KR101014802B1

KR101014802B1 - 복합 탈분지 효소를 이용하여 전분으로부터 포도당을 제조하는 방법

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Publication number: KR101014802B1
Application number: KR1020090120529A
Authority: KR
Inventors: 박관화; 김정완; 양태주; 최지혜; 박종태; 심재훈
Original assignee: 인천대학교 산학협력단
Priority date: 2009-12-07
Filing date: 2009-12-07
Publication date: 2011-02-15

Abstract

본 발명은 복합 탈분지 효소를 이용하여 전분으로부터 포도당을 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 전분, 아밀로펙틴 및 말토덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 전분당을 포함하는 기질 용액에 서열번호 3의 설펄로버스속(Sulfolobus sp .)에서 유래된 탈분지 효소 및 서열번호 6의 노스탁속(Nostoc sp.)에서 유래에서 유래된 탈분지 효소가 혼합된 복합 탈분지 효소를 첨가하여 반응시키는 단계 및 글루코아밀레이즈(glucoamylase)를 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 포도당의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 포도당 제조방법은 전분에 존재하는 다양한 사슬길이를 가수분해 할 수 있는 설펄로버스속에서 유래된 탈분지 효소와 8 이상인 사슬길이를 특이적으로 가수분해 할 수 있는 노스탁속에서 유래된 탈분지 효소가 혼합된, 복합 탈분지 효소를 사용함으로써 전분으로부터 포도당을 매우 효과적으로 생산할 수 있다.

설펄로버스, 노스탁, 탈분지, 효소, 포도당

Description

복합 탈분지 효소를 이용하여 전분으로부터 포도당을 제조하는 방법{Method for producing glucose using debranching enzyme complex}

본 발명은 복합 탈분지 효소를 이용하여 전분으로부터 포도당을 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 전분, 아밀로펙틴 및 말토덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 전분당을 포함하는 기질 용액에 서열번호 3의 설펄로버스속(Sulfolobus sp.)에서 유래된 탈분지 효소 및 서열번호 6의 노스탁속(Nostoc sp.)에서 유래된 탈분지 효소가 혼합된 복합 탈분지 효소를 첨가하여 반응시키는 단계 및 글루코아밀레이즈(glucoamylase)를 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 포도당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

곡물, 식물 등을 포함한 생물자원으로서 바이오매스를 가공하면 메탄올, 에탄올, 바이오디젤유 등의 액체연료를 얻을 수 있는 것으로 알려져 있다. 특히 바이오 에탄올은 바이오매스에 함유되어 있는 전분을 포도당으로 변환한 다음 이것을 알콜 발효시켜서 수득된다.

상기와 같이 전분을 포도당으로 변환하기 위해서는 효소를 사용한 방법이 주로 이용되고 있다. 상기 방법은 미생물에서 유래한 알파아밀레이즈를 전분에 작용 시켜 액화시킨 후 탈분지 효소 및 글루코아밀레이즈를 반응시켜 포도당을 제조하는 것이다. 상기 제조에 사용되는 탈분지 효소는 전분의 주성분인 아밀로펙틴의 분지점에 존재하는 α-1,6-결합을 가수분해 함으로써 전분의 분해를 용이하게 하고 당화수율을 높이는 작용을 한다.

상기 제조방법에 이용되는 탈분지 효소로 주로 슈도모나스속(Pseudomonas sp.)에서 분리한 효소인 Promozyme (Novo사)을 사용하였다. 그러나 상기 Promozyme은 좁은 범위의 측쇄길이 (DP 4 내지 5)에 대한 특이성을 나타내므로, 전분에 존재하는 다양한 길이 (DP 3 내지 30)의 분지사슬의 가수분해에 부적합하여 포도당 수율이 현저히 저조한 문제점이 있었다.

본 발명자들은 설펄로버스속(Sulfolobus sp.)에서 유래된 탈분지 효소 및 노스탁속(Nostoc sp.)에서 유래된 탈분지 효소가 혼합된 복합 탈분지 효소를 이용한 경우 전분으로부터 포도당을 매우 효과적으로 생산할 수 있음을 밝혀 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 전분, 아밀로펙틴 및 말토덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 전분당을 포함하는 기질 용액에 서열번호 3의 설펄로버스속(Sulfolobus sp .)에서 유래된 탈분지 효소 및 서열번호 6의 노스탁속(Nostoc sp.)에서 유래된 탈분지 효소가 혼합된 복합 탈분지 효소를 첨가하여 반응시키는 단계 및 글루코아밀레이즈(glucoamylase)를 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 포도당의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 포도당을 효모로 발효시키는 단계를 포함하는 바이오 에탄올의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 전분, 아밀로펙틴 및 말토덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 전분당을 포함하는 기질 용액에 서열번호 3의 설펄로버스속 (Sulfolobus sp.)에서 유래된 탈분지 효소 및 서열번호 6의 노스탁속(Nostoc sp.)에서 유래된 탈분지 효소가 혼합된 복합 탈분지 효소를 첨가하여 반응시키는 단계 및 글루코아밀레이즈(glucoamylase)를 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 포도당의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 포도당을 효모로 발효시키는 단계를 포함하는 바이오 에탄올의 제조방법을 제공한다.

이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명의 포도당의 제조방법은 전분, 아밀로펙틴 및 말토덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 전분당을 포함하는 기질 용액에 서열번호 3의 설펄로버스속(Sulfolobus sp.)에서 유래된 탈분지 효소 및 서열번호 6의 노스탁속(Nostoc sp.)에서 유래된 탈분지 효소가 혼합된 복합 탈분지 효소를 첨가하여 반응시키는 단계 및 글루코아밀레이즈(glucoamylase)를 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 전분은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 호화된 전분을 사용할 수 있으며, 상기 호화된 전분은 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있으나 바람직하게는 전분을 70 내지 120℃에서 1분 내지 30분 동안 호화된 것일 수 있다. 상기와 같이 호화된 전분을 사용하면 이후 알파아밀라아제가 전분을 액화 내지 덱스트린화하는데 보다 효과적이기 때문이다. 상기와 같이 전분을 호화시키기 위해서는 통상적으로 사용되는 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 상기 온도 및 시간 범위에서 호화시키는 것이 바람직하다.

상기 아밀로펙틴 및 말토덱스트린은 전분에 알파아밀레이즈를 첨가하여 당업 계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 알파아밀레이즈는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 전분을 액화 내지 덱스트린화시키는 효소이다. 상기 효소로 전분을 액화 내지 덱스트린화시키기 위해 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 상기 전분에 알파아밀레이즈를 첨가하고 40 내지 80℃에서 pH 5.0 내지 pH 7.5의 조건에서 반응시킬 수 있다. 상기 온도 및 pH 범위를 벗어나는 경우 알파아밀레이즈의 활성이 40% 이상 감소하므로 상기 온도 및 pH 범위에서 반응시키는 것이 바람직하다.

상기 설펄로버스속(Sulfolobus sp.)에서 유래된 탈분지 효소는 바람직하게는 설펄로버스 솔파타리쿠스 균주 (Sulfolobus solfataricus P2)에서 유래한 것일 수 있다. 상기 설펄로버스속에서 유래된 탈분지 효소는 서열번로 3의 아미노산 서열(NCBI 등재번호: NP_343473.1)을 가지며, 50 내지 70℃에서 최적 활성을 나타내고, 40℃ 내지 80℃에서 최적 활성의 80%의 역가를 나타낸다. 또한 상기 탈분지 효소는 pH 5.0 내지 7.0에서 최적 활성을 나타내고, pH 4.0 내지 pH 8.0에서 최적 활성의 50 % 이상의 역가를 나타낸다(<실시예 2>참조). 상기 설펄로버스속에서 유래된 탈분지 효소는 α-1,6-결합의 가수분해활성을 가지며, 특히 사슬길이에 대한 선택성(DP(degree of polymerization) 2 이상)이 매우 넓어 전분, 아밀로펙틴 및 말토덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 전분당을 포함하는 기질 용액에 존재하는 다양한 길이의 분지사슬을 용이하게 가수분해할 수 있는 활성이 있다. 특히 DP가 10 이상인 경우 가장 빠른 가수분해 특성을 나타낸다(<실시예 2> 및 <실시예 3>참조).

한편 노스탁속(Nostoc sp.)에서 유래된 탈분지 효소는 바람직하게는 노스탁속 균주 PCC73102 (Nostoc punctiforme PCC73102)에서 유래된 것일 수 있다. 상기 노스탁속에서 유래된 탈분지 효소는 서열번호 6의 아미노산 서열(NCBI 등재번호: ZP_00110310.1)을 가지며, 상기 효소는 pH 6.0 내지 8.0에서 최적의 역가를 나타내며, 30 내지 50℃에서 최적의 역가를 나타낸다(<실시예 5> 참조). 상기 노스탁속에서 유래된 탈분지 효소는 길이가 8 이상(DP 8 이상)인 사슬을 특이적으로 가수분해하는 활성이 있다(<실시예 5> 참조).

상기 복합 탈분지 효소는 전분, 아밀로펙틴 및 말토덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 전분당을 포함하는 기질 용액에 존재하는 다양한 사슬길이를 가수분해 할 수 있는 설펄로버스속에서 유래된 탈분지 효소와 8 이상인 사슬길이를 특이적으로 가수분해 할 수 있는 노스탁속에서 유래된 탈분지 효소가 혼합된 것으로, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 설펄로버스속에서 유래된 탈분지 효소 및 노스탁속에서 유래된 탈분지 효소가 1:0.1~10 유닛(unit) 비율로 혼합된 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 설펄로버스속에서 유래된 탈분지 효소 및 노스탁속에서 유래된 탈분지 효소가 1:1의 유닛 비율로 혼합된 것일 수 있다.

상기 복합 탈분지 효소를 전분, 아밀로펙틴 및 말토덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 전분당을 포함하는 기질 용액에 첨가하여, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 30 내지 80℃에서 pH 4.0 내지 pH 8.0의 조건에서 반응시킬 수 있다. 상기 온도 및 pH 범위를 벗어나는 경우 복합 탈분지 효소의 활성이 현저히 감소하므로 상기 온도 및 pH 범위에서 반응시키는 것이 바람직하다. 또한 상기 복합 탈분지 효소의 반응시간은 반응온도 및 pH에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있으나 바람직하게는 8시간 이상, 보다 바람직하게는 24시간이상일 수 있으며 가장 바람직하게는 72시간 이상일 수 있다.

상기 설펄로버스속에서 유래된 탈분지 효소 및 노스탁속에서 유래된 탈분지 효소는 설펄로버스 속 또는 노스탁 속에서 분리하거나 유전공학적인 방법으로 제조될 수 있다. 상기 유전공학적인 방법은 통상의 공지된 방법일 수 있다. 바람직하게는 본원 발명의 탈분지 효소를 제조하는 방법은 미생물 발현 생산 시스템을 통하여 생산할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 탈분지 효소의 생산방법은 (a) 설펄로버스 속 또는 노스탁 속에서 분리된 탈분지 효소를 코딩하는 DNA 서열을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하고 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질 전환체를 제조한 다음, 상기 형질전환체를 배양하여 탈분지 효소를 생산할 수 있다(<실시예 1> 및 <실시예 4> 참조).

상기 글루코아밀레이즈(glucoamylase)는 녹말의 가수분해반응을 촉매하는 효소로써 특히 사슬의 비환원성 말단으로부터 점차 글루코오스를 절단해 가는 효소이다. 상기 글루코아밀레이즈(glucoamylase)를 첨가함으로써 상기 복합 탈분지 효소에 의해 절단된 전분 사슬로부터 최종적으로 포도당을 제조할 수 있다. 상기 글루코아밀레이즈를 첨가하여 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 30 내지 80℃에서 pH 4.0 내지 pH 8.0의 조건에서 반응시킴으로써 포도당을 제조할 수 있다. 상기 온도 및 pH 범위를 벗어나는 경우 글루코아밀레이즈의 활성이 현저히 감소하므로 상기 온도 및 pH 범위에서 반응시키는 것이 바람직하다. 또한 상기 글루코아밀레이즈는 복합 탈분지 효소와 함께 첨가할 수도 있으며, 바람직하게는 복합 탈분지 효소를 첨가한 다음 첨가할 수 있다.

본 발명의 포도당 제조방법은 상기와 같이 전분에 존재하는 다양한 사슬길이를 가수분해 할 수 있는 설펄로버스속에서 유래된 탈분지 효소와 8 이상인 사슬길이를 특이적으로 가수분해 할 수 있는 노스탁속에서 유래된 탈분지 효소가 혼합된, 복합 탈분지 효소를 사용함으로써 전분, 아밀로펙틴 및 말토덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 전분당을 포함하는 기질 용액으로부터 포도당을 매우 효과적으로 생산할 수 있다. 특히 액화 찰옥수수 전분을 기질로 하거나 아밀로펙틴을 기질로 하는 경우 모두, 상용되는 Promozyme 효소를 이용한 경우에 비하여 상기 복합 탈분지 효소를 사용한 경우 매우 효과적으로 포도당이 생산될 수 있다. 또한 설펄로버스속에서 유래된 탈분지 효소와 노스탁속에서 유래된 탈분지 효소를 각각 사용하는 것보다, 상기 탈분지 효소를 혼합하여 사용하는 경우 전분에 존재하는 다양한 사슬길이를 효과적으로 가수분해할 수 있어, 전분에서 포도당을 보다 효과적으로 생산할 수 있다. (<실시예 6> 참조)

한편 본 발명의 에탄올 제조방법은 상기와 같이 제조된 포도당을 효모로 발효시켜 제조되는 것을 특징으로 한다.

상기 바이오에탄올 생산을 위한 발효에 사용될 수 있는 효모로는 이에 한정되지 않지만 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 사용할 수 있으며, 높은 당 농도에서도 발효를 수행할 수 있는 내당성 균주와 효소 당화의 최적 온도인 40~45 ℃ 부근에서도 에탄올 전환이 가능한 내열성 균주들을 사용할 수 있다. 발효공정은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 당화공정과 별도로 수행 시 25~30 ℃, 특히 29 ℃의 온도에서 10~20 시간 동안 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 포도당 제조방법은 상기와 같이 전분에 존재하는 다양한 사슬길이를 가수분해 할 수 있는 설펄로버스속에서 유래된 탈분지 효소와 8 이상인 사슬길이를 특이적으로 가수분해 할 수 있는 노스탁속에서 유래된 탈분지 효소가 혼합된, 복합 탈분지 효소를 사용함으로써 전분, 아밀로펙틴 및 말토덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 전분당을 포함하는 기질 용액으로부터 포도당을 매우 효과적으로 생산할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

설펄로버스 솔파타리쿠스 유래 탈분지 효소 유전자 클로닝 및 탈분지효소 생산

<1-1> 유전자 클로닝

설펄로버스 설파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus, ATCC 35092) 균주로부터 Genomic DNA를 QIAmp Tissue Kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 분리한 후에 이로부터 아래의 PCR 방법을 이용하여 유전자를 분리하였다. 상기 내열성 탈분지효소 유전자를 분리하기 위하여 하기 표 1에 기재된 프라이머를 각각 제작하였다.

	서열	서열번호
정방향 프라이머 SS2094-NdeI	5'-GTTAAGTACACATATGGCATTATTCTTCAG-3'	1
역방향 프라이머 SS2094-HindIII	5'-CCTATACGAAGCTTTTATCATAATTCTATC-3'	2

상기 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 DNA에 대해 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 PCR 산물을 수득하였으며, 전기영동을 통하여 상기 PCR 산물의 크기가 약 2.2 kb임을 확인하였다. 상기 PCR의 조건은 하기 표 2에 기재된 바와 같다.

단계(step)	온도	반응시간
First(1^st) denaturation	95℃	5 min
Second(2^st) denaturation	95℃	30 sec
Annealing	55℃	30 sec
Extension	72℃	2 min
Cycle	go to denaturation	33 cycle
Final extension	72℃	7 min

상기 PCR 산물을 37℃에서 6시간 동안 제한효소 Nde I과 Hind III(New England Biolabs(NEB), USA)로 처리하고, 이를 동일한 제한 효소로 동일한 조건에서 처리한 p6XHis119(김태집, 박사학위논문, 서울대학교, 1998) 발현벡터와 ligase(New England Biolabs(NEB), USA)를 이용하여 12시간동안 16℃에서 라이게이션하여 p6xHSGDE를 제조하였다. 상기 p6xHSGDE의 벡터 맵을 도 2에 나타내었다. 상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 PCR산물과 벡터는 Nde I과 Hind III의 제한효소 부위에 의해 결합되어 있으며, 탈분지효소 유전자와 5'말단에 6개의 부가적인 히스티딘 잔기를 포함하고 있다.

상기 재조합 벡터 p6xHSGDE를 숙주세포에 형질전환 시키기 위하여, 5 ml LB 액체 배지에 숙주 세포인 E. coli MC1016(New England Biolabs(NEB), USA)를 접종하여 37 ℃에서 12시간 배양하고, 배양액 1.0 ml을 새로운 LB 액체 배지 50 ml에 접종하여 600 nm에서 흡광도가 0.5가 될 때까지 배양하였다. 상기 흡광도를 확인한 배양액 1.5 ml를 4 ℃에서 7000 x g의 조건으로 5분간 원심분리하여 균체를 회수한 뒤, 0.75 ml의 형질전환용액I(50 mM CaCl₂)으로 현탁하고 얼음 속에서 30분간 방치하였다. 이후 4 ℃에서 6000 x g의 조건으로 2분간 원심분리하여 균체를 회수하고, 회수된 균체를 0.15 ml의 형질전환용액II(100 mM CaCl₂)로 현탁하여 얼음 속에서 30분간 방치하였다.

현탁액 0.15 ml와 500 ng의 상기 라이게이션한 용액을 혼합하고, 얼음 속에서 1시간 방치한 후 42 ℃에서 2분간 열 충격을 주었다. 상기 열 충격을 준 혼합액에 0.8 ml의 LB 액체 배지를 혼합한 후, 37℃에서 1시간 배양시켰다. 상기 1시간 동안 배양한 배양액을 암피실린(최종농도 100 μg/ml)을 함유한 LB 한천 배지에 평판 도말하여 내성을 보이는 균주를 1차 선별하였다.

1차 선별된 균주를 암피실린이 포함된 LB 액체 배지 5 ml에 접종하여 37 ℃에서 12시간 배양하고, 원심분리하여 균체를 수득하였다. 플라스미드 분리키트(Qiagen, USA)로 회수된 균체로부터 플라스미드를 분리하고 상기와 동일한 Nde I과 Hind III제한 효소를 이용하여 상기와 동일한 조건에서 절단하여, 약 2.2 kb의 크기의 유전자가 있는지 여부를 확인하였다.

<1-2> 설펄로버스 솔파타리쿠스 유래 탈분지 효소의 생산 및 정제

상기에서 제조한 p6xHSGDE 벡터를 E. coli MC1061에 상기와 동일한 방법으로 형질전환 시킨 후 암피실린 내성여부를 확인하여 형질전환체를 선별하였다. 상기 선별된 형질전환체를 암피실린이 함유된 LB 액체 배지 2.5L에 접종하여 37°C에서 17시간 배양한 후, 4°C에서 7,000 x g의 조건으로 30분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 상기 회수된 균체를 300 mM NaCl과 10 mM 이미다졸이 함유된 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)에 현탁한 후 초음파 분쇄하였다. 상기 초음파 분쇄를 수행한 배양액을 원심분리하여 상등액을 취하고, 70°C에서 20분간 열처리한 다음, 10,000 x g의 조건으로 30분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 수득된 상등액은 Ni-NTA 친화 크로마토그래피에 주입하여, 정제하였다.

재조합 벡터 p6xHSGDE로 형질전환 시킨 E. coli MC1061에서 생산된 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 탈분지 효소의 정제단계별 시료의 전기영동 사진을 도 3에 나타내었다. 상기 도 3에서 M은 사이즈 마커이고, lane 1은 E. coli MC1061/p6xHSGDE 형질전환체를 초음파 분쇄하여 수득한 상등액이고, lane 2는 상기 초음파 분쇄 후 수득한 상득액의 시료를 65℃에서 20분간 열처리한 것이고, lane 3은 Ni-NTA 친화 크로마토그래피로 정제한 탈분지 효소이다.

상기 도 3에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE상에서 상기 탈분지 효소의 크기는 약 83,000 Da의 분자량을 나타내었다.

< 실시예 2>

설펄로버스 솔파타리쿠스 유래 탈분지 효소의 특성

<2-1> 효소 역가

본 발명의 탈분지 효소의 역가는 아밀로펙틴을 기질로 하여 분지결합 가수분해로 인하여 생성되는 환원성 말토덱스트린의 증가량을 측정하여 결정하였다.

탈분지 효소의 역가를 측정하기 위한 기질용액은 다이메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 1 %(w/v)로 용해된 아밀로펙틴 150 μl, 200 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5) 75 μl 에 45 μl의 증류수를 섞어 준 후 역가측정온도 75℃ 에서 3분간 예열하고, 30 μl의 효소 희석액을 섞어주어 반응을 진행하였다. 10분간 반응 후 DNS solution 900 μl를 투입하여 반응을 정지시키고 5분간 끓는 물에서 가열하여 발색 후 냉수로 식힌 후 575 nm에서 흡광도를 측정하여 역가를 결정하였다. 말토오스를 이용하여 표준곡선을 작성하였고 그 범위는 0.1 μmole/ml - 1.0 μmole/ml 사이 농도로 하였다.

<2-2> 온도 특성

효소의 최적 온도를 결정하기 위해, 다양한 온도 범위에서 아밀로펙틴 용액에 대한 상대적 역가를 측정하였다.

50 mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 5.5)에 용해된 2%(w/v) 아밀로펙틴 기질 용액 150 ㎕에 동일 완충용액 120 ㎕을 넣고 40°C 내지 90°C 범위의 다양한 온도에서 5분간 열처리한 후, 실시예 1-2에서 정제한 탈분지 효소 30 ㎕을 넣고 각각의 온도에서 10분 동안 반응시켰다. 상기 반응된 반응액으로부터 상대적 효소활성을 DNS 법을 이용하여 측정하였다.

그 결과 설펄로버스 솔파타리쿠스 유래 탈분지 효소는 50-70°C에서 최적 활성을 나타내었으며, 40°C 내지 80°C에서 최적활성의 80 %의 역가를 유지하였다.

<2-3> pH 특성

효소의 최적 pH를 결정하기 위해, 다양한 pH 범위에서 아밀로펙틴 용액에 대한 상대적 역가를 측정하였다.

50 mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 4.5 내지 6.0) 또는 50 mM 소듐 포스페이트 완충액(pH 6.0 내지 7.5) 각각에 용해된 0.5 %(w/v) 아밀로펙틴 기질 용액 150 ㎕에 각각의 완충용액 120 ㎕ 및 실시예 1-2에서 정제한 탈분지 효소 30 ㎕을 넣고 75 °C에서 10분 동안 반응시켰다. 상기 반응된 반응액으로부터 상대적 효소활성을 DNS 법을 이용하여 측정하였다.

그 결과 설펄로버스 솔파타리쿠스 유래 탈분지 효소는 pH 5.0-7.0에서 최적 활성을 나타내었으며, pH 4.0 내지 pH 8.0에서 최적활성의 50 % 이상의 역가를 유지하였다.

<2-4> 기질특이성 분석

다양한 기질의 가지결합을 가지는 분지 β-CD를 이용한 설펄로버스 설파타리쿠스 탈분지 효소의 기질특이성을 분석하기 위해, 50mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.5)에 G2-β-CD에서 G10-β-CD까지 다양한 가지결합 길이를 가지는 기질을 준비하고 적당히 희석한 효소액을 섞어주어 70℃에서 반응을 진행하고, 반응이 진행됨에 따라 적당량을 채취하여 끓는 물에 가열하여 반응을 정지시키고 원심 분리하여 불순물을 제거한 후 TLC(Thin layer chromatography)를 이용하여 분석을 진행하였다. 상기 결과를 도 4에 기재하였다.

상기 도 4에 기재된 바와 같이, 상기 탈분지 효소는 G2-β-CD 이상의 모든 기질을 가수분해할 수 있는 것으로 나타났으며 가지결합의 길이가 증가 할수록 빠른 가수분해 특성을 나타내었다. 특히 가지결합길이가 DP(degree of polymerization)가 10 이상인 경우 가장 빠른 가수분해 특성을 나타내었으며, 전반적으로 광범한 길이의 가지결합 특이성을 나타내었다.

< 실시예 3>

설펄로버스 설파타리쿠스 유래 탈분지 효소를 이용한 액화 찰옥수수 전분의 측쇄 가수분해

<3-1> 액화 찰옥수수전분의 측쇄 가수분해

액화 찰옥수수전분 (Liquified Waxy Corn Starch; LWCS)을 50 mM 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.5)에 5.0 % (w/v)이 되도록 준비한 후 기질 1 mg을 기준으로 0.02 Unit의 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 탈분지 효소 (비교구는 Promozyme, Novo사, 0.02U/mg 기질)를 가하고 70℃에서 24시간 반응시켰다. 상기 반응액을 끓는 물에서 15분간 가열하여 반응을 종결시켰다.

<3-2> 반응액의 고성능 음이온 교환 크로마토그래피 분석

상기 실시예 <3-1>에서 수득한 반응액을 고성능 음이온 교환 크로마토그래피 (High Performance Anion Exchange Chromatography)를 이용하여 분석하였다. 상세하게는, 시료 즉, 상기 반응액은 용출액을 초순수로 3배 희석하여 0.45 ㎛ 박막여과지로 여과하여 20 ㎕를 주입하였고, 유속은 분당 1 ml로 하였다. HPAEC 분석은 GP40 그래디언트 펌프(Dionex사, USA)의 , ED40 전기화학적 검출기(Dionex사, USA) 및 카보팩-컬럼(CarboPac PA1)을 이용하여 시행하였으며, A 용매로는 150 mM의 가성소다액을 사용하였으며, A 용매에 600 mM 소듐 아세테이트를 녹인 것을 B 용매로 하여 B 용매가 30분 동안 0에서 30%가 되도록 직선적으로 농도구배를 걸어주었다.

상기 고성능 음이온 교환 크로마토그래피에 의하여 실시예 <3-1>에 의해 제조된 아밀로펙틴을 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 탈분지 효소로 반응시켜 생성된 반응 산물을 분석한 결과를 도 5에 나타내었다. (a)는 상용 탈분지 효소인 Promozyme (Novo사)을 처리한 비교구이며 (b)는 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 탈분지 효소를 처리한 반응액을 분석한 결과이다.

상기 도 5에 나타낸 바와 같이 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 탈분지 효소 처리구 (b)에서 비교구 (Promozyme 처리구)에 비하여 분지 말토올리고당이 현저히 감소하여 대부분이 분해되었음을 나타낸다.

< 실시예 4>

노스탁 균주 유래 탈분지 효소의 유전자 클로닝 및 효소 생산

<4-1> 노스탁 균주 유래 탈분지 효소의 유전자 클로닝

노스탁속 균주 PCC73102(Nostoc sp. PCC73102, ATCC, USA)를 ATCC medium 819 Blue-Green Nitrogen-fixing medium[0.04 g K₂HPO₄, 0.075 g MgSO₄7H₂O, 0.036 g CaCl₂2H₂O, 6.0 mg Citric acid, 6.0 mg Ferric ammonium citrate, 1.0 mg EDTA, 0.02 g Na₂CO₃, 1 mL Trace metal Mix A5(2.86 g H₃BO₃, 1.81 g MnCl₂4H₂O, 0.222 g ZnSO₄7H₂O, 0.39 g Na₂MoO₄2H₂O, 0.079 g CuSO₄5H₂O, 49.4 mg Co(NO₃)₂6H₂O] 50ml에 접종하여 25℃에서 배양하고 원심분리하여 균체를 회수하고 염색체 DNA를 분리하였다(Dubnau, D. and R. D. Abenson, 1971, J. Mol. Biol., 56, 209-221)

즉, 회수된 균체에 라이소자임을 처리하여 원형질체 세포로 만든 다음 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 넣어 세포를 완전히 파괴한 후 전체 반응액에 대해 농도가 1몰이 되도록 소디움 클로라이드를 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 이것을 원심분리하여 상등액만을 취하고, 페놀:클로로포름:아이소아밀알콜의 혼합액(각 용액의 부피의 비 = 25:24:1)을 상등액과 동일한 부피로 첨가하여 액 중의 단백질 등 불순물을 제거하였다. 이 과정을 수회 반복하였다. 두 배 부피의 99%의 에탄올을 첨가하여 침전시키고, 이것을 유리막대로 감아서 분리하여 1/10xSSC 완충용액(3M 소디움 클로라이드, 0.3M 소디움 시트레이트)에 녹였다.

상기 노스탁 균주 유래 탈분지 효소 유전자는 하기 표 3의 프라이머를 이용하여, 하기 표 4의 방법으로 PCR을 수행하여 노스탁 균주 유래 탈분지 효소 유전자를 분리하였다.

상기 노스탁 균주 유래 탈분지 효소 유전자를 분리하기 위하여 정방향 프라이머 Nos-NdeI(5'-AAA AAG TTA CAT ATG CAA ATT CAA ACA CCA-3', 서열번호 4) 및 역방향 프라이머 Nos-XhoI(5'-AAA GTC CTC GAG GTC CCC AGT CCC CAG GAT-3', 서열번호 5)를 각각 제작하였으며, 상기 프라이머는 하기 표 3과 같다.

	서열	서열번호
정방향 프라이머 Nos-Ndd I	5'-AAA AAG TTA CAT ATG CAA ATT CAA ACA CCA-3'	4
역방향 프라이머 Nos-Xho I	5'-AAA GTC CTC GAG GTC CCC AGT CCC CAG GAT-3'	5

노스탁속 균주 염색체 DNA에 대해 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 PCR 산물을 TNERM하였으며, 전기영동을 통하여 상기 PCR 산물의 크기가 약 1.5 kb임을 확인하였다. 상기 PCR의 조건은 하기 표 4에 기재된 바와 같다.

단계(STEP)	온도	반응시간
First(1^st) denaturation	95 ℃	5 min
Second(2^st) denaturation	95 ℃	1 min
Annealing	55 ℃	30 sec
Extension	72 ℃	1min 30sec
Cycle	go to denaturation	33 cycles
Final extension	72 ℃	7 min

상기 PCR 산물을 37℃에서 6시간 동안 제한효소 NdeI과 XhoI로 처리하고, 이를 동일한 제한 효소로 처리한 pET-29b 발현벡터(Novagen, 독일)와 라이게이션하여 pETNPul6xH를 제조하였다. 상기 라이게이션을 통하여 제조한 재조합 벡터 pETNPul6xH의 벡터의 개열지도를 도 6에 나타내었다. 상기 pETNPul6xH 벡터는 노스탁 균주 유래 탈분지 효소 유전자를 포함하며, 상기 노스탁 균주 유래 탈분지 효소 유전자의 3' 말단에 8개의 부가적인 아미노산 잔기(Leu-Glu-6His)를 포함하고 있다.

형질전환을 위하여, 5 ml LB 액체 배지에 숙주 세포인 E. coli MC1016(New England Biolab(NEB), USA)를 접종하여 37 ℃에서 12시간 배양하고, 배양액 1.0 ml을 새로운 LB 액체 배지 50 ml에 접종하여 600 nm에서 흡광도가 0.5가 될 때까지 배양하였다. 상기 흡광도를 확인한 배양액 1.5 ml를 4 ℃에서 7000 x g의 조건으로 5분간 원심분리하여 균체를 회수한 뒤, 0.75 ml의 형질전환용액I(50 mM CaCl₂)으로 현탁하고 얼음 속에서 30분간 방치하였다. 이후 4 ℃에서 6000 x g의 조건으로 2분간 원심분리하여 균체를 회수하고, 회수된 균체를 0.15 ml의 형질전환용액II(100 mM CaCl₂)로 현탁하여 얼음 속에서 30분간 방치하였다.

현탁액 0.15 ml와 500 ng의 상기 라이게이션한 용액을 혼합하고, 얼음 속에서 1시간 방치한 후 42 ℃에서 2분간 열 충격을 주었다. 상기 열 충격을 준 혼합액에 0.8 ml의 LB 액체 배지를 혼합한 후, 37℃에서 1시간 배양시켰다. 상기 1시간 동안 배양한 배양액을 카나마이신(최종농도 20 μg/ml)을 함유한 LB 한천 배지에 평판 도말하여 내성을 보이는 균주를 1차 선별하였다.

1차 선별된 균주를 카나마이신이 포함된 LB 액체 배지 5 ml에 접종하여 37 ℃에서 12시간 배양하고, 원심분리하여 균체를 수득하였다. 플라스미드 분리키트(Qiagen, 독일)로 회수된 균체로부터 플라스미드를 분리하고 상기와 동일한 NdeI과 XhoI제한 효소를 이용하여 상기와 동일한 조건에서 절단하여, 약 1.5 kb의 크기의 유전자가 포함되어 있음을 확인하였다.

<4-2> 형질전환체의 배양 및 탈분지 효소의 생산정제

상기에서 제조한 pETNPul6xH 벡터를 E. coli BL21(DE3)에 상기와 동일한 방법으로 형질전환시킨 후 카나마이신 내성여부를 확인하여 상기 벡터가 형질전환된 균주 즉, 형질전환체를 선별하였다. 선별한 형질전환체는 카나마이신이 함유된 LB 액체 배지 2.5 L에 접종하고 37°C에서 배양하여 600 nm에서 흡광도가 0.6이 될 때 IPTG를 최종농도 0.5 mM로 첨가하여 25 내지 37°C에서 5시간 배양하였다. 상기 IPTG 첨가 후, 온도에 따른 노스탁 균주 유래 탈분지 효소의 발현양을 도 7에 나타내었다.

상기 도 7에 나타난 바와 같이, 배양 온도에 따른 노스탁 균주 유래 탈분지 효소의 발현양은 측정한 결과 30℃이상의 온도에서는 노스탁 균주 유래 탈분지 효소의 발현양이 극히 적었으며, 25℃에서의 발현율이 제일 우수함을 알 수 있었다.

상기에서 선별한 형질전환주를 배양한 후, 4°C에서 7,000 x g의 조건으로 30분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 상기 회수된 균체를 300 mM NaCl과 10 mM 이미다졸이 함유된 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)으로 현탁한 후, 상기 현탁한 균체를 초음파 분쇄하였다. 상기 초음파 분쇄를 수행한 배양액을 10,000 x g의 조건으로 30분간 원심분리하여 상등액을 취하고, 상기 수득된 상등액은 Ni-NTA 친화 크로마토그래피에 주입하여, 정제하였다.

재조합 벡터 pETNPul6xH로 형질전환 시킨 E. coli BL21(DE3)에서 생산된 노스탁 균주 유래 탈분지 효소의 정제단계별 시료의 전기영동 사진을 도 8에 나타내었다. 상기 도 8의 M은 사이즈 마커이고, 레인 1은 E. coli BL21(DE3)/pETNPul6xH 형질전환체를 초음파 분쇄하여 수득한 상등액이고, 레인 2는 상기 초음파 분쇄 후 수득한 상득액의 시료를 Ni-NTA 친화 크로마토그래피로 정제한 노스탁 균주 유래 탈분지 효소이다.

상기 도 8에 나타낸 바와 같이, 노스탁 균주 유래 탈분지 효소(레인 2)는 Ni-NTA 친화 크로마토그래피 과정을 통하여 효율적으로 정제된 것을 확인할 수 있으며, SDS-PAGE상에서 상기 노스탁 균주 유래 탈분지 효소의 크기는 약 55,000 Da의 분자량을 나타내어 상기 노스탁 균주 유래 탈분지 효소의 아미노산 서열로부터 유추된 이론적 분자량과 유사한 값을 나타내었다.

상기 도 9에 나타낸 아밀로플루란네이즈의 MALDI-TOF MS 분석 결과는 56584.39로 나타났으며, 상기 분석결과는 노스탁 균주 유래 탈분지 효소에 Histidine tag이 결합된 것에 해당되므로, 상기 MALDI-TOF MS 분석 결과는 아미노산 서열로부터 유추된 이론적 분자량인 56,512 Da과 거의 동일한 값을 나타내었다.

< 실시예 5>

노스탁 균주 유래 탈분지 효소의 특성

<5-1> 효소 역가

50mM sodium phosphate (pH7.0) 완충용액에 용해된 1% 풀루란 125㎕ 에 50mM sodium phosphate (pH7.0) 완충용액 100㎕와 효소 30㎕넣어 반응용액을 만들었다. 효소를 넣지 않은 반응용액을 30℃에서 5분간 예열하고 효소를 넣고 10분간 반응시켰다. 750㎕ DNS 용액 (3.5-dinitrosalicylic acid 10.6g, NaOH 19.8g, Na,K-Tartrate 306g, phenol 7.6ml, Na-metabisulfite 8.3g 과 증류수 1,416ml) 을 넣어 반응을 중지시켰다. 효소를 넣지 않은 반응은 대조군으로 사용하였다. 반응용액을 5분간 끓인 뒤, 흐르는 찬물로 식혔다. 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 1 unit은 특정 반응조건하에서 1분 동안 생성되는 환원당 1μmol 을 형성하는데 필요한 효소의 양을 말한다.

<5-2> pH 특성

노스탁 균주 유래 탈분지 효소의 최적 반응 pH를 결정하기 위해, 다양한 pH 범위의 브리튼 로빈슨 완충액(pH 2.0 내지 11.0) 각각에 파라나이트로 페닐 말토펜타오스를 첨가하여 1%(w/v) 파라나이트로 페닐 말토펜타오스 기질 용액을 제조하고, 용해된 1%(w/v) 파라나이트로 페닐 말토펜타오스 기질 용액 300 ㎕에 실시예 <4-2>의 노스탁 균주 유래 탈분지 효소 30 ㎕을 넣고 30℃에서 4분 동안 반응시킨 후, 에탄올 400 ㎕과 2M 트리스 100 ㎕를 넣어 반응을 중단시켰다. 상기 반응을 중단시킨 반응액을 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 최고 흡광도 값을 기준으로 상대적 활성을 측정하였다.

노스탁 균주 유래 탈분지 효소는 pH 6.0-8.0에서 최적의 역가를 나타내었다.

<5-3> 온도 특성

노스탁 균주 유래 탈분지 효소의 최적 반응 온도를 결정하기 위해, 50 mM 소디움 포스페이트 완충액 (pH 7.0)에 파라나이트로 페닐 말토펜타오스를 첨가하여 1%(w/v) 파라나이트로 페닐 말토펜타오스 기질 용액을 제조하고, 5°C 내지 60°C의 다양한 온도범위로 기질 용액을 가열시킨 후, 실시예 <5-2>의 방법에 따라 흡광도를 측정하여 상대적 효소활성을 측정하였다.

노스탁 균주 유래 탈분지 효소는 30-50°C에서 최적의 역가를 나타냈다.

<5-4> 기질특이성 분석

2%의 DP(degree of polymerization) 수치가 2 내지 12의 사슬로 구성된 분지사이클로덱스트린 용액 (pH 7.0, 50 mM 소디움 포스페이트 완충액)에 희석된 노스탁 균주 유래 탈분지 효소를 가한 후, 30℃에서 5 내지 180분간 반응시키면서 시간별로 시료를 채취하고 TLC를 이용하여 분석하고 그 결과를 도 10에 기재하였다.

상기 도 10에 기재한 바와 같이 노스탁속 탈분지 효소는 사슬길이 DP 수치가 8 이상인 분지사이클로덱스트린은 분해하나, 사슬길이 DP 수치가 7 이하는 분해하지 못함을 알 수 있었다. 이는 노스탁속 유래 탈분지 효소는 DP 수치가 8 이상의 사슬에만 특이적으로 작용하는 것을 나타낸다.

< 실시예 6>

설펄로버스 솔파타리쿠스 유래 탈분지 효소 및 노스탁 균주 유래 탈분지 효소가 혼합된 복합 탈분지 효소를 이용한 포도당 제조

<6-1> 액화 찰옥수수 전분으로부터 포도당의 제조

찰옥수수 전분을 105℃에서 5분간 호화시킨 후, 알파아밀레이즈를 첨가하여 85℃에서 2시간 동안 반응시켜 전분을 액화 및 덱스트린화 한 다음, 이를 기질로 하여 복합 탈분지 효소 (설펄로버스 솔파타리쿠스 유래 탈분지 효소 및 노스탁 균주 유래 탈분지 효소의 혼합비가 1:1 유닛 비율)를 처리하여 포도당을 제조하고 이를 상용의 Promozyme(Novo 사)과 비교하였다.

구체적으로 상기 5%의 액화 및 덱스트린화된 찰옥수수 전분에 복합 탈분지 효소를 0.02U/mg를 혼합하고, 글루코아밀레이즈(Novo 사)를 추가적으로 혼합하여 60℃, pH 5.5에서 2시간 동안 반응시켜 생성된 포도당의 양을 GOD-POD방법(Properties of a novel thermostable glucoamylase from the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus in relation to starch processing. Kim MS et al., Appl Environ Microbiol. 2004 Jul;70(7):3933-40.)을 이용하여 분석하고 그 결과를 도 11에 기재하였다.

상기 도 11에서 기재한 바와 같이, Promozyme 처리한 경우보다 복합탈분지효소를 처리한 경우에서 포도당 생성량이 월등히 증가하였다.

<6-2> 아밀로펙틴으로부터 포도당의 제조

아밀로펙틴을 50 mM 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.5)에 5.0 % (w/v)이 되도록 녹인 후, 기질 1 mg을 기준으로 복합 탈분지 효소 0.02 unit을 가하고, 기질 1 mg을 기준으로 글루코아밀레이즈(AMG, Novo사)를 1 unit으로 첨가하여 75℃에서 24시간 반응시켰다. 상기 반응액을 끓는 물에서 15분간 가열하여 반응을 종결시켰다.

상기 수득한 반응액을 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(High Performance Anion Exchange Chromatography)를 이용하여 분석하였다. 구체적으로, 상기 반응액을 초순수로 3배 희석하여 0.45 ㎛ 박막여과지로 여과하여 20 ㎕를 주입하였고, 유속은 분당 1 ml로 하였다. HPAEC 분석은 GP40 그래디언트 펌프(Dionex사, USA)의 , ED40 전기화학적 검출기(Dionex사, USA) 및 카보팩-컬럼(CarboPac PA1)을 이용하여 시행하였으며, A 용매로는 150 mM의 가성소다액을 사용하였으며, A 용매에 600 mM 소듐 아세테이트를 녹인 것을 B 용매로 하여 B 용매가 30분 동안 0에서 30%가 되도록 직선적으로 농도구배를 걸어주었다.

상기 고성능 음이온 교환 크로마토그래피에 의하여 아밀로펙틴을 복합 탈분지 효소로 반응시켜 생성된 반응 산물을 분석한 결과를 도 12에 나타내었다.

이때 상기 복합 탈분지 효소 대신에 Promozyme을 사용한 경우, 설펄로버스 솔파타리쿠스 유래 탈분지 효소(TreX)만을 사용한 경우 및 노스탁 균주 유래 탈분지 효소(NAP)만을 사용한 경우를 비교예로 하였으며, 다른 모든 조건은 복합 탈분지 효소를 사용한 경우와 동일하게 하였다.

상기 도 12에 나타낸 바와 같이, 복합 탈분지 효소를 처리한 경우 포도당 생산량이 상기 비교예에 비하여 월등히 높으며, 특히 72시간 처리한 경우 하기 표 5에 기재한 바와 같이 비교예에 비하여 약 50% 이상의 포도당 생산량이 증가함을 알 수 있다.

	Pro+AMG	TreX+AMG	NAP+AMG	TreX+NAP+AMG
8 hr	64.7%	58.8%	56.5%	76.5%
24 hr	88.2%	91.8%	80.0%	138.8%
72 hr	108.2%	100.0%	94.1%	152.9%

* Pro: Promozyme, AMG: 글루코아밀레이즈

* 기준: TreX를 처리하고 72시간 경과한 수치를 100%로 함

도 1은 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 탈분지 효소(TreX) 및 노스탁속 균주 유래 아밀로플루란네이즈 효소를 동시에 처리하여 포도당 및 바이오에탄올을 제조하는 공정의 흐름도이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 벡터인 p6xHSGDE의 개열지도이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 벡터 p6xHSGDE로 형질전환시킨 E. coli MC1061에서 생산된 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 탈분지 효소의 정제단계별 시료의 전기영동 사진이다.

도 4는 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 탈분지 효소의 가지결합 사슬길이에 대한 특이성을 나타낸 박막크로마토그래피 분석 결과이다.

도 5는 액화된 찰옥수수전분을 베타 아밀레이즈로 처리하여 분지올리고당 측쇄를 잔존하게 한 후, 이를 분해하는 설펄로버스 설파타리쿠스 탈분지 효소의 탈분지 효과를 상용효소인 Promozyme (Novo 사)과 비교한 음이온교환수지 액체크로마토그래피 (HPAEC) 그림이다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 벡터인 pETNPul6xH의 개열지도이다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 IPTG 첨가 후, 배양 온도에 따른 노스탁속 균주 유래 탈분지 효소(NPDE)의 발현양을 활성 측정을 통해 나타낸 그래프이다.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 벡터 pETNPul6xH로 형질전환시킨 E. coli BL21(DE3)에서 생산된 노스탁속 균주 유래 탈분지 효소(NPDE)의 정제단계별 SDS-PAGE 전기영동 사진이다.

도 9는 정제된 노스탁속 균주 유래 탈분지 효소(NPDE)의 MALDI-TOF MS(matrix associated laser desorption ionization - time-of-flight mass spectrometry) 분석 결과이다.

도 10은 노스탁속 균주 유래 탈분지 효소(NPDE)의 가지결합 사슬길이 특이성을 나타낸 박막크로마토그래피 분석 결과이다.

도 11은 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 탈분지 효소(TreX) 및 노스탁속 균주 유래 탈분지 효소(NPDE)가 혼합된 복합 탈분지 효소를 이용하여 액화 옥수수전분으로부터 포도당 생산 수율을 측정하고 이를 상용 탈분지 효소인 Promozyme (Novo 사)과 비교한 그래프이다.

도 12는 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 탈분지 효소(TreX) 및 노스탁속 균주 유래 탈분지 효소(NPDE)가 혼합된 복합 탈분지 효소에 의한 포도당 생산을 비교예와 상대적인 양을 퍼센트로 확인한 그림이다.

(Pro: Promozyme, TreX: 설펄로버스 솔파타리쿠스 유래 탈분지 효소, NAP: 노스탁 균주 유래 탈분지 효소, AMG: 글루코아밀레이즈)

<110> INCHEON UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Method for producing glucose using debranching enzyme complex <130> DPP20093647KR <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SS2094-NdeI <400> 1 gttaagtaca catatggcat tattcttcag 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SS2094-HindIII <400> 2 cctatacgaa gcttttatca taattctatc 30 <210> 3 <211> 718 <212> PRT <213> Sulfolobus solfataricus <400> 3 Met Ala Leu Phe Phe Arg Thr Arg Asp Arg Pro Leu Arg Pro Gly Asp 1 5 10 15 Pro Tyr Pro Leu Gly Ser Asn Trp Ile Glu Asp Asp Asp Gly Val Asn 20 25 30 Phe Ser Leu Phe Ser Glu Asn Ala Glu Lys Val Glu Leu Leu Leu Tyr 35 40 45 Ser Leu Thr Asn Gln Lys Tyr Pro Lys Glu Ile Ile Glu Val Lys Asn 50 55 60 Lys Thr Gly Asp Ile Trp His Val Phe Val Pro Gly Leu Arg Pro Gly 65 70 75 80 Gln Leu Tyr Ala Tyr Arg Val Tyr Gly Pro Tyr Lys Pro Glu Leu Gly 85 90 95 Leu Arg Phe Asn Pro Asn Lys Val Leu Ile Asp Pro Tyr Ala Lys Ala 100 105 110 Ile Asn Gly Ser Val Ile Trp Asn Asp Ala Val Phe Gly Tyr Lys Ile 115 120 125 Gly Asp Gln Asn Gln Asp Leu Thr Tyr Asp Glu Arg Asp Ser Gly Glu 130 135 140 Tyr Val Pro Lys Ser Val Val Ile Asn Pro Tyr Phe Glu Trp Asp Asp 145 150 155 160 Glu Asp Phe Ile Lys Gly Lys Lys Val Pro Leu Lys Asp Thr Val Ile 165 170 175 Tyr Glu Val His Val Lys Gly Phe Thr Lys Leu Arg Leu Asp Leu Pro 180 185 190 Glu Asn Ile Arg Gly Thr Tyr Glu Gly Leu Ala Ser Glu Gln Met Ile 195 200 205 Ser Tyr Leu Lys Asp Leu Gly Ile Thr Thr Val Glu Leu Met Pro Val 210 215 220 Phe His Phe Ile Asp Gln Arg Phe Leu Thr Asp Lys Gly Leu Thr Asn 225 230 235 240 Tyr Trp Gly Tyr Asp Pro Ile Asn Phe Phe Ser Pro Glu Cys Arg Tyr 245 250 255 Ser Ser Thr Gly Cys Leu Gly Gly Gln Val Leu Ser Phe Lys Lys Met 260 265 270 Val Asn Glu Leu His Asn Ala Gly Ile Glu Val Ile Ile Asp Val Val 275 280 285 Tyr Asn His Thr Ala Glu Gly Asn His Leu Gly Pro Thr Leu Ser Phe 290 295 300 Arg Gly Ile Asp Asn Thr Ala Tyr Tyr Met Leu Gln Pro Asp Asn Lys 305 310 315 320 Arg Tyr Tyr Leu Asp Phe Thr Gly Thr Gly Asn Thr Leu Asn Leu Ser 325 330 335 His Pro Arg Val Ile Gln Met Val Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Trp Val 340 345 350 Thr Glu Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ala Ala Leu 355 360 365 Ala Arg Glu Leu Tyr Ser Val Asn Met Leu Asn Thr Phe Phe Ile Ala 370 375 380 Leu Gln Gln Asp Pro Ile Leu Ser Gln Val Lys Leu Ile Ala Glu Pro 385 390 395 400 Trp Asp Val Gly Gln Gly Gly Tyr Gln Val Gly Asn Phe Pro Tyr Gln 405 410 415 Trp Ala Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Ser Ile Arg Arg Phe Trp 420 425 430 Arg Gly Glu Ala Leu Pro Tyr Ser Glu Ile Ala Asn Arg Leu Leu Gly 435 440 445 Ser Pro Asp Ile Tyr Leu Gly Asn Asn Lys Thr Pro Phe Ala Ser Ile 450 455 460 Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Gly Phe Thr Leu Glu Asp Leu Val Ser 465 470 475 480 Tyr Asn Gln Lys His Asn Glu Ala Asn Gly Phe Asn Asn Gln Asp Gly 485 490 495 Met Asn Glu Asn Tyr Ser Trp Asn Cys Gly Ala Glu Gly Pro Thr Asn 500 505 510 Asp Gln Asn Val Val Ile Cys Arg Glu Lys Gln Lys Arg Asn Phe Met 515 520 525 Ile Thr Leu Leu Val Ser Gln Gly Thr Pro Met Ile Leu Gly Gly Asp 530 535 540 Glu Leu Ser Arg Thr Gln Arg Gly Asn Asn Asn Ala Phe Cys Gln Asp 545 550 555 560 Asn Glu Ile Thr Trp Phe Asp Trp Asn Leu Asp Glu Arg Lys Ser Lys 565 570 575 Phe Leu Glu Phe Val Lys Lys Met Ile Gln Phe Tyr Arg Ala His Pro 580 585 590 Ala Phe Arg Arg Glu Arg Tyr Phe Gln Gly Lys Lys Leu Phe Gly Met 595 600 605 Pro Leu Lys Asp Val Thr Phe Tyr Thr Leu Glu Gly Arg Glu Val Asp 610 615 620 Glu Lys Thr Trp Ser Ser Pro Thr Gln Leu Val Ile Phe Val Leu Glu 625 630 635 640 Gly Ser Val Met Asp Glu Ile Asn Met Tyr Gly Glu Arg Ile Ala Asp 645 650 655 Asp Ser Phe Leu Ile Ile Leu Asn Ala Asn Pro Asn Asn Val Lys Val 660 665 670 Lys Phe Pro Lys Gly Lys Trp Glu Leu Val Ile Ser Ser Tyr Leu Arg 675 680 685 Glu Ile Lys Pro Glu Glu Arg Ile Ile Glu Gly Glu Lys Glu Leu Glu 690 695 700 Ile Glu Gly Arg Thr Ala Leu Val Tyr Arg Arg Ile Glu Leu 705 710 715 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nos-Ndd I <400> 4 aaaaagttac atatgcaaat tcaaacacca 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nos-Xho I <400> 5 aaagtcctcg aggtccccag tccccaggat 30 <210> 6 <211> 488 <212> PRT <213> Nostoc sp. PCC73102 <400> 6 Met Gln Ile Gln Thr Pro Asp Trp Val Lys His Ala Val Phe Tyr Gln 1 5 10 15 Ile Phe Pro Asp Arg Phe Ala Arg Ser Lys Gln Pro Arg Lys Arg Leu 20 25 30 Leu Gln Glu Ala Arg Trp Glu Asp Trp Asp Ser Met Pro Thr Leu Gln 35 40 45 Gly Tyr Lys Gly Gly Asp Leu Trp Gly Ile Met Glu Asp Leu Asp Tyr 50 55 60 Ile Gln Asn Leu Gly Ile Asn Ala Ile Tyr Phe Thr Pro Ile Phe Gln 65 70 75 80 Ser Ala Ser Asn His Arg Tyr His Thr His Asp Tyr Tyr Gln Val Asp 85 90 95 Pro Met Leu Gly Gly Asn Glu Ala Phe Lys Glu Leu Leu Asp Ala Ala 100 105 110 His Gln Arg Asn Ile Lys Val Val Leu Asp Gly Val Phe Asn His Ser 115 120 125 Ser Arg Gly Phe Phe Phe Phe His Asp Val Leu Glu Asn Gly Pro His 130 135 140 Ser Pro Trp Val Asn Trp Phe Lys Ile Glu Gly Trp Pro Leu Ser Pro 145 150 155 160 Tyr Asn Gly Glu Phe Pro Ala Asn Tyr Val Gly Trp Ala Gly Asn Arg 165 170 175 Ala Leu Pro Glu Phe Asn His Asp Asn Pro Glu Val Arg Glu Tyr Ile 180 185 190 Met Glu Ile Ala Glu Tyr Trp Leu Lys Phe Gly Ile Asp Gly Trp Arg 195 200 205 Leu Asp Val Pro Phe Glu Ile Lys Thr Pro Gly Phe Trp Gln Glu Phe 210 215 220 Arg Asp Arg Thr Lys Ala Ile Asn Pro Glu Ala Tyr Ile Val Gly Glu 225 230 235 240 Val Trp Gly Asp Ser Arg Gln Trp Leu Asp Gly Thr Gln Phe Asp Gly 245 250 255 Val Met Asn Tyr Leu Phe Ala Gly Pro Thr Ile Ala Phe Ala Ala Gly 260 265 270 Asp Arg Val Val Leu Glu Gln Val Gln Ser Arg Asp Tyr Gln Pro Tyr 275 280 285 Pro Pro Leu Phe Ala Ala Glu Tyr Ala Thr Lys Ile Gln Glu Val Leu 290 295 300 Gln Leu Tyr Pro Trp Glu Ile Gln Leu Thr Gln Leu Asn Leu Leu Ala 305 310 315 320 Ser His Asp Thr Ala Arg Leu Met Thr Ile Ala Gly Gly Asp Ile Ala 325 330 335 Ser Val Glu Leu Ser Thr Leu Leu Leu Leu Thr Phe Pro Gly Ala Pro 340 345 350 Ser Ile Tyr Tyr Gly Asp Glu Val Gly Leu Pro Gly Gly Ile Asp Pro 355 360 365 Asp Ser Arg Arg Gly Phe Pro Leu Glu Ala Asn Trp Asn Gln Glu Ile 370 375 380 Phe Asn Thr His Arg Gln Leu Ile Thr Ile Arg Gln Thr Tyr Pro Ala 385 390 395 400 Leu Arg Thr Gly Asp Tyr Gln Val Leu Tyr Ala Gln Gly Gln Leu Tyr 405 410 415 Leu Phe Ala Arg Thr Leu Gly Thr Glu Glu Leu Ile Ile Ala Ile Asn 420 425 430 Ala Gly Thr Ser Ser Ala Thr Ala Asn Val Asp Val Ala Ser Leu His 435 440 445 Thr Gln Pro Asn Lys Leu Leu Tyr Gly Thr Ala Glu Ala Glu Trp Asn 450 455 460 Gly Glu Glu Gly Thr Gln Gln Leu Ser Leu Thr Leu Pro Ala Arg Ser 465 470 475 480 Gly Cys Ile Leu Gly Thr Gly Asp 485

Claims

포도당을 제조하는 방법으로서,

전분, 아밀로펙틴 및 말토덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 전분당을 포함하는 기질 용액에 서열번호 3의 설펄로버스속(Sulfolobus sp.)에서 유래된 α-1,6-결합의 가수분해효소 및 서열번호 6의 노스탁속(Nostoc sp.)에서 유래된 α-1,6-결합의 가수분해효소가 혼합된 복합 α-1,6-결합의 가수분해효소를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 글루코아밀레이즈(glucoamylase)를 첨가하여 반응시키는 단계를 포함하고,

상기 복합 α-1,6-결합의 가수분해효소는 서열번호 3의 설펄로버스속(Sulfolobus sp.)에서 유래된 α-1,6-결합의 가수분해효소 및 서열번호 6의 노스탁속 균주(Nostoc sp.)에서 유래된 α-1,6-결합의 가수분해효소가 1 : 0.1~10 유닛(unit) 비율로 혼합되고,

상기 서열번호 3의 설펄로버스속(Sulfolobus sp.)에서 유래된 α-1,6-결합의 가수분해효소는 DP(degree of polymerization) 2~30의 가지결합길이에 대해 가수분해 특성을 나타내고, DP 10~30의 가지결합길이에 대한 가수분해 속도가 DP 2~9의 가지결합길이에 대한 가수분해 속도보다 빠르고,

상기 서열번호 6의 노스탁속(Nostoc sp.)에서 유래된 α-1,6-결합의 가수분해효소는 DP 8~30의 가지결합길이에 대해서만 특이적으로 가수분해 특성을 갖는 포도당의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서,

상기 복합 α-1,6-결합의 가수분해효소를 첨가하여 30 내지 80℃, pH 4.0 내지 pH 8.0에서 반응시키는 것인 포도당의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 글루코아밀레이즈를 첨가하여 30 내지 80℃, pH 4.0 내지 pH 8.0에서 반응시키는 것인 포도당의 제조방법.
제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 포도당을 제조하는 단계; 및 상기 포도당을 효모로 발효시키는 단계를 포함하는 바이오 에탄올의 제조방법.