CN116656759B - 一种制备β-环糊精的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备β‑环糊精的方法，属于环糊精生产技术领域。本发明向质量分数为10％～30％的酶反应底物中加入β‑环糊精葡萄糖基转移酶和糊精脱支酶SsGDE酶进行预处理；加入β‑环糊精葡萄糖基转移酶与环己烷进行反应6h～10h，高效制备得到β‑环糊精。相比于不添加SsGDE酶的制备方法，本发明通过添加SsGDE酶将β‑环糊精的转化率提高了4.36％～43.95％，且可将β‑环糊精制备酶反应时间从10h～12h缩短至6h。本发明的制备方法提高了β‑环糊精在产物中的占比，有利于后续分离操作，且反应过程无需调节pH，操作简单，有利于β‑环糊精的高效制备。
Description
技术领域
本发明涉及环糊精生产技术领域，尤其是指一种制备β-环糊精的方法。
背景技术
β-环糊精(β-Cyclodextrins,β-CD)是7个葡萄糖单元经α-1,4-糖苷键连接而成的环状聚合物，具有内腔疏水而外部亲水的中空圆筒形立体结构，可以容纳与其形状和大小适合的疏水性客体分子，且有着无毒或极低毒性、安全无害的特点，是食品添加剂使用标准(GB2760-2014)允许添加的物质，可用其改善有机酸、脂肪酸、芳香族和极性化合物等疏水客体分子易挥发、稳定性差的缺陷，在食品、材料、医药等领域广泛应用，具有很高的经济价值。
工业上，β-环糊精的生产常用酶法制备工艺完成，即使用β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-Cyclodextringlycosyltransferase,β-CGT酶)作用淀粉获得。β-CGT酶是α-淀粉酶13家族(GH13)的一员，能同时利用水解、歧化、环化和偶合功能催化淀粉生成各种产物，如环糊精、低聚糖及各类糊精类物质。然而，CGT酶在表观上是一种从淀粉分子的非还原末端开始降解的外切酶，不能跨过支化点(α-1,6糖苷键)，而淀粉底物中通常含有75％～80％的支链淀粉，这极大地降低了环糊精生产过程中淀粉底物的利用率和β-环糊精的生产效率。
目前，针对β-CGT酶受到α-1,6糖苷键限制，无法高效制备β-环糊精问题的解决策略较少。相关专利仅有一项，江苏省奥谷生物科技有限公司使用普鲁兰酶或异淀粉酶与CGT酶进行协同反应生产β-环糊精(楼志华,丁红辉,周立等.β-环糊精的制备工艺[P].江苏：CN201510122435.8,2015-03-19.)，但其需调节pH，预处理和酶反应过程温度较高且酶反应时间较长，不利于降低β-环糊精生产的能耗和提升效率。
发明内容
为了解决β-CGT酶受到α-1,6糖苷键限制，无法高效制备β-环糊精的问题，本发明提供一种制备β-环糊精的方法，具体为一种在环化反应过程中使用糊精脱支酶水解α-1,6糖苷键，解除分支点对β-CGT酶的限制，提高β-环糊精制备效率的方法。
本发明通过以下方案实现：
本发明的目的是提供一种制备β-环糊精的方法，包括以下步骤：
(1)向酶反应底物中加入β-环糊精葡萄糖基转移酶和SsGDE酶进行预处理；
(2)将步骤(1)所得预处理后的底物中加入β-环糊精葡萄糖基转移酶与环己烷进行反应，制备得到β-环糊精。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述SsGDE酶为来源于Saccharolobussolfataricus的糊精脱支酶(GenBank:AAK42273.1/UniProt:Q7LX99)。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述SsGDE酶的用量为100U/g～1000U/g干淀粉；即每g干基淀粉加入100-1000USsGDE酶。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述酶反应底物选自木薯淀粉、玉米淀粉和小麦淀粉中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述酶反应底物的质量浓度为10％～30％。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述β-环糊精葡萄糖基转移酶的用量为1U/g～5U/g干淀粉。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述预处理的条件为：70℃～90℃液化30min～90min。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述反应的时间为6h～10h；所述反应的温度为40℃～45℃。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述β-环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为1U/g～5U/g干淀粉。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述环己烷的体积浓度为1％～3％。
在本发明的一种实施方式中，所述酶反应底物在预处理之前还包括调浆处理：50℃、300rpm下搅拌5min～10min至体系均匀混合。
本发明中所用的SsGDE酶是来源于Saccharolobussolfataricus的糊精脱支酶，能够对糊精分子中DP12-20的侧链进行高效脱支。
本发明使用糊精脱支酶(SsGDE酶)提高了β-环糊精的转化率并缩短β-环糊精的制备时间。
本发明高效制备β-环糊精的方法不影响β-环糊精在产物中的占比以及后续分离工艺。
本发明在环糊精制备的液化阶段加入热稳定性良好的糊精脱支酶，其在液化过程中可促进β-CGT酶对淀粉底物进行水解，降低体系粘度，液化结束后糊精脱支酶仍具有酶活力，可与β-CGT酶继续发挥协同作用，促进环化反应的进行。因此，本发明中糊精脱支酶在环糊精制备的两个阶段中均发挥了作用，更有利于β-环糊精转化率的提升。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明提供了一种制备β-环糊精的方法，本发明制备方法的优势在于无需调节酶反应体系pH或加入金属离子辅助，预处理和反应过程的温度均较低，且最佳反应条件下可将β-环糊精转化率提升43.95％，并将酶反应时间从10～12h缩短至6h。另外，本发明所使用的糊精脱支酶具有良好的热稳定性，可在液化阶段加入，经液化阶段高温处理后不会明显失去酶活力，仍可对β-环糊精制备起到良好的促进作用。并且，本发明所使用的糊精脱支酶是一种对DP 12-20链段具有高效专一脱支活力的脱支酶，不会产生大量抑制β-CGT酶活力的小分子低聚糖。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明实施例6中不使用糊精脱支酶制备的β-环糊精产物的HPLC图；
图2是本发明实施例6中不使用糊精脱支酶制备的β-环糊精产物的HPLC图的局部放大图；
图3是本发明实施例6中使用糊精脱支酶制备的β-环糊精产物的HPLC图；
图4是本发明实施例6中使用糊精脱支酶制备的β-环糊精产物的HPLC图的局部放大图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明中使用的测试方法如下：
1、β-环糊精转化率的测定和计算方法：从反应体系中取样并使用分析天平精确称量其质量，用去离子水稀释，蒸馏30min至环己烷不再蒸出，定容至250mL，测定β-环糊精的含量测定。使用酚酞法对定容后样品中的β-环糊精含量进行测定，具体而言，取1mL待测溶液，加入3.5mL30mMNaOH，再加入0.5mL由5mMNa2CO3溶液配制的0.02％(w/v)酚酞溶液(pp)，室温下显色20min，于波长550nm下测定吸光度，以去离子水作为空白。同时，以0mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL的β-环糊精标品进行实验，绘制标准曲线。β-环糊精转化率为体系中生成的β-环糊精的总质量与所用淀粉底物的质量的比值。
2、产物中β-环糊精占比的测定和计算方法：β-CGT酶作用淀粉时的主要产物是β-环糊精，但其还有α-环糊精、γ-环糊精以及其他小分子糖生成，对后续β-环糊精的结晶分离有一定影响。因此，使用高效液相色谱法(HPLC)测定产物中β-环糊精的纯度和占比。HPLC的测试条件为：Agilent1260InfinityII高效液相色谱仪(配示差折光检测器)，色谱柱HypersilGOLDAmino(4.6mm×250mm)，流动相为60％的乙腈水溶液，柱温为30℃，流速为1mL/min。β-环糊精的纯度为β-环糊精的质量与产物中所有环糊精和小分子糖的质量总和的比例。
3、SsGDE酶的生产方法：将SsGDE酶的甘油管菌种(EscherichiacoliBL21(DE3)-pET20b(+)/gde)100μL接入到50mLLB培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)在37℃、200rpm条件下培养12h，进行活化步骤；活化结束后，取2mL活化后菌液加于50mLTB培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)中，在37℃、200rpm条件下培养3h；之后，向培养基中加入20μLIPTG诱导剂，其终浓度为0.01mM，在25℃、200rpm条件下培养96h。发酵结束后，8000r/min离心15min，收集上清液，得到SsGDE酶。
实施例1不使用和使用糊精脱支酶的β-环糊精制备方法及其转化率比较。
不使用糊精脱支酶的β-环糊精制备方法：在500mL两口烧瓶中以250g体系进行β-环糊精生产，以20％(干基，w/w)木薯淀粉为底物，加入2U/g(淀粉干基)的β-CGT酶，升温至70℃热处理1h后，降温至45℃，加入2U/g(淀粉干基)的β-CGT酶和1.5％(v/v)的环己烷，反应10h，取样测定β-环糊精含量并计算转化率。
使用糊精脱支酶的β-环糊精制备方法：在500mL两口烧瓶中以250g体系进行β-环糊精制备，以20％(干基，w/w)木薯淀粉为底物，加入2U/g(淀粉干基)的β-CGT酶和750U/g(淀粉干基)的SsGDE酶，升温至70℃预处理1h后，降温至45℃，加入2U/g(淀粉干基)的β-CGT酶和1.5％(v/v)的环己烷，反应10h，取样测定β-环糊精含量并计算转化率。
本实施例中不同制备方法所得β-环糊精的转化率结果如表1所示：
表1糊精脱支酶对β-环糊精转化率的影响
由表1可以看出，相比于不使用糊精脱支酶的制备方法，使用糊精脱支酶能够明显提高β-环糊精转化率，提高比例达43.95％。
实施例2缩短反应时间后，不使用和使用糊精脱支酶的β-环糊精制备方法及其转化率比较。
本实施例中不使用糊精脱支酶的β-环糊精制备方法和使用糊精脱支酶的β-环糊精制备方法均与实施例1相似，区别仅在于：β-环糊精制备过程中的反应时间由10h缩短至6h，其他预处理方式、反应过程和检测方式不变。
本实施例中不同制备方法所得β-环糊精的转化率结果如表2所示：
表2缩短反应时间后糊精脱支酶对β-环糊精转化率的影响
由表2可以看出，反应6h时，相比于不使用糊精脱支酶的制备方法，使用糊精脱支酶能够明显提高β-环糊精转化率，提高比例达38.15％。同时，使用糊精脱支酶协同制备β-环糊精6h时转化率高于实施例1中不使用糊精脱支酶制备β-环糊精10h时的转化率，说明糊精脱支酶的使用可以显著缩短β-环糊精的制备时间。
实施例3以不同来源淀粉作为底物，不使用和使用糊精脱支酶的β-环糊精制备方法及其转化率比较。
本实施例中不使用糊精脱支酶的β-环糊精制备方法和使用糊精脱支酶的β-环糊精制备方法均与实施例1相似，区别仅在于：以玉米淀粉或小麦淀粉作为底物，其他预处理方式、反应过程和检测方式不变。
本实施例中不同制备方法所得β-环糊精的转化率结果如表3所示：
表3以不同来源淀粉作为底物糊精脱支酶对β-环糊精转化率的影响
由表3可以看出，以其他来源淀粉作为底物时，糊精脱支酶在β-环糊精制备中应用，也可起到一定的促进效果。以玉米淀粉为底物时，糊精脱支酶的使用可将β-环糊精的转化率提升10.21％；以小麦淀粉为底物时，糊精脱支酶的使用可将β-环糊精转化率提升4.36％。由此可见，糊精脱支酶对以不同淀粉为底物的β-环糊精制备均有一定的促进作用，可广泛应用。
实施例4不同底物浓度时，不使用和使用糊精脱支酶的β-环糊精制备方法及其转化率比较。
本实施例中不使用糊精脱支酶的β-环糊精制备方法和使用糊精脱支酶的β-环糊精制备方法均与实施例1相似，区别仅在于：木薯淀粉底物浓度为10％或30％，其他预处理方式、反应过程和检测方式同实施例1。
本实施例中不同制备方法所得β-环糊精的转化率结果如表4所示：
表4以不同浓度木薯淀粉作为底物糊精脱支酶对β-环糊精转化率的影响
由表4可以看出，当木薯淀粉底物浓度为10～30％时，糊精脱支酶在β-环糊精制备中应用，均可起到一定的促进效果。当木薯淀粉底物浓度为10％时，糊精脱支酶的使用可将β-环糊精转化率提升20.81％；当木薯淀粉底物浓度为30％时，糊精脱支酶的使用可将β-环糊精转化率提升25.14％。由此可见，糊精脱支酶对不同底物浓度的β-环糊精制备均有一定的促进作用，可广泛应用。
实施例5不使用和使用不同用量糊精脱支酶的β-环糊精制备方法及其转化率比较。
本实施例中不使用糊精脱支酶的β-环糊精制备方法和使用糊精脱支酶的β-环糊精制备方法均与实施例1相似，区别仅在于：糊精脱支酶的用量不同，具体分别为50U/g、100U/g、250U/g、500U/g以及1000U/g干淀粉，其他预处理方式、反应过程和检测方式同实施例1。
本实施例中不同制备方法所得β-环糊精的转化率结果如表5所示：
表5不同用量糊精脱支酶对β-环糊精转化率的影响
由表5可以看出，当糊精脱支酶用量较少时(50U/g干淀粉)，糊精脱支酶几乎无法促进β-环糊精的生成；当糊精脱支酶用量为100U/g～1000U/g干淀粉时，糊精脱支酶的使用对β-环糊精制备均有一定促进作用。同时，考虑到糊精脱支酶的促进效果和制备成本，认为糊精脱支酶的用量为750U/g干淀粉较为适宜，即实施例1。
实施例6糊精脱支酶促进β-环糊精生产对其在产物中占比的影响。
通过实施例1的不同制备方法进行β-环糊精的制备，并使用HPLC测定和计算β-环糊精在产物中的占比。HPLC对环糊精制备产物的鉴定如图1至图4所示，β-环糊精在产物中占比的计算结果如表6所示：
表6糊精脱支酶对β-环糊精在产物中占比的影响
由图1～4和表6可以看出，糊精脱支酶的使用不会使β-环糊精制备的副产物增加，且一定程度上可以提升β-环糊精的占比，有利于后续β-环糊精的结晶分离。
对比例1不使用和在环化反应阶段使用糊精脱支酶的β-环糊精制备方法及其转化率比较
本对比例中不使用糊精脱支酶的β-环糊精制备方法和在环化反应阶段使用糊精脱支酶的β-环糊精制备方法均与实施例1相似，区别仅在于：糊精脱支酶的加入时间在环化反应进行的0h、1h、3h、6h，其他预处理方式、反应过程和检测方式同实施例1。
本对比例中不同制备方法所得β-环糊精的转化率结果如表7所示：
表7环化反应阶段使用糊精脱支酶对β-环糊精转化率的影响
由表7可以看出，在环化反应进行的0h、1h、3h以及6h使用糊精脱支酶，对β-环糊精转化率均有一定提升作用，可分别提升27.39％、24.32％、18.09％以及16.15％，但其提升效果均不如实施例1中的43.95％。因此可以得出结论，糊精脱支酶在环化反应液化阶段加入的使用效果最佳，即实施例1。
对比例2不使用和使用普鲁兰酶的β-环糊精制备方法及其转化率比较
本对比例中不使用普鲁兰酶的β-环糊精制备方法和使用普鲁兰酶的β-环糊精制备方法均与实施例1相似，区别仅在于：该制备方法中使用的脱支酶为普鲁兰酶，其他预处理方式、反应过程和检测方式同实施例1。
本对比例中不同制备方法所得β-环糊精的转化率结果如表8所示：
表8普鲁兰酶对β-环糊精转化率的影响
由表8可以看出，普鲁兰酶的使用对β-环糊精转化率的提升无明显积极效果，且会使其下降16.72％。与实施例1对比，可得出结论：无法使用普鲁兰酶替换本发明中使用的糊精脱支酶。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (5)
1.一种制备β-环糊精的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）向酶反应底物中加入β-环糊精葡萄糖基转移酶和SsGDE酶进行预处理；
（2）将步骤（1）所得预处理后的底物中加入β-环糊精葡萄糖基转移酶与环己烷进行反应，制备得到β-环糊精；
步骤（1）中，所述SsGDE酶为来源于Saccharolobus solfataricus的糊精脱支酶；
步骤（1）中，所述SsGDE酶的用量为100 U/g~1000 U/g干淀粉；
步骤（1）中，所述酶反应底物的质量浓度为10%~30%；
步骤（1）中，所述β-环糊精葡萄糖基转移酶的用量为1 U/g~5 U/g干淀粉；
步骤（1）中，所述预处理的条件为：70℃~90℃液化30 min~90 min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述酶反应底物选自木薯淀粉、玉米淀粉和小麦淀粉中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述反应的时间为6 h ~10 h；所述反应的温度为40℃~45℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述β-环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为1 U/g~5 U/g干淀粉。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述环己烷的体积浓度为1%~3%。
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