FI98737C - Lämmönkestävä syklodekstriini-glykosyylitransferaasi, sen tuottaminen ja käyttö - Google Patents

Description

98737 LMmmönkestävä syklodekstriini-glykosyylitransferääsi, sen tuottaminen ja käyttö - Termostabil cyklodextrin-glykosyl-transferas, dess tillverkning och andvändning.

Tämä keksintö kohdistuu syklodekstriini-glykosyylitransfe-5 raasiin, menetelmään sen tuottamiseksi, mikrobilajiin, joka kykenee tuottamaan sitä, ja sen käyttöön tärkkelyksen nes-teyttämisessä ja syklodekstriinin tuottamisessa.

Syklodekstriini-glykosyylitransferaasi (1 , 4-a-D-glukaani-4-a-D-(1 ,4-a-D-glukano)-transferääsi, E.C. 2.4.1.19), jota 10 jälj empänä nimitetään syklodekstriini-glykosyylitransferaa-siksi tai CGTaasiksi, on entsyymi, jolle on tunnusomaista sen kyky muodostaa syklodekstriinejä tärkkelyksen tai tärk-kelyshydrolysaatin syklisoinnilla.

Täten entsymaattiset syklisointireaktiot tuottavat syklo-15 dekstriinejä (jotka lyhennetään CD:ksi ja ne tunnetaan myös Schardinger-dekstriineinä), jotka ovat syklisiä molekyylejä, jotka koostuvat kuudesta, seitsemästä tai kahdeksasta a-D-glykopyranoositähteestä, jotka ovat a -1,4-sidosten sitomia. Ne tunnetaan vastaavasti a-, B- tai gamma-syklodeks-20 triineinä riippuen glukoositähteiden lukumäärästä 6, 7 tai 8.

Syklodekstriinejä on valmistettu tähän mennessä E.B. Til-denin ja C.S. Hudsonin (J. American Chemical Society) 64:1432(1942], kuvaaman menetelmän muunnoksilla, joka mene-25 telmä käsittää nesteytetyn tärkkelyksen käsittelemisen Bacillus maceransiksesta peräiisin olevalla syklodekstriini-• glykosyylitransferaasi-(CGTaasi)-entsyymillä. Kaikilla tä män menetelmän muunnelmilla on lukuisia huonoja puolia. Ensiksikin, koska CGTaasi ei ole riittävän lämmönkestävä 30 käytettäväksi tärkkelyksen hyytelöitymislämpötilan yläpuolella, täytyy tärkkelys esikäsitellä esimerkiksi a-amylaa-silla tärkkelyksen liukoisaksi tekemiseksi. On tärkeää, että tärkkelys on nesteytetty suhteellisen alhaiseen DE:hen 2 98737 (dekstroosiekvivalentti) , joten tärkkelyksen nesteytyömenetelmän suorittamisen jälkeen täytyy käsittelyaine, tavallisesti a-amylaasi, inaktivoida hyvän syklodekstriinisaannon saamiseksi. Toiseksi Bacillus macerans -CGTaasi ei ole 5 riittävän vakaa käytettäväksi kohotetuissa lämpötiloissa ja sen tähden entsymaattinen syklodekstrinointimenetelmä suoritetaan noin 50 °C:ssa, jolloin se on mahdollisen mikrobi -kontaminaation kohteena. Kolmanneksi vaatii tärkkelyksen muuttaminen Bacillus macerans -CGTaasilla syklodekstrii-10 neiksi (50 °C:ssa, pH 7,0) pidennettyä reaktioaikaa, ennen kuin saavutetaan kohtuullisia saantoja.

Tähän mennessä alalla tunnetut CGTaasi-entsyymit tuotetaan sellaisilla mikro-organismeilla, kuten Bacillus macerans, 15 Bacillus cirkulans, Bacillus stearothermophilus, Bacillus megaterium, Bacillus ohbensis, alkalifiiliset Bacillus-la-jit, Micrococcus luteus, Micrococcus varians ja Klebsiella pneumoniae. Kuitenkaan yksikään näillä mikro-organismeilla tuotetuista entsyymeistä ei ole riittävän vakaata 60 °C:n 20 yläpuolella syklodekstriinien tuottamiseen käytettäväksi lämpötiloissa, jotka ovat riittävän korkeita, jotta vältetään mahdollinen mikrobikontaminaatio.

Vesipitoisen tärkkelyslietteen entsymaattista nesteytystä 25 käytetään käytännössä laajalti ensimmäisenä vaiheena tärkkelyksen muuttamiseen dektroosiksi (glukoosi). Tärkkelys-teollisuudessa on otettu laajalti käyttöön US-3 921 590 :n nesteytysmenetelmä. Tavanomaisia olosuhteita ovat suihku-keittäminen 105 °C:ssa 5 minuuttia, mitä seuraa pitäminen 30 90 minuuttia 95 °C:ssa tärkkelyspitoisuudessa 35 paino-% DS:a (kuivasubstanssi). Tässä menetelmässä käytetty entsyymi on Termamyl ™ (Novo Industri A/S:n tuote), Bacillus licheniformiksesta peräisin oleva a-amylaasi. Nesteytys suoritetaan pH:ssa noin 6,0, mitä seuraa glykoamylaasilla 35 sokeroiminen pH:ssa suunnilleen 4,5-5,0.

Alalla on jo kauan etsitty tärkkelyksen nesteytysentsyymei-tä, jotka kykenevät nesteyttämään pH:ssa 4,5, jolloin välissä oleva pH-säädön tarve eliminoidaan. Tähän tarkoituk- li 3 98737 seen on käytetty Bacillus stearothermophiluksesta peräisin olevaa a-amylaasia, mutta tässä selityksessä olevat tiedot osoittavat, että se ei nesteytä hyvin niinkin alhaisessa pH:ssa kuin 4,5. US-4 578 532 ja US-4 61 3 570 selostavat 5 Clostridiumista peräisin olevia happoa kestäviä a-amylaase-ja, mutta sanottujen patenttien tiedot osoittavat, että niiden stabiilius on 100 °C:ssa tai pH:n 4,5 yläpuolella riittämätön.

Keksinnön kohteena on saada aikaan syklodekstriini-glyko-10 syylitransferääsi, jonka lämmönkestävyys on riittävä, jotta sitä voidaan käyttää CD-tuotannossa 60 °C:ssa tai sen yli, jolloin mikrobi-infektion vaara on vähäinen, ja jota voidaan käyttää tärkkelyksen nesteytykseen yli 90 °C:ssa, jossa tärkkelys hyytelöityy täydellisesti.

15 Keksinnön kohteena on myös saada aikaan entsyymi, joka kykenee nesteyttämään tärkkelyksen pH:ssa 4,5 ja yli 100 °C:n lämpötilassa.

Muita keksinnön kohteita ovat aikaansaada menetelmä sanotun lämmönkestävän entsyymin tuottamiseksi ja mikrobilaji, 20 joka kykenee tuottamaan sitä. Lisäkohteena on saada aikaan menetelmä sanotun entsyymin käyttämiseksi CD:n tuottamiseen 60 °C:ssa tai sen ylittävissä lämpötiloissa ja menetelmä sanotun entsyymin käyttämiseksi tärkkelyksen nesteyttämi-seen pH:ssa noin 4,5-5,0.

25 Keksijät ovat eristäneet lukuisia termofiilisiä obligaat-tisia anaerobisia lajeja, jotka tuottavat CGTaaseja, joilla on yllättävä lämmönkestävyys.

Näin ollen keksintö saa aikaan ensinnäkin syklodekstriini-glykosyylitransferaasin, jolle on tunnusomaista, että se 30 kuuluu lajiin Thermoanaerobacter tai Thermoanaerobium, ja että sen lämpötilaoptimi on pH:ssa 5,0 mitattuna noin 95 °C; pH-optimi noin 5,0; ja sen jäännösaktiivisuus on 40 minuutin 80 °C:ssa ja pHlssa 5,0 inkuboinnin jälkeen noin 95 % tärkkelyksen ja Ca++:n puuttuessa.

4 98737

Toiseksi keksintö saa aikaan menetelmän syklodekstriini-glykosyylitransferaasin (CGTaasi) tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää Thermoanaerobacterin tai Thermoanaerobiumin CGTaasia tuottavan lajin viljelemisen anaerobisissa olosuh-5 teissä, tai transformoidun isäntäorganismin viljelemisen, joka organismi sisältää sopivaa geneettistä informaatiota siitä, aerobisissa olosuhteissa sopivassa ravintoainetta sisältävässä väliaineessa ja CGTaasin sen jälkeisen fermen-tointiväliaineesta talteenottamisen.

10 Kolmanneksi keksintö saa aikaan Thermoanaerobacter- tai Thermoanaerobiumlajin biologisesti puhtaan viljelmän, jolle on tunnusomaista kyky tuottaa syklodekstriini-glykosyyli-transferaasia, ja se, että se on liikkumaton.

Neljänneksi keksintö saa aikaan tärkkelyksen nesteytysmene-15 telmän, joka käsittää vesipitoisen tärkkelyslietteen alistamisen entsymaattiseen nesteytykseen sanotun syklodeks-triini-glykosyylitransferaasin läsnäollessa pH:ssa alueella noin 4,0-5,5, edullisesti lämpötilassa, joka nousee noin 100 °C:een.

20 Viidenneksi keksintö saa aikaan menetelmän syklodekstriinin tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää tärkkelyshydroly-saattiliuoksen käsittelemisen sanotulla syklodekstriini-glykosyylitransferaasilla lämpötilassa yli 60 °C, ja syk-lodekstriinituotteen sen jälkeisen reaktioseoksesta tal-25 teenottamisen.

Kuudenneksi keksintö saa lisäksi aikaan menetelmän syklodekstriinin tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää vesipitoisen tärkkelyslietteen käsittelyn entsymaattisesti patenttivaatimuksen 1 mukaisella syklodekstriini-glykosyyli-30 transferaasilla yli noin 100 °C:n lämpötilassa ja pHIssa alueella 4,0-5,5, edullisesti oleellisesti ilman kalsium-suolan additiota, ja saadun siirapin sen jälkeisen pitämisen lämpötilassa alueella 80 °C - 90 °C korkeintaan noin 28 tuntia siirapin ollessa alueella 20-30 % DS vähintään 35 osan sanotusta pitämisajasta, ja syklodekstriinituotteen

II

5 98737 sen jälkeisen reaktioseoksesta talteenottamisen.

Mikro-organismi

Keksinnön mikro-organismit ovat termofiilisiä obligaattisia anaerobisia bakteereita, jotka kuuluvat sukuun Thermoanae-5 robacter (J. Wiegel ja L.G. Ljungdahl, Arch. Mikrobiol. (1981) 128: 343-348) tai sukuun Thermoanaerobium (J.G. Zei-kus et ai., Arch. Mikrobiol., 122, 41-48 (1979). Näiden sukujen taksonomiaa ei ole todistettu, ja on pelkästään päätelty, että näm kaksi sukua voitaisiin oikeastaan luoki-10 telia yhdeksi ja samaksi suvuksi, koska ne ovat niin samankaltaisia, että jopa tämän alan erikoisasiantuntija ei voi erottaa niitä.

Päivastoin kuin tunnetuille Thermoanaerobacter- ja Thermo-anaerobium-lajeille on keksinnön mukaisille mikrobilajeille 15 tunnusomaista kyky tuottaa CGTaasia, ja se, että ne ovat liikkumattomia. Jotkin keksinnön mukaiset lajit ovat myös indolipositiivisia päinvastoin kuin tunnetut lajit. Tunnettujen lajien T. ethanolicus DSM 3389 ja T. finii DSM 2246 ei ole havaittu olevan lämmönkestävän CGTaasin tuottajia.

20 Keksijät eristivät 8 lajia ja ne talletettiin American Type Culture Collectioniin (ATCC) ja National Collections of Industrial Marine Bacteriaan (NCIMB) patentointisyistä Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti seuraavasti:

Tallennenumero Tallennuspäivä Tallettajan viite 25 1. ATCC 53627 3.6.1987 ANO-15-7-5A2-70 2. NCIB 40053 6.10. 1988 ANO-16-7-2A-70 3. NCIB 40054 6.10.1988 ANO-16-7-4A-70 4. NCIB 40055 6.10.1988 ANO-36-7-1 5. NCIB 40056 6.10.1988 ANO-38-7-1 30 6. NCIB 40057 6.10.1988 ANO-55-5-1-55 7. NCIB 40058 6.10.1988 ANO-51-7-1-70 8. NCIB 40059 6.10.1988 ANO-55-7-1-70

Edellä mainittujen lajien mutantit ja variantit kuuluvat myös keksinnön piiriin.

6 98737 NCIMB, Skotlanti, luokitteli nämä kaikki 8 lajia Thermoan-aerobacter-lajiksi tai Thermoanaerobium-lajiksi suvun ollessa analysoimaton. Muut taksonomiset tiedot on annettu seuraavaksi: 2

II

7 98737

Lai inumero_1_2_3_4_5_6_7_8_ °C inkubointi_55 60 60 60 60 60 60 60_ solumorfologia (a) (b)

Gram _______ vaiht.

5 itiöt ________ liikkuvuus ________ pesäkemorfologia (c) (d) (d) (d) (d) kasvu 30 °C (e) 37 °C ND ND + 10 50 °C + viskoosi KOH-testissä + + + + + + + .+ kasvu glukoosi-hiiva (+)+ + + + - - + 1 5 kasvu TYG + ND ND + ND - - + katalaasi ________ oksidaasi, Ko-vacs, P-W-S (f) kloramfeniko-20 liherkkyys + hemolyysi hevosen-veri-agarissa lakmusmaito-25 reduktio PNPG + H2S-tuotanto +

Katso huomautukset (a)-(f) seuraavalta sivulta β 98737

Huomautukset: (a) Eripituisia raemaisia sauvoja ketjuina.

(b) Säännöllisiä sauvoja, "raemainen" värjääntyminen, yksinkertainen ja lyhyissä ketjuissa.

5 (c) (tärkkelysagar, 3 päivää): pyöreä, säännöllinen, koko nainen, sileä, matala (?), kupera (?), läpikuultama-ton, kellertävän ruskeankeltainen, 2,5 mm halkaisija.

(d) (R.C.M., 3 päivää): pyöreä, säännöllinen, kokonainen, sileä, kiiltävä, läpikuultava, tasainen, valkoinen, 10 3 mm halkaisija.

(e) + (hidas 7 päivää) (f) peptoni-vesi-sokeri: ei happoa tai kaasua.

ND ei määritetty.

Il 9 98737

API 20A -anaerobinen testi 24 tuntia 60 °C

Lai inumero_1_2_3_4_5_6_7_8 indoli + -

5 ureaasi NC NC - - - NC NC

happoa glukoosista - - - mannitolista - - - laktoosista - 10 sakkaroosista + maltoosista + - + salisiinistä + ksyloosista + + + arabinoosista + 15 glyserolista - sellobioosista +_ - + mannoosista + - + meletsitoosista - raffinoosista - 20 sorbitolista - ramnoosista + trehaloosista +_ ( + ) + ·; gelatinaasista* + + eskuliinihydrolyysi + + + 25 NC ei muutoksia inkuboinnin jälkeen +_ jälkiä reaktiosta * voi olla korkean lämpötilan aiheuttama muunnos CGTaasin tuottaminen CGTaasi-entsyymin valmistaminen voidaan suorittaa viljele-30 mällä keksinnön mukaista mikrobilajia (esimerkiksi ATCC 53627) anaerobisissa olosuhteissa väliaineessa, joka sisältää maltodekstriiniä hiililähteenä, hiivauutetta ja kiven-näisliuoksia. Optimaalinen pH ja lämpötila CGTaasin tuottamiselle on pH 7,0 ja 67 °C. Entsyymi erittyy fermentoin- 10 98737 tiväliaineeseen, mikä osoittaa sen olevan solunulkoinen entsyymi.

Vaihtoehtoisesti voidaan keksinnön mukaista CGTaasia tuottaa viljelemällä aerobisesti transformanttia, joka sisältää 5 sopivan geneettisen informaation. Yleensä tämä tuotantomenetelmä käsittää seuraavat vaiheet: (a) sopivan yhdistelmä-DNA-kloonausvektorin aikaansaamisen, joka vektori sisältää DNA-sekvenssit, jotka koodittavat Thermoanaerobacter- tai Thermoanaerobium-lajin CGTaasia; 10 (b) sopivan isäntäorganismin transformoinnin vaiheesta (a) saadulla kloonausvektorilla; (c) transformoidun isännän viljelemisen aerobisissa olosuhteissa sopivaa ravintoainetta sisältävässä väliaineessa ja CGTaasin sen jälkeisen väliaineesta talteenottamisen.

15 Esimerkkejä sopivista isäntäorganismeista ovat Escherichia-, Streptomyces-, Bacillus- tai Aspergillus-lajit, edullisesti E. coli-, B. subtilis-, B. licheniformis- tai A. oryzae -laji.

CGTaasi voidaan ottaa talteen poistamalla solut fermentoin-20 tiväliaineesta ja konsentroimalla sitten liemi esim. ultra-filtraatiolla.

CGTaasin puhdistaminen

Karakterointisyistä suoritettiin ATCC 53627:stä peräisin olevan raa'an CGTaasi-valmisteen homogeenisuuteen saakka 25 puhdistaminen DEAE-Sepharose-kromatografiällä, Chromatofo-cusingR, ja akarboosi-Sepharose-affiniteettikromatografiällä. Puhdistettiin kolme I:ksi, Ilrksi ja Uliksi merkittyä komponenttia. SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesiin perustuen muista lajeista peräisin olevista raakavalmis-30 teista löydettiin vain yksi CGTaasi-komponentti.

CGTaasin lämmönkestävyys

Keksinnön mukaisille CGTaaseille on tunnusomaista lämmönkestävyys, joka on paljon parempi kuin tekniikan tason mukaisten entsyymien lämmönkestävyys. 5 % Lintner-tärkkelys-

II

11 98737 0,1 M natriumasetaatissa pH 5,0 (50 ppm Ca+ + ) 50 minuutin 95 °C:ssa inkuboinnin jälkeen keksinnön mukainen CGTaasi (ATCC 53627) säilyttää lähes 100 % aktiivisuudestaan.

5 Kuvio 3 esittää ATCC 53627:stä peräisin olevan raa'an CGTaasin jäännösaktiivisuutta 40 minuutin erilaisissa lämpötiloissa pH:ssa 5,0 substraatin ja Ca++:n puuttuessa inkuboinnin jälkeen. Kuten osoitettiin, se säilyttää suunnilleen 95 % aktiivisuudesta 80 °C:ssa näissä olosuhteissa.

10 Vertailun vuoksi on esitetty myös tiedot kahdesta tekniikan tason mukaisesta nesteyttävästä entsyymistä: Bacillus licheniformiksesta peräisin olevasta α-amylaasista (Term-amyl™) ja Bacillus stearothermophiluksesta peräisin olevasta a-amylaasista.

15

Komponenteilla I, II ja III on samanlainen lämmönkestävyys kuin ATCC 53627:n raa'alla CGTaasilla. Vertailun vuoksi on Bacillus macerans -CGTaasin raportoitu olevan vakaa vain alle 50 °C:n lämpötiloissa ja menettävän aktiivisuutensa 20 nopeasti yli 50 °C:ssa (Stavn, A. ja Granum, P.E., Carbohydrate Research, 75 [1979] 243).

CGTaasin karakterointi Lämpötilaoptimi. Lämpötilan vaikutus CGTaasi-aktiivisuuteen 25 määritettiin. ATCC 53627:stä peräisin olevalla CGTaasilla on lämpötilaoptimi 95 °C:ssa pH:ssa 5,0 0,1 M natriumase-taatti - 100 ppm Ca++:ssa (katso kuvio 1) . Tämä optimi on vastakohta Bacillus macerans -CGTaasin optimille, jonka on raportoitu olevan 55 °C pH:ssa 6,0 (Stavn, A. ja Granum, 30 P.E., Carbohydrate Research, 75 [1979] 243).

pH-optimi. pH:n vaikutusta CGTaasi-aktiivisuuteen tutkittiin 60 °C:ssa. ATCC 53627:stä peräisin olevan CGTaasin pH-optimi on 5,0, jolloin aktiivisuus oli laaja happamalla 35 alueella, kun sitä testattiin sitraattifosfaatti - 0,5 % Lintner-tärkkelys - 100 ppm Ca++ -puskurijärjestelmässä (katso kuvio 2). Tämä arvo on samanlainen kuin pH-optimi 5,2-5,7, joka on raportoitu Bacillus macerans -CGTaasista (Stavn, A. ja Granum, P.E., Carbohydrate Research, 75 12 98737

[1979] 243).

Molekyy1ipaino. CGTaasien molekyylipainot määritettynä SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla, mitä seurasi 0,8 % Lintner-tärkkelys-jodi-GelriteR-päällystys pH:ssa 6,0 5 55 °C:ssa, olivat seuraavat: ATCC 53627 I 117000 daltonia ATCC 53627 II 110000 daltonia ATCC 53627 III 108000 daltonia NCIB 40053 99000 daltonia 10 NCIB 40054 106000 daltonia NCIB 40055 104000 daltonia NCIB 40056 101000 daltonia NCIB 40057 126000 daltonia NCIB 40058 210000 daltonia 15 NCIB 40059 154000 daltonia Nämä tulokset osoittavat, että kaikki CGTaasit ovat erilaisia.

Isoelektriset pisteet. Isolektrinen fokusointi käyttämällä LKB Ampholine PAG -levyä, pH 3,5-9,5, mitä seurasi 0,8 % 20 Lintner-tärkkelys-jodi-agar-päällystys pH:ssa 6,0 55 °C:s-sa, osoitti, että CGTaasin isoelektriset pisteet ovat vastaavasti 4,55, 4,50 ja 4,50.

Toimintamallit. AminexR HPX-42A (Bio-Rad) HPLC käyttämällä havaitsemiseen taitekerrointa osoitti, että toimintamallit, 25 jotka tuotettiin Lintner-tärkkelyksen kunkin ATCC 53627:stä peräisin olevan CGTaasin aiheuttamasta degradaatiosta olivat identtisiä (katso kuvio 4). Nämä kolme CGTaasia ovat siten katalyyttisesti samanlaisia. Hydrolyysin jälkeen esiintyy kolme huippua oikealla ja NMR:n avulla niiden on 30 osoitettu olevan (vasemmalta oikealle) vastaavasti a-, gamma- ja B-syklodekstriini.

Kuvio 7 vertaa keksinnön mukaisella CGTaasilla (ATCC 53627) tuotettua toimintamallia tekniikan tason mukaiseen nesteyt- 13 98737 tävään entsyymiin, nimittäin Bacillus stearothermophiluk-sesta peräisin olevaan α-amylaasiin.

Tärkkelyksen muuttaminen svklodekstriineiksi a-, gamma- tai B-syklodekstriineiksi ATCC 53627:stä peräi-5 sin olevalla CGTaasilla nesteyttämisen aikana muuttumis-%:n määrittely 4,46 Phadebas U/g DS:n standardiannoksella on esitetty jäljempänä. Olosuhteet olivat 35 % DS maissitärk-kelystä pH:ssa 4,5 14 minuutin primäärinesteyksellä 105 eC:ssa ja 4 tunnin sekundäärinesteytyksellä 90 °C:ssa.

10 CGTaasin muuttumis-% (6,8 Phadebas U/g DS) 5 % DS-Lintner-tärkkelystä - 0,1 M natriumasetaattia (50 ppm Ca^+) pH:ssa 5,0 ja 95 °C 50 min on myös esitetty, a- ja gamma-syklo-dekstriinien yhtäläiset määrät tuotettiin nesteytyksessä, kun taas B-syklodekstriiniä muodostui lähes kaksi kertaa 15 niin paljon. Lintner-tärkkelysreaktiossa muodostui kaksi kertaa niin paljon B-syklodekstriiniä kuin gamma-sykiodek-striiniä, mutta α-syklodekstriiniä muodostui kuitenkin kolme kertaa enemmän kuin gamma-syklodekstriiniä.

Syklodekstriini

20 Reaktio ra-CD gamma-CD B-CD

Lintner-tärkkelys 13,8 4,4 9,3

Nesteytys 3,8 3,6 6,4

Syklodekstriini-qlykosyylitransferaasien vertailu Keksinnön mukaisen CGTaasin vertailu useiden tunnettujen 25 CGTaasien julkaistuihin tietoihin on esitetty jäljempänä olevassa taulukossa. Useat selvät erot ovat ilmeisiä, erityisesti lämpötilaoptimi ja stabiilius.

14 98737 tn

3 VO

ö o oa Ö vo u — — O T- o o in o Q m - - - 30 . o in r~- vo U r- <h{-i noo vo i o o

•h υ · O fN o i ra in - E

ro -h ex h - m m ex —o o ex -p gin < eo m —- m r- in — 2 cm ® ~ 08 S 3 T- o o tn o -H r-t (N ^ ^ n, m *—i o Uh in ao U r- (0 -h o O o Ilo m O · O -*r o K in in s ^ q CX P - oo oCX --ocx a) ra m < in co in ί· h vo —

VW

H tn m o — — U 3 C tn or- o •H r—4 (g ^ ·* * s.

rHrHUrn O U VO in U VO

>-HQ) OO o _ | o > O O Q VO O 5 OM ffi m q <3 E - in mft » in ex ^gmEH^rr- m—'in in^> Ä o tr tn m vo T tn C o\ - -- — h 3 q av vo oo o C f—4 H <T\ ^ ^ v -H r—I 3 - U Γ— OV U Γ— •H -H 0 U O o I o H y H P 00 S o ra jJnj-HH- m ft - in ex ^/) m υ <c in in — r- in — OS o O 9 oo i—I tn -h - -—- —v 3 M vo o (N o > H Hl - «. >.

tn I-I 4-1 -O Uh VO Uh -i-ι C r- o ° „ i o

Sqm ^ n m S N» m ¾ -H ra E vo r- in — in n —

0) I

»H M

0 m ij| tn o o S3 -U 3 - - i—iO !—i o o Uh U r- m h htUO o o o _ o

•H -h q .e i in o ra o K

:q υ <D a p - oo o ex - o ex £ äx ui ie t——-vo in — g ra m g -3 r- in tn (N m •h :Q vo — — gi 4J m o o ec in o o o - - tn -H - o o o tj in Uin •H tn y o o o o o o

di? O in oooh E o E

ia <D tj - Oi-i- m CX - OCX

p» rt; *— x— τ-σν—ιη oo ·— 3

? s I

έ * 1 % | o -g 3 , § & ε e q -h -h in -h -h q £ q a -h -h -u

3 ύ 4 § SISU IS

s fl 3, 3 s 3 ö -s ΰ

•H 4-> -P Ö >, UJ

q h o) S'-' so ex :qh>« fl φ 4-> m ω ex o q.-h o -h omrHP g T Std o m u m -h ow :ΐ9 rä :q tn o W Ή ei E —' rH CX rH -—’ r~ * 15 98737 Tärkkelyksen nesteytysmenetelmä Tärkkelyksen nesteytystä käytetään osittain tärkkelyksen depolymerointiin ja liukoisaksi tekemiseen samoin kuin tekemään se sopivaksi myöhemmälle entsymaattiselle, esim.

5 glukoamylaasilla sokeroimiselle. Teollisuudessa on laajalti otettu käyttöön US-3 921 590:n nesteytysmenetelmä. Tavalliset olosuhteet ovat kuumentaminen 105 °C:een esim. suih-kukeittämällä, pitämällä 5 minuuttia tässä lämpötilassa, mitä seuraa pitäminen 90 minuuttia 95 °C:ssa B. lichenifor-10 mis -a-amylaasin kanssa pH:ssa noin 6. Koska glukoamylaasia käytetään pHjssa noin 4,0-5,5, on haluttua nesteyttää pH:s-sa, joka on tällä alueella. B. stearothermophiluksesta peräisin oleva a-amylaasi nesteyttää hyvin pH:ssa 5,8, mutta kumpikin mainituista a-amylaaseista on kykenemätön nesteyt-15 tämään pHrssa alle 5,0. Tällä keksinnöllä aikaansaatu nesteytysmenetelmä suoritetaan pHrssa noin 4,0-5,5 (edullisesti 4,5-5,5), jolloin myöhempi sokeroiminen voidaan suorittaa ilman välissä olevaa pH-säätöä.

Keksinnön mukainen CGTaasi ei tarvitse Ca++:a stabiiliu-20 teensä edes alhaisessa pH:ssa, joten kalsiumsuolan additi-ota ei tarvita.

Sopivat nesteytysolosuhteet ovat noin 1-60 minuuttia noin 100-115 °C:ssa, mitä seuraa edullisesti pitäminen 50 minuutista 4 tuntiin noin 80-100 °C:ssa. Jatkuva menetelmä on 25 edullinen ja kuumentaminen on edullisinta suihkukeittämäl-lä. Keksinnön mukainen CGTaasi nesteyttää tärkkelyksen hyvin annostustasoilla 2-5 Phadebas U (katso jäljempänä) grammaa tärkkelys-DS:tä (kuiva substanssi) kohti. Tärkke-lyspitoisuus on tavallisesti alueella 15-40 % DS:ää (pai-30 no/paino-% kuivaa substanssia), useimmiten 25-35 % DS:ää.

Tärkkelyksen α-amylaasilla katalysoitu hydrolyysi johtaa viskoosisuuden pienemiseen, johon liittyy pelkistävien sokerien lisäys. CGTaasi siis pilkkoo tärkkelystä, mutta oleellisesti ilman pelkistävien sokereiden generaatiota.

35 Entsymaattiset reaktiot laskevat oleellisesti polymeroitu-mistasoa saaden aikaan liuoksen, joka sisältää suurimole- 98737 16 kyylipainoisia maltodekstriinejä, joilla on oleellinen a-, β- ja gamma-syklodekstriinipitoisuus. Täten 35 % DS-maissi-tärkkelyksen muuttuminen pH:ssa 4,5 nesteytyksestä 105 °C:ssa 14 minuuttia ja 4 tunnin pitoaikana 90 °C:ssa 5 a-, B- ja gamma-syklodekstriiniksi on vastaavasti 3,8 %, 6,4 % ja 3,6 %.

Keksinnön mukaista nesteytysmenetelmää voidaan käyttää dekstroosin (glukoosi) tuottamiseen suurena saantona märkä-jauhetusta maissitärkkelyksestä tai muusta puhdistetusta 10 tärkkelyksestä nesteyttämällä CGTaasilla, mitä seuraa pelkällä glukoamylaasilla tai yhdessä pullulanaasin kanssa sokeroiminen.

Keksinnön mukaista nesteytysmenetelmää voidaan käyttää myös etanolin tuottamiseen tärkkelystä sisältävästä biomassasta.

15 Tässä tapauksessa biomassa nesteytetään CGTaasilla pH:ssa 4,5-5,5, mitä seuraa glukoamylaasilla sokerointi glukoosin muodostamiseksi ja samanaikainen tai myöhempi glukoosin fermentointi hiivalla etanoliksi. Sen jälkeen alkoholi voidaan ottaa talteen alalla tunnetuilla menetelmillä. Koko 20 menetelmä suoritetaan edullisesti pH:ssa noin 5,0 ilman mitään välissä olevaa pH-säätöä, ja samanaikainen sokerointi ja fermentointi suoritetaan noin 30 °C:ssa 72 tunnin aikana. Nesteytys voidaan suorittaa joko alhaisissa DS-ta-soissa (15-20 %) tai korkeissa DS-tasoissa (20-40 %). Kor-25 kea-DS-menetelmisssä täytyy DS-tasoa pienentää noin 20 %:iin ennen fermentointia, jotta saavutetaan noin 10 tilavuus-% alkoholin maksimaalinen hiivatoleranssi.

Alkoholin tuotantoon tarkoitettu raakamateriaali voi käsittää puhdistetun tärkkelyksen, kuten märkäjauhettu maissi-30 tärkkelys, raa'at, käsittelemättömät materiaalit, kuten maissi, vehnä, riisi, durra, kassava ja peruna (joiden tärkkelyspitoisuus on 15-80 %), ja muut tärkkelystä sisältävät materiaalit, kuten teollisuuden jäte- ja sivutuotteet. Puhdistetun tärkkelyksen kyseessä ollessa käsittää 35 nesteytysmenetelmä edullisesti alkukäsittelyn yli 100 °C:s-sa, mitä seuraa alhaisemmassa lämpötilassa pitäminen täy-

II

17 98737 delliseen nesteytymiseen saakka. Muiden raakamateriaalien ollessa kyseessä (joiden tärkkelyspitoisuus on pienempi) suoritetaan nesteyttäminen edullisesti alueella 60-100 °C.

Syklodekstriinln tuottaminen 5 Esillä oleva keksintö saa aikaan menetelmän syklodekstrii-nien tuottamiseksi lämmönkestävällä CGTaasilla. Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä nesteytettyä tärkkelystä käsitellään CGTaasilla lämpötilassa, joka nousee noin 60 °C:een, suositeltavasti ei yli noin 24 tuntia, ja sen 10 jälkeen syklodekstriinit otetaan talteen reaktioseoksesta.

Keksinnön edullisessa muodossa menetelmä käsittää tärkke-lyslietteen nesteyttämisen CGTaasi-entsyymillä pH:ssa noin 5,0 alkulämpötilassa, joka nousee noin 100 °C:een, mitä seuraa nesteytetyn tärkkelyksen muuttaminen syklodekstrii-15 neiksi pitämällä nesteytettyä tärkkelystä noin 80-90 °C:ssa noin 24 tuntiin saakka pitovaiheessa, sopivasti ilman pH-säätöä, ja sopivasti ilman entsyymin uudelleenannostusta.

Verrattuna tekniikan tason mukaisiin menetelmiin tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään lämpötiloja, jotka 20 ovat riittävän korotettuja, jotta vältetään vakava mikrobi-kontaminaatiovaara, mikä on tietenkin edullista. Erillisenä (mutta samankaltaisena) etuna on, että entsymaattinen muuttaminen tapahtuu CGTaasilla nopeasti korotetuissa muutta-mislämpötiloissa. Jo nesteytetyn tärkkelyssubstraatin kä-25 sittelyaika, joka ei ylitä noin 24 tuntia, kuuluu myös tämän keksinnön toteuttamiseen. Huolimatta edellä kuvatuista edullisistä määritteistä, jo nesteytetyn tärkkelyksen muuttaminen ei ole erityisen edullinen tämän keksinnön muoto. Paljon edullisempaa on aloittaa menetelmä raakatärkkelyk-30 sellä, esim. tärkkelyslietteellä, ja käyttää CGTaasia generoimaan nesteytettyä tärkkelystä siitä.

CGTaasi-entsyymiä voidaan käyttää nesteyttämään tärkkelystä (so. generoimaan juoksevaa siirappia tärkkelyslietteestä) pH-alueella 4,0-5,5, kun kalsiumia ei ole lisätty ja stan-35 dardeissa tärkkelyksen nesteytysolosuhteissa (kuten edellä 1 8 98737 kuvattiin). CGTaasin käyttö tärkkelyslietteen nesteyttämi-seen ja sitten nesteytetyn tärkkelyksen muuttamiseen syklo-dekstriineiksi muodostaa edullisimman menetelmän ja muodostaa keksinnön edullisen toteuttamisen.

5 Tärkkelyksen CGTaasilla nesteyttämistä seuraa tärkkelyksen muuttaminen syklodekstriineiksi. Täten saadaan oleellinen määrä syklodekstriineitä ja se on läsnä nesteytetyssä tärkkelyksessä ennen tärkkelyksen entsymaattisen syklodekstriineiksi lisämuuttamisen suorittamista.

10 Yleensä ottaen tärkkelyksen nesteytysmenetelmästä suoraan saatavissa olevien syklodekstriinien saantoa ei ole pidetty adekvaattina. Lisäksi nesteytetyn tärkkelyksen entsymaat-tinen CGTaasilla muuttaminen nostaa oleellisesti syklodekstriinien saantoa.

15 (Suihku)keitetyn tärkkelyksen korotetussa lämpötilassa pi- tämiskäsittely, joka muodostaa standardiolosuhdetärkkelys-nesteytysmenetelmän osan, voi kestää noin 24 tuntia, kuitenkin sopivasti noin 90 °C:ssa, jotta muutetaan enemmän nesteytettyä tärkkelystä syklodekstriineiksi, jolloin muut-20 tamisvaihetta seuraa haluttaessa nesteytetyn tärkkelyksen kohtuullinen laimentaminen optimaalisemmalle DS-tasolle. Mikä tahansa pH-säätö, jota halutaan optimaalista entsymaattista syklodekstriineiksi muuttumista varten, voidaan tehdä joko aloitustärkkelyslietteessä tai laimennukseen 25 liittyen. Kuitenkaan ei ole havaittu tarpeelliseksi käsitellä useammalla CGTaasi-entsyymillä tärkkelysnesteytysvai-heen jälkeen.

Keksinnön mukaisen syklodekstriini-glykosyylitransferaasin lämmönkestävyys, joka mahdollistaa sen käytön korkeammissa 30 entsymaattisen muuttamisen lämpötiloissa, kuin mitä on mahdollista tekniikan tason mukaisilla entsyymeillä (huomattavasti korkeampi kuin Bacillus macerans -entsyymillä, jonka rajalämpötila on 50 °C), mahdollistaa yhdistetyn nesteytys- ja muuttamismenetelmän, joka voidaan suorittaa ilman 35 merkittävää siirapin välijäähdyttämistä. Toistettuna, tämä

II

19 98737 kyky tuottaa syklodekstriinejä korotetuissa lämpötiloissa poistaa pidennetyt reaktioajat, joita käytettiin aiemmin, ja toteutettaessa tätä keksintöä alle noin 24 tunnin reak-tioaikoja tarkastellaan nesteytetyn tärkkelyksen entsymaat-5 tista muuttamista varten.

Keksintöä toteutettaessa käytettävä tärkkelys voidaan saada mistä tahansa kasvilähteestä mukaan lukien esimerkiksi vahamaissi, maissi, vehnä, durra, peruna, tapioka, riisi tai saago. Lisäksi substraatteina voidaan myös käyttää 10 tärkkelysten muuntamattomia muotojen lisäksi muunnettuja muotoja, jotka on johdettu tärkkelyksen käsittelystä entsyymeillä, hapoilla, alkaleilla jne. Syklodekstriinin tuot-tamisreaktiot voidaan suorittaa nesteytetyssä tärkkelyksessä, jonka DS-pitoisuudet ovat alueella 1 % - 40 % DSiää, 15 mutta muuttamisen maksimaaliseen tehokkuuteen on edullista 20-30 % DS-kiintoaineliuos. Haluttaessa voidaan nesteyttää konsentroidumpia tärkkelyslietteitä (standardiolosuhteet ovat 35 % DS:ää), ja laimentaa sitten 20-30 % DS-dekstrii-niliuoksiksi syklodekstriineiksi muuttamista varten.

20 Yhteenvetona kokonaismenetelmän olosuhteista, jossa lähtö-materiaali on raakatärkkelys, keksinnön mukaista CGTaasia voidaan käyttää laajalla olosuhdealueella, mukaan lukien 35 % DS-lietteen suhteellisen kovat standardinesteytysolo-suhteet, suihkukeittäminen 105 °C:ssa ja 90 minuutin pitä-25 minen 95 °C:ssa pH-alueella 4,0-5,5 Ca++:n puuttuessa, mitä seuraa pitempi aina 24 tuntiin kestävä pitäminen yli 55 °C:ssa. Maksimaalista muuttamista ja/tai minimaalista CGTaasin käyttöä varten pitäsi molemmat pitovaiheet (jotka voivat olla tietenkin yksi ainoa pidennetty pitäminen) suo-30 rittaa alueella 80 °C - 90 °C, ja tärkkelyspitoisuuden pitäisi olla 20-30 % DS-alueella (joko aloitustärkkelysliet-teessä tai nesteytetyn tärkkelyksen laimentamisella).

Lisäyhteenvetona, syklodekstriinit voidaan tuottaa nestey-tetystä tärkkelyksestä inkuboimalla siirappi keksinnön mu-35 kaisella CGTaasilla lämpötila-alueella 50-95 °C, edullisesti 80-90 eC:ssa, reagoittamalla noin 24 tuntia tai vähemmän 98737 20 pH-alueella 4-9 edullisimmin noin pH:ssa 5,0. Syklodeks-triinituote voidaan ottaa talteen reaktioliuoksesta kuten aiemmin. Kuitenkin talteenotetut syklodekstriinit voidaan fraktonoida a-, B- ja gamma-syklodekstriineiksi alalla tun-5 netun käytännön mukaisesti, esim. D. French et al.:n kuvaamien, Journal of American Chemical Society 71:353 (1949), menetelmien avulla.

Tärkkelyshydrolysaatin jaksoittaiset muuttamiset syklodeks-triineiksi Bacillus macerans -CGTaasilla on suoritettu tä-10 hän mennessä useimmiten sopivan kompleksantin läsnäollessa, jotta tasapainoa siirretään tuotteen muodostumisen suuntaan. Syklodekstriinisulkeumayhdisteet ovat sopivasti liukenevia ja siten ne presipitoituvat liuoksesta rektio-seoksessa. Kompleksoitunut syklodekstriini voidaan ottaa 15 talteen suodattamalla tai sentrifugoimalla, ja kompleksant-ti voidaan sitten hajottaa alalla tunnetuilla menetelmillä. Sopivat syklodekstriinikompleksantit käsittävät syklo-ok-taanin, heksaanin, 1-butanolin, 1-dekanolin jne. On identifioitu lukuisia kompleksantteja, jotka kompleksoituvat 20 selektiivisesti a- tai B-muodon kanssa (katso esimerkiksi US-patentti 3 640 847). Erityisesti syklo-oktaani on B-syk-lodekstriiniselektiivinen, kun taas 1-dekanoli on a-syklo-dekstriiniselektiivinen. Tämän keksinnön toteuttaminen tarkoittaa muuttamisten suorittamista käyttäen CGTaasia komp-25 leksanttien läsnäollessa.

Svklodekstriini-glykosyylitransferaasitesti CGTaasin tärkkelystä dekstrinoiva toiminta mitattiin Pharmacia Phadebas (R) Amylase Tesfllä pHissa 6,0 60 °C:ssa inkuboimalla 200 μΐ entsyymiliuosta 4,0 millilitralla 0,1 30 M natriumasetaattia (100 ppm Ca++) ynnä Phadebas-tabletilla 15 minuuttia. Sitten reaktio pysäytettiin 0,5 ml:11a 1,0 N HCl:a.

Testiliuosta sentrifugoitiin 2 minuuttia Eppendorf-sentri-fugissa huoneenlämpötilassa, ja supernatantin absorbanssi 35 luettiin 620 nm:ssä ja 1 ,0-3,0:n absorbanssirvo pitäisi saavuttaa. Standardikäyrä konstruoitiin käyttämällä Bacil-

II

21 98737 lus licheniformis -a-mylaasia standardina, jolloin yksi Phadebas-yksikkö määritettiin entsyymin määräksi, joka katalysoi 1 ,0 pmoolia Lintner-tärkkelyksen glukosidisidosten hydrolyysiä minuuttia kohden 60 °C:ssa pH:ssa 6.

5 Syklodekstriinituotteen määritteleminen -, 6- ja gamma-syklodekstriinit määritettiin BioRad Ami-nex(R) Carbohydrate HPX-42A korkean suorituskyvyn nestekro-matografiällä. Käytettiin kahta pylvästä (300 x 7,8 mm) perättäin 85 °C:ssa lasitislattua vettä eluenttina virtaus-10 nopeudella 0,6 ml/minuutti. Havainnointi tehtiin taiteker-toimella. Standardikäyrät konstruoitiin α -, β- ja gamma-syklodekstriinien autenttisilla näytteillä (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri).

Kuvio 1 on CGTaasin suhteellisen aktiiviuden versus lämpo-15 tila käyrä; kuvio 2 on CGTaasin suhteellisen aktiiviuden versus pH käyrä; kuvio 3 on ATCC 53627:stä peräisin olevan CGTaasin lämmön-kestävyyden suhteessa Bacillus stearothermophilus -a-amy-20 laasiin ja Termamyl™:ään käyrä; kuvio 4 on HPLC-käyrät, jotka osoittavat CGTaasien I, II ja III toimintamallia; kuvio 5 on viskoosisuus versus aikakäyrä, joka vertaa tärkkelyksen nesteytystä CGTaasiin, Termamyl™:ään ja Ba-25 cillus stearothermophilus -0-amylaasiin; kuvio 6 esittää kierron versus kiertonopeusmittaus käyrää, joka esittää nesteytettyjen tärkkelysliuosten, jotka on saatu vaihtelemalla CGTaasin annostustasoja, viskosisuuden vaihteluita; 30 kuvio 7 on HPLC-käyrät, jotka vertailevat CGTaasin ja Bacillus stearothermophilus a-amylaasin toimintamalleja.

Esimerkki 1 CGTaasin tuottaminen anaerobisesti viljelemällä Lajia ATCC 53627 viljeltiin esipelkistetyssä väliaineessa 35 argonin alaisena aloitus-pH:ssa 7, joka väliaine koostui seuraavista komponenteista grammoina litraa kphti: Maltrin 22 98737 M-100, 5,0; KH2PO4, 2,0; K2HPO4, 6,0; NaCl, 1,0; (NH4)2S04, 2,5; MgS04.7H20, 0,5; CaCl2.2H20, 0,05; hiivauute, 2,0;

Na2S, 0,5; kysteiini-HCl, 0,5; resatsuriini (redoksi-indi-kaattori), 2 ng; ja hivenmetalleja 5,0 ml. Hivenmetalliliu-5 os koostui seuraavista komponenteista grammoina litraa kohti: FeCl3.6H20, 5,40; ZnS04.7H20, 1,45; MnCl2.4H20, 1,00; CuS04.5H20, 0,25; ja H3BO3, 0,10. Hivenmetalliliuos tehtiin happamaksi konsentroidulla HCl:lla suolojen liuottamiseksi.

Lajia inkuboitiin 67 °C:ssa sekoittamatta 40 tuntia. Mak-10 simaalinen aktiivisuustaso oli 40 tunnin kulutta 200 Phade-bas U liemilitraa kohti. Viljelyliemi sentrifugoitiin, sitten se suodatettiin ja konsentroitiin lopuksi volumetriseen aktiivisuuteen 30-50 Phadebas U millitraa kohti käyttämällä Millipore Minitan Systemiä.

15 ATCC 53627:stä peräisin olevan CGTaasin puhdistaminen suoritettiin peräkkäisillä vaiheilla, joihin kuuluu DEAE-Se-pharose-kromatografia, Chromatofocusing, ja akarboosi-Se-pharose-affiniteettikromatografia. DEAE-Sepharose-kromato-grafia suoritettiin pH:ssa 7,5 10 mM Tris-HCl:ssa (2,5 mM 20 CaCl2), 4 °C, käyttämällä lineaarista NaCl-gradienttia (0-200 mM). Chromatofocusing (Pharmacia) suoritettiin 4 °C:ssa käyttämällä lineaarista pH-gradienttia pHrssa 7-5. Akarboo-siaffiniteettikromatografia suoritettiin pH:ssa 6,0, 4 °C, ja eluointi suoritettiin 0,1 M natriumasetaatti- (100 ppm 25 Ca++) -puskuripesulla. Chromatofocusingilla saatiin kolme yksittäistä l:ksi, Il:ksi ja Uliksi merkittyä CGTaasi-kom-ponenttia ja ne puhdistettiin homogeeniuteen akarboosiaf-finiteettikromatografiällä. Chromatofocusingin jälkeisten kolmen CGTaasin suhteelliset määrät oli CGTaasi I - 20 %, 30 CGTaasi II - 60 % ja CGTaasi III - 20 %.

Esimerkki 2 CGtaasin tuottaminen viljelemällä aerobisesti transformoitua isäntäorganismia

Lajin ATCC 53627 soluista eristettiin kromosomaalinen DNA 35 seuraavasti. Solut (3,1 g märkäpaino) suspendoitiin 4,5 ml:aan 25 % sakkaroosi - 50 mM Tris pH 8,0 - 40 mM EDTAia.

Il 23 98737

Suspensiota käsiteltiin lysotsyymillä (2 mg/ml) 30 minuuttia jaan päällä, mitä seurasi 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Lisättiin pronaasia (1 mg/ml) ja suspensiota inku-boitiin 37 °C:ssa 30 minuuttia. Lysaattia uutettiin kahdes-5 ti 8 mlrlla fenolia 30 minuuttia 3 ml:n 10 mM Tris - 1 mM EDTA pH 7,4 -puskuria lisäämisen jälkeen. Sitten vesifaasi uutettiin kahdesti 10 ml:11a kloroformia. DNA presipitoi-tiin lisäämällä 0,45 ml 3M natriumasetaatti - 1 mM EDTAza pH 7,0 ja 2,75 ml isopropanolia ja inkuboimalla jään päällä 10 5 minuuttia. DNA pelletoitiin sentrifugoimalla ja pestiin kahdesti 70 % etanolilla. Pellettiä kuivattiin 10 minuuttia tyhjön alaisena ja sitten se liuotettiin uudelleen 15 ml:aan 10 mM Tris- 1 mM EDTA pH 7,4 -puskuria.

DNA-valmiste alistettiin keesiumkloridigradienttisentrifu-15 gaatioon 15 °C:ssa, 1 92000 g, 40 tuntia. Kromosomaalinen DNA-nauha kerättiin, uutettiin keesiumkloridilla kyllästetyllä isopropanolilla kolme kertaa ja dialysoitiin 10 mM Tris - 1 mM EDTA pH 7,4 -puskuria vasten 4 °C:ssa. Talteen otettiin 590 pg kromosomaalista DNA:ta.

20 DNA hajotettiin osittain ECORI-restriktioentsyymillä inkuboimalla 200 pg 33 yksiköllä EcoRIzä 150 pl:ssa 50 mM Tris pH 8 - 10 mM MgCl2 - 100 mM NaCl:a 12 minuuttia 37 °C:ssa. Osittain hajotettu DNA alistettiin 10-40 % sakkaroosigra-dienttisentrifugaatioon 135000 g:ssä, 15 °C, 16 tunniksi.

25 180 pl:n fraktiot kerättiin ja 5 pl:n alikvootit analysoi tiin 1 % agaroosigeelielektroforeesilla. Fraktiot, joiden koko oli 7-15 kb, yhdistettiin, dialysoitiin 1 l:aa 10 mM Tris - 1 mM EDTA pH 7,4 -puskuria vasten, presipitoitiin etanolilla ja liuotettiin 100 plraan 10 mM Tris - 1 mM EDTA 30 pH 7,4 -puskuria.

Vektori pBR322 hajotettiin EcoRIillä inkuboimalla 2,5 pg 30 yksiköllä EcoRIzä 125 pl:ssa 50 mM Tris pH 8,0 - 10 mM MgCl2 - 100 mM NaClza 2 tuntia 37 °C:ssa. DNA:n analyysi agaroosigeelillä osoitti, että hajotus oli täydellinen.

35 Hajotettu vektori uutettiin kahdesti fenolilla, kerran eetterillä ja presipitoitiin etanolilla.

24 98737

Vektori liuotettiin 100 pljaan 100 mM Tris pH 8,0 - 1 mM MgCl2:a ja defosforyloitiin 20 yksiköllä vasikan suoliston alkalista fosfataasia 37 °C:ssa 30 minuutin ajan. Defosfo-ryloitu vektori uutettiin fenolilla kahdesti, uutettiin 5 kloroformilla kahdesti ja presipitoitiin etanolilla. Defos-foryloitu pBR322 liuotettiin 50 μ1:33η 10 mM Tris - 1 mM EDTA pH 7,4 -puskuria.

Hajotetun pBR322:n ja lajin ATCC 53627 DNA;n ligatointi suoritettiin sekoittamalla 0,4 μg:aan osittain EcoRIillM 10 hajotettua kromosomaalista DNA:ta (7-15 kb) ja 0,1 pg:aan EcoRIillä hajotettua defosforyloitua pBR322:a 10 yksikköä T4 DNA -ligaasia 20 pljssa 50 mM Tris pH 7,4 - 10 mM MgCl2~ 20 mM DTT - 1 mM ATP:tä joka sisälsi 5 pg BSA/ml, ja inku-boimalla yön yli 14 °C:ssa.

15 Kompetentit E. coli HB101 (ATCC 33694) -solut valmistettiin transformointia varten T. Maniatuksen, E. F. Fritschin ja J. Sambrookin menetelmällä, Molecular Cloning - A Laboratory manual, sivu 250.

Puolet edellä valmistetusta ligatoidusta DNA:sta transfor-20 moitiin E. colirn HB101 kompetentteihin soluihin Maniatus et al.:n menetelmän mukaisesti (supra). Soluja viljeltiin yön yli 37 °C:ssa levyillä, jotka sisälsivät Luria-Bertani-(LB)-väliainetta ja tetrasykliiniä pitoisuudessa 15 μg/ml. Tetrasykliiniresistenssit koloniat replikalevitettiin tärk-25 kelyslevyille, jotka sisälsivät 1 % amylopektiini-LB-väli-ainetta ja tetrasykliiniä (15 μg/ml) ja niitä inkuboitiin yön yli. CGTaasi-tuotanto määritettiin alistamalla tärkke-lyslevyt kuumennuskäsittelyn 70 °C:ssa jälkeen 1 tunniksi jodihöyrylle, jossa puhdistusalueet voidaan havaita.

30 Yksi E. coli NV601:ksi nimetty CGTaasi-positiivinen tran-formantti otettiin talteen yli 5000 koloniasta. Laji oli sekä ampisilliini- että tetrasykliiniresistentti. Yhdistel-mäplasmidin talteenottaminen standardeilla aikalisillä lyy-simenetelmillä ja kompetenttien E. coli HB101 -solujen uu-35 delleentransformointi sai aikaan CGTaasi-ositiivisia trans- 25 98737 formantteja.

Yhdistelmäplasmidin restriktiokartoitus ilmaisi, että DNA-fragmentti, jonka koko oli 12,8 kb, oli insertoitu pBR322:n EcoRI-paikkaan. Restriktioentsyymillä BamHI suoritettu de-5 leetioanalyysi ilmaisi, että CGTaasia koodittava geeni sijaitsi 6,0 kb:n BamHI-BamHI-fragmentissa.

CGTaasi tuotettiin viljelemällä E. coli NV601:ä Luria-Ber-tani-väliaineessa, joka sisälsi 15 yg tetrasykliiniä ml:aa väliainetta kohti, 37 °C:ssa 300 rpm:ssä 24 tuntia. Solut 10 kerättiin sentrifugoimalla ja sitten ne lysoitiin sonikoi-malla.

Yhdistelmä-CGTaasin karakterointi suhteessa luontaiseen CGTaasiin ottaen huomioon molekyylipaino (SDS-PAGE), iso-elektrinen piste, lämmonkestävyys, toimintamalli, nestey-15 tystoiminta ja syklodesktriinin tuotanto ei osoittanut mitään entsyymien välistä eroa. Yhdistelmä-CGTaasi ristirea-goitettiin vasta-aineen kanssa, joka oli herätetty luontaista CGTaasia (komponentti II) vastaan.

Esimerkki 3 20 Syklodekstriinin tuotanto

Keksinnön mukaisella CGTaasilla (ATCC 53627) tuotettua syk-lodekstriiniä ja Bacillus maceransista peräisin olevaa CGTaasia vertailtiin. Koska Bacillus macerans -CGTaasi ei kykene nesteyttämään tärkkelystä normaaleissa suihkukeitin-25 olosuhteissa, käytettiin esikäsiteltyä tärkkelystä, so. Lintner-tärkkelystä. Entsyymeitä reagoitettiin 15 % DS-Lintner-tärkkelyksen kanssa (plus 40 ppm Ca++) 50 °C:ssa ja 90 °C:ssa 24 tuntia. Annostus oli 4,46 Phadebas U grammaa DS-tärkkelystä kohti. Bacillus macerans -CGTaasi reagoitet-30 tiin pH:ssa 7,0, kuten edellä, kontrollointia varten.

26 98737

Syklodeks tri ini saanto lämpöt. »-CD gamma- 3-CD kokonais- kokonais-CD CGTaasi pH (°C) % CD. % % CD, % g/100 ml

Keksintö 5,0 50 14,9 7,0 15,3 37,2 5,6 5 5,0 90 14,9 6,6 14,6 36,1 5,4

Bacillus 5,0 50 10,2 5,7 13,8 29,7 4,5 macerans 5,0 90 0,3 0 0 0,3 0,1 7.0 50 10,1 5,4 14,5 30,0 4,5 7.0 90 0,5 0 0,5 1,0 0,2 10 Tulokset osoittavat, että keksinnön mukainen CGTaasi saa aikaan paremman muuttumisen 50 °C:ssa, joka on tekniikan tason mukaisen B. macerans -entsyymin optimi. Keksinnön mukaisella CGTaasilla on oleellisesti yhtä suuri muuttuminen 90 °C:ssa, jossa tekniikan tason mukainen entsyymi on 15 havaittu lähes inaktiiviseksi. Keksinnön mukainen CGTaasi tuottaa a-, 3- ja gamma-syklodekstriiniä suhteessa (50 °C:ssa) 0,74:1,0:0,41, so. suhteellisesti enemmän a-CDsä kuin B. macerans -entsyymi.

Esimerkki 4 20 Tärkkelyksen nesteyttäminen erilaisissa pH:issa 35 % DS-tärkkelystä, jossa oli 40 ppm Ca++ tai ei ollut sitä, nesteytettiin 105 °C:ssa 14 minuuttia, mitä seurasi 4 tuntia 90 °C:ssa. Entsyymi annostettiin 4,46 Phadebas U/g DS:ksi (60 °C, pH 6,0). Keksinnön mukaista CGTaasia (ATCC 25 53627) verrattiin Termamyli™:ään (B. licheniformis -a-amy- laasi, saatavissa Novo Industri A/S:stä) ja B. stearother-mophilus -a-amylaasiin (saatavissa G-Zyme™ G995:nä Enzyme Bio-Systems, Ltd.:stä).

Dekstroosiekvivalentti (DE) mitattiin nesteytyksen jälkeen 30 ja tärkkelys arvosteltiin nesteytyneeksi, jos tärkkelyssii-rappi oli juoksevaa nesteytyksen jälkeen (osoitti oleellista viskoosisuuden vähenemistä).

98737 27

Entsyymi pH Ca+j. DE nesteytynyt CGTaasi 4,5 + 0,51 kyllä CGTaasi 4,5 - 0,44 kyllä CGTaasi 5,0 + 0,73 kyllä 5 CGTaasi 5,0 - 0,69 kyllä CGTaasi 5,5 + 1,10 kyllä OGIhasi 5,5 - 0,83 kyllä BS-amylaasi 4,5 + ei määriteltävissä ei BS-amylaasi 4,5 - ei määriteltävissä ei 10 BS-anylaasi 5,0 + 4,78 kyllä* BS-amylaasi 5,0 - ei määriteltävissä ei BS-amylaasi 5,5 + 9,78 kyllä BS-amylaasi 5,5 - 5,58 kyllä BS-amylaasi 5,8 + 13,6 kyllä 15 Termamyl™ 6,2 + 14,4 kyllä ♦Arvioitu nesteytyneeksi mutta hyvin viskoosiksi.

On nähty, että keksinnön mukaisella CGTaasilla voidaan saavuttaa hyvä nesteytys, jopa niinkin alhaisessa pH:ssa kuin 4,5 ilman että lisätään Ca++:a ja oleellisesti ilman pel-20 kistävien sokereiden muodostumista.

Esimerkki 5 Tärkkelyksen nesteyttäminen erilaisilla entsyymiannostuk-silla 35 % DS-maissitärkkelystä nesteyttiin CGTaasilla (ATCC 25 53627) pH:ssa 4,5 Ca++-lisäyksen puuttuessa. Käytettiin entsyymiannostuksia 0,223, 0,446, 0,892, 2,23 ja 4,46 Pha-debas U/g DS. Vertailun vuoksi käytettiin Termamyliä pHrssa 6,2 ja B. stearophilus -amylaasia pH:ssa 5,8, kumpiakin 4,46 U/g DS ja läsnä oli 40 ppm Ca++. Nesteytysolosuhteet 30 olivat 14 minuuttia 100 °C:ssa tai 105 °C:ssa (kuten jäljempänä on osoitettu), mitä seurasi 4 tuntia 90 °C:ssa. Viskoosisuus mitattiin nesteytyksen jälkeen 60 °C:ssa Haa-ke Rotovisco RV 12 -viskometrillä, jossa on NV-anturijär-jestelmä ja M500-mittauskäyttöyksikkö, vastaavissa nestey-35 tyksen pHrissa. Tulokset on annettu seuraavaksi ja ne on esitetty kuviossa 6.

28 98737

Primaarinen Viskositeetti

Annostus Lisätty nesteytys- (CP) käyttöroot-

Entsyymi U/g PS Ca++ pH lämpötila torin nopeud. 32 CGTaasi 0,223 - 4,5 100 °C *) 5 OGTaasi 0,446 - 4,5 100 eC *) CGTaasi 0,892 - 4,5 1 05 °C 280 OGTaasi 2,23 - 4,5 105 °C 66,9 CGTaasi 4,46 - 4,5 105 °C 42,4

Termamyl 4,46 40 ppn 6,2 105 °C 41,6 10 BS-anylaasi 4,46 40 ppn 5,8 105 °C 34,1 *) mittaus ei ole mahdollista talla nopeudella

Tulokset osoittavat, että 2-5 U/g CGTaasin DS:ää on sopiva annostaso.

Esimerkki 6 15 Nesteytetyn tärkkelyksen sokeroiminen

Esimerkin 4 mukaiset nesteytetyt tärkkelykset säädettiin pH:hon 4,3 tai 4,5 60 öC:ssa ja Dextrozyme^M:ää 150/50 lisättiin annostuksena 1,2 1/t DS. Dextrozyme on Aspergillus nigeristä peräisin olevan glukoamylaasin ja Bacillus acido-20 pullulyticuksesta peräsin olevan pullulanaasin seos; sitä on saatavissa Novo Industri A/S:stä. Sokeroimista suoritettiin 48 tuntia 60 °C:ssa ja dekstroosi määritettiin Bio-Rad AminexR HPX-87C HPLCrllä.

Entsyymi nesteytyksen pH sckeroinnin pH Ca++ dekstroosi-¾ 25 OGTaasi 4,5 4,5 + 96,0 CGTaasi 4,5 4,5 - 96,0 CGTaasi 5,0 4,3 + 95,6 CGTaasi 5,0 4,3 - 95,5 CGTaasi 5,5 4,3 + 95,7 30 OGTaasi 5,5 4,3 - 95,8 BS-amylaasi 4,5 4,3 + ei määritettäv.

BS-amylaasi 4,5 4,3 - ei määri tettäv.

BS-amylaasi 5,0 4,3 + 96,0 BS-amylaasi 5,0 4,3 - ei määri tettäv.

35 BS-amylaasi 5,5 4,3 + 95,8 BS-amylaasi 5,5 4,3 - 95,9 BS-amylaasi 5,8 4,5 + 96,8

Termamyl11111 6,2 4,5 + 96,4 40 Tulokset osoittavat kaikkien keksinnön mukaisesti nestey-tettyjen tärkkelysten hyvää sokeroitumista. Kyky sokeroida • pHlssa 4,5 nesteytetty tärkkelys osoittaa tämän keksinnön mukaisen menetelmän selvää etua verrattuna tekniikan tason

II

29 98737 mukaisiin nesteytyksiin B. licheniformiksesta tai B. stea-rothermophiluksesta peräisin olevilla a-amylaaseilla, koska ennen sokerointia ei pH:ta tarvitse säätää keksinnön mukaisen tärkkelyksen nesteytyksen tapauksessa.

5 Esimerkki 7

Syklodekstriinin tuottaminen erilaisilla tärkkelyspitoi-suuksilla

Maissitärkkelys vaihteli 15 % - 40 % DS:ää. Lietteet nes-teytettiin ensin pH:ssa 5,0, eikä kalsiumia lisätty, käsit-10 telemällä 14 minuuttia 105 °C:ssa, mitä seurasi 4 tunnin pitäminen 90 °C:ssa, käyttämällä CGTaasia (ATCC 53627) annoksena 4,46 Phadebas U kohti gramma DS-tärkkelystä. Syklodekstriinin tuottamista tarkkailtiin tärkkelyksen nestey-tysprosessin jatkuvan pito-osan jälkeen entsyymiä s.isältä-15 vän dekstriiniliuoksen inkuboimiseksi toiset 24 tuntia pH:ssa 5,0 ja 90 °C:ssa. Syklodekstriinisaannot määritettiin Bio-Rad Aminex Carbohydrate HPX-42A HPLCjllä. Tulokset:

Syklodekstriinisaanto

20 a-CD gamma-CD B-CD kokonais-CD kokonais-CD

DS-% % % % % q/100 ml 15 9,6 6,3 15,4 31,3 4,7 20 8,1 5,8 17,6 31 ,5 6,3 25 7,2 5,9 15,3 28,4 7,1 25 30 6,7 4,6 12,6 23,9 7,2 35 5,0 4,2 11,0 20,2 7,1 40 6,9 4,4 11,1 22,4 9,0 Pääteltiin, että tärkkelyksen alkupitoisuus noin 20-30 % laskettuna kokonais-CD-prosentista ja g CD/100 ml:sta oli 30 optimaalinen syklodekstriinituotannolle. Siksi valittiin pitoisuus 25 % DSJää lisäesimerkkejä varten. B-syklodeks-triiniä tuotettiin ensisijaisesti kaikissa tärkkelyspitoi-suuksissa. B : a:gamma-syklodekstriini en suhde oli 1 ,0 :0,47:0,39 25 2»:ssa DS:ää. Suurin havaittu syklodeks-35 triinin saanto 25 & DS-tärkkelyksestä oli suunnilleen 30 %. Käsitteleminen CGTaasi-entsyymillä ja reaktioajan ulottami- 30 98737 nen 48 tuntiin ei lisännyt saantoja.

Esimerkki 8

Syklodekstriinin tuottaminen erilaisissa pHtissa pH:n vaikutus syklodekstriinin tuotantoon määritettiin 5 käyttämällä 25 % DS-tärkkelyslietettä. Tarkkelyslietteet nesteytettiin osoitetuissa pH-arvoissa, mutta muutoin kuten esimerkissä 7, ja nesteytettyjä tärkkelyksiä inkuboitiin sitten 24 tuntia 90 °C:ssa samoissa pH-arvoissa.

Seuraavana esitetyt tulokset osoittavat, että pH 5,0 oli 1 0 optimaalinen tärkkelyksen nesteytyksen kokonaismenetelmälle ja syklodekstriinin tuotannolle.

Syklodekstriinin saanto α-CD gamma-CD β-CD kokonais-CD kokonais-CD pH % % % % g/100 ml 1 5 4,0 2,5 1 ,0 2,0 5,5 1 ,4 4,5 5,0 4,3 8,4 17,7 4,4 5.0 7,4 5,5 16,7 29,6 7,4 6.0 8,0 5,3 14,9 28,2 7,1 7.0 8,4 5,0 12,9 26,3 6,6 20 8,0 8,4 5,0 13,4 25,8 6,7 9.0 6,3 4,5 8,5 19,3 4,8

Esimerkki 9

Syklodekstriinin tuottaminen erilaisssa lämpötiloissa Lämpötilan vaikutusta keksinnön mukaisella CGTaasilla (ATCC 25 53627) tuotetun syklodekstriiniin tuotantoon tutkittiin, kun kalsiumia ei lisätty, suorittamalla inkubointivaihe 24 tuntia pH:ssa 5,0 erilaisissa lämpötiloissa, kuten jäljempänä osoitetaan. Tärkkelyslietteen 15 % DS- tai 25 % DS-liete nesteytettiin ensin CGTaasilla esimerkin 7 olosuh-30 teissä annoksena 4,46 Phadebas U kohti gramma DS-tärkkelys-tä. Tulokset: 31 98737

15 % PS

Syklodekstriinin saanto

Lämpö- a-CD gamma-CD β-CD kokonais-CD kokonais-CD

tila °C _ % _% % g/100 ml 5 50 8,1 5,6 15,4 29,0 4,4 80 8,6 6,1 18,7 33,4 5,0 90 9,6 6,3 15,4 31,3 4,7 95 7,3 5,1 8,5 20,9 3,1

25 % PS

10 Syklodekstriinin saanto

Lämpö- a-CD gamma-CD β-CD kokonais-CD kokonais-CD

tila °C _ % _% % g/100 ml 50 7,1 4,8 12,1 24,0 6,0 70 7,2 5,5 13,7 26,4 6,6 15 80 7,2 5,5 14,6 27,3 6,8 90 7,2 5,9 15,3 28,4 7,1 95 6,3 5,8 14,6 26,7 6,7

Tulokset osoittavat, että 80-90 °C:n muuttamislämpötila on optimaalinen sekä 15 % DSrssä että 25 % DS:ssä (24 tunnin 20 inkuboinnin jälkeen). Lämpötilan laskeminen 50 °C:een antoi pienemmän saannon.

Esimerkki 10

Syklodekstriinin tuottaminen korkeissa lämpötiloissa lisä-annostamalla entsyymiä ja ilman sitä 25 Mahdollisuutta, ettei tasapainoa saavutettu, tutkittiin 90 °C:ssa ja 95 °C:ssa lisäannostamalla esimerkin 9 reak-tioseoksiin, jotka sisälsivät 15 X tärkkelystä, CGTaasia ennen 24 tunnin inkubointia ja antamalla reaktion jatkua toiset 24 tuntia. Tulokset (katso jäljempänä) osoittivat, 30 että tasapaino saavutettiin 90 °C:ssa. 95 °C:ssa lisäannos-tamine oli tarpeellista, jotta saavutettiin samat syklodekstriinin saannot, jolloin ilmeni hieman entsyymiaktiivisuuden katoa pidennetyn 95 °C*.ssa inkuboinnin aikana.

32 98737

Syklodekstrlinln saanto

Lämpö- aika a-CD gamma-CD β-CD kokorais-CD kokonais-CD

tila (°C) lisäys (h) % % % % q/100 ml 9Ö - 24--9j6 1J- 3T73 - 1,7 - 5 90 + 24 9,5 6,3 16,2 32,0 4,8 90 - 48 10,1 6,3 14,0 30,4 4,6 90 + 48 9,1 5,9 16,5 31,5 4,7 95 - 24 7,3 5,1 8,5 20,9 3,1 95 + 24 10,2 6,5 13,7 30,4 4,6 10 95 - 48 9,3 5,2 10,2 24,7 3,7 95 + 48 11,3 6,6 13,5 31,4 4,7

Esimerkki 11

Syklodekstrilnin tuottaminen kalsiumadditiolla tai ilman sitä 15 Kalsiumin vaikutusta syklodekstriinin tuotantoon tutkittiin. 25 % DS-maissitärkkelysliete nesteytettiin keksinnön mukaisella CGTaasilla (ATCC 53627) pH:ssa 40 ppm kalsiumia läsnäollessa tai poissaollessa annoksena 4,46 Phadebas U grammaa DS-tärkkelystä kohti. Sitten nesteytettyjä tärkke-20 lyksiä inkuboitiin 24 tuntia 90 °C:ssa. Tulokset (katso jäljempänä) osoittivat, että kalsiumionin läsnäololla ei ole vaikutusta kokonaissaantoon.

Syklodekstriinin saanto

a-CD gamma-CD B-CD kokonais-CD kokonais-CD

25 Kalsium _ %_ q/100 ml 6,0 6,0 15,1 27,1 6,8 + 6,2 5,8 14,4 26,4 6,6

Esimerkki 12

Syklodekstriinin tuottaamlnen erilaisilla entsyymiannostuk-30 silla CGTaasi-annostuksen vaihtelun vaikutus syklodekstriinisaan-toon määritettiin käyttämällä 25 X DS-maissitärkkelystä.

Annos vaihteli 2,23-6,69 Phadebas U grammaa DS-tärkkelystä kohti. Tärkkelys nesteytettiin pHIssa 5,0 ATCC 53627 :n 35 CGTaasilla käyttämällä edellä annettuja annoksia ja kalsiumin puuttuessa. Nesteytettyjä tärkkelyksiä inkuboitiin sitten 24 tai 48 tuntia 90 °C:ssa, pH 5,0. Muut olosuhteet olivat kuten esimerkissä 5.

33 98737

Tulokset (katso jäljempänä) osoittivat, että 24 tunnin ja 48 tunnin kuluttua saavutettiin suurimmat saannot annoksilla 4,46 ja 3,35 Phadebas U grammaa DS-tärkkelystä kohti.

Syklodekstriini 5 Annos, Phadebas U aika, a-CD gairma-(D B-CD kokonais-CD kokonais-CD DS-grammaa kohti h % % % % % 2.23 24 5,8 5,9 13,0 5377 6,2 3.35 24 6,3 5,8 14,9 27,0 6,8 4.46 24 6,0 6,0 15,1 27,1 6,8 10 6,69 24 5,9 5,2 10,5 21,6 5,4 2.23 48 6,7 6,7 14,8 28,2 7,1 3.35 48 6,7 6,5 15,3 28,5 7,1 4.46 48 6,7 6,1 15,8 28,6 7,1 6,69 48 6,6 5,6 13,7 25,9 6,5 15 Esimerkki 1 3

Syklodekstriinin tuottaminen käyttämällä kompleksanttia Syklo-oktaanin vaikutusta B-syklodekstriinikompleksanttina syklodekstriinien muuttamisessa tutkittiin. 25 % DS-maissi-tärkkelys nesteytettiin pH:ssa 5,0 lisätyn kalsiumin puut-20 tuessa ATCC 53627 :n CGTaasilla esimerkin 7 olosuhteissa annoksena 4,46 Phadebas U grammaa DS-tärkkelystä kohti.

Sitä seurasi muuttaminen syklodekstriiniksi 90 °C:ssa 24 tuntia, mutta syklo-oktaania lisättiin tasolla 0,6 grammaa grammaa DS-tärkkelystä kohti ennen kuin 24 tunnin inkuboin-25 ti aloitettiin.

Muuttamistulokset (katso jäljempänä) osoittivat, että syk lo-oktaanin additio nosti lopullista syklodekstriinisaan-toa, erityisesti B-syklodektriinisaantoa.

34 98737

Syklodekstriinin saanto

d-CD gamma-CD B-CD kokonais-CD kokonais-CD

_|__%_ _£__% g/100 ml

Kontrolli 7,2 5,9 15,3 28,4 7,1 5 Syklo-oktaa- nin kanssa: kompleksoi- tumaton 3,7 2,3 2,6 8,6 2,2 kompleksoi- 10 tunut 1,9 0,6 25,0 27,5 6,9

Kokonais 5,6 2,9 27,6 36,1 9,1

Esimerkki 14

Syklodekstriinin tuottaminen erilaisista tärkkelyksistä Useita tärkkelyksiä vertailtiin. Maissista, perunoista, 15 vehnästä, riisistä ja vahamaissista peräisin olevan tärkkelyksen lietteet (25 % DS) nesteytettiin pH:ssa 5,0 lisätyn kalsiumin puuttuessa keksinnön (ATCC 53627) mukaisella CGTaasilla annoksena 4,46 Phadebas U grammaa DS-tärkkelystä kohti esimerkin 7 olosuhteissa. Nesteytettyjä liuoksia in-20 kuboitiin sitten 24 tuntia 90 °C:ssa.

Tulokset (katso jäljempänä) osoittivat, että lopullisessa syklodekstriinisaannossa oli eroja ja että kaikissa tapauksissa muodostui ensisijaisena tuotteena B-syklodekstriiniä.

Syklodekstriinin saanto

25 a-CD gamma-CD B-CD kokonais-CD kokonais-CD

Tärkkelys _%__%__%__%_ g/100 ml maissi 7,4 5,4 15,4 28,2 7,1 peruna 9,3 5,6 14,6 29,5 7,4 vehnä 7,0 4,9 13,7 25,6 6,4 30 riisi 5,1 4,3 8,3 17,7 4,4 vahamaissi 7,1 4,5 11,9 23,5 5,9 li 35 98737

Esimerkki 15

Etanolin fermentoimlnen risteytetystä tärkkelyksestä Märkäjauhetun maissitärkkelyksen 31,5% DS-lietettä nestey-tettiin keksinnön mukaisella (ATCC 53627) CGTaasilla pH:ssa 5 5,0 ilman kalsiumlisäystä 14 minuuttia 105 °C:ssa, mitä seurasi 4 tuntia 90 eC:ssa. Suoritettiin myös kontrolli Termamyl™:llä, kuten kuvattiin paitsi, että pH:ssa 6,2 40 ppm kalsiumia läsnäollessa. Entsyymiannos oli kussakin tapauksessa 5,0 Phadebas-yksikköä grammaa DS-tärkkelystä koh-10 ti.

Nestetyksen lopussa paksuuntunut tärkkelys laimennettiin 22,4 % DS:ään hiivaravintoseoksella. Ravintoseoksessa oleva lopullinen komponenttipitoisuus litraa kohti oli 4,0 g hii-vauutetta, 1,6 g ammoniumfosfaattia, 0,4 g magnesiumsu1-15 faattia, 3,2 g sitruunahappoa ja 0,6 g natriumsitraattia. Lopullinen pH oli 5,2. AMG 200 L:ää (NOVO Laboratories,

Inc., Danbury, CT) lisättiin annoksena 0,44 % paino/paino laskettuna tärkkelyksestä. Penisilliini G:tä ja streptomy-siinisulfaattia sisällytettiin tasoina 200 ug/ml. Fermen-20 taatioita inkuboitiin 30 °C;ssa 300 rpm 64 tuntia.

Etanolin tuotanto mitattiin epäsuorasti hiilidioksidituotannosta, so. painon menetys ajan funktiona. Lopulliset etanolisaannot vahvistettiin Bio-Rad Aminex HPX-42A suuren suorituskyvyn nestekromatografiällä.

25 64 tunnin kuluttua oli etanolisaanto laskettuna hiilidiok sidituotannosta 87,3 % ja 89,7 % CGTaasilla ja Termamyillä nesteytetyillä tärkkelyksillä vastaavasti. Nämä saannot vahvistettiin Bio-Rad Aminex HPX-42A HPLCillä. Teollinen standardisaanto on tavallisesti noin 86-90 %.

30 Esimerkki 16 CGTaasin tuottaminen NCIB 40053-40059:n anaerobisella viljelemisellä

Lajit NCIB 40053-40059 viljeltiin kuten esimerkissä 1 paitsi, että viljelylämpötila oli 55 °C.

36 98737

Maksimaaliset aktiivisuustasot oli 40 tunnin inkuboinnin jälkeen Phadebas-yksikkoinä litraa lientä kohti seuraavat: NCIB 40053: 18, NCIB 40054: 53, NCIB 40055: 26, NCIB 40056: 22, NCIB 4057: 27, NCIB 40058: 28 ja NCIB 40059:10. Vilje-5 lyliemet sentrifugoitiin, sitten ne suodatettiin ja lopuksi ne konsentroitiin 30-50 Phadebas-yksikön volumetriseen aktiivisuuteen millilitraa kohti käyttämällä Millipore Mini-tan Systemiä.

Esimerkki 17 10 Tärkkelyksen nesteyttäminen NCIB 40053-40059;n CGTaasilla CGTaasi-valmisteita, jotka oli valmistettu kuten esimerkissä 16, verrattiin kyvyltään nesteyttää 35 % DS-maissitärk-kelystä pH:ssa 4,5. Tärkkelystä nesteytettiin 105 °C:ssa 14 minuuttia, mitä seurasi 4 tuntia 90 °C:ssa entsyymian-15 noksella 4,46 Phadebas U/g DS (60 °C, pH 6,0).

Dekstroosiekvivalentti (DE) mitattiin nesteyttämisen jälkeen ja tärkkelys katsottiin nesteytyneeksi, jos tärkkelys-siirappi oli nesteyttämisen jälkeen juoksevaa osoittaen oleellista viskoosisuuden vähenemistä.

20 Tulokset osoittivat, että kaikilla CGTaaseilla voidaan saavuttaa pH:ssa 4,5 hyvä nesteytys, joka on samanlainen kuin lajista ATCC 53627 peräisin olevalla CGTaasilla saavutettu. Kaikissa tapauksissa ei ollut mitattavissa oleellisesti DE:tä, joka osoittaa CGTaasi-aktiivisuutta.

25 Aminex(R) HPX-42A (Bio-Rad) HPLC käyttämällä taitekerrointa havaitsemiseen osoitti, että toimintamallit, jotka tuotettiin maissitärkkelyksen nesteytyksellä oli CGTaasin tavanomaisia, jolloin kolme huippua olivat a-, gamma- ja B-syk-lodekstriineitä. Kullakin entsymillä tuotetun syklodeks-30 triinin suhteellisessa suhteessa ei havaittu suuria eroja verrattuna ATCC 53627:n CGTaasiin.

Esimerkki 18

Kloonatulla CGTaasilla nesteyttäminen 35 % DS-maissitärkkelysliete käsiteltiin kloonatulla CGTaa-

II

37 98737 silla, joka oli valmistettu kuten esimerkissä 2, annoksena 8,92 Phadebas-yksikköM DS-grammaa kohti pH:ssa 4,5 ilman että lisättiin Ca++:a. Suihkutusta tehtiin 105 °C:ssa 5 minuutin ajan (primälrinesteytys) , mitä seurasi pitäminen 5 95 °C:ssa 2 tuntia tai 90 °C:ssa 4 tuntia (sekundäärines- teytys). Sekundäärinesteytyksen 95 °C:ssa tai 90 °C:ssa aikana havaittiin viskoosisuuden nopea väheneminen.

90 °:ssa viskoosisuuden vähenemistä tarkkailtiin koko ajan käyttämällä Nametre-viskometriä. Tulokset osoittivat, että 10 esiintyi nopea viskoosisuuden lasku 400 senttiposiin x g/cm3 7 minuutissa toisessa nesteytyksessä. Nesteytetyn tärkkelyksen toisen nesteytyksen jälkeiset toimintamallit määritettynä Bio-Rad Aminex(^) HPX-42A HPLC:lla osoittivat tunnusomaisia syklodekstriinimalleja molemmissa lämpöti-15 loissa. Neokuproiinimenetelmällä saatiin <1,0:n DEr-arvot, jotka osoittivat, että pelkistävät pääteryhmät, jotka liittyvät CCTaasin mekanismiin, puuttuivat.

Esimerkki 19

Kloonatulla CGTaasilla nesteytetyn tärkkelyksen sokeroimi-20 nen Tärkkelysliuoksia, jotka oli nesteytetty esimerkissä 18 CGTaasilla pH:ssa 4,5, sokeroitiin AMG:1lä ja Dextrozymellä pH:ssa 4,5 60 °C:ssa 48 tuntia annoksella 0,18 AG DS-grammaa kohti. Dekstroosisaannot määritettiin Bio-Rad Aminex(R) 25 HPX-87C HPLC:llä.

Saanto-%

Entsyymi dekstroosi DP2 DP3 DP4 + 95 °C sekundääri-nesteytys 30 Dextrozyme 95,87 2,44 0,39 1,30 AMG 95,09 2,27 0,36 2,28 90 °C sekundääri-nesteytys

Dextrozyme 95,37 3,34 0,40 0,89 35 AMG 95,36 3,21 0,38 1,05 38 98737

Tulokset osoittavat hyvää dekstroosisaantoa kaikissa tapauksissa. Suurin saanto saavutettiin 95 °C:n sekundääri-nesteytyksellä ja sokeroimalla Dextrozymellä.

Il

Claims (17)

98737

1. Sykiodekstriini-glykosyylitransferääsi, tunnettu siitä, että se on peräisin Thermoanaerobacter- tai Thermoanaerobium-kannasta, joka on kanta ATCC 53627 tai jokin kannoista NCIB 5 40053 - NCIB 40059, että sen lämpötilaoptimi on mitattuna pH:ssa 5,0 noin 95°C; pH-optimi on noin 5,0; ja jäännösaktii-visuus on 40 minuutin 80°C:ssa ja pH:ssa 5,0 inkuboinnin jälkeen noin 95 % tärkkelyksen ja Ca++:n puuttuessa.

2. Menetelmä sellaisen syklodekstriini-glykosyylitransfe- raasin (CGTaasi) tuottamiseksi, jonka lämpötilaoptimi on mitattuna pH:ssa 5,0 noin 95°C; pH-optimi on noin 5,0; ja jään-nösaktiivisuus on 40 minuutin 80°C:ssa ja pH:ssa 5,0 inkuboinnin jälkeen noin 95 % tärkkelyksen ja Ca++:n puuttuessa, 15 tunnettu siitä, että menetelmä käsittää CGTaasia tuottavan Thermoanaerobacter- tai Thermoanaerobium-kannan viljelemisen anaerobisissa olosuhteissa tai sellaisen bakteeri-isäntäor-ganismin viljelemisen, joka on transformoitu mainittua CGTaasia koodaavalla DNA-sekvenssillä, jolloin mainittu DNA-sek-20 venssi on johdettu siitä, aerobisissa olosuhteissa sopivassa ravintoainetta sisältävässä väliaineessa, ja CGTaasin senjäl-keisen fermentointiväliaineesta talteenottamisen.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu sii-25 tä, että kanta on ATCC 53627 tai jokin kannoista NCIB 40053 - NCIB 40059.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäorganismi on Escherichia- tai Bacillus-kanta, 30 edullisesti E. coli-, B. subtilis- tai B. licheniformis -kanta.

5. Thermoanaerobacter- tai Thermoanaerobium-kannan biologisesti puhdas viljelmä, tunnettu siitä, että se on kannan ATCC 35 53627 tai jonkin kannoista NCIB 40053 - NCIB 40059 viljelmä, jolla on kyky tuottaa syklodekstriini-glykosyylitransferaa-sia, jonka lämpötilaoptimi on mitattuna pH:ssa 5,0 noin 95°C; pH-optimi on noin 5,0; ja jäännösaktiivisuus on 40 minuutin 98737 80°C:ssa ja pHrssa 5,0 inkuboinnin jälkeen noin 95 % tärkkelyksen ja Ca++:n puuttuessa, ja siitä, että se on liikkumaton.

6. Transformoitu bakteeri-isäntäorganismi, tunnettu siitä, että se kykenee tuottamaan CGTaasia viljelemällä aerobisissa olosuhteissa ja että se on saatu transformoimalla isäntäorganismi rekombinantti-DNA-kloonausvektorilla, joka käsittää geenin ilmentymistä helpottavia funktioita koodaavia DNA-sek-10 venssejä ja Thermoanaerobacter- tai Thermoanaerobium-kannan CGTaasia koodaavan DNA-sekvenssin, joka kanta on ATCC 53627 tai jokin kannoista NCIB 40053 - NCIB 40059.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen transformoitu organismi, 15 tunnettu siitä, että isäntäorganismi on Escherichia- tai Ba- cillus-kanta, edullisesti E. coli-, B. subtilis- tai B. licheniformis -kanta.

8. Tärkkelyksen nesteytysmenetelmä, tunnettu siitä, että se 20 käsittää vesipitoisen tärkkelyslietteen alistamisen entsy- maattiseen nesteytykseen patenttivaatimuksen 1 mukaisen CGTaasin läsnä ollessa pH:ssa, joka on alueella noin 4,0-5,5, edullisesti lämpötilassa, joka nousee yli noin 100°C:n.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen tärkkelyksen nesteytys menetelmä, tunnettu siitä, että tärkkelyslietteeseen ei lisätä kalsiumsuolaa.

10. Patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukainen menetelmä, tunnettu 30 siitä, että nesteytetty tärkkelys alistetaan sen jälkeen ent- symaattiseen sokerointiin glukoamylaasin läsnä ollessa oleel-lisesti ilman välissä olevaa pH:n säätöä.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu sii-35 tä, että se käsittää lisäksi etanolifermentoinnin hiivalla yhtaikaa sanotun sokeroinnin kanssa tai sen jälkeen. li 98737

12. Menetelmä syklodekstriinin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää nesteytetyn tärkkelysliuoksen entsympaattisen, patenttivaatimuksen 1 mukaisella syklodekstriini-gly-kosyylitransferaasilla käsittelemisen yli 60°C:n lämpötilassa 5 ja syklodekstriinituotteen senjälkeisen reaktioseoksesta tal-teenottamisen.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sanottu entsyymikäsittely suoritetaan alle noin 24 10 tunnissa.

14. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sanottu nesteytetty tärkkelysliuos generoidaan nesteyttämällä entsymaattisesti tärkkelysliete sanotulla

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sanottu entsyyminesteytys suoritetaan pH:ssa alueella noin 4,0-5,5 ja sanottu myöhempi tärkkelyshydrolysaatin 20 entsyymikäsittely suoritetaan ilman välissä olevaa pH:n säätöä.

15 CGTaasilla.

16. Patenttivaatimuksen 14 tai 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tärkkelyshydrolysaatin entsyymikäsittely 25 suoritetaan ilman että nesteytettyyn tärkkelykseen annostetaan uudelleen CGTaasia.

17. Menetelmä syklodekstriinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vesipitoisen tärkkelyslietteen 30 käsittelemisen entsymaattisesti patenttivaatimuksen 1 mukaisella syklodekstriini-glykosyylitransferaasilla yli noin 100°C:n lämpötilassa ja pH:ssa alueella 4,0-5,5, edullisesti ilman kalsiumsuolan additiota, ja saadun siirapin senjälkeisen pitämisen lämpötilassa alueella 80-90°C ei enempää kuin 35 noin 28 tuntia siirapin ollessa alueella 20-30 % kuivaa substanssia vähintään osan sanotusta pitoajasta, ja syklodekstriinituotteen senjälkeisen talteenottamisen reaktioseoksesta. 98737