JPS5937955B2 - バシルス属アミラ−ゼｇ６によるオリゴ糖の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はパシルス属細菌の生産するアミラーゼを使用し
、でん粉からマルトヘキサオースを含有する糖化物を製
造する方法に関するものである。

従来、アミラーゼとしては、α−アミラーゼ、β−アミ
ラーゼ、グルコアミラーゼなど、でん粉に対する分解様
式を異にする種々のアミラーゼが知られ、グルコースや
マルトースの製造に使用されてきた。

そして最近は、より分子量の太きい、例えば、マルトト
リオース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）、マル
トペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ６）
などのオリゴ糖製造技術の開発が要望されている。

これらの糖は食品の甘味料、増量剤、賦形剤、包接剤上
して食品及び薬品工業に広く使用でき木ものと考えられ
ている。

そして、現在までに、例えば、マルｌ−トＩＪオースに
ついてはＳ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｃｅｕｓ
の生産するＮ−Ａ４６８酵素（特開昭５４−９７３９号
及び特開昭５１−１１００４９号）が知られ、マルトテ
トラオースについてはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ５ｔｕ
ｚ−ｅｒｉのアミラーゼ（Ａｒｃｈｉｖｅ ｏｆ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ １ｓｔｒｙａｎｄ Ｂ １ｏｐｈｙｓｉ
ｃｓ第１４５巻、１０５〜１１４頁（１９７１年））が
知られている。

そしてマルトヘキサオースについては、Ａｅｒｏｂａｃ
ｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎ−ｅｓの生産する細胞壁に結合
するアミラーゼが、でん粉をその非還元性末端からマル
トヘキサオース単位で加水分解すると云われている（特
開昭４８−３９６８８号、特開昭４８−３９６４９号及
びＢ １ｏｃｈｉ ｍ ｉｃａ ｅｔ Ｂ １ｄｐｈｙ
ｓｉｃａ Ａｃｔａ 、第４１０巻、３３３〜３４５頁
（１９７５年））。

本発明者はオリゴ糖生産能の強い微生物を求めて、土壌
中より微生物の検索を行ってきた結果、パシルス・サー
キュランスと同定した微生物がでん粉をマルトヘキサオ
ースを主成分として糖化物に分解するアミラーゼを菌体
外に著量に生産すること、そしてこのアミラーゼをでん
粉又はアミロペクチンに作用させるに際し、α−１，６
−グルコシダーゼ又はα−アミラーゼの存在下で反応を
行なうとマルトヘキサオースの収量が顕著に増加するこ
とを認め本発明を完成した。

すなわち、本発明は、でん粉又はその液化物からマルト
ヘキサオースを生成するパシルス属の生産するアミラー
ゼＧ６をでん粉、アミ口ペクチンの液化物に作用させ糖
化するに際し、α−１，６−グルコシダーゼ又はα−ア
ミラーゼで処理することを特徴とするパシルス属アミラ
ーゼＧ６によるマルトヘキサオース含有糖化物の製造方
法に関するものである。

以下に本発明の内容をより具体的に説明する。

パシルス属細菌の生産する酵素によるオリゴ糖の生産に
ついては、例えば、α−アミラーゼがでん粉分解物の構
成糖の少量成分としてマルトヘキサオースを生成したり
、又、シクロデキストリングリコジルトランスフェラー
ゼにより、グルコース６個が結合した環状デキストリン
を生成することは知られているが、本発明に示すような
マルトヘキサオースを主成分とするでん粉糖化物を生成
するパシルス属アミラーゼは知られていない。

しかも、本発明のアミラーゼはＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ
ａｅｒｏ−ｇｅｎｅｓの生産する酵素とは違い、菌体外
に生産されるため、生産量が多く、且つ酵素的性質にお
いても、以下に記載するように、差異が多く新規な酵素
き認められるものであり、本酵素をアミラーゼ゛Ｇ６と
命名した。

アミラーゼＧ６の酵素的性質 （１）作用； でん粉、アミロース、アミロペクチン、
デキストリンなどからマルトヘキサオースを主成分とす
る糖分解物を生成する。

マルトヘキサオースの収量は基質の液化度に依存するが
通常、２５〜３５％である。

可溶性でん粉に対する馳は約０．０６５％、可溶性でん
粉を基質としたときの典型的な糖化物の組成を第１図に
示す。

（２）作用…範囲及び最適作用ｐＨ；ｐＨ４〜１１の範
囲に作用し、最適ｐＨは８付近（１％可溶性でん粉、０
．０５Ｍトリス緩衝液の下で、４０℃で１時間反応（第
２図）） （３）作用温度範囲及び最適作用温度； 約７０℃まで
作用し、最適作用温度は約６０℃（１％可溶性でん粉、
０．０５ Ｍ トＩＪス緩衝液の下で、各温度で３０分
間反応（第３図月 （４） ｐＨ安定性；ｐＨ約５〜約１１で安定（０，
０５Ｍ緩衝液の下で、３０℃で３時間放置後、残存活性
を測定（第４図）） （５）熱安定性； ０．０５ＭトＩＪス緩衝液の下で
、各温度で１０分間加熱後、残存活性を測定した。

その結果、５０℃、１０分間の加熱で約１０％失活し、
５５℃、１０分間の加熱で約５０％失活し、６０℃、１
０分間の加熱で約８０％失活した。

（６）阻害剤； 本酵素は５Ｘ１０−’ＭのＭｇＣｌ２
、Ｆｅ５０ 、ＣｏＣｌ 、Ｚｎ５Ｏ、ＣｕＳＯ４に
より、４ ２ ４それぞ
れ約９９％、約８９％、約７９％、約７６％、約６６％
阻害された。

又、５Ｘ１０ ’ＭＣａＣ１２によっても約４０％阻
害された。

σ）安定化； カルシウムによる熱安定性の増加は認め
られなかった。

（８）精製方法； 本酵素は培養Ｐ液から硫安４０〜７
０％飽和で沈澱物として回収され、次いで、ＤＥＡＢ−
セファローズ カラムクロマトグラフィー（０，０２５
Ｍリン酸緩衝液に溶解した塩化カリウム０．２〜０．６
Ｍでグラジェント溶出）同カラムによる再クロマトグラ
フィー、セファデックスＧ−２００カラム クロマトグ
ラフィーにより、クロマト的に単一アミラーゼに精製す
ることができる。

（９）分子量； セファデックスＧ−２００カラムクロ
マトグラフィーによる分子量は約 ７６０００であった。

（１０） 力価測定法； 本酵素の活性測定は、０．
ＩＭＦリス緩衝液に溶解させた１％可溶性でん粉液０．
５ｒｎｌに適量の酵素を加え、水で全量１ｒｎｌとし、
４０℃で反応させる。

この条件で１時間に１′ＩｎＪ！のグルコースに相当す
る還元力を生成する酵素量を１単位とした。

以上の酵素的性質について、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅ
ｒｏｇｅｎｅｓの酵素と比較した結果を第１表に示す。

第１表から明らかなように、本発明のアミラーゼＧ６に
よるでん粉糖ｆヒ物は、主成分であるマルトヘキサオー
スの他に、反応初期よりマルトース、マルトトリオース
、マルトテトラオース及びマルトペンタオースを生成す
ることから、でん粉性基質の非還元性末端からマルトヘ
キサオース単位で分解する酵素と断定できない。

本発明のアミラーゼＧ６はＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅ
ｒｏｇｅｎｅｓの酵素に比ベアアルカ男性側）こ安定で
あり、作用ｐＨもアルカリ性側にある０又、Ａｅｒｏｂ
ａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓアミラーゼＧ６はカル
シウムイオンにより熱失活から保護されるのに比べ、本
発明のアミラーゼＧ６にはこのような効果は認められな
い。

本発明のアミラーゼＧ６は菌体外に生産される酵素であ
るが、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓの酵
素は細胞壁に結合した酵素である。

なお、本発明において使用される微生物の菌学的性質は
下記に示す通りであり、本菌株は微工研菌寄第５８５３
号として、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され
ている。

（１）形便； 単桿菌、大きさ０．７〜１．ＯＸ２．４
〜４．０μ、非運動性、ダラム陰性。

（２）胞子； 胞子前細胞はふくらみ、球形〜楕円形の
胞子を形成する。

（３）ゼラチン； 殆んど液化しない。

（４）肉汁寒天； 生育中程度、表面平滑で薄く、半透
明乳白色。

（５）グルコース肉汁寒天； 肉汁寒天培地よりも生育
不良。

（６）クエン酸寒天； わずかに生育。

（７）グルコース−硝酸塩寒天； わずかに生育。

（８）肉汁； かずかに混濁、沈澱する。

（９）食塩肉汁；１〜８％食塩濃度でも生育、１０％食
塩濃度では生育しないか、わずかに生育。

（１ｐ）ミルク； ゆっくり凝固、その後ペプトン化。

（１１）ポテト； 生育微弱 （１２）チロシン寒天； 生育中程度、チロシナーゼ陰
性。

（１３）グルコース−アスパラギン寒天；生育微弱。

（１４）インドール； 生成しない。

（１５）アセチルメチルカルビノール；生成する。

（１６）硫化水素； 生成する。

（１７） 硝酸塩の還元； 陰性。

（１８）ウレアーゼ； 生成しない。

（１９）カタラーゼ； 生成しない。

（２０）グルコース肉汁培地のｐＨ； 約５゜Ｇ２１
）でん粉の加水分解； 陽性。

（２２）炭水化物の利用； グルコース、フラクトース
、マンノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、シ
ュークロース、ラクトース、マルトース、ラフィノース
、マンニトール、イヌリン、でん粉、Ｌ−ソルボース、
ソルビトールを利用虫酸するが、ガスの発生なし。

（２３）生育温度； 最適生育温度は３５〜４５°Ｃ１
最高生育温度は５０〜５５℃。

（２４）死滅温度； １００℃で１０分間加熱しても死
滅しない。

（２５）最適生育ｐＨ；８〜９゜ 以上の菌学的性質について、ＢｅｒｇｅチｓｓＭａｎｎ
ｕａｌｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙの第７版及び第８版（Ｔｈｅ Ｗｉ ］
］ ｉａｍａ ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏｍｐａ−ｎｙ
１９５７年及び１９７４年）を参照し、本微生物はパ
シルス サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕ
］ａｎｓ ）に近縁の微生物であると同定し、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ Ｇ ６と命名した。

本発明による酵素生産のための培養は、通常、用いられ
る固体培地または液体培地が使用され、液体培養のため
の培地の炭素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エ
キス、カゼイン、コーンステイープ リカーなどのいず
れかと、炭素源としてでん粉、デキストリン、マルトー
ス、グルコース、シュークロースなどのいずれか、及び
これを補足する無機窒素源、リン酸塩、マグネシウム塩
及び少量の金属塩を含む培地が近用される。

培養温度は２５〜５５℃、ｐＨ７〜９で行なう。

アミラーゼＧ６は菌体外に生産される酵素であるので、
培養終了後、濾過又は遠心分離して除菌し、上澄液を回
収する。

そして、必要に応じて濃縮し、硫安、硫酸ナトリウムな
どによる塩析、又はアセトン、エタノール、メタノール
、イソプロパツールなどの有機溶剤を加え、酵素を沈澱
物として収得する。

次に、本酵素を用いて、でん粉、アミロペクチン又はこ
れらの派生物に作用させてマルトヘキサオースを生成す
るためには、通常、基質濃度５〜４０％で行なわれるが
、基質濃度が高くなると少し阻害作用があられれる。

反応のｐＨは４〜１１の広い範囲で行なうことができる
が、ｐＨ７及び７以下の反応では生成したマルトヘキサ
オースがマルトテトラオースとマルトースに分解する反
応が著しくなるため、ｐＨ８〜９の範囲で反応を行なう
のが望ましい。

反応温度は、通常、４０〜６０’Ｃである。

マルトヘキサオースの収量は液化でん粉のＤＥによっで
ある程度影響を受けるが、ＤＥ約４３の液化でん粉を使
用したときの一糖化物の糖組成は、クルコース２．１％
、マルトース５．７％、マルトトリオース２．５％、マ
ルトテトラオース６７％、マルトペンタオース４．８％
、マルトヘキサオース約３１％、そしてその他のオリゴ
糖４７．１％であった。

本発明において使用されるα−１，６−グルコシダーゼ
は、例えば、エーロバクター エーロゲンス（Ａｅｒｏ
ｂａｃｔｅｒ ａｅｒｇｅｎｓ ）やシュードモナスア
ミロデラモサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｄ
ｅｒａｍｏ−ｓａ ）のものが使用でき、これらは生化
学工業■から入手することができる。

この他、ストレプトマイセス属やパシルス属などのα−
１，６−グルコシダーゼも同様に使用することができる
。

又、本発明に使用されるα−アミラーゼは、例えば、パ
シルス属の生産するでん粉液化酵素であり、生化学工業
■や大和化成■から入数するこきができる。

α−１，６−グルコシダーゼによる処理はアミラーゼＧ
６による糖化前でもよく、又同時でもよＧ）。

パシルス属アミラーゼＧ６によるでん粉、アミロペクチ
ン又はその部分分解物の糖化に際し、本発明を適用して
、α−１，６−グルコシダーゼ又はα−アミラーゼで処
理すると、無処理の場合に比べ、マルトヘキサオースの
収量が、少なくとも３〜１０％増加する。

以下に、実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例 １ ２１三角フラスコに、肉エキス５％、Ｋ２ＨＰＯ４０，
３％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，１％、可溶性でん粉１
％からなる培地４００７を入れ、常法により殺菌後、バ
シルス サーキュランスＧ６（倣工研菌寄第５８５３号
）を接種し、３０°Ｃで４８時間振盪培養した。

培養後、得られた上澄液について生産されたアミラーゼ
Ｇ６を測定した結果、培地−尚り４１．１単位であった
。

この上澄液２．２１から硫安４０〜７０％飽和で沈澱す
る区分を集め、蒸溜水で透析した。

得られた酵素液（２５０ｒｎｌ）のアミラーゼＧ６活性
は２５３単位／７であった。

ＤＥ４．３の液化でん粉（大和化成■製クライスクーゼ
ＫＭで液化）をそれぞれ約６０ｍ９と０．２ Ｍトリス
緩衝液０４−に、アミラーゼＧ６ ０．９６単位を加え
たもの（１）及びこれにＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒ
−ｏｇｅ島のα−１，６−グルコシダーゼ９．５単位（
Ａｇｒ、 ＢｉｏＪ、 Ｃｈｅｍ、、第４０巻第１５１
５頁、１９７６年によった）加えたもの（２）、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓｓｕｂｔｊＪｉｓのα−アミラーゼ（クライ
スクーゼＫＭ）０．０２５単位加えたもの（３）および
Ｂａｃｉｌｌ−ｕｓ属の耐熱性α−アミラーゼ（大和化
成■製す−モアミラーゼ）０．０２５単位加えたもの（
４）について、それぞれ水で全量１ｒｎｌとし、５０℃
で４３時間反応を行ない、得られた糖化物について液体
クロマトグラフ（カラム 昭和電工■製Ｎ ＨｐａｋＪ
−４，１１、溶出液 アセトニトリル６５％；水３５％
）で分離、分取し、フェノール−硫酸法で定量した。

結果は第２表に示す通りであった。表から明らかなよう
に、α−１，６−グルコシダーゼの存在下で反応を行う
ことにより、マルトヘキサオースの収量が８．３％増加
した。

又、α−アミラーゼの存在下で反応を行うことにより３
〜４％収量が増加した。

実施例 ２ 液化でん粉（ＤＥ４．３ ） ５ ｏｍｔｚに、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍ−ｏｎａｓ属のα−１，６−グルコシダーゼ２
５０単位を添加しｐＨ３，５４０℃で５時間反応し、次
いでアミラーゼＧ６ １．５単位を加えｐＨ８〜８．５
、温度５０℃（基質の終濃度１０％）で２０時間反応を
行った。

得られた糖化物の糖組成は第３表に示す通りであった。

表から明らかなように、でん粉をα−１，６−グルコシ
ダーゼで処理することにより、無処理の場合に比べ、マ
ルトヘキサオース（Ｇ６）の収量が約１７％増加した。

【図面の簡単な説明】

第１図はアミラーゼＧ６によるでん粉糖化物の液体クロ
マトグラムを示す（１はグルコース、２はマルトース、
３はマルＩ−） ＩＪオース、４はフル１ヘテトラオー
ス、５はマルトペンタオース、６はマルトヘキサオース
を示す。 第２図、第３図と第４図は、それぞれアミラーゼＧ６反
応の最適作用ｐＨ，最適作用温度とｐＨ安定性を示して
いる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ でん粉又はその液化物からマルトヘキサオースを生
   成するパシルス属の生産するアミラーゼＧ６をでん粉、
   アミロペクチンの液化物に作用させ糖化するに際し、α
   −１，６−グルコシダーゼ又はα−アミラーゼで処理す
   ることを特徴とするバシルス属アミラーゼＧ６によるマ
   ルトヘキサオース含有糖化物の製造方法。