAIRLDPNVQEYAVYEALQLGEVFSRANEFDVIHSHVGYTALPYTSLVKTPVVHTLHGRFTADNERIFSQYRNQNYVSISHSQRQLRELNYIATVYNAIAVETHHFYPQPSDPPYLAFLGRLSPEKGPHHAIEIAKRVGIPLRMAGKVDRVDRDYFKELIEPHIDGEFIQFIGEADHPTKNALLGGAIAMLFPITWQEPFGLVMIESMAAGTPVVAIAKGAAPEVIEHGKTGFLCHSVEDCVAAVAQVPQLDRMACRDYVWQRFSVERMVSEYEAVYDTVLANTFVHNGHRRGTIELMAS。
UniProt数据库中编号为tll1591的蛋白，其基因表达产物是UDP-葡萄糖:蔗糖/α-1,2-葡萄糖α-1,2-葡萄糖基转移酶(UDP-Glc:sucrose/alpha-1,2-glucan alpha-1,2-glucosyltransferase)，是一种新型糖基转移酶类。酶学委员会(enzyme commission，EC)提出的酶的系统命名法中查询不到tll1591对应的EC编号。
截止目前，只有三种α-1,2-葡萄糖基转移酶被公开报道过。1、ALG10是真核细胞内质网腔中蛋白质N-糖基化的关键酶，属于α-1,2-葡萄糖基转移酶，可把多萜醇葡萄糖(dolichyl phosphate glucose)上的葡萄糖残基转移至Glc2Man9GlcNAc2上的葡萄糖残基上，以α-1,2糖苷键连接(The ALG10 locus of Saccharomyces cerevisiae encodes theα-1,2glucosyltransferase of the endoplasmic reticulum:the terminal glucose ofthe lipid-linked oligosaccharide is required for efficient N-linkedglycosylation，Glycobiology 1998,8(5),455-62.)。2、DSR-E来源于Leuconostocmesenteroides NRRL B-1299，属于糖苷水解酶家族70(GH70)(MolecularCharacterization of DSR-E,an-1,2Linkage-Synthesizing Dextransucrase with TwoCatalytic Domains，JBacteriol 2002,184(20),5753-61.)。DSR-E把蔗糖裂解成葡萄糖和果糖，并把葡萄糖残基转移至麦芽糖或者有α-1,6糖苷键连接的葡萄糖残基上，以α-1,2糖苷键连接(Structural Insights into the Carbohydrate Binding Ability of an-(132)Branching Sucrase from Glycoside Hydrolase Family 70*，J Biol Chem 2016,291(14),7527-40.)。3、WaaJ是一种大肠杆菌中的UDP-Glc:(glucosyl)LPSα-1,2-glucosyltransferase，可把UDP-葡萄糖上的葡萄糖残基转移至LPS外核心第二个葡萄糖残基上，以α-1,2糖苷键连接(Four critical aspartic acid residues potentiallyinvolved in the catalytic mechanism of Escherichia coli K-12WaaR，FEMSMicrobiol Lett 1999,174(1),105-9.)。以上三种酶和tll1591的催化机制完全不同，底物和产物也完全不同。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组酶在合成含有α-(1,2)糖苷键的葡聚糖中的应用。在本发明申请前，未见有催化同类化学反应酶的报道。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一种重组酶在合成含有α-(1,2)糖苷键的葡聚糖中的应用，所述重组酶与UniProt数据库中编号为tll1591蛋白的序列一致性≥40％。
作为优选的实施方式，所述重组酶与UniProt数据库中编号为tll1591蛋白的序列一致性为100％。
作为优选的实施方式，所述含有α-(1,2)糖苷键的葡聚糖为葡萄糖基蔗糖，其制备方法如下：
在温度为-20-120℃条件下，将浓度为0.001-2000μg/ml的重组酶、浓度为0.0001-1.5M的蔗糖和浓度为0.0001-1.5M的UDP-葡萄糖在pH 1-14的反应溶液中反应0.01-960小时，反应过程中，所述重组酶催化二磷酸尿苷葡萄糖上的葡萄糖以α键的形式转移到蔗糖上的葡萄糖的2号位，形成α-(1,2)糖苷键，形成葡萄糖基蔗糖。
作为优选的实施方式，所述葡萄糖基蔗糖的英文通式为：α-D-glucopyrano syl-(1-2)-[α-D-glucopyranosyl-(1-2)]n1-β-D-fructofuranosides，n1≥1，n1为正整数；所述葡萄糖基蔗糖含有一个果糖残基；所述葡萄糖基蔗糖的分子量≥0.5kD a；所述葡萄糖基蔗糖含有两个以上的葡萄糖残基。
作为优选的实施方式，所述含有α-(1,2)糖苷键的葡聚糖为糖原，其制备方法如下：
在温度为-20-120℃条件下，将浓度为0.001-2000μg/ml的重组酶、浓度为0.0001-1.5g/ml的糖原和浓度为0.0001-1.5M的UDP-葡萄糖在pH 1-14的反应溶液中反应0.01-960小时，反应过程中，所述重组酶将葡萄糖残基以α-(1,2)糖苷键的形式转移到糖原上，形成糖原。
作为优选的实施方式，所述糖原的英文通式为：糖原-[α-D-glucopyranosyl-(1-2)]n2+UDP，n2≥1，n2为正整数。
作为优选的实施方式，所述含有α-(1,2)糖苷键的葡聚糖为葡聚糖，其制备方法如下：
在温度为-20-120℃条件下，将浓度为0.001-2000μg/ml的重组酶、浓度为0.0001-1.5g/ml的葡聚糖和浓度为0.0001-1.5M的UDP-葡萄糖在pH 1-14的反应溶液中反应0.01-960小时，反应过程中，所述重组酶将葡萄糖残基以α-(1,2)糖苷键的形式转移到含有α-(1,4)糖苷键、α-(1,6)糖苷键、α-(1,3)糖苷键、α-(1,2)糖苷键、β-(1,2)糖苷键、β-(1,3)糖苷键、β-(1,4)糖苷键或β-(1,6)糖苷键的葡聚糖上，形成葡聚糖。
作为优选的实施方式，所述葡聚糖的英文通式为：葡聚糖-[α-D-glucopyranosyl-(1-2)]n3+UDP，n3≥1，n3为正整数。
作为优选的实施方式，所述重组酶的制备方法包括以下步骤：克隆或合成UniProt数据库中编号为tll1591的基因，构建过表达质粒，转化大肠杆菌感受态E.coli BL21(DE3)中，诱导表达重组酶，经纯化后获得重组酶。
本发明的有益效果是：
本发明通过克隆或合成UniProt数据库中编号为tll1591的基因，构建过表达质粒，转化大肠杆菌感受态E.coli BL21(DE3)中，诱导表达重组酶，经纯化后获得一种重组酶，该重组酶与UniProt数据库中编号为tll1591蛋白的序列(DNA序列或氨基酸序列)一致性(identity)≥40％。
本发明的重组酶能够催化二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-葡萄糖)上的葡萄糖以α键的形式转移到蔗糖上的葡萄糖的2号位，形成α-(1,2)糖苷键。反应过程为：重组酶+UDP-葡萄糖+蔗糖→α-D-glucopyranosyl-(1-2)-[α-D-glucopyranosyl-(1-2)]n1-β-D-fructofuranosides+UDP，其中n1≥1。
本发明的重组酶能够将葡萄糖残基以α-(1,2)糖苷键的形式转移到糖原或淀粉上，形成糖原或淀粉。反应过程：重组酶+UDP-葡萄糖+糖原→糖原-[α-D-glucopyranosyl-(1-2)]n2+UDP，其中n2≥1。
本发明的重组酶将葡萄糖残基以α-(1,2)糖苷键的形式转移到含有α-(1,4)糖苷键、α-(1,6)糖苷键、α-(1,3)糖苷键、α-(1,2)糖苷键、β-(1,2)糖苷键、β-(1,3)糖苷键、β-(1,4)糖苷键或β-(1,6)糖苷键的葡聚糖上，形成葡聚糖。反应过程为：重组酶+UDP-葡萄糖+葡聚糖→葡聚糖-[α-D-glucopyranosyl-(1-2)]n3+UDP，其中n3≥1。
综上，本发明利用一种重组酶催化合成含有α-(1,2)糖苷键的葡聚糖，其反应底物和反应原理均与现有技术中的酶催化底物及催化过程完全不同。本发明的一种重组酶可以广泛应用于工业生产含有α-(1,2)糖苷键的葡聚糖。其中的α-1,2葡聚糖可用于制备化妆品、药品、食品和工业用品，例如化妆品、凝胶、治疗消化道疾病的添加剂/药物、促进伤口愈合的药物、层析柱的填料、胶囊、抗生素和治疗肿瘤的药物、塑料等。
附图说明
图1为实施例1中所获得目的蛋白的SDS-PAGE分析结果。图中，M、非预染的蛋白质Marker；从左至右：1、诱导前菌液，2、诱导后菌液，3、裂解后上清，4、裂解后沉淀，5、酶切前蛋白，6、酶切12h后蛋白，7、酶切16h后蛋白，8、浓缩前蛋白。
图2为实施例5中对实施例2所得葡萄糖基蔗糖的薄层层析(TLC)结果。图中，1、不同大小的葡萄糖基蔗糖产物和蔗糖；2、蔗糖对照。
图3为实施例7中对实施例2所得α-(1,2)-葡聚三糖的核磁共振分析结果。A、葡聚三糖的结构；B、1H-NMR的实验结果；C、HMBC和HMQC的实验结果。
图4为实施例8中对实施例2、实施例3和实施例4所得产物的高效阴离子交换色谱(HPAEC)分析结果。1表示：实施例2所得葡萄糖基蔗糖的高效阴离子交换色谱(HPAEC)分析结果；2表示：实施例3所得糖原的高效阴离子交换色谱(HPAEC)分析结果；3表示：实施例4中所得葡聚糖的高效阴离子交换色谱(HPAEC)分析结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1重组酶的制备
(1)克隆或合成UniProt数据库中编号为tll1591的基因。
(2)构建过表达质粒
以合成tll1591基因或Thermosynechococcus elongatus菌液为模板进行PCR扩增。PCR的试剂组成为：5μL 5×Pfu buffer，1μL 10mM dNTP，10μM酶扩增所用的上下游引物各1μL，10ng模板，1μL Pfu DNA聚合酶，用ddH2O补足至50μL。反应程序为A.95℃5min，B.95℃30s，C.58℃30s，D.72℃2min，E.72℃10min，其中从B到D步骤循环30次，最后获得相关蛋白的基因的PCR产物。把扩增出来的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳的方法纯化一次。利用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切PCR产物1h，再用琼脂糖凝胶纯化酶切后的PCR产物，并测量浓度。按照PCR产物片段与线性载体质粒pET28a摩尔比3:1的比例进行DNA连接，连接酶为T4 DNA连接酶，16℃连接过夜。将8μL DNA连接产物转化到100μL感受态大肠杆菌DH5α中。把大肠杆菌DH5α铺于含有抗生素的LB固体培养基上，37℃过夜培养。第二天对生长出来的菌落进行菌落PCR验证。提取阳性克隆的质粒，并进行DNA测序。所有酶在大肠杆菌中异源表达所用到的质粒是pET15b、pET22b、pET28a、pET28a-EGFP等，这些融合蛋白都带his标签。
将所构建的tll1591-pET28a重组质粒转化至大肠杆菌感受态E.coli BL21(DE3)中，涂布于含有卡那抗性的LB固体培养基平板上，将LB固体培养基平板倒置于37℃恒温培养箱中培养14-16h。
(3)挑取单克隆菌落接种于10mL含卡那/氨苄抗性(10μL)的LB液体培养基中，37℃、180rpm过夜培养，将过夜培养的菌液扩大培养至1L含卡那抗性(1mL)的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养6-8h，加入诱导剂IPTG500μL，37℃、130rpm过夜诱导表达蛋白。
(4)诱导后，4500rpm、15min离心收集菌体，加入50mL蛋白裂解液吹悬菌体沉淀；利用超声细胞粉碎机破碎菌体，设置功率30％，开3s、关3s，12min，观察破碎效果，菌体澄清即裂解完成；收集裂解液，12000rpm高速离心20min，取出上清液装入50mL离心管中，加入已清洗好的Ni-NTA，4℃垂直混匀1h；倒入空的层析柱，待液体流出加入蛋白漂洗液，清洗三遍，洗去杂蛋白；用蛋白洗脱液洗脱目的蛋白；用考马斯蛋白定量法检测蛋白质浓度。
(5)蛋白透析及酶切：选用3.5kDa规格的透析袋，将目的蛋白放入透析袋中，用透析夹密封好，置于透析液中4℃条件下透析过夜，定期更换透析液。
透析后加入凝血酶(1mg蛋白:10U凝血酶)切除His标签，通过透析将His标签渗出，得到单纯的目的蛋白样品。
(6)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法检测目的蛋白：30μL的蛋白样品中加入10μL 4×SDS-PAGE Loading buffer，100℃加热10min，上样跑胶(120-220V)，电泳结束后，将SDS-PAGE胶完全浸入考马斯亮蓝染色液中，染色3-4h，加入脱色液，缓慢脱色直至蛋白条带清晰可见，用凝胶成像仪观察并拍照保存。
SDS-PAGE检测结果如图1所示，所制备的目的蛋白的分子量大小约为40kDa左右，与预期大小一致，条带清晰可见，纯度达到90％以上。
(7)SDS-PAGE检测后，由于目的蛋白的分子量大小约为40kDa左右，因此选用3.0kDa规格的超滤管进行浓缩。将酶切透析后的蛋白于4℃、12000rpm离心10min，取上清到浓缩管中，4℃、4000rpm缓慢浓缩，直到浓度达到30mg/mL，小量分装后置于-80℃保存备用。
实施例2重组酶催化合成葡萄糖基蔗糖
在温度为25℃条件下，将浓度为1μg/ml的实施例1所制备的重组酶、浓度为0.01M的蔗糖和浓度为0.01M的UDP-葡萄糖在pH8.0的反应溶液中反应6小时，催化葡萄糖基蔗糖的生成。
催化葡萄糖基蔗糖生成的具体过程为：
重组酶+UDP-葡萄糖+蔗糖→α-D-glucopyranosyl-(1-2)-[α-D-glucopyranosyl-(1-2)]n1-β-D-fructofuranosides+UDP，其中n1≥1，n1为正整数。
实施例3重组酶催化合成糖原
在温度为25℃条件下，将浓度为100μg/ml的重组酶、浓度为0.1g/ml的糖原和浓度为0.02M的UDP-葡萄糖在pH7.5的反应溶液中反应24小时，催化糖原的生成。
重组酶可将葡萄糖残基以α-(1,2)糖苷键的形式转移到糖原上，其催化糖原生成的具体过程为：
重组酶+UDP-葡萄糖+糖原→糖原-[α-D-glucopyranosyl-(1-2)]n2+UDP，其中n2≥1，n2为正整数。
重组酶催化合成淀粉的具体条件和过程同上。
实施例4重组酶催化合成葡聚糖
在温度为25℃条件下，将浓度为50μg/ml的重组酶、浓度为0.2g/ml的葡聚糖和浓度为0.04M的UDP-葡萄糖在pH7.5的反应溶液中反应24小时，催化葡聚糖的生成。
重组酶可将葡萄糖残基以α-(1,2)糖苷键的形式转移到含有α-(1,4)糖苷键、α-(1,6)糖苷键、α-(1,3)糖苷键、α-(1,2)糖苷键、β-(1,2)糖苷键、β-(1,3)糖苷键、β-(1,4)糖苷键或β-(1,6)糖苷键的葡聚糖上，其催化葡聚糖生成的具体过程为：重组酶+UDP-葡萄糖+葡聚糖→葡聚糖-[α-D-glucopyranosyl-(1-2)]n3+UDP，其中n3≥1，n3为正整数。
实施例5薄层层析(TLC)
展层剂配方：正丁醇:丙酮:水＝4:3:1(体积比)，现用现配，避光保存。
显色剂配方：2mL苯胺溶于48mL丙酮中得产物A，2g二苯胺溶于48mL丙酮中得产物B，17mL磷酸与3mL水混合得产物C，将产物A、B、C混合后放入棕色瓶中，避光处保存。
薄层层析(TLC)：将实施例2所得产物通过玻璃毛细管点样在靠近硅胶板一端的位置，通过展层剂作用使样品沿板上升；待溶剂被蒸发，分离成分的位置被确定，用显色剂显色，显色后在鼓风干燥箱中85℃显色10-15min，直到条带清晰为止，拍照保存。
薄层层析(TLC)结果如图2所示：反应中如果添加实施例1所制备的重组酶，那么TLC的结果显示有多个新的条带产生(图2中左边条带)，其中三个新条带分别是α-D-glucopyranosyl-(1-2)-[α-D-glucopyranosyl-(1-2)]1-β-D-fructofuranosides、α-D-glucopyranosyl-(1-2)-[α-D-glucopyranosyl-(1-2)]2-β-D-fructofuranosides和α-D-glucopyranosyl-(1-2)-[α-D-glucopyranosyl-(1-2)]3-β-D-fructofuranosides。反应中如果不添加实施例1所制备的重组酶，那么TLC的结果显示仅有蔗糖一个条带(图2中右边条带)。
实施例6质谱分析
利用质谱法分析实施例2所得产物的分子量。通过高分辨率质谱(MS)确认所得产物，将最终溶液直接注入配备电喷雾离子源(Thermo Fisher Scientific，美国)的Q-Exactive MS仪器中。MS数据以70000的分辨率在m/z为100-800的范围内采集。MS以负离子模式执行，并在以下优化参数下运行：喷涂电压，3.5kV；毛细管温度320度；鞘气流速，20任意单位；辅助气体流量，2个任意单位；S镜头RF电平为80％。
质谱法分析实施例2所得产物的分子量如表1所示。
表1
Figure GDA0003865817840000081
实施例7核磁共振分析
利用核磁共振法解析实施例2所得产物的结构。NMR测量是在具有5mm宽带反向探头和屏蔽z梯度的Bruker 600MHz光谱仪上进行的，使用可变温度控制器将温度调节到0.1K以内，将干燥样品溶于700微升D2O，丙酮蒸汽作为内参(δ1H＝2.22p.p.m,δ13C＝30.9p.p.m)，使用2D HMQC、HMBC、DQF COZY和TOCSY光谱进行结构阐明。
核磁共振分析结果如图3所示。核磁共振解析了α-1,2葡聚三糖(α-D-glucopyranosyl-(1-2)-[α-D-glucopyranosyl-(1-2)]3-β-D-fructofuranosides)的结构(图3A)。图3B是1H-NMR的结果，根据3JHH耦合常数和1JCH耦合常数(对于葡萄糖异构体b1和c1分别为170.4和170.5Hz)，并将α-1,2葡聚三糖的化学位移和蔗糖的标准化学位移进行对比，可以判定α-1,2葡聚三糖含有两个α-D-Glc和一个β-D-Fru。图3C是HMBC和HMQC的实验结果，据此共价键的类型可以判定两个葡萄糖之间(3JCb2-Hc1)的糖苷键为α-1,2糖苷键，而葡糖糖和果糖(3JCa2-Hb1)之间的糖苷键为α,β-1,2糖苷键。以上试验结果说明实施例1所制备的重组酶催化合成α-1,2葡聚糖。
实施例8高效阴离子交换色谱(HPAEC)分析
利用HPAEC法分析实施例2、实施例3和实施例4所得酶促反应产物。Dionex ICS-5000Plus离子色谱系统由ICS-5000+SP梯度泵、电化学检测器组成(金电极)和AS-AP自动进样器构成，安装上CarboPac PA20色谱柱后构成HPAEC。将样品溶解在去离子水中，并使用上述HPAEC系统在CarboPac PA200色谱柱上进行色谱分离，流动相为NaAc和NaOH。
高效阴离子交换色谱(HPAEC)分析结果如图4所示。图4中，左边的峰代表小分子量物质，右边的峰代表大分子量物质，每个峰和每个峰之间的差别是一个葡萄糖残基。图4中的1表示实施例2所得葡萄糖基蔗糖的高效阴离子交换色谱(HPAEC)分析结果，其中，最左边为蔗糖，右边的峰均为新生成的葡萄糖基蔗糖的峰。图4中的2表示：实施例3所得糖原的高效阴离子交换色谱(HPAEC)分析结果，其中，左边一个峰为低分子量糖原，其右边的峰均为新生成的含有α-(1,2)糖苷键的糖原的峰。图4中的3表示：实施例4中所得葡聚糖的高效阴离子交换色谱(HPAEC)分析结果，其中，左边一个峰为葡聚糖，其右边的峰均为新生成的含有α-(1,2)糖苷键的葡聚糖的峰。HPAEC的结果中每个峰代表一种α-1,2葡聚糖，并且相邻峰中的α-1,2葡聚糖的区别仅是一个葡萄糖残基。
通过高效阴离子交换色谱(HPAEC)分析可知：实施例1所制备的重组酶可以合成含有30个以上葡萄糖残基的葡聚糖，并且这些葡聚糖中含有α-(1,2)糖苷键。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure GDA0003865817840000111
Figure GDA0003865817840000121
SEQUENCE LISTING
<110> 东北师范大学
<120> 一种重组酶在合成含有α-(1,2)糖苷键的葡聚糖中的应用
<160> 1
<210> 1
<211> 358
<212> tll1591
<213> Artificial sequence
<400> 1
Met Arg Ile Ala Gln Val Ala Pro Leu Trp Glu Arg Val Pro Pro Pro AlaTyr Gly Gly Val Glu Leu Val Val Ser Leu Leu Thr Glu Glu Leu Val Lys Arg GlyHis Glu Val Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asp Ser Met Thr Gln Ala Lys Leu Val SerThr Tyr Pro His Ala Ile Arg Leu Asp Pro Asn Val Gln Glu Tyr Ala Val Tyr GluAla Leu Gln Leu Gly Glu Val Phe Ser Arg Ala Asn Glu Phe Asp Val Ile His SerHis Val Gly Tyr Thr Ala Leu Pro Tyr Thr Ser Leu Val Lys Thr Pro Val Val HisThr Leu His Gly Arg Phe Thr Ala Asp Asn Glu Arg Ile Phe Ser Gln Tyr Arg AsnGln Asn Tyr Val Ser Ile Ser His Ser Gln Arg Gln Leu Arg Glu Leu Asn Tyr IleAla Thr Val Tyr Asn Ala Ile Ala Val Glu Thr His His Phe Tyr Pro Gln Pro SerAsp Pro Pro Tyr Leu Ala Phe Leu Gly Arg Leu Ser Pro Glu Lys Gly Pro His HisAla Ile Glu Ile Ala Lys Arg Val Gly Ile Pro Leu Arg Met Ala Gly Lys Val AspArg Val Asp Arg Asp Tyr Phe Lys Glu Leu Ile Glu Pro His Ile Asp Gly Glu PheIle Gln Phe Ile Gly Glu Ala Asp His Pro Thr Lys Asn Ala Leu Leu Gly Gly AlaIle Ala Met Leu Phe Pro Ile Thr Trp Gln Glu Pro Phe Gly Leu Val Met Ile GluSer Met Ala Ala Gly Thr Pro Val Val Ala Ile Ala Lys Gly Ala Ala Pro Glu ValIle Glu His Gly Lys Thr Gly Phe Leu Cys His Ser Val Glu Asp Cys Val Ala AlaVal Ala Gln Val Pro Gln Leu Asp Arg Met Ala Cys Arg Asp Tyr Val Trp Gln ArgPhe Ser Val Glu Arg Met Val Ser Glu Tyr Glu Ala Val Tyr Asp Thr Val Leu AlaAsn Thr Phe Val His Asn Gly His Arg Arg Gly Thr Ile Glu Leu Met Ala Ser

Claims (3)

1.一种重组酶在合成含有α-(1,2)糖苷键的葡聚糖中的应用，所述重组酶与UniProt数据库中编号为tll1591蛋白的序列一致性为100%；
所述含有α-(1,2)糖苷键的葡聚糖为葡萄糖基蔗糖，其制备方法如下：
在温度为25℃条件下，将浓度为1μg/ml的重组酶、浓度为0.01 M的蔗糖和浓度为0.01M的UDP-葡萄糖在pH 8.0的反应溶液中反应6小时，反应过程中，所述重组酶催化二磷酸尿苷葡萄糖上的葡萄糖以α键的形式转移到蔗糖上的葡萄糖的2号位，形成α-(1,2)糖苷键，形成葡萄糖基蔗糖。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述葡萄糖基蔗糖的英文通式为：α-D-glucopyranosyl-(1-2)-[α-D-glucopyranosyl-(1-2)]n1-β-D-fructofuranosides，n1≥1，n1为正整数；所述葡萄糖基蔗糖含有一个果糖残基；所述葡萄糖基蔗糖的分子量≥0.5kDa；所述葡萄糖基蔗糖含有两个以上的葡萄糖残基。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组酶的制备方法包括以下步骤：克隆或合成UniProt数据库中编号为tll1591的基因，构建过表达质粒，转化大肠杆菌感受态E.coli BL21（DE3）中，诱导表达重组酶，经纯化后获得重组酶。
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