KR100735819B1 - 효소를 이용한 고순도 말토올리고당의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 신규 내열성 아밀레이즈(Pyrococcus furiosus thermostable amylase)를 이용한 고순도의 사슬형 말토올리고당의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 신규 내열성 아밀레이즈는 사이클로덱스트린의 환 구조를 개열하는 반응이 매우 빠르므로 이를 이용하여 사이클로덱스트린을 포함하는 기질로부터, 글루코오스 분자수가 6 내지 9개인 사슬형 말토올리고당을 효과적으로 제조할 수 있다.

파이로코커스 퓨리오서스, 내열성 아밀레이즈, 말토올리고당

Description

효소를 이용한 고순도 말토올리고당의 제조방법{ENZYMATIC PREPARATION OF HIGHLY PURIFIED MALTOOLIGOSACCHARIDE}

도 1은 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 신규 내열성 아밀레이즈를 이용하여 전분으로부터 직쇄상 말토헥사오스(G6, maltohexaose), 말토헵타오스(G7, maltoheptaose) 및 말토옥타오스(G8, maltooctaose)를 제조하는 공정도이다.

도 2는 파이로코커스 퓨리오서스 아밀레이즈의 당전이반응( transglycosylation reation)에 의한 사슬형 말토헵타오스, 말토옥타오스 및 말토노나오스(G9, maltononaose)를 제조하는 공정도이다.

도 3은 pETPFTA-6h의 벡터 맵(map)이다.

도 4는 pRARE의 벡터 맵이다.

도 5는 E. coli BL21(DE3)에서 생산된 파이로코커스 퓨리오서스 유래 아밀레이즈의 정제단계별 시료의 전기영동 사진이다.

도 6은 정제된 아밀레이즈 재조합 단백질의 MALDI-TOF MS(matrix associated laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry) 분석 결과이다.

도 7은 아밀레이즈 재조합 단백질의 다양한 pH 조건에 따른 효소활성을 나타낸 것이다.

도 8은 아밀레이즈 재조합 단백질의 pH 안정성을 나타낸 것이다.

도 9는 아밀레이즈 재조합 단백질의 온도에 따른 활성을 나타낸 것이다.

도 10은 아밀레이즈 재조합 단백질의 온도 안정성을 나타낸 그래프이다.

도 11은 아밀레이즈 재조합 단백질의 DSC(Differential Scanning Calorimetry) 결과이다.

도 12는 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 신규 내열성 아밀레이즈를 알파-, 베타-, 감마-사이클로덱스트린에 작용시킨 후 박막 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC)로 분석한 사진이다.

도 13은 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 신규 내열성 아밀레이즈를 베타-사이클로덱스트린에 첨가하고 반응시간에 따라 시료를 채취한 후 TLC로 분석한 사진이다.

도 14는 베타-사이클로덱스트린에 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 신규 내열성 아밀레이즈를 작용시킨 반응용액을 소수성 컬럼크로마토그래피를 이용하여 미 반응 베타-사이클로덱스트린을 제거한 후 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(High-Performance Anion Exchange Chromatography, HPAEC)로 분석한 결과이다.

도 15는 가용성 녹말에 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈를 반응시켜 얻은 알파-, 베타-, 및 감마-사이클로덱스트린 농축액을 다시 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 신규 내열성 아밀레이즈에 반응시킨 후 박막 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC)로 분석한 사진이다.

도 16은 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 신규 내열성 아밀레이즈를 알파-, 베타- 및 감마-사이클로덱스트린과 각각에 글루코오스가 함유된 용액에 첨가 하여 작용시킨 후 박막 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC)로 분석한 사진이다.

도 17은 실시예 6에 따른 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈 생산용 벡터맵이다.

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 신규 내열성 아밀레이즈를 이용한 사이클로덱스트린을 포함하는 기질로부터 고순도로 글루코오스 분자수 6-9개의 직쇄상 또는 측쇄상 말토올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

[종래기술]

말토올리고당은 단백질 변성방지 효과 및 식품의 마스킹(masking) 효과와 부드러운 식감부여등 식품분야에서 널리 이용되고 있는 기능성 당류이다. 말토올리고당은 말토오스(G2, maltose), 말토트라이오스(G3, maltotriose), 말토테트라오스(G4, maltotetraose) 및 말토펜타오스(G5, maltopentaose), 말토헥사오스(G6, maltohexaose), 말토헵타오스(G7, maltoheptaose), 말토옥타오스(G8, maltooctaose), 말토노나오스(G9, maltononaose)등을 포함한다.

말토헥사오스(G6), 말토헵타오스(G7) 및 말토옥타오스(G8)를 전분으로부터 생산하는 방법으로는 산 가수분해 방법과 효소를 이용한 방법이 주로 이용되고 있 다. 상기 효소를 이용한 방법으로는 미생물에서 유래한 알파-아밀레이즈를 전분에 작용시켜 말토헥사오스 및 말토헵타오스를 제조하는 방법이다. 그러나 상기 방법으로 제조하는 경우 말토헥사오스와 말토헵타오스의 수율이 저조하고, 글루코오스(G1, glucose), 말토오스(G2, maltose), 말토트라이오스(G3, maltotriose), 말토테트라오스(G4, maltotetraose) 및 말토펜타오스(G5, maltopentaose) 등이 다량으로 생성되어 이를 제거하기 위해 컬럼크로마토그래피, 유기용매를 이용한 분리 및 정제공정이 요구됨으로써 생산경비가 과다하게 소요될 뿐만 아니라 분리, 정제가 어려워 고 순도의 말토헥사오스 및 말토헵타오스를 얻기가 매우 어렵다(미국특허 제 5739024호; E. Ben Messaoud et al. Enzyme Microb . Technol. 34:662-666. 2004).

또한 말토옥타오스의 경우, 사이클로덱스트린에 사이클로말토덱스트리네이즈(CyclomaltoDextrinase, CDase)를 작용시켜 효소적으로 합성하는 방법이 보고되어 있다(Uchida et al. Carbohydr . Res. 287:271-274. 1996). 그러나 반응과정에서 말토오스, 말토트라이오스, 말토테트라오스 및 말토펜타오스가 다량으로 생성되어 생산 수율이 저조하고 또한 부산물을 제거하는 정제과정이 요구되는 문제점이 있다.

따라서, 부산물의 생성없이 고순도의 말토헥사오스, 말토헵타오스, 말토옥타오스 및 말토노나오스를 생산할 수 있는 방법의 개발이 요구된다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 상기 내열성 아밀레이즈의 사이클로덱스트린에 대한 개환 속도가 개환으로 생 성된 말토올리고당의 가수분해 속도에 비하여 매우 빠른 점을 이용하여 사이클로덱스트린으로부터 기타 소당류가 생성되지 않고 순도가 높은, 사이클로덱스트린을 포함하는 기질로부터 글루코오스 분자수 6이상의 말토올리고당을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 사이클로덱스트린을 포함하는 기질용액에, 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)에서 분리된 아밀레이즈를 0.04-0.1 unit(효소역가)/mg(사이클로덱스트린 기질양)으로 첨가하고, pH 4.0 내지 6.0 및 온도 65 내지 95 ℃에서 반응시켜, 글루코오스 분자수 6 내지 8개의 직쇄상 말토올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 사이클로덱스트린과 글루코오스를 추가로 포함하는 기질용액에, 상기 아밀레이즈를 0.2-0.5 unit(효소역가)/mg(사이클로덱스트린 기질양)으로 첨가하고, pH 4.0 내지 6.0 및 온도 65 내지 95 ℃에서 반응시켜, 글루코오스 분자수 6 내지 9개의 사슬형 말토올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 사이클로덱스트린을 포함하는 기질용액이 가용성 녹말에 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈를 반응시켜 얻은 것일 수 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)에서 분리된 아밀레이즈에 관한 것으로, 상기 아밀레이즈는 내열성이 우수한 효소이다.

본 발명에 따른 아밀레이즈는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 약 77,163 Da의 분자량을 갖는다.

본 발명의 아밀레이즈는 열 안정성 및 pH 안정성이 매우 우수하여, 60 내지 95 ℃에서 안정하며, pH 3 내지 11에서 안정성을 갖는다. 또한 아밀레이즈는 온도 65 내지 95 ℃에서, pH 4-6에서 효소활성을 갖는다. 바람직하기로는 효소활성을 갖는 범위는 온도 85 내지 90 ℃이며, pH는 4 내지 4.5이다. 상기 아밀레이즈는 알파-아밀레이즈와는 달리 열 안정성을 위해 칼슘 이온을 요구하지 않는다.

본 발명의 아밀레이즈를 코딩하는 염기서열은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 일예로 서열번호 1일 수 있다. 상기 염기서열은 하기 표 1a 내지 표 1b(서열번호 1) 및 표 2a 내지 표 2c(서열번호 2)와 같다.

본 발명의 아밀레이즈는 파이로코커스 퓨리오서스로부터 분리 또는 유전공학적인 방법으로 제조될 수 있다. 특히 아밀레이즈는 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵생물에서 유래된 진핵세포로부터 용이하게 생산할 수 있다. 일예로 본 발명에서는 아밀레이즈 생산방법을 제공한다.

아밀레이즈의 생산방법은 (a) 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)에서 분리된 아밀레이즈를 코딩하는 DNA 서열을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; (c) 상기 형질전환체를 배양하여 아밀레이즈를 생산하는 단계를 포함한다.

상기 아밀레이즈의 생산방법은 통상의 공지된 방법으로 용이하게 제조할 수 있으며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 자명한 것이다.

상기 (a) 단계에서, 아밀레이즈를 코딩하는 서열은 통상의 발현용 벡터, 예컨대 pET-22b(+) 벡터(프로모터: T7, 전사종결인자: T7, 선별마커: 암피실린 저항성 유전자)에 삽입하여 재조합 벡터를 제조할 수 있으나, 상기 발현용 벡터는 숙주세포의 종류에 따라 적합한 벡터를 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명에서는 일실시예로 도 3의 DNA 개열지도를 갖는 pETPFTA-6h 벡터를 제조하였다.

상기 (b) 단계는 형질전환하는 단계로, 숙주세포는 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵생물 유래 세포일 수 있으며, 예컨대 대장균, 유산균, 효모, 곰팡이 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 형질전환방법은 통상의 공지방법으로 용이하게 실시할 수 있다.

상기 (c) 단계는 형질전환체를 배양하는 단계로, 숙주세포에 따라 적합한 배지를 선택할 수 있으며, 배양 조건 역시 숙주세포에 따라 달리 적용할 수 있다. 본 발명의 일실시예로 제조한 Escherichia coli BL21(DE3)/pETPFRA-6h, pRARE는 2004년 12월 3일자로 대한민국 대전광역시 유성구 어은동에 소재한 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 10738BP를 부여받았다. 상기 Escherichia coli BL21(DE3)/pETPFRA-6h, pRARE(KCTC 10738BP)는 암피실린이 첨가된 LB배지에서 30 내지 37 ℃에서 배양하며 600nm에서 흡광도가 0.6이 되면 IPTG를 최종농도 0.1 내지 10 mM로 첨가하여 1 내지 5시간 배양하여, 다량의 아밀레이즈 재조합 단백질을 생산할 수 있다.

또한 아밀레이즈의 생산방법은 상기 (c) 단계이후에, 형질전환체 균체로부터 아밀레이즈 재조합 단백질을 정제하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 정제단계는 형질전환체 균체를 파쇄하는 단계, 상등액을 취하여 열처리하는 단계 및 상등액을 취하여 니켈 친화성 크로마토그래피를 실시하는 단계를 포함할 수 있다.

또한 본 발명에서는 아밀레이즈 재조합 단백질의 생산율을 향상시키기 위하여, 상기 단계들 중 (b) 단계에서 E. coli에서 흔하게 나타나지 않는 6개의 코돈(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)을 독립적으로 암호화하는 pRARE 플라스미드(클로람페니콜 내성)를 상기 (a) 단계에서 제조한 재조합 벡터와 동시에 숙주세포에 형질전환할 수 있다. 이 경우 상기 (a) 단계의 재조합 벡터만을 단독으로 형질전환한 경우에 비하여 아밀레이즈 재조합 단백질의 생산율이 30 내지 40 % 증가한다.

상기한 아밀레이즈 생산방법은, 모균주를 이용한 생산방법에 비하여 배양온도를 낮추어 실시함으로써 미생물 배양비용을 줄일 수 있는 효과가 있으며 또한 효소의 생산성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 아밀레이즈는 α-1,4 글루코시드 및 α-1,6 글루코시드 결합을 분해하는 효소적 특성을 포함한다. 즉, 아밀레이즈는 말토올리고당(maltooligosaccharides), 가용성 전분, 사이클로덱스트린(cyclodextrin),플루란(pullulan), 아카보오스(acarbose) 및 파라-나이트로페닐 말토펜타오사이드(pNPG5, p-nitrophenyl maltopentaoside)로 이루어진 군으로부터 선택된 기질에 작용하여 α-1,4 글루코시드 및 α-1,6 글루코시드 결합을 분해하여, 글루코오스, 말토오스, 말토테트라오스, 말토트라이오스, 판노오스, 아카비오신-글루코오스, 파라-나이트로페닐 글루코사이드(pNPG1, p-nitrophenyl glucoside), 파라-나이트로페닐 말토사이드(pNPG2, p-nitrophenyl maltoside) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 당화합물을 생성시킨다. 상기 말토올리고당의 예로는 말토트라이오스(G3, maltotriose), 말토테트라오스(G4, maltotetraose), 말토펜타오스(G5, maltopentaose), 말토헥사오스(G6, maltohexaose), 말토헵타오스(G7, maltoheptaose) 및 말토옥타오스(G8, maltooctaose) 등이 있으며, 사이클로덱스트린으로는 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린 및 감마-사이클로덱스트린이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

특히, 본 발명의 아밀레이즈는 사이클로덱스트린을 개환하여 말토올리고당을 형성시키며, 이때 형성된 말토올리고당을 가수분해시킨다. 이때, 사이클로덱스트린의 개환 속도는 말토올리고당의 가수분해 속도에 비하여 8 내지 9 배 빠르게 진행되어, 반응시간을 조절함으로써 개환 후 가수분해 되기전의 개환된 말토올리고당을 용이하게 수득할 수 있다. 예컨대 본 발명의 내열성 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 아밀레이즈는, 베타-사이클로덱스트린의 환 개열과 말토헵타오스 가수분해에 대하여 하기 표 3과 같은 반응속도를 갖는다. 베타-사이클로덱스트린에 대한 반응속도는 말토헵타오스에 대한 반응속도에 비하여 약 8.6배 높다.

기질	반응속도 (mmol/min)	상대적 반응속도
베타-사이클로덱스트린 β-CD	499.9	8.6
말토헵타오스 (G7)	58.3	1.0

구체적인, 사이클로덱스트린으로부터 개환된 말토올리고당 제조방법은, 상기 아밀레이즈를 사이클로덱스트린용액에 가한 후, pH 4.0 내지 6.0 및 온도 65 내지 95 ℃에서 반응시켜 개환된 말토올리고당을 제조하는 것이다. 또한 상기 반응시간, 즉 아밀레이즈와 사이클로덱스트린간의(0.04-0.1 unit, 효소 역가/mg, 사이클로덱스트린 기질의 양) 반응시간은 10 내지 60분 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 아밀레이즈에 대한 기질용액은 사이클로덱스트린을 포함하는 기질용액일 수 있다. 또한 상기 기질용액은 사이클로덱스트린과 글루코오스를 포함하는 혼합용액일 수 있다. 상기 사이클로덱스트린은 알파-사이클로덱스트린(G6), 베타-사이클로덱스트린(G7) 및 감마-사이클로덱스트린(G8)으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택될 수 있다. 사이클로덱스트린만을 기질용액으로 사용하는 경우에는 상기 아밀레이즈의 개환반응에 의해 알파-사이클로덱스트린(G6), 베타-사이클로덱스트린(G7) 및 감마-사이클로덱스트린(G8)는 각각 글로코오스가 알파-1,4 결합으로 연결된 말토헥사오스, 말토헵타오스, 및 말토옥타오스가 생성될 수 있다. 또한 글루코오스와 사이클로덱스트린을 포함하는 기질용액을 사용할 경우에는 상기 파이로코커스 퓨리오서스의 아밀레이즈의 개환 작용과 또 다른 활성인 당전이 작용에 의해서, 사이클로덱스트린이 개환되어 제조된 말토올리고당의 환원말단에 글루코오스를 알파-1,4 또는 알파-1,6으로 전이하여 글루코오스 분자수 6 내지 9의 사슬형 말토올리고당을 제조할 수 있다.

상기 사이클로덱스트린을 포함하는 기질용액은, 사이클로덱스트린을 용매에 용해한 용액이거나, 사이클로덱트린 용액일 수 있다.

상기 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈는 통상의 알려진 효소를 사용할 수 있다. 본 발명의 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈는 전기 효소를 생산하는 균주로부터 분리 또는 유전공학적인 방법으로 제조될 수 있으며, 상용화된 효소를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈의 생산방법은 통상의 공지된 방법으로 용이하게 제조할 수 있으며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 자명한 것이다. 시판되는 효소로는 Novozymes 사에서 판매하는 Toruzym등이 있다.

본 발명에 사용가능한 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈의 일예로는 호알카리성 Bacillus sp. I-5로부터 얻는 서열번호 5에 기재된 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈 유전자를 클로닝 후, E. coli MC1061에서 단백질 발현 후 정제해서 얻은 효소액일 수 있으며, 상기 효소는 최적온도와 pH는 각각 60℃, 6.0 이다. 상기 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈의 제조방법의 구체적인 예로는, (a) 호알칼리성 바실러스 sp. I-5에서 분리된 CGTase 코딩하는 DNA 서열(서열번호 5)을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계, (b) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계, (c) 상기 형질전환체를 배양하여 CGTase를 생산하는 단계로 진행된다. (a) 단계에서, CGTase를 코딩하는 서열은 통상의 발현용 벡터를 사용가능하며, 예로서 pBR322벡터에 amyR2 프로모터를 사용하였고 선별마커로 암피실린 저항성 유전자를 사용한다. (b) 단계는 형질전환하는 단계로, 숙주세포는 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵생물 유래 세포일 수 있으며, 예컨대 대장균, 유산균, 효모, 곰팡이 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.형질전환방법은 통상의 공지방법으로 용이하게 실시할 수 있다. (c) 단계에서 Escherichia coli MC1061를 숙주세포로 이용하여 pR2CGT 플라스미드를 트랜스포메이션한 형질 전환체를 암피실린이 첨가된 LB배지에서 37 ℃에서 15시간 배양하여, 다량의 CGTase 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 또한 상기 제조된 효소는 정제단계는 일반적인 CGTase의 정제 방법과 동일하게 수행할 수 있으며, 예컨대 형질전환체 균체를 파쇄하고, 상등액을 취하여 베타 사이클로덱스트린 친화성 크로마토그래피를 실시하여 정제할 수 있다. 상기 서열번호 5의 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈 유전자 염기서열은 표 4a 내지 표 4b와 같다.

상기 본 발명의 사이클로덱스트린으로부터 개환된 말토올리고당 제조방법은, 반응물을 소수성 컬럼크로마토 그래피를 실시하는 단계를 더욱 실시할 수 있다. 상기 소수성 컬럼크로마토 그래피를 통하여, 미반응 사이클로덱스트린은 사이클로덱린 환 내부의 소수성 특성으로 인해 선택적으로 수지에 결합되고 개환된 말토올리고당은 결합되지 않고 용출된다. 따라서, 용이하게 개환된 말토올리고당만을 분리할 수 있으며, 또한 미 반응 기질의 재사용을 위해 결합된 베타-사이클로덱스린은 90 ℃ 증류수로 용출시킬 수 있다(도 1).

소수성 컬럼크로마토 그래피는, 소수성 수지가 충진된 컬럼을 사용하여 실시할 수 있으며, 컬럼용매로는 물, 예켠대 증류수를 사용할 수 있다. 상기 소수성 수지는 통상적으로 시판되는 소수성 수지일 수 있으며, 예로는 부틸 세파로즈, 엠버라이트 XAD-4 HP 및 XAD-7 HP등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 사이클로덱스트린으로부터 글루코오스 분자수 6-8개의 직쇄상 말토올리고당 제조방법은, 고순도의 말토헥사오스, 말토헵타오스, 말토옥타오스를 용이하게 제조할 수 있다. 상기 각 말토올리고당은 혈중 아밀레이즈 활성 측정에 이용되는 고가의 진단 시약 원료용으로 이용될 수 있을 뿐만 아니라 화학시약용으로 사용 할 수 있다.

또한, 사이클로덱스트린과 글루코오스로부터 글루코오스 분자수 6-9개의 사슬형 말토올리고당 제조방법은, 고순도의 말토헥사오스, 말토헵타오스, 말토옥타오스 및 말토노나오스를 용이하게 제조할 수 있다. 상기 말토올리고당을 포함하는 혼합 농축액은 저감미 신소재로서 식품에 널리 활용될 수 있다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 내열성 파이로코커스 퓨리오서스로부터 아밀레이즈 유전자 클로닝 및 아밀레이즈 생산

1-1. 아밀레이즈 유전자 클로닝

파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) DSM 3638의 염색체 DNA는 North Carolina 주립대학 (Raleigh, NC)의 A. M. Grunden 박사로부터 제공받아서 사용하였다.

내열성 아밀레이즈 유전자를 분리하기 위하여 정방향 프라이머 PFTA-Fnd(서열번호 3), 역방향 프라이머 PFTA-Rxo(서열번호 4)를 각각 제작하고, 파이로코커스 퓨리오서스 염색체 DNA에 대해 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 서열번호 1의 염기서열을 갖는 약 2.0 kb의 PCR 산물을 수득하였다. 상기 PCR 산물은 제한효소 NdeI과 XhoI로 처리하고, 이를 동일한 제한 효소로 처리한 pET-22b(+) 발현벡터와 라이게이션하여 pETPFTA-6h를 제조하였다. 도 3에 pETPFTA-6h의 벡터 맵을 간략히 도시하였다. pETPFTA-6h 벡터는 아밀레이즈 유전자를 포함하며, 상기 아밀레이즈 유전자의 3' 말단에 8개의 부가적인 아미노산 잔기(Leu-Glu-6His)를 포함하고 있다. 상기실험에서 사용된 프라이머(서열번호 3,4)의 염기서열은 다음 표 5와 같다.

서열번호	염기서열
3	caattgctac acatatgtat aagctcg
4	gcggatgggt actcgaggag gcaccacct

형질전환을 위하여, 5 ml LB 액체 배지에 숙주 세포인 E. coli MC1016를 접종하여 37 ℃에서 12시간 배양하고, 배양액 1.0 ml을 새로운 LB 액체 배지 50 ml에 접종하여 600 nm에서 흡광도가 0.5가 될 때까지 배양하였다. 배양액 1.5 ml를 4 ℃에서 원심분리(7000 xg, 5분)하여 균체를 회수한 뒤 0.75 ml의 형질전환용액I(50 mM CaCl2)으로 현탁하고 얼음 속에서 30분간 방치하였다. 이후 원심분리(4 ℃, 6000 xg, 2분)하여 균체를 회수하고, 회수된 균체는 0.15 ml의 형질전환용액II(100 mM CaCl2)로 현탁하여 얼음 속에서 30분간 방치하였다. 현탁액 0.15 ml에 500 ng의 상기 라이게이션한 용액을 혼합하고, 얼음 속에서 1시간 방치한 후 42 ℃에서 2분간 열 충격을 주었다. 여기에 0.8 ml의 LB 액체 배지를 넣고 37 ℃에서 1시간 배양시킨 후, 암피실린(최종농도 100 μg/ml)을 함유한 LB 한천 배지에 평판 도말하여 내성을 보이는 균주를 1차 선별하였다.

1차 선별된 균주를 암피실린이 포함된 LB 액체 배지 5 ml에 접종하여 37 ℃에서 12시간 배양하고, 원심분리하여 균체를 수득하였다. 플라스미드 분리 키트로 회수된 균체로부터 플라스미드를 분리하고 NdeI과 XhoI제한 효소로 절단하여, 약 2.0 kb의 아밀레이즈 유전자가 포함되어 있음을 확인하였다.

1-2. 형질전환체 제조

상기에서 제조한 pETPFTA-6h 벡터를 E. coli BL21(DE3)로 형질전환시킨 후 암피실린 내성 균주를 선별하였다. 선별한 형질전환체I는 암피실린이 함유된 LB 액체 배지 2.5 L에 접종하여 37 ℃에서 배양하고 600 nm에서 흡광도가 0.6이 될 때 IPTG를 최종농도 1 mM로 첨가하여 3시간 배양하였다.

또한 효율적인 과발현을 위하여, E. coli에서 흔하게 나타나지 않는 6개의 코돈들(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)을 독립적으로 암호화하는 도 4의 pRARE 플라스미드(클로람페니콜 내성)를 재조합 발현 플라스미드 pETPFTA-6h와 함께 동시 형질전환 후, 암피실린과 클로람페니콜(최종농도 34 μg/ml) 내성을 보이는 균주를 형질전환주II로 선발하였다. 상기 pRARE는 6개의 코돈들(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)을 암호화하는 tRNA 유전자를 포함하고 있으며, 클로남페니콜 저항성 유전자 및 레플리콘(P15A ori)를 포함한다.

1-3. 정제

상기에서 선별한 2종의 형질전환주는 배양한 후 원심분리(4 °C, 7,000 xg, 30분)하여 균체를 회수하고, 300 mM NaCl과 10 mM 이미다졸이 함유된 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)에 현탁한 후 초음파 분쇄하였다. 원심분리하여 상등액을 취하고, 70 ℃에서 20분간 열처리한 다음 원심분리(10,000 xg, 30분)하여 상등액을 수득하였다. 상등액은 Ni-NTA 친화 크로마토그래피에 주입하여, 정제하였다.

도 5는 E. coli BL21(DE3)에서 생산된 파이로코커스 퓨리오서스 유래 아밀레이즈의 정제단계별 시료의 전기영동 사진으로, M은 사이즈 마커이고, 레인1은 E. coli BL21(DE3)/pETPFTA-6h 형질전환주를 초음파 분쇄하여 수득한 상등액이고, 레인2는 E. coli BL21(DE3)/pETPFTA-6h/pRARE 형질전환주를 초음파 분쇄하여 수득한 상등액이고, 레인3은 상기 “2”의 시료를 70 ℃에서 20분간 열처리한 것이고, 레인4는 Ni-NTA 친화 크로마토그래피로 정제한 아밀레이즈 재조합 단백질이고 레인5는 상기 레인4의 아밀레이즈 재조합 단백질에 가용성 전분을 기질로 반응시킨 것이다.

도 5에 나타난 바와 같이, E. coli BL21(DE3)/pETPFTA-6h 형질전환주는 E. coli BL21(DE3)/pETPFTA-6h/pRARE 형질전환주에 비하여 아밀레이즈 재조합 단백질의 발현율이 낮았다. 고세균 유전자들의 E. coli에서 비효율적인 발현은 E. coli 세포 내에서 좀처럼 이용되지 않는 AGA, AGG의 알지닌, AUA의 아이소루신 및 GGA의 글라이신 코돈들을 많이 이용하기 때문이라는 사실이 알려져 있다. 본 발명의 아밀레이즈 유전자에는 알지닌인 경우는 40개 중에서 38개, 아이소루신은 47개 중에서 17개, 글라이신은 44개 중에서 23개가 상기 코돈에 해당되어, E. coli BL21(DE3)/pETPFTA-6h 형질전환주에서 아밀레이즈 재조합 단백질의 발현이 낮은 것으로 생각된다. 이에 E. coli 세포 내에서 단백질 발현을 증가하기 위하여, 상기 코돈들을 독립적으로 가지고 있는 pRARE 플라스미드를 pETPFTA-6h 벡터와 동시에 E. coli에 도입시킨 것이다. 그 결과, 도 5에서 확인된 바와 같이 E. coli BL21(DE3)/pETPFTA-6h/pRARE 형질전환주에서 아밀레이즈 재조합 단백질 발현이 현저히 증가되었다.

또한 아밀레이즈 재조합 단백질은 열처리(도 5의 레인3) 및 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피(도 5의 레인4) 과정을 통하여 효율적으로 정제되어, SDS-PAGE상에서 약 70,000 Da의 분자량을 나타내었으며, 가용성 전분을 기질로 반응시키고 아이오다인 용액으로 염색하였을때 동일 위치에서 효소역가를 나타내었다(도 5의 레인5).

도 6은 정제된 아밀레이즈 재조합 단백질의 MALDI-TOF MS(matrix associated laser desorption ionization - time-of-flight mass spectrometry) 분석 결과로, 아밀레이즈의 아미노산 서열로부터 유추된 이론적 분자량인 77,149 Da과 거의 동일한 값인 분자량이 77,163 Da 이었다.

실시예 2: 파이로코커스 퓨리오서스 유래 아밀레이즈의 특성

2-1. 효소 역가

50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.5)에 용해된 1 (w/v)% 베타-사이클로덱스트린 기질 용액 150 ㎕에 동일 완충용액 120 ㎕을 넣고 90℃에서 5분간 열처리한 후 적절히 희석된 실시예 1에서 정제한 아밀레이즈 30 ㎕을 넣고 90 ℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 3,5-디나이트로살리실릭산(DNS)를 넣어 반응을 중단시킨 뒤 5분간 끓여 발색시켜 575 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 말토오스 표준 곡선과 비교하여 1분당 1μmol의 말토오스를 생산하는 효소량을 1 단위(unit)로 정하였다.

2-2. pH 특성

효소의 최적 pH를 결정하기 위해, 다양한 pH 범위의 베타-사이클로덱스트린 용액에 대한 상대적 역가를 측정하였다.

50 mM 소듐 시트레이트 완충액(pH 3.0-4.0), 50 mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 4.0-6.0), 50 mM 소듐 포스페이트 완충액(pH 6.0-7.5) 및 50 mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5-8.0) 각각에 용해된 1 (w/v)% 베타-사이클로덱스트린 기질 용액 150 ㎕에 각각의 완충용액 120 ㎕을 넣고 90 ℃에서 5분간 열처리한 후 정제한 아밀레이즈 30 ㎕을 넣고 90 ℃에서 10분간 반응시켜, 상대적 효소활성을 측정하였다.

도 7은 아밀레이즈 재조합 단백질의 다양한 pH 조건에 따른 효소활성을 나타낸 것으로, 아밀레이즈는 pH 4.5에서 최적의 역가를 가지며 pH 4.0 내지 6.0에서 50 % 이상의 역가를 유지하였다.

또한, 아밀레이즈의 pH 안정성을 측정하기 위하여, 효소액(최종 농도 0.1 mg/ml)은 37 ℃에서 24시간 동안 다양한 pH 범위의 0.1 M 브리턴-로빈슨(Britton-Robinson) 완충액에서 방치한 후, 잔존하는 효소 역가는 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.5)에 용해된 1 (w/v)% 베타-사이클로덱스트린 기질 용액 150 ㎕에 동일 완충용액 120 ㎕을 넣고 90 ℃에서 5분간 열처리한 후 상기 아밀레이즈 30 ㎕을 넣고 90 ℃에서 10분 동안 반응시켜, 상대적 효소활성을 측정하였다.

도 8은 아밀레이즈 재조합 단백질의 pH 안정성을 나타낸 것으로, pH 3.0 내지 11.0 의 넓은 pH 범위에서 안정한 상태로 유지됨을 확인할 수 있었다.

2-3. 온도 특성

아밀레이즈 재조합 단백질의 최적 온도를 결정하기 위해, 50 mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 4.5)에 용해된 1 (w/v)% 베타-사이클로덱스트린 기질 용액 150 ㎕에 동일 완충용액 120 ㎕을 넣고 55 ℃에서 110 ℃ 범위의 다양한 온도에서 5분간 열처리한 후 정제한 아밀레이즈 30 ㎕을 넣고 각각의 온도에서 10분 동안 반응시켜, 상대적 효소활성을 측정하였다.

도 9는 아밀레이즈 재조합 단백질의 온도에 따른 활성을 나타낸 것으로, 90 ℃에서 최적 역가를 보였으며 75 내지 92 ℃에서 약 80 %의 역가를 유지하였다.

온도 안정성 조사를 위해, 50 mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 5.0)에 투석된 효소액(최종 농도 0.1 mg/ml)을 85 ℃에서 100 ℃ 범위의 서로 다른 온도에서 다양한 시간대별로 취한 후, 잔존하는 효소 역가는 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.5)에 용해된 1 (w/v)% 베타-사이클로덱스트린 기질 용액 150 ㎕에 동일 완충용액 120 ㎕을 넣고 90 ℃에서 5분간 열처리한 후 상기 반응된 아밀레이즈 30 ㎕을 넣고 90 ℃에서 10분 동안 반응시켜, 상대적 효소활성을 측정하였다.

도 10은 아밀레이즈 재조합 단백질의 온도 안정성을 나타낸 그래프로, 85 ℃에서 120분 동안 방치한 후에도 역가가 전혀 감소하지 않을 정도로 매우 높은 열 안정성을 보였으며, 100 ℃에서 60분 동안 방치한 후에는 효소 역가의 30 % 이상이 유지되었다. 아밀레이즈 재조합 단백질의 반감기(half-life)는 90 ℃에서 398분, 95 ℃에서 114분이다.

2-4. DSC(Differential Scanning Calorimetry) 분석

아밀레이즈 재조합 단백질의 용융 온도(melting temperature)를 분석하기 위해서 DSC를 실시하였다. 정제된 아밀레이즈 재조합 단백질은 50 mM 소듐 포스페이트 완충액(pH 7.0)에 1 mg/ml의 농도로 현탁한 후, 시료는 분당 1 ℃의 속도로 25 내지 125 ℃ 사이의 온도에서 분석되었다.

도 11은 아밀레이즈 재조합 단백질의 DSC 결과로, 아밀레이즈 재조합 단백질의 용융 온도는 104.3 ℃로 매우 높은 열 안정성을 나타내었으며 91.7 ℃에서 효소의 단량체에서 기인된 작은 흡열 변곡점을 보였다.

실시예 3: 사이클로덱스트린 환 개열 속도와 G7 -올리고당의 가수분해 속도 비교

기질로서 베타-사이클로덱스트린과 말토헵타오스에 대한 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 신규 내열성 아밀레이즈의 가수분해 속도를 각각 측정하였다.

50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.5)에 용해된 1 (w/v)% 기질 용액 150 ㎕에 동일 완충용액 120 ㎕을 넣고 90 ℃에서 5분간 열처리한 후 실시예 1-3의 아밀레이즈 30 ㎕(0.07 unit)를 넣고 90 ℃에서 2 내지 10분 동안 50 ㎕씩 반응 시료를 취한 후 끓는 물에서 15분간 가열하여 반응을 종결시켰다. 기질인 베타-사이클로덱스트린이나 말토헵타오스가 가수분해되는 양은 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(High-Performance Anion Exchange Chromatography, HPAEC)를 이용하여 측정하였다.

하기 표 6은 베타-사이클로덱스트린의 환 개열 반응속도와 말토헵타오스 가수분해 반응속도를 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분석한 후 정량한 결과를 나타낸 것이다.

기질	반응속도 (mmol/min)	상대적 반응속도
베타-사이클로덱스트린 (β-CD)	499.9	8.6
말토헵타오스 (G7)	58.3	1.0

실시예 4: 사이클로덱스트린으로부터 말토헥사오스 , 말토헵타오스 및 말토옥 타오스의 제조

4-1. 말토헥사오스, 말토헵타오스 및 말토옥타오스의 제조

50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.5)에 용해된 1 (w/v)% 알파-, 베타- 및 감마-사이클로덱스트린 각각의 기질 용액 450 ㎕에, 동일 완충용액 360 ㎕을 넣고 90 ℃에서 5분간 열처리한 후 실시예 1-3의 아밀레이즈 90 ㎕(0.22 unit)를 넣고 90 ℃에서 10 내지 60분 동안 반응시켰다. 반응 후 반응액을 끓는 물에서 15분간 가열하여 반응을 종결시켰다.

4-2. 반응액의 박막 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC) 분석

실시예 4-1에서 반응 후, 반응액은 박막 크로마토그래피를 이용하여 반응산물을 분석하였다.

각 시료를 Whatman K5F 실리카겔 TLC 플레이트에 1 ㎕씩 로딩하고, 아이소프로필 알코올, 에틸 아세테이트 및 증류수의 비가 3:1:1(v/v/v)인 전개액에서 1회 전개시킨 후, 건조시켜 0.3 %(w/v) N-(1-나프틸)-에틸렌다이아민과 5 %(w/v) 황산을 함유한 메탄올에 담갔다 꺼낸 후 110 ℃ 오븐에서 10분 동안 발색시켰다.

도 12는 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 신규 내열성 아밀레이즈에 의한 알파-, 베타-, 감마-사이클로덱스트린 기질 분해 결과를 보여주는 박막 크로마토그래피 사진으로, M은 말토올리고당 표준 물질이고, 레인1은 기질로 알파-사이클로덱스트린을 사용한 것이고, 레인2는 기질로 베타-사이클로덱스트린을 사용한 것이고, 레인3은 기질로 감마-사이클로덱스트린을 사용한 것이다.

도 12에서, 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 신규 내열성 아밀레이즈는 기질인 알파-사이클로덱스트린을 가수분해하여 말토헥사오스를 주 반응산물로 생성하였고, 베타-사이클로덱스트린을 가수분해하여 주 반응산물로 말토헵타오스를 생성하였고, 또한 감마-사이클로덱스트린을 가수분해하여 주 반응산물로 말토옥타오스를 생성하였다. 따라서, 상기 효소는 사이클로덱스트린의 환 구조를 용이하게 개열하는 것을 알 수 있다.

도 13는 기질로서 베타-사이클로덱스트린에 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 신규 내열성 아밀레이즈를 반응시킨 후 시간에 따른 가수분해 산물을 보여주는 박막 크로마토그래피 사진으로, M은 말토올리고당 표준 물질이고, 레인1 내지 레인4는 각각 반응시간 10분, 20분, 40분 및 60분간 반응시킨 것이다.

도 13에서, 아밀레이즈는 빠른 속도로 기질인 베타-사이클로덱스트린의 환 구조를 개열한 후, 주 반응산물로 생성된 말토헵타오스는 서서히 가수분해 됨을 알 수 있다.

따라서 이와 같은 사이클로덱스트린의 환 개열속도와 말토헵타오스 가수분해 속도가 크게 차이가 나므로, 이를 이용하여 알파-, 베타-, 감마-사이클로덱스트린의 환 구조를 개열하여 각각 말토헥사오스, 말토헵타오스 및 말토옥타오스를 다량으로 생성하고, 효소 역가와 반응시간을 단축함으로써 말토헥사오스, 말토헵타오스 및 말토옥타오스의 가수분해를 최소화하는 반응조건을 용이하게 조절 할 수 있다.

실시예 5: 고 순도 말토헥사오스 , 말토헵타오스 및 말토옥타오스 제조

5-1.말토헥사오스, 말토헵타오스 및 말토옥타오스의 분리 및 정제

실시예 4-1에서 90℃에서 10분 동안 반응시켜 제조된 말토헵타오스 및 말토옥타오스를 소수성 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분리 및 정제 하였다.

약 5 ml의 부틸 세파로스(butyl-separose) 수지를 컬럼에 충진 한 후 증류수 20 ml을 흘려보내 컬럼을 안정화 시키고, 실시예 4-1에서 얻은 반응액을 주입하였다. 사이클로덱스린 환 내부의 소수성 특성으로 인해 미 반응 사이클로덱스린은 선택적으로 수지에 결합되고, 말토헥사오스, 말토헵타오스 및 말토옥타오스는 결합되지 않고 용출되었다. 미 반응 기질의 재사용을 위해 결합된 사이클로덱스린은 90 ℃ 증류수로 용출한다.

5-2. 순도 분석

실시예 5-1에서 수득한 용출액을 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분석하였다.

시료는 용출액을 초순수로 100배 희석하여 0.45 ㎛ 박막여과지로 여과하여 20 ㎕를 주입하였고, 유속은 분당 1 ml로 하였다. HPAEC 분석은 Dionex사(미국)의 GP40 그래디언트 펌프와 ED40 전기화학적 검출기 및 카보팩-컬럼(CarboPac PA1)을 이용하여 시행하였으며, A 용매로는 150 mM의 가성소다액을 사용하였으며, A 용매에 600 mM 소듐 아세테이트를 녹인 것을 B 용매로 하여 40분후에 B 용매가 40분 동안 0에서 40 %가 되도록 직선적으로 농도구배를 걸어주었다.

도 14는 분리한 말토헵타오스의 순도를 분석한 것으로, 미 반응 베타-사이클로덱스트린은 소수성 컬럼크로마토그래피를 이용하여 비교적 간단히 제거되어 고 순도 말토헵타오스만이 쉽게 분리, 정제됨을 알 수 있다. 함유된 전체 올리고당에 대한 말토헵타오스의 순도는 약 90 %였다.

표 7은 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 통하여 분석한, 상기 실시예 5-1의 용출물의 조성이다.

조성	(%)
글루코오스	0.6
말토오스	0.3
말토트라이오스	1.1
말토테트라오스	1.3
말토펜타오스	0.5
말토헥사오스	1.4
미지 당화합물	6.1
말토헵타오스	88.7

실시예 6: 효소를 이용한 녹말용액으로부터 말토헥사오스 , 말토헵타오스 및 말토옥타오스 농축액의 제조

50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 6.0)에 용해된 4 (w/v)% 가용성 녹말 기질 용액 500 ㎕에 동일 완충용액 400 ㎕을 넣고 60 ℃에서 5분간 열처리하였다.

상기 열처리된 용액에 서열번호 5의 유전자서열을 갖는 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈 유전자를 유전공학적 방법으로 생산 및 정제하여 1mg/ml 농도의 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈를 50 ㎕으로 넣고 60 ℃에서 30분간 반응 시켜 알파- 베타- 및 감마-사이클로덱스트린을 생성하였다. 상기 효소를 생산하기 위해서, 호알카리성 Bacillus sp. I-5로부터 서열번호 5의 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈 유전자를 amyR2 프로모터를 사용하였고 선별마커로 암피실린 저항성 유전자를 갖는 pBR322벡터에 클로닝하고(도 17 참조), E. coli MC1061에서 암피실린이 첨가된 LB배지에서 37 ℃에서 15시간 배양하여, 다량의 CGTase 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 단백질 발현 및 정제해서 얻은 암피실린이 첨가된 LB배지에서 37 ℃에서 15시간 배양하여, 다량의 CGTase 재조합 단백질을 생산한 후에, 형질전환체 균체를 파쇄하고, 상등액을 취하여 베타 싸이클로덱스트린 친화성 크로마토그래피를 실시하여 정제하여 사용하였다.

반응 후 반응액을 끓는 물에서 5분간 가열하여 반응을 종결시켰다. 얻어진 반응액에 실시예 1-3의 아밀레이즈 50 ㎕(3 unit)를 넣고 85 ℃에서 60분 동안 반응시켜 환 구조를 개열하였다. 반응 후 반응액을 끓는 물에서 15분간 가열하여 반응을 종결시켰다. 반응액은 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분석하였다.

도 15는 가용성 녹말에 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈를 반응시켜 얻은 알파-, 베타-, 및 감마-사이클로덱스트린 농축액을 다시 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 신규 내열성 아밀레이즈에 반응시켜 말토헥사오스, 말토헵타오스 및 말토옥타오스의 농축액을 제조한 결과를 보여주는 음이온 교환 크로마토그래피 그림으로, (A)는 아밀레이즈 반응전 사이클로덱스트린 농축액이며, (B)는 아밀레이즈 반응후 생성된 말토헥사오스, 말토헵타오스 및 말토옥타오스의 농축액이다.

도 15에서, 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 신규 내열성 아밀레이즈는 알파-, 베타- 및 감마-사이클로덱스트린을 효과적으로 가수분해하여 말토헥사오스, 말토헵타오스 및 말토옥타오스 농축액을 생성함을 알 수 있다.

실시예 7: 당전이 반응에 의한 특수 올리고당 혼합물의 제조

50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 4.5)에 용해된 10 (w/v)% 알파-사이클로덱스트린과 30 (w/v)% 글루코오스 용액, 10 (w/v)% 베타-사이클로덱스트린과 30 (w/v)% 글루코오스 용액 및 10 (w/v)% 감마-사이클로덱스트린과 30 (w/v)% 글루코오스 용액 1 ml에, 실시예 1-3의 신규 내열성 아밀레이즈를 각각 25 ㎕(4.5 unit) 넣고 80 ℃에서 60분 동안 반응 후 반응액을 끓는 물에서 15분간 가열하여 반응을 종결시켰다. 반응액은 박막 크로마토그래피를 이용하여 반응산물을 분석하였다.

도 16은 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 신규 내열성 아밀레이즈에 의해 각각 알파-, 베타- 및 감마-사이클로덱스트린과 글루코오스의 당전이 반응으로부터 생성된 생성물을 보여주는 박막 크로마토그래피 사진으로, M은 말토올리고당 표준 물질이고, 레인1은 기질로 알파-사이클로덱스트린과 글루코오스를 사용한 것이고, 레인2는 베타-사이클로덱스트린과 글루코오스 사용한 것이고, 레인3은 기질로 감마-사이클로덱스트린과 글루코오스를 사용한 것이다.

도 16에서, 파이로코커스 퓨리오서스에서 분리된 신규 내열성 아밀레이즈는 알파-, 베타-, 감마-사이클로덱스트린의 환 구조를 개열하고 생성된 말토올리고당의 환원말단에 글루코오스를 알파-1,4 및 알파-1,6으로 전이하는 당전이 반응을 하여 각각 특수 올리고당 혼합물 A(직쇄상 말토헥사오스, 말토헵타오스, 및 환원말단의 글루코오스가 알파-1,6으로 연결된 측쇄상 말토헵타오스), 특수 올리고당 혼합물 B(직쇄상 말토헵타오스, 말토옥타오스 및 환원말단의 글루코오스가 알파-1,6으로 연결된 측쇄상 말토옥타오스) 및 특수 올리고당 혼합물 C(직쇄상 말토옥타오스, 말토노나오스 및 환원말단의 글루코오스가 알파-1,6으로 연결된 측쇄상 말토노나오스)를 효과적으로 생성하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 아밀레이즈의 사이클로덱스트린 개환 반응을 이용한 직쇄상 말토헥사오스, 말토헵타오스 및 말토옥타오스의 제조방법 및 이들을 포함한 직쇄상 말토노나오스 및 측쇄상 말토헵타오스, 말토옥타오스 및 말 토노나오스 혼합 농축액을 제공함으로써, 고 순도의 직쇄상 말토헥사오스, 말토헵타오스 및 말토옥타오스를 쉽고 간단하면서 저가의 비용으로 제조할 수 있으며, 제조된 직쇄상 말토헥사오스, 말토헵타오스 및 말토옥타오스는 진단 의학 시약용 및 화학시약용으로 사용될 수 있다. 또한 이들을 포함한 직쇄상 말토노나오스 및 측쇄상 말토헵타오스, 말토옥타오스 및 말토노나오스 혼합 농축액은 식품에 사용될 수 있다.

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Claims (7)

1. 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린 및 감마-사이클로덱스트린으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 사이클로덱스트린을 포함하는 기질용액에, 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)에서 분리된 아밀레이즈를 pH 4.0 내지 6.0 및 온도 65 내지 95 ℃에서 반응시켜, 글루코오스 분자수 6 내지 8개의 사슬형 말토올리고당으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 제조하는 사슬형 말토올리고당 제조방법으로서,

   상기 아밀레이즈는 사이클로덱스트린 개환 활성과 사슬형 말토올리고당의 가수분해 활성을 가지고, 개환으로 생성된 사슬형 말토올리고당의 가수분해 활성에 비해 8배 내지 9배 높은 사이클로덱스트린 개환 활성을 가지며,

   글루코오스 분자수 6 내지 8개의 사슬형 말토올리고당으로 이루어진 군으로부터 선택된 사슬형 말토올리고당 함량이 가장 높은 시점을 반응종료 시점이 되도록 상기 아밀레이즈와 사이클로덱스트린의 반응을 10분 내지 60분 동안 수행하는 것인, 고순도의 글루코오스 분자수 6개 내지 8개의 사슬형 말토올리고당으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 제조하는 사슬형 말토올리고당 제조방법.
2. 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린 및 감마-사이클로덱스트린으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 사이클로덱스트린 및 글루코오스를 포함하는 기질용액에, 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)에서 분리된 아밀레이즈를 pH 4.0 내지 6.0 및 온도 65 내지 95 ℃에서 반응시켜, 글루코오스 분자수 6 내지 9개의 사슬형 말토올리고당으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 제조하는 사슬형 말토올리고당 제조방법으로서,

   상기 아밀레이즈는 사이클로덱스트린 개환 활성과 사슬형 말토올리고당의 가수분해 활성을 가지고, 개환으로 생성된 사슬형 말토올리고당의 가수분해 활성에 비해 8배 내지 9배 높은 사이클로덱스트린 개환 활성을 가지며,

   글루코오스 분자수 6 내지 9개의 사슬형 말토올리고당으로 이루어진 군으로부터 선택된 사슬형 말토올리고당 함량이 가장 높은 시점을 반응종료 시점이 되도록 상기 아밀레이즈와 사이클로덱스트린의 반응을 10분 내지 60분 동안 수행하는 것인, 고순도의 글루코오스 분자수 6개 내지 9개의 사슬형 말토올리고당으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 제조하는 사슬형 말토올리고당 제조방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린을 포함하는 기질용액은, 가용성 녹말에 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈를 반응시켜 얻은 사이클로덱스트린 용액인 사슬형 말토올리고당 제조방법.
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5. 제 1항에 있어서, 상기 아밀레이즈는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)에서 유래된 아밀레이즈인, 사슬형 말토올리고당 제조방법.
6. 제 2항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린을 포함하는 기질용액은, 가용성 녹말에 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈를 반응시켜 얻은 사이클로덱스트린 용액인 사슬형 말토올리고당 제조방법.
7. 제 2항에 있어서, 상기 아밀레이즈는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)에서 유래된 아밀레이즈인, 사슬형 말토올리고당 제조방법.

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