CN103352060A

CN103352060A - 一种基于淀粉脱支法的大环糊精制备方法

Info

Publication number: CN103352060A
Application number: CN2013103121183A
Authority: CN
Inventors: 金征宇; 许燕; 周星; 王金鹏; 徐学明
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-07-24
Filing date: 2013-07-24
Publication date: 2013-10-16
Anticipated expiration: 2033-07-24
Also published as: CN103352060B

Abstract

本发明公开一种基于淀粉脱支法的大环糊精制备方法，以淀粉为酶反应底物，经淀粉脱支处理、4-α-糖基转移酶作用、糖化酶处理、乙醇沉淀、冻干后即得大环糊精成品；所述淀粉为不同来源的天然淀粉，包括普通玉米淀粉、普通木薯淀粉。本发明直接以价格低廉的天然淀粉为底物即可制备得到高转化率、高纯度的大环糊精纯品，工艺简单，经济高效。

Description

一种基于淀粉脱支法的大环糊精制备方法

技术领域

本发明涉及大环糊精的制备方法，尤其涉及基于淀粉脱支法的大环糊精的制备方法。属于食品加工技术领域。

背景技术

大环糊精是一类由9个及以上葡萄糖残基经α-1, 4糖苷键连接而成的环状麦芽聚糖的总称，具有水溶性好、黏度低、不易回生等特点，可与客体分子形成包合物从而起到保护客体分子及提高客体分子溶解度的作用，因此，其在食品、医药、化学工业领域具有很大的应用潜力。

众所周知，淀粉由直链淀粉和支链淀粉两类组成，天然淀粉中直链、支链淀粉之比约为15~28%比72~85%，由于4-α-糖基转移酶的最适底物是直链淀粉，其作用于支链淀粉制备得到的大环糊精量很小，从而使含有大量支链淀粉的天然淀粉无法用于大环糊精的工业化生产。目前，大环糊精的生产方法通常是以直链淀粉含量较高的马铃薯直链淀粉为底物，通过4-α-糖基转移酶作用来生产，此种方法虽可获得较高的转化率，但由于直链淀粉制备成本较高，价格昂贵，其大规模生产和工业化应用均受到极大限制。

鉴于此，寻找一种具有工业化大规模生产潜能的高效、低成本的大环糊精制备途径具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有大环糊精制备工艺存在的上述缺陷，本申请人经过研究改进，提供一种高效、低成本的基于淀粉脱支法的大环糊精制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种基于淀粉脱支法的大环糊精制备方法，以淀粉为酶反应底物，经淀粉脱支处理、4-α-糖基转移酶作用、糖化酶处理、乙醇沉淀、冻干后即得大环糊精成品；所述淀粉为不同来源的天然淀粉，包括普通玉米淀粉、普通木薯淀粉。

具体包括以下步骤：

（1）淀粉的脱支：以预热的50mM，pH 3.5的醋酸钠缓冲液为溶剂，将所述淀粉配制成1wt%的淀粉溶液，加入5~10U/g异淀粉酶，于40℃，pH 3.5的条件下脱支12h，然后沸水浴灭酶；

（2）1wt%脱支淀粉溶液的制备：向步骤（1）所得脱支反应液中加入6倍体积的无水乙醇，于5000rpm离心8~12min，弃上清，向沉淀物中加入预热的Tris-HCl缓冲液至沉淀重量百分浓度为1wt%，煮沸30~60min，即得；

（3）4-α-糖基转移酶作用：向步骤（2）所得脱支淀粉溶液中加入10U/g栖热水生菌4-α-糖基转移酶，于70℃，pH 7.5的条件下反应1~24h，优选为12h，

然后沸水浴灭酶；

（4）糖化酶处理：向步骤（3）所得反应液中加入4倍体积的的醋酸钠缓冲液，混匀后加入0.4U/ml的糖化酶，于50℃，pH 5.5的条件下反应6h以水解残留底物，然后沸水浴灭酶，离心除去变性酶蛋白；

（5）乙醇沉淀：向步骤（4）所得上清液中加入10倍体积的无水乙醇，离心沉淀大环糊精；

（6）冻干：将步骤（5）所得沉淀物于-20℃冷冻过夜后冻干48h以除去残留的水分和乙醇，即得大环糊精成品。

其进一步的技术方案为：

所述淀粉于步骤（1）所述操作前先进行预处理，步骤如下：用90%二甲基亚砜将所述淀粉配制成1wt%的淀粉溶液，沸水浴1h后于室温条件下搅拌过夜，再加入6倍体积的无水乙醇，于5000rpm离心10min，取沉淀即得。

步骤（2）所述Tris-HCl缓冲液浓度为50mM，pH 7.5。

步骤（4）所述醋酸钠缓冲液浓度为50mM，pH 5.5。

步骤（4）所述糖化酶来源于根霉属。

本发明的有益技术效果如下：

本发明通过淀粉脱支处理这一创造性工艺步骤的引入，并结合4-α-糖基转移酶作用、糖化酶处理、乙醇沉淀等步骤工艺参数的摸索优化，首次克服了天然淀粉无法直接高效制备大环糊精的技术瓶颈，直接以价格低廉的天然淀粉为底物即可制备得到高转化率、高纯度的大环糊精纯品，省去了提取和改性成本，工艺简单，经济高效，为天然淀粉的高效利用及大环糊精的工业化生产开辟了一条新途径。实验证明，通过本发明制备工艺，不同来源的淀粉大环糊精转化率均得到很大程度的提升，具有工业化大规模生产的潜能。

附图说明

图1为本发明实施例1中普通玉米淀粉大环糊精转化率随时间变化的示意图。

图2为本发明实施例2中普通木薯淀粉大环糊精转化率随时间变化的示意图。

图3为本发明实施例3中大环糊精纯品质谱图。

图4为本发明实施例3中高直链玉米淀粉大环糊精转化率随时间变化的示意图。

具体实施方式

以下结合附图，并通过实施例对本发明进行具体说明。

以下实施例1~实施例3所述各原料均为市售商品，所述各试验方法和实验仪器如无特殊说明均属本领域常规。

实施例1 普通玉米淀粉脱支法生产大环糊精

具体制备步骤如下：

（1）玉米淀粉的脱支预处理及1wt%淀粉溶液的配制：称取10mg普通玉米淀粉（购自杭州普罗星淀粉有限公司），加入1ml 90%二甲基亚砜，沸水浴1h后于室温条件下磁力搅拌过夜，再加入6倍体积的无水乙醇，于5000rpm离心10min，弃上清，向所得沉淀物中加入1ml预热的醋酸钠缓冲液（50mM，pH 3.5)，煮沸30min即得1wt%普通玉米淀粉溶液。

（2）普通玉米淀粉的脱支：向步骤（1）制备的1wt%普通玉米淀粉溶液中加入7.5U/g异淀粉酶（购自爱尔兰Megazyme公司），于40℃，pH 3.5的条件下脱支12h，然后沸水浴10min灭酶。

（3）1wt%脱支淀粉溶液的制备：向步骤（2）所得脱支反应液中加入6倍体积的无水乙醇，于5000rpm离心10min，弃上清，向沉淀物中加入1ml预热的Tris-HCl缓冲液（50mM，pH 7.5) 至沉淀重量百分浓度为1wt%，煮沸30min后即得1wt%的脱支普通玉米淀粉溶液。

（4）4-α-糖基转移酶作用：向步骤（3）所得脱支普通玉米淀粉溶液中加入10U/g栖热水生菌4-α-糖基转移酶（由基因工程菌E.coli DH5α通过发酵并纯化所得），于70℃，pH 7.5的条件下反应不同时间（1h，3h，6h，12h，24h）后，沸水浴10min灭酶。

（5）糖化酶处理：向步骤（4）所得反应液中加入4倍体积醋酸钠缓冲液（50mM，pH 5.5），混匀后加入0.4U/ml根霉属来源的糖化酶（购自爱尔兰Megazyme公司），于50℃，pH 5.5的条件下反应6h以水解未反应完全的底物，然后沸水浴10min灭酶，于10000rpm离心10min除去变性酶蛋白。

（6）乙醇沉淀：向步骤（5）所得上清液中加入10倍体积的无水乙醇，于10000rpm室温离心10min，所得沉淀即为大环糊精粗品。

（7）冻干：将步骤（6）所得沉淀于-20℃冷冻过夜后冻干48h以除去其中残留的乙醇和水，即得普通玉米淀粉大环糊精纯品。

以未经脱支处理（其余处理步骤同本实施例）的普通玉米淀粉为对照，测定步骤（4）中不同反应时间下大环糊精的转化率，结果参见图1。由图1可知，经过本发明脱支处理，普通玉米淀粉大环糊精的最高转化率由20.3%提高到33.06%。

实施例2 普通木薯淀粉脱支法生产大环糊精

具体制备步骤如下：

（1）木薯淀粉的脱支预处理及1wt%淀粉溶液的配制：称取10mg普通木薯淀粉（购自杭州普罗星淀粉有限公司），加入1ml 90%二甲基亚砜，沸水浴1h后于室温条件下磁力搅拌过夜，再加入6倍体积的无水乙醇，于5000rpm离心10min，弃上清，向所得沉淀物中加入1ml预热的醋酸钠缓冲液（50mM，pH 3.5)，煮沸30min即得1wt%普通木薯淀粉溶液。

（2）普通木薯淀粉的脱支：向步骤（1）制备的1wt%普通木薯淀粉溶液中加入5U/g异淀粉酶（同上），于40℃，pH 3.5的条件下脱支12h，然后沸水浴10min灭酶。

（3）1wt%脱支淀粉溶液的制备：向步骤（2）所得脱支反应液中加入6倍体积的无水乙醇，于5000rpm离心8min，弃上清，向沉淀物中加入1ml预热的Tris-HCl缓冲液（50mM，pH 7.5)，煮沸45min后即得1wt%的脱支普通木薯溶液。

（4）4-α-糖基转移酶作用：向步骤（3）所得脱支普通木薯淀粉溶液中加入10U/g栖热水生菌4-α-糖基转移酶（同上），于70℃，pH 7.5的条件下反应不同时间（1h，3h，6h，12h，24h）后，沸水浴10min灭酶。

（5）糖化酶处理：向步骤（4）所得反应液中加入4倍体积醋酸钠缓冲液（50mM，pH 5.5），混匀后加入0.4U/ml根霉属来源的糖化酶（同上），于50℃，pH 5.5的条件下反应6h以水解未反应完全的底物，然后沸水浴10min灭酶，于10000rpm离心10min除去变性酶蛋白。

（7）冻干：将步骤（6）所得沉淀于-20℃冷冻过夜后冻干48h以除去其中残留的乙醇和水，即得普通木薯淀粉大环糊精纯品。

以未经脱支处理（其余处理步骤同本实施例）的普通木薯淀粉为对照，测定步骤（4）中不同反应时间下大环糊精的转化率，结果参见图2。由图2可知，经过本发明脱支处理，普通木薯淀粉大环糊精的最高转化率由16.82%提高到32.4%。

实施例3 高直链玉米淀粉脱支法生产大环糊精

具体制备步骤如下：

（1）高直链玉米淀粉的脱支预处理及1wt%淀粉溶液的配制：称取10mg高直链玉米淀粉（购自杭州普罗星淀粉有限公司），加入1ml 90%二甲基亚砜，沸水浴1h后于室温条件下磁力搅拌过夜，再加入6倍体积的无水乙醇，于5000rpm离心10min，弃上清，向所得沉淀物中加入1ml预热的醋酸钠缓冲液（50mM，pH 3.5)，煮沸30min即得1wt%高直链玉米淀粉溶液。

（2）高直链玉米淀粉的脱支：向步骤（1）制备的1wt%高直链玉米淀粉溶液中加入10U/g异淀粉酶（同上），于40℃，pH 3.5的条件下脱支12h，然后沸水浴10min灭酶。

（3）1wt%脱支淀粉溶液的制备：向步骤（2）所得脱支反应液中加入6倍体积的无水乙醇，于5000rpm离心12min，弃上清，向沉淀物中加入1ml预热的Tris-HCl缓冲液（50mM，pH 7.5)，煮沸60min后即得1wt%的脱支高直链玉米淀粉溶液。

（4）4-α-糖基转移酶作用：向步骤（3）所得脱支高直链玉米淀粉溶液中加入10U/g栖热水生菌4-α-糖基转移酶（同上），于70℃，pH 7.5的条件下反应不同时间（1h，3h，6h，12h，24h）后，沸水浴10min灭酶。

（7）冻干：将步骤（6）所得沉淀于-20℃冷冻过夜后冻干48h以除去其中残留的乙醇和水，即得高直链玉米淀粉大环糊精纯品。

大环糊精检测：称取所得大环糊精纯品制备成浓度为10mg/mL的大环糊精溶液，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行结构测定，结果参见图3（图3中，CA表示大环糊精，下标表示大环糊精的聚合度，大环糊精分子量的计算公式为：162n+18+23，n表示大环糊精的聚合度）。由图3可知，通过本实施例方法可制备得到聚合度范围在5~40的大环糊精纯品。

以未经脱支处理（其余处理步骤同本实施例）的高直链玉米淀粉为对照，测定步骤（4）中不同反应时间下大环糊精的转化率，结果参见图4。由图4可知，经过本发明脱支处理，高直链玉米淀粉大环糊精的最高转化率由26.85%提高到46.05%。

综上所述，经本发明脱支和制备工艺，不同来源的淀粉大环糊精转化率均得到很大程度的提升，证明本发明是一种高效的大环糊精生产方法。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于淀粉脱支法的大环糊精制备方法，其特征在于：以淀粉为酶反应底物，经淀粉脱支处理、4-α-糖基转移酶作用、糖化酶处理、乙醇沉淀、冻干后即得大环糊精成品；所述淀粉为不同来源的天然淀粉，包括普通玉米淀粉、普通木薯淀粉。

2.根据权利要求1所述基于淀粉脱支法的大环糊精制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：

（1）淀粉的脱支：以预热的50mM，pH 3.5的醋酸钠缓冲液为溶剂，将所述淀粉配制成1wt%的淀粉溶液，加入5~10U/g异淀粉酶，于40℃，pH3.5的条件下脱支12h，然后沸水浴灭酶；

（3）4-α-糖基转移酶作用：向步骤（2）所得脱支淀粉溶液中加入10U/g栖热水生菌4-α-糖基转移酶，于70℃，pH7.5的条件下反应1~24h，然后沸水浴灭酶；

3.根据权利要求2所述基于淀粉脱支法的大环糊精制备方法，其特征在于所述淀粉于步骤（1）所述操作前先进行预处理，步骤如下：用90%二甲基亚砜将所述淀粉配制成1wt%的淀粉溶液，沸水浴1h后于室温条件下搅拌过夜，再加入6倍体积的无水乙醇，于5000rpm离心10min，取沉淀即得。

4.根据权利要求2所述基于淀粉脱支法的大环糊精制备方法，其特征在于：步骤（2）所述Tris-HCl缓冲液浓度为50mM，pH 7.5。

5.根据权利要求2所述基于淀粉脱支法的大环糊精制备方法，其特征在于：步骤（3）所述反应时间为12h。

6.根据权利要求2所述基于淀粉脱支法的大环糊精制备方法，其特征在于：步骤（4）所述醋酸钠缓冲液浓度为50mM，pH 5.5。

7.根据权利要求2所述基于淀粉脱支法的大环糊精制备方法，其特征在于：步骤（4）所述糖化酶来源于根霉属。