CN103952358A - 一株生物转化生产蒜糖醇的大肠杆菌工程菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一株生物合成蒜糖醇的大肠埃希氏菌工程菌株及其构建方法与应用，公开了一株大肠埃希氏菌重组菌株strainII。实验证明，利用该菌株的静息细胞反应可以将D-果糖转化为蒜糖醇，该稀少糖醇在食品和医药行业具有广泛的应用前景。

Description

一株生物转化生产蒜糖醇的大肠杆菌工程菌株及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说是涉及利用基因工程技术和微生物学方法制备的一株大肠埃希氏菌工程菌株及其构建方法，以及将其用于转化生产蒜糖醇中的应用。 
背景技术
稀少糖（Rare Sugar）是自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物（2002年国际稀少糖学会ISRS定义），其味道类似于蔗糖，但具有热量低、稳定性高、甜味协调、无吸湿性、无致龋齿性、耐受性高等优点，对改善特殊人群的饮食起到重要作用。另外，大量研究结果还表明稀少糖在抗癌、清除自由基、神经保护等诸多方面发挥着重要的生理活性作用，还可和蛋白及多肽等活性物质发生美拉德反应从而优化其功能活性（Zeng Y, Zhang X, Guan Y, Sun Y. Characteristics and antioxidant activity of Maillard reaction products from psicose-lysine and fructose-lysine model systems. J Food Sci. 2011, 76(3):C398-403；Sun Y, Hayakawa S, Ogawa M, Fukada K, Izumori K. Influence of a rare sugar, d-Psicose, on the physicochemical and functional properties of an aerated food system containing egg albumen. J Agric Food Chem. 2008, 56(12):4789-4796.）。功能性稀少糖具有独特的生物学活性，市场开发潜力较大。 
    蒜糖醇（allitol）是一种六碳稀少糖醇，具有一定的降血糖功能，而且降糖过程缓慢平稳，即使大量服用也不会发生低血糖危险，服用安全，可用于制备治疗糖尿病药物；另外，蒜糖醇具有对称性，可以作为D-型和L-型六碳稀少糖相互转化的连接中心。因此，蒜糖醇不仅可用于甜味剂、保健品、降糖药物，还可以用来生产其它稀少己糖。 
    目前，蒜糖醇的生产方式主要是提取法和化学转化法，生产效率低，成本高。日本的研究学者何森健（Izumori Ken）教授建立的Izumoring策略为稀少糖的生物转化提供了一条新的途径（Izumori K. Izumoring: a strategy for bioproduction of all hexoses. J Biotechnol. 2006, 124(4):717-722）。研究发现，某些微生物可以实现D-阿洛酮糖和蒜糖醇之间的相互转化，如集聚肠杆菌Enterobacter agglomerans 221e（Muniruzzaman S, Tokunaga H, Izumori K. Conversion of D-psicose to allitol by Enterobacter agglomerans strain 221e. J Ferment BioengVolume. 1995, 79(4):323-327），该文献报道了以D-阿洛酮糖为底物转化生产蒜糖醇，但该菌底物特异性较差，如以D-果糖和D-阿洛酮糖混合物进行转化可能生成其他副产物；又如产气肠杆菌Enterobacter aerogenes IK7（Gullapalli P, Takata G, Poonperm W, Rao D, Morimoto K, Akimitsu K, Tajima S, Izumori K. Bioproduction of D-psicose from allitol with Enterobacter aerogenes IK7: a new frontier in rare ketose production. Biosci Biotechnol Biochem. 2007, 71(12):3048-3054），该文献只报道了以蒜糖醇为底物转化生产D-阿洛酮糖，国内尚未有相关报道。国外的主要专利有： 
[1] Ikumori Takeshi, Tsuzaki keiji. Ribitol dehydrogenase and its production and use. Japan, JP19940218155, 1994-08-20.
该专利公开了利用产气肠杆菌Enterobacter aerogenes IK7生产1-脱氧-L-阿洛酮糖和1-脱氧-L-果糖等脱氧稀少糖的方法，但是没有涉及生产蒜糖醇的方法。
[2] Izumori Ken, Morimoto Kenji, Takata Goro, Tokuda Masaaki, Tsujisaka Yoshio, Takeshita Kei, Tsusaki Keiji, Okuma Kazuhiro. Microorganism with ability to produce deoxy polyol dehydrogenase and use thereof. Japan, JP20060313672,  2006-11-20. 
该专利公开了利用集聚肠杆菌Enterobacter agglomerans 221e的氧化和还原作用分别生产多种稀少糖和糖醇的方法，但该菌底物特异性较差，如以D-果糖和D-阿洛酮糖混合物进行转化可能生成其它副产物。
发明内容
    本发明的目的是提供一株用于转化生产蒜糖醇的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株。 
本发明所提供的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株的名称为strain II，该菌株已于2014年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.9024。 
本发明另一目的在于提供一种构建大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II CGMCC No.9024的方法，包括以下步骤： 
（1）PCR扩增来源于瘤胃菌（Ruminococcus sp.）的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因（dpe），连接到载体pET-21a上，构建D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的表达载体pET-dpe；PCR扩增来源于产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）CGMCC7662的核糖醇脱氢酶基因（rdh）和来源于念珠菌（Candida methylica）X81129的甲酸脱氢酶基因（fdh），连接到载体pCDFDuetTM-1上，构建核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的双酶表达载体pCDF-rdh-fdh；PCR扩增来源于运动发酵单孢菌（Zymomonas mobilis subsp. mobilis）ZM4的葡萄糖转运蛋白基因（glf），连接到pACYC184M载体上，构建葡萄糖转运蛋白的表达载体pACYC184M-glf。
（2）向大肠埃希氏菌BL21 star中导入D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的表达载体pET-dpe、核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的双酶表达载体pCDF-rdh-fdh和葡萄糖转运蛋白的表达载体pACYC184M-glf，得到重组大肠埃希氏菌strain II。 
本发明还一目的在于提供所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II CGMCC No.9024在转化生产蒜糖醇中的应用。 
具体的，将大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株strain II CGMCC No.9024重悬于Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液中，制备成细胞浓度达到OD600=40-80（优选为60）的静息细胞溶液；然后使用D-果糖作为底物，底物浓度为5-15％（优选为10％，质量／体积百分浓度），在30-45℃（优选为42℃）、pH 6.0-8.0（优选为7.0）、厌氧条件下反应12-18h（优选为15h），将底物转化为蒜糖醇。 
采用以上技术方案，本发明提供了一株大肠埃希氏菌工程菌株strain II及其构建方法。实验证明，利用该菌株的静息细胞，可以D-果糖为底物，转化生产蒜糖醇。因此，本发明的大肠埃希氏菌工程菌株strain II可应用于蒜糖醇生产领域，生产的蒜糖醇在食品和医药行业具有广泛的应用前景。 
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。 
附图说明
图1为构建大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II和用其转化生产蒜糖醇的技术路线。 
图2为大肠埃希氏菌工程菌株strain II静息细胞以D-果糖为底物转化生产蒜糖醇最适反应温度的结果。 
图3为大肠埃希氏菌工程菌株strain II静息细胞以D-果糖为底物转化生产蒜糖醇最适反应pH的结果。 
图4为大肠埃希氏菌工程菌株strain II静息细胞以不同浓度D-果糖为底物转化生产蒜糖醇的结果。 
具体实施方式
本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。 
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell， David W.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor）。 
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。 
本发明中所用引物由大连宝生物公司合成。 
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。 
实施例1、构建大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II
本发明具体提供一株用于生产蒜糖醇的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II及其构建方法，其技术路线如图1所示，包括以下三个方面：（1）将来源于瘤胃菌（Ruminococcus sp.）的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因（dpe）连接到载体pET21上，构建表达载体pET-dpe，该基因表达产物可以将D-果糖转化成D-阿洛酮糖；（2）将来源于产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）CGMCC7662的核糖醇脱氢酶基因（rdh）和来源于念珠菌（Candida methylica）X81129的甲酸脱氢酶基因（fdh）连接到载体pCDFDuetTM-1上，构建双酶表达载体pCDF-rdh-fdh，rdh基因的表达产物可以将D-阿洛酮糖转化成蒜糖醇，fdh的表达产物作为辅酶再生系统中的关键酶，在其催化甲酸脱氢的同时将NAD+转化成NADH，作为D-阿洛酮糖转化为蒜糖醇反应中的辅酶因子；（3）将来源于运动发酵单孢菌（Zymomonas mobilis subsp. mobilis）ZM4的葡萄糖转运蛋白基因（glf）连接到pACYC184M载体上，构建表达载体pACYC184M-glf，该基因表达产物可以提高D-果糖转运到细胞内部的速率。
具体来讲，本发明大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II的构建方法，包括以下步骤： 
（1）利用引物1和引物2 PCR扩增来源于瘤胃菌（Ruminococcus sp.）的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因（dpe），连接到载体pET-21a上，构建D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的表达载体pET-dpe；利用引物3和引物4 PCR扩增来源于产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）CGMCC7662的核糖醇脱氢酶基因（rdh），利用引物5和引物6 PCR扩增来源于念珠菌（Candida methylica）X81129的甲酸脱氢酶基因（fdh），连接到载体pCDFDuetTM-1上，构建核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的双酶表达载体pCDF-rdh-fdh；利用引物7和引物8 PCR扩增PCR扩增来源于运动发酵单孢菌（Zymomonas mobilis subsp. mobilis）ZM4的葡萄糖转运蛋白基因（glf），连接到pACYC184M载体上，构建葡萄糖转运蛋白的表达载体pACYC184M-glf。引物序列如下：
引物1：5’-GGAATTCCATATGAAATATGGTATTTATTACG-3’
引物2：5’-CCGCTCGAGTTAGACTTCAAATACATG-3’
引物3：5’-CGGAATTCGATGAATACTTCCCTTAGCGGTAA-3’
引物4：5’-CCCAAGCTTTCAGAGATCCACGCTGTTCGG-3’
引物5：5’-GAAGATCTCATGAAGATCGTTTTAGTCT-3’
引物6：5’-GGGGTACCTTATTTCTTATCGTGTTTACCGT-3’
引物7：5’-CGGAATTCAGTTCTGAAAGTAGTCAGGG-3’
引物8：5’-AACTGCAGCTACTTCTGGGAGCG-3’
（2）向大肠埃希氏菌BL21 star中导入D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的表达载体pET-dpe、核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的双酶表达载体pCDF-rdh-fdh和葡萄糖转运蛋白的表达载体pACYC184M-glf，得到重组大肠埃希氏菌strain II。
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II菌株已于2014年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.9024。 
    实施例2、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II在转化生产蒜糖醇中的应用
（1）大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II的培养
将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II CGMCC No.9024接种于含有100μg/ml氨苄青霉素、100μg/ml链霉素和10μg/ml氯霉素的LB培养基，在37℃、pH 7.0、200rpm条件下对菌株进行发酵培养，至OD600值为0.8-1.0，加入IPTG至终浓度1.0mmol/L，20°C，100rpm，诱导过夜。
（2）大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II静息细胞的制备 
离心收集诱导后的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II CGMCC No.9024菌体，用pH　7.0的Tris-HCl缓冲液（配方：50mM Tris水溶液，用盐酸调制pH为7.0）洗涤菌体2-3次，加入pH　7.0的Tris-HCl缓冲液重悬细胞，得到的细胞悬浮液即为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II CGMCC No.9024静息细胞。
（3）蒜糖醇的转化生产 
以100mM D-果糖为底物，并添加200mM甲酸钠，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II CGMCC No.9024静息细胞终浓度为OD600=60，厌氧条件下，分别在25、30、37、42、50℃下反应18h。结果显示，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II CGMCC No.9024转化生产蒜糖醇的最适反应温度为42℃，当温度提高到50℃时，转化率降低了60%（图2）。
实施例3、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II在转化生产蒜糖醇中的应用
方法与实施例2相同，不同之处是在不同pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0），42℃下反应18h。结果显示，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II CGMCC No.9024转化生产蒜糖醇的最适反应pH值为7.0，当pH大于8.0时，转化反应的转化效率降低较快（图3）。
实施例4、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II在转化生产蒜糖醇中的应用
方法与实施例2相同，不同之处是在100、200、300、500mM D-果糖浓度（对应甲酸钠浓度为200、400、600、1000mM），42℃下反应18h。结果显示，在低底物浓度下，例如100和200 mM，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II CGMCC No.9024将几乎所有的D-果糖都转化为了蒜糖醇；在高底物浓度下，例如300和500 mM，只有将近50%的D-果糖转化为了蒜糖醇。当底物浓度为500 mM时，产物蒜糖醇产量最高，达到48.62 g/L（图4）。
实施例2-4说明使用本发明的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)工程菌株strain II CGMCC No.9024可以实现蒜糖醇的生物转化法生产，可以将D-果糖转化为功能性稀少糖醇—蒜糖醇，最高转化率几乎达到100%，最高产量48.62 g/L。由于转化反应使用更为廉价的D-果糖作为底物，大大降低了成本。且蒜糖醇可以应用于制备医药品（如糖尿病治疗药物等）、保健品、其它稀少糖的原料等诸多领域中，应用前景广泛。 

Claims (9)

1.大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株strain II，保藏编号为CGMCC No.9024。
2.一种构建权利要求1所述大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株strain II CGMCC No.9024的方法，即向大肠埃希氏菌中引入D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因、核糖醇脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和葡萄糖转运蛋白基因，得到重组大肠埃希氏菌，命名为strain II。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：构建携带D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因、核糖醇脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和葡萄糖转运蛋白基因的重组大肠埃希氏菌strain II的具体方法包括以下步骤：
(1) PCR扩增来源于瘤胃菌（Ruminococcus sp.）的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因（dpe），连接到载体pET-21a上，构建D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的表达载体pET-dpe；PCR扩增来源于产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）CGMCC7662的核糖醇脱氢酶基因（rdh）和来源于念珠菌（Candida methylica）X81129的甲酸脱氢酶基因（fdh），连接到载体pCDFDuetTM-1上，构建核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的双酶表达载体pCDF-rdh-fdh；PCR扩增来源于运动发酵单孢菌（Zymomonas mobilis subsp. mobilis）ZM4的葡萄糖转运蛋白基因（glf），连接到pACYC184M载体上，构建葡萄糖转运蛋白的表达载体pACYC184M-glf；
(2) 向大肠埃希氏菌BL21 star中导入D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的表达载体pET-dpe、核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的双酶表达载体pCDF-rdh-fdh和葡萄糖转运蛋白的表达载体pACYC184M-glf，得到重组大肠埃希氏菌strain II。
4.权利要求1所述大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株strain II CGMCC No.9024在转化生产蒜糖醇中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于利用大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株strain II CGMCC No.9024转化生产蒜糖醇的方法如下：
将大肠埃希氏菌（Escherichia coli）工程菌株strain II CGMCC No.9024重悬于Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液中，制备成细胞浓度达到OD600=40-80（优选为60）的静息细胞溶液；然后使用D-果糖作为底物，底物浓度为5-15％（优选为10％，质量／体积百分浓度），在30-45℃（优选为42℃）、pH 6.0-8.0（优选为7.0）、厌氧条件下反应12-18h（优选为15h），将底物转化为蒜糖醇。
6.用权利要求5所述方法得到的蒜糖醇。
7.权利要求6所述蒜糖醇在制备医药品（如糖尿病治疗药物）中的应用。
8.权利要求6所述蒜糖醇在保健品中的应用。
9.权利要求6所述蒜糖醇作为其它稀少糖生产原料的应用。
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